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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
ESTRATÉGIAS ANALÍTICAS PARA DETERMINAÇÃO
DE ARSÊNIO E SELÊNIO EM AMOSTRAS DE
ALIMENTOS EMPREGANDO A ESPECTROMETRIA DE
FLUORÊSCENCIA ATÔMICA COM GERAÇÃO DE
HIDRETOS
DANNUZA DIAS CAVALCANTE
Salvador
ABRIL DE 2014
DANNUZA DIAS CAVALCANTE
ESTRATÉGIAS ANALÍTICAS PARA DETERMINAÇÃO
DE ARSÊNIO E SELÊNIO EM AMOSTRAS DE
ALIMENTOS UTILIZANDO A ESPECTROMETRIA DE
FLUORÊSCENCIA ATÔMICA COM GERAÇÃO DE
HIDRETOS – HG AFS
Tese submetida ao Colegiado de Pós-Graduação em
Química da Universidade Federal da Bahia como parte
dos requisitos para obtenção do título de Doutor em
Química (Química Analítica).
Orientador: Prof. Dr. Walter Nei Lopes dos Santos
Salvador
Abril de 2014
Este trabalho é dedicado em primeiro lugar a Deus, que esteve sempre me guiando durante essa jornada,
me dando forças quando eu achava que não tinha mais e me mostrando que posso todas as coisas
nAquele que me fortalece. A Ele toda honra, toda gloria e toda gratidão!!!
Aos meus amados Pais (Jesus e Dionei) pela dedicação, amor, e por jamais medirem esforços, ajudando-
me na concretização dessa etapa da minha vida. Não tenho palavras para agradecer tanto amor e
dedicação.
A meu esposo Thiago pelo amor, apoio e paciência e a minha filha Eloah, razão de minha felicidade.
Te amo muito filha!!!!
AGRADECIMENTOS
A todos meus familiares, em especial a meus irmãos (Layane e Danilo) pelo incentivo.
Ao professor Dr. Walter Nei Lopes dos Santos pela orientação, confiança, liberdade,
incentivo e amizade. E por ter sido sempre mais que um orientador. Muito obrigada!!!
Ao professor Dr. Sergio Luís Costa Ferreira, pelas boas contribuições no decorrer
desses quatro anos.
A professora Drª Maria das Graças Korn e sua aluna Isa pela ajuda nas digestões no
forno de micro ondas.
A professora e amiga Drª Danielle Muniz pela ajuda em vários momentos desse
trabalho.
A amiga Luciana Bittencourt pelas coletas no arrozal e por tantos outros auxílios.
Ao professor e amigo Dr. Samuel Marques Macêdo, por me passar todo seu
conhecimento e experiência sobre a geração de hidretos.
Aos colegas do Grupo de Pesquisa e Desenvolvimento em Química Analítica
(GPDQA): Gerfersom, Eduardo, Luciana, Celeste, Daniel, Meire, Bruna, Leonardo,
Mauricio e Paula.
Aos alunos de Iniciação científica que me ajudaram nesse trabalho: Jéssica, Paula e
Leonardo.
Ao programa de pós-graduação em química da UFBA, pela oportunidade de realizar
esse trabalho e seus professores e funcionários;
Ao programa de Pós-graduação em Química Aplicada da Universidade do Estado da
Bahia e todos os seus Discentes e funcionários.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela
concessão da bolsa de estudo.
A todos meus amigos, por compartilhar todos os momentos, difíceis e felizes;
A todas as pessoas que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste
trabalho
RESUMO
Neste trabalho que está no âmbito do PRONEX, foram desenvolvidas estratégias
analíticas para a determinação de arsênio e selênio em amostras de alimentos por HG
AFS. Foram realizados três trabalhos distintos. O primeiro consistiu no emprego da
amostragem em suspenção para determinação de arsênio em amostras de arroz.
Procedimentos de amostragem de suspensão foram avaliados para determinação de
As por geração de hidreto acoplado a AFS, usando HNO3 e sonicação por 30 min. As
amostras foram preparadas com KI em ácido ascórbico e com HCl 6 mol L-1, para
determinação As total. A exatidão foi confirmada por análise do material de referência
certificado NIES SRM 10b de farinha de arroz, a precisão foi confirma com valores de
RSD abaixo de 5,9 % e limites de detecção e quantificação de 0,91 e 3,04 ng L-1,
respectivamente. Este método foi utilizado para determinar o teor de arsênio em 24
amostras de arroz que foram adquiridas em supermercados da cidade de Salvador,
Bahia, Brasil. O conteúdo de arsênio nos três tipos de arroz (branco, parbolizado e
integral) variou de 0,12 a 0,47 µg g-1. O segundo trabalho foi o desenvolvimento de
método analítico para determinação de selênio em ovos. Três tipos de ovos foram
adquiridos (codorna, galinha e pata) em feiras e supermercados de Salvador. A
digestão foi realizada mediante adição de HNO3, H2O2 30% v v-1 e HCl 6 mol L-1,
utilizando o bloco digestor com dedo frio. As condições para a pré-redução e geração
do hidreto de selênio foram otimizadas empregando o planejamento fatorial e a matriz
de Doehlert. As condições ótimas foram: concentração de HCL 5,3 mol L-1,
concentração do borohidreto de sódio 2,6 % (m/v), volume de KBr 10% 1,0 mL e
tempo de pré-redução de 30 min. O método apresentou limites de detecção e
quantificação de 0,22 e 0,77 ng L-1, respectivamente. O RSD ficou abaixo de 4,7 %
demonstrando boa repetibilidade. A exatidão foi comprovada através da análise do
CRM de tecido de ostra e também através de comparação com resultados obtidos em
análise no ICP-MS. O método foi aplicado em quatro diferentes grupos de amostras,
na clara e na gema separadas e na mistura dos dois, sendo que as concentrações
mínimas e máximas foram de 0,35 ± 0,01 a 0,88 ± 0,03 µg g-1. O terceiro trabalho foi o
desenvolvimento de método para determinação de arsênio em atum e sardinha
enlatados. As amostras foram submetidas a 3 procedimentos de preparo de amostra
(bloco digestor, forno de micro-ondas e forno mufla). As condições para a pré-redução
e geração do hidreto de arsênio foram otimizadas empregando o planejamento fatorial
e a matrix de Doehlert e as condições encontradas foram: tempo de pré-redução de 21
min, volume de pré-redutor KI 10 % (m v-1) em ácido ascórbico 2% (m v-1) de 1,0 mL,
concentração de HCl 4,7 mol L-1 e concentração de NaBH4 de 2% (m v-1). O método
mostrou-se preciso, com valores de RSD abaixo de 7,0 %. Um material de referência
certificado de tecido de ostra (NIST SRM 1566b) foi analisado para avaliar a exatidão
do método. O material foi submetido a três procedimentos de digestão. Através da
análise dos resultados pode-se observar que o valor obtido no forno de micro-ondas e
no bloco digestor foi cerca de metade do valor certificado, pois a arsenobetaina só é
convertida a arsênio inorgânico a temperaturas acima de 300 º C. O método foi
aplicado para 20 amostras de atum e sardinha enlatados e os valores de concentração
variaram de: 0,63 ± 0,10 a 3,28 ± 0,20 µg g-1.
Palavras Chave: Arsênio, selênio, arroz, ovos, pescados enlatados, HG AFS.
ABSTRACT
In this work is under PRONEX, strategies for analytical determination of arsenic and
selenium in food samples by HG AFS were developed. Three diferent studies were
conducted. The first one consisted in the use of sampling in suspension for
determination of arsenic in rice procedures were evaluated to As by hydride generation
coupled to AFS using HNO3 and sonication for 30 min. The samples were prepared
with KI in ascorbic acid and 6 mol L-1 HCl to determine total As. The accuracy was
confirmed by analysis of certified reference material NIES SRM 10b rice flour, precision
was confirmed with% RSD values lower than 5.9% and limits of detection and
quantification of 0.91 and 3.04 ng L -1, respectively. This method was used to
determine the content of arsenic in 24 rice samples purchased at supermarkets in the
city of Salvador, Bahia, Brazil. The content of arsenic in the three types of rice (white,
parboiled and integral) ranged from 0.12 to 0.47 µg g-1. In the second study we
developed a method for determination of selenium in eggs. Three types of eggs were
purchased (quail, chicken and paw) at fairs and supermarkets of Salvador. The
digestion was performed by adding HNO3, 30% H2O2 (v v-1), 6 mol L-1 HCI and, using
the block digester cold finger. The conditions for the pre-reduction and hydride
generation of selenium were optimized using factorial design and Doehlert matrix, the
optimal conditions were: HCl concentration of 5.3 mol L-1, the 2.6% (w v-1) sodium
borohydride concentration, 1.0 mL volume of 10% (w v-1) KBr and pre-reduction time
30 min. The method has limits of detection and quantification of 0.22 and 0.77 ng L -1,
respectively. The% RSD was below 4.7 showing good repeatability. The accuracy was
confirmed by analysis of CRM oyster tissue and also by comparison with results
obtained for analysis by ICP-MS. The method was applied to four different groups of
samples, in clear and separate yolk and mix of the two, the minimum and maximum
concentrations were 0.35 ± 0.01 to 0.88 ± 0.03 mg g-1. The third work was the
development of a method for determination of arsenic in canned tuna and sardines.
The samples were subjected to three procedures for sample preparation (digestion
block, microwave and oven muffle). The conditions for the pre-reduction and hydride
generation of arsenic were optimized using factorial design matrix and Doehlert, the
conditions were: pre-reduction time of 21 min, volume of 1.0 mL of 10% KI (w v-1) (pre-
reducing) in 2% ascorbic acid, HCl concentration of 4.7 mol L-1 and NaBH4- in 2% (v m-
1). The method was precise, with RSD values below 7.0%. A certified reference
material of oyster tissue (NIST SRM 1566b) was analyzed to assess the accuracy of
the method. The material was subjected to the three digestion procedure. From the
analysis of the results it can be seen that the value obtained in the microwave oven
and the digester block was about half the value of the certificate, as the only
arsenobetaine is converted to inorganic arsenic at temperatures above 300 °C. The
method was applied to 20 samples of canned tuna and sardines and concentration
values ranged from 0.63 ± 0.10 to 3.28 ± 0.20 mg g-1.
Key-words: Arsenic, selenium, rice, eggs, canned fish, HG AFS
LISTA DE TABELAS
Páginas
Tabela 1: Algumas formas orgânicas e inorgânicas de arsênio 21
Tabela 2: Principais formas químicas do selênio 22
Tabela 3: Limites máximos de arsênio em alimentos definidos pela
ANVISA
25
Tabela 4: Ingestão diária recomendada de selênio – ANVISA 26
Tabela 5- Matriz de Doehlert para duas variáveis (A e B) com um ponto central
48
Tabela 6: Parâmetros operacionais do HG AFS empregados na
determinação do arsênio
54
Tabela 7: Seleção do extrator/solvente para preparação das
suspensões das amostras de arroz
58
Tabela 8: Comparação entre amostragem em suspensão e
extração das amostras de arroz para quantificação de arsênio
58
Tabela 9: Comparação entre a amostragem em suspenção e
digestão ácida para determinação de arsênio nas amostras de arroz
60
Tabela 10: Determinação de As total em amostras de arroz
utilizando a amostragem em suspensão
61
Tabela 11: Parâmetros operacionais do HG AFS para determinação
de Selênio
66
Tabela 12: Parâmetros operacionais do ICP-MS para determinação
de Selênio
67
Tabela 13: Planejamento fatorial dois níveis completo - otimização
do processo de geração do hidreto de selênio.
72
Tabela 14: Matrix Doehlert para otimização da geração de hidreto
de selênio.
74
Tabela 15: Análise da variância (ANOVA) para os dados referentes
á Tabela 14.
75
Tabela 16: Resultados para determinação de Se no CRM de tecido
de ostra empregando o método proposto (mg kg-1, n=3).
77
Tabela 17: Concentração de Se nas amostras de ovos por HG AFS
e ICP-MS
78
Tabela 18. Programa de aquecimento em forno de micro-ondas
com cavidade
86
Tabela 19: Planejamento fatorial dois níveis completo - otimização
do processo de geração do hidreto de arsênio.
89
Tabela 20: Matrix Doehlert para otimização da geração do hidreto
de arsênio
91
Tabela 21: Análise da variância (ANOVA) para os dados referentes
á Tabela 20
92
Tabela 22: Resultados para determinação de As no CRM de tecido
de ostra utilizando os dois métodos de preparo de amostra.
94
Tabela 23: Concentração de arsênio em sardinha e atum enlatados,
após digestão em bloco digestor com dedo frio e em forno de micro-
ondas com cavidade.
96
LISTA DE FIGURAS
Páginas
Figura 1: Representação esquemática do AFS 37
Figura 2: Diagrama esquemático. a) dedo frio, b) tudo de digestão e
c) dedo frio acoplado ao tubo de digestão.
44
Figura 3: Distribuição dos pontos experimentais da matriz Doehlert representado por um hexágono regular com as coordenadas normalizadas, para otimização de duas variáveis.
47
Figura 4: Porcentagem de extração do arsênio no arroz em função
do tempo de sonicação.
