Universidade Federal de Ouro Preto

Programa de Ps-Graduao em Engenharia Ambiental

Mestrado em Engenharia Ambiental

Estudo da Extrao e Desenvolvimento de Metodologia para

Determinao Simultnea de Microcontaminantes Orgnicos em gua

Superficial por GC-MS e Mtodos Quimiomtricos

Ananda Lima Sanson

Ouro Preto, MG

2012

Universidade Federal de Ouro Preto

Programa de Ps-Graduao em Engenharia Ambiental

Mestrado em Engenharia Ambiental

Ananda Lima Sanson

Estudo da Extrao e Desenvolvimento de Metodologia para

Determinao Simultnea de Microcontaminantes Orgnicos em gua

Superficial por GC-MS e Mtodos Quimiomtricos

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-

Graduao em Engenharia Ambiental,

Universidade Federal de Ouro Preto, como parte

dos requisitos necessrios para a obteno do

ttulo de Mestre em Engenharia Ambiental.

rea de Concentrao: Meio Ambiente.

Orientadora: Profa. Dr

a. Gilmare Antnia da

Silva

Co-orientador: Prof. Dr. Robson Jos de Cssia

Franco Afonso

Ouro Preto, MG

Julho de 2012

Catalogao: sisbin@sisbin.ufop.br

S229e Sanson, Ananda Lima. Estudo da extrao e desenvolvimento de metodologia para

determinao simultnea de microcontaminantes orgnicos em gua superficial por GC-MS e mtodos quimiomtricos [manuscrito]: / Ananda Lima Sanson 2012.

xv, 151f. : il. color.; grafs.; tabs. Orientadores: Profa. Dra Gilmare Antnia da Silva. Prof. Dr. Robson Jos de Cssia Franco Afonso. Dissertao (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto

de Cincias Exatas e Biolgicas. Programa de Ps-Graduao em Engenharia Ambiental.

rea de concentrao: Meio Ambiente.

1. Preparao de amostra (Qumica) - Teses. 2. Cromatografia gs - Teses. 3. Espectrometria de massa Teses. I. Silva, Gilmare Antnia da. II. Afonso, Robson Jos de Cssia Franco. III. Universidade Federal de Ouro Preto. IV. Ttulo.

CDU: 543.54

mailto:Sisbin@sisbin.ufop.br

AGRADECIMENTOS

Agradeo Deus por ter aberto essa porta para o mestrado para mim. Meus pais,

Pedro e Regina e meus irmos, Pedro Hugo e Caio, que sempre me fizeram ver mais longe e

acreditaram em mim. Sem o apoio de vocs eu no seria capaz de continuar e, por mais

distante que estejam sempre me apoiaram a continuar, mesmo quando eu pensei em desistir.

Amo muito vocs e lhes devo esta conquista.

Tambm preciso agradecer ao meu companheiro e amigo de todas as horas, boas e

ruins, que nunca me deixou ficar pra baixo e duvidar da minha capacidade: Bruno, essa vitria

tambm sua, te amo muito!

Existem muitas pessoas que tambm fizeram parte dessa minha caminhada: Jorge,

Cida, Cyntia e Paulinho... que me acolheram e com as quais dividi muitas risadas; ao pessoal

do Laboratrio de Cromatografia e Espectrometria de Massas: Maurcio, Keila, Brbara,

Dbora, Jlio, Carlcio, Rayssa, Andr, Cludia, Tereza, Rafaela, Jlia, Amanda, Ramon e

todos aqueles que j passaram por l... obrigada pela companhia nos dias (e noites) de

trabalho; s meninas do Laboratrio de Estudos em Quimiometria: Luciana (super parceira),

Jussara, Gleice, Taciana (parceira e amiga de todas as horas)... sempre pude contar com

vocs, muito obrigada; ao pessoal de Salinas: Daniela, Oscar, Magalhes... obrigada pela

companhia e por todas as risadas compartilhadas; s minhas queridas amigas-irms: Fernanda

e Fernanda... vocs sempre me apoiando nas minhas aventuras e me dando fora para

continuar com as minhas escolhas... amo muito vocs e muito obrigada; todos que

participaram diretamente ou no, mas que me apoiaram nessa trajetria: Diego, Luide,

Shelen... valeu!!

E logico, tenho que agradecer queles que me transmitiram seu conhecimento e

amizade, aos meus orientadores Gilmare e Robson. Muito obrigada vocs que tambm me

ajudaram a passar por esse perodo do mestrado, sem vocs isso no seria possvel.

Agradeo tambm a todos do ProAmb e UFOP.

Por fim, obrigada a todos que fazem parte do meu dia-a-dia!

A mente que se abre para uma nova ideia jamais voltar ao seu tamanho original.

Albert Eistein

V

RESUMO

Microcontaminantes emergentes constituem um grupo de substncias que foco de

intensa preocupao por parte de diversas agncias internacionais. Neste grupo encontram-se

diferentes classes de contaminantes, sendo elas: poluentes orgnicos persistentes, frmacos e

produtos de cuidados pessoais, medicamentos veterinrios, perturbadores endcrinos e

nanomateriais. Mesmo sendo encontrados em concentraes da ordem de ng/L os mesmos so

capazes de provocar efeitos adversos em humanos e na vida aqutica; por este motivo seu

monitoramento se faz necessrio. Neste trabalho foram estudadas as seguintes classes de

microcontaminantes: perturbadores endcrinos (estradiol, etinilestradiol, estrona, 4-octilfenol,

4-nonilfenol, dietilftalato, dietilhexilftalato e bisfenol A), frmacos (diclofenaco, ibuprofeno,

paracetamol, naproxeno, cido acetil saliclico e genfibrozila) e o estimulante cafena. Como

as concentraes desses contaminantes em gua so bastante reduzidas preciso realizar uma

etapa de extrao para que suas anlises sejam viveis. Deste modo foram estudadas as

seguintes tcnicas: extrao em fase slida (SPE), extrao lquido-lquido (LLE) e

microextrao lquido-lquido dispersiva (DLLME). Para um estudo sistemtico de todas as

variveis que podem influenciar as metodologias de extrao, foram utilizados planejamentos

experimentais multivariados (fatorial fracionrio e Doehlert, ambos com ponto central). A

SPE foi a tcnica mais efetiva e as trs variveis estudadas foram significativas (volume, pH

da amostra e pH da lavagem). A maioria dos analitos apresentaram valores de rea

cromatogrfica maximizadas com o pH da amostra e da lavagem cido e nveis mdios de

volume, dentro da faixa experimental investigada. Assim, a extrao otimizada foi efetuada

em cartucho Strata-X, com 500 mL de amostra em pH 2,0, lavagem com gua em pH 2,0 e

eluio realizada por 3 3 mL de acetato de etila. A determinao dos compostos estudados

foi realizada por cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas (GC-MS),

passando por etapa prvia de derivatizao, e a metodologia foi validada apresentando limite

de deteco do mtodo (MLOD) de 0,5 a 5,0 ppb e limite de quantificao do mtodo

(MLOQ) na ordem de 0,5 a 75 ppb, e valores de recuperao de 33 a 160 %. Ainda, por haver

uma etapa anterior de pr-concentrao, os nveis de concentrao em amostras naturais

passveis de anlise so 1.000 vezes menor. A metodologia desenvolvida foi utilizada para

anlise de amostras de gua superficial coletadas ao longo da bacia do Rio Doce e os

resultados dessas anlises foram tratados por meio da anlise das componentes principais e da

VI

rede neural de Kohonen, onde foi possvel observar o perfil de contaminao das amostras

coletadas e relacion-lo com o local de coleta.

Palavras-chave: microcontaminantes emergentes, mtodos de preparo de amostra,

cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas (GC-MS), otimizao multivariada

e anlise exploratria.

VII

ABSTRACT

Emergents microcontaminants are a group of substances that is the focus of intense

concern by various international agencies. In this group there are different classes of

contaminants, such as: persistente organic pollutants, pharmaceuticals and personal care

products, veterinary drugs, endocrine disruptors and nanomaterials. Although the

concentrations usually found are in the ng/L levels, they are able to cause adverse effects on

aquatic life in humans and, for this reason, their monitoring are necessary. In this study, the

following classes of microcontaminants were evaluated: endocrine disruptors (estradiol,

ethinyl estradiol, estrone, 4-octylphenol, 4-nonylphenol, diethyl phthalate, dietilhexilftalato

and bisphenol A), pharmaceuticals (diclofenac, ibuprofen, acetaminophen, naproxen,

acetylsalicylic acid and gemfibrozil), and the stimulant caffeine. As the concentrations of

these contaminants in water are very small it must be realized an extraction step to become

possible their analyses. Thus it was studied the following techniques: solid phase extraction

(SPE), liquid-liquid extraction (LLE) and dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME).

For a systematic study of all the variables that influence the extraction methodologies, it was

utilized multivariate experimental designs (fractional factorial with central point and

Doehlert). Thus it was selected the SPE as the most effective, considering that all the three

studied variables were significant (volume and pH of the sample and pH of the wash), with

most analytes presenting maximized chromatographic area values with acid pH of sample and

for washing values and medium volume values, in the experimental domain investigated. In

this way, the optimized extraction process was performed on Strata-X cartridge, with 500 mL

of sample in pH 2.0, washing with water in pH 2.0 and elution carried out for 3 3 mL of

ethyl acetate. The determination of the studied compounds was performed by gas

chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS), with a prior step of derivatization,

and the methodology was validated showing MLOD from 0.5 to 5.0 ppb and MLOQ in the

order from 0.5 to 75 ppb, and recovery values of 33 to 160 %. However, since there is a

previous step of pre-concentration, concentration levels in natural samples that may be

analyzed are 1000 times lower. The developed methodology was used to analyze surface

water samples collected along the Rio Doce Basin and the results of these analyses were

treated by principal component analysis and Kohonen neural network where it was possible to

observe the profile of contamination of the collected samples and relate it to the sampling

local.

VIII

Key-words: emerging microcontaminants, sample preparation techniques, gas

chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS), multivariate optimization and

exploratory analysis.

