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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES VIVIAN MATSUKURA DOS SANTOS
ESTUDO DOS MECANISMOS DE INDUÇÃO DE
MORTE CELULAR POR FENOTIAZINAS EM
CÉLULAS LEUCÊMICAS K562
Mogi das Cruzes, SP 2010
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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES VIVIAN MATSUKURA DOS SANTOS
ESTUDO DOS MECANISMOS DE INDUÇÃO DE
MORTE CELULAR POR FENOTIAZINAS EM
CÉLULAS LEUCÊMICAS K562
Orientador: Prof. Dr. Tiago Rodrigues Co-orientador: Prof. Dr. Ivarne Luis dos Santos Tersariol
Mogi das Cruzes, SP 2010
Dissertação apresentada ao Mestrado em Biotecnologia da Universidade de Mogi das Cruzes como parte dos requisitos para obtenção de título de mestre em Biotecnologia. Área de Concentração: Biológica
FINANCIAMENTO: FAPESP, CNPq, FAEP.
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a todos que acreditaram em meu potencial e me
incentivaram com amor, compreensão, carinho, presença e incansável apoio ao
longo do período de elaboração deste trabalho.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pelo que iluminou meu caminho, me proporcionando saúde e
força para realização de mais uma etapa de minha vida.
Agradeço aos meus queridos orientadores, Prof. Dr. Tiago Rodrigues e Prof. Dr.
Ivarne Luis dos Santos Tersariol, que sempre acreditaram no meu potencial e me
incentivaram a crescer cada vez mais. Agradeço por todo conhecimento e
experiência profissional transmitidos com todo carinho, compreensão e
dedicação.
Agradeço minha mãe Elisabeth M. Matsukura pelo apoio nas horas difíceis,
mostrando que só se alcança um objetivo se realmente acredita nele.
Agradeço aos meus familiares que sempre me apoiaram frente às dificuldades
encontradas com muito carinho e compreensão.
Agradeço ao Dr. Fabio D. Nascimento e ao Dr. Edgar Paredes Gamero que me
ajudaram com os experimentos realizados na UNIFESP-EPM.
Agradeço aos meus amigos, que estiveram sempre ao meu lado me ajudando e
me aconselhando nas horas difíceis.
Agradeço a minha banca examinadora, Prof. Dra. Katia Cristina Ugolini Mugnol
e a Prof. Dra. Elaine Guadalupe Rodrigues, pelas brilhantes considerações que
guiaram a confecção final deste trabalho.
Agradeço à FAPESP, a CNPq e a FAEP pelo fomento que possibilitou a
execução deste trabalho.
"Você não pode ensinar nada a um homem; você pode apenas ajudá-lo a encontrar a
resposta dentro dele mesmo."
Galileu Galilei
RESUMO Fenotiazinas (FTZ) são fármacos psicotrópicos utilizados no tratamento de esquizofrenia. A literatura tem revelado que estas drogas apresentam efeito indutor de apoptose e supressor de proliferação de linhagens leucêmicas em cultura. No entanto, os mecanismos de indução de morte celular por FTZ permanecem não esclarecidos. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos pró-apoptóticos das FTZ tioridazina (TR), flufenazina (FP) e trifluoperazina (TFP) em linhagens de leucemia mielóide crônica (K562), explorando seus mecanismos de indução de morte celular. Ainda, foi avaliada citotoxicidade das FTZ fotoexcitadas comparativamente ao estado fundamental. A incubação das células leucêmicas K562 com TR, FP e TFP provocou uma diminuição da viabilidade celular de forma concentração dependente, com valores de EC50 variando entre 25 a 35 µmol/L dependendo da estrutura da FTZ, sendo TR o derivado mais potente. Tal efeito envolve uma seqüência de eventos como o aumento súbito de Ca2+ citosólico seguido pela captação pela mitocondrial, com dissipação do ∆Ψ. Em paralelo foi observada a permeabilização da membrana lisossomal e a possível comunicação entre lisossomos e mitocôndrias na morte celular induzida por TR. Além disso, as FTZ induziram a oxidação de grupos tiólicos e diminuição dos níveis de GSH na ausência de lipoperoxidação. A inibição por 3-MA sugere que o disparo de morte celular por TR envolve autofagia. A morte celular foi predominantemente apoptótica e seletiva para células tumorais, não afetando as normais, sendo exacerbada pela irradiação. Esses resultados apontam o grande potencial farmacológico das fenotiazinas na quimioterapia antitumoral. Palavras-chave: fenotiazinas, células K562, cálcio, mitocôndria, permeabilização de membrana lisossomal, apoptose, autofagia.
ABSTRACT Phenothiazines (PTZ) are psychotropics drugs used for the treatment of schizophrenia. The literature has revealed that these drugs have the effect of inducing apoptosis and suppressing proliferation of leukemic lines in culture. However, the mechanisms of induction of cell death by PTZ remain unexplained. Therefore, the objective of this work was to investigate the pro-apoptotic effects of PTZ thioridazine (TR), trifluoperazine (TFP) and fluphenazine (FP) in chronic myeloid leukemic cell (K562), exploring the mechanism of induction of cell death. The incubation of K562 leukemic cells with TR, FP and TFP caused a decrease in cell viability in a concentration dependent, with EC50 values ranging from 25 to 35µmol/L depending on the structure of the PTZ, and TR the most potent derivative. This event involves a sequence of events as the increased of Ca2+, followed by uptake by mitochondria, with dissipation of ∆Ψ in cell death induced by TR. In parallel we observed lysosomal membrane permeabilization, and a possible communication between lysosomes and mitochondria in cell death induced by TR. In addition, the PTZ induced oxidation of thiol groups and decreased levels of GSH in the absence of lipid oxidation. The inhibition by 3-MA suggests that the triggering of cell death by TR involves autophagy. The cell death was predominantly apoptotic and selective for tumor cells, not affecting the normal, being exacerbated by irradiation. These results show the great potential drug phenothiazine in antitumor chemotherapy.
Key words: phenothiazines, K562 cells, lysosomal membrane permeabilization, mitochondria, autophagy, apoptosis.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1- Formação do gene quimérico Bcr/Abl pela translocação t(9q;22q) 21
Figura 2- Células K562. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
Figura 3 - Diferentes tipos de morte celular. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
Figura 4 - Vias de indução de apoptose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
Figura 5 - Alterações no compartimento lisossomal durante a imortalização e a transformação. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
31
Figura 6 - Apoptose induzida via ativação de TNF. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
Figura 7 - Principais diferenças entre morte celular necrótica e apoptótica. . 33
Figura 8 - Papel da autofagia na privação nutricional e ausência de fatores de crescimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
35
Figura 9 - Esquema de diferentes tipos de autofagia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
Figura 10 - Estrutura química do núcleo tiazínico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
Figura 11- Estrutura química dos principais representantes das fenotiazinas 39
Figura 12 - Efeitos das fenotiazinas sobre a viabilidade de células K562. . . 51
Figura 13- Caracterização do tipo de morte celular induzido pelas fenotiazinas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
53
Figura 14 - Efeitos das fenotiazinas sobre a atividade das caspases -3 e -6. . 56
Figura 15 – Efeitos das fenotiazinas sobre a elevação da permeabilidade lisossomal em células K562. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
59
Figura 16 - Efeitos das fenotiazinas sobre a viabilidade de células K562 e células mononucleares normais pelo método do MTT e exclusão de azul de tripan. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
62
Figura 17 - Efeitos da TR sobre o potencial de membrana mitocondrial. . . 64
Figura 18 - Efeitos de TR sobre a homeostase do Ca2+ e respostas mitocondriais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
66
Figura 19 - Efeitos de BAPTA-AM sobre a morte celular induzida pelas fenotiazinas em células K562 (4h). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
69
Figura 20 - Efeitos de BAPTA-AM sobre a morte celular induzida pelas fenotiazinas em células K562 (24h). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
70
Figura 21 - Efeitos de EGTA sobre a morte celular induzida pelas fenotiazinas em células K562. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
71
Figura 22 - Efeitos de BAPTA-AM e EGTA sobre a morte celular induzida pelas fenotiazinas em células K562. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
71
Figura 23 - Efeitos de BAPTA-AM e E-64 sobre a morte celular induzida pelas fenotiazinas em células K562. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
72
Figura 24 - Efeitos da 3-MA sobre a morte celular induzida por TR.. . . . . . 73
Figura 25 - Efeitos das fenotiazinas sobre a formação de Tbars em células K562 (A) e lisossomos (B). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
74
Figura 26 - Efeitos da vitamina E sobre a morte celular induzida pelas fenotiazinas em células K562. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
75
Figura 27 - Efeitos oxidação de grupos tiólicos de proteínas pelas fenotiazinas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
76
Figura 28 - Efeitos das fenotiazinas sobre os níveis celulares de GSH. . . . . 77
Figura 29 - Efeitos das fenotiazinas no estado excitado sobre a viabilidade de células K562. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
78
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Caracterização de morte celular apoptótica e autofágica. . . . . . 37
Tabela 2 - Porcentagens entre células K562 viáveis, apoptóticas e necróticas com incubação de 6 horas com TR. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
54
Tabela 3 - Porcentagens entre células K562 viáveis, apoptóticas e necróticas com incubação de 24 horas com fenotiazinas. . . . . . . . . . . . . . .
55
Tabela 4 - Comparação dos valores de EC50 para as fenotiazinas (TR, FP e TFP) no estado fundamental e excitado sobre a viabilidade de células K562. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
79
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
3-MA 3-metiladenina
Abl Abelson
Abs Absorbância
Ac-DEVD-CHO N-Ac-Asp-Glu-Val-Asp-CHO (inibidor de caspase -3)
Ac-DEVD-pNA N-Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide (substrato de caspase -3)
Ac-VEID-pNA N-acetyl-Val-Glu-Ile-Asp-p-Nitroanilide (substrato de caspase -6)
AIF Fator Indutor de Apoptose
AMPK Proteína Quinase Ativada por AMP
ANT Translocador de Nucleotídeos de Adenina
AO Acridina Orange
APAF-1 Fator Ativador de Proteases Apoptóticas 1
ATP Adenosina Trifosfato
BAPTA-AM Ácido 1,2-bis(2-aminofenoxi)etano- N,N,N,N-tetracético
Bcr Breakpoint Cluster Region
BCRJ Banco de células do Rio de Janeiro
BHT Butilhidroxitolueno
BSA Soro de Albumina Bovina
CaMKK-β Cálcio/quinase quinase β dependente de calmodulina
CCCP Carbonilcianeto 3-clorofenilhidrazona
CNMC Comitê de Nomenclatura de Morte Celular
Dig Digitonina
DTNB Ácido 5,5-ditiobis-nitrobenzóico
DTT Ditiotreitol
EC50 Concentração Efetiva
EDTA Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético
EGTA Ácido Etilenoglicol Tetra-Acético
EROs Espécies Reativas de Oxigênio
FITC Isotiocianato de Flouresceína
Fluo 3/AM 4-(6-Acetoxymethoxy-2,7-dichloro-3-oxo-9-xanthenyl)-4'-methyl-2,2'-(ethylenedioxy)dianiline-N,N,N',N'-tetraacetic acid tetrakis(acetoxymethyl) ester.
FP Flufenazina
FTZ Fenotiazinas
GSH Glutationa Reduzida
HPV Papiloma Vírus Humano
HSP Proteína de heat shock
HtrA2/Omi High-temperature requirement protein A2
INCA Instituto Nacional do Câncer
IP Iodeto de Propídeo
LAMP-2A Receptor Lysosome-Associated Membrane Protein Type-2A
LLA Leucemia Linfoblástica Aguda
LMA Leucemia Mielóide Aguda
LMC Leucemia Mielóide Crônica
LNC Leucemia Neutrofílica Crônica
mTOR Alvo da Rapamicina em Mamíferos
MTT Brometo de 3-(4,5-dimetilazol-2-il-2,5-difeniltetrazol)
NAD(P)H Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato
NADH Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo
OMS Organização Mundial de Saúde
OPT o-ftalaldialdeído
PML Permeabilização de Membrana Lisossomal
PMM Permeabilização de Membrana Mitocondrial
PTPM Poro de Transição de Permeabilidade Mitocondrial
PTZ Phenothiazines
RIPK1 Receptor de Proteína Quinase-1
Rhod-2/AM 1-[2-Amino-5-(3-dimethylamino-6-dimethylammonio-9-xanthenyl)phenoxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)]ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid, tetraacetoxy methyl ester
RNA Ácido Ribonucleico
SDS Dodecil sulfato de sódio
SMAC
Segundo Ativador Mitocondrial de Caspase
SPI(2A) Inibidor de Protease Serina 2A
TBA Ácido Tricloroacético
TBARs Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
TCA Ácido Tiobarbitúrico
TFP Trifluoperazina
TMRM Tetrametilrodamina Metil Éster
TNF Fator de Necrose Tumoral
TNFR-1 TNF via receptor-1
TPM Transição de Permeabilidade Mitocondrial
TR Tioridazina
TRAF-2 Fator de necrose T
TRAIL TNF - related apoptosis inducing ligant - receptor 1
URF Unidade relativa de Fluorescência
Z-F-R-MCA Z-Phe-Arg-7-amido-4-methylcoumarin (substrato de cisteíno proteases)
LISTA DE SÍMBOLOS
[Ca2+]c Concentração de cálcio citosólico
[Ca2+]m Concentração de cálcio mitocondrial
∆ψ Potencial de membrana mitocondrial
Ca2+ Íon cálcio
CaCl Cloreto de cálcio
HCl Ácido clorídrico
HEPES Ácido N-2-Hidroxietilpiperazina-N'-2'-Etanossulfônico
K+ Íon potássio
KCl Cloreto de potássio
KH2PO4 Hidrofosfato de potássio
MgCl2 Cloreto de magnésio
Na+ Íon sódio
NaCl Cloreto de sódio
NaOH Hidróxido de sódio
t-BOOH Tert-butil hidroperóxido
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO/JUSTIFICATIVA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
1.1. Considerações gerais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
1.2. Leucemia Mielóide Crônica e a Resistência à Apoptose. . . . . . . . . 20
1.3. Células K562. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
1.4. Morte Celular. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
1.4.1. Apoptose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
1.4.2. Necrose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
1.4.3. Autofagia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
1.5. Fenotiazinas Apresentam um Grande Potencial Antitumoral. . . . . . 38
1.6. Justificativa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
2. OBJETIVOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
3.1. Objetivos Gerais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
3.2. Objetivos Específicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
3. MÉTODO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.1. Linhagem de Células K562. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.2. Isolamento de Células Mononucleares. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.3. Teste de Exclusão de Azul de Tripan. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.4. Teste de Redução de 1-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-3,5-difenilformazan (MTT). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
45
4.5. Análise de Dupla Marcação com Anexina V - Isotiocianato de Flouresceína (FITC)/ Iodeto de propídeo (IP) por Citometria de Fluxo. . . .
45
4.6. Análise da Atividade das Caspases. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.7. Preparação da Fração Lisossomal-Mitocondrial. . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.8. Dosagem de Proteína. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.9. Determinação da Atividade Enzimática da Catepsina B.. . . . . . . . . 47
4.10. Ensaio de Permeabilidade da Membrana Lisossomal. . . . . . . . . . . 47
4.11. Determinação do ∆ψ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
4.12. Análise da Homeostase de Ca2+. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
4.13. Análise de Oxidação Lipídica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
4.14. Dosagem de Grupos Tiólicos Reduzidos de Proteínas. . . . . . . . . . 49
4.15. Dosagem de Glutationa Reduzida (GSH). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
4.16. Sistema de Irradiação para Teste de MTT. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
4.17. Análise Estatística. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
4. RESULTADOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
5.1. Estudo dos Efeitos das Fenotiazinas em Estado Fundamental Sobre a Viabilidade de Células K562. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
51
5.2. Caracterização do Tipo de Morte Celular Induzido pelas Fenotiazinas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
52
5. 3. Estudo dos Efeitos das Fenotiazinas Sobre a Atividade da Caspase -3 e -6. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
55
5.4. Avaliação da Permeabilização Lisossomal na Morte Celular Induzida pelas Fenotiazinas em Células Leucêmicas K562. . . . . . . . . . . . .
57
5.5. Efeitos das Fenotiazinas sobre a Viabilidade de Células Mononucleares Normais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
61
5.6. Dissipação do ∆ψ Mitocondrial Induzida por TR com Envolvimento de Cisteíno Catepsinas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
63
5.7. Aumento de Ca2+ Citosólico Induzido pelas Fenotiazinas e Contribuição Mitocondrial para a Homeostase. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
64
5.8. Envolvimento da Autofagia na Morte Celular Induzida pelas Fenotiazinas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
72
5.9. Avaliação de participação de estresse oxidativo na morte celular induzida pelas fenotiazinas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
73
5.10. Efeitos das fenotiazinas no estado excitado sobre a viabilidade de
células leucêmicas K562: comparação com estado fundamental. . . . . . . . .
77
5. DISCUSSÃO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
6. CONCLUSÃO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
7. REFERÊNCIAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
19
1. INTRODUÇÃO/ JUSTIFICATIVA
1.1. Considerações gerais
Embora o câncer seja uma doença relativamente comum, nas últimas décadas tem se
tornado um evidente problema da saúde pública mundial. Segundo a Organização Mundial de
Saúde (OMS), a cada ano ocorrem cerca de 10 milhões de novos casos de câncer
(STEWART, B.W. & KLEIHUES, 2003). De acordo com o Instituto Nacional de Câncer
(INCA), em 2005, de um total de 58 milhões de mortes ocorridas no mundo, o câncer foi
responsável por 7,6 milhões, representando 13% de todas as mortes. Estima-se que, em 2020,
o número de casos novos anuais seja da ordem de 15 milhões (INCA, 2007). Desta forma,
além do diagnóstico precoce e da prevenção, é muito importante o desenvolvimento de
terapias seguras e eficazes no tratamento desta doença.
Avanços tecnológicos, no campo da quimioterapia, têm aumentado a sobrevida, ou até
mesmo proporcionado a cura, de alguns pacientes. As principais classes de agentes
quimioterápicos utilizados no tratamento do câncer são: inibidores mitóticos, como alcalóides
da vinca (vincristina e vimblastina), inibidores da enzima topoisomerase II (etoposide) e
agentes alquilantes (cisplastina) (KESKIN et al., 2000; JORDAN et al., 1991; ROSENBERG
et al., 1969). Entretanto, várias reações adversas são descritas em pacientes que utilizam estes
compostos; e, dentre elas, são observados alguns distúrbios psíquicos, bem como depressão,
ansiedade, psicoses, agitação e delírio. Sendo assim, drogas psicotrópicas são, eventualmente,
indicadas para tratamento dessas mudanças comportamentais (BREITBART, 1995;
DEROGATIS et al., 1983; BRUERA et al., 1998).
Dados da literatura têm demonstrado que drogas psicotrópicas da família das
fenotiazinas, além de apresentar efeitos no controle de desordens psiquiátricas, também
apresentam potencial antineoplásico (MOTOHASHI, et al 2000). Além disso, foi observada
uma diminuição significativa da incidência de câncer em pacientes esquizofrênicos tratados
com fenotiazinas (MORTENSEN et al., 1989; BARAK et al., 2005; DALTON, et al., 2004).
Fenotiazinas são fármacos que apresentam diversas propriedades biológicas
interessantes, dentre elas, a inibição de proliferação celular e a indução de apoptose
(ZHELEV et al., 2004). Além disso, dados da literatura, e do nosso grupo, têm demonstrado
que compostos tiazínicos exibem propriedades fotoquímicas e fototoxicidade (BHOWMIK et
al., 2001; RODRIGUES et al., 2006), sendo que essas propriedades de fotossensibilização
20
podem promover danos oxidativos em macromoléculas, causando alteração ou perda de sua
função (MOORE, 1977; RODRIGUES et al., 2005).