57
Figura 5: Gráfico de pareto da otimização da geração de hidreto de
selênio
73
Figura 6: Superfície de resposta da otimização de hidreto de selênio. 75
Figura 7: Gráfico dos valores preditos X valores observados para
geração do hidreto de selênio
76
Figura 7: Gráfico de pareto da otimização da geração de hidreto de
arsênio
90
Figura 8: Superfície de resposta para otimização da geração de
hidreto do arsênio
92
Figura 9: Gráfico dos valores preditos X valores observados para
otimização da geração de hidreto do arsênio
93
LISTA DE SIGLAS e ABREVIAÇÕES
ANVISA: Agência Nacional de vigilância sanitária
WHO: World Health Organization
EU:União Europeia ( do ingles: European Union)
US EPA: Agência proteção ambiental dos Estados Unidos ( do inglês: United States
Environmental Protection Agency)
IDR: Ingestão Diária Recomendada
MMAA: ácido monometilarsônico
DMAA: ácido dimetilarsônico
AsB: arsenobetaína
AsC: arsenocolina
SeCys: Selenocisteína
SeMet: Selenometionina
SeCM: Selenometilcisteína
CONAMA: Conselho Nacional do Meio Ambiente
HG AFS: Espectrometria de Fluorescência atômica com geração de hidretos (do
inglês: Hydride generation atomic fluorescence spectrometry)
HG AAS: Espectrometria de absorção atômica com geração de hidretos (do inglês:
Hydride generation atomic absorption spectrometry)
FAAS: Espectrometria de absorção atômica com chama (do inglês: Flame atomic
absorption spectrometry)
AES: Espectrometria de emissão atômica
ICP OES: Espectrometria de emissão atômica com plasma indutivamente acoplado
(do inglês: Inductively coupled plasma optical emission spectrometry.)
CV AFS: Espectrometria de fluorescência atômica com vapor frio (do inglês: atomic
fluorescence spectrometry
2
HR CS FAAS: Espectrometria de absorção atômica com chama de alta resolução com
fonte contínua
GFAAS: Espectrometria de absorção atômica com forno de grafite (do inglês: Graphite
furnace atomic absorption spectrometry)
ICP-MS: Espectrometria de massas com plasma indutivamente acoplado (do inglês:
Inductively coupled plasma mass spectrometry)
CV AAS: Espectrometria de absorção atômica com vapor frio
ETAAS: Espectrometria de absorção atômica com atomização eletrotérmica (do inglês:
Electrothermal atomic absorption spectrometry)
EVOP: Plano evolucionário de otimização
MSR: Metodologia de superfície de resposta
HPLC: Cromatografia líquida de alta resolução
HCL: Lâmpada de cátodo oco
CRM: Material de referência certificado
IUPAC: União internacional de química pura e aplicada
RSD: Desvio padrão relativo
LD: Limite de detecção
LQ: Limite de quantificação
ANOVA: Análise de variânci
13
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ............................................................................ 16
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................ 19
1. O Elemento químico Arsênio ........................................................................ 19
2. O elemento químico Selênio ......................................................................... 21
3. Arsênio e Selênio nos alimentos .................................................................. 24
3.1 Arsênio ............................................................................................................................................................................................ 24
3.2 Selênio ................................................................................................................................................................................... 26
4. Geração de Hidretos ...................................................................................... 27
4.1 Sistema de Redução NaBH4/Ácido ................................................................................................................... 28
4.2 Mecanismos de Geração de Hidreto utilizando o NaBH4 .......................................................... 29
4.3. Transporte dos hidretos voláteis ...................................................................................................................... 30
4.5 Interferências ............................................................................................................................................................................ 33
5. A Espectrometria de Fluorescência Atômica ............................................... 35
6. Métodos de preparo de amostra ................................................................... 37
6.1 Amostragem por suspensão .................................................................................................................................... 38
6.1.1 Preparo das suspensões ........................................................................................................................................ 39
6.2 Decomposição da Matéria orgânica ................................................................................................................. 41
6.2.1. Digestão por via úmida utilizando radiação micro-ondas .................................................. 41
6.2.2. Decomposição por via úmida utilizando bloco digestor com “dedo frio” ........... 42
7. Otimização Multivariada ................................................................................ 44
7.1 Planejamento Fatorial Completo ........................................................................................................... 45
7.2 Metodologia da Superfície de Resposta (MSR) ........................................................................... 46
7.3 Matriz de Doehlert ............................................................................................................................................................ 46
OBJETIVOS ............................................................................... 49
Objetivos Específicos .............................................................................................. 49
CAPITULO I ............................................................................... 50
Amostragem em suspensão e HG AFS para
determinação de arsênio total em amostras de arroz. .. 50
INTRODUÇÃO ............................................................................ 51
14
EXPERIMENTAL ......................................................................... 53
1. Instrumentação .............................................................................................. 53
2. Reagentes e soluções .................................................................................... 54
3. Amostras ........................................................................................................ 55
4. Preparação das Suspensões e determinação de As por HG AFS .............. 55
5. Digestão das amostras utilizando bloco digestor com “dedo frio” ........................................ 56
RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................... 57
1. Otimização das condições experimentais .................................................... 57
2. Escolha do extrator/solvente para determinação de arsênio utilizando
amostragem em suspensão. ................................................................................ 57
3. Investigação da necessidade de introdução das partículas da suspensão
no HG AFS ............................................................................................................. 58
4. Comparação entre o método proposto (amostragem em suspensão) e
digestão ácida utilizando o sistema bloco digestor/dedo frio. .......................... 59
5. Estudos de validação ..................................................................................... 60
6. Aplicação ........................................................................................................ 61
CONSIDERAÇOES FINAIS ........................................................ 62
CAPITULO II .............................................................................. 63
Desenvolvimento de método analítico para
determinação de selênio em amostras de ovos (clara e
gema) por HG AFS ................................................................ 63
INTRODUÇÃO ........................................................................... 64
EXPERIMENTAL ........................................................................ 66
1. Instrumental.................................................................................................... 66
2. Reagentes e soluções .................................................................................... 67
3. Amostras ........................................................................................................ 68
3.1 Digestão das amostras .......................................................................................................................................... 68
4. Otimização Multivariada da pré-redução e geração do hidreto de selênio 69
5. Etapa de pré-redução ..................................................................................... 69
RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................... 71
1. Otimização multivariada do sistema proposto para a geração de hidreto ............ 71
1.1. Planejamento Fatorial ............................................................................................................................................. 71
1.2 Planejamento Doehlert ............................................................................................................................................... 73
15
2. Validação do Método ..................................................................................... 76
3. Aplicação do método desenvolvido ............................................................. 77
CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................ 79
CAPITULO III ............................................................................. 80
Determinação de arsênio total em amostras de atum e
sardinha enlatados por HG AFS ........................................ 80
INTRODUÇÃO ............................................................................ 81
EXPERIMENTAL ......................................................................... 83
1. Instrumentação .............................................................................................. 83
2. Reagentes e soluções .................................................................................... 83
3. Amostras e material de referência certificado ................................................... 84
4. Procedimentos para digestão das amostras ................................................ 85
4.2 Digestão das amostras de sardinha e atum enlatados em bloco
digestor com dedo frio ......................................................................................................................................................... 85
4.2. Digestão das amostras de sardinha e atum enlatados em forno de micro
ondas .......................................................................................................................................................................................................... 86
5. Otimização Multivariada da pré-redução e geração do hidreto de arsênio ... 86
6. Etapa de pré-redução ..................................................................................... 87
RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................. 88
1. Otimização multivariada do sistema proposto para a geração de hidreto ......... 88
1.1. Planejamento Fatorial ............................................................................................................................................. 88
1.2. Planejamento Doehlert....................................................................................................................................... 90
2. Validação do Método ..................................................................................... 93
3. Aplicação ........................................................................................................ 95
CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................ 97
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................ 98
16
INTRODUÇÃO
A determinação de elementos químicos em amostras complexas sempre
se mostrou com um dos principais problemas da química analítica. Sendo
assim, diversos procedimentos têm sido desenvolvidos com o intuito de
minimizar os efeitos de matriz e ampliar a faixa de aplicação das técnicas mais
comumente empregadas.
Nesse contexto a geração de hidretos apresenta uma grande vantagem,
pois o analito é separado da matriz e convertido a um composto volátil, sendo,
em seguida, transportado ao atomizador, onde ocorre a atomização para a
quantificação. Nos primeiros trabalhos, a atomização era feita utilizando-se a
chama comum, que logo foi substituída por atomizadores de tubo de quartzo.
Atualmente, devido ao desenvolvimento de métodos analíticos e o surgimento
de diversas técnicas instrumentais de análise, vários sistemas de atomização
vêm sendo amplamente utilizados [1].
Considerações importantes sobre o potencial do método de geração de
hidreto acoplada às técnicas de espectrometria de absorção atômica (AAS)
foram descritas detalhadamente por Dedina e Tsalev [2]. Algumas Revisões [3-
45] também fizeram importantes considerações sobre o método de geração de
hidretos em espectrometria atômica. Sem dúvida, a determinação por geração
de hidreto tem sido empregada preferencialmente em AAS, entretanto,
interesse crescente pelo método é reportado empregando-se a espectrometria
de fluorescência atômica (AFS) [6-789]. Geralmente, a introdução de um
analito na forma de hidretos aumenta a sensibilidade e seletividade, e permite
obter limites de detecção com valores muito abaixo das técnicas
convencionais.
Para a determinação de espécies voláteis, empregando-se a geração de
vapor químico, várias considerações devem ser feitas a respeito da reação de
formação de vapor, por cada espécie. A concentração do NaBH4, e o tipo e
concentração do ácido são os fatores mais estudados. Entretanto, cada
espécie formadora de hidreto apresenta particularidades para a reação com o
NaBH4 em meio ácido, podendo depender do seu estado de oxidação, do pH
da solução, do ambiente redutor ou oxidante, dentre outros [10, 11].
17
A geração de hidreto acoplado às técnicas espectroanalíticas (AAS,
AFS, ICP OES, ICP-MS), exige uma decomposição completa ou dissolução
das amostras antes da análise quantitativa, o que aumenta tanto o tempo de
análise como risco de contaminação da amostra além de perdas de analito por
volatilização [12].
A etapa de pré-tratamento da amostra é reconhecidamente a mais
demorada e trabalhosa do que a análise propriamente dita, sendo os
procedimentos de preparação de amostra para determinação de As e Se
críticos devido à alta volatilidade destes elementos. Esta realidade tem levado
pesquisadores a buscar alternativas mais simples e rápidas de tratamento da
amostra, particularmente para análise de rotina.
Uma alternativa simples para minimização do preparo da amostra é o
emprego da amostragem na forma de suspensão, diminuindo o tempo de
preparo da amostra, reduzindo o risco de contaminação e evitando perdas do
analito por volatilização, além de possibilitar, em muitos casos, utilizar a técnica
de calibração com padrões aquosos [13, 14].
É bem conhecida à toxicidade de arsênio e selênio e outros elementos
que formam hidretos, por isso o interesse no monitoramento desses elementos
em amostras biológicas, ambientais e de alimentos, a fim de controlar suas
concentrações abaixo dos níveis de segurança. Além disso, o selênio também
é considerado essencial, apresentando uma faixa de concentração muito
estreita entre os níveis de essencialidade e toxicidade [15].
O solo, pesticidas, inseticidas e a água utilizada no cultivo agrícola são
as principais fontes de introdução de minerais, tanto essencial quanto tóxico,
em alimentos [16]. Processos antrópicos e eventos naturais como erosão de
solos, erupções vulcânicas, podem causar aumento dos níveis de elementos
tóxicos em águas, alimentos e na atmosfera. Dessa forma, a ingestão de água
e alimentos representam fontes de introdução de elementos no organismo
humano. Dentre as várias técnicas existentes para a determinação desses
elementos em amostras ambientais e de alimentos, as espectroanalíticas se
baseiam na introdução da amostra por nebulização pneumática. Apesar da
simplicidade do processo de introdução da amostra e de sua boa estabilidade,
somente 5% da amostra chega até a chama ou plasma, sendo o restante
descartado no dreno devido à baixa eficiência de nebulização [17]. Assim,
18
esforços têm sido feitos como alternativa para introdução do analito para
ampliar a faixa de aplicação dessas técnicas.
No presente trabalho, foram desenvolvidos procedimentos para a
determinação de As e Se total, empregando a amostragem de suspensão e
decomposição por via úmida em bloco digestor com sistema de refluxo (dedo
frio) como estratégias analíticas para o preparo de amostra e quantificação
empregando o HG AFS.
19
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1. O Elemento químico Arsênio
Elemento químico de símbolo As e número atômico 33, é considerado
um semi-metal ou metaloide por possuir características físicas e químicas
pertencentes tanto aos metais quanto aos não metais. Possui massa atômica
75 u e apresenta-se nas condições ambiente como um sólido, pertence ao
grupo 15 A da tabela periódica. Foi descoberto em 1250 por Alberto Magno e
sua aparência varia de acordo com o estado alotrópico em que se encontra:
cinza ou metálico, amarelo e negro. O arsênio cinza metálico é a forma mais
estável nas condições normais [18,19].
Uma de suas principais aplicações é como conservante do couro e da
madeira, uso que representa, cerca de 70 % do consumo mundial. O arsenato
de gálio é um importante semicondutor empregado em circuitos integrados que
são mais rápidos e caros do que os de silício. É utilizado também como aditivo
em ligas metálicas de chumbo e latão. Possui também uma grande aplicação
como herbicidas (arsenito de sódio), inseticida (arsenato de chumbo) e
venenos. Outras aplicações deste elemento são na indústria farmacêutica, do
vidro, cerâmica e metalúrgica. Recentemente voltou-se o interesse
principalmente pelo uso do tri óxido de arsênio para o tratamento de pacientes
com leucemia.
O arsênio e alguns de seus compostos são considerados umas das
substâncias mais tóxicas da história da humanidade. No século V a.C. o
arsênio foi considerado um veneno sendo responsável pelo envenenamento de
várias personalidades como Napoleão Bonaparte e George III da Inglaterra
[20].
O arsênio existe na natureza de diversas formas químicas incluindo
espécies orgânicas e inorgânicas, está presente em mais de 200 minerais,
sendo mais comum nas piritas. Ele é encontrado em 4 estados de oxidação
diferentes: -3, 0, +3 e +5 e está vastamente distribuído na natureza,
20
representando uma preocupação para a saúde humana quando se concentra
no meio ambiente tanto por processos naturais como antropogênicos. [21].
Compostos contendo arsênio são utilizados no tratamento de algumas
doenças e na agricultura sendo encontrados nos herbicidas e inseticidas [22]. A
flora e a fauna marinha contêm compostos de arsênio, pois nas vias
metabólicas o nitrogênio e o fósforo podem ser substituídos facilmente por ele
[21]. É o vigésimo elemento mais abundante na crosta terrestre.