IX

LISTA DE FIGURAS

Figura 2.1- Esquematizao do sistema endcrino humano (SILVA, A. F.). ......................... 23

Figura 2.2- Estrutura qumica do estradiol. ........................................................................... 29

Figura 2.3- Estrutura qumica do etinilestradiol. ................................................................... 30

Figura 2.4- Estrutura qumica da estrona. ............................................................................. 32

Figura 2.5- Estrutura qumica do 4-octilfenol. ...................................................................... 32

Figura 2.6- Estrutura qumica do 4-nonilfenol. ..................................................................... 33

Figura 2.7- Estrutura qumica do bisfenol A. ........................................................................ 33

Figura 2.8- Estrutura qumica do dietilftalato. ...................................................................... 35

Figura 2.9- Estrutura qumica do dietilhexilftalato. ............................................................... 35

Figura 2.10a- Estrutura qumica do cido acetil saliclico. .................................................... 38

Figura 2.11- Estrutura qumica da genfibrozila. .................................................................... 39

Figura 2.12- Estrutura qumica da cafena. ........................................................................... 40

Figura 2.13 - Formao do ction radical por ionizao por eltron (DOWNARD, 2004). .... 49

Figura 2.14- Esquema das etapas do processo de extrao em fase slida. Adaptado de:

http://www.crawfordscientific.com ...................................................................................... 50

Figura 4.1- Esquema do procedimento de extrao em fase slida. ....................................... 72

Figura 4.2- Sistema de extrao para SPE desenvolvido no Laboratrio de Cromatografia e

Espectrometria de Massas - UFOP. ...................................................................................... 73

Figura 4.3- Esquema do procedimento de extrao lquido-lquido estudado. ....................... 76

Figura 4.4- Procedimento realizado para avaliar a microextrao lquido-lquido dispersiva

dos microcontaminantes em estudo. ..................................................................................... 78

Figura 5.1- Reao de derivatizao com BSTFA : 1 %TMCS. Fonte: Sigma-Aldrich Product

Specification. ....................................................................................................................... 88

Figura 5.2- Procedimento de derivatizao otimizado para os microcontaminantes em estudo.

............................................................................................................................................ 89

Figura 5.3- Cromatograma do extrato obtido dos 15 microcontaminantes em estudo aps

processo de anlise otimizado (SPE derivatizao GC-MS), na concentrao de 100 ppb.

............................................................................................................................................ 92

Figura 5.4- Comparao entre os ensaios (1, 2, 3, 4 e PC) dos planejamentos de triagem para

os trs solventes acetato de etila (ACET), diclorometano (DICLO) e metanol (MEOH) para

extrao dos microcontaminantes. ........................................................................................ 94

Figura 5.5- Representao dos stios de interao da fase estacionria do cartucho de extrao

em fase slida Strata-X (Phenomenex). ............................................................................. 96

Figura 5.6- Comparao entre os ensaios (1, 2, 3, 4 e PC) dos planejamentos de triagem para

os trs solventes acetato de etila (ACET), clorofrmio (CLORO) e diclorometano (DICLO)

para extrao dos microcontaminantes. ................................................................................ 97

X

Figura 5.7- Comparao entre os ensaios (1, 2, 3, 4 e PC) dos planejamentos de triagem para

os dois solventes acetato de etila (ACET) e metanol (MET) para extrao dos

microcontaminantes. ............................................................................................................ 99

Figura 5.8- Comparao entre os melhores ensaios de cada metodologia de extrao analisada

para os microcontaminantes. .............................................................................................. 101

Figura 5.9- Proporo de maiores valores de rea de pico em relao ao ensaio (1 a 12 e ponto

central pc) realizado para SPE no planejamento Doehlert. ............................................... 103

Figura 5.10- a) Valores estimados pelo modelo versus valores medidos e b) grfico dos

resduos obtidos do planejamento Doehlert para o naproxeno. ............................................ 105

Figura 5.11- a) Valores estimados pelo modelo versus valores medidos e b) grficos dos

resduos obtidos do planejamento Doehlert para o dietilhexilftalato. .................................. 107

Figura 5.12- a) Valores estimados pelo modelo versus valores medidos e b) grficos dos

resduos obtidos do planejamento Doehlert para o ibuprofeno. ........................................... 108

Figura 5.13- Esquema da metodologia de extrao em fase slida e de derivatizao

otimizados. ........................................................................................................................ 110

Figura 5.14- Cromatograma dos ons monitorados (modo SIM) para o 4-octilfenol-TMS e seu

espectro de massas obtido no modo SCAN......................................................................... 111

Figura 5.15- Cromatograma dos ons monitorados (modo SIM) para o ibuprofeno-TMS e seu

espectro de massas obtido no modo SCAN......................................................................... 112

Figura 5.16- Cromatograma dos ons monitorados (modo SIM) para a estrona-TMS e seu

espectro de massas obtido no modo SCAN......................................................................... 113

Figura 6.1- Grfico de escores da PC1 versus PC2 da anlise por SPE-GC-MS com

derivatizao de 15 microcontaminantes orgnicos em amostras de gua da bacia do Rio

Doce. ................................................................................................................................. 125

Figura 6.2- Grfico de escores da PC1 versus PC2 da anlise por SPE-GC-MS com

derivatizao de 15 microcontaminantes orgnicos em amostras de gua da bacia do Rio

Doce. ................................................................................................................................. 126

Figura 6.3- Perfil geral de distribuio das amostras selecionadas, aps tratamento com a rede

neural de Kohonen. ............................................................................................................ 128

Figura 6.4- Mapas de distribuio individual das variveis (microcontaminantes) utilizadas no

tratamento pela rede neural de Kohonen. ............................................................................ 129

LISTA DE EQUAES

(Equao 4.1)................ ....................................................................................................... 81

(Equao 4.2)...................................................... ................................................................... 81

(Equao 5.1)............................................................................. ........................................... 120

XI

LISTA DE TABELAS

Tabela 2.1- Compostos classificados como perturbadores endcrinos (adaptado de QUEIROZ,

2011). (continua) .................................................................................................................. 27

Tabela 2.2- Mtodos para a determinao de microcontaminantes em amostras ambientais.

(continua)............................................................................................................................. 42

Tabela 4.1- Informaes e caractersticas fsico-qumicas dos microcontaminantes estudados.

(continua)............................................................................................................................. 64

Tabela 4.2- Faixas testadas para as variveis envolvidas na reao de derivatizao. ............ 68

Tabela 4.3- Valores testados durante o processo de otimizao das condies da

cromatografia gasosa e espectrometria de massas para separao e determinao de

microcontaminantes. ............................................................................................................ 69

Tabela 4.4- Variveis e nveis analisados em cada um dos trs planejamentos realizados para a

SPE, um para cada solvente estudado (metanol, acetato de etila e diclorometano). ............... 72

Tabela 4.5- Planejamento fatorial fracionrio 23-1

, resoluo III, com triplicata no ponto

central (pc) para investigao das variveis experimentais da SPE. Os valores entre parntesis

representam os nveis decodificados. .................................................................................... 74

Tabela 4.6- Variveis e nveis avaliados nos planejamentos para triagem da extrao lquido-

lquido dos microcontaminantes em estudo. ......................................................................... 75

Tabela 4.7- Planejamento fatorial fracionrio 23-1

, resoluo III, com triplicata no ponto

central (pc) para investigao das variveis experimentais da LLE. Os valores em parntesis

representam os nveis decodificados. .................................................................................... 76

Tabela 4.8- Nveis das variveis estudadas para a microextrao lquido-lquido dispersiva

dos microcontaminantes em estudo. ..................................................................................... 77

Tabela 4.9- Planejamento fatorial fracionrio 23-1

, resoluo III, com 3 replicatas no ponto

central (pc) para investigao das variveis experimentais da DLLME. Os valores em

parntesis representam os nveis decodificados. ................................................................... 78

Tabela 4.10- Variveis e os respectivos nveis avaliados na tcnica para construo de

superfcie de resposta para a extrao em fase slida dos microcontaminantes em estudo. .... 80

Tabela 4.11- Planejamento Doehlert com triplicata no ponto central (pc) para otimizao dos

parmetros operacionais da SPE, sendo as variveis: pH da amostra, volume da amostra e pH

da lavagem. Os valores em parntesis representam os nveis decodificados. ......................... 80

Tabela 4.12- Descrio dos pontos de coleta das amostras naturais de gua. (continua) ........ 86

Tabela 5.1- Parmetros e valores otimizados para o mtodo de determinao de

microcontaminantes por GC-MS. ......................................................................................... 91

Tabela 5.2- Relao dos produtos de derivatizao produzidos, a relao m/z utilizada para

quantificao e as relaes m/z utilizadas na identificao no estudo de microcontaminantes

por GC-MS. ......................................................................................................................... 93

Tabela 5.3- Valores dos efeitos e do parmetro p ( = 0,05) de cada varivel estudada para a

SPE com solvente de eluio acetato de etila, para o planejamento experimental fatorial

XII

fracionrio 23-1

, resoluo III, com triplicata no ponto central. Em negrito esto apontados os

valores significativos (p < 0,05). .......................................................................................... 95

Tabela 5.4- Valores dos efeitos e do parmetro p ( = 0,05) de cada varivel estudada para a

ELL com solvente de extrao acetato de etila, para o planejamento experimental fatorial

fracionrio 23-1

, resoluo III, com triplicata no ponto central. Em negrito esto apontados os

valores significativos (p < 0,05). .......................................................................................... 98

Tabela 5.5: Valores dos efeitos e do parmetro p ( = 0,05) de cada varivel estudada para a

DLLME com solvente de extrao acetato de etila, para o planejamento experimental fatorial

fracionrio 23-1

, resoluo III, com triplicata no ponto central. Em negrito esto apontados os

valores significativos (p < 0,05). ........................................................................................ 100

Tabela 5.6- Valores da ANOVA do parmetro p para a regresso e para a falta de ajuste do

planejamento Doehlert para SPE dos microcontaminantes em estudo. Em negrito esto

apontados os valores significativos. (Inicio) ....................................................................... 102

Tabela 5.7- Tabela de anlise de varincia para o planejamento Doehlert executado no estudo

da otimizao das condies operacionais SPE para determinao de naproxeno em gua, no

nvel de significncia de 0,05. FV = fonte de varincia, SQ = soma quadrtica, nGL = nmero

de graus de liberdade, MQ = mdia quadrtica, Fcalc = valor calculado e p = parmetro

estatstico p. ....................................................................................................................... 104

Tabela 5.8- Tabela de anlise de varincia para o planejamento Doehlert executado no estudo

da otimizao das condies operacionais SPE para determinao de dietilhexilftalato em

gua, no nvel de significncia de 0,05. FV = fonte de varincia, SQ = soma quadrtica,

nGL = nmero de graus de liberdade, MQ = mdia quadrtica, Fcalc = valor calculado e

p = parmetro estatstico p.................................................................................................. 106

Tabela 5.9- Tabela de anlise de varincia para o planejamento Doehlert executado no estudo

da otimizao das condies operacionais SPE para determinao de ibuprofeno em gua, no

nvel de significncia de 0,05. FV = fonte de varincia, SQ = soma quadrtica, nGL = nmero

de graus de liberdade, MQ = mdia quadrtica, Fcalc = valor calculado e p = parmetro

estatstico p. ....................................................................................................................... 108

Tabela 5.10- Nveis das variveis indicados pelo algoritmo gentico para a SPE dos

microcontaminantes. .......................................................................................................... 109

Tabela 5.11- Faixas de concentrao (ppb), R e equao da curva para os analitos em estudo.