Sendo assim, neste trabalho, foram investigados os efeitos das fenotiazinas em células
tumorais em cultura, explorando os mecanismos moleculares e bioquímicos associados à
indução de morte celular e possível potencial farmacológico das fenotiazinas na quimioterapia
do câncer.
1.2. Leucemia Mielóide Crônica e a Resistência à Apoptose
A leucemia mielóide crônica (LMC) é responsável por aproximadamente 15% a 20%
das leucemias em adultos, sendo sua incidência de um a dois casos por 100 mil habitantes. A
faixa etária preferencial se situa entre 45 a 55 anos de idade, porém pode ocorrer raramente
em idosos e crianças (BACCARANI et al., 2006).
A LMC é uma doença proliferativa do sistema hematopoiético, caracterizada pela
expansão clonal de uma célula-tronco primitiva e pluripotente denominada “stem cell”
(célula-tronco), que tem a capacidade de se diferenciar em células mielóides, monocíticas,
megacariocíticas e células B e T (KOEFFLER & GOLDE, 1980; TESTA & ROBERTA,
2007).
A evolução da LMC apresenta as seguintes fases: fase crônica, fase acelerada ou de
transformação, fase blástica ou aguda. A fase crônica é caracterizada por hiperplasia medular,
capacidade de maturação das células mielóides e manifestação em sangue periférico,
facilmente controlado pela terapia medicamentosa convencional. Entretanto, na fase acelerada
há excessiva perda de diferenciação celular e significativo aumento da resistência às terapias
medicamentosas. Já na fase blástica, também resistente à terapia convencional, é agressiva,
com quadro clínico da leucemia aguda, ou seja, ocorre acúmulo de numerosas células
leucêmicas de rápida proliferação, que são denominados blastos, permitindo ao paciente uma
sobrevida muito curta (CALABRETTA & PERROTTI, 2004; RADICH, 2007).
A LMC está associada, em 90-95% dos casos, a uma anormalidade genética específica,
caracterizada pela formação de um cromossomo 22 encurtado, denominado cromossomo
Philadelphia, identificado em 1960 por Nowel e Hungerford na cidade de Philadelphia, EUA
(NOWELL & HUNGERFORD, 1960). O cromossomo Philadelphia origina-se da
translocação entre os braços longos dos cromossomos 9 e 22, t(9;22)(q34:qll) e esta
translocação resulta na fusão entre os genes abl (Abelson) e bcr (breakpoint cluster region) no
21
cromossomo 22, produzindo a proteína oncogene Bcr/Abl (Figura 1A) (SHET et al., 2002;
LAURENT et al., 2001; FADERL et al., 1999; BUENO-DA-SILVA et al., 2003; SESSIONS,
2007).
A proteína Bcr/Abl apresenta intensa atividade de tirosina quinase, que
constitutivamente interfere no processo apoptótico induzido por diferentes estímulos e
aumenta a resistência à apoptose, devido à independência de fatores de crescimento para a
proliferação, à interação com importantes vias bioquímicas, como a da proteína Ras, e à perda
de adesão da célula com estroma da medula óssea e matriz extracelular (NIMMANAPALLI
& BHALLA, 2002; BEDI et al., 1994; NISHII et al., 1996).
A formação do gene quimérico Bcr/Abl ocorre pela transposição do gene Abl (éxon 2-
11) para o cromossomo 22 onde fusiona com a região 5’ do gene Bcr. Três pontos de quebra
são descritos no gene Bcr: M-bcr, m-bcr e µ-bcr. De acordo com a localização do ponto de
quebra, esse oncogene híbrido terá tamanhos diferentes. Com a quebra dentro da região M-
bcr, os transcritos híbridos produzidos são: “b3a2” e “b2a2”. Em ambos os casos, a tradução
destes RNAs leva à formação de uma oncoproteína de fusão de 210kd (p210bcr/abl). As quebras
nas regiões m-bcr e µ-bcr produzem os transcritos “e1a2” e “e19a2”, respectivamente, e a
tradução das oncoproteínas de fusão p190bcr/abl e p230bcr/abl (Figura 1B) (DEININGER et al.,
2000; LAURENT et al., 2001; SHET et al., 2002).
Figura 1. Formação do gene quimérico Bcr/Abl pela translocação t(9q;22q). (A) Translocação dos braços longos dos cromossomos 9 e 22 e os rearranjos cromossômicos possíveis. (B) Produtos da translocação que resultam em diferentes fenótipos da leucemia. Adaptado de Fardel et al. (1999).
Cromossomo 22Cromossomo 22 Cromossomo 9Cromossomo 9Cromossomo 22Cromossomo 22 Cromossomo 9Cromossomo 9A
B
22
A p210bcr/abl está presente em 95% dos casos de LMC e em cerca de um terço dos casos
de leucemia mielóide aguda (LMA); e é responsável pela transformação maligna LMC por
promover desregulação da proliferação celular, diminuição de aderência, e diminuição de
respostas apoptóticas (DALEY et al., 1990; HALLEK et al., 1996). A p190bcr/abl está presente
na leucemia linfoblástica aguda (LLA) e em casos raros de LMA e LMC (MELO et al., 1994;
SAGLIO et al., 1996). Já a p230bcr/abl está associada à leucemia neutrofílica crônica (LNC),
que é marcada por anemia, baixa proporção de granulócitos imaturos, hepatoesplenomegalia
branda e expansão de neutrófilos maduros (LI et al., 1999; PANE et al., 1996).
A inibição por contato é um controle negativo na proliferação celular, ou seja, o contato
celular entre células vizinhas, em células normais, tem efeito inibitório sobre a sua
proliferação (COOPER & HAUSMAN, 2007). A proteína p210bcr/abl promove fosforilações
das proteínas do complexo de adesão impedindo o reconhecimento destas pelas integrinas
(proteína transmembrana que medeia à adesão das células à matriz extracelular). Desta forma,
a célula hematopoiética passa a ter deficiência na adesão com a medula óssea, o que promove
a mieloproliferação (DI BACCO et al., 2000).
A proteína Ras é um transdutor de um sinal importante na sinalização das vias
intracelulares. As proteínas p190bcr/abl e p210bcr/abl atuam na via Ras promovendo
modificações em suas propriedades sinalizadoras. As mutações em Ras conduzem à ativação
permanente de Ras-GTP, o que promove transformações nas atividades regulatórias, na
proliferação e diferenciação em células hematopoiéticas (SAWYERS et al., 1995).
Fatores de crescimento são moléculas sinalizadoras que apresentam papel central na
proliferação, sobrevivência e diferenciação de células normais. A expressão de Bcr/ abl torna
a proliferação celular independente de fatores de crescimento externos, por ativação de fatores
de sinalizadores intracelulares, pela mutação de genes responsáveis pelo controle de ciclo
celular ou, ainda, por sinalização autócrina (SAGLIO et al., 2006).
As proteínas codificadas por Bcr/ abl inibem a ação da caspase -3 e prolongam o
período G2/M do ciclo celular, o que resulta em sobrevivência extremamente aumentada
dessas células alteradas (CANITROT et al., 2002). O gene Bcr/ abl ainda aumenta a
expressão de proteínas anti-apoptóticas, como é o caso da proteína Bcl-xL, e fosforila e
inativa proteínas que induzem apoptose, como a proteína Bad (LAURENT et al., 2001).
A proteína p53 apresenta, como principal função, o monitoramento das células quanto a
danos de DNA. O papel de p53 é identificar a presença de danos no DNA e parar o ciclo
celular, de modo que possa ocorrer um processo de reparo, antes que o DNA seja replicado e
transmitido para as células-filhas. As mutações no gene supressor tumoral p53 podem ocorrer
23
em aproximadamente 20-30% dos casos de pacientes com LMC em crises blásticas,
contribuindo para a progressão da doença (COOPER & HAUSMAN, 2007; DI BACCO et al.,
2000).
O tratamento da LMC, por não se tratar de um tumor sólido, baseia-se no emprego de
quimioterápicos capazes de promover a mielossupressão. Os fármacos comumente utilizados
são interferon alfa e o mesilato de imatinibe. Avanços terapêuticos incluem, além do
desenvolvimento de novos quimioterápicos, transplante de medula óssea e infusão de
linfócitos do doador, aumentando, significativamente, a perspectiva de vida de portadores de
LMC. Entretanto, mecanismos biológicos que privilegiam a seleção de células
hematopoiéticas malignas sobre as células normais na LMC, têm sido responsáveis pela
resistência às modalidades terapêuticas (AGUILERA & TSIMBERIDOU, 2009;
HEHLMANN & SAUSSELE, 2008; PINILLA-IBARZ & QUINTAS-CARDAMA, 2009).
Visto que as alterações celulares na LMC favorecem o aumento do desenvolvimento
tumoral e o bloqueio da apoptose pelas vias clássicas, torna-se muito importante o estudo de
novas drogas capazes de induzir morte nestes tipos celulares, explorando seus mecanismos
moleculares e bioquímicos.
1.3. Células K562
Neste trabalho foi utilizado, como modelo de estudo, a linhagem de células leucêmicas
mieloblásticas humanas K562 (Figura 2A e B). A linhagem K562 foi estabelecida por Lozzio
& Lozzio em 1975 a partir das células isoladas por efusão pleural de uma mulher de 53 anos
de idade, com leucemia mielóide crônica em crise blástica terminal (LOZZIO & LOZZIO,
1973). Esta linhagem cresce em suspensão no meio RPMI-1640 suplementado com 10% de
soro fetal bovino (necessário para o seu crescimento ótimo).
As células K562 possuem por volta de 20µm de diâmetro, contêm o citoplasma
basófilo, apresentam dois ou mais nucléolos proeminentes e não apresentam grânulos. Não
são coradas com reagentes citoquímicos positivos para granulócitos e monócitos, e não
apresentam reação com peroxidase; entretanto, são fortemente reativas com fosfatase ácida
(JAMIESON, 2008; KOEFFLER & GOLDE, 1980). As células K562 são arredondadas,
agrupam-se em formato de “cachos” (Figura 2B) e são satisfatoriamente cultivadas na
concentração de 1x105 células /mL (LOZZIO & LOZZIO, 1973). Multiplicam-se
rapidamente, sendo os repiques realizados quando a confluência celular chega a cerca de 80%.
24
Com cerca de 48 a 72 horas sem serem repicadas, o pH do meio diminui e adquire uma
coloração amarela ou laranja, indicando a necessidade de meio fresco com pH ajustado para
7,2 (PERES & CURI, 2005).
As células da linhagem eritroleucêmica humana K562 são hematopoiéticas malignas,
com cromossomo Filadélfia positivo e apresentam alta capacidade de proliferação e bloqueio
de vias que disparam a apoptose; sendo assim, um interessante modelo de estudo para
identificação e/ou desenvolvimento de novas drogas, capazes de induzir morte celular.
Figura 2. Células K562, com baixa (A) e alta confluência (B) e cultivadas em meio RPMI 1640, suplementado com 10% de soro bovino fetal, L-glutamina 0,2mmo/L, penicilina 0,1mg/mL e streptomicina 0,1mg/mL (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO, USA). As células K562 foram mantidas em estufa com 5% de CO2 a 37ºC. Os repiques foram realizados a cada 72 horas e a viabilidade celular foi determinada utilizando o corante de exclusão Azul de Tripan 0,16% (m/v) em câmara de Neubauer. Microscopia óptica (200X).
1.4. Morte Celular
Estímulos metabólicos e terapêuticos podem de maneira simultânea provocar uma série
de respostas adaptativas e sinais de morte celular. A soma do programa de adaptação e sinais
de morte determina o destino da célula: morte ou sobrevivência celular (HENRIQUEZ et al.,
2008; LOCKSHIN & ZAKERI, 2004).
A morte celular pode ser classificada de acordo com seus aspectos morfológicos
(apoptose necrose e autofagia), os critérios enzimológicos (com ou se envolvimento de
nucleases ou de classes distintas de proteases, como caspases, calpaínas, catepsinas e
transglutaminases), aspectos funcionais (programada ou acidental, fisiológica ou patológica),
ou imunológicos (imunogênico ou não imunogênico). Além disso, conforme as
recomendações do Comitê de Nomenclatura de Morte Celular (NCCD) em 2009 outras
tentativas de definição de modalidade de morte celular atípicas vêm sendo descritas como:
A B
25
mitose catastrófica, necrapoptose, piroptose, pironecrose, entose, paraptose, dentre outras
(KROEMER et al., 2009).
A Figura 3 mostra um esquema das principais vias que podem disparar o processo de
morte celular: apoptose, necrose e autofagia. Além disso, ilustra também, uma morte celular
denominada de piroptose, uma modalidade atípica de morte celular.
A apoptose é definida como um processo fisiológico, desencadeado a partir da
sinalização por receptores de membrana e/ ou por de sinais de estresse, que acarretam
respostas mitocondriais. A execução do programa apoptótico ocorre a partir da liberação de
proteínas pró-apoptóticas, ativação de caspases e a eliminação das células afetadas sem
geração de resposta inflamatória (AFFORD & RANDHAWA, 2000; ELMORE, 2007). Em
contrapartida, a necrose induz tumefação no citosol e em organelas, que aumentam de volume
e sofrem lise, liberando seus conteúdos para o espaço extracelular, causando reações
inflamatórias (HAN, et al 2008). A oncose é uma nova caracterização de morte celular,
definida como uma alteração pré-letal que precede a morte necrótica (MAJNO & JORIS,
2005; TRUMP et al., 1997). A morte celular autofágica é caracterizada pelo aparecimento de
vesículas citoplasmáticas com dupla ou multimembrana (autofagossomos) envolvendo
organelas como retículo endoplasmático e mitocôndria. Os autofagossomos completos
fundem com lisossomos, para que ocorra a degradação do conteúdo citoplasmático
(GOZUACIK & KIMCHI, 2004; KROEMER & JÄÄTTELÄ, 2005).
Recentemente, vem sendo descrita uma nova forma de morte celular, denominada
piroptose, que é dependente apenas da caspase -1 e ocorre e, especificamente, em células
infectadas por Salmonella e Shigella. A morte celular por piroptose ainda não permanece bem
esclarecida; entretanto, sabe-se que este tipo de morte envolve uma combinação distinta das
características dos processos de apoptose e de necrose. Células piroptóticas apresentam
desacoplamento da fosforilação oxidativa, a fragmentação do DNA e a condensação nuclear,
assim como células apoptóticas. Por outro lado, ocorre a ruptura da membrana plasmática,
com liberação de citocinas e de conteúdo citoplasmático e desenvolvimento de um potente
evento inflamatório, semelhante ao que ocorre no processo de necrose (FINK & COOKSON,
2005; FRANCHI et al., 2005).
26
Figura 3. Diferentes tipos de morte celular. Células respondem aos estímulos de morte iniciando uma série de eventos moleculares que disparam a apoptose. A apoptose envolve a ativação de uma cascata de eventos, envolvendo a ativação de caspases iniciadoras e efetoras, a fragmentação de DNA com padrão característico (ladder), que é resultante da clivagem de nucleossomos, e alterações morfológicas como encolhimento celular, a condensação e a fragmentação da cromatina nuclear e formação de corpos apoptóticos prontamente fagocitados por células vizinhas. Na ausência de fagocitose, corpos apoptóticos podem sofrer lise e gerar reação inflamatória. Este processo é conhecido como necrapoptose. A autofagia é um mecanismo de degradação de componentes citoplasmáticos pelos lisossomos, sendo mediada através de vacúolos autofágicos. Alterações morfológicas observadas na autofagia incluem presença de vacúolos autofágicos que ocupam o citosol e uma discreta condensação da cromatina. A oncose é um caminho pré-letal que antecede a necrose e apresenta, como características, a tumefação de celular e de organelas, a degradação da membrana e eventual liberação de conteúdo inflamatório. A piroptose é uma via de morte mediada pela ativação da caspase -1, uma protease capaz de ativar citocinas inflamatórias, IL-1β e IL-18. Nesta via, também ocorre o processo de lise celular, com geração de resposta inflamatória. Adaptado de Fink & Cookson (2005).
27
1.4.1. Apoptose
A apoptose representa uma forma especial de morte celular que permite a eliminação
segura e controlada das células no momento em que tiverem cumprido a sua função biológica,
e atua como um processo antagônico à mitose. Este tipo de morte celular ocorre
fisiologicamente, por exemplo, para a eliminação de células senescentes, de células infectadas
por vírus e de células com lesões ou mutações no DNA, que podem levar ao desenvolvimento
de câncer (HATZOLD & CONRADT, 2008; AFFORD & RANDHAWA, 2000; BURSCH et
al., 2000). No entanto, a apoptose pode ocorrer indevidamente em algumas patologias, como
nos danos causados por radicais livres, doenças neurodegenerativas induzidas por
xenobióticos, entre outras (SMAILI et al., 2003).
A apoptose possui alterações morfológicas marcantes, bem como o encolhimento
celular e a condensação e fragmentação da cromatina (picnose e cariorrexe). Além disso, a
membrana plasmática de células apoptóticas sofre extensão com formação de blebs (bolhas),
os quais aumentam de número e tamanho e rompem, originando estruturas celulares
denominadas corpos apoptóticos. Estes corpos apoptóticos são facilmente reconhecidos,
fagocitados e removidos por macrófagos ou células vizinhas sem desencadear processo
inflamatório (ELMORE, 2007).
Células apoptóticas e fragmentos celulares são facilmente reconhecidos e fagocitados
por macrófagos e células vizinhas, devido à translocação de fosfatidilserina do lado interno
para o lado externo da membrana plasmática. A externalização dos resíduos de fosfatidilserina
em células apoptóticas pode ser detectada usando a proteína Anexina V marcada (PERES &
CURI, 2005).
Alterações bioquímicas também podem ser observadas no processo, bem como a
ativação de uma cascata enzimática e um padrão próprio de fragmentação do DNA resultante
da clivagem da fita entre os nucleossomos. Estes fragmentos oligonucleossômicos podem ser
separados pela técnica de eletroforese em gel de agarose, formando um padrão de bandas
conhecidas como escada de DNA (ladder) (KOEFFLER & GOLDE, 1980; PERES & CURI,
2005).
O mecanismo de regulação deste processo conta com o envolvimento de diversos
grupos de proteínas, como, por exemplo, membros da família Bcl-2 que desempenham
importantes papéis durante a apoptose em condições fisiológicas e patológicas e regulam a
integridade da membrana mitocondrial externa, induzindo e impedindo a permeabilização da
28
mesma. Entre os membros da família Bcl-2, há proteínas pró-apoptóticas, como Bax, Bid,
Bad e Bak, e proteínas antiapoptóticas, como Bcl-2 e Bcl-XL (PETROS et al., 2004).
Outro grupo importante de proteínas envolvidas na apoptose é o conhecido como gupo
das caspases. Pertencentes à família das cisteíno-proteases, estas enzimas são sintetizadas
como precursores inativos, que são convertidos para a forma ativa por clivagem proteolítica,
catalisada por outras caspases. Dentro deste grupo, há as caspases iniciadoras (caspase-2,
caspase-8 e caspase-10), que ativam as caspases efetoras (caspase-3, caspase-6 e caspase-7).
Algumas caspases podem clivar, também, outras proteínas que participam da regulação da
apoptose, como, por exemplo, a clivagem de Bid pela caspase-8, que promove a sua
translocação do citosol para a mitocôndria, causando liberação de fatores pró-apoptóticos para
o citosol (NUÑEZ et al., 1998; WANG et al., 2005).