Devido a fatores como a dieta humana, a exposição ocupacional e
ambiental, a média de consumo diário de arsênio por um adulto pode variar no
intervalo de 0,025 a 0,033 mg Kg-1dia-1.
A maior fonte de exposição ocupacional do arsênio pelo ser humano é
na produção de pesticidas, herbicidas e outros produtos agrícolas. Já as
maiores fontes de exposição não ocupacional são a ingestão de água e
alimentos contaminados [23].
O arsênio possui altos níveis de toxicidade devida sua facilidade em ser
absorvido tanto oralmente quanto por inalação, sendo a extensão da absorção
dependente da solubilidade do composto [ 24 ]. Uma longa exposição aos
compostos inorgânicos do arsênio pode acarretar diversas doenças tais como:
conjuntivite, hiperpigmentação, hiperqueratose, doenças cardiovasculares,
distúrbios no sistema nervoso central e vascular periférico, câncer de pele e
gangrena nos membros [25, 26]. Quase todo arsênio absorvido localiza-se
inicialmente na fração eritrócito do sangue. O elemento deixa rapidamente a
corrente sanguínea e deposita-se nos tecidos, armazenando-se principalmente
no fígado, rins e pulmões. É depositado nos cabelos, sendo que esta
deposição ocorre cerca de duas semanas após a administração,
permanecendo neste local durante anos. Também é depositado nos ossos
onde ficam longos períodos [27]. Na Tabela 1 são apresentadas as principais
espécies de arsênio. [25].
A urina é a principal via de eliminação dos compostos de arsênio, sendo
cerca de 50% da dose ingerida eliminada por esta via. Além disso, pequenas
porções são eliminadas através da pele, cabelos, fezes, unhas e pulmão [24,
28].
O principal interesse em determinar diferentes espécies de arsênio está
relacionado à diferente toxicidade das espécies. O As (III) é 60 vezes mais
21
tóxico do que o As (V) e as espécies inorgânicas são aproximadamente 100
vezes mais tóxicas que as orgânicas. O grau de toxidade das espécies mais
importantes de As segue essa ordem de toxidade: arsenito (III) > arsenato (V) >
monometilarsenato (MMA) > dimetilarsenato (DMA) (V) [25, 29].
A maior fonte não ocupacional de exposição a arsênio é através da
ingestão de água [24] e alimentos, sendo que os alimentos de origem marinha
possuem uma das mais altas taxas de arsênio, mas praticamente todo ele está
na forma orgânica, principalmente como arsenobetaína, que é essencialmente
não tóxica e excretada na urina, sem modificação e com um tempo de
residência curto [30, 31]. O nível de arsênio inorgânico nesses alimentos é
inferior a 1%, sendo que na carne, cereais e outros alimentos ingeridos
diariamente esse nível é superior [30].
Tabela 1: Algumas formas orgânicas e inorgânicas de arsênio [25].
Composto Abreviatura Fórmula
Arsenito As (III) AsO33-
Arsenato As (V) AsO43-
Ácido monometilarsônico MMAA (V) CH3AsO(OH)2
Ácido dimetilarsínico DMAA (V) (CH3)2AsOH
Arsenobetaina AsB (CH3)3As+CH2COO-
Arsenocolina AsC (CH3)3As+CH2CH2OH
2. O elemento químico Selênio
O selênio é um metaloide, que foi identificado em 1817 pelo químico
sueco Jons Jacob Berzelius. Pertence ao grupo 16 da tabela periódica,
possuindo símbolo Se, número atômico 34 e massa atômica 78 u. Está
localizado entre o enxofre e o telúrio, possuindo propriedades químicas e
físicas semelhantes aos mesmos [18].
É encontrados na natureza em 5 estados de oxidação (-2, 0, +2, +4 e
+6), todos eles comumente encontrados na natureza, exceto o +2. Na Tabela 2
são mostrados as principais formas químicas do selênio no ambiente.
22
Tabela 2: Principais formas químicas do selênio [32].
Composto Abreviatura Fórmula
Selenito Se (IV) SeO4-2
Selenato Se (VI) SeO3-2
Selenocisteína SeCys HOOCCH(NH2)CH2–Se–H
Selenometionina SeMet HOOCCH(NH2)CH2CH2–Se–CH3
Selenometilcisteína SeCM HOOCCH(NH2)CH2–Se–CH3
Selenocistina HOOCCH(NH2)CH2–Se–Se–
CH2CH(NH2)COOH
O selênio elementar é relativamente pouco tóxico. No entanto, alguns de
seus compostos são extremamente perigosos. Concentrações de seleneto de
hidrogênio, superiores a 0,1 miligramas por metro cúbico de ar, podem ser
bastante prejudiciais ou mesmo letais. A exposição a vapores que contenham
selênio pode provocar irritações dos olhos, nariz e garganta. A inalação desses
vapores pode ser muito perigosa devido à sua elevada toxicidade [33]
É um elemento-traço essencial para os seres humanos e animais,
envolvendo diversas ações fisiológicas. A essencialidade nutricional do selênio
foi relatada pela primeira vez para impedir a necrose hepática em animais de
laboratório, depois disso vários estudos indicaram que o selênio desempenha
um importante papel em muitos aspectos da saúde. Além disso, ele é parte
integrante do sítio catalítico de várias enzimas, inclusive a glutationa
peroxidase [32, 34],
É um micronutriente encontrado no pão, nos cereais, nos pescados, nas
carnes, nas plantas e ovos [35]. Um alimento tipicamente brasileiro e rico em
selênio é a castanha do Pará. Ele é um poderoso antioxidante que ajuda a
neutralizar os radicais livres, estimula o sistema imunológico e intervém no
funcionamento da glândula tireóide [36, 40].
O conteúdo de selênio nas plantas varia de acordo com a sua
concentração no solo, que varia regionalmente. Em todo o mundo há regiões
em que a concentração de selênio no solo é muito baixa, como por exemplo,
regiões do da Austrália, nordeste da China, norte da Correia do Sul, Centro-sul
23
da China, Nepal, Tibet e entre outras. Essa deficiência se agrava mais quando
a dieta é derivada inteiramente dos alimentos locais com pouco ou nenhuma
importação de alimentos, essas pessoas que vivem nessas regiões pobres em
selênio tem uma ingestão diária desse elemento muito baixa. Por exemplo, no
Nepal a ingestão é de 23 mg/dia, na China cerca de 26 mg/dia, sendo que o
recomendado é cerca de 55 mg/dia [37]. Existe uma elevada incidência de
doenças relacionadas à deficiência em selênio entre as pessoas que vivem
nessas regiões, inclusive o câncer, devido a isso há uma busca elevada de
agentes naturais como o selênio que possam inibir o desenvolvimento do
câncer, incentivando vários estudos utilizando o selênio para prevenir o câncer
realizado em todo mundo [37, 38].
A deficiência de selênio pode causar: mialgia, degeneração pancreática,
sensibilidade muscular, maior suscetibilidade ao câncer. Por outro lado, o
excesso de selênio pode causar fadiga muscular, colapso vascular periférico,
congestão vascular interna, unhas fracas, queda de cabelo, dermatite,
alteração do esmalte dos dentes e vômito [39].
É muito utilizado em retificadores que convertem corrente alternadas em
contínua. Como sua condutividade aumenta em presença da luz e, porque
pode converter a luz diretamente em eletricidade, é empregado em células
fotoelétricas, em fotômetros e células solares. Quando introduzido em
pequenas quantidades no vidro, o selênio serve como descorante, mas em
grandes quantidades dá ao vidro uma coloração vermelha, útil em sinais
luminosos. É também usado na manufatura de esmaltes para cerâmicas e
derivados do aço, assim como na fabricação da borracha para aumentar a
resistência à abrasão. Os sulfetos de selênio são utilizados em medicina
veterinária e em shampoos anticaspa [35].
O selênio encontrado no meio ambiente é proveniente de fontes naturais
(processos geofísicos e biológicos) e fontes antropogênicas (processos
industriais e agricultura). As primeiras fontes são responsáveis pela presença
do selênio no ambiente, enquanto que as demais, pela redistribuição deste no
ambiente, isto é pela liberação de selênio das fontes geológicas e pela
disponibilização deste para os organismos do ecossistema terrestres e
aquáticos [40].
24
No ambiente aquático, o selênio pode existir nas formar inorgânicas
(selenito, selenato, selênio elementar, selenetos metálicos) e orgânicas e seu
estado de oxidação vai depender das condições ambientais [38].
A RESOLUÇÃO do Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA) Nº
396, de 03 de abril de 2008, que estabelece uma classificação das águas
subterrâneas quanto ao uso e também determina os limites de contaminantes,
estabeleceu o limite máximo de 0,01 mg L-1 para água para consumo humano
[41].
3. Arsênio e Selênio nos alimentos
O monitoramento de contaminantes inorgânicos é de grande relevância
em análises de amostras de alimentos, como também em outras amostras que
necessitam do controle desses contaminantes. Assim sendo, a determinação
de elemento traço de interesse toxicológico é de relevância no contexto
econômico e na saúde pública [36].
Em geral, a concentração de metais e metaloides nos alimentos é
influenciada por fatores ambientais, pois estão presentes na atmosfera, na
água, em solos, sedimentos e pela ação de vulcões, no caso do arsênio. O
processamento desses alimentos com o uso de fertilizantes, pesticidas,
herbicidas, água de irrigação contaminada, contaminação do ar e outros,
podem levar esses metais aos alimentos.
3.1 Arsênio
O arsênio ocorre naturalmente nos alimentos, embora certas quantidades
devam ser somadas como resultado da contaminação devido sua presença no
ambiente. Alimentos de origem animal e vegetal possuem geralmente teores de
arsênio menores que 1mg Kg-1, exceto produtos de origem marinha que podem
possuir teores mais elevados. A ingestão de arsênio total vai depender da
quantidade desses alimentos na dieta humana. Na tabela 3, estão os limites
máximos de arsênio para algumas classes de alimentos definidos pela Agência
25
Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) na portaria nº 685, de 27 de agosto
de 1998 [42].
Tabela 3: Limites máximos de arsênio em alimentos definidos pela ANVISA.
Alimentos Limites (mg Kg-1)
Gorduras vegetais 0,1
Gorduras e emulsões refinadas 0,1
Gorduras hidrogenadas 0,1
Açúcares 1,0
Caramelos e balas 1,0
Bebidas alcoólicas fermentadas 0,1
Bebidas alcoólicas fermento-destiladas 0,1
Cereais e produtos a base de cereais 1,0
Gelados Comestíveis 1,0
Ovos e produtos de ovos 1,0
Leite fluído pronto para o consumo 0,1
Mel 1,0
Peixe e produtos de peixe 1,0
Produto de cacau e derivados 1,0
Chá, mate, café e derivados. 1,0
La Guardia e colaboradores desenvolveram um método simples e
sensível para determinação de arsênio total por Espectrometria de
Fluorescência Atômica com Geração de Hidretos (HG AFS) em amostras de
bebidas refrescantes como refrigerantes, chás e suco de frutas, obtendo limites
de detecção que variaram de 0,01 a 0,03 ng mL-1 [43].
Já Capar et al. propôs um método para determinação de arsênio, selênio,
antimônio e telúrio em tecidos de peixe utilizando a Espectrometria de
absorção atômica com geração de hidretos (HG AAS), obtendo limites de
detecção de 10 a 20 ng g-1 [44].
Montorro e colaboradores propuseram um método para determinação de
arsênio total e suas espécies inorgânicas no arroz cru e cozido, visando
26
determinar sua biodisponibilidade, para tanto eles simularam uma digestão
gastrointestinal, o As (V) foi à espécie mais encontrada [45].
3.2 Selênio
O selênio está presente na maioria dos alimentos, sendo que podemos
encontrar boas fontes deste elemento nos frutos secos (especialmente na
castanha do Brasil), peixe, marisco, vísceras (rins ou fígado) e nas carnes. Os
cereais, verduras e outros alimentos vegetais também contêm selênio, contudo,
o seu teor varia de acordo com o tipo de solo a partir do qual se desenvolvem
[46].
A quantidade dietética recomendada de selênio para homens e mulheres
é 55 µg dia-1, para mulheres grávidas e em lactação esse valor aumenta para
60 e 70 µg dia-1, respectivamente, ver tabela 4 [47]. A deficiência de selênio
pode causar doenças como a de Keshan que provoca o aumento do coração e
seu mau funcionamento, essa doença tem ocorrido na China onde o consumo
de selênio é inferior a 19 µg dia-1 para os homens e 13 µg dia-1para as
mulheres. A deficiência de selênio também pode afetar a função da tireoide
porque o selênio é essencial para síntese do hormônio ativo [48].
Tabela 4: Ingestão diária de selênio recomendada pela ANVISA
Ingestão diária recomendada (µg dia-1)
Lactente Crianças (anos) Adultos Gestantes Lactantes até 1
ano
0 - 0,5 anos 0,5 - 1 1 - 3 4 - 6 7 - 10
10 15 20 20 30 70 65 75 Fonte: Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA Portaria n.33/1998
Por outro lado, um consumo demasiado de alimentos ricos em selênio
pode levar a uma condição chamada de selenoses, na qual os sintomas são:
queimação no estômago, perda de cabelo, unhas marcadas de brancas, e
alguns danos no nervo, por isso que Instituto de Medicina dos Estados Unidos
estabeleceu o limite máximo de ingestão de selênio de 400 µg/dia para adultos
[47, 49].
27
Inúmeras pesquisas mostram que a concentração de selênio nos
alimentos pode apresentar grande variação, dependendo dos teores presentes
no solo. Em função da importância do selênio, é necessário conhecer a
composição nutritiva dos alimentos, de forma a garantir um consumo adequado
desse elemento por parte da população [50].
Jordão e colaboradores determinaram os teores de selênio em alguns
alimentos consumidos no Brasil, dentre eles feijão, arroz, farinha, abacate,
abacaxi e banana da terra. Os teores mais elevados de selênio foram
encontrados nos produtos de origem animal, sobretudo nos pescados, e nos
produtos derivados do trigo [36].