.......................................................................................................................................... 114

Tabela 5.12- Valores dos limites de deteco e de quantificao determinados para os

microcontaminantes estudados. .......................................................................................... 115

Tabela 5.13- Valores de coeficientes de variao obtidos aps anlise em quintuplicata e em

trs nveis de concentrao para os microcontaminantes em estudo. (continua) .................. 116

Tabela 5.14- ndice de recuperao para SPE dos microcontaminantes estudados. (continua)

.......................................................................................................................................... 118

Tabela 5.15- Valores de efeito matriz para os analitos AAS, IBU, CAF e E2 em trs diferentes

amostras. ............................................................................................................................ 121

Tabela 6.1: Concentraes em ppt encontradas nas amostras naturais analisadas pelo mtodo

desenvolvido neste trabalho. (n.d.: no detectado) .............................................................. 124

XIII

LISTA DE NOTAES

AINE: anti-inflamatrio no esteroidal

ANN: artificial neural network (rede

neural artificial)

BSTFA : 1% TMCS:

bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida com

1 % de trimetilclorosilano

DLLME: dispersive liquid - liquid

microextraction (extrao lquido

lquido dispersiva)

EDTA: cido etilenodiaminotetractico

EI: electron ionization (ionizao por

eltrons)

EPA: Environmental Protection Agency

erro y: erro relativo em y

GA: Genetic algorithm (algoritmo

gentico)

GC-MS: gas chromatography tandem

mass spectrometry (cromatografia

gasosa acoplada espectrometria de

massas)

IQ: Instituto de Qumica

IUPAC: International Union of Pure

and Applied Chemistry

LC-MS: liquid chromatography tandem

mass spectrometry (cromatografia

lquida acoplada espectrometria de

massas)

MLOD: limite de deteco do mtodo

LLE: liquid - liquid extraction (extrao

lquido - lquido)

MLOQ: limite de quantificao do

mtodo

LQTA: Laboratrio de Quimiometria

Terica e Aplicada

pc: ponto central

EDC: endocrine disruptor compounds

PI: padro interno

RMSE: Root Mean Square Error (erro

quadrtico mdio)

SCAN: scanning ion

SIM: selected ion monitoring

SPE: solid phase extraction (extrao

em fase slida)

TIC: total ion monitoring

TMS: trimetilclorosilano

XIV

NDICE

1. INTRODUO ........................................................................................................... 16

2. CONTEXTUALIZAAO DO ASSUNTO E REVISO DA LITERATURA .............. 20

2.1 MICROCONTAMINANTES EMERGENTES ......................................................................................20

2.1.1 Perturbadores Endcrinos (EDC) ..................................................................................21

2.1.1.1 O Sistema Endcrino ........................................................................................................... 22

2.1.1.2 Mecanismo de Ao dos Perturbadores Endcrinos ............................................................. 25

2.1.1.3 Efeitos dos Perturbadores Endcrinos em Humanos ............................................................ 26

2.1.1.4 Substncias Classificadas como Perturbadores Endcrinos ................................................... 27

Estradiol (E2) ................................................................................................................................. 29

Etinilestradiol (EE2) ........................................................................................................................ 30

Estrona (E1) ................................................................................................................................... 31

4-Octilfenol (4OF) .......................................................................................................................... 32

4-Nonilfenol (4NF) ......................................................................................................................... 33

Bisfenol A (BPA) ............................................................................................................................. 33

Dietilftalato (DEFT) ........................................................................................................................ 34

Dietilhexilftalato (DEHFT) ............................................................................................................... 35

2.1.2 Frmacos ....................................................................................................................36

2.1.2.1 Anti-inflamatrios ............................................................................................................... 37

2.1.2.2 Reguladores Lipdicos .......................................................................................................... 39

2.1.2.3 Estimulantes ....................................................................................................................... 40

2.2. MTODOS ANALTICOS PARA DETERMINAO DE MICROCONTAMINANTES .........................................41

2.2.1 A Cromatografia .........................................................................................................48

2.2.2 Detectores em Cromatografia Gasosa Espectrometria de Massas .............................48

2.2.3 Preparo de Amostra ....................................................................................................49

2.2.4 Derivatizao ..............................................................................................................52

2.2.5. Validao da Metodologia Otimizada ..........................................................................53

2.4. QUIMIOMETRIA ...................................................................................................................57

2.4.1 Planejamentos Experimentais ......................................................................................58

2.4.2 Anlise Exploratria dos Dados das Amostras ..............................................................60

3. OBJETIVOS ................................................................................................................ 61

3.1 OBJETIVOS ESPECFICOS .................................................................................................................61

4. MATERIAIS E MTODOS ......................................................................................... 62

4.1 REAGENTES, SOLVENTES E VIDRARIAS ........................................................................................62

4.2 PREPARO DAS SOLUES DOS PADRES ...........................................................................................63

XV

4.3 OTIMIZAO DAS CONDIES DA REAO DE DERIVATIZAO.........................................................68

4.4 ESTUDO DAS CONDIES CROMATOGRFICAS E DE DETECO ........................................................68

4.5 DETERMINAO DOS TEMPOS DE RETENO E RELAO MASSA / CARGA DOS MICROCONTAMINANTES ....70

4.6 SELEO DO PROCEDIMENTO DE EXTRAO ................................................................................70

4.6.1 Triagem da Extrao em Fase Slida............................................................................71

4.6.2 Triagem para a Extrao Lquido-Lquido .....................................................................75

4.6.3 Triagem para Microextrao Lquido-Lquido Dispersiva ..............................................77

4.6.4 Seleo da Tcnica de Extrao ...................................................................................79

4.7 CONSTRUO DA SUPERFCIE DE RESPOSTA PARA A EXTRAO EM FASE SLIDA ..................................79

4.8 ABORDAGEM NEURO-GENTICA ..............................................................................................81

4.9 VALIDAO DA METODOLOGIA DE DETERMINAO DE MICROCONTAMINANTES ..................................83

4.10 ANLISE DAS AMOSTRAS NATURAIS ..........................................................................................84

5. RESULTADOS E DISCUSSES ................................................................................ 88

5.1 OTIMIZAO DAS CONDIES DA REAO DE DERIVATIZAO.........................................................88

5.2 OTIMIZAO DAS CONDIES CROMATOGRFICAS E DE DETECO ..................................................89

5.3 DETERMINAO DA RELAO MASSA / CARGA DE CADA MICROCONTAMINANTE .................................92

5.4 SELEO DO PROCEDIMENTO DE EXTRAO ................................................................................94

5.4.1 Triagem para a Extrao em Fase Slida......................................................................94

5.4.2 Triagem para a Extrao Lquido-Lquido .....................................................................97

5.4.3 Triagem para Microextao Lquido-Lquido Dispersiva................................................99

5.5 ESCOLHA DO PROCEDIMENTO DE EXTRAO ............................................................................. 101

5.6 CONSTRUO DA SUPERFCIE DE RESPOSTA............................................................................... 102

5.7 ABORDAGEM NEURO-GENTICA ............................................................................................ 109

5.8 VALIDAO DA METODOLOGIA DE DETERMINAO DE MICROCONTAMINANTES ................................ 110

5.4.1 Seletividade .............................................................................................................. 111

5.4.2 Curva Analtica e Linearidade .................................................................................... 113

5.4.3 Limite de Deteco do Mtodo e Limite de Quantificao do Mtodo ........................ 115

5.4.4 Preciso .................................................................................................................... 116

5.4.5 Exatido ou Ensaio de Recuperao ........................................................................... 118

5.4.6 Efeito Matriz ............................................................................................................. 120

6. AVALIAO EXPLORATRIA DAS AMOSTRAS NATURAIS .......................... 123

7. CONCLUSES ......................................................................................................... 130

8. TRABALHOS FUTUROS ......................................................................................... 132

9. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ........................................................................ 133

16

1. INTRODUO

Com a industrializao, dezenas de milhares de produtos sintticos so produzidos

para facilitar muitas prticas industriais, domsticas e pessoais, sendo assim introduzidos no

ambiente. Deste modo, define-se por guas residuais como correntes lquidas ou suspenses

originrias de processos e / ou utilidades, podendo vir acompanhadas tambm de guas

pluviais contaminadas e esgotos sanitrios" (The PubChem Project, 2012). Esta classe de

gua contm mltiplas substncias qumicas dentre elas os denominados microcontaminantes

emergentes, e ainda algumas que tem o potencial de perturbar os processos endcrinos em

organismos vivos, os denominados perturbadores ou disruptores endcrinos (endocrine

disruptor compounds - EDC). Nos pases industrializados, a maioria do esgoto produzido

tratado em uma estao de tratamento de esgoto (ETE) antes de ser lanado no ambiente. No

entanto, alguns hormnios naturais e produtos qumicos sintticos podem ser encontrados em

guas superficiais, porque muitas destas substncias so resistentes biodegradao em ETE

ou so descartadas diretamente sem qualquer tratamento (Toxnet, 2012). Muitas dessas

substncias, embora banidas, ainda permanecem e permanecero por muito tempo na natureza

devido a sua alta estabilidade e, mesmo em pequenas quantidades, seu efeito poder ser

biomagnificado atravs da ascenso na cadeia alimentar (ChemSpider, 2012).