Além disso, algumas proteínas podem induzir a apoptose de forma caspase-
independente, como é o caso do fator indutor de apoptose (Apoptosis Inducing Factor, AIF) e
endonuclease G, que atuam diretamente na condensação da cromatina e fragmentação
internucleossomal do DNA (ARMSTRONG, 2006; BRÖKER et al., 2005).
A indução de apoptose pode ocorrer através de via extrínseca (via receptor de morte) ou
intrínseca (via mitocondrial). Na via extrínseca, o disparo da apoptose ocorre por meio de
ativação de receptores de morte: Fas, TNFR-1 e TRAIL-R1, localizados na membrana
plasmática, por polipeptídeos sinalizadores, pertencentes à família fator de necrose tumoral
(TNF) (FESIK et al., 2000) . Na via intrínseca, a principal organela envolvida no processo é a
mitocôndria. Estímulos de morte, como um aumento súbito de Ca2+ na citosol e a subsequente
captação pela mitocôndria, induzem a uma rápida transição da permeabilidade da membrana
mitocondrial (TPM). Esse fenômeno, conhecido TPM, ocorre devido à abertura de um poro
de transição de permeabilidade mitocondrial (PTPM) e é dependente de acumulo de Ca2+ na
matriz (FRANCHI et al., 2009; LOTSCHER, et al., 1979; WEIS et al., 1972; LEMASTERS
et al., 1979).
A TPM está associada à perda da seletividade da membrana mitocondrial interna que
resulta na dissipação do ∆Ψ (potencial de membrana mitocondrial), detectado com o auxílio
de marcadores fluorescentes lipofílicos catiônicos, capazes de acumular na mitocôndria
conforme o ∆Ψ (PERES & CURI, 2005; MATHUR et al., 2006, CASTEDO et al., 2006). A
dissipação do ∆Ψ e o inchamento osmótico da mitocôndria causam o rompimento da
membrana mitocondrial externa e a liberação de proteínas apoptóticas, como citocromo c,
segundo ativador mitocondrial de caspase (Smac), também conhecido como Diablo,
29
HtrA2/Omi (High-temperature requirement protein A2) e endonuclease G (BELIZÁRIO et
al., 2007; HALESTRAP et al., 2007).
O citocromo c, liberado pelas mitocôndrias para o citosol, interage com o fator ativador
de proteases apoptóticas 1 (Apaf-1) e, na presença de dATP, forma um complexo
multimérico, o apoptossoma, capaz de recrutar a pró-caspase 9 promovendo sua autoclivagem
em caspase 9, a qual catalisa a ativação de caspases efetoras para a proteólise dos
constituintes celulares (FESIK, 2000).
A TPM pode ser disparada por situações de estresse oxidativo. Espécies reativas de
oxigênio (EROs) são geradas continuamente em baixas quantidades, durante o transporte de
elétrons na cadeia respiratória e, normalmente, são eliminadas de forma eficiente por enzimas
que fazem parte de um complexo sistema de defesa antioxidante. Algumas condições ou
substâncias químicas que aumentem a geração de EROs podem conduzir ao acúmulo de
H2O2, exceder a capacidade de defesa e gerar uma situação conhecida como estresse
oxidativo, que está associada a danos oxidativos em macromoléculas biológicas, como, por
exemplo, a lipoperoxidação da membrana mitocondrial e a oxidação de grupos tiólicos de
proteínas (VERCESI et al., 1987; AON et al., 2007; KINSEY et al., 2007, KOWALTOWSKI
et al., 2001).
As vias extrínseca e intrínseca podem estar interligadas, uma vez que a caspase -8, que é
ativada pela via extrínseca, pode ativar Bid, que, por sua vez, age ativando a via intrínseca,
com a inativação das proteínas anti-apoptóticas da família Bcl-2 e com a ativação de Bax/Bak,
que agem na permeabilização da membrana mitocondrial, conforme pode ser observado na
Figura 4.
É bem estabelecido o envolvimento da mitocôndria no disparo e/ou na regulação da
apoptose. Desta forma, alguns ensaios foram desenvolvidos para avaliar eventos
mitocondriais ligados à apoptose. A microscopia confocal é uma ferramenta muito potente e
comumente utilizada com células íntegras para a avaliação de eventos mitocôndrias, como
TPM, despolarização da membrana mitocondrial interna, fluxos de Ca2+, estado redox da
mitocôndria e geração de EROs (AFFORD & RANDHAWA, 2000).
30
Figura 4. Vias de ativação de apoptose. A apoptose pode ocorre por duas cascatas bioquímicas, que são conhecidas como via extrínseca ou intrínseca. A apoptose via extrínseca é mediada através de receptores específicos de membrana como, FAS e TNFR1 que ativam a caspase -8, que por sua vez ativa caspase -3 promovendo o disparo da apoptose. A apoptose via intrínseca, é mediada através de estímulos intracelulares, bem como, aumento súbito de Ca2+ ou aumento da geração de espécies reativas de oxigênio. Tais estímulos podem induzir a permeabilização da membrana mitocondrial (PMM) e liberação de proteínas apoptóticas como o citocromo c para citosol. Este interage com APAF-1 com formação de apoptossoma e ativação de caspase -9, que promove assim a ativação de uma cascata de caspases, tais como a caspase -3, desencadeando o processo de apoptose. A PMM também pode ativar mecanismos independentes da ativação de caspases que eventualmente podem executar o processo de morte celular. Além disso, as vias, extrínseca e intrínseca também podem estar interligadas uma vez que a caspase -8, pode levar a ativação de Bid que pode promover a PMM por inativação de proteínas anti-apoptóticas da família Bcl-2 Adaptado de Galluzzi, et al. (2009).
Além do envolvimento mitocondrial na apoptose, outras organelas podem participar do
processo. Recentemente, foi apontado o envolvimento de lisossomos na apoptose. Lisossomos
são organelas envoltas por membrana, que contêm uma variedade de enzimas capazes de
hidrolisar todos os tipos de polímeros biológicos (proteínas, carboidratos, ácidos nucléicos e
lipídeos). Têm como função a degradação de material captado do exterior da célula, bem
como a digestão de componentes obsoletos em meio intracelular (COOPER & HAUSMAN,
2007).
31
Algumas enzimas lisossomais, em especial as cisteíno-proteases catepsinas B e L, têm
sido implicadas em processos fisiopatológicos que envolvem intensa remodelação da matriz
extracelular, por promoverem a proteólise de seus componentes, tais como a angiogênese, o
turnover (renovação) da matriz extracelular, bem como em processos tumorais invasivos e
metastáticos em geral (MIGNATTI & RIFKIN, 1993). Além dessa função de degradação de
proteínas da matriz extracelular em processos fisiológicos ou patológicos, as catepsinas
lisossomais parecem estar envolvidas na indução da apoptose (BUCK et al., 1992; FU et al.,
1998).
Alterações marcantes podem ser vistas no compartimento lisossomal de células
tumorais, durante a imortalização e a transformação, que elevam a sensibilidade de morte
celular através da via lisossomal (Figura 5). Durante a imortalização, podemos observar
alterações como uma elevação da sensibilidade da membrana dos lisossomos a agentes
lisossomotrópicos e um aumento de volume e de compartimentos ácidos da organela. Já na
transformação, pode ser observada uma elevação na expressão gênica e secreção das cisteíno
catepsinas, um aumento do tráfego de lisossomos e o aparecimento da proteína Hsp70 na
membrana lisossomal, que induz à maior estabilidade da membrana (FEHRENBACHER, N.
& JAATTELA, 2005).
Imortalização Transformação
Elevação da sensibilidade da membrana lisossomal a agentes
lisossomotrópicos
Aumento de volume de compartimentos ácidos
Elevação da sensibilidade de morte celular pela via lisossomal
Aumento da expressão de cisteíno catepsinas
Alteração no tráfego dos lisossomos
Aumento de secreção de catepsinas
Aparecimento de Hsp70 na membrana lisossomal > estabilidade
da membrana lisossomal
Lisossomos
Imortalização Transformação
Elevação da sensibilidade da membrana lisossomal a agentes
lisossomotrópicos
Aumento de volume de compartimentos ácidos
Elevação da sensibilidade de morte celular pela via lisossomal
Aumento da expressão de cisteíno catepsinas
Alteração no tráfego dos lisossomos
Aumento de secreção de catepsinas
Aparecimento de Hsp70 na membrana lisossomal > estabilidade
da membrana lisossomal
Lisossomos
Figura 5. Alterações no compartimento lisossomal durante a imortalização e a transformação. Adaptado de Fehrenbacher & Jäätellää, M (2005).
A catepsina B possui atividade de protease ativadora de morte celular, dependente e
independente de caspases, e é capaz de disparar mecanismos que induzem apoptose em
32
células tumorais. Foi demonstrado que a morte celular de células infectadas por papiloma
vírus humano (HPV), via complexo inibitório da oncoproteína E7 do HPV e p21, está
associada à ativação da catepsina B. Também foi observado que a ativação de apoptose, pela
catepsina B, ocorre tanto em células tumorais com mutações em caspases quanto em células
com superexpressão de proteínas Bcl-2 e p21 (KAZNELSON et al., 2004).
Drogas antitumorais que induzem a permeabilização da membrana lisossomal (PML)
promovem a liberação de catepsinas B e D para o citosol, que, por sua vez, podem induzir
apoptose dependente de Bax. Esses compostos que promovem a translocação de enzimas
lisossomais para o citosol induzem morte celular independentemente de p53 (ERDAL et al.,
2005). Além disso, tem sido observado que o TNF-R1, além de ativar caspases, também
promove apoptose mediada pela mobilização de enzimas lisossomais para o citosol (Figura
6). Antagonicamente, o fator de transcrição NF-kappaB é capaz de bloquear o efeito pró-
apoptótico do TNF, pela indução da expressão de uma proteína inibidora da atividade de
catepsina B, denominada serine protease inhibitor 2A (Spi2A) (LIU et al., 2003).
Dados da literatura têm mostrado que a catepsina B é capaz de clivar a proteína Bid na
sua forma pró-apoptótica tBid e degradar a enzima SK-1, que é inibidora de apoptose
(CIRMAN et al., 2004; TAHA et al., 2005). Desta forma, as enzimas lisossomais,
particularmente a catepsina B, têm sido diretamente implicadas no controle da apoptose.
Lisossomo Mitocôndria
Apoptossomo
CisteCisteíínonocatepsinacatepsina
Morte Celular Programada
Lisossomo Mitocôndria
Apoptossomo
CisteCisteíínonocatepsinacatepsina
Morte Celular Programada
Figura 6. Apoptose induzida via ativação de TNF-R1. TNF promove a ativação da caspase -8, que medeia a apoptose pela via mitocondrial pela ativação de Bax/Bak. A ativação de Bax/BAk promove a liberação do citocromo c, que leva à montagem do apoptossoma. No apoptossoma, a caspase -9 é clivada e as caspases -3 (e -7) são ativadas promovendo o disparo da apoptose. Em paralelo, a clivagem da caspase -8 leva à ativação da caspase -9, o que promove a apoptose, mediada pela permeabilização da membrana lisossomal e a mobilização de cisteíno catepsinas para citosol. Adaptado de Gyrd-Hansen, et al. (2006).
33
1.4.2. Necrose
A necrose, em contrapartida à apoptose, é um processo desordenado de morte celular,
causado por fatores que levam à lesão celular irreversível e, consequentemente, à morte
celular (KROEMER et al., 2009; HAN et al., 2008). Durante esse processo, podem ser
observadas alterações metabólicas marcantes, tais como depleção de ATP, diminuição da
capacidade de manutenção da homeostase celular, influxo de água e íons intracelulares e
perda de integridade de membrana. A diminuição dos níveis de ATP interfere na função da
bomba de Na+/K+ e leva à tumefação celular, devido ao acumulo de Na+. Isto promove o
rompimento da membrana plasmática e a liberação de conteúdo citoplasmático, inclusive
enzimas lisossomais, para o meio extracelular, o que resulta em lesão tecidual e resposta
inflamatória (BOUJRAD et al., 2007; GOLSTEIN, et al., 2006).
Estudos têm demonstrado que alguns receptores de morte podem estar envolvidos com
a morte celular induzida por necrose, bem como receptor de proteína quinase-1 (RIPK1) e o
fator de necrose tumoral associado a fator-2 (TRAF-2) (Figura 7).
Figura 7. Regulação da necrose. A necrose ocorre e partir da ativação de receptores de morte RIPK1 e TRAF2. Tal ativação impede a associação da ciclofilina D (Cyc. D) com translocador de nucleotídeos de adenina (ANT) na mitocôndria. A depleção de NAD+ e de ATP resulta em acumulo de Ca2+ e espécies reativas de oxigênio (EROs), seguido por ativação de calpaínas, liperoxidação e rompimento da membrana plasmática. Adaptado de Amaravadi & Thompson (2007)
34
Após a sinalização ou dano induzido por lesões, a necrose pode disparar uma sequência
de eventos intracelulares, como disfunção mitocondrial, aumento da geração de EROS,
depleção de ATP, falha na manutenção da homeostase de Ca2+, proteólise por calpaínas e
catepsinas, ruptura da membrana lisossomal e início de ruptura de membrana plasmática.
Além disso, pode ocorrer também a inibição de proteínas específicas, que regulam os
processos de apoptose e autofagia (EGUCHI et al., 1997; GOLSTEIN et al., 2006).
A TPM desempenha papel importante, tanto na apoptose quanto na necrose. Entretanto,
a necrose ocorre quando a TPM causa depleção rápida de ATP, enquanto o processo de
apoptose é disparado quando a TPM ocorre sem exaustão de ATP (LEMASTERS et al., 1999;
EGUCHI et al., 1997).
A “necrose clássica” foi, por muitos anos, descrita como um tipo de morte transtornada
e acidental, um tipo morte que ocorre em resposta a eventos patológicos e que incide de
maneira rápida, com liberação descontrolada de conteúdo inflamatório que afeta populações
celulares vizinhas. No entanto, estudos recentes demonstram que morte celular por necrose,
algumas vezes, pode ocorrer como um evento regulado, em alguns processos fisiológicos,
como renovação celular e resposta imune (HENRIQUEZ et al., 2008). Esse processo, capaz
de exibir aspectos de morte celular programada, é chamado de necrose programada e pode
ocorrer como resposta à sinalização extracelular, ou pode ser iniciado como resposta a
perturbações intracelulares. A morte celular por necrose pode ser induzida por diversos
agentes ou situações, tais como: doença cardiovascular oclusiva, doenças neurodegenerativas,
infecções virais, fármacos, isquemia-reperfusão ou tratamento do câncer (ZONG et al., 2006).
Além disso, a resposta imune causada pelo processo necrótico apresenta importância
fisiológica em algumas situações, como infecção viral. Alguns vírus são capazes de codificar
inibidores de caspases, para evitar que acorra a apoptose da célula hospedeira. Nestes casos,
pode ocorrer a ativação de necrose como uma via alternativa, uma vez que o forte estímulo,
produzido pela necrose, promove a migração de células de defesa (PROSKURYAKOV et al.,
2003).
Foi demonstrado que, em algumas situações, podem ser observadas alterações
morfológicas características tanto de necrose quanto de apoptose, no mesmo tecido, ou até
mesmo, na mesma célula, processo este chamado de necrapoptose (HAN et al., 2008). A
necrapoptose é um mecanismo regulado de morte celular, que ocorre caspase-independente e
apresenta características morfológicas semelhantes à necrose, incluindo disfunção
mitocondrial e perda de integridade de membrana (KITANAKA & KUCHINO, 1999;
HENRIQUEZ et al., 2008).
35
1.4.3. Autofagia
A autofagia é um processo que ocorre em função da fisiologia normal sendo o maior
mecanismo regulador de turnover (renovação) de proteínas e organelas. Este processo
envolve a degradação de componentes citoplasmáticos nos lisossomos. É um processo
mediado por uma única organela, o autofagossomo, facilmente identificado por microscopia
eletrônica (MIZUSHIMA, 2007).
Figura 8. Papel da autofagia na privação nutricional e ausência de fatores de crescimento. A privação de nutrientes e/ou a privação nutricional disparam a sinalização de vias que estimulam a autofagia. A autofagia envolve sequestro de material citoplasmático e formação de um vacúolo dupla membrana, denominado autofagossomo. O autofagossomo se funde com lisossomos para a formação do autofagolisossomo, onde o material é degradado. A degradação de lipídeos e proteínas gera, como produtos, ácidos graxos e aminoácidos, que podem ser utilizados para manter a produção de ATP e a síntese de proteínas promovendo a sobrevivência celular. Adaptado de Levine & Yuan (2005).
A autofagia é induzida em resposta à ausência de fatores de crescimento, à privação
nutricional e de hormônios, ao estresse em retículo endoplasmático, ao acúmulo de proteínas
desnaturadas, radiação, sinalização de Ca2+ e drogas anticâncer (LEVINE, B & YUAN,
Privação
nutricional
Ausência de fatores de
crescimento
Diminuição de nutrientes extracelulares
Diminuição de nutrientes intracelulares
Degradação de material citoplasmático
Estrutura pré-autofagossomal
Autofagia
Material citoplasmático
Bloqueio na absorção de nutrientes
Sensores de nutrientes
Sinalização de eventos
Isolamento de
membrana
Autofagossomo
Lisossomo
Autolisossomo
Aminoácidos Ácidos graxos
Mitocôndria
Ciclo de Krebs
Síntese de proteínas
Sobrevivência celular
Privação
nutricional
Ausência de fatores de
crescimento
Diminuição de nutrientes extracelulares
Diminuição de nutrientes intracelulares
Degradação de material citoplasmático
Estrutura pré-autofagossomal
Autofagia
Material citoplasmático
Bloqueio na absorção de nutrientes
Sensores de nutrientes
Sinalização de eventos
Isolamento de
membrana
Autofagossomo
Lisossomo
Autolisossomo
Aminoácidos Ácidos graxos
Mitocôndria
Ciclo de Krebs
Síntese de proteínas
Sobrevivência celular
36
2005). A autofagia, além participar no turnover de proteínas e agir na reciclagem de organelas
intracelulares, sob condições de privação de nutrientes é um recurso para sobrevivência,
sendo que os componentes citosólicos degradados geram moléculas para sustentar a síntese
macromolecular e a geração de ATP (Figura 8) (KUNDU & THOMPSON, 2008; LEVINE,
et al 2008; LEVINE & YUAN, 2005; HOYER-HANSEN, 2007)
São descritos três tipos de autofagia (Figura 9) sendo eles: microautofagia,
macroautofagia e autofagia mediada por chaperonas. A micro e a macroautofagia envolvem
um rearranjo eficaz de membranas, que resulta na capacidade de envolver grandes estruturas.
A microautofagia consiste no sequestro de componentes citosólicos, pela invaginação direta
da membrana lisossomal; em contrapartida, a macroautofagia envolve a formação de
vesículas citosólicas de dupla membrana, denominadas autofagossomos, os quais se fundem
com o compartimento lisossomal para que ocorra a degradação. A autofagia mediada por
chaperonas é um processo específico, para proteínas que são marcadas pelo pentapeptídeo
KFERQ (Lys-Phe-Glu-Arg-Gln). Este complexo então se liga a Receptor Lysosome-
Associated Membrane Protein Type-2A (LAMP-2A), localizado na membrana lisossomal que
é responsável pela translocação de proteínas para o lúmen lisossomal (DICE, 2007; TARDY,
et al 2006, YEN & KLIONSKY, 2006).