Muller et al. determinaram selênio em água e leite de cocô utilizando a
espectrometria de absorção atômica com atomização eletrotérmica em forno de
grafite, eles concluíram que esses alimentos podem ser úteis como fontes de
selênio facilmente disponíveis à população [51].
4. Geração de Hidretos
A geração de hidretos compreende um processo de derivatização
química no qual são produzidos hidretos voláteis, a partir do tratamento da
amostra com um agente redutor, que pode ser um metal ou um reagente
específico que na maioria das vezes é o tetrahidroborato de sódio (NaBH4), em
meio acidificado [52,53]. Nos primeiros trabalhos, os sistemas de redução
metal/ácido eram os mais comumente utilizados. Embora melhorassem o sinal
analítico, o uso desses sistemas foi associado com algumas limitações como:
elevado tempo requerido para formação do hidreto, o sistema de coleta era
susceptível à interferência e perda, e a sensibilidade era limitada devido ao
amplo fator de diluição do hidreto durante a etapa de introdução na chama de
difusão argônio/hidrogênio [53, 54].
Está técnica vem sendo abordada como uma excelente alternativa de
introdução de amostra em determinações espectrométricas, uma vez que
separa o analito da matriz, aumenta a eficiência de transporte do analito em
relação aos nebulizadores comumente empregados para introdução de
amostra, melhora a sensibilidade e o limite de detecção [55].
28
O acoplamento da espectrometria com a geração de hidretos para
determinação de elementos traço se difundiu rapidamente em virtude das
várias vantagens apresentadas e de sua simplicidade. Ela se baseia na
geração de hidretos voláteis à temperatura ambiente após reação do
tetrahidroborato de sódio com um determinado elemento em meio ácido. Em
geral, esta técnica se aplica aos elementos: arsênio [ 56 ], bismuto [ 57 ],
germânio [58], chumbo [58], antimônio [59], selênio [60], telúrio [57] e estanho
[61], os quais nestas condições formam hidretos covalente estáveis [62, 63].
O primeiro trabalho utilizando a geração de hidretos foi o trabalho de
Holak [64], onde o zinco metálico foi utilizado como redutor para produzir a
arsina, pela redução do arsênio presente na amostra acidificada, sendo a
arsina transportada para a atomização por um espectrômetro de absorção
atômica com chama (FAAS).
A técnica baseia-se na conversão da espécie de interesse em um
hidreto covalente gasoso que, por meio de um gás de arraste, é transportado
ao atomizador, onde ocorre sua atomização. O processo de determinação
espectrométrica por geração química de hidreto pode ser dividido em três
partes: a geração do hidreto volátil, o transporte do hidreto volátil para o
atomizador (que inclui também sua liberação da solução) e a
atomização/quantificação dos hidretos.
4.1 Sistema de Redução NaBH4/Ácido
Em 1972 foi proposta uma nova abordagem para geração de hidretos
utilizando soluções redutoras de tetrahidroborato de sódio (NaBH4) (que
precisam ser estabilizadas em meio alcalino) para geração de hidretos de
arsênio e antimônio [65]. Com o emprego do NaBH4, o número de elementos
determináveis por geração de hidretos aumentou, passando a incluir elementos
como bismuto, germânio, chumbo, estanho e telúrio [66].
O sistema que utiliza do NaBH4 em meio alcalino como agente redutor
para formação dos hidretos voláteis se mostra o mais eficiente com maior
reprodutibilidade nas medidas e cinética de reação mais definida do que outros
sistemas, além de possibilitar automação [53, 67]. O NaBH4 ao longo do tempo
29
se degrada, por isso deve ser preparado em meio alcalino, pouco antes do uso.
[ 68 ]. Mas, a concentração da base deve ser adequada para não causar
supressão no sinal analítico.
Geralmente, a concentração de NaBH4 depende da espécie analítica a
ser determinada e do sistema proposto para geração de hidretos. Os trabalhos
na literatura recomendam o uso da solução de NaBH4 na faixa de 0,5 – 10 %
(m/v), em solução aquosa estabilizada por 0,1 – 2,0 % (m/v) de KOH ou NaOH.
No sistema NaBH4/ácido, o HCl é o mais utilizado, embora H2SO4 e HNO3
também possam ser usados.
O NaBH4 é o agente redutor mais empregado em geração de hidreto por
mostrar-se mais eficiente e versátil, podendo ser empregado tanto por sistemas
em batelada quanto por sistemas em fluxo, visto sua rápida cinética de reação
e maior reprodutibilidade, qualquer que seja o método de detecção empregado
[53].
4.2 Mecanismos de Geração de Hidreto utilizando o NaBH4
O primeiro mecanismo descrito para a geração de hidreto [69] indica que
o processo ocorre a partir da evolução de hidrogênio atômico, também
chamado de hidrogênio nascente, que é formado pela hidrólise ácida do agente
redutor, a qual pode ser representada pela equação 1, do ponto de vista global
e estequiométrico sem envolver o mecanismo complexo e a cinética de reação
[53].
Equação 1: BH4- + H+ + 3H2O H3BO3 + 8H
Após a formação do hidrogênio nascente, há a derivatização do
elemento para o hidreto equivalente, conforme representado pela equação 2. O
hidrogênio atômico em excesso, que não reagiu, forma hidrogênio molecular,
que é um dos produtos finais da hidrólise ácida do tetraborato de sódio.
Equação 2: Am+ + (m+n)H AHn + mH+
30
Onde, ‘A’ é o analito de interesse, ‘m’ o estado de oxidação do analito e
‘n’ o número de coordenação do hidreto.
Outro mecanismo vem sendo proposto por autores que discordam com a
hipótese de formação do hidreto a partir do hidrogênio nascente D’ULIVO [70,
71 ] e seus colaboradores propõem a transferência gradual de átomos de
hidrogênio do borano para o substrato analito após formação de complexos
intermediários analito-borano. Segundo essa hipótese, o mecanismo pode ser
escrito pelas equações 3 e 4 [66, 72]:
Equação 3: NaBH4 + H3O+ + 2H2O → intermediários → H3BO3 + H2
Equação 4: NaBH4/intermediários + A → AHn
O uso de reagentes deuterados em vários trabalhos tem demonstrado
que o hidrogênio ligado diretamente ao boro é o responsável pela formação do
hidreto. Em um destes estudos com reagentes deuterados [73], foi observado
que a reação de As (III) e As (V) com NaBD4 em HCl 3 mol L-1 e H2O foi obtida
como principal produto AsD3 e quando se utilizou NaBH4 em DCl e D2O, foi
obtido como principal produto o AsH3. Assim, os autores puderam afirmar que a
arsina foi produzida a partir da transferência do hidrogênio ligado diretamente
ao boro. Segundo os autores, caso o hidrogênio nascente estivesse envolvido
no processo de geração do hidreto, o principal produto seria AsHnD3-n.
4.3. Transporte dos hidretos voláteis
O transporte do hidreto ao sistema de detecção pode ser feito de duas
maneiras: transferência direta ou coleta.
Na transferência direta o hidreto é transportado para o atomizador com o
auxílio do fluxo de um gás inerte, conhecido como gás carreador, e também
com o auxílio do gás hidrogênio formado durante a geração do hidreto. Os
gases inertes empregados são o nitrogênio e o argônio [74, 53].
Já na coleta, as espécies voláteis formadas são coletadas em
armadilhas localizadas entre o frasco reacional e o atomizador, para
posteriormente serem transportadas.
Procedimentos envolvendo a coleta do hidreto foram muito utilizados
quando os agentes redutores metal/ácido eram empregados. Estas reações
31
eram relativamente lentas, podendo levar alguns minutos. Assim, a coleta do
hidreto e sua liberação ao sistema de medida produziam sinais maiores, devido
à pré-concentração, e aumentando a reprodutibilidade [75].
4.4 Atomização e mecanismo de atomização de hidretos
Os atomizadores de hidreto têm como finalidade converter o hidreto do
analito a seu átomo livre com o máximo de eficiência. Muitas técnicas de
espectrometria atômica são acopladas a geração de hidretos, o que gera uma
gama de possibilidades de atomizadores empregados. Dentre as técnicas, a
mais amplamente acoplada à geração de hidretos é a Espectrometria de
Absorção Atômica (AAS), a qual apresenta como possibilidades de
atomizadores: a chama, o tubo de quartzo aquecido externamente, o tubo de
quartzo com chama interna e o forno de grafite.
A atomização em chama foi amplamente empregada quando se
trabalhava com geração de hidretos. O hidreto gerado era diretamente
introduzido em uma chama de ar-hidrogênio-argônio/nitrogênio, mas isso
resultava em uma menor sensibilidade devido à diluição do hidreto nos gases
da chama e em maiores limites de detecção devido à alta absorção de fundo e
ruídos [53].
Desde sua introdução em 1972 por Chu e colaboradores [ 76 ], os
atomizadores de tubo de quartzo tornaram-se os mais utilizados para
determinação de metais por geração de hidreto. Estes tubos são
confeccionados em forma de T, os quais são alinhados ao caminho óptico do
aparelho [53,54]. Os tubos de quartzo podem ter aquecimento externo
realizado por uma chama ou uma manta resistora e interno por uma chama de
oxigênio-hidrogênio ou ar-hidrogênio gerada próxima à junção do braço central
com a parte principal do tubo. Este sistema de atomização apresenta uma série
de vantagens como alta sensibilidade, baixo ruído de fundo e limites de
detecção adequados para determinação de diferentes espécies que geram
hidreto [53, 77].
A atomização do hidreto em forno de grafite pode ser dividida em dois
tipos: atomização direta, na qual o hidreto é transportado do frasco reacional
para o forno de grafite, onde é imediatamente atomizado, e a atomização após
32
captura in situ do hidreto no forno. O sistema de atomização direta no forno de
grafite apresenta uma menor sensibilidade quando comparado com a
atomização após coleta in situ e a atomização com tubo de quartzo [54].
Elevadas temperaturas de plasmas e chamas permitem um mecanismo
de atomização via decomposição térmica. Em tubos de quartzo, as
temperaturas são relativamente baixas, menores que 1000 °C, assim, a
atomização não deve ser provocada devido à decomposição térmica [53].
Acredita-se que a atomização dos hidretos gasosos no tubo de quartzo
aquecido ocorre devido aos átomos de hidrogênio livres. Foi observado que o
As não produz sinal de atomização quando a arsina é introduzida em uma
célula de quartzo aquecida, em uma atmosfera contendo apenas o gás inerte
[78]. O fato da influência do hidrogênio, na atomização do hidreto de As ser
menor em temperaturas maiores no forno de grafite sugere que o mecanismo
de atomização por decomposição térmica desempenha a principal função.
Os mecanismos envolvidos na atomização da arsina, em atomizadores
de tubo de quartzo, são dependentes da reação do hidreto com radical
hidrogênio presente no interior do tubo, sendo necessário um suprimento de
oxigênio [79]. Para a formação dos radicais hidrogênio, traços de oxigênio
desempenham um papel fundamental, conforme é apresentado nas reações
abaixo, descritas pelas equações 5 a 7.
Equação 5: H + O2 OH + O
Equação 6: O + H2 OH + H
Equação 7: OH + H2 H2O + H
Assim, a decomposição da arsina pela ação da temperatura e colisão
com radicais hidrogênio, resultando em átomos livres em fase gasosa, pode ser
descrito pela equação 8:
Equação 8: AsH3 H AsH2 + H2 H AsH + H2 As + H2
H
33
São diversas as vantagens atribuídas à geração química de vapor. O
fato de, geralmente, apenas o analito formar a espécie volátil, previne possíveis
interferências que poderiam ser causadas pela presença de concomitantes.
Além disso, por ser um sistema de introdução mais eficiente do que aqueles
baseados na nebulização pneumática convencional, sendo que o transporte da
espécie volátil formada, embora dependendo do rendimento da reação, da
eficiência da purga e do transporte ao atomizador, pode alcançar 100%. A
elevada eficiência no transporte do analito proporciona uma maior
sensibilidade, implicando em melhores limites de detecção, a níveis de µg/Kg a
ng/Kg. O confinamento do vapor atômico no volume definido pela célula de
quartzo aumenta a densidade de átomos no caminho óptico, assim como o
tempo de residência, podendo a eficiência de atomização chegar a 100% [54,
80].
4.5 Interferências
Embora a geração de hidretos seja uma técnica na qual, diversas
interferências de análise são eliminadas e/ou minimizadas, em alguns casos,
algumas interferências podem ocorrer, podendo estar relacionadas a diferentes
fases do processo (fase líquida, fase gasosa e interferências espectrais.).
O primeiro grupo ocorre na fase líquida, durante a formação do hidreto
ou durante a transferência do hidreto da solução, devido às mudanças de
velocidade de formação do hidreto e/ou diminuição na eficiência de formação
do hidreto [53].
A interferência na fase líquida pode ser causada pelo efeito da matriz ou
por elementos de diferentes estados de oxidação. Neste último caso, a
interferência acontece porque ocorre uma competição para a redução das
diferentes espécies químicas, resultando numa baixa formação do hidreto.
Neste caso, existe a necessidade de decompor completamente o material
orgânico durante pré-tratamento da amostra que contém a espécie analítica de
interesse. Uma decomposição incompleta da matéria orgânica resulta na
formação de um excesso de espuma que pode reter algum hidreto formado [52,
53, 66].
34
A interferência devido ao efeito da matriz ocorre quando a matriz afeta a
eficiência da formação do hidreto. Neste caso, alguns ácidos inorgânicos (ácido
nítrico e sulfúrico), usados em procedimentos de digestão da amostra, afetam
drasticamente a formação do hidreto de interesse. A interferência destes ácidos
é maior em atomizadores de tubos fechados do que em tubos de quartzo
abertos.
Para controle destas interferências na fase líquida, muitas propostas já
foram e ainda estão sendo sugeridas. Dentre elas têm-se: a busca de uma
condição que permita o mínimo de tempo de residência do hidreto formado na
mistura reacional (matriz), o uso de agentes mascarantes, utilização de
procedimentos de separação para remover os interferentes inorgânicos e
otimização das condições críticas da concentração do ácido e do agente
redutor, a fim de obter condições experimentais que permitam maiores razões
interferente/analito nas determinações [53].