Nas ltimas cinco dcadas tem havido crescente preocupao sobre a exposio

humana e dos animais selvagens a estes compostos, que so substncias exgenas, naturais ou

sintticas, com o potencial de causar efeitos adversos na sade de um organismo ou em sua

descendncia, resultando em distrbios na funo hormonal entre outros (DESVERGNE et

al., 2009; TAYLOR et al., 2011; CASALS-CASAS; DESVERGNE, 2011; SCHMIDT et al.,

2011b; FLINT et al., 2012). Estas substncias podem interferir com a produo, liberao,

metabolismo e eliminao, ou podem ainda simular a ocorrncia de hormnios naturais

(BILA; DEZOTTI, 2003; RAIMUNDO, 2007).

Ainda no existe um nico mecanismo que explique a ao dos EDC uma vez que eles

pertencem a diferentes classes. As manifestaes clnicas dependem da substncia, dose,

durao do contato, via de exposio e perodo do desenvolvimento no qual o indivduo foi

exposto (e.g. fetal, neonatal, pr-puberal, puberal ou adulto). A exposio aos interferentes

endcrinos em perodos crticos do desenvolvimento do feto ou da criana pode causar telarca

17

(desenvolvimento mamrio antes dos oito anos sem outra evidncia de puberdade), pubarca

(aparecimento de plos pubianos ou axilares ou ambos sem outros sinais de puberdade),

menarca (primeiro perodo menstrual), puberdade precoce, atraso puberal, ginecomastia

(desenvolvimento do tecido mamrio em homens) e malformaes reprodutivas

(DESVERGNE et al., 2009; CASALS-CASAS; DESVERGNE, 2011).

Alm dos efeitos no desenvolvimento e na reproduo, h tambm uma crescente

preocupao de que os distrbios metablicos podem estar ligados com os perturbadores

endcrinos. A taxa de obesidade global tem aumentado drasticamente ao longo das ltimas

trs dcadas em adultos, crianas e adolescentes, especialmente em pases desenvolvidos. A

obesidade frequentemente associada a distrbios metablicos (incluindo diabetes tipo 2,

sndrome metablica, complicaes pulmonares e cardiovasculares, alm de doenas do

fgado), bem como outras questes de sade, como problemas psicolgicos e ou sociais,

problemas reprodutivos e algumas formas de cncer (DESVERGNE et al., 2009; HATCH et

al., 2010; JANESICK; BLUMBERG, 2011; SAAL et al., 2012).

Esta preocupao ampliada por dois fatores, a expanso da produo de produtos

qumicos, que j atingiu 400 milhes de toneladas no mundo e o aumento da poluio por

estes produtos (MAIA; DEZOTTI, 2007). Porm, o grau de exposio e efeitos dos milhares

de produtos com os quais entramos em contato diariamente ainda desconhecido.

Acompanhando a ascendncia dos perturbadores endcrinos, a Unio Europeia em 2002

estabeleceu uma lista de 553 substncias classificadas como lista de candidatas que seriam

avaliadas como possveis perturbadores endcrinos (COMISSION OF THE EUROPEAN

COMMUNITIES, 2002). J em 2010, os Estados Unidos, via Agncia de Proteo

Ambiental (EPA), divulgou sua segunda lista de produtos qumicos e substncias para quais a

EPA pretende emitir ordens de ensaio sob o Programa de Triagem de Perturbadores

Endcrinos (EDSP) (EPA, 2010). Mais recentemente, a Organizao Mundial da Sade

(WHO) divulgou um documento abordando a presena de frmacos em gua potvel (WHO,

2012).

Devido apreenso em relao a presena dos microcontaminantes emergentes no

ambiente tem-se elevado o interesse na anlise destas substncias qumicas. Como so

encontradas concentraes a nvel trao destes poluentes orgnicos em amostras aquosas,

etapas de pr-concentrao como a extrao lquido-lquido (LLE) ou a extrao em fase

18

slida (SPE) so comumente aplicadas como etapa antecedente anlise cromatogrfica

(LOUTER et al., 1997; HOGENBOOM et al., 2000; SLOBODNK et al., 2000; BROSSA et

al., 2004; NIE et al., 2009; OHE et al., 2011). A anlise por cromatografia gasosa (GC)

acoplada espectrometria de massas (MS) foi a mais utilizada inicialmente, no entanto muitos

compostos no so passveis de serem analisados por GC devido sua instabilidade trmica e

polaridade e, para produzir compostos volteis, alguns analitos requerem derivatizao.

Mesmo a etapa de derivatizao sendo considerada onerosa, novos mtodos demonstraram

que as anlises desses microcontaminantes por GC-MS, mesmo necessitando realizar a reao

de derivatizao, so viveis por apresentarem menores limites de deteco e minimizar a

influencia de alguns interferentes como o que acontece na anlise por cromatografia lquida

(MOL et al., 2000; HERNANDO et al., 2004; KAWAGUCHI et al., 2004; LIN et al., 2005).

Um estudo da presena simultnea de diversos microcontaminantes em diferentes

amostras resulta em um nmero razoavelmente grande de variveis e, para que seja possvel

uma abordagem adequada e eficiente dessa informao multivariada, algumas metodologias

devem ser aplicadas. A abordagem multivariada tem se tornado, de modo crescente, uma

importante rea da qumica (quimiometria) e de outras cincias. A quimiometria constitui a

aplicao de mtodos matemticos e estatsticos a dados qumicos com muitas variveis, bem

como o estudo das diferentes informaes do sistema por meio da anlise das variabilidades

realmente significativas (RODIONOVA, 2005; KOWALSKI et al., 2007). A extrao de

maior quantidade significativa de informaes qumicas e outras informaes relevantes

acerca do sistema alvo, por meio da utilizao dos mtodos quimiomtricos, certamente seria

impossvel de ser praticada pelo uso dos mtodos matemticos convencionais.

Vrios mtodos quimiomtricos tm sido propostos para os mais diversos fins, como

os mtodos de planejamentos experimentais, reconhecimento de padres supervisionados e

no supervisionados, calibrao multivariada, mtodos de inteligncia artificial, pr-

processamento de dados, entre muitas outros (FERREIRA, et al., 2004; BAILEY; RUTAN,

2011; STAFILOV et al., 2011).

A proposta do estudo cromatogrfico de microcontaminantes emergentes, substncias

com implicaes to adversas para o ser humano e meio ambiente, certamente foi

potencializada, inovada e mesmo, em alguns aspectos, viabilizada pela utilizao dos mtodos

quimiomtricos abordados neste trabalho. Cabe realar que a proposta aqui foi o estudo de

19

diferentes tcnicas de extrao para o desenvolvimento de um mtodo de extrao e

determinao de microcontaminantes em amostras de gua superficial, por cromatografia

gasosa acoplada espectrometria de massas, utilizando tcnicas de otimizao multivariada,

alm da anlise exploratria dos resultados obtidos visando encontrar perfis de contaminao.

20

2. CONTEXTUALIZAAO DO ASSUNTO E REVISO DA

LITERATURA

2.1 Microcontaminantes Emergentes

Contaminantes ou microcontaminantes emergentes constituem um grupo de

substncias classificadas como tal por levantarem preocupaes acerca dos efeitos que

provocam vida aqutica e ao ambiente (U.S. EPA, 2008).

Segundo a Agncia de Proteo Ambiental Americana (U.S. EPA) a classe de

contaminantes emergentes se divide em cinco grupos:

Poluentes orgnicos persistentes (POP): compostos utilizados em retardantes

de chama, plastificantes (e.g. teres difenlicos polibromados), assim como

cidos orgnicos perfluorados;

Frmacos e produtos de cuidado pessoal: incluem os frmacos de uso humano

com prescrio ou venda livre, bactericidas, protetores solares e fragrncias;

Medicamentos veterinrios: antibiticos, antifngicos e hormnios;

Perturbadores endcrinos: este grupo inclui hormnios naturais e sintticos,

pesticidas, alquilfenois, etc. So substncias capazes de modificar o

funcionamento do sistema endcrino de organismos aquticos; e

Nanomateriais: nanotubos de carbono, dixido de titnio particulado em nano

escala, etc.

Milhares de toneladas dessas substncias so produzidas indiscriminadamente em todo

o mundo, sendo consumidas pela populao e inseridas no meio ambiente provenientes do

esgoto domstico e de resduos agrcolas e industriais, alcanando os corpos dgua devido

ineficincia dos tratamentos de esgoto tradicionais, alm do descarte inadequado

(KASPRZYK-HORDERN et al., 2008; GTZ et al., 2010; OHE et al., 2011).

Os microcontaminantes possuem essa denominao por serem encontrados no

ambiente em concentraes da ordem de ng/L, no entanto, esta reduzida quantidade capaz

de gerar efeitos deletrios nos organismos; por este motivo seu monitoramento se faz

necessrio (SLOBODNK et al., 2000; QUEIROZ, 2011).

21

Dentre esses compostos uma reviso da literatura mais aprofundada acerca de sua

origem, fontes de contaminao e metodologias de anlise ser feita a seguir para alguns EDC

e frmacos.

2.1.1 Perturbadores Endcrinos (EDC)

Perturbadores endcrinos so substncias qumicas que podem interferir na produo,

liberao, metabolismo e eliminao ou podem mimetizar a ocorrncia dos hormnios

naturais. Existem diversas definies propostas para os EDC, denominados em ingls

endocrine disrupting chemicals (EDC). Alguns autores entendem que so considerados EDC

somente as substncias que interagem com stios receptores de hormnios, enquanto outros os

definem como quaisquer substncias que causem desequilbrio, interferncia ou alterao no

sistema endcrino, independentemente se atuam diretamente no stio receptor ou no. H

ainda pesquisadores que definem um EDC com base nos seus efeitos, ou seja, trata-se de uma

substncia qumica que, mesmo presente em concentrao extremamente baixa, capaz de

interferir no funcionamento natural do sistema endcrino, podendo causar cncer, prejudicar

os sistemas reprodutivos e causar outros efeitos adversos (BILA; DEZOTTI, 2003).