Figura 9. Esquema de diferentes tipos de autofagia. Os três tipos de autofagia descritos são: microautofagia, macroautofagia e autofagia mediada por chaperonas. Dependendo da especificidade do conteúdo, a autofagia pode ser um processo seletivo ou não-seletivo. No processo de autofagia não-seletivo uma porção do citoplasma é sequestrada dentro de uma dupla membrana, o autofagossomo, o qual se funde com o lisossomo para que haja a degradação. Em contrapartida, o processo de autofagia seletivo, ocorre à degradação específica de algumas organelas. Em certas condições, pode ocorrer por macro ou microautofagia, e recebem nomes específicos como, por exemplo, macropexofagia, micropexofagia e mitofagia. (Yen & Klionsky 2008).
37
A autofagia é um mecanismo defensivo e protetor, e pode agir como estratégia de
sobrevivência celular; entretanto, dependendo do estímulo, a autofagia pode evoluir para um
mecanismo de morte celular (BERGMANN, 2007). A morte celular autofágica é uma forma
de morte celular programada, morfologicamente distinta da apoptose, que ocorre devido à
ocorrência excessiva de autofagia. Na morte celular autofágica, em contraste com a apoptose,
ocorre a degradação precoce das organelas, com preservação de elementos do citoesqueleto
(KROEMER & LEVINE, 2008).
Algumas características em comum com a apoptose podem ser observadas na morte
celular autofágica, como, por exemplo, a formação de blebs de membrana. A comparação das
características dos dois tipos de morte celular programada pode ser observada na Tabela 1.
Tabela 1. Caracterização de morte celular apoptótica e autofágica
Apoptose
Autofagia
Núcleo
Condensação da cromatina Núcleo picnótico Fragmentação de DNA (ladder)
Condensação parcial da cromatina Pode ou não apresentar núcleo picnótico Núcleo intacto até estágios tardios Não há fragmentação de DNA
Citoplasma
Condensação do citoplasma Fragmentação celular com formação de corpos apoptóticos Liberação de proteases lisossomais pode estar envolvida TPM frequentemente envolvida Caspase dependente
Aumento do número de vesículas autofágicas Aumento do número de autolisossomos Aumento da atividade lisossomal Dilatação co complexo golgi, e algumas vezes, do retículo endoplasmático TPM pode estar envolvida Caspase independente
Membrana celular
Blebs
Blebs
Métodos de detecção
Microscopia eletrônica Detecção de fragmentação nuclear e de DNA Testes de ativação de caspases Testes de clivagem de substratos de caspases Coloração TUNEL Teste com marcação de anexina V/FTIC
Microscopia eletrônica Teste avaliando aumento de atividade lisossomal. (marcação com alaranjado de acridina ou lysotracker) Testes com marcação do monodansilcadaverina (MDC)- marcador de vacúolos autofágicos Localização de LC3
38
1.5. Fenotiazinas Apresentam um Grande Potencial Antitumoral
As fenotiazinas são neurolépticos utilizados no tratamento da esquizofrenia, no controle
de desordens psicológicas, no tratamento de mania, ansiedade e agitação psicomotora
(LEHMANN, 1997). Além disso, alguns derivados podem ser utilizados, também, como
antieméticos e anti-histamínicos (BHARGAVA & CHANDRA, 1963; ALLAN, 1987;
MORAK-MŁODAWSKA & JELEŃ, 2007).
Estruturalmente, as fenotiazinas possuem uma estrutura básica de três anéis, onde dois
anéis benzênicos estão ligados por um átomo de enxofre e um de nitrogênio, conhecido como
núcleo tiazínico (Figura 10).
Figura 10. Estrutura química do núcleo tiazínico
As substituições no núcleo fenotiazínico estão no carbono 2 e no nitrogênio 10. Em
função do grupo lateral substituinte na posição 10, esses fármacos podem ser subdivididos em
três subclasses: os alifáticos, cujo principal representante é a clorpromazina, os piperazínicos,
os quais incluem a trifluoperazina e a flufenazina, e os piperidínicos, sendo a tioridazina é o
principal representante (Figura 11) (BALDESSARINI & TARAZI, 1989).
A natureza do ligante, na posição 10, influencia na atividade farmacológica; e o ligante
eletronegativo na posição 2 aumenta a eficácia da droga. Apesar de serem efetivas, no
tratamento de desordens psiquiátricas, as fenotiazinas não possuem um mecanismo de ação
simples, atuando no bloqueio de receptores dopaminérgicos D2, α2-adrenérgicos,
muscarínicos, colinérgicos, histamínicos e serotoninérgicos, porém sem um alvo específico
(MARUOKA et al., 2007).
Alguns efeitos secundários podem ser exibidos por pacientes que utilizam fenotiazinas,
como: distúrbios extrapiramidais (DENVIR et al., 1998), torsades de pointe (taquicardia
ventricular polimórfica) com morte súbita cárdica (GLASSMAN & BIGGER, 2007),
agranulocitose (ROSENTHAL et al., 1967) e erupções fotoalérgicas (EBERLEIN-KONIG et
al., 1997; ELISEI et al., 2002). As fenotiazinas são metabolizadas no sistema microssomal
hepático sofrendo S-oxidação no núcleo tiazínico, bem como hidroxilação aromática (LIN et
al., 1993). Tem sido relatado que alguns pacientes podem apresentar hepatotoxicidade grave,
S
N
39
associada ao uso clínico de fenotiazinas, o que inclui colestase intra-hepática (MORADPOUR
et al., 1994; GOODMAN, 2002), esteatose (BRIND, 2007) e hepatite (WEIDEN &
BUCKNER, 1973). Entretanto, os mecanismos moleculares de indução de hepatotoxicidade
pelas fenotiazinas permanecem não completamente compreendidos.
Alguns desses efeitos biológicos podem estar relacionados com a característica
anfifílica da droga, na qual o núcleo tiazínico é relativamente hidrofóbico, enquanto que a
cadeia lateral é hidrofílica e dependendo o pH do meio, positivamente carregada. Devido a
essa característica, as fenotiazinas são capazes de se autoagregar e de formar estruturas do
“tipo micelas”, que interagem com domínios hidrofóbicos de proteínas e de sistemas
heterogênicos, como os lipossomos e as membranas biológicas (LUXNAT & GALLA, 1986).
S
N
N
SCH3
S
N CF3
N
N
OH
S
N CF3
N
N
TIORIDAZINA
FLUFENAZINA TRIFLUOPERAZINA
Figura 11. Estrutura química dos representantes das subclasses das fenotiazinas. Alífáticos (clorpromazina), piperidínicos (tioridazina) e pioerazínicos (flufenazina e trifluoperazina).
S
N Cl
N
CLORPROMAZINA
40
Estudos demonstraram que a clorpromazina em torno de 100 µmol/L é capaz de formar
poros nas membranas de 14Å, aproximadamente, devido a modificações estruturais sendo que
tal efeito pode estar relacionado com a penetração da droga no centro hidrofóbico da
membrana, o que aumenta a mobilidade das cadeias de hidrocarbonetos (LIEBER, et al
1984). A tioridazina interage com as membranas de forma dependente da concentração e
altera os parâmetros de transição de fase, pela indução da perturbação na região dos grupos de
cabeças polares e pela redução da entalpia. Isso indica que a droga interage com a face
polar/apolar da bicamada (WESOLOWSKA et al., 2004). Outros relatos mostram a interação
direta das fenotiazinas com a membrana plasmática de hemácias, o que induz mudanças no
formato celular e, até mesmo, a hemólise (MONCELLI &BECUCCI, 1992;
HÄGERSTRAND, & ISOMAA, 1992). O mesmo ocorre com plaquetas (HOLMSEN, H &
RYGH, 1990; THARMAPATHY et al., 2000).
As fenotiazinas compõem uma classe de substâncias com estruturas químicas muito
interessantes e apresentam efeitos biológicos diversificados, muitas vezes paradoxais,
descritos na literatura. Estudos com mitocôndrias isoladas mostraram que a trifluoperazina é
capaz de inibir a F1Fo-ATP sintase (DABBENI-SALA & PALATINI, 1990) e proteger a
mitocôndria de danos induzidos por pró-oxidantes em presença de Ca2+ (PEREIRA et al.,
1992) bloqueando a segunda fase da oxidação de NAD(P)H, induzida pelo pró-oxidante (tert-
butil hidroperóxido) t-BOOH, e inibe, parcialmente, a geração de EROs e a indução da TPM
(NIEMINEN et al., 1997). Um estudo caracterizou o potente efeito antioxidante da tioridazina
em mitocôndrias isoladas e demonstrou sua correlação com a inibição da TPM e liberação de
citocromo c. Isso sugere que tais compostos apresentam potencial para modular a apoptose
induzida por esta via (RODRIGUES, et al., 2002).
Em estudos usando sistemas celulares, foi observado que a tioridazina inibiu a
proliferação de células, devido à diminuição do suprimento de ATP, por inibir a via glicolítica
e a F1Fo-ATP sintase (GLASS-MARMOR et al., 1996). Trifluperazina inibiu a apoptose
espontânea de linfócitos CD4+ de pacientes aidéticos, mas, por outro lado, induziu a apoptose
em fibroblastos V79 (PAN et al., 1998; KARMAKAR et al., 2001). Recentemente, foi
observado que a clorpromazina induz apoptose em linfoblastos humanos e em linhagens
leucêmicas em cultura, sem afetar a viabilidade de linfócitos normais (ZHELEV et al., 2004).
Entretanto, o mecanismo de indução de apoptose pelas fenotiazinas permanece não
completamente esclarecido. Uma revisão da literatura, que discute sobre a resistência múltipla
41
de células tumorais a quimioterápicos, aponta que a trifluoperazina (TFP), é capaz de reverter
parcialmente este processo, aumentando eficácia da quimioterapia (SOUZA et al., 2003).
Além disso, a literatura tem mostrado que compostos tiazínicos exibem propriedades
fotoquímicas e fototoxicidade (BHOWMIK et al., 2001; RODRIGUES et al., 2006) sendo
que tais propriedades de fotossensibilização podem promover danos oxidativos em
macromoléculas, causando alteração ou perda de sua função (MOORE, 1997). Esses efeitos,
causados por derivados fenotiazínicos no estado excitado, envolvem danos oxidativos a
proteínas e lipídeos, tais como ácido linoléico ou membranas de eritrócitos (ELISEI et al.,
2002). Um estudo recente com mitocôndrias isoladas mostrou que as fenotiazinas, quando
irradiadas, induzem a lipoperoxidação da membrana mitocondrial sendo este efeito é
diminuído pela adição de butilhidroxitolueno (BHT), um clássico scavenger de radicais livres
sugerindo lipoperoxidação observada é causada por cátions radicais fotogerados das
fenotiazinas (RODRIGUES et al., 2005).
Como dados da literatura e do nosso grupo têm demonstrado que as fenotiazinas
tioridazina (TR), flufenazina (FP) e a trifluoperazina (TFP) exibem efeitos biológicos sobre
mitocôndrias, bem como atividades pró-apoptóticas em células tumorais (KROEMER &
JAATTELA, 2005; MOHAMAD et al., 2004), o estudo do efeito de TR, FP e TFP em células
tumorais em cultura e em organelas, envolvidas no processo de apoptose, torna-se
extremamente importante para a compreensão do mecanismo de morte celular, exibido pelas
drogas, e possível aplicação no tratamento do câncer.
1.6. Justificativa
A LMC é uma doença mieloproliferativa clonal, resultante da transformação neoplásica
da célula progenitora homatopoética. Células de LMC apresentam diversas alterações
morfológicas e funcionais, que contribuem para a resistência aos estímulos de indução de
morte celular. Sendo assim, é de grande valia a descoberta e/ou o desenvolvimento de novos
fármacos, capazes de disparar morte nestes modelos celulares. Além disso, é fundamental o
estudo de mecanismos que disparam a morte celular, com investigação de possíveis vias
alternativas para o tratamento contra a LMC. Fenotiazinas são fármacos antipsicóticos que
apresentam diversas propriedades biológicas interessantes, dentre eles a atividade indutora de
apoptose, em alguns tipos celulares e a diminuição da resistência múltipla de certos tumores a
42
quimioterápicos clássicos (MOTOHASHI, et al., 2000; ZHELEV, et al., 2004 ). Além disso,
publicações anteriores realizadas pelo nosso grupo apontam que as fenotiazinas apresentam
efeitos biológicos sobre mitocôndrias, sendo que, estes efeitos podem estar envolvidos na
capacidade de indução de morte celular por estes compostos. Além disso, nosso grupo
também tem demonstrado que compostos tiazínicos exibem propriedades fotoquímicas e
fototoxicidade em mitocôndrias isoladas (RODRIGUES, et al 2006). Assim, a caracterização
dos efeitos das fenotiazinas em estado fundamental e excitado sobre a morte celular de células
leucêmicas, avaliando seus efeitos sobre lisossomos e mitocôndrias e a possível interligação
entre estas organelas durante o processo de morte celular, torna-se extremamente importante
para compreender os mecanismos bioquímicos pelos quais as fenotiazinas promovem a morte
celular e seu potencial farmacológico e/ou toxicológico.
43
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivos gerais
O presente projeto apresenta como objetivos gerais: (i) caracterizar o efeito indutor de
morte celular das fenotiazinas TR, FP e TFP no estado fundamental, em linhagens leucêmicas
humanas K562, e explorar os mecanismos de indução de morte celular, com base em suas
ações sobre mitocôndrias e lisossomos, para se estabelecer a possível comunicação entre estas
organelas durante o processo de morte celular; e (ii) avaliar o efeito das fenotiazinas
irradiadas sobre a viabilidade de células tumorais em cultura, em comparação com seus
efeitos no estado fundamental.
2.2 Objetivos específicos
Para que os objetivos gerais propostos neste projeto sejam atingidos, propomos as
seguintes metas:
- avaliar o efeito das fenotiazinas em estado fundamental sobre a viabilidade de células
K562 e comparar com células sanguíneas mononucleares normais;
- avaliar se a morte celular induzida pelas fenotiazinas está envolvida com a
externalização da fosfatidilserina;
- avaliar se a morte celular induzida pelas fenotiazinas envolve a ativação das caspases
efetoras -3 e -6;
- avaliar alterações na permeabilização de membrana lisossomal e do potencial de
membrana mitocondrial na presença de fenotiazinas;
- avaliar o efeito das fenotiazinas sobre a homeostase de cálcio nas células K562;
- avaliar o envolvimento de estresse oxidativo na morte celular induzida pelas
fenotiazinas, medindo a geração de espécies reativas de oxigênio (EROs), a oxidação lipídica
de membranas e a quantidade de antioxidantes intracelulares; e,
- avaliar os efeitos das fenotiazinas no estado excitado sobre a viabilidade de células
K562 e comparar com seu efeito em estado fundamental.
44
3. MÉTODO
As fenotiazinas foram adquiridas da Sigma Chemical Co. (St Louis, MO, USA). Todos
os demais reagentes utilizados tiveram o maior grau de pureza disponível comercialmente.
3.1. Linhagem de células K562. As células K562 foram adquiridas do Banco de Células do
Rio de Janeiro (BCRJ), sob a coordenação do Prof. Dr. Radovan Borojevic da Universidade
Federal do Rio de Janeiro. As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Sigma Chem.
Co., St. Louis, MO, USA), suplementado com 10% de soro bovino fetal (CultiLab), L-
glutamina 0,2 mmo/L, penicilina 0,1 mg/mL e streptomicina 0,1mg/mL (Sigma Chem. Co.,
St. Louis, MO, USA) mantidas em estufa com 5% de CO2 a 37ºC. Os repiques foram
realizados a cada 72 horas e a viabilidade celular foi determinada utilizando o corante de
exclusão Azul de Tripan 0,16% (m/v) em câmara de Neubauer (AMERICAN TYPE
CULTURE COLLECTION, 2009 RUMJANECK, 2000).
3.2. Isolamento de células mononucleares. Para obtenção das células mononucleares, foi
realizada a coleta de sangue total da aluna Vivian Matsukura dos Santos, com anticoagulante
EDTA. A separação das células mononucleares foi realizada com a utilização de Ficoll-
Hypaque (Sigma Chem. Co. St. Louis, MO, USA), ajustado a uma densidade de 1,077 ±
0,001, formando duas interfaces separadas. A amostra foi centrifugada 400 g por 30 minutos,
formando três interfaces separadas. Os elementos de maior densidade, tais como agregado de
eritrócitos e os granulócitos, sedimentam rapidamente, o que resulta na sua concentração no
fundo do tubo. Os linfócitos e os monócitos permanecem na interface plasma – Ficoll-
Hypaque. As células mononucleares foram retiradas e ressuspendidas em meio RPMI 1640
(Sigma Chem. Co. St. Louis, MO, USA), suplementado com 10% de soro bovino fetal
(CultiLab) e centrifugadas 400 g por 10 minutos. O sedimento enriquecido em células
mononucleares foi ressuspendido com 3,0 ml de meio RPMI 1640 (PERES & CURI, 2005).
3.3. Teste de exclusão de Azul de Tripan. Células mononucleares e K562 (2x105 por poço)
foram incubadas em meio RPMI 1640 (Sigma Chem. Co.St. Louis, MO, USA), suplementado
com 10% de soro bovino fetal (CultiLab), com fenotiazinas 20 e 50 µmol/L. Para a
determinação de viabilidade, 10µL da suspensão de células foi adicionada à solução de Azul
45
de Tripan 0,016% (90 µL). A contagem realizada em câmera de Neubauer, sendo
consideradas inviáveis as células que incorporaram o corante, e viáveis as que excluíram o
Azul de Tripan (PERES & CURI, 2005).
3.4. Teste de redução de 1-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-3,5-difenilformazan (MTT). Células
K562 e mononucleares normais foram incubadas (2x105 células por poço) em meio RPMI
1640 (Sigma Chem. Co.St. Louis, MO, USA), suplementado com 10% de soro bovino fetal
(CultiLab), com diferentes concentrações de fenotiazinas em uma placa de 96 poços em estufa
com CO2 5%, por 24 horas. Após o período de incubação com as drogas, foi adicionado 10µL
da solução de MTT (5 mg/ml) e as amostras foram incubadas por mais 4 horas. Após este
período, os cristais de formazam, formados pela atividade da enzima succinato desidrogenase
mitocondrial, foram solubilizados pela adição de 100 µL de SDS 10 % (m/v) (em HCl 0,01
mol/L) e incubados por mais 12 horas. Após a leitura em 570 nm, a porcentagem de células
viáveis foi avaliada em relação ao controle sem adição das drogas (100%). A concentração na
qual 50% do efeito máximo da droga é observado - concentração efetiva 50% (EC50) foi
determinada por meio de curva dose-resposta (MOSMANN, 1983). Além disso, foram
avaliados os efeitos de diversos compostos sobre a resposta das células K562 às fenotiazinas
estudadas: Ac-DEVD-CHO 10 µmol/L (inibidor de caspase -3), E-64 10µmol/L (inibidor de
cisteíno proteases), BAPTA-AM 10µmol/L (quelante de Ca2+ intracelular), EGTA 2,5
mmol/L (quelante de Ca2+ extracelular), 3-metiladenina 5 mmol/L (inibidor de autofagia),
vitamina E 50 e 100 µmol/L (agente antioxidante).