As interferências da fase gasosa podem ocorrer no volume morto do
frasco de reação, na linha de transporte ou no atomizador. As interferências
que ocorrem ao longo do transporte do hidreto, já liberado da solução para o
atomizador, pode causar atraso e/ou perdas; as que ocorrem no processo de
atomização estão relacionadas ao excesso de outro elemento formador de
hidreto, o que traz como consequência, a diminuição do sinal analítico. Este
tipo de interferência pode ser interpretado de duas maneiras: o interferente
pode promover o declínio da concentração dos radicais H no interior do
atomizador, ou acelerar o decaimento dos átomos livres do analito no
atomizador, via reação analito-interferente, que podem resultar na formação de
moléculas diatômicas estáveis [54].
As interferências espectrais promovem aumento do sinal analítico. Elas
ocorrem quando o detector interpreta um sinal, que não o do analito, como se
dele fosse. Podem ser causados pela presença de espécies atômicas que
absorvam ou emitam radiação no mesmo comprimento de onda que o analito.
Este tipo de interferência é muito raro na absorção e fluorescência atômica.
Outra possibilidade de interferência é a presença de espécies moleculares ou
partículas no caminho óptico que atenuem a radiação primária. Em se tratando
de geração de hidretos, essas interferências são usualmente insignificantes,
devido à separação do analito da matriz [54].
35
Muitos procedimentos são utilizados para eliminar ou minimizar a
interferência dos elementos tanto na fase líquida quanto na fase gasosa. O
procedimento mais simples é aumentar a acidez do meio reacional. Outro
procedimento é alterar a quantidade de NaBH4 [81].
Além disso, vários reagentes são usados para minimizar e eliminar o
efeito dos interferentes. Na maioria dos casos são utilizados bases de Lewis,
que podem funcionar como ligantes, sendo que alguns são agentes redutores
ou complexantes, tais como: EDTA, KI [82], tiuréia [83], ácido ascórbico, KCN,
1,10-fenantrolina e L-cisteína.
Outra maneira bastante eficiente para eliminar ou minimizar o efeito de
interferentes é o uso de métodos de separação e pré-concentração. Gurkan e
colaboradores empregaram a metodologia do ponto nuvem para separar e pré-
concentrar espécies de arsênio em amostras de água, para posterior
quantificação por HG AAS [84]. Já Turker et al., utilizou a pré-concentração em
fase sólida, usando um adsorvente hibrido de nano partículas de dióxido de
zircônio e óxido de boro para especiação e determinação de As (III), As (V) e
As total em amostras de água por HG AAS [85].
5. A Espectrometria de Fluorescência Atômica
A espectrometria de fluorescência atômica é amplamente empregada
com a geração de hidretos. Este acoplamento constitui uma técnica analítica de
relativa simplicidade e baixo custo. É muito sensível, seletiva para alguns
elementos como: mercúrio, arsênio, selênio, bismuto, antimônio, telúrio,
chumbo e cádmio, por isso o seu acoplamento com a geração de hidretos vem
crescendo bastante nos últimos anos [86].
É uma técnica de análise elementar que envolve o uso de uma fonte de
radiação com comprimento de onda característico para excitar átomos livres na
forma de vapor a um nível de energia mais alto que o nível fundamental. A
excitação dos átomos do analito é seguida por um processo de relaxamento,
que envolve a emissão de radiação de fluorescência, de comprimento de onda
igual ao fornecido pela fonte, portanto, a energia emitida como radiação
36
fluorescente pela amostra é proporcional à radiação ressonante absorvida por
ela [86].
Na espectrometria de fluorescência atômica com geração de hidretos, o
atomizador utilizado na decomposição do hidreto é uma chama de difusão, rica
em radicais H, que atua facilitando o processo de atomização dos hidretos [86].
A instrumentação básica de um AFS é semelhante aos de AAS e AES,
exceto que a fonte de luz e o detector são localizados em um ângulo reto,
como mostra a figura 1. Consiste de uma fonte de radiação, um atomizador, um
seletor de comprimento de onda e um detector [86]. A radiação emitida pela
lâmpada de cátodo oco não deve alcançar o detector, pois este interpretaria a
radiação emitida pela lâmpada como sinal analítico. O uso de filtros
adequados, associado ao arranjo do equipamento, no qual a fonte emissora se
encontra a 90º do detector, minimizam o espalhamento da radiação na célula
de atomização [86].
O AFS oferece grandes vantagens em termos de linearidade e níveis de
detecção, o que tem melhorado em função da qualidade das lâmpadas
empregadas como fontes de excitação. Suas limitações, como espalhamento,
supressão da fluorescência e emissão de fundo, dependem dos níveis de
impurezas das amostras, mas a separação analito-matriz, inerente à geração
de hidretos, favorece sua associação à detecção por fluorescência atômica [54,
86].
La Guardia e colaboradores (2011) desenvolveram um sistema não
cromatográfico para determinação de Sb (III), Sb (V), Te (IV) e Te (VI) em
amostras de cereais. O procedimento baseia-se na extração assistida por
ultrassom e na determinação por espectrometria de fluorescência atômica
acoplada com geração de hidretos (HG AFS) [87].
Wang and Zhang determinaram arsênio, bismuto, telúrio e selênio em
amostras de solo utilizando um HG MC AFS (Espectrômetro de fluorescência
atômica multi canal com geração de hidretos). Esse equipamento permitiu a
determinação simultânea de todos esses analitos com boa precisão e baixos
limites de detecção [88].
Campos et al. determinou arsênio total em água do mar, utilizando o HG
AFS, eles conseguiram limite de detecção de 36 ng L-1, comprovando assim
mais uma vez a sensibilidade da técnica [89].
37
Leal e colaboradores acoplaram um sistema de injeção em fluxo ao HG
AFS para determinação online de dimetilarsênio (DMA) e arsênio inorgânico
total, a utilização de uma lâmpada UV permitiu a foto-oxidação online do DMA
para posterior quantificação no HG AFS, o método proposto foi aplicado em
diversas amostras de águas mostrando-se preciso, sensível e exato [90].
Figura 1: Representação esquemática do AFS (AURORA INSTRUMENTS)
6. Métodos de preparo de amostra
O preparo de amostra é uma das etapas mais importantes de toda a
sequência analítica, pois ela é responsável pelo maior custo e constituem a
maior fonte de erros na sequência analítica [91].
Grande parte das técnicas analíticas requer que a amostra seja
convertida em uma solução, devendo ser submetida a um tratamento
adequado visando a determinação do(s) analito (s). Este tratamento pode
variar desde um simples polimento da superfície de uma amostra, até a
38
completa transformação da amostra sólida em uma solução compatível com o
método de determinação. A maneira de se decompor a amostra para a análise
depende da sua natureza, do elemento a ser determinado e sua concentração,
do método de determinação, e da precisão e exatidão desejada [91].
6.1 Amostragem por suspensão
Suspensão é um fluido heterogêneo contendo partículas dispersas com
diâmetro maior que 1 µm. A fase sólida é dispersa no fluido por agitação
mecânica. Nas suspensões, geralmente, ocorre a sedimentação das partículas
quando o meio está em repouso e quando não são usados agentes
estabilizantes [91]
A amostragem por suspensão tem sido proposta como uma boa
alternativa para o preparo de amostra quando comparada aos métodos de
decomposição. Ela apresenta diversas vantagens, dentre as quais pode-se
destacar:
Diminuição do tempo de preparo das amostras;
Menor consumo de ácidos concentrados;
Menor possibilidade de perdas do analito pela formação de
resíduos insolúveis ou por volatilização;
Menor possibilidade de contaminação
É bastante aplicável à determinação de elementos voláteis por
abordagens de geração de vapor químico [91, 92].
Considerando as vantagens citadas, a amostragem de suspensão tem
sido objeto de pesquisa para determinação de vários elementos acoplada à
geração de vapor químico [93, 94, 95]. Entretanto, a precisão dos métodos
analíticos envolvendo a amostragem de suspensão está intimamente
relacionada com a homogeneidade da amostra analisada. Considerações
sobre a homogeneidade da amostra é crucial para emprego desta técnica,
porque a quantidade de amostra suspensa pode não ser representativa da
composição real da amostra global [91,92]
Vários métodos têm sido propostos para a determinação de arsênio
considerando o método de amostragem de suspensão em matrizes sólidas
39
após uma etapa de geração de hidreto [92]. Essa abordagem foi aplicada com
sucesso para a determinação de arsênio em diversas amostras sólidas por HG
AAS. Desde então, vários métodos, usando amostragem de suspensão e
geração de vapor químico, têm sido propostos [96], como a determinação de
As, Sb, Se, Te, e Bi em leite por HG AFS [97], determinação de chumbo em
sedimento e lodo de esgoto por HG-ICP OES [98] e determinação de arsênio
em amostras de arroz integral, branco e parboilizado [99].
6.1.1 Preparo das suspensões
Vários fatores devem ser considerados quando se emprega a
amostragem de suspensão, como: método de moagem; granulometria;
solvente; particionamento do analito; massa da amostra e proporção de volume
de diluente; reagentes estabilizantes e sistema de homogeneização da
suspensão [92].
Vários métodos de moagem mecânica têm sido utilizados para o preparo
de suspensões. A escolha do equipamento adequado depende das
características da matriz, principalmente da sua dureza. Geralmente, as
técnicas de moagem podem ser aplicadas a uma grande variedade de
materiais, principalmente se a amostra for previamente submetida a uma etapa
de secagem [91].
Em geral, os procedimentos de moagem convencional são apropriados
para o preparo de suspensões de amostras de alimento que estejam na forma
de pó ou que tenham sido secas antes da moagem, mas não são eficazes para
redução do tamanho de partículas de alimentos com elevador teores de água,
fibras e gorduras. Para essas matrizes o procedimento de moagem mais
indicado é a moagem criogênica [91]. O tamanho das partículas tem papel
decisivo na estabilidade das suspensões durante a aspiração, transporte ou
introdução da amostra, assim como na eficiência da atomização.
Os solventes empregados para o preparo das suspensões são
componentes importantes, pois podem funcionar como diluentes extratores do
elemento de interesse para a fase líquida, de modo que a eficiência da
40
transferência influencia para melhorar a exatidão e precisão do método [92,
100].
A quantidade de analito extraído das partículas para o solvente pode ser
influenciado pela matriz da amostra, a natureza do analito, a interação entre o
analito e a matriz, o tamanho das partículas, o tipo e a concentração do
solvente e o tempo de exposição ao solvente. A seleção do solvente é
comumente feita com base na matriz da amostra, características do analito e a
técnica de detecção [92, 100].
A quantidade de amostra sólida e volume de diluente devem ser
selecionados tendo em conta tanto a homogeneidade da amostra como o nível
de concentração final do analito que possa ser quantificado. Com uma
proporção adequada, entre massa e volume de diluente, para um determinado
método analítico, uma relação linear da quantidade de suspensão da amostra
contra o sinal analítico deve ser esperada. Entretanto, é importante afirmar que
as suspensões com proporções diferentes entre massas de amostra e volumes
de diluentes, podem fornecer resultados analíticos completamente diferentes
[101, 102].
A amostragem em suspensão pode ser combinada com a maioria das
técnicas espectroanalíticas, como FAAS, GFAAS, ICP OES, ICP-MS [103], HR
CS FAAS, HG AFS [104] e CV AFS [105]. Lin e Jiang propuseram um método
utilizando a amostragem em suspensão para determinação de As, Cd, Hg e Pb
em ervas por ICP-MS [ 106 ]. Já Souza et al, utilizou a amostragem em
suspensão como preparo para a amostra de adoçantes sólidos e determinaram
Ca, Cd, Cu, Co, Fe, Mg, Mn, Na, Ni, Pb, Se e Zn, por ICP OES [107]. Bezerra e
colaboradores desenvolveram a amostragem em suspenção para
determinação de manganês e zinco em folhas de chá por FAAS [108]. Brandão
et al propuseram um método baseado na amostragem em suspensão para
determinação de ferro em leite em pó fortificado por HR CS FASS [109]. Já
Aranda e colaboradores utilizaram a amostragem em suspensão para
determinação de um elemento volátil (mercúrio) que é facilmente perdido nos
procedimentos de preparo de amostras convencionais, em sangue humano e
quantificação por CV AFS [110].
Um fator muito importante quando se fala de amostragem em suspenção
é a avaliação das estratégias de calibração.
41
Em vários trabalhos utilizando amostragem de suspensão e empregando
a geração de hidreto como estratégia para a introdução do analito no sistema
de detecção, a técnica de calibração com padrões aquosos pôde ser
empregada com êxito [111, 112, 113]. Em alguns trabalhos, padrões aquosos
não puderam ser empregados para a calibração devido à interferência da
matriz. Esta interferência é verificada pela diferença entre as inclinações das
curvas com padrões aquosos e a técnica de adição de analito. Neste contexto,
estratégias como calibração com adição de analito [114, 115], adição de analito
e diluição isotópica [95], calibração com adição de padrão interno [116], foram
empregadas para a quantificação de As por amostragem de suspensão e
geração de hidreto, utilizando técnicas espectroanalíticas.
6.2 Decomposição da Matéria orgânica
A maioria das técnicas analíticas empregadas para determinação
elementar utiliza a introdução da amostra na forma de solução, na qual o
analito esteja numa forma disponível para a determinação. Assim, em geral,
devem-se utilizar procedimentos de preparo de amostra que levem a total ou
parcial destruição da matéria orgânica existente em grandes proporções na
maioria das matrizes de alimentos [117]. A decomposição pode ocorrer por via
seca ou úmida, sendo a primeira também chamada de calcinação ou
incineração e a segunda, comumente chamada de digestão.