Sob uma viso fisiolgica, um perturbador endcrino uma substncia natural ou

sinttica que, por meio de exposies ambientais ou devido ao desenvolvimento inapropriado,

altera o sistema endcrino e a homeostasia que permitem ao organismo se comunicar e

responder ao seu ambiente (DIAMANTI-KANDARAKIS et al., 2009; CASALS-CASAS;

DESVERGNE, 2011).

Acompanhando a ascendncia dos perturbadores endcrinos, no ano de 2002 a Unio

Europeia estabeleceu uma lista de 553 substncias classificadas como lista de candidatas

que seriam avaliadas como possveis perturbadores endcrinos. Aps estudos preliminares,

uma segunda lista, agora denominada lista prioritria de substncias para maior avaliao

dos seus efeitos endcrinos foi expedida; esta nova lista conta com 428 substncias que

pertencem a diferentes grupos qumicos, por exemplo, alquilfenois e seus derivados,

benzoatos, cloretos de alcanos, ftalatos, dioxinas / furanos e bifenilpoliclorados. Destas

substncias 194 possuem clara evidncia de efeitos no sistema endcrino (COMISSION OF

THE EUROPEAN COMMUNITIES, 2002).

22

J em 2010, os Estados Unidos, via Agncia de Proteo Ambiental, divulgou sua

segunda lista de produtos qumicos e substncias para as quais a EPA pretende emitir ordens

de ensaio sob o Programa de Triagem de Perturbadores Endcrinos (EDSP). A EPA

estabeleceu o EDSP em resposta seo 408 da Lei Federal de Alimentos, Medicamentos e

Cosmticos que dispem sobre a tolerncia e isenes para os resduos qumicos de

pesticidas. Nesta lista esto includas substncias como acetaldedo, benzo(a)pireno,

eritromicina, entre outros (EPA, 2010).

Vrios so os compostos que se enquadram nessa classe de substncias, sendo um

grupo de molculas muito heterogneo e que inclui produtos qumicos sintticos (e.g.

solventes industriais, lubrificantes e seus derivados, plsticos, pesticidas, fungicidas e

produtos de higiene pessoal e farmacuticos), assim como produtos naturais (e.g.

fitoestrgenos) (DIAMANTI-KANDARAKIS et al., 2009; MOREIRA, 2010; QUEIROZ,

2011).

2.1.1.1 O Sistema Endcrino

O sistema endcrino composto por um conjunto de glndulas situadas em diferentes

partes do corpo, como representado na Figura 2.1. Entre estas glndulas esto a hipfise,

tireoide, adrenais, pncreas e gnadas (GHISELLI; JARDIM, 2007). As mltiplas atividades

das clulas, tecidos e rgos do corpo so coordenadas pela interao de vrios tipos de

sistemas mensageiros qumicos como:

(a) neurotransmissores, que so liberados por terminais axnios de neurnios nas

junes sinpticas e agem localmente para controlar as funes da clula nervosa;

(b) hormnios endcrinos, que so liberados por glndulas ou clulas especializadas

na circulao sangunea e influenciam na funo de clulas de outro local no corpo;

(c) hormnios neuroendcrinos, que so secretados por neurnios na circulao

sangunea e influem na funo de clulas de outro local no corpo;

(d) parcrinos, que so secretados por clulas no fluido extracelular e afetam a funo

de clulas vizinhas de um tipo diferente;

(e) autcrinos, que so secretados por clulas no fluido extracelular e afetam a funo

das mesmas clulas que o produzem por ligao a receptores na membrana celular; e

23

(f) citocinas, que so peptdeos secretados por clulas no fluido extracelular e podem

funcionar como hormnios autcrinos, parcrinos ou endcrinos. Exemplos de citocinas

incluem as interleucinas e outras linfocinas que so secretadas por clulas auxiliares e agem

sobre outras clulas do sistema imune (GUYTON, 2006).

Figura 2.1- Esquematizao do sistema endcrino humano (SILVA).

Os hormnios so substncias qumicas secretadas por glndulas endcrinas que

comandam diversas funes dos diferentes rgos e sistemas do corpo (GHISLLEI; JARDIM,

2007). Alguns hormnios endcrinos afetam tipos muito diferentes de clulas, como o

hormnio do crescimento (da glndula hipfise), por exemplo, que causa o crescimento em

muitas partes do corpo e a tiroxina (da glndula tireoide) que aumenta a proporo de muitas

reaes qumicas em quase todas as clulas do corpo (COSTANZO, 2008).

24

Outros hormnios afetam somente tecidos alvo especficos, porque somente estes

tecidos possuem receptores para tais hormnios. Como exemplo tem-se o hormnio

adrenocorticotrfico (ACTH), da glndula hipfise, que estimula especificamente o crtex

adrenal, causando a secreo de hormnios adrenocorticais, assim como os hormnios

ovarianos, que tm efeitos especficos sobre os rgos sexuais femininos, bem como sobre as

caractersticas sexuais do corpo feminino (GUYTON, 2006).

A primeira etapa da ao de um hormnio ligar-se a receptores especficos da clula

alvo, por este motivo, clulas que no possuem receptores para os hormnios no respondem

a eles. Os receptores para alguns hormnios esto localizados sobre a membrana da clula

alvo, enquanto que outros receptores hormonais esto localizados no citoplasma ou no ncleo.

Quando o hormnio combina com o receptor, este normalmente inicia uma cascata de reaes

na clula, com cada etapa se tornando mais vigorosamente ativada, tanto que, mesmo em

pequenas concentraes, o hormnio pode ter um amplo efeito (GUYTON, 2006).

A regulao da secreo hormonal pode ocorrer por dois mecanismos distintos: o

feedback negativo e o feedback positivo. O feedback negativo o princpio mais comum e

autolimitante. Um hormnio tem aes biolgicas que, direta ou indiretamente, inibem ou

favorecem determinada secreo hormonal. Por exemplo, a insulina secretada pelas clulas

beta pancreticas em resposta ao aumento da glicose no sangue. No entanto, a insulina causa

um aumento da glicose dentro das clulas que resulta no decrscimo da concentrao de

glicose no sangue. Este decrscimo, ento, diminui a secreo de insulina. J o feedback

positivo raro; um hormnio tem aes biolgicas que, direta ou indiretamente, causam mais

secreo de outro hormnio. Por exemplo, o aumento do hormnio luteinizante (LH) que

ocorre antes da ovulao, resultado do feedback positivo do estrognio sobre a glndula

hipfise. O LH ento age sobre os ovrios e provoca mais secreo de estrognio

(COSTANZO, 2008).

Quando alguma substncia exgena interfere no funcionamento normal do sistema

hormonal, esta descrita como perturbador endcrino e as substncias que causam este efeito

so nomeadas como perturbadores ou desreguladores endcrinos (SWEDENBORG et al.,

2009).

25

2.1.1.2 Mecanismo de Ao dos Perturbadores Endcrinos

O entendimento sobre os mecanismos de ao dos perturbadores endcrinos est em

constante crescimento. Inicialmente se sabia que estas substncias agiam diretamente nos

receptores hormonais, porm atualmente, a pesquisa cientfica demonstra que os mecanismos

so muito mais amplos do que se imaginava originalmente. Sabe-se que os EDC agem por

meio de receptores nucleares, no-nucleares, vias enzimticas que envolvem a biossntese de

esteroides e / ou seu metabolismo e diversos mecanismos que convergem para os sistemas

endcrino e reprodutivo (DIAMANTI-KANDARAKIS et al., 2009; SWEDENBORG et al.,

2009).

Os hormnios funcionam basicamente por meio da interao com seus respectivos

receptores, que podem ser classificados em dois grupos:

(a) receptores ligados membrana, que respondem principalmente a hormnios

peptdeos, por exemplo, insulina, e

(b) receptores nucleares (NR), que so ativados quando ocorre a interao entre o

receptor e os pequenos hormnios lipoflicos, por exemplo, hormnios sexuais.

Os perturbadores endcrinos so molculas pequenas e lipoflicas em sua maioria;

sendo assim, eles tm acesso privilegiado aos NR, provocando a desregulao da funo

endcrina no organismo afetado (CASALS-CASAS; DESVERGNE, 2011).

Alguns EDC podem se ligar aos receptores e exercer ao como agonista ou

antagonista, assim aumentando ou reduzindo o efeito hormonal. Contudo h um mecanismo

particular que envolve o receptor aril hidrocarboneto (AhR), receptor que est diretamente

envolvido no metabolismo de diversas substncias exgenas (DIAMANTI-KANDARAKIS et

al., 2009). A ativao da via de sinalizao do AhR ocorre quando o indivduo entra em

contato com compostos xenobiticos. Estes compostos funcionam como potentes e seletivos

agonistas que atravessam a membrana plasmtica, difundindo-se pelo citoplasma e ligando-se

finalmente ao AhR. A ativao da sinalizao do AhR por compostos exgenos em modelos

animais produz numerosas consequncias txicas ao organismo, incluindo carcinognese,

involuo do timo, enfraquecimento severo e morte (BARCLLEOS et al., 2006).

26

Em suma, os perturbadores endcrinos possuem diversos mecanismos de ao, muitos

deles ainda no elucidados, que resultam na desregulao das funes endcrinas o que

culmina em efeitos desastrosos aos organismos afetados.

2.1.1.3 Efeitos dos Perturbadores Endcrinos em Humanos

No h sistema que seja imune aos perturbadores endcrinos, devido s semelhanas

entre estas substncias exgenas e os hormnios endgenos, e tambm por serem capazes de

agir mesmo quando em concentraes muito baixas (DIAMANTI-KANDARAKIS et al.,

2009). Alm do mais, devido estabilidade dos EDC no ambiente, eles acabam perpetuando-

se na cadeia alimentar sendo transportados a grandes distncias a partir do seu local de

origem, chegando a locais onde no houve seu uso, fazendo com que ocorra exposio a estas

substncias que contaminam as guas e os alimentos (ALVES et al., 2007).