3.5. Análise de dupla marcação com Anexina V - isotiocianato de flouresceína (FITC)/
Iodeto de propídeo (IP) por citometria de fluxo. A determinação de células em apoptose e
necrose foi realizada por dupla marcação com Anexina V - FITC / IP pela técnica de citometria
de fluxo. As células K562 (5x105 células por poço) foram tratadas com fenotiazinas (10 e
25µmol/L) durante 24h e centrifugadas 100g por 6 minutos. A 1X105 células foi adicionado
tampão de ligação contendo HEPES 10mmol/L, NaCl 140 mmol/L , CaCl 2,5 mmol/L, pH
7,4, anexina V 1µg/mL e iodeto de propídeo 2,5 µg/mL. As células foram incubadas em tubos
de propileno, protegidas da luz e mantidas em temperatura ambiente durante 15 minutos. A
detecção da porcentagem de células em apoptose e necrose foi determinada em citômetro de
fluxo (Becton Dickinson Immunocytometry System, San Jose, CA, USA da UNIFESP-EPM),
conectado com um computador utilizando o software Cell Quest iPro (BEDNER et al., 1999,
BOECK, 2001).
46
3.6. Análise da atividade das caspases. As medidas da atividade das caspases 3 e 6 foram
realizadas utilizando kits colorimétricos de protease (R&D Systems. USA). Após a incubação
de células com TR 50 µmol/L durante 24 horas, 1x106 células/mL foram coletadas por
centrifugação e lisadas com tampão de lise. O lisado celular foi incubado com ditiotreitol
(DTT) 0,2 mol/L para ativação das cisteíno-proteases e com o substratos cromogênicos Ac-
DEVD-pNA e Ac-VEID-pNA 4 mmol/L a 37ºC por 2 horas em microplacas para um volume
final de 200 µL. O aumento na atividade de caspase foi determinado por medida de
absorbância em 405 nm.
A ativação da caspase -3 também foi avaliada por citometria de fluxo, com utilização de
anticorpo anti-caspase 3. Células K562 (1x106 células por poço) foram incubadas com
fenotiazinas (10 e 25 µmol/L) por 24 horas. Após o período de incubação com as drogas, as
células foram ressuspendidas em formaldeído 2% e incubadas 30 min a 20°C. As células
foram tratadas com saponina 0,001% por 15 minutos e lavadas com PBS contendo glicina
0,01mol/L. A suspensão foi centrifugada e o precipitado foi ressuspendido em 100 µL tampão
PBS contendo anticorpo anti-caspase 3. As amostras foram incubadas por 40 min e analisadas
em citômetro de fluxo (Becton Dickinson Immunocytometry System, San Jose, CA, USA da
UNIFESP-EPM) conectado com um computador (Macintosh Apple, CA, USA), utilizando o
software Cell Quest iPro (BELLOC et al., 2000).
3.7. Preparação da fração lisossomal-mitocondrial. As células K562 foram ressuspendidas
em 5 mL do HEPES-KOH 10 mM, pH 7,4 contendo sacarose 250 mmol/L e EGTA 0,3
mmol/L. A lise da membrana plasmática das células foi realizada manualmente por
aspiração da suspensão repetidamente, por 20 vezes, em uma seringa de 10 mL. A suspensão
foi centrifugada, 580 g por 5 minutos a 4ºC, e o sobrenadante a 10.300g por 10 minutos a 4ºC.
O sedimento rico em lisossomos foi ressuspendido em meio contendo sacarose 250mmol/L,
EGTA 0,3 mmol/L, e HEPES-KOH 10 mmol/L, pH 7,4 (ANDREU et al., 2005).
3.8. Dosagem de proteína. Uma alíquota (10µL) da amostra a ser determinada foi adicionada
a 100 µL de uma solução de ácido deoxicólico 5% (m/v) e água q.s.p. 1,5 mL. A essa mistura,
foi adicionado 1,5 mL do reativo de Biureto, composto por sulfato cúprico 0,15 % (m/v),
tartarato de sódio e potássio 0,6 % (m/v) e NaOH 0,75 M. A absorbância foi determinada em
47
540 nm contra um branco de reagentes e a concentração foi determinada a partir de uma curva
de calibração obtida nas mesmas condições da amostra, utilizando como padrão soro
albumina bovina (BSA) (CAIN & SKILLETER, 1987).
3.9. Determinação da atividade enzimática da catepsina B. A atividade da catepsina B,
presente na fração lisossomal-mitocondrial de células K562, foi monitorada pela hidrólise de
seu substrato fluorogênico Z-Phe-Arg-7-amido-4-methylcoumarin (Z-F-R-MCA) em um
espectrofluorímetro Hitachi F-2500 (Tóquio, Japão). Os comprimentos de onda usados foram
380 (excitação) e 460nm (emissão) e as fendas de excitação e emissão, 10 e 20 nm,
respectivamente. As cubetas de quartzo, utilizadas para as leituras, apresentavam caminho
óptico de 10 mm e capacidade de 3,0 mL. Antes do ensaio, as cisteíno-proteases presentes no
extrato bruto foram ativadas pela adição de ditiotreitol (DTT) 2,5 mmol/L por 5 minutos, a
37ºC. O tampão de ensaio era composto por fosfato de sódio 50 mmol/L, pH 6.0, adicionado
de NaCl 200 mmol/L e EDTA 1 mmol/L. Após a adição do substrato fluorogênico Z-F-R-
MCA 5 µmol/L à preparação enzimática, a fluorescência decorrente da hidrólise do substrato
foi monitorada em tempo real. A atividade total da catepsina B foi determinada pela adição do
detergente Triton X-100 0,2 % (m/v). Os resultados da atividade enzimática foram expressos
em unidades de fluorescência, provenientes da hidrólise do substrato fluorogênico (KAMBOJ
et al., 1993; BARRETT & KIRSCHKE, 1981)
3.10. Ensaio de permeabilidade da membrana lisossomal. A integridade da membrana
lisossomal das células K562 foi avaliada por meio da incorporação celular de Alaranjado de
Acridina - Acridine Orange (AO), fluoróforo metacromático e lisossomotrópico. Para
aquisição das imagens, células K562 (1x106 células por poço) foram marcadas com AO
5µg/mL de em meio RPMI 1640 por 15 minutos a 37°C em atmosfera contendo 5% de CO2.
Em seguida, as células foram lavadas com RPMI 1640 e expostas a TR 25µmol/L a 37°C em
5% de CO2. A emissão de fluorescência do fluoróforo foi registrada por um microscópio de
fluorescência confocal (Zeiss LSM 510 confocal microscope, Jena, Alemanha, da UNIFESP-
EPM). AO, quando excitada com luz azul de 488 nm, apresenta emissão de cor vermelha nos
lisossomos, em elevada concentração, e também emite na cor verde, em baixa concentração,
no citosol e núcleo celular. Desta forma, drogas que induzem a elevação da permeabilidade da
membrana lisossomal são visualizadas pela perda do sinal em vermelho da acridina orange
48
nos lisossomos, com concomitante ganho de sinal verde, característico da marcação de
citoplasma e núcleo.
3.11. Determinação do ∆ψ. O ∆ψ foi determinado em um espectrofluorímetro Hitachi F-
2500 (Tóquio, Japão), monitorando se alterações de fluorescência da rodamina 123, em
células permeabilizadas com digitonina. A rodamina 123 é um fluoróforo catiônico, que se
distribui eletroforeticamente na matriz, em resposta a carga negativa da membrana
mitocondrial interna (MATHUR, et al 2006), usando como comprimentos de onda de
excitação e emissão 505 e 535 nm, respectivamente. Células K562 (1x106 células/ml) foram
incubadas a 37°C, em um meio composto por sacarose 250 mmol/L, HEPES 10 mmol/L,
KH2PO4 2 mmol/L, EGTA 0,5 mmol/L, BSA 0,5% (m/v), MgCl2 5mmol/L, pH 7,2
adicionado de rodamina 123 1µmol/L. Como substrato respiratório foi utilizado succinato de
potássio 5µmol/L (+ rotenona 2,5µmol/L). A permeabilização da membrana plasmática foi
realizada pela adição de digitonina 0,004% (m/v). Tal concentração de digitonina foi obtida
por meio de titulação e é a menor quantidade que permite a entrada dos substratos
respiratórios sem afetar a função mitocondrial. Os resultados foram expressos como
intensidade relativa de fluorescência (IMBERTI et al., 1993).
O ∆ψ foi monitorado, também, com a utilização de tetrametilrodamina metil éster
(TMRM). TMRM é um marcador fluorescente lipofílico catiônico, derivado da rodamina123
capaz de acumular na mitocôndria, de acordo com o ∆ψ. Células K562 foram incubadas com
TMRM 0,1µmol/L por 15 min, lavadas em meio RPMI 1640 e as imagens foram coletadas
utilizando microscópio confocal (Zeiss LSM 510 confocal microscope, Jena, Alemanha, da
UNIFESP-EPM) a 548 e 600 nm excitação e emissão, respectivamente (SCADUTO et al.,
1999).
3.12. Análise da homeostase de Ca2+. Os níveis de Ca2+ citosólico foram monitorados por
alterações de fluorescência de fluo-3/AM. Células K562 foram marcadas com 4 µmol/L, por
40min. O aumento dos níveis de Ca2+ intracelular induzido por TR foi monitorado por
microscópio confocal (Zeiss LSM 510 confocal microscope, Jena, Alemanha, da UNIFESP-
EPM), utilizando comprimentos de onda de 488 e 500-550 nm (filtro excitação/ emissão).
Para registro simultâneo de sinais de Ca2+ citosólico e mitocondrial, células foram duplamente
marcadas com rhod-2 e fluo-3. Células foram marcadas com 4 µmol/L rhod-2/AM a 37°C,
por 30 minutos, lavadas com meio RPMI 1640 e incubadas com 4 µmol/L, fluo-3/AM à 37°C
49
por 40 minutos. A células com dupla marcação (fluo-3 e rhod-2) foram, simultaneamente,
excitadas em 488 e 543nm (DUCHEN, 2000).
3.13. Análise de oxidação lipídica. A oxidação de lipídeos foi avaliada a partir da formação
de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico - Thiobarbituric Acid Reactive Substances
(TBARs). Células K562 foram incubadas com fenotiazinas por 4 horas em meio contendo
KCl 130 mmol/L, HEPES-KOH 10 mmol/L, pH 7,4, a 37 ºC. Para determinação do TBARs,
foi adicionado 1 mL de ácido tiobarbitúrico (TBA) 1 % (preparado em NaOH 0,05 mol/L),
100µL de NaOH 10 mol/L e 500 µL de ácido fosfórico 20 %, seguido por incubação durante
20 minutos a 85º C. O complexo foi extraído com 2 mL de n-butanol e a absorbância foi
determinada em 532nm. A concentração de TBARs foi calculada a partir de um ε = 1,56x105
(moles/L)-1. Como controle positivo da reação, foi utilizado (NH4)2Fe(SO4)2 50 µmol/L. O
ensaio também foi realizado com a fração lisossomal-mitocondrial de células K562, com
incubação de 10 minutos com fenotiazinas (BUEGE & AUST 1978).
3.14. Dosagem de grupos tiólicos reduzidos de proteínas. Células K562 foram incubadas
(1x106 células/mL) com fenotiazinas por 4 horas. Após o tempo de incubação, as células
foram tratadas com 1mL de ácido tricloroacético (TCA) 5% (m/v) e centrifugadas a 900 g por
5 minutos. O precipitado foi ressuspendido em 1,0 mL de tampão fosfato 0,5 mol/L, pH 7,6,
e, após adição de ácido 5,5-ditiobis-nitrobenzóico (DTNB) 0,2 mmol/L, a absorvância foi
determinada em 412 nm. A concentração de grupamentos tiólicos reduzidos foi calculada com
base em ε=13.600 (mol/L)-1 cm-1 (JOCELYN, 1987).
3.15. Dosagem de glutationa reduzida (GSH). A quantidade de GSH foi determinada
espectrofluorimetricamente, utilizando o-ftalaldialdeído (OPT). As células K562 foram
incubadas (1x106 células/mL) com fenotiazinas por 4 horas. Após o tempo de incubação, as
amostras foram tratadas com 1 mL de ácido tricloroacético (TCA) 5% (m/v) e centrifugadas a
900 g por 5 minutos. Alíquotas do sobrenadante (100 µL) foram adicionadas a 1,0 mL de
NaH2PO4 0,1 mol/L, pH 8,0, contendo EGTA 5 mmol/L, seguido da adição de 100 µL de o-
ftalaldeído 1 mg/mL. A fluorescência foi determinada, após 15 minutos em 350 e 420 nm,
excitação e emissão, respectivamente. A curva padrão foi preparada com GSH 0-40 µmol/L
(HISSIN & HILF, 1976).
50
3.16. Sistema de Irradiação para teste de MTT. As amostras foram irradiadas com uma
lâmpada UV Model UVGL-25 Multiband UV 254/365nm, 4Watts de potência, em 365 nm a
8 cm de distância, por 30 minutos.
3.17. Análise estatística. As análises estatísticas foram realizadas por meio de análise t-Test
do programa Microcal Origin 6.0 (Microcal™ Software, Inc.).
51
4. RESULTADOS
4.1. Estudo dos efeitos das fenotiazinas em estado fundamental sobre a
viabilidade de células K562
Os efeitos das fenotiazinas TR, FP e TFP sobre a viabilidade das células K562 foram
avaliados pelo método da redução de MTT por desidrogenases mitocondriais de células
viáveis. Células K562 (2x105 células por poço) foram incubadas com fenotiazinas por 24
horas, com a finalidade de caracterizar a citotoxicidade dos derivados fenotiazínicos. Para a
obtenção de uma curva de viabilidade celular, foram utilizadas concentrações diferentes de
fenotiazinas (1, 5, 10, 20, 30, 50, 75 e 100 µmol/L). A Figura 12 mostra uma curva
concentração-resposta do efeito das fenotiazinas sobre a viabilidade das células K562. Os
resultados foram demonstrados com valores de concentração efetiva (EC50) das fenotiazinas.
O EC50 é a concentração na qual 50% do efeito máximo da droga foi observado, ou seja, é a
concentração citotóxica de droga capaz de afetar a viabilidade de 50% de uma população de
células. Como podemos observar, as fenotiazinas apresentam efeito antiproliferativo, sendo,
TR é a fenotiazina que apresenta maior citotoxicidade sobre as células K562 (EC50 = 25,14
µmol/L), seguida por TFP (EC50 = 31,26 µ/mol/L) e FP (EC50 = 35,33 µmol/L).
0 25 50 75 1000
25
50
75
100
Fenotiazinas (µM)
viabilida
de celular
(% do controle) TR EC
50 = 25,14µmol/L
FP EC50 = 35,33µmol/L
TFP EC50 = 31,26µmol/L
Figura 12. Efeitos das fenotiazinas sobre a viabilidade de células K562. Curva dose-resposta mostrando a viabilidade de células K562 (2x105 por poço) incubadas por 24 h com TR, FP e TFP, avaliada por meio do teste de redução do MTT. A porcentagem de células viáveis foi calculada em relação ao controle (100%). Os valores de EC50 estão representados em µmol/L.
52
4.2. Caracterização do tipo de morte celular induzido pelas fenotiazinas
Para investigar o tipo de morte celular induzido pelas fenotiazinas, células (1x105
células/mL) foram duplamente marcadas com anexina V-FITC (isotiocianato de flouresceína) e
iodeto de propídeo (PI) e foram analisadas por citometria de fluxo.
A fosfatidilserina é um fosfolipídio presente na face interna na membrana de células.
Sua externalização ocorre durante o processo de apoptose e permite o rápido reconhecimento
e fagocitose por macrófagos e células vizinhas. A anexina V é uma molécula que apresenta
alta afinidade pela fosfatidilserina. Esta molécula, quando associada ao FITC, se liga à
fosfatidilserina e emite alta fluorescência em 515-530 nm (quadrante inferior da direito dos
gráficos - Figura 13A e B). Em contrapartida, o IP se liga ao DNA, intercalando-se entre as
duplas fitas dos ácidos nucléicos, e emite fluorescência em 560-580 nm. A marcação positiva
para IP indica que as células perderam a integridade da membrana (quadrante superior
esquerdo dos gráficos - Figura 13A e B) (COOPER & HAUSMAN 2007;
DARZYNKIEWICZ et al., 1997).
Nestes ensaios, as células K562 foram tratadas com fenotiazinas por 24 e 6 horas, sendo
que, em 6 horas, selecionamos apenas TR, fenotiazinas de maior efeito sobre a morte das
células K562. Além disso, foram selecionadas duas concentrações de fenotiazinas 25 µmol/L
(EC50 de TR) e 10 µmol/L (dose subletal).
Como pode ser observado na Figura 13A, a incubação das células K562 com TR (10 e
25 µmol/L), por 6 horas, resultou em discreta porcentagem de células em apoptose, sendo que
ainda pode ser observada uma porcentagem grande de células viáveis (quadrante inferior
esquerdo dos gráficos – Figura 13A). Ainda na mesma figura, podemos observar que as
células tratadas com TR (10 e 25 µmol/L) apresentam, também, uma pequena porcentagem de
marcação com IP, indicativo de necrose e de dupla marcação, que pode representar o processo
de necrapoptose ou apoptose tardia (quadrante superior direito dos gráficos - Figura 13A)
(LEMASTERS, 1999).
Em contrapartida à incubação de 24 horas das células K562 com fenotiazinas (Figura
13B), houve predominância de marcação com Anexina V-FITC; sendo que, nas células
tratadas com TR, podemos observar maior porcentagem de apoptose, seguida por TFP e FP.
Na incubação das fenotizinas, por 24 horas, ainda podemos observar uma porcentagem
discreta de marcação com PI e de dupla marcação. A quantificação, da marcação de células
K562 com Anexina V- FITC e IP, com incubação de 6 e 24 horas com fenotiazinas é
demonstrada na Tabela 2 e 3 respectivamente.
53
Controle TR 10 µmol/L TR 25 µmol/L
A
B
TR 10 µmol/L
Controle
TR 25 µmol/L
54
Figura 13. Caracterização do tipo de morte celular induzido pelas fenotiazinas. As células K562 (5x105
células/mL) foram incubadas com TR por 6 horas (A) e com TR, FP e TFP por 24 horas (B). A caracterização do tipo de morte, induzido pelas fenotiazinas, foi determinada por citometria de fluxo com 1x105 células/mL, utilizando dupla marcação com Anexina V- FITC/IP. Quadrante inferior esquerdo dos gráficos (células viáveis - ausência marcação anexina V-FITC/IP), quadrante inferior direito dos gráficos (marcação com anexina V-FITC), quadrante superior esquerdo dos gráficos (marcação com IP) e quadrante superior da direito dos gráficos (dupla marcação anexina V-FITC/IP)
Tabela 2 – Quantificação de marcação com Anexina V- FITC e IP em células K562 incubadas por 6horas com TR.
10µM 25µM
Anexina V-FTIC -/ IP - 64,1% 38,5% Anexina V-FTIC +/ IP - 16,5% 49,1% Anexina V-FTIC -/ IP + 8,5% 4,3% Anexina V-FTIC +/ IP + 10,8% 8,1%
FP 10 µmol/L FP 25 µmol/L
TFP 10 µmol/L TFP 25 µmol/L
55
Tabela 3 – Quantificação de marcação com Anexina V- FITC e IP em células K562 incubadas por 24
horas com fenotiazinas.
4.3. Estudo dos efeitos das fenotiazinas sobre a atividade da caspase -3 e -6
Para avaliarmos os efeitos de TR sobre a atividade das caspases efetoras -3 e -6, células
K562 foram incubadas com TR 50µmol/L, por 24 horas e a atividade das caspases foi
avaliada por método colorimétrico, pela absorbância do cromóforo p-nitroanilina (pNA),
liberado após hidrólise dos substratos cromogênicos Ac-DEVD-pNA (substrato da caspase -3)
e Ac-VEID- pNA (substrato da caspase -6) 4 mmol/L. Os resultados apresentados na Figura
14A demonstraram que a incubação de TR 50 µmol/L (a concentração de TR afeta cerca de
90% da viabilidade das células K562) por 24 horas não foi capaz de promover a ativação das
caspases efetoras -3 e -6 nas células K562.