A digestão por via úmida pode ser realizada em sistemas fechados
(forno de micro-ondas, bombas de digestão) e/ou em sistemas abertos (placa
de aquecimento, bloco digestor) por um ácido ou pelas misturas de ácidos
[118]. A digestão da amostra por via úmida em sistema aberto (à pressão
atmosférica) é uma das técnicas mais antigas e usadas para a decomposição
de matéria orgânica e inorgânica [119].
6.2.1. Digestão por via úmida utilizando radiação micro-ondas
A decomposição de matérias orgânicas por via úmida implica em
aquecimento da amostra na presença de um ácido mineral oxidante
42
concentrado, de misturas de ácidos oxidantes, ou mistura de um ácido oxidante
com peróxido de hidrogênio. Torna-se possível oxidar completamente a maioria
das amostras, deixando os elementos a serem determinados na solução ácida
em formas inorgânicas simples e apropriados para análise, se os ácidos forem
suficientemente oxidantes, e se o aquecimento for feito a temperaturas
elevadas durante um período de tempo adequado.
A digestão assistida por micro-ondas em sistema fechado tem sido um
dos métodos de preparo de amostra mais utilizados, principalmente quando se
quer determinar elementos voláteis. Essa técnica apresenta diversas
vantagens como: o tempo de digestão é reduzido, a quantidade de reagente
utilizado é pequena, menor risco de contaminação da amostra. Dentre suas
principais limitações estão: o tempo necessário para se resfriar os fracos, que
podem levar horas, a limitação na quantidade de amostra a ser digerida [91].
6.2.2. Decomposição por via úmida utilizando bloco digestor com “dedo
frio”
O preparo de amostra envolvendo o sistema de refluxo com “dedo frio”
permite digerir amostras em bloco digestor para determinação de elementos
voláteis, pois a perda dos elementos por volatilização é evitada devido a
condensação provocada pelo sistema de refluxo formado pelo “dedo frio”. Essa
técnica combina vantagens como: massas de amostras e volumes dos
reagentes que não são críticos, ou seja, pode utilizar uma quantidade maior de
amostra ou de reagentes sem risco de explosão e pode-se trabalhar com
diversos tipos de amostras, tanto orgânicas como inorgânicas [120].
Os primeiros métodos de preparo de amostra envolvendo sistema de
refluxo para condensação de espécies voláteis foram utilizando condensadores
convencionais, apesar de altamente eficazes, mas não são práticos quando se
tem um grande número de amostras para digerir.
O dedo frio é um tubo de vidro em forma de dedo que é colocado sob o
tubo de digestão (Figura 2). Água fria é colocada dentro do dedo frio para
resfriar a parte superior do tubo digestor, provocando assim o refluxo e
condensação das espécies voláteis evitando a perda por evaporação. Os
ácidos utilizados na digestão, também são condensados, isso pode gerar uma
43
vantagem ou uma desvantagem, a vantagem é que poucos reagentes precisam
ser adicionados porque é pouco consumido o que diminui o risco de
contaminação e a desvantagem é que a solução resultante da digestão
normalmente tem uma concentração elevada de ácidos. Esse inconveniente
pode ser resolvido através de uma diluição da amostra quando possível, ou
preparar a curva na mesma concentração das amostras [120].
Vários autores já utilizaram o sistema de refluxo com dedo frio para
determinação de elementos voláteis e comprovando a eficiência do método.
Como Ribeiro e colaboradores que utilizaram o dedo frio para preparar
amostras biológicas e determinar mercúrio por CV AAS, ele atingiram uma
temperatura máxima de 120º C, material de referência certificado foi analisado
comprovando assim a exatidão e precisão do método proposto [121].
Ferreira et al., utilizou do sistema de refluxo com dedo frio para digerir
amostras de vegetais e determinar chumbo por ETAAS, foi utilizado um
material de referencia certificado de folhas de espinafre e o valor encontrado foi
compatível ao do certificado. O método também se mostrou preciso com
valores de RSD % abaixo de 4,27 [122].
Ribeiro et al., utilizou três procedimentos para preparar amostras de
carne e quantificar Cd, Pb e Sn por GFAAS. Os procedimentos foram: digestão
ácida utilizando o dedo frio, solubilização com hidróxido tetrametilamônio e
ácido fórmico. Teste de adição e recuperação foi realizado assim também
como análise de vários materiais de referência certificados de carne, e foi
observado que os melhores resultados foram obtidos com as amostras
submetidas à digestão ácida [123].
Ferreira e colaboradores propuseram um método direto para
determinação de cádmio em vinho por GFAAS. Durante o processo de
validação outro método de preparo de amostra foi utilizado, o sistema bloco
digestor com dedo frio. O método de regressão linear foi utilizado para
comparar os resultados obtidos com os dois métodos, os resultados
demonstraram que não havia diferença significativa [124].
44
Figura 2: Diagrama esquemático. a) dedo frio, b) tudo de digestão e c) dedo
frio acoplado ao tubo de digestão [120].
7. Otimização Multivariada
A quimiometria é um ramo da Química que consiste na aplicação de
métodos matemáticos e estatísticos em planejamento e otimização de
procedimentos analíticos e na obtenção de resultados que sejam relevantes a
partir das informações químicas obtidas.
Um bom planejamento consiste em projetar um experimento de forma a
obter-se exatamente o tipo de informação que se procura sobre o sistema
estudado. Um planejamento fatorial completo pode ser utilizado quando se
deseja avaliar (de maneira qualitativa ou quantitativa) a influência de variáveis
sobre o sistema, enquanto que um planejamento fatorial fracionário pode ser
usado apenas para uma triagem de variáveis em sistemas com muitas
variáveis. Por isso é necessário, ao iniciar-se um planejamento, ter
conhecimento preliminar das variáveis ou fatores e as respostas de interesse
para o sistema que se deseja estudar [125].
O experimentado quando não tem noção de qual região experimental
poderá fornecer os valores ótimos para as variáveis estudadas, o mesmo
45
poderá recorrer aos desenhos sequenciais que serão úteis para indicar a
direção para futuros experimentos. Dentre os desenhos sequência podem ser
usados o método simplex [126,127], o método da subida mais íngreme e o
plano evolucionário de otimização (EVOP) [127]. Já os desenhos simultâneos
fornecem a relação entre fatores e respostas por meio de combinação do
desenho experimental, construção do modelo matemático e aplicação da
metodologia da superfície de resposta (MSR) [128]. Nesta etapa de otimização,
as técnicas mais utilizadas incluem o planejamento Doehlert [ 129 , 130 ],
desenho composto central [131] e desenho Box-behnken [132].
7.1 Planejamento Fatorial Completo
O objetivo de um planejamento fatorial completo é identificar quais os
fatores tem influência ou não sobre a resposta. Os fatores são as variáveis
independentes a serem controladas no processo, podendo ser quantitativas ou
qualitativas, e a resposta é a variável dependente que, em uma análise
química, corresponde ao valor medido nos experimentos.
Um planejamento fatorial completo realiza experimentos em todas as
possíveis combinações dos níveis dos fatores. O mais simples envolve apenas
dois níveis para cada fator e, nesse caso, são realizados 2k ensaios, onde k
corresponde ao número de fatores [125].
Para a realização dos ensaios utiliza-se uma matriz de planejamento que
descreve todas as combinações a serem estudadas. Nos planejamentos de
dois níveis representam-se os níveis superiores e inferiores por sinais (+) e (-),
respectivamente [125]. Um ponto central pode ser incluído com o valor médio
dos níveis, sendo representado por zero (0). Assim, replicatas dos pontos
centrais podem ser usadas para identificar relações não lineares no intervalo
estudado e fornecer uma estimativa do erro experimental sem a necessidade
de replicata de todo o experimento [133].
46
7.2 Metodologia da Superfície de Resposta (MSR)
A metodologia da superfície de resposta (MSR) é um conjunto de
técnicas de otimização de experimentos que foi desenvolvida por G.E.P. Box
na década de 1950 [134]. Esta metodologia consiste em um grupo de técnicas
matemático-estatísticas utilizadas para análise e modelagem de problemas, no
qual uma resposta particular é função de diversas variáveis objetivando
otimizar esta resposta. Pode ser de duas etapas distintas: modelagem e
deslocamento. Estas etapas podem ser repetidas quantas vezes forem
necessárias, com o objetivo de atingir uma região ótima da superfície
investigada [125]. A modelagem pode ser feita por ajuste de modelos simples
(lineares ou quadráticos) às respostas obtidas com planejamentos fatoriais. O
deslocamento segue o caminho da máxima inclinação de um determinado
modelo, onde há um maior pronunciamento da resposta.
7.3 Matriz de Doehlert
O planejamento por matriz de Doehlert foi aplicado em Química Analítica
pela primeira vez para avaliação das melhores condições experimentais numa
técnica de separação que envolvia uso de cromatografia líquida de alta
eficiência (HPLC). Desde então há vários registros de sua aplicação para
otimização envolvendo métodos espectrométricos, cromatográficos,
eletroanalíticos, entre outras [135,136].
O planejamento utilizando matriz de Doehlert é um sistema de
otimização de experimentos de segunda ordem que possui seus pontos
distribuídos uniformemente por todo espaço experimental. Para duas variáveis,
o desenho Doehlert consiste em um ponto central e seis pontos formando um
hexágono regular. Neste tipo de desenho, o número de níveis não é o mesmo
para todas as variáveis. Uma variável é estudada em cinco níveis enquanto a
outra em apenas três níveis, como é mostrada na Figura 3. Vale ressaltar que
nesse planejamento, as variáveis podem vim a ser estudadas em até sete
níveis. Critérios diferentes podem ser usados para a escolha das variáveis,
47
como regra geral, escolhe-se a variável de maior efeito como o fator de cinco
níveis para obtenção de maiores informações sobre o sistema [125, 127].
Figura 3: Distribuição dos pontos experimentais da matriz Doehlert representado por um hexágono regular com as coordenadas normalizadas, para otimização de duas variáveis.
O desenho é definido considerando-se o número de variáveis e os
valores codificados (Ci) da matriz experimental. A relação entre o valor
codificado e o valor real é dada pela expressão:
𝐶𝑖 = |𝑋𝑖 − 𝑋𝑖
0
𝐶𝑋𝑖| 𝐾
Ci é o valor codificado para o fator i, Xi é o valor real no experimento, Xi0
é p valor real no ponto central no domínio experimental, ΔXi é o passo de
variação (valor central – valor mínimo), e K é o limite do valor codificado para
cada fator (1 e 0,866 para o primeiro e segundo fator, respectivamente). O
48
número de experimentos (N) é determinado por N= k2 + k + Co, onde k é o
número de variáveis e Co é o número de pontos centrais [125]. A Tabela 5
apresenta uma matriz de Doehlert para dois fatores.
Tabela 5: Matriz de Doehlert para duas variáveis (A e B) com um ponto central
Variáveis Experimentais
A B
1 0 0
2 1 0
3 0,5 0,866
4 -1 0
5 -0,5 -0,866
6 0,5 -0,866
7 -0,5 0,866
49
OBJETIVOS
____________________________________________________________
Desenvolver estratégias analíticas para a determinação de arsênio e
selênio em amostras de alimentos empregando diferentes procedimentos
de preparo de amostra com posterior determinação por HG AFS.
Objetivos Específicos
Desenvolver e validar procedimento analítico de preparo de amostra,
empregando amostragem em suspensão, visando determinação de
arsênio utilizando HG AFS em diversas amostras de arroz.
Desenvolver e validar procedimento analítico de preparo de amostras de
ovos utilizando bloco digestor com dedo frio visando à determinação de
selênio por HG AFS.
Desenvolver e validar procedimento analítico de preparo de amostra
empregando bloco digestor com dedo frio para determinação de arsênio
em amostras de atum e sardinha enlatados por HG AFS
Avaliar as concentrações de arsênio e selênio em alimentos de consumo
diário visando contribuir para tabela de composição de alimentos e
segurança alimentar.
Mostrar a eficiência e aplicabilidade da otimização multivariada na
otimização das condições de pré-redução e geração dos hidretos de
arsênio e selênio.
50
CAPITULO I
___________________________
Amostragem em suspensão
e HG AFS para
determinação de arsênio
total em amostras de arroz.
51
INTRODUÇÃO
O arroz (Oryza sativa L.) é uma planta da família das gramíneas que
alimenta mais da metade da polução mundial. É a terceira maior cultura
cerealífera do mundo, apenas ultrapassada pelo milho e trigo. É um cereal rico
em hidratos de carbono. Para ser cultivado o arroz necessita de água em
abundância, para manter a temperatura ambiente dentro de intervalos
adequados [137].
O arroz é um importante componente da dieta básica brasileira, sendo o
Brasil o mais importante produtor não asiático, com consumo da população de
32 kg de arroz por ano. Ele pode acumular quantidades consideráveis de
elementos essenciais, mas também de elementos tóxicos, como arsênio (As)
[138]. É mais eficiente na acumulação de metais do que outros cereais [139]
devido às condições anaeróbias nos solos das plantações de arroz e da
captação inadvertida e eficiente de arsênio através da via do ácido silícico do
arroz. Por esta razão, o arroz é uma fonte importante de substâncias
inorgânicas.
O uso de água contaminada com arsênio leva ao acúmulo desse metal
no solo e nos grãos de arroz. Em solos aeróbicos, a mobilidade do o As (V) é
facilitada aumentando a absorção dessa espécie pelos grãos de arroz. O
arroz contem tanto as formas inorgânicas de arsênio (III e o V) como as
orgânicas, principalmente o ácido dimetilarsínico (DMA) [140, 141].
A depender da região de produção o arroz pode ter predominância maior
de uma espécie ou outra de arsênio. Por exemplo, no arroz produzido na
região asiática a predominância é de espécies inorgânicas, enquanto que no
arroz produzido na Europa e nos EUA, as espécies orgânicas são as que
predominam [142].
As formas de arsênio presentes em alimentos de origem terrestre,
geralmente de origem inorgânica, não estão bem caracterizadas devido a sua
ocorrência em concentrações muito baixas, da ordem de µg Kg-1. Na Índia,
desde 1983, vêm sendo relatados casos de contaminação da água por arsênio.