A relao direta da interao dos EDC e as alteraes provocadas em humanos ainda

obscura em alguns casos, mas sabe-se que estes compostos so suspeitos de provocarem

efeitos que resultam em distrbios no sistema endcrino, incluindo a perturbao do sistema

reprodutivo feminino (diferenciao sexual, disfuno dos ovrios, aumento do risco de

cncer de mama e de vagina, ovrios policsticos e endometriose) e do sistema reprodutivo

masculino (reduo na produo de esperma, aumento do risco de cncer testicular e de

prstata, infertilidade e alteraes nos nveis hormonais da tireoide) (BILA; DEZOTTI, 2003;

JUGAN et al., 2010; SHI et al., 2012).

Os disruptores endcrinos tambm esto relacionados com disfunes no

desenvolvimento cerebral, principalmente em lactentes e crianas, que possuem o crebro

excepcionalmente mais sensvel aos neurotoxicantes ambientais do que os adultos. Segundo a

Academia Nacional Americana de Cincia, cerca de 9,5 milhes de crianas com menos de 18

anos sofrem com alguma deficincia relacionada ao desenvolvimento do crebro, como

hiperatividade e dficit de ateno, dislexia, dficit sensorial, retardo mental, transtornos do

espectro autista, dificuldades de aprendizagem e paralisia cerebral. A Academia Nacional

Americana de Cincia sugere que a etiologia do desenvolvimento de 3 % dessas desordens

pode ser atribuda exposio a substncias txicas ambientais e outros 25 % pode ser

resultado da combinao da exposio ambiental a tais compostos juntamente com a

predisposio gentica (MIODOVNIK, 2011).

27

Os efeitos dos EDC na homeostase do peso corpreo outra rea de pesquisa que vem

crescendo nos ltimos cinco anos. O tecido adiposo por si s um rgo do sistema

endcrino, secreta hormnios e adipocinas alm de expressar diferentes receptores. O termo

obesognico define molculas que regulam inadequadamente o metabolismo lipdico e a

adipognese promovendo a obesidade e a lista de molculas obesognicas continua

crescendo, incluindo o bisfenol A, ftalatos, pesticidas organoclorados, steres difenil

polibromados e bifenilas policloradas (HATCH et al., 2010).

evidente que os perturbadores endcrinos so capazes de provocar uma gama

enorme de efeitos adversos. Com a evoluo nas pesquisas clnicas, provavelmente outros

distrbios sero relacionados a estas substncias. Portanto, a identificao e quantificao

destes compostos nas matrizes ambientais de suma importncia, visto a exposio ambiental

aos mesmos estar intimamente relacionada aos seus efeitos.

2.1.1.4 Substncias Classificadas como Perturbadores Endcrinos

Na Tabela 2.1 esto exemplificados os principais EDC estudados e descritos na

literatura.

Tabela 2.1- Compostos classificados como perturbadores endcrinos (adaptado de QUEIROZ,

2011). (continua)

Ftalatos Pesticidas

Dietilftalato (DEF)

Di-iso-butilftalato (DIBF)

Di-n-butilftalato (DBF)

Butilbenzilftalato (BBF)

Diciclohexiloftalato (DCHF)

Di-2-(2-etil-hexil)ftalato (DEHF)

Di-n-octilftalato (DOF)

Di-isooctilftalato (DIOF)

Di-iso-nonilftalato (DINF)

Di-iso-decilftalato (DIDF)

Inseticidas

2,2 bis-p-clorofenil-1,1,1-tricloroetano

(DDT)

2,2 bis-p-clorofenil-1,1-dicloroetileno

(DDE)

Lindano

Deltametrin

Carbofurano

Herbicidas

Atrazina

Linuron

Fungicidas

Vinclozolina

Tridemorfos

Carbendazina

Penconazol

Procloraz

Procimidona

Alquilfenois

Nonilfenol (NF)

Octilfenol (OF)

Nonilfenol etoxilado

Octilfenol etoxilado

28

Epoxiconazol

Compostos orgnicos de estanho Agentes teraputicos e farmacuticos

Tributilestanho (TBE)

Trifenilestanho (TFE)

Dietilestilbestrol (DES)

17-etinilestradiol (EE2)

Furanos e Dioxinas Policlorados de bifenilas (PCB)

Dibenzo-p-dioxina

2,3,7,8-tetraclorodibenzeno-p-dioxina

(TCDD)

2,3,7,8-tetraclorodibenzofurano (TCDF)

2,4,4-triclorobifenil

2,2,5,5-tetraclorobifenol

2,2,4,5,5-pentaclorobifenil

2,3,4,4,5-hexaclorobifenil

2,2,3,4,4,5-hexaclorobifenil

2,2,3,4,4,5,5-heptaclorobifenil

Bisfenol Parabenos

Bisfenol A (BPA)

Benzilparabeno

Butilparabeno

Etilparabeno

Isobutilparabeno

n-Propilparabeno

Metilparabeno

Tabela 2.1- Compostos classificados como perturbadores endcrinos (adaptado de QUEIROZ,

2011). (concluso)

Hidrocarbonetos aromticos

policclicos Retardantes de chama bromados

Naftalina

Acenaftileno

Fluoreno

Fenantreno

Antraceno

Fluoranten

Pireno

Benzo[a]antraceno

Criseno

Benzo[b]fluoranteno

Benzo[k]fluoranteno

Benzo[a]pireno

Indeno[123-cd]pireno

Benzo[ghi]perileno

Polibromobifenila (PBB)

2,2,4,4-tetrabromodifenil ter

2,2,4,4,5-pentabromodifenil ter

2,2,4,4,6-pentabromodifenil ter

2,2,4,4,5,5-hexabromodifenil ter

2,2,4,4,5,6-hexabromodifenil ter

2,2,3,4,4,5,6-heptabromodifenil ter

Octabromodifenil ter (BDE octa)

Decabromociclodifenil ter (BDE 209)

Hexabromociclododecano (HBCD)

Tetrabromobisfenol A (TBBA)

Metais pesados Fitoestrgenos

Cdmio

Mercrio

Chumbo

Zinco

Isoflavona: daidzena e genistena

Lignanas: metaresinol e enterodiol

29

Como pode ser observado, uma vasta gama de substncias classificada como

perturbadores endcrinos; estes compostos apresentam caractersticas fsico-qumicas

distintas o que dificulta o desenvolvimento de uma nica metodologia para a determinao

simultnea dos mesmos em amostras ambientais. Por este motivo, alguns desses compostos

foram selecionados para este estudo, estando os mesmos apresentados a seguir onde tambm

esto relacionadas outras informaes pertinentes.

Estradiol (E2)

O estradiol (Figura 2.2) um hormnio sexual natural, da classe dos esteroides,

produzido pelos folculos ovarianos. responsvel pelo crescimento dos seios e epitlios

reprodutivos, maturao de ossos longos e desenvolvimento das caractersticas sexuais

secundrias. Alm disso, tambm responsvel pela manuteno dos tecidos do organismo,

garantindo a elasticidade da pele e dos vasos sanguneos e a reconstituio ssea, entre outras

funes (GOODMAN GILMAN, 2005).

OH

OH

Figura 2.2- Estrutura qumica do estradiol.

Este hormnio natural tambm utilizado na terapia de reposio hormonal na

menopausa, onde apresenta inmeras vantagens por controlar os sintomas vasomotores,

aumentar a lubrificao vaginal, a libido feminina e o bem-estar psquico. Tambm indicado

no tratamento de hipoestrogenismo, assim como no tratamento de cncer de mama e

carcinoma de prstata andrgeno-dependente (como paliativo) (Toxnet, 2012). Porm,

segundo a International Agency for Research on Cancer (IARC) o estradiol classificado

como pertencente ao Grupo I Carcinognico para humanos (IARC, 2012). Este hormnio

biotransformado no fgado a estrona e estriol, sendo este ltimo subproduto o principal

eliminado na urina e nas fezes (GOODMAN GILMAN, 2005).

30

Estudos relatam que a criao animal uma das principais fontes de contaminao

ambiental por estradiol, visto que esse hormnio natural excretado pelos animais e devido

ao pouco ou at mesmo inexiste tratamento desses resduos, ele atinge os corpos dgua

provocando efeitos adversos em organismos sensveis (SCHUH et al., 2011). Considerando o

uso do estradiol como tratamento de algumas enfermidades, como na reposio hormonal e

alguns cnceres, a excreo proveniente de seu uso farmacutico contribui com apenas 5 %

em relao quantidade excretada naturalmente pelos organismos (MES et al., 2005).

Etinilestradiol (EE2)

O etinilestradiol (Figura 2.3) o principal estrognio sinttico encontrado nas plulas

anticoncepcionais combinadas e nas terapias de reposio hormonal (FERREIRA, 2008).

utilizado no tratamento de alguns tipos de carcinomas (metasttico mamrio masculino e

prosttico avanado), hipogonadismo feminino, falncia ovariana primria e sndrome de

Turner (PubChem, 2012). O etinilestradiol tambm utilizado como um contraceptivo de

emergncia combinado com levonorgestrel ou norgestrel.

CHOH

OH

Figura 2.3- Estrutura qumica do etinilestradiol.

Estudos tentam relacionar os efeitos do EE2, em relao ao seu potencial estrognico,

com o tempo de exposio e o respectivo efeito no desenvolvimento de alteraes nos

sistemas, principalmente aqueles relacionados ao sistema endcrino e reprodutivo

(BLZQUEZ et al., 1998; ANDREW et al., 2010). Porm, a reviso aqui apresentada

constatou a dificuldade em se extrapolar os dados obtidos em ensaios com animais para os

efeitos que provavelmente seriam ocasionados em humanos, principalmente devido s

31

diversas fontes de exposio a uma gama enorme de compostos com os quais entramos em

contato diariamente.

Com humanos h dados de estudos que relacionam episdios de cnceres de mama,

cervical e fgado em mulheres que fazem uso da terapia hormonal combinada. Alm disso, a

IARC classifica como cancergenos para os seres humanos (Grupo 1) os contraceptivos orais

combinados (Toxnet, 2012; IARC, 2012).