Para tentarmos comprovar de outra forma esse resultado, pré-incubamos um inibidor
específico da caspase efetora -3 (Ac-DEVD-CHO) com as células, antes da adição das
fenotiazinas, e medimos a viabilidade celular pelo método de redução MTT. Caso houvesse a
ativação da caspase -3, e se essa fosse responsável, ao menos parcialmente, pela morte celular
induzida pelas fenotiazinas, a pré-incubação, com seu inibidor específico, deveria ter efeito
inibitório sobre a morte celular induzida pelas fenotiazinas. Dessa forma, os efeitos das
fenotiazinas sobre a viabilidade de células K562 foram avaliados na ausência e na presença de
Ac-DEVD-CHO (10 µmol/L). Como pode ser observado na Figura 14B, o inibidor Ac-
DEVD-CHO não foi capaz de proteger as células K562 da morte induzida pelas fenotiazinas.
Este resultado sugere que não há envolvimento de caspases na morte celular induzida pelas
fenotiazinas.
TR FP TFP 10µM 25µM 10µM 25µM 10µM 25µM Anexina V-FTIC -/ IP - 28,6% 10,5% 38,3% 10,7% 24,6% 9,5%
Anexina V-FTIC +/ IP - 36,0% 81,5% 45,9% 70,7% 55,7% 76,1%
Anexina V-FTIC -/ IP + 6,9% 0,4% 4,4% 1,1% 1,5% 0,8%
Anexina V-FTIC +/ IP + 28,5% 7,6% 38,3% 17,5% 18,3% 13,6%
56
Como existe a possibilidade do inibidor Ac-DEVD-CHO não atravessar a
adequadamente a membrana plasmática das células durante o período de incubação, foi
realizado um ensaio de citometria de fluxo, utilizando anticorpo monoclonal anti-caspase-3
ativa. Células K562 foram incubadas com fenotiazinas (10 e 25 µmol/L) por 24h e marcadas
com anticorpo anti-caspase-3 clivada. A Figura 14C mostra que as fenotiazinas promovem a
ativação de uma população significativa de caspase -3, observada pelo deslocamento das
curvas brancas dos gráficos para a direita. Dentre todos os métodos que utilizamos para a
detecção da caspase -3 o ensaio de citometria de fluxo utilizando anticorpo anti-caspase-3
clivada é o mais específico, demonstrando a ativação da caspase-3 na morte celular induzida
pelas fenotiazinas.
co
ntrole
TR20µM
TR50µM
FP20µM
FP50µM
TFP20µM
TFP50µM
0
20
40
60
80
100
120 B
viabilidad
e celular
(% do con
trole)
K562 K562 + Ac-DEVD-CHO
control
e
TR50µ
M0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
A
Atividad
e da ca
spase
(Abs) caspase 3
caspase 6
57
Figura 14. Efeitos das fenotiazinas sobre a atividade das caspases -3 e -6. (A) Células K562 (1x106 células/mL) foram incubadas com TR (50 µmol/L) por 24horas e a atividade das caspases -3 e -6 foi mensurada pela absorbância cromóforo pNA liberado após a hidrólise dos substratos Ac-DEVD (substrato da caspase -3) e Ac-VEID (substrato da caspase -6) 4 mmol/L. (B) O inibidor de caspase -3 (Ac-DEVD-CHO) 10 µmol/L foi incubado por 12 h com as células K562 (2x105 células por poço), seguido pela incubação com TR, FP e TFP por 24 horas. A viabilidade foi avaliada por meio do teste de redução do MTT. (C) As células K562 (1x106 células/mL) foram fixadas e marcadas com anticorpos anti-caspase -3 clivada e analisadas por citometria de fluxo. Curva vermelha: controle; e, curva branca: estimulado com fenotiazinas.
4.4. Avaliação da permeabilização lisossomal na morte celular induzida
pelas fenotiazinas em células leucêmicas K562
Nos ensaios para a avaliação dos efeitos da fenotiazinas sobre a permeabilidade
lisossomal, foi utilizada fração lisossomal-mitocondrial isolada de células K562. A alteração
da permeabilidade lisossomal induzida pelas fenotiazinas foi verificada por meio do aumento
da atividade da catepsina B, monitorada pela hidrólise do substrato fluorogênico Z-F-R-MCA.
Como pode ser observado na Figura 15A, as fenotiazinas causaram um aumento imediato na
velocidade de hidrólise do substrato fluorogênico, indicando a ocorrência de permeabilização
em lisossomos isolados de células K562. TR apresentou maior efeito sobre a permeabilidade
TR FP TFP
10µmol/L
25µmol/L
C
Eve
ntos
Eve
ntos
Eve
ntos
Eve
ntos
Eve
ntos
Eve
ntos
TR FP TFP
10µmol/L
25µmol/L
C
TR FP TFP
10µmol/L
25µmol/L
TR FP TFP
10µmol/L
25µmol/L
C
Eve
ntos
Eve
ntos
Eve
ntos
Eve
ntos
Eve
ntos
Eve
ntos
58
lisossomal, quando comparada com FP e TFP. A atividade total da catepsina B foi obtida pela
adição do detergente Triton X-100, que solubiliza as membranas lipídicas dos lisossomos e
libera todo o seu conteúdo.
Para verificar o envolvimento da permeabilização lisossomal na morte celular induzida
pelas fenotiazinas, pré- incubamos um inibidor específico de cisteíno protease (E-64) antes da
adição das fenotiazinas, e a viabilidade foi avaliada pelo teste de redução de MTT. Dessa
forma, os efeitos das fenotiazinas sobre a viabilidade de células K562 foram avaliados na
ausência e na presença de E-64 (10 µmol/L). Como pode ser observada na Figura 15B, a pré-
incubação com E-64 inibiu o efeito indutor de morte celular, exibido pelas fenotiazinas,
demonstrando que as catepsinas lisossomais desempenham importante papel na indução de
morte celular induzida pelas fenotiazinas.
A integridade da membrana lisossomal também foi verificada nas células K562 intactas,
por meio de microscopia confocal, com utilização do fluoróforo metacromático
lisossomotrópico AO. AO, quando excitada com luz azul (488 nm), apresenta emissão de cor
vermelha, nos lisossomos onde se encontra em concentração elevada (~ 100 - 1000µmol/L), e
também emite na cor verde, quando está em baixa concentração (~ 1-10 µmol/L), como, por
exemplo, no citosol e no núcleo. Desta forma, o aumento da permeabilidade da membrana
lisossomal é visualizado pela perda da emissão vermelha de AO nos lisossomos, com
concomitante ganho de emissão verde, característico da marcação de citoplasma e núcleo. A
emissão amarela representa AO em concentrações intermediárias (~ 30 µmol/L). Nas imagens
da Figura 15 C [1] observamos o controle sem o tratamento das células K562 com TR, onde
pode ser visualizada a marcação dos lisossomos em vermelho e citoplasma e núcleo em verde.
Já nas células tratadas com TR por 30 minutos (Figura 15C [2]) e 2 h (Figura 15C [3]),
podemos notar a marcação de lisossomos com um vermelho difuso e a marcação para
citoplasma e núcleo com uma mudança de tonalidade em verde (de “verde-bandeira” para
“verde brilhante”), quando comparada ao controle. Observa-se, também, um ganho de
amarelo, que representa AO em concentrações intermediárias. Fato indicativo que TR
promoveu a PML com extravasamento do seu conteúdo para citosol. Além disso, podemos
notar, nas imagens de maior aumento, intensa vacuolização, fragmentação nuclear e formação
de blebs (bolhas) de membrana [Figura 15C(4)].
59
A
10 uM 25 uM 50 uM 100 uM Tx-100
100
80
60
40
20
0
LMP (%)
FP
TFP
TR
10µmol/ L 25µmol/L 50µmol/ L 100µmol/L Tx-100
PM
L
B
control
e20µ
M50µ
M20µ
M50µ
M20µ
M50µ
M0
20
40
60
80
100
** *
* **
TFPFPTR
viabilidade
celular
(% do co
ntrole)
K562 K562+E-64
60
Figura 15. Efeitos das fenotiazinas sobre a elevação da permeabilidade lisossomal em células K562. (A) A permeabilidade de lisossomos isolados de células K562 foi avaliada por ativação de catepsina B, monitorada através da hidrólise do substrato fluorogênico (Z-F-R-MCA 5µmol/L), sendo utilizado como controle positivo Triton X-100 (TX-100), onde ocorreu a liberação total da enzima marcadora. Os dados apresentados foram obtidos de diferentes preparações lisossomais. (B) O inibidor específico de cisteíno proteases (E-64) 10 µmol/L foi incubado por 12 horas com as células K562 (2x105 células por poço), seguido pela incubação com TR, FP e TFP por 24 horas. A viabilidade foi avaliada por meio do teste de redução do MTT. *K562+E-64 estatisticamente diferente de K562 (p<0.05) (C) A permeabilização lisossomal de células K562 foi avaliada por microscopia confocal, utilizando acridina orange 5 mg/mL. (1) controle, ausência de TR; (2) TR, 30 min; (3) e (4) TR, 2h de incubação em diferentes aumentos, onde podemos observar intensa vacuolização intracelular e a formação de blebs de membrana (setas).
(1)
(2)
(3)
(4)
C
61
4.5. Efeitos das fenotiazinas sobre a viabilidade de células mononucleares
normais
Podemos observar, pelos resultados anteriores, que as fenotiazinas são capazes de
promover morte de células tumorais, com participação da via lisossomal. Como lisossomos de
células tumorais apresentam diferenças sobre lisossomos de células normais
(FEHRENBACHER & JAATTELA, 2005), investigamos se as fenotiazinas afetam, também,
a viabilidade de células normais.
Assim, verificamos os efeitos das drogas sobre a viabilidade de células mononucleares
normais, isoladas do sangue periférico da aluna Vivian Matsukura dos Santos, bem como, nas
células K562, comparativamente. Células K562 (2x105 por poço) foram incubadas com
fenotiazinas (20 e 50 µmol/L) e a viabilidade celular foi avaliada pelo método de redução de
MTT (Figura 15A), e também pelo método de exclusão de Azul de Tripan (Figura 15 B). O
azul de tripan é um corante utilizado com a finalidade de determinar a viabilidade celular.
Células viáveis são capazes de excluir o corante do citoplasma; entretanto, células inviáveis
são incapazes de excluir o azul de tripan e ganham coloração em azul (PERES & CURI,
2005).
Como pode ser observado na Figura 16, as fenotiazinas TR, FP e TFP (20 e 50µmol/L)
não apresentaram atividade citotóxica capaz de induzir morte em células mononucleares
normais, em relação à sua capacidade de induzir morte celular nas células leucêmicas K562.
Foi observado que TR apresenta maior citotoxidade em ambas às células, seguido pela FP e
TFP. Porém, a citotoxidade induzida pelas fenotiazinas, em células mononucleares, é
significativamente menor que em células leucêmicas humanas K562.
62
Control
e20µ
M50µ
M20µ
M50µ
M20µ
M50µ
M0
20
40
60
80
100 *
Teste de redução de MTT
A
**
*
*
*
TFPFPTR
viab
ilida
de celular
(% do controle)
K562 células mononucleares
Control
e20µ
M50µ
M20µ
M50µ
M20µ
M50µ
M0
20
40
60
80
100 **
Teste de exclusão de Azul de Tripan
B*
**
*
TFPFPTR
viabilidade
celular
(% do co
ntrole)
K562 células mononucleares
Figura 16. Efeitos das fenotiazinas sobre a viabilidade de células K562 e células mononucleares normais, pelo método do MTT e exclusão de azul de tripan. Células K562 (2x105 células por poço) e mononucleares isoladas de um indivíduo saudável foram incubadas TR, FP e TFP (20 e 50 µmol/L) por 4 horas e a viabilidade celular foi avaliada por meio de teste de redução MTT (A) e exclusão de Azul de Tripan (B). A porcentagem de células viáveis foi calculada em relação ao controle (100%). *Células mononucleares estatisticamente diferentes de K562 (p<0.05).
63
4.6. Dissipação do ∆ψ mitocondrial induzida por TR com envolvimento de
cisteíno catepsinas
É bem descrito, na literatura, o envolvimento mitocondrial na apoptose, com a indução
de TPM e abertura do PTPM, onde um dos principais processos associados é dissipação do
∆ψ (KROEMER et al., 2007). O ∆ψ é resultado do gradiente eletroquímico formado pelo
consumo de substratos pela cadeia transportadora de elétrons. Ocorre através de um fluxo de
elétrons, através de complexos mitocondriais, acompanhado pelo bombeamento de prótons
para o espaço intermembranas, tornando a matriz relativamente mais alcalina e negativa, em
relação ao espaço intermembranas (LEHNINGER et al., 1978).
Desta forma, o efeito das fenotiazinas sobre o potencial de membrana mitocondrial
torna-se um importante parâmetro a ser avaliado no nosso trabalho. Além disso, podemos
observar, nos resultados anteriores, que a morte celular, induzida pelas fenotiazinas, envolve a
PML com extravasamento do seu conteúdo para citosol. Assim, avaliamos os efeitos das
fenotiazinas sobre o potencial de membrana mitocondrial e o envolvimento das cisteíno
catepsinas, através da incubação de E-64, a fim de avaliar uma possível comunicação entre
lisossomos e mitocôndrias.
O ∆ψ foi avaliado utilizando o fluoróforo rodamina 123 em células K562
permeabilizadas com digitonina 0,004% (m/v), na ausência e na presença da TR (20 e 50
µmol/L) e de E-64 10 µmol/L inibidor específico de cisteíno catepsinas. O efeito máximo foi
comparado ao do desacoplador clássico CCCP.
A rodamina 123 é um fluoróforo catiônico lipofílico, que se distribui no compartimento
mitocondrial, conforme o ∆ψ, emitindo fluorescência em vermelho, medida na região de
535nm, que é proporcional à quantidade absoluta de rodamina 123. Assim, a redução de
fluorescência está relacionada com a despolarização mitocondrial, ou seja, a perda do ∆ψ
(MATHUR et al., 2006; EMAUS et al., 1986).
Como pode ser observado na Figura 17, a incubação com TR 50 µmol/L por 4 horas, à
suspensão celular impediu completamente a formação do ∆ψ induzida pela adição de
succinato em células permeabilizadas. Entretanto, quando as células foram incubadas com TR
20 µmol/L, houve a formação do ∆ψ, mas este foi menor que aquele na ausência de TR. Este
∆ψ formado, além de ser de menor extensão, não se manteve, sendo lentamente dissipado, e
tal efeito foi abolido pela pré-incubação de E-64.
64
Figura 17. Efeitos da TR sobre o potencial de membrana mitocondrial. Células K562 (1x106 células/mL) foram incubadas com E-64 10µmol/L por 18 horas e TR 50 e 20µmol/L por 4 horas.O potencial de membrana mitocondrial foi mensurado com a utilização de rodamina 123 1µmol/L em células permeabiizadas com digitonina (dig) 0,004%. O efeito máximo da droga foi comparado ao do desacoplador clássico CCCP. Os resultados foram expressos em Unidade Relativa de Fluorescência (U.R.F.).
4.7. Aumento de Ca2+ citosólico induzido pelas fenotiazinas e contribuição
mitocondrial para a homeostase.
Para avaliarmos se TR seria capaz de alterar a homeostase celular de Ca2+, as células
K562 foram marcadas fluoróforo fluo-3/AM (4 µmol/L) e a emissão de fluorescência
registrada por microscopia confocal. O Fluo-3/AM é um fluoróforo, capaz de atravessar a
membrana plasmática, e quando excitado (λex=488 nm), emite fluorescência em verde
(λem=560-600 nm) quando ligado a Ca2+ (MINTA et al., 1989).
Como pode ser observado na Figura 18A, logo após a adição de TR ocorreu um
aumento instantâneo da concentração de cálcio citosólico ([Ca2+]c). Tal evento ocorreu em
função do tempo, observado pelo aumento gradual da fluorescência de fluo-3 (ganho de
verde) após a adição da droga, e atingiu seu pico em, aproximadamente, 50 minutos. Após
isso, a fluorescência diminuiu, sugerindo a captação de cálcio para as organelas ou seu
extravasamento para o meio extracelular.
Para avaliarmos se ocorreu captação do cálcio citosólico pelas mitocôndrias, as
concentrações de cálcio mitocondrial ([Ca2+]m) e [Ca2+]c e foram avaliadas simultaneamente
por dupla marcação de células K562 com fluo-3/AM e rhod-2/AM.
0 150 300 450 6001200
1500
1800
2100
2400dig
CCCP
U.R.F.
tempo(s)
controle TR20 TR20+E-64 TR50 TR50+E-64
65
Rhod-2/AM é um indicador de Ca2+ mitocondrial, e, como o fluo-3/AM, rhod-2/AM
livre não emite fluorescência, entretanto quando ligado a Ca2+, emite fluorescência em
vermelho (λem = 560-600nm) (DUCHEN et al., 2003).
Células K562 foram, então, excitadas ao mesmo tempo, em 488 nm e 543 nm. As
emissões de fluorescência de fluo-3/AM e rhod-2/AM foram capturadas com dois filtros de
emissão, em 500 a 550 nm e 560 a 600 nm.
A Figura 18B mostra o aumento dos níveis de Ca2+ no citosol através do ganho de
verde (marcação de fluo-3/AM), seguido por captação mitocondrial, visto com ganho de
vermelho (marcação de rhod-2/AM). Além disso, podemos visualizar uma perda de emissão
verde, com concomitante ganho de vermelho, o que indica a total captação de Ca2+ pela
mitocôndria. Ainda nesta figura, podemos observar alterações morfológicas, como
fragmentação nuclear e extensões de membrana com formação de blebs (bolhas) de
membrana, ao decorrer do tempo.
Como a captação de cálcio pelas mitocôndrias pode causar a dissipação do ∆ψ por
abertura do PTPM, avaliamos, também, o potencial de membrana das mitocôndrias, nas
mesmas condições dos experimentos de cálcio, com o uso do fluoróforo tetrametilrodamina
metil éster (TMRM). TMRM é um marcador fluorescente lipofílico catiônico derivado da
rodamina 123, capaz de acumular na mitocôndria, de acordo com o ∆ψ. Quando o ∆ψ é
formado, TMRM emite fluorescência em vermelho (λem = 530-550 nm); entretanto, a perda de
emissão de fluorescência é observada com a dissipação do ∆ψ (SCADUTO et al., 1999).
Células K562 foram marcadas com TMRM 0,1 µmol/L por 15 minutos e avaliadas por
meio de microscopia confocal. Como pode ser observado na Figura 18C ocorre à formação
do ∆ψ nas células K562; entretanto, com a adição de TR 25 µmol/L, este é rapidamente
dissipado, observado pela diminuição da fluorescência de TMRM.
A Figura 18D mostra, em função do tempo, a emissão de fluorescência, captada por
microscopia de fluorescência confocal das imagens anteriores (figuras 17A,B e C). Onde
podemos observar, em função do tempo, o aumento da [Ca2+]c (círculo vazio), com
subsequente captação pelas mitocôndrias (círculo preenchido) e a dissipação do ∆ψ (triângulo
preenchido) induzido por TR. Nossos resultados demonstraram que o disparo da morte celular
induzida pelas fenotiazinas é causado por um rápido aumento de cálcio citosólico, que resulta
em aumento de cálcio mitocondrial e consequente dissipação do ∆Ψ.