Em Bangladesh, estima-se que 300 000 pessoas de um total de 36 milhões já
morreram de câncer devido à contaminação das águas por arsênio, cuja
52
concentração é superior a 2000 µg L-1. As águas contaminadas são usadas
para consumo humano e para irrigar plantações; particularmente os arrozais. A
concentração de arsênio encontrada em amostras de arroz foi de 4 a 8 mg Kg-1
e, nas áreas mais contaminadas, a concentração chegou a 83 mg Kg-1[143] .
Nos Estados Unidos também têm ocorrido problemas de contaminação
da água e de alimentos por arsênio. Como o caso que aconteceu em algumas
regiões de Wisconsin, onde foi constatada a contaminação de plantações de
arroz, sendo que as concentrações encontradas nestas plantações variaram
em torno de 2 a 5 mg Kg-1 [144].
Dados os argumentos aqui apresentados, este trabalho pretendeu
investigar a concentração total de arsênio em amostras de arroz (branco,
integral e parboilizado) de diversas marcas comercializadas na cidade de
Salvador, empregando a amostragem em suspensão como alternativa para
simplificar o preparo de amostra e quantificação empregando o HG AFS.
53
EXPERIMENTAL
___________________________________________
1. Instrumentação
A intensidade de fluorescência do arsênio foi medida por um
espectrômetro fluorescência Atômica (Modelo 3300 Lumina Aurora Biomed Inc
- Canadá) com um forno de tubo de quartzo, como atomizador, e ignição
automática. Argônio foi utilizado como gás de transporte. Lâmpadas de cátodo
oco (HCL), de elevada intensidade, foram usadas como uma fonte de luz. As
condições experimentais encontram-se resumidos na Tabela 6.
As amostras foram trituradas em um moinho de facas (A-11 da IKA) e
tamisadas em malha de 300 mesch.
As suspensões foram sonicadas em um banho ultrassônico modelo USC
-1850 (UNIQUE-Indaiatuba, SP - Brasil) com controlador de temperatura em
frequência de 25 kHz e potência de 154 W.
A digestão completa das amostras de arroz foi realizada utilizando-se
um bloco digestor de 40 canais (Tecnal-Brasil), com termostato para controle
da temperatura.
54
Tabela 6: Parâmetros operacionais do HG AFS empregados na determinação
do arsênio.
Parâmetros
Corrente da Lâmpada (mA) 80
Comprimento de onda (nm) 193,7
Voltagem (V) 400
Gás argônio
Pressão (psi) 30
Vazão do gás auxiliar (mL min-1) 800
Vazão do gás de arraste (mL min-1) 400
Rotação da bomba (rpm) 50
Fluxo da solução redutora (NaBH4) (mL min-1) 4
Altura do queimador (mm) 8
Tempo de integração do sinal (s) 10
2. Reagentes e soluções
Todas as soluções foram preparadas usando água ultra pura, com
resistência de 18,2 mohms cm-1. A água foi obtida a partir de um sistema de
purificação de água Milli-Q da Millipore (Bedford, MA, EUA). Ácido nítrico e
clorídrico de grau analítico da Merck (Darmstadt, Alemanha). As soluções
padrão de arsênio III (1000 mg mL-1) foram obtidas por dissolução de
quantidades apropriadas de Na3AsO3 (Sigma - St. Loius, MO, EUA) em ácido
nítrico a 0,05 % (m v-1). Soluções de trabalho (0,5 a 10,0 µg L-1 de As (III))
foram preparadas diariamente nas mesmas condições das amostras. Uma
solução de ácido clorídrico (6,0 mol L-1) foi preparada a partir de HCl
concentrado (37%, v/v, Merck).
O agente redutor utilizado foi uma solução de borohidreto de sódio 2 %
(m v-1), que foi estabilizado com 0,5 % (m v-1) de hidróxido de sódio, que era
preparada diariamente utilizando reagentes de grau analítico da Merck.
O pré-redutor utilizado foi o iodeto de potássio, uma solução a 10 % (m
v-1) em ácido ascórbico a 2% (m v-1) foi preparada por diluição do reagente da
55
Merck com água ultra pura. O material de referência certificado usado na
avaliação de precisão foi NIES, farinha de arroz 10b SRM, que foi fornecido
pelo Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia, Gaitersburgh, MD, EUA.
Cada recipiente de plástico foi lavado com água da torneira e detergente
extran e embebido numa solução de ácido nítrico a 10 % (v / v) durante 24
horas, e lavada três vezes com água deionizada antes de ser usado.
3. Amostras
As amostras foram adquiridas em supermercados da cidade de salvador
no mês de janeiro de 2011. Três tipos foram analisados: arroz branco,
parboilizado e integral de diversas marcas. Também foram coletadas amostras
de um arrozal na cidade de Propriá-Sergipe, duas de arroz branco (com casca
e sem casca) e uma de arroz integral. As amostras foram trituras utilizando-se
um liquidificador, tamisadas em malha de 300 mech e armazenadas em frascos
de PVC previamente descontaminados e guardadas em dessecador.
4. Preparação das Suspensões e determinação de As por
HG AFS
As suspensões das amostras de arroz foram preparadas pela
combinação de 200 mg de amostra, 5,0 mL de HNO3 2 mol L-1 em balões de
25,0 mL, imergindo em um banho de ultrassom por 30 minutos antes de se
diluir para 25,0 mL com água Milli-Q. As soluções do branco analítico foram
preparadas exatamente da mesma maneira.
Uma alíquota de 5,0 ml da suspensão foi transferida para um balão
volumétrico de 10 ml no qual foi adicionado 3 ml de ácido clorídrico 6 mol L-1 e
1,5 mL da solução de iodeto de potássio 10% (m v-1) em ácido ascórbico a 2%.
A solução ficou em repouso durante 30 minutos e em seguida avolumada com
água ultra pura. Esta suspensão levada para análise no HG AFS utilizando a
solução de borohidreto de sódio NaBH4 2% (m v-1) como redutor.
As curvas de calibração foram preparadas diariamente, com padrões
aquosos (3,0 mL de HCl 6,0 mol L-1 e 1,5 mL da solução de pré-redução).
56
5. Digestão das amostras utilizando bloco digestor com “dedo
frio”
Cerca de 200 mg das amostras de arroz foram transferidas para tubos
digestores de vidro, seguido da adição de 2,0 mL de HNO3 concentrado e 1 mL
de peróxido de hidrogênio 30% (v/v). Os tubos foram tampados, usando o dedo
frio contendo água em temperatura ambiente. Os tubos foram aquecidos até o
ponto de ebulição do HNO3 (120 ° C) por 3 h. As soluções finais foram
transferidas para balões volumétricos de 10,0 mL e os volumes completados
com água ultra pura. O procedimento de análise para amostras digeridas foi o
mesmo das suspensões, com a única diferença que foi tomada uma alíquota
de 3 ml do digerido.
57
RESULTADOS E DISCUSSÃO
1. Otimização das condições experimentais
A otimização das condições experimentais se deu de forma univariada.
Primeiro, foi estudado o efeito do tempo de sonicação, que foi variado entre 0 a
40 min. Houve a influência deste parâmetro sobre o sinal analítico obtido.
Pode-se observar na Figura 4 que no tempo de 30 min obteve quase 100 % de
extração do arsênio. Foi realizada comparação do extraído com os valores
obtidos com as amostras digeridas.
Figura 4: Porcentagem de extração do arsênio no arroz branco em
função do tempo de sonicação.
2. Escolha do extrator/solvente para determinação de
arsênio utilizando amostragem em suspensão.
O estudo foi realizado com três tipos de extratores: água, ácido nítrico e
ácido clorídrico, os ácidos foram estudados em três diferentes concentrações e
água à temperatura ambiente e aquecida a 70 º C. A resposta foi avaliada pela
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 10 20 30 40 50
% E
XTR
AÇ
ÃO
TEMPO (min)
58
intensidade gerada pelo equipamento. O extrator que se mostrou mais eficiente
foi HNO3 na concentração de 2 mol L-1. Os resultados estão apresentados na
Tabela 7. A porcentagem de extração foi calculada em comparação com os
resultados das amostras digeridas.
Tabela 7: Seleção do extrator/solvente para preparação das suspensões de
amostras de arroz.
Extrator Concentração (mol L-1)
ou temperatura
% Extração
Ácido clorídrico 1 38
2 61
3 62
Ácido nítrico 1 48
2 98
3 96
Água 25º C 51
70º C 49
3. Investigação da necessidade de introdução das
partículas da suspensão no HG AFS
Este estudo foi realizado para investigar a necessidade ou não de
introdução das partículas no HG AFS. Primeiro, foram analisadas as amostras
em suspensão. Em seguida, a mesma amostra após ser submetida ao
procedimento de sonicação foi centrifugada e apenas o sobrenadante foi
analisado. Os valores obtidos para a amostragem de suspensão foram mais
elevados do que o valor obtido quando apenas a fase líquida, depois da
centrifugação, foi introduzida no HG AFS, demonstrando assim que o processo
de extração, nestas condições, não foi completo e por isso foi necessário
utilizar a suspensão para a recuperação completa. Os resultados são
mostrados na Tabela 8.
59
Tabela 8: Comparação entre amostragem em suspensão e extração das
amostras de arroz para quantificação de arsênio (n=3)
Amostras Amostragem
suspensão
(µg g-1)
RSD % Extração
(µg g-1)
RSD %
P1 0,20 ± 0,03 5,8 0,16 ± 0,03 8,6
B1 0,22 ± 0,04 4,8 0,20 ± 0,03 6,5
I3 0,34 ± 0,06 5,8 0,32 ± 0,05 5,8
I4 0,22 ± 0,02 4,1 0,17 ± 0,01 2,8
I5 0,20 ± 0,01 4,1 0,16 ± 0,01 1,1
P3 0,20 ± 0,01 2,4 0,21 ± 0,02 4,4
B6 0,27 ± 0,03 4,4 0,23 ± 0,01 4,0
4. Comparação entre o método proposto (amostragem em
suspensão) e digestão ácida utilizando o sistema bloco
digestor/dedo frio.
Três amostras aleatórias foram submetidas aos dois procedimentos, a
amostragem em suspensão e a digestão ácida utilizando o bloco digestor e o
dedo frio. Todo o procedimento foi realizado no mesmo dia nas mesmas
condições descritas na parte experimental.
As amostras selecionadas foram uma de cada tipo de arroz (arroz
branco, integral e parboilizado) e o material de referencia certificado de farinha
de arroz (NIES 10b). Na Tabela 9 estão apresentados os resultados. A
comparação estatística usando teste t pareado [145] (95% de confiança) não
apresentou diferenças significativas entre os resultados obtidos pelos dois
métodos, mostrando a concordância dos métodos de preparo de amostra
utilizados neste trabalho.
60
Tabela 9: Comparação entre a amostragem em suspensão e digestão ácida
para determinação de arsênio nas amostras de arroz (n=3).
Amostras Suspenção
(µg g-1)
RSD % Bloco digestor
(µg g-1)
RSD%
Arroz branco 0,26 ± 0,03 5,0 0,26 ± 0,02 3,8
Arroz
Parbolizado
0,28 ± 0,03 4,5 0,23 ± 0,03 5,0
Arroz Integral 0,23 ± 0,01 2,2 0,24 ± 0,01 0,3
CRM 0,11 ± 0,01 2,7 0,12 ± 0,01 4,9
5. Estudos de validação
Para a determinação de arsênio por amostragem em suspensão usando
cerca de 0,200 g de amostras de arroz, os limites de detecção e de
quantificação (calculado de acordo com as recomendações da IUPAC) [165]
foram de 0,0005 e 0,0017 µg g - 1, respectivamente.
A precisão foi avaliada através da determinação do desvio padrão
relativo (RSD %), foram de 0,3 e 5,9% para amostras de arroz que tinham
conteúdos de arsênico de 0,12 e 0,47 µg g -1, respectivamente.
A equação de calibração foi y = 109,71 [As µg L- 1] – 6,687 com um
coeficiente de correlação (R) de 0,9995.
A técnica de adição de analito foi utilizada para avaliar a exatidão do
método e os efeitos da matriz. Esta técnica foi realizada por adição de arsênio
em três amostras: arroz branco, parboilizado e integral, foram adicionados à
concentração de 0,2 μg g-1 de arsênio. Os valores de recuperação variaram de
95 a 105%, mostrando assim que a calibração externa poderia ser utilizada.
Também se confirmou a exatidão da análise empregando-se material de
referência certificada de farinha de arroz (CRM NIES 10b). A concentração de
arsênio no certificado foi de 0,11 µg g-1, e a concentração determinada pelo
método proposto de: 0,12 ± 0,009 µg g -1, comprovando assim a exatidão do
método proposto.
61
6. Aplicação
O método proposto foi aplicado para determinar o teor de arsênio em
vinte amostras de três tipos de arroz (branco, parboilizado e integral) de
diversas marcas, adquiridas na cidade de Salvador-Ba. O teor de arsênio
encontrado nas amostras variaram de 0,12 e 0,47 µg g-1. Foram realizado teste
de adição/recuperação para cinco amostras e os valores de recuperação
ficaram na faixa de 95 a 105%. Estes resultados, expressos com intervalos de
95% de confiança, são apresentados na Tabela 11.
Tabela 10: Determinação de As total em amostras de arroz utilizando a amostragem em suspensão. (n = 3).
Amostras Concentração (µg g-1) RSD %
B1 0,19 ± 0,02 4,5 B2 0,21 ± 0,02 3,4 B3 0,28 ± 0,03 3,8 B4 0,47 ± 0,04 0,4 B5 0,31 ± 0,04 4,7 B6 0,29 ± 0,02 3,3 B7 0,13 ± 0,02 5,9 B8 0,26 ± 0,02 3,8 P1 0,12 ± 0,01 3,3 P2 0,25 ± 0,01 2 P3 0,23 ± 0,005 0,8 P4 0,20 ± 0,003 0,7 P5 0,28 ± 0,004 0,5 P6 0,24 ± 0,002 0,3 P7 0,23 ± 0,01 2,3 I1 0,13 ± 0,01 3,7 I2 0,23 ± 0,03 5 I3 0,20 ± 0,02 3,5 I4 0,22 ± 0,02 4,1 I5 0,20 ± 0,01 4,1
BP* 0,16 ± 0,02 3,9 BPC* 0,19 ± 0,03 4,2
IP* 0,27 ± 0,04 4,9
*B: arroz branco; P: arroz parboilizado; I: arroz integral; BP: arroz branco de Propriá; BPC: arroz branco
de Propriá com casca; IP: arroz integral de Propriá.