Devido existncia de um grupo metil adicional em sua estrutura em relao ao

estradiol, o etinilestradiol possui maior potencial estrognico e tambm se torna mais

resistente ao metabolismo fazendo com que grande parte do que consumido chegue

inalterado rede de esgoto. Como os tratamentos de esgoto convencionais so ineficientes

frente degradao / remoo desse composto, grande parte lanada aos corpos dgua,

chegando intactos ao meio ambiente. Por sua vez, ele tambm sofre pequena biodegradao

sendo capaz de exercer seu efeito estrognico nos organismos aquticos, bem como na

populao que consome essa gua e os produtos que se utilizam da mesma (ANDREW et al.,

2010).

Diante destes aspectos, muitos grupos de pesquisa vm estudando os efeitos desse

hormnio sobre organismos, desde organismos aquticos como os bivalves (ANDREW et al.,

2010) a mamferos como os ratos (YAMASAKI et al., 2002). Como consequncia, efeitos

como alteraes na produo de protenas e nos rgos reprodutores foram descritos,

corroborando com a classificao desse hormnio como disruptor endcrino.

Estrona (E1)

A estrona, estrutura qumica apresentada na Figura 2.4, indicada na terapia de

reposio hormonal para sintomas de deficincia estrognica nos perodos pr e ps-

menopausa. Tambm indicada para prevenir a osteoporose na ps-menopausa em mulheres

para as quais no so apropriados outros medicamentos (GOODMAN GILMAN, 2005).

32

O

OH

Figura 2.4- Estrutura qumica da estrona.

um dos subprodutos formados do metabolismo do estradiol, sendo tambm

convertida por hidratao a estriol. Sendo assim, a estrona est presente na urina de mulheres

grvidas assim como de alguns animais, como nas guas, alm de se encontrar na placenta

humana, na urina de touros e cavalos e at em algumas plantas (GOODMAN GILMAN,

2005; Toxnet, 2012).

Alguns tratamentos com irradiao com luz ultra-violeta (UV). indicam que o tempo

de meia vida na fotodegradao de 2 a 3 h em gua de rio, o que sugere que ela possa ser

susceptvel a fotlise direta pelo sol. Tambm h estudos que indicam que a populao pode

ser exposta ingesto de estrona via gua contaminada (Toxnet, 2012).

4-Octilfenol (4OF)

O 4-octilfenol (Figura 2.5) produto da biodegradao de surfactantes alquilfenois

etoxilados, que so largamente utilizados como detergentes, emulsificantes, lubrificantes,

intermedirios para resinas, fungicidas, bactericidas, adesivos, etc. (LUO et al., 2010;

Toxnet, 2012).

OH

CH3

Figura 2.5- Estrutura qumica do 4-octilfenol.

Atinge principalmente o meio ambiente marinho pelas guas residuais das fbricas. O

octilfenol foi descrito na literatura como sendo capaz de desregular a resistina, um hormnio

33

especfico de adipcito que pode levar a uma resistncia insulina e reduzir a diferenciao

de adipcitos (SWEDENBORG et al., 2009).

4-Nonilfenol (4NF)

O 4-nonilfenol (Figura 2.6) uma substncia utilizada como coestabilizante em mistura

com metal para a estabilizao a quente durante a produo de plstico, tambm usado

como monmero na produo de resinas fenlicas e ainda faz parte da preparao de

lubrificantes, agentes surfactantes, demulsificantes de petrleo, fungicidas e antioxidantes

para borracha e plsticos. Desta forma, ele entra em contato com o meio ambiente pelo

descarte de resduos (Toxnet, 2012).

OH

CH3

Figura 2.6- Estrutura qumica do 4-nonilfenol.

Ensaios in vitro relataram que o 4-nonilfenol estimula a acumulao lipdica, acelerando

sua diferenciao adipcitos maduros (DIAMANTI-KANDARAKIS et al., 2009).

Bisfenol A (BPA)

O bisfenol A (Figura 2.7) utilizado como monmero de plastificantes como os

utilizados em garrafas plsticas (e.g. garrafa de gua), em pelculas protetoras de alimentos,

resinas de poliestireno e selantes dentrios. Por ter usos to diferentes, a populao est

exposta a este EDC por diferentes vias (CASALS-CASAS; DESVERGNE, 2011; BOAS et

al., 2012).

CH3

CH3

OHOH

Figura 2.7- Estrutura qumica do bisfenol A.

34

Muitos estudos apontam os efeitos do BPA sobre a vida selvagem apenas em relao

aos efeitos no sistema endcrino, porm muitos outros efeitos podem ser observados. Por

exemplo, em concentraes de 1,1 a 12,8 mg/L, o BPA sistematicamente txico a vrios

organismos aquticos, como os peixes de gua doce (Pimephales promelas) e os de gua

salgada (Menidia menidia).

Estudos levaram a Agncia de Meio Ambiente do Canad a reportar em 2008 valores

para a concentrao molar para produo de efeito agonista mximo em 50 % da populao

(EC50) e, o valor da concentrao na gua ou ar letal para 50 % da populao (LC50), em 1,0 e

10 mg/L, respectivamente. Assim, classificaram o BPA como moderadamente txico para a

biota aqutica.

J para a Comisso Europeia e para a EPA o BPA classificado como txico. Alguns

estudos indicam que uma concentrao de 12 g ou menos capaz de ser nociva vida

selvagem (Toxicology 2012; FLINT et al., 2012).

Outras consequncias relatadas do contato com o bisfenol A so: dermatite de contato,

observada em trabalhadores que produziam produtos com BPA (KANG et al., 2006);

alterao no padro de metilao do DNA; e alteraes no desenvolvimento do crebro

(WOLSTENHOLME et al., 2011).

Dietilftalato (DEFT)

O dietilftalato (Figura 2.8) utilizado como veculo de fragrncias e de ingredientes

cosmticos, solvente para nitrocelulose e acetato de celulose, sendo tambm plastificante.

Pode ser liberado facilmente a partir desses produtos, visto que no um dos monmeros

utilizados na produo de polmeros plsticos. Tambm usado em inseticidas e na aspirina,

assim como para dar gosto amargo ao lcool que comumente vendido em farmcias

(Toxnet, 2012).

35

OO

O CH3

O

CH3

Figura 2.8- Estrutura qumica do dietilftalato.

H relatos na literatura de que o DEFT seja capaz de induzir a proliferao de clulas

de cncer de mama, em estudos in vitro (Toxnet, 2012).

Dietilhexilftalato (DEHFT)

O dietilhexilftalato (Figura 2.9) um ftalato sinttico utilizado na fabricao de

plsticos para embalagens para alimentos, em produtos txteis, cosmticos e em embalagens

descartveis. rapidamente absorvido pelo trato gastrointestinal e eliminado aps ingesto

oral, por isso no txico quando o contato se d por essa via (Toxnet, 2012).

OOO

CH3

O CH3

CH3

CH3

Figura 2.9- Estrutura qumica do dietilhexilftalato.

A exposio a esse composto pode ocorrer de diversas maneiras, ainda nos primeiros

anos da vida humana, incluindo a fase de desenvolvimento fetal atravs da placenta, e durante

36

o desenvolvimento da criana por meio da amamentao, brinquedos levados boca e

produtos de cuidado pessoal (CASALS-CASAS; DESVERGNE, 2011).

Os ftalatos so potentes disruptores endcrinos por modularem o sistema tiroidal,

podendo interferir com o receptor da tireoide por ao agonista ou antagonista (SHI et al.,

2012). Outra linha de estudos intensificada a da investigao do tipo de interao desses

compostos com outras rotas nos organismos e a razo que os fazem capazes de afetar diversas

rotas metablicas como as dos lipdios e glicose; porm, maiores estudos se fazem necessrios

(DESVERGNE et al., 2009). Estudos de curto e longo tempo relacionaram doses de ftalatos

com a desregulao dos nveis de insulina srica, glicose sangunea, glicognio heptico,

hormnios da tireoide T3 e T4 e cortisol. Em humanos, estabeleceu-se uma correlao entre a

concentrao de metablitos de ftalatos com a obesidade abdominal e a resistncia insulina

em homens adultos. Esses compostos so assim considerados obesognicos ambientais

(CASALS-CASAS; DESVERGNE, 2011).

2.1.2 Frmacos

Frmacos so compostos qumicos pouco solveis em gua, lipoflicos e

biologicamente ativos que podem ser administrados oralmente, topicamente ou

parenteralmente. Aps administrao, essas substncias so absorvidas, distribudas,

parcialmente metabolizadas e finalmente excretadas do corpo na forma original, associada ou

como metablitos. Uma quantidade significativa dessas substncias originais e seus

metablitos so excretados pela urina, fezes ou esterco animal, sendo frequentemente

encontrados no esgoto domstico (RANG et al., 2003; GOODMAN GILMAN, 2005).

Nas ltimas dcadas houve um crescente aumento no uso de medicamentos pela

populao mundial, principalmente relacionado ao uso de analgsicos, anti-inflamatrios,

reguladores lipdicos, entre outros (QUEIROZ, 2011).

A principal rota de entrada de frmacos no ambiente por meio do lanamento de

esgotos domsticos, tratados ou no, em cursos dgua. Eles tambm podem ser introduzidos

atravs dos efluentes de indstrias farmacuticas, efluentes rurais e tambm pela disposio

inadequada de produtos no usados ou com o prazo de validade expirado (QUEIROZ, 2011;

VIEIRA, 2011; BRANDT, 2012). Caso relatado como em Hyderabad, na ndia, um dos

maiores produtores de matria-prima para as indstrias farmacuticas do mundo, em cujo

37

efluente tratado da regio foram encontrados frmacos em concentraes de g/L a mg/L

(WELLS et al., 2010).

Com isso a preocupao da comunidade cientfica com a presena de frmacos no

meio ambiente tem se tornado cada vez maior, uma vez que essas substncias so

biologicamente ativas, e a presena das mesmas no ambiente aqutico significa um risco

potencial para a sade humana se essas substncias estiverem presentes em gua para

consumo (LEE, et al., 2005).