66
B
A
67
Figura 18. Efeitos de TR sobre a homeostase do Ca2+ e respostas mitocondriais. (A) Células K562 foram marcadas com Fluo-3 4 µmol/L e a fluorescência foi verificada de 0 a 2500 segundos após a adição de TR 25µmol/L. O efeito de TR sobre a [Ca2+]c foi avaliado através do aumento de fluorescência de fluo-3 (ganho de verde). (B) Dupla marcação de células K562 com rhod- 2/AM e fluo-3/AM permitiu a avaliação simultânea dos níveis de [Ca2+]c e [Ca2+]m. As imagens que apresentam fluorescência de rhod-2 emitem sinal vermelho e a fluorescência de fluo-3 em verde. Ainda, nas imagens podemos notar a condensação de cromatina e formação de blebs de membrana (setas). (C) O ∆ψ foi avaliado a partir de marcação com TMRM 0,1 µmol/L e a fluorescência verificada de 0 a 730 segundos após a adição de TR (25 µmol/L). (D) Ca2+ citosólico (circulo vazio), Ca2+ mitocondrial (circulo preenchido) e variação do ∆ψ (triangulo preenchido).
D
C
68
Vale a pena ressaltar a dificuldade de obtenção de tais imagens ao longo do tempo, por
microscopia confocal, por se tratar de células não aderentes.
Para certificar que a morte celular induzida pelas fenotiazinas é disparada pelo aumento
do [Ca2+]c, incubamos, previamente, as células K562 com BAPTA-AM 10 µmol/L, um
quelante de Ca2+ que facilmente atravessa a membrana plasmática das células. Após a
incubação com BAPTA-AM por 1 hora a viabilidade foi avaliada pelo método de redução de
MTT, após a incubação das fenotiazinas (10, 20, 30, e 50 µmol/L) por 4 horas (Figura 19) e
24 horas (Figura 20). Como pode ser observado, BAPTA-AM inibiu, parcialmente, o efeito
das fenotiazinas sobre a morte celular.
Para verificarmos se o aumento de cálcio citosólico era causado pela liberação por
organelas, como mitocôndrias e retículo endoplasmático, ou se era proveniente do meio
extracelular, utilizamos EGTA 2,5 mmol/L incubado com as células por 5 minutos, visto que
este quelante de cálcio não entra nas células, quelando apenas o cálcio externo. Como pode
ser observado na Figura 21, o EGTA também foi capaz de proteger, parcialmente, o efeito
indutor de morte celular exibido pelas fenotiazinas.
69
Figura 19. Efeitos de BAPTA-AM sobre a morte celular induzida pelas fenotiazinas em células K562 (4h). Células K562 (2x105 por poço) foram incubadas com 10µmol/L BAPTA-AM por 4h e fenotiazinas (20, 30 e 50µmol/L) TR (A), FP (B) e TFP (C) por 4horas. A viabilidade foi avaliada por meio de redução do MTT, e a porcentagem de células viáveis foi calculada em relação ao controle (100%). *K562 + BAPTA-AM estatisticamente diferente de K562 (p<0.05).
Controle
TPF10µM
TFP20µM
TFP30µM
TFP50µM
0
20
40
60
80
100
120
*
viab
ilida
de celular
(% con
trole)
K562 K562 + BAPTA-AMC
Controle
FP10µM
FP20µM
FP30µM
FP50µM
0
20
40
60
80
100
120
*
*
viabilida
de celular
(% do controle)
K562 K562 + BAPTA-AM
A
B Controle
TR10µM
TR20µM
TR30µM
TR50µM
0
20
40
60
80
100
120
*
*
viabilidade celular
(% do controle)
K562 K562 + BAPTA-AM
70
Figura 20. Efeitos de BAPTA-AM sobre a morte celular induzida pelas fenotiazinas em células K562 (24h). Células K562 (2x105 por poço) foram incubadas com 10µmol/L BAPTA-AM por 4h e fenotiazinas (20, 30 e 50µmol/L) TR (A), FP (B) e TFP (C) por 24horas. A viabilidade foi avaliada por meio de redução do MTT, e a porcentagem de células viáveis foi calculada em relação ao controle (100%). *K562 + BAPTA-AM estatisticamente diferente de K562 (p<0.05).
Controle
TR10µM
TR20µM
TR30µM
TR50µM
0
20
40
60
80
100
120
*
*viab
ilidad
e celular
(% do con
trole)
K562 K562+BAPTA-AM
A
Controle
FP10µM
FP20µM
FP30µM
FP50µM
0
20
40
60
80
100
120
*
*
viabilidade ce
lular
(% do con
trole)
K562 K562+BAPTA-AM
B
Controle
TFP10 µ
M
TFP20 µ
M
TFP30 µ
M
TFP50 µ
M0
20
40
60
80
100
120
*
* *
viab
ilida
de celular
(% do co
ntrole)
K562 K562+BAPTA-AM
C
71
Figura 21. Efeitos de EGTA sobre a morte celular induzida pelas fenotiazinas em células K562. Células K562 (2x105 por poço) foram incubadas com 2,5mmol/L EGTA por 5 min e fenotiazinas (20, 50µmol/L) por 24h. A viabilidade foi avaliada por meio de redução do MTT, e a porcentagem de células viáveis foi calculada em relação ao controle (100%). *K562 + EGTA estatisticamente diferente de K562 (p<0.05).
Como BAPTA-AM e EGTA foram capazes de promover a inibição parcial da morte
celular induzida pelas fenotiazinas, realizamos um novo ensaio, com incubação prévia de
ambos os quelantes. Como pode ser observada na Figura 22, a pré-incubação BAPTA-AM e
EGTA promoveu uma inibição bastante significativa do efeito das fenotiazinas sobre a morte
das células K562. Estes dados comprovam a participação do Ca2+ na morte celular induzida
pelas fenotiazinas, ocorre por aumento de [Ca2+]c proveniente de meio extracelular que deve
funcionar amplificando o processo que culmina na morte celular.
Figura 22. Efeitos de BAPTA-AM e EGTA sobre a morte celular induzida pelas fenotiazinas em células K562. Células K562 (2x105 por poço) foram incubadas com, 10µmol/L BAPTA-AM por 4horas, 2,5mmol/L EGTA por 4horas e fenotiazinas (20 e 50 µmol/L) por 24h. A viabilidade foi avaliada por meio de redução do MTT, e a porcentagem de células viáveis foi calculada em relação ao controle (100%). *K562 + BAPTA-AM + EGTA estatisticamente diferente de K562 (p<0.05).
Control
e
TR 20µM
TR 50µM
FP20µM
FP50µM
TFP20µ
M
TFP50µ
M
0
20
40
60
80
100 *
**
*
*
a*
viabilidade
celular
(% do co
ntrole)
K562 K562+EGTA
control
e
TR20µ
MTR
50µMFP2
0µMFP5
0µM
TFP20µ
M
TFP50µ
M
0
20
40
60
80
100** *
***
viabilidade
celular
(% do con
trole)
K562 K562+BAPTA-AM+EGTA
72
Como as fenotiazinas foram capazes de permeabilizar as membranas lisossomais,
avaliamos, também, a incubação prévia do inibidor específico de cisteíno catepsinas o E-64
10 µmol/L por 18 horas e BAPTA-AM por 4h, onde podemos observar (Figura 23) que a
presença destes dois moduladores protegeu 100% a morte celular induzida pelas fenotiazinas.
Figura 23. Efeitos de BAPTA-AM e E-64 sobre a morte celular induzida pelas fenotiazinas em células K562. Células K562 (2x105 células por poço) foram incubadas com 10 µmol/L E-64 por 18h, 10 µmol/L BAPTA-AM por 4 horas e fenotiazinas (20 e 50µmol/L) por 24h. A viabilidade foi avaliada por meio de redução do MTT, e a porcentagem de células viáveis foi calculada em relação ao controle (100%). *K562 + BAPTA-AM + E-64 estatisticamente diferente de K562 (p<0.05)
4.8. Envolvimento da autofagia na morte celular induzida pelas
fenotiazinas.
Conforme os resultados obtidos, podemos notar que as fenotiazinas promovem morte
nas células leucêmicas K562. Tal evento envolve que a sinalização de Ca2+ e a participação
lisossomal e mitocondrial.
Dados recentes da literatura mostram que Ca2+, além de estar envolvido no processo
apoptose, também pode participar na sinalização da autofagia. O processo pode ocorrer como
resposta a estresse em retículo endoplasmático, associado ao aumento [Ca2+]c. O aumento da
[Ca2+]c ativa CaMKK-β, que por sua vez, ativa AMPK, que conduz à diminuição da
fosforilação de um inibidor de autofagia (mTOR) (HOYER-HANSEN & JÄÄTTELÄ, 2007)
As imagens obtidas, por microscopia confocal usando AO, evidenciaram a presença de
inúmeros vacúolos intracelulares, que poderiam ser vacúolos autofágicos. Sendo assim,
avaliamos o envolvimento do processo de autofagia na morte celular induzida pelas
fenotiazinas. Pré-incubamos 3-metiladenina (3-MA), um inibidor de autofagia, por 1 hora
Control
e
TR 20µM
TR50µ
MFP2
0µMFP5
0µM
TFP20µ
M
TFP50µ
M
0
20
40
60
80
100
120
**
**
**
viab
ilida
de ce
lular
(% do co
ntrole)
K562 K562+BAPTA-AM+E-64
73
com as células K562, antes da adição de TR 20 µmol/L por 24 horas e medimos a viabilidade
celular, através do método de redução de MTT. Como pode ser observado na Figura. 24, a
pré-incubação da 3-MA inibiu o efeito indutor de morte celular exibido por TR, o que sugere
que a morte celular induzida por TR ocorre pelo processo de autofagia.
Figura 24. Efeitos da 3-MA sobre a morte celular induzida por TR. Células K562 (2x105por poço) foram incubadas com 3-MA 5mmol/L por 1 hora e TR 25 µmol/L por 24 horas. A viabilidade foi avaliada por meio de teste de redução do MTT e a porcentagem de células viáveis foi calculada em relação ao controle (100%).. *TR+3-MA estatisticamente diferente de K562 (p<0.05).
4.9. Avaliação de participação de estresse oxidativo na morte celular
induzida pelas fenotiazinas
Como os danos oxidativos às macromoléculas biológicas causados por EROs estão
envolvidos na TPM induzida por pró-oxidantes, foi avaliado se as fenotiazinas eram capazes
de causar oxidação de lipídeos.
A oxidação de lipídeos é uma reação radicalar em cadeia, que leva à formação de vários
subprodutos. Alguns destes apresentam a capacidade de reagir com TBA formando um
cromóforo, cuja absorbância é proporcional à lipoperoxidação (BUEGE & AUST, 2004).
Células K562 foram incubadas com fenotiazinas (50 µmol/L) por 4 horas e a
lipoperoxidação de membrana foi avaliada pela formação de TBARs. Como foi observado
anteriormente, a morte celular induzida pelas fenotiazinas envolve a participação lisossomal,
com liberação de cisteíno catepsinas; estes ensaios foram realizados também com fração
lisossomal-mitocondrial isolada de células K562, incubadas com fenotiazinas por 10 minutos.
Como pode ser observada na Figura 25, a incubação das fenotiazinas com células K562 (A) e
Controle TR25µM TR25µM + 3-MA5mM0
20
40
60
80
100
*
viab
ilida
de celular
(% do co
ntrole)
74
com a fração lisossomal-mitocondrial (B) não resultou na formação de TBARS, sugerindo
que estes compostos não são capazes de iniciar diretamente a oxidação de lipídeos de
membranas nestas células.
Figura 25. Efeitos das fenotiazinas sobre a formação de TBARs em células K562 (A) e lisossomos (B). Células K562 (1x106 células/mL) foram incubadas com TR, FP e TFP (50 µmol/L) por 4 horas, e lisossomos isolados das mesmas foram incubados com TR, FP e TFP (20 e 50 µmol/L) por 10 minutos. A formação de TBARs na membrana de células K562 e na membrana lisossomal foi avaliada pela determinação do malondialdeído (MDA). Como controle positivo foi utilizado com (NH4)2 Fe(SO4)2 50 µmol/L (Fe2+). A concentração de MDA foi calculada a partir de ε = 1,56x105 (moles/L)-1.
Controle
TR20µM
TR50µM
FP20µM
FP50µM
TFP20µM
TFP50µM
Fe2+
0,00
0,04
0,08
0,12
0,16 B
TBARs
(µmol/m
g proteína)
Controle
TR 50µM
FP 50µM
FP 50µM
Fe2+
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0 A
TBARs
µmol/m
g/proteína
75
Para ratificar que a morte celular induzida pelas fenotiazinas não envolve a oxidação de
lipídeos de membrana, incubamos vitamina E (50 e 100 µmol/L) por 30 minutos e a
viabilidade celular foi avaliada por teste de redução de MTT. A vitamina E é um agente
antioxidante lipossolúvel, que confere a proteção à membrana celular por atuar como quelante
dos oxidantes produzidos durante a liperoxidação (NIKIE & NOGUCHI, 2004).
Como pode ser observada na Figura 26, a presença da vitamina E não interferiu no
efeito indutor de morte celular exibido por TR e FP, o que corrobora a hipótese de que a
morte celular induzida por estes compostos não envolve a participação de danos oxidativos de
membrana. Entretanto, a vitamina E 100 µmol/L promoveu uma proteção significativa na
morte celular induzida por TFP 20 µmol/L, sugerindo que o mecanismo de ação destas drogas
sobre a morte celular pode não ocorrer da mesma maneira para os diferentes derivados
fenotiazínicos.
control
e20µ
M30µ
M20µ
M30µ
M20µ
M30µ
M
0
20
40
60
80
100
*
TFPFPTR
viabilidade
celular
(% do controle)
K562 K562 + Vit E (50µmol/L) K562 + Vit E (100µmol/L)
Figura 26. Efeitos da vitamina E sobre a morte celular induzida pelas fenotiazinas em células K562. Células K562 (2x105 células por poço) foram incubadas com vitamina E (50 µmol/L and 100µmol/L) 30 minutos e fenotiazinas (20 e 30 µmol/L) por 24 horas. A viabilidade foi avaliada por meio de redução do MTT, e a porcentagem de células viáveis foi calculada em relação ao controle (100%). * K562 + vitamina E estatisticamente diferente de K562 (p<0.05).
Ainda que as fenotiazinas não apresentassem efeito indutor de oxidação lipídica,
avaliamos seus efeitos sobre a oxidação de grupos tiólicos de proteínas utilizando o ácido 5,5-
76
ditiobis-nitrobenzóico (DTNB), que reage com grupamentos tiólicos reduzidos absorvendo
luz no comprimento de onda de 412 nm.
Como pode ser observado na Figura 27, a incubação de TR, FP e TFP 35 µmol/L
resultou em oxidação dos grupos tiólicos de proteínas. TR e FP apresentaram intensidade de
efeito parecido e menor que TFP, que foi a fenotiazina mais potente em oxidar SH, mas não
em induzir a morte celular.
Ainda na mesma figura, podemos observar que a incubação com EGTA 2,5 mmol/L por
5 min inibiu o efeito de TFP sobre a oxidação de grupamentos tiólicos de proteínas, o que
indica que a oxidação dos grupos tiólicos, promovida por TFP, ocorre devido à elevação de
Ca2+.
Controle
t-BOO
H TR FP TFP
0
20
40
60
80
100
120
**
*
**
proteína -SH (%)
K562 K562 + EGTA
Figura 27. Oxidação de grupos tiólicos de proteínas pelas fenotiazinas. As células (1x106 células/mL) foram incubadas com EGTA 2,5 mmol/L por 5min TR, FP e TFP 35 µmol/L por 4 horas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal em estufa com 5% de CO2 a 37ºC. O conteúdo de grupamentos tiólicos reduzidos de proteínas foi medido espectrofotometricamente em 412 nm usando DTNB. Como controle positivo foi utilizado o oxidante t-butilhidroperóxido (t-BOOH) 2 mM.*Estatisticamente diferente do controle e ** K562+EGTA estatisticamente diferente de K562 (p<0.05).
A glutationa reduzida (L-g-glutamil-L-cisteinil-glicina GSH) é um tripeptídeo que
possui um resíduo tiólico de cisteína, e está presente em altas concentrações na matriz
mitocondrial e no citosol, mantendo um ambiente redutor e participando do sistema de
eliminação de peróxidos intracelulares (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1989). Sendo
assim, avaliamos os efeitos das fenotiazinas sobre os níveis celulares de GSH utilizando o
OPT. Como pode ser observado na Figura 28, as fenotiazinas TR e TFP foram capazes de
diminuir os níveis de GSH, enquanto FP não apresentou efeito significativo. Uma vez que as
77
fenotiazinas foram capazes de reagir com grupamentos tiólicos de proteínas celulares, este
resultado sugere que tal efeito pode se estender aos grupos tiólicos da GSH, sem afetar o
estado redox celular.
Da mesma forma que para os grupamentos tiólicos totais, a pré-incubação com EGTA
2,5 mmol/L foi capaz de inibir a oxidação de GSH induzida por TFP, indicando que este
processo é resultado do aumento da [Ca2+]c.
Figura 28. Efeitos das fenotiazinas sobre os níveis celulares de GSH. As células (1x106 células/mL) foram incubadas com EGTA 2,5 mmol/L por 5 minutos TR, FP e TFP 35 µmol/L por 4 horas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal em estufa com 5% de CO2 a 37ºC. Os níveis de GSH foram avaliados fluorimetricamente usando OPT. Como controle positivo foi utilizado o oxidante t-butilhidroperóxido (t-BOOH) 2 mM. .*Estatisticamente diferente do controle e ** K562+EGTA estatisticamente diferente de K562 (p<0.05).
4.10. Efeitos das fenotiazinas no estado excitado sobre a viabilidade de
células leucêmicas K562: comparação com estado fundamental
Uma vez que as fenotiazinas, no estado fundamental, são capazes de diminuir a
viabilidade de células K562, avaliamos os efeitos das fenotiazinas fotoexcitadas sobre a
viabilidade de células K562. Para efeito comparativo, os resultados obtidos foram
apresentados como curvas de viabilidade celular, juntamente com as curvas obtidas com as
fenotiazinas no estado fundamental. As amostras foram irradiadas em uma placa de 96 poços
por 30 minutos, com uma lâmpada UV de 4 W de potência em comprimento de onda de 365
nm a uma distância de 15 cm e a viabilidade celular foi avaliada por meio do teste de redução
Controle
t-BOO
H TR FP TFP
0
20
40
60
80
100
120
*
*
**
GSH (%)
K562 K562 + EGTA
78
de MTT. Todas as fenotiazinas testadas em estado excitado apresentaram maior citotoxidade
sobre as células K562, em relação àquelas no estado fundamental, demonstrado pelo
deslocamento das curvas para a esquerda, com diminuição dos valores de EC50 (Figura 29).
Diferentemente do observado no estado fundamental, onde TR foi a mais potente fenotiazina
indutora de morte celular, no estado excitado TFP (Figura 29A) apresentou maior efeito
citotóxico, seguida por FP (Figura 29B) e TR (Figura 29C). A comparação entre os valores
de EC50 pode ser observada na Tabela 3. Esses resultados indicam que as fenotiazinas TR, FP
e TFP apresentam propriedades fotoquímicas interessantes sobre sistemas biológicos, com
potencial aplicação dessa classe de compostos como sensibilizadores para Terapia
Fotodinâmica.