Dados de ecotoxicidade crnica, bem como informaes sobre os nveis atuais de

distribuio nos diferentes compartimentos ambientais, continuam escassos e concentram a

ateno nas classes teraputicas mais frequentemente prescritas e consumidas. No entanto,

eles indicam o impacto negativo que estes contaminantes qumicos podem ter sobre os

organismos vivos, ecossistemas e, finalmente, na sade pblica. Atualmente na Europa e

Estados Unidos a legislao exige estudos de impactos ambientais de novos medicamentos e

consequentemente avaliao dos efeitos agudos e crnicos. No entanto, ainda persiste a falta

de conhecimento sobre dados toxicolgicos e efeitos sinrgicos dos frmacos (SANTOS et

al., 2010).

2.1.2.1 Anti-inflamatrios

Em um levantamento bibliogrfico realizado por Santos et al. (2010), dentre os estudos

publicados entre os anos de 1996 e 2009, as principais classes teraputicas citadas so:

antibiticos, anti-inflamatrios no esteroidais (AINE), reguladores lipdicos, antiepilticos,

hormnios sexuais, beta bloqueadores, antidepressivos, antineoplsicos, contrastes de raios-X,

anti-hipertensivos, ansiolticos, bloqueadores de H2, B2-simpaticomimticos e antidiabticos

orais.

Para a tcnica de GC-MS, utilizada neste estudo, os antibiticos no so passveis de

anlise, principalmente devido a sua grande massa molecular, o que faz com que possuam

elevados pontos de ebulio.

Por outro lado, os anti-inflamatrios no esteroidais possuem molculas menores que os

antibiticos e so passveis de derivatizao, o que reduz sensivelmente seus pontos de

ebulio tornando-os analisveis por GC-MS.

38

Os AINE apresentam trs efeitos principais: diminuio da resposta inflamatria;

diminuio da dor de causas inflamatrias (efeito analgsico) e diminuio da febre (efeito

antipirtico). Destacam-se nesse estudo o cido acetilsaliclico (AAS) (Figura 2.10a), o

paracetamol (PCT) (Figura 2.10b), o ibuprofeno (IBU) (Figura 2.10c), o naproxeno (NPX)

(Figura 2.10d) e o diclofenaco (DCF) (Figura 2.10e).

O

O

OCH3

OH

Figura 2.10a- Estrutura qumica do cido

acetil saliclico.

O

OHNH

CH3

Figura 2.10b- Estrutura qumica do

paracetamol (acetaminofeno).

O

CH3

CH3

OH

CH3

Figura 2.10c- Estrutura qumica do

ibuprofeno.

O

OH

OCH3

Figura 2.10d- Estrutura qumica do

naproxeno.

NaO

NHCl

Cl

O

Figura 2.10e- Estrutura qumica do diclofenaco sdico.

Os cinco AINE demonstrados acima e foco deste estudo, so classificados como

inibidores no seletivos da ciclo-oxigenase (COX) e alm de compartilharem dos mesmos

usos teraputicos tambm possuem efeitos adversos semelhantes. O principal efeito

39

indesejvel do uso dos AINE a tendncia em induzir ulcerao gstrica ou intestinal, assim

como inibio da funo plaquetria, inibio da induo do trabalho de parto, alteraes da

funo renal e reaes de hipersensibilidade (GOODMAN GILMAN, 2005).

Porm, a intensidade e os efeitos provocados pelos frmacos no meio ambiente podem

ser muito diferentes daqueles analisados em laboratrio, pois os frmacos chegam ao

ambiente muitas vezes sob a forma de subprodutos ou produtos complexos, ou at mesmo

podem alterar suas propriedades fsico-qumicas quando sofrem polimorfismo (SCHMIDT et

al., 2011a).

Alm disso, no ambiente, os frmacos encontram alvos para atuao, como nos peixes

que possuem uma ciclo-oxigenase similar humana, e uma prostaglandina importante na

formao da casca do ovo de pssaros tambm afetada. Outra evidncia foi um estudo que

identificou alteraes citolgicas no fgado, rins e guelras de Oncorhynchus mykiss, aps

exposio crnica por 28 dias a uma concentrao de 5 g/dia de diclofenaco (SANTOS et

al., 2010).

2.1.2.2 Reguladores Lipdicos

Estes frmacos so amplamente receitados e tem como objetivo reduzir o risco do

paciente desenvolver uma doena cardaca coronariana, em indivduos com

hiperlipoproteinemia tipo IIb (Toxnet, 2012).

O frmaco genfibrozila (Figura 2.11) pertence classe dos derivados do cido fbrico,

sendo capaz de atuar na reduo da concentrao plasmtica de triglicerdeos e colesterol,

alm de induzir a liplise de lipoprotenas e reduzir a produo de triglicerdeo. Este

composto j foi descrito na literatura por atuar em outros organismos como em golfinhos, nos

quais ele capaz de se bioacumular e reduzir os nveis de testosterona nos machos

(SCHMIDT et al.,2011b).

OCH3

CH3

CH3

CH3

O

OH

Figura 2.11- Estrutura qumica da genfibrozila.

40

2.1.2.3 Estimulantes

A cafena (Figura 2.12) utilizada terapeuticamente como estimulante do sistema

nervoso central, alm de ser inibidora de fosfodiesterase. Dentre os tratamentos que se

utilizam da cafena encontram-se: para apneia neonatal (curto tempo); em associao com a

ergotamina para enxaquecas; em conjunto com paracetamol para alvio mais rpido da dor

(apesar de ter nenhum efeito analgsico); e em combinaes com analgsicos e diurticos para

alvio da tenso e reteno de fludo associada menstruao (Toxnet, 2012).

CH3

CH3

CH3

O

O N

NN

N

Figura 2.12- Estrutura qumica da cafena.

Sintomas de efeitos adversos provocados por esta substncia so relatados quando uma

quantidade considervel ingerida, o que leva a ansiedade, palpitaes, tremores e taquicardia

(Toxnet, 2012).

Muitos autores consideram a cafena como um marcador da contaminao

antropognica, pois ela largamente consumida pela populao em alimentos, bebidas e

medicamentos, o que evita flutuaes nas concentraes encontradas nas guas superficiais

durante o ano, j que este consumo elevado garante que grandes quantidades de cafena sejam

excretadas e alcancem o ambiente. Tambm levado em considerao o fato de que esta

substncia altamente eliminada nas estaes de tratamento de esgoto, fazendo com que a

principal via de contaminao dos corpos dgua seja o lanamento direto de efluentes

domsticos e industriais (BUERGE et al., 2003, 2006; GLASSMEYER et al., 2005;

MONTAGNER; JARDIM, 2011).

Porm, vale ressaltar, como comentado por Burge e seus colaboradores (2003), que o

uso da cafena como marcador de contaminao antropognica se restringe a reas que no

possuem fontes naturais ou industriais significativas. O que chama a ateno para a

41

importncia de se estudar mais a fundo o uso desse marcador, principalmente no estado de

Minas Gerais, devido a extensa produo de caf.

2.2. Mtodos Analticos para Determinao de Microcontaminantes

Devido grande relevncia dos microcontaminantes emergentes, mtodos robustos

tm sido desenvolvidos visando a sua determinao nas mais variadas matrizes. As amostras

ambientais so em sua maioria complexas e as concentraes dos compostos de interesse

esto normalmente na escala de g/L a ng/L, o que demanda tcnicas de preparo de amostras

e tcnicas analticas elaboradas e eficientes (GE et al., 2010; SILVA, COLLINS, 2011;

WANG et al., 2011).

Os mtodos utilizados para anlise de microcontaminantes empregam, em sua maioria,

tcnicas cromatogrficas que podem utilizar equipamentos de cromatografia lquida ou de

cromatografia gasosa (FAN et al., 2005; RODRIGUEZ-MOZAZ et al., 2007; KIM et al.,

2007). Em ambos os casos, a deteco desses compostos feita normalmente por

espectrometria de massas, dada sua elevada especificidade e menores limites de deteco.

Outros mtodos de anlise, baseados em tcnicas enzimticas ou bioensaios, tambm tm sido

estudados. O princpio destes bioensaios a produo de anticorpos e / ou receptores que se

liguem substncia que apresente, por exemplo, atividade estrognica (NOGUEIRA, 1999).

Todavia, seu maior custo operacional e a pouca especificidade do mtodo tem favorecido o

uso das tcnicas cromatogrficas na anlise destes compostos (FARR et al., 2007). A

Tabela 2.2 resume alguns dos mtodos por bioensaios e cromatogrficos para determinao de

microcontaminantes emergentes em amostras de interesse ambiental encontrados na literatura.

42

Tabela 2.2- Mtodos para a determinao de microcontaminantes em amostras ambientais. (continua)

Imunoensaios

Teste Analitos Amostra Preparo da

amostra Maiores informaes

LD e LQ

(ng/L)

Concentraes

encontradas

(ng/L)

Referncia

YES E1, E2, E3, EE2,

4NF, 4-tOF, BPA gua do mar

SPE segundo Beck

et al. (2005)

Clulas de

Saccharomyces

cerevisae incubao: 32C/72 h/80 rpm

EEF a partir do

ED50

1 (E2), 1,25 (EE2),

2,5 10-1

(E1), 1,2 10

-4 (BPA),

1,8 10-5

(4NF)

EEF encontradas:

0,5 (E1), 0,70 (EE2), 0,68

(BPA), 0,80 (4NF), 0,55 (4-tOF)

(Beck, Bruhn, &

Gandrass, 2006)

ELISA E2, EE2 gua

superficial (2 a

6 L)

SPE (disco C18),

hidrlise enzimtica (glucuronidase),

limpeza da amostra

por HPLC

Incubao dos kits por

60 min. Anlise tambm por

GC-MS.

Recuperao: 44-117 %

0,05 (E2, EE2) 0,08 (E2),

43

Tabela 2.2- Mtodos para a determinao de microcontaminantes em amostras ambientais. (continuao)

Cromatografia

Equipamento Analitos Amostra Preparo da amostra Recuperao

(%)

LD e LQ

(ng/L)

Concentraes

encontradas (ng/L)

Referncia

GC-MS (coluna Rtx-

5MS, 30 m

0,25 m