0 20 40 60 80 100
0
20
40
60
80
100A
viab
ilida
de celular
(% do co
ntrole)
TFP (µmol/L)
TFP (fundamental)Ec50= 32,6 µmol/L
TFP (excitado)Ec50= 5,6 µmol/L
0 20 40 60 80 1000
20
40
60
80
100B
viabilidad
e ce
lular
(% do controle)
FP µmol/L
FP (fundamental)Ec50= 36,6 µmol/L
FP (excitado) Ec50= 6,0 µmol/L
79
Figura 29. Efeitos das fenotiazinas no estado excitado sobre a viabilidade de células K562. As células K562 (2x105 células/poço) foram irradiadas por 30 minutos com TR (A), FP (B) e TFP (C), seguida de incubação por 24 horas. A viabilidade foi avaliada pelo teste de redução do MTT. A porcentagem de células viáveis foi calculada em relação ao controle (100%) e os valores de EC50 estão representados em µmol/L.
Tabela 4. Comparação dos valores de EC50 para as fenotiazinas (TR, FP e TFP) no estado fundamental e excitado sobre a viabilidade de células K562.
Fundamental Excitado
EC50 tioridazina (TR) 25,6 µmol/L 8,7 µmol/L
EC50 flufenazina (FP) 36,6 µmol/L 6,0 µmol/L
EC50 trifluoperazina (TFP) 33,1 µmol/L 5,2 µmol/L
0 20 40 60 80 100
0
20
40
60
80
100C
viab
ilida
de celular
(% do co
ntrole)
TR µmol/L
TR (fundamental) Ec50= 25,6µmol/L
TR (excitado) Ec50= 8,7µmol/L
80
5. DISCUSSÃO
A LMC é uma doença clonal maligna, caracterizada pela excessiva proliferação da
linhagem mielóide e pela perda progressiva de diferenciação celular (DEININGER et al.,
2000). Embora haja diversos estudos, envolvendo a descoberta e/ou o desenvolvimento de
novos compostos, capazes de induzir a mieloproliferação, o tratamento da LMC continua
sendo um desafio. A LMC não é uma doença curável por terapia medicamentosa, sendo o
transplante de medula óssea a única modalidade curativa de tratamento, por induzir a
remissão molecular, com a eliminação de transcritos de Bcr/Abl (SAWYERS et al., 1995;
HEHLMANN & SAUSSELE, 2008; PEGGS & MACKINNON, 2003; FRAZER et al.,
2007). Sendo assim, tornam-se muito importantes estudos de compostos capazes de induzir
morte em células leucêmicas mieloblásticas, explorando mecanismos moleculares e
bioquímicos envolvidos no processo, investigando possíveis vias alternativas para tratamento
da LMC.
Trabalhos publicados pelo nosso grupo demonstraram que TR, FP e TFP apresentam
uma potente atividade antioxidante, inibindo a TPM em baixas concentrações (RODRIGUES
et al., 2002); e, quando fotoexcitadas, ocorre a formação de um cátion radical (RODRIGUES
et al., 2006), capaz de causar a lipoperoxidação em mitocôndrias isoladas (RODRIGUES et
al., 2005). Além disso, dados do nosso grupo ainda não publicados mostraram que estes três
compostos, em altas concentrações, são capazes de interagir com a membrana mitocondrial,
induzir a TPM e a liberação do citocromo c, eventos envolvidos na apoptose (CRUZ et al.,
2010 – manuscrito submetido) .
Dados da literatura demonstraram que as fenotiazinas apresentam efeito supressor de
proliferação de células leucêmicas (ZHELEV et al., 2004; HAIT et al., 1985;
NORDENBERG et al., 1999). Nossos resultados corroboram esses dados, uma vez que as
fenotiazinas (TR, FP e TFP) foram capazes de promover morte em células leucêmicas
mieloblásticas humanas (K562), visto pelos baixos valores de EC50. Dentre as três
fenotiazinas testadas a que apresentou maior efetividade citotóxica foi TR, seguida por TFP e
FP.
Visto que as fenotiazinas apresentam a capacidade de afetar a viabilidade de células
K562, a caracterização do tipo de morte celular induzido se torna um ponto importante a ser
avaliado no nosso trabalho.
81
Células apoptóticas apresentam diversas alterações bioquímicas; dentre elas, a
externalização da fosfatidilserina, que permite rápido reconhecimento e fagocitose por
macrófagos e células vizinhas (DROGA-MAZOVEC et al., 2008; LOCKSHIN et al., 2004).
Nossos resultados, nos quais avaliamos a porcentagem de células que sofreram externalização
da fosfatidilserina (visualizado por ensaios com marcação por Anexina V-FTIC) e perda de
integridade de membrana (visualizado por ensaios com marcação por IP), demonstraram uma
discreta porcentagem de células em necrose e necrapoptose; entretanto, observou-se uma
predominância de morte celular por apoptose foi observada.
A ativação de caspases é um evento importante na iniciação e execução do processo de
apoptose. Nossos ensaios por citometria de fluxo com marcação com anticorpo anti-caspase -
3, clivada demonstraram que morte celular induzida pelas fenotiazinas é dependente da
ativação da caspase -3.
Dados da literatura mostram a participação de lisossomos no disparo da morte celular
por apoptose, através da clivagem de Bid e homólogos da família Bcl-2. Sendo assim, drogas
capazes de induzir a PML, com liberação do seu conteúdo para citosol, podem apresentar
potencial apoptótico (DROGA-MAZOVEC et al., 2008).
Nossos resultados demonstraram que as fenotiazinas foram capazes de induzir alteração
na permeabilidade da membrana lisossomal, com a liberação de catepsinas lisossomais. Sabe-
se que fenotiazinas apresentam caráter anfipático e podem interagir com membranas
biológicas (MALHEIROS et al., 1998). Assim, é possível que as fenotiazinas interajam
diretamente com a membrana lisossomal, promovendo permeabilização.
Células tumorais apresentam alterações no compartimento lisossomal, e tais alterações
podem facilitar o processo de morte celular pela via lisossomal (FEHRENBACHER &
JAATTELA, 2005). Como nossos resultados demonstraram que a morte celular induzida
pelas fenotiazinas envolve a PML, investigamos se os compostos também afetam a
viabilidade de células normais, em comparação com as células K562. Para isso, utilizamos
células mononucleares normais, onde observamos que as fenotiazinas apresentam baixo efeito
citotóxico sobre a viabilidade de células normais, em relação a tumorais. Este resultado é
muito importante, com relação ao potencial farmacológico das fenotiazinas, para que sejam
utilizadas como antitumorais, pois mostra uma citotoxicidade seletiva destes compostos para
células tumorais, em relação às células normais, característica desejável em quimioterapia.
O efeito sobre lisossomos exibido por TR não foi exclusivo, uma vez que TR também
apresentou efeito sobre mitocôndrias, visto pela dissipação ∆ψ de células K562 marcadas com
fluoróforos catiônicos (TMRM e rodamina 123). Não sabemos se isso é um efeito direto das
82
fenotiazinas sobre as mitocôndrias; porém, uma possível comunicação entre estas organelas
na morte celular induzida por TR foi observada, uma vez que a pré-incubação do E-64 inibiu
o efeito de TR sobre a dissipação do ∆ψ. Entretanto, com 50 µmol/L, o efeito de TR parece
ser inespecífico, agindo simultaneamente, em mitocôndrias e lisossomos, uma vez que nestas
condições o ∆ψ sequer foi formado.
Mitocôndrias apresentam um sofisticado sistema de controle de homeostase de Ca2+. O
transporte deste cátion, através da membrana mitocondrial interna, ocorre para estimular e
controlar o ciclo de Krebs e a fosforilação oxidativa, entre outras vias metabólicas, através da
ativação da produção de NADH pela piruvato desidrogenase, isocitrato desidrogenase, α-
cetoglutarato desidrogenase e a F1Fo-ATP sintase, além de estimular o transporte de elétrons e
ativar o translocador de nucleotídeos de adenina (ANT), participando da regulação da
produção de ATP (GUNTER et al., 1998). Entretanto, em algumas condições, pode ocorrer
um aumento súbito da [Ca2+]c, com subsequente captação pela mitocôndria, como tentativa de
manutenção da homeostase. No entanto, a elevação da [Ca2+]m pode induzir TPM, associada
à despolarização, desacoplamento da fosforilação oxidativa, aumento da produção de EROs e
liberação de proteínas pró-apoptóticas, como o citocromo c e Smac/DIABLO para o citosol,
promovendo a apoptose (BROOKES et al., 1978; SMAILI et al., 2003).
TR induziu um aumento instantâneo das [Ca2+]c, com subsequente captação pela
mitocôndria. Estes dados sugerem que esse aumento de Ca2+ TR induzido é, temporalmente, o
primeiro evento observado, e este parece desencadear todos os demais que culminam na
apoptose. Essa hipótese foi corroborada pelo efeito inibitório da morte celular induzida pelas
fenotiazinas por quelantes de Ca2+ (BAPTA-AM e EGTA), sendo que, na presença destes
quelantes e E-64, a morte celular foi completamente abolida. Esses dados comprovam que as
fenotiazinas apresentam a capacidade de indução de apoptose via aumento de Ca2+ citosólico,
que dispara a permeabilização de membrana lisossomal, com a liberação de catepsinas
lisossomais e dissipação do potencial de membrana que devem funcionar amplificando o
processo que culmina na morte das células.
Além disso, vale ressaltar que o E-64 é também capaz de inibir a calpaína, uma protease
neutra ativada por Ca2+ (LU, et al. 2002), que está envolvida na morte celular autofágica ou
apoptótica. Tal evento certifica o envolvimento do Ca2+ no disparo da morte celular induzida
pelas fenotiazinas.
Na morte celular induzida pelas fenotiazinas, foram observadas algumas características,
que sugerem que o evento possa ocorrer por apoptose e/ou por autofagia, como o aumento
súbito de Ca2+. Nas imagens obtidas por microscopia confocal, podemos observar uma intensa
83
vacuolização no citosol e formação de blebs (bolhas) de membrana, características de ambos
[conferir se é isso] os processos de morte celular.Nós observamos através de ensaios onde
avaliamos os efeitos de um inibidor de autofagia (3-MA) sobre a morte celular induzida pelas
fenotiazinas, que a morte exibida pelos compostos está envolvida com o processo autofágico.
Dados da literatura demonstraram que a inibição da apoptose pode disparar a morte
celular por autofagia, bem como, a inibição da autofagia pode desencadear a apoptose
(GOZUACIK, et al., 2004). Os dados obtidos, no nosso trabalho, sugerem que a morte celular
induzida pelas fenotiazinas pode ocorrer por apoptose, por autofagia ou por ambos.
A permeabilização de membranas é um evento que pode ser desencadeado por danos
oxidativos à bicamada lipídica, conhecida como lipoperoxidação (HALLIWELL &
GUTTERIDGE, 1986). Mesmo sabendo, previamente, que as fenotiazianas apresentam uma
potente atividade antioxidante (RODRIGUES et al, 2002), investigamos se as
permeabilizações lisossomal e mitocondrial observadas poderiam ser decorrentes de danos
oxidativos às membranas, causados pelas fenotiazinas.
Nossos resultados demonstraram que as fenotiazinas não são capazes de iniciar
diretamente, a oxidação de lipídeos de membranas nestas células, nem de induzir a formação
de radicais livres, capazes de causar lipoperoxidação (ânions superóxido, peróxido de
hidrogênio e radicais hidroxil). Além de não induzir a oxidação dos lipídeos da membrana, os
valores de TBARs, obtidos na presença de fenotiazinas, foram sempre menores que o
controle, em concordância com dados da literatura, que demonstram que estas moléculas
possuem potente atividade antioxidante. Além disso, observamos que a presença da vitamina
E não interferiu no efeito indutor de morte celular, exibido por TR e FP, corroborando a
hipótese de que a morte celular induzida por estes compostos não envolve a participação de
danos oxidativos de membrana. Entretanto, a vitamina E, em concentrações elevadas (100
µmol/L), promoveu uma proteção significativa na morte celular induzida por TFP 20 µmol/L,
sugerindo que o mecanismo de ação destas drogas sobre a morte celular pode não ocorrer da
mesma maneira para os diferentes derivados fenotiazínicos.
A oxidação de grupos tiólicos de proteínas está associada ao estresse oxidativo, ou
situações relacionadas à transição de permeabilidade mitocondrial (TPM) e à liberação de
proteínas anti-apoptóticas para o citosol, envolvidas na morte celular por apoptose
(KROEMER, et al 2007). E, ainda que não tenha sido observada oxidação lipídica em células
K562 incubadas com as fenotiazinas, avaliamos se estes compostos seriam capazes de causar
oxidação de grupos tiólicos de proteínas. Nós observamos que as fenotiazinas foram capazes
de promover a oxidação de grupos tiólicos, sendo que TR e FP apresentaram intensidade de
84
efeito parecido e menor que TFP, que foi a fenotiazina mais potente. Estes resultados não
seguem a mesma ordem de potência observada nos ensaios de viabilidade, que demonstraram
que TR é a mais efetiva em induzir morte celular. Isso sugere que a oxidação de grupos
tiólicos não é a causa direta da morte celular induzida pelas fenotiazinas, ou, pelo menos, não
é o único fator contribuinte.
Como descrito nos resultados anteriores, a incubação das células com as fenotiazinas
não foi acompanhada de oxidação de lipídeos de membrana sugerindo a ausência do
envolvimento de espécies reativas de oxigênio (EROs) na morte celular observada. No
entanto, como foi observada a oxidação de grupamentos tiólicos de proteínas sem a
ocorrência da respectiva oxidação lipídica, esse primeiro efeito pode ser decorrente da ação
direta das drogas sobre esses grupos, ou sobre outras moléculas ou enzimas que afetam esses
grupamentos. Em contrapartida, observamos que a incubação com EGTA inibiu o efeito de
TFP sobre a oxidação de grupamentos tiólicos de proteínas. Este resultado indica que a
oxidação desses grupos tiólicos induzida por TFP é promovida pela elevação de Ca2+ induzida
pelas fenotiazinas.
A ausência de oxidação de lipídeos das membranas celulares de células K562 incubadas
com as fenotiazinas sugere a ausência de radicais livres no processo, mas não exclui a
participação de EROs na morte celular induzida pelas fenotiazinas, pois estas podem ter sido
geradas e eliminadas pelo sistema de defesa antioxidante celular antes de causar os danos
oxidativos. Particularmente, o aumento da produção mitocondrial de radicais livres pode
exceder a capacidade de defesa do sistema antioxidante e causar danos oxidativos a
macromoléculas associados à TPM (GUNTER et al., 1998; FRANCO et al., 2007).
A GSH é um tripeptídeo que possui um resíduo tiólico de cisteína, está presente em
altas concentrações na matriz mitocondrial e no citosol, mantendo um ambiente redutor e
participando do sistema de eliminação de peróxidos intracelulares (AON et al., 2007).
Visto que as fenotiazinas foram capazes de induzir a oxidação de grupamentos tiólicos,
nos avaliamos os efeitos das fenotiazinas sobre os níveis celulares de GSH, onde observamos
que TR e TFP foram capazes de diminuir os níveis de GSH. Esses dados sugerem que, uma
vez que TR e TFP foram capazes de reagir com grupamentos tiólicos de proteínas celulares,
tal efeito pode se estender aos grupos tiólicos da GSH sem afetar o estado redox celular.
Além disso, tal efeito de TFP, da mesma forma que para grupamentos tiólicos totais, foi
inibido também na presença de EGTA indicando que este processo é resultado do aumento da
[Ca2+]c.
85
Nos resultados onde avaliamos a indução de estresse oxidativo na morte celular induzida
pelas fenotiazinas, obtivemos informações muito interessantes. Notamos que TFP apresenta
um comportamento diferente dos outros dois compostos. Visto que a vitamina E foi capaz de
proteger somente a morte celular induzida por TFP. Além disso, a intensidade dos efeitos de
TFP na indução de oxidação de grupos tiólicos de proteínas e na diminuição dos níveis de
GSH foi muito maior do que os observados em TR e FP. O efeito de TFP sobre a oxidação de
grupos tiólicos e a diminução dos níveis de GSH parece estar envolvido com a sinalização de
Ca2+, efeito que não foi exibido pelos outros dois compostos. Os mecanismos pelos quais TFP
dispara a morte das células K562, e a seqüência de eventos envolvidas no processo, serão
investigados futuramente.
Diversos trabalhos têm demonstrado que compostos que contêm o núcleo tiazínico (dois
anéis benzênicos ligados por um átomo de nitrogênio e um de enxofre) exibem propriedades
fotoquímicas e fototoxicidade (BHOWMIK et al., 2001), sendo que tais propriedades de
fotossensibilização podem promover danos oxidativos em macromoléculas, causando
alteração ou perda de sua função (MOORE, 1977). A irradiação das fenotiazinas gera um
estado excitado triplete que, dependendo do estado de agregação e da polaridade do meio,
pode gerar um derivado sulfóxido ou um cátion radical, capaz de causar danos a
macromoléculas biológicas (RODRIGUES et al., 2006).
Como esperado, nossos resultados preliminares demonstraram que a irradiação das
fenotiazinas incubadas com as células tumorais resultou na diminuição dos valores de EC50,
obtidos pelas curvas de viabilidade celular, sugerindo um aumento da citotoxicidade das
fenotiazinas fotoexcitadas. No entanto, entre as fenotiazinas estudadas, observamos uma
ordem de potência citotóxica diferente daquela obtida com as fenotiazinas no estado
fundamental. Ainda em caráter especulativo, acreditamos que as fenotiazinas menos
hidrofóbicas (TFP e FP) são mais eficientemente fotoexcitadas em relação à TR, que é mais
hidrofóbica, enterrando-se mais profundamente na bicamada lipídica, atrapalhando sua
adequada irradiação. Será dada a continuidade a estes estudos, investigando os mecanismos
moleculares associados ao aumento da citotoxicidade.
86
6. CONCLUSÃO
Este estudo que demonstrou que as fenotizinas são potentes indutores de morte em
células leucêmicas K562. Os mecanismos moleculares responsáveis por tal efeito envolvem,
inicialmente, a elevação de Ca2+ citosólico seguida por subsequente captação pelas
mitocôndrias, promovendo dissipação do ∆Ψ. Paralelamente, o aumento de Ca2+, ou a própria
fenotiazina diretamente, promoveu permeabilização lisossomal, com a liberação das
catepsinas, que também contribuíram para a perda do gradiente eletroquímico. A captação de
Ca2+ pelas mitocôndrias, provavelmente dispara a TPM associada à oxidação de grupamentos
tiólicos de proteínas e GSH, na ausência de danos oxidativos por EROs. Foi observado,
também, um comportamento diferente de TFP com relação à oxidação de grupos tiólicos de
proteínas e na diminuição dos níveis de GSH, efeito que será posteriormente investigado.
As fenotiazinas induziram morte celular, predominantemente apoptótica e a proteção
por 3-MA, sugere que a morte celular, promovida pelas fenotiazinas, em envolve o processo
de autofagia, de apoptose ou ambos. Na verdade, a elevação de Ca2+ no citosol pode disparar
a autofagia, que evolui para apoptose. Uma característica muito importante para o uso de
fenotiazinas como antitumorais é a seletividade apresentada, induzindo a morte de células
tumorais, mas não as normais, demonstrando um potencial farmacológico enorme dessas
drogas e aplicação na quimioterapia antitumoral. Ainda, os resultados preliminares mostram
que a irradiação das fenotiazinas aumenta significativamente sua citotoxicidade, fato que será
posteriormente estudado para possível aplicação na terapia fotodinâmica.
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