62
CONSIDERAÇOES FINAIS
______________________________________________
Neste trabalho a amostragem por suspensão demonstrou ser um
procedimento de extração útil, especialmente dada à volatilidade das espécies
de arsênio.
Os três tipos de arroz (branco, parboilizado e marrom) analisados não
apresentaram grande diferença nas concentrações de arsênico.
O método proposto é preciso, exato e sensível para a determinação de
arsênio em arroz. É oportuno, considerando a alta toxicidade deste metal e o
grande consumo deste cereal na dieta humana.
63
CAPITULO II
Desenvolvimento de método
analítico para determinação
de selênio em amostras de
ovos (clara e gema) por HG
AFS
64
INTRODUÇÃO
A dieta é a principal fonte de selênio para o organismo, logo pode ser
encontrado em alimentos como grãos (trigo integral e arroz integral), vísceras,
peixes, frango, ovos e como principal fonte a castanha do Pará [146, 150]. Em
muitos países, os níveis de selênio nos alimentos não são adequados e a
deficiência deste na nutrição humana é um problema global. Estudos
realizados ao longo dos últimos anos indicaram que o enriquecimento de
alimentos de origem animal (principalmente leite, carne e ovos) com selênio,
via suplementação de rações para animais, pode ser uma forma eficaz de
aumentar a ingestão de selênio em países onde o consumo deste elemento
está abaixo da dose diária recomendada (RDA) [147, 148].
O ovo é conhecido como um dos alimentos mais completos, pois possui
uma rica fonte de nutrientes, ou seja, um excelente balanço de gorduras,
carboidratos, minerais e vitaminas, e principalmente proteínas. Desse modo,
ele é a segunda melhor fonte de proteína disponível para alimentação humana,
perdendo somente para o leite materno. No entanto, é um meio ideal para o
desenvolvimento de microrganismos patogênicos e por se tratar de um produto
de origem animal, assim como a carne e seus derivados, é um alimento
altamente perecível e que pode perder sua qualidade rapidamente [149].
Além de ser um alimento completo e equilibrado em nutrientes é uma
fonte de proteína de baixo valor econômico, logo é um produto de fácil acesso
para população podendo contribuir para melhorar a dieta de famílias de baixa
renda. Além de ser um ingrediente de alta importância na culinária brasileira
[150].
No Brasil, dados do IBGE apontam para um consumo per capita anual
de 4,3 kg de ovos demonstrando que este alimento é amplamente consumido
pela população [151].
Na otimização de um procedimento analítico há necessidade de ajustar
as variáveis para estabelecer as melhores condições para a realização das
análises. Este processo pode ser demorado e trabalhoso quando uma
otimização univariada convencional é executada, outra desvantagem também é
65
não considerar as interações entre as variáveis, o que torna improvável a
condição ideal [152]. O desenho experimental é uma importante ferramenta
estatística e devido a sua simplicidade esta sendo cada vez mais utilizada
pelos químicos analíticos para as diferentes amostras. Entre as suas
vantagens, está a redução do número de experimentos necessários, o que
resulta em menor consumo de reagentes e significativamente menos trabalho
de laboratório [153,154].
Neste trabalho, o planejamento fatorial completo e a matriz Doehlert
foram aplicadas para otimizar o processo de pré-redução e geração de hidretos
para determinar selênio total em amostras de ovos por HG AFS.
66
EXPERIMENTAL
_______________________________________________________
1. Instrumental
Balança analítica
Liofilizador Modulyo D, Thermo Scientific, USA.
Milli-Q System, Millipore, Bedford, MD, USA
Espectrômetro de Fluorescência Atômica acoplado ao gerador de
hidretos, Aurora Instruments, Mod. Lumina 3300, USA;
Bloco digestor, Tecnal, Brasil, mod. TE-007 MP;
Capela de fluxo laminar
Espectrômetro de massas com plasma indutivamente acoplado
(ICP-MS)
Os parâmetros operacionais do espectrômetro de fluorescência atômica
para a determinação de selênio total são apresentados na Tabela 11 e do ICP
MS na Tabela 12.
Tabela 11: Parâmetros operacionais do HG AFS para determinação de Selênio
Parâmetros
Corrente da Lâmpada (mA) 100
Voltagem (V) 420
Comprimento de onda da lâmpada (nm) 196
Gás argônio
Pressão (psi) 30
Vazão do gás auxiliar (mL min-1) 800
Vazão do gás de arraste (mL min-1) 400
Rotação da bomba (rpm) 50
Fluxo da solução redutora (NaBH4) (mL min-1) 4
Altura do queimador (mm) 8
Tempo de integração do sinal (s) 10
67
Tabela 12: Parâmetros operacionais do ICP-MS para determinação de Selênio
Parâmetros Valores
Potencia incidente (W) 1310
Fluxo argônio nebulizador (L min-1) 0,87
Fluxo argônio plasma (L min-1) 13,0
Fluxo argônio auxiliar (L min-1) 0,7
Modo de análise Peak jump
Sweeps 100
Dwell Time (ms) 10
Fluxo gás CCT (mL min-1) 6,5
Isótopos 78 e 80
LD 0,036
LQ 0,119
2. Reagentes e soluções
Brometo de potássio
Ácido nítrico 65 % (m/m)
Peróxido de hidrogênio 30 % (v/v)
Ácido clorídrico 12 mol L-1
Borohidreto de sódio
Hidróxido de sódio
Água ultra pura
Solução padrão de Se (IV) 1000 mg L-1
Todos os reagentes utilizados nesse trabalho foram de grau analítico, da
marca Merck, e todas as soluções foram preparadas em água ultra pura, obtido
através de um sistema ultra purificador (Milli-Q System, Millipore, Bedford, MD,
USA).
Todas as vidrarias utilizadas no preparo das amostras foram inicialmente
lavadas com detergente Extran, e, em seguida, mantidos em banho de HNO3
10% (v v-1) por um período mínimo de 24 horas.
68
A solução padrão estoque de selênio (IV) 1000 mg L-1, utilizada no
preparo da curva de calibração e dos testes de adição e recuperação, foi
preparada utilizando NaSeO3 e água ultrapura. Soluções de trabalho (0,5 a
10,0 µg L-1 de Se (IV) foram preparadas diariamente nas mesmas condições
das amostras. A solução de HCl 6,0 mol L-1 foi preparada a partir de solução de
HCl 12,0 mol L-1 e água ultra pura. As soluções de KBr 10% (m v-1) e de NaBH4
2% (m v-1) em NaOH 0,5% (m v-1) também foram preparadas após da diluição
em água ultra pura.
3. Amostras
As amostras foram adquiridas em feiras e supermercados da cidade de
Salvador em outubro de 2011. Foram escolhidos quatro tipos de ovos, ovos de
galinha (vermelho e branco), ovos de codorna e ovos de pata.
As amostras foram separadas em três categorias: gema, clara e mistura
(gema e clara). Foram acondicionadas em recipientes plásticos e levadas ao
freezer por dois dias, após esse período foram liofilizadas por 3 dias. A
moagem foi realizada utilizando-se grau e pistilo, não sendo necessária a
utilização de moinho. As amostras foram peneirados em malha de 300 mesh e
acondicionados em dessecador até o momento da análise.
3.1 Digestão das amostras
Após a etapa de pré-tratamento, pesou-se em triplicata cerca de 0,200 g
das amostras em tubos de digestão, sendo em seguida adicionado 2 mL de
ácido nítrico 14 mol L-1. A cada tubo de digestão, foi acoplado um condensador,
denominado “dedo-frio”, acoplado na parte superior do tubo de digestão. Nesse
condensador é adicionado água ultra-pura, e durante o processo de digestão
da amostra, esse sistema de refluxo impede a perda de espécies voláteis de
selênio. A digestão foi realizada em um período de aproximadamente 3 horas,
numa faixa de temperatura compreendida entre 120-140° C, aumentada de
forma gradual. Após o início da ebulição, foram adicionados 0,5 mL de H2O2,
de maneira vagarosa, mais 0,5 mL de H2O2, trinta minutos após, visando,
69
dessa maneira, potencializar a degradação da matéria-orgânica. Ao final da
digestão 1 mL de HCl 6 mol L-1 foi adicionado, para obtenção de melhores
resultados na geração de hidretos.
Após a etapa de digestão, os digeridos foram transferidos para balões
volumétricos de 10 mL, sendo posteriormente aferidos com água ultra-pura e
acondicionados em geladeira até o momento da análise.
4. Otimização Multivariada da pré-redução e geração
do hidreto de selênio
Planejamento fatorial e desenho Doehlert foram aplicados para otimizar
a pré-redução e a geração de hidreto para determinação de selênio em ovos. O
planejamento fatorial completo em dois níveis foi utilizado para avaliar os
efeitos de quatro variáveis. O software Statistic 7.0 foi utilizado para processar
os resultados. As variáveis estudadas foram: tempo de pré-redução (10 e 30
min.), volume do pré-redutor KBr 10 % (m v-1) (1,0 e 2,0 mL), concentração do
HCl (3,0 e 6,0 mol L-1) e concentração do NaBH4 (1 e 4 % m/v). O número total
de experimentos exigidos por este método foi dado pela equação: nK=24=16.
Para avaliar o erro experimental, as medições do ponto central foram repetidas
três vezes, aumentando o número total de experimentos para dezenove.
Os resultados obtidos através do planejamento fatorial foram avaliados,
e as variáveis estatisticamente significativas bem como as interações com
maior influência no sistema foram determinadas e otimizadas pela metodologia
de superfície de resposta, aplicando-se a matriz de Doehlert. As variáveis
estudadas foram: concentração de ácido clorídrico em cinco níveis e
concentração de borohidreto de sódio em três níveis.
5. Etapa de pré-redução
Após a digestão das amostras, estas foram submetidas a uma etapa de
pré-redução, tendo em vista que após o processo de digestão toda espécie de
Se contida na amostra é oxidada a Se6+, espécie esta que não gera hidreto,
havendo a necessidade, portanto, da redução do Se6+ a Se4+.
70
Para a pré-redução do Se, foi adicionado 1,0 mL do digerido em um
balão volumétrico de 10 mL, adicionando em seguida 3,0 mL de HCl 6,0 mol L-1
e 1,0 mL de KBr a 10% (m v-1). Após a adição dos reagentes, a solução
permaneceu em repouso por um período de 10 minutos, tempo necessário
para a conversão do Se6+ em Se4+, aferindo o balão volumétrico com água
ultra-pura, e submetendo em seguida a amostra à análise.
71
RESULTADOS E DISCUSSÃO _____________________________________________________
1. Otimização multivariada do sistema proposto para a geração
de hidreto
A otimização foi conduzida utilizando-se 10,0 mL de uma solução 5,0 µg L-1
de Se (IV) e os experimentos foram realizados em ordem aleatória.
1.1. Planejamento Fatorial
Um planejamento fatorial completo (24) foi empregado para avaliar o nível
de significância dos fatores. Os domínios experimentais para cada fator foram
definidos com base em dados da literatura. Valores codificados e sinais
analíticos (intensidade) estão apresentados na Tabela 13.
Através do gráfico de pareto observou-se que a interação
entre concentração de ácido clorídrico e concentração de borohidreto de sódio
foram significativa (p <0,05) para o processo de pré-redução e geração de
hidreto do selênio (Figura 5). Esses fatores foram investigados usando a matriz
Doehlert. Os níveis em que foi estudado cada variável foram baseados nos
experimentos realizados para o planejamento fatorial.
72
Tabela 13: Planejamento fatorial dois níveis completo - otimização do processo de geração do hidreto de selênio
Experimentos TR* (min) [HCl]*
(mol L-1)
[NaBH4]*
(%)
V. KBr*
(mL)
Int. sinal*
1 - - - - 50,6
2 + - - - 42,5
3 - + - - 35,6
4 + + - - 38, 2
5 - - + - 15,1
6 + - + - 12,6
7 - + + - 55,0
8 + + + - 64,6
9 - - - + 59,7
10 + - - + 36,2
11 _ + - + 25,1
12 + + - + 33,4
13 - - + + 27,1
14 + - + + 34,4
15 - + + + 40,6
16 + + + + 57,1
17 0 0 0 0 67,9
18 0 0 0 0 61,1
19 0 0 0 0 65,6
*TR: tempo de pré-redução; Vol KI: volume de pré-redutos; [HCl]: concentração de HCl e [NaBH4]: concentração de borohidreto de sódio.
73
Figura 5: Gráfico de pareto da otimização da geração de hidreto de selênio.
1.2 Planejamento Doehlert
Com base nos resultados do planejamento fatorial a matriz Doehlert foi
realizada a fim de ajustar um modelo quadrático para os dados e identificar as
condições ótimas para o procedimento [155]. A matriz é apresentada na Tabela
14, que inclui as três repetições do ponto central para avaliar o erro
experimental, resultando em nove experimentos no total. A concentração de
ácido clorídrico foi estudada em cinco níveis, enquanto que a concentração de
borohidreto de sódio foi estudada em três níveis.
-0,009
0,11
0,16
- 0,24
0,40
0,84
1,03
1,16
- 1,12
3,01
p = 0,05
Estimativa dos Efeitos
(4) KBr
1 e 4
(1) TR
(3) [NaBH4]
3 e 4
1 e 3
1 e 2
(2) [HCl]
2 e 4
2 e 3
74
Tabela 14: Matrix Doehlert para otimização da geração de hidreto de selênio.
Exp. [HCl]* (mol L-1) [NaBH4]* (%) Int. sinal*
1 - 0.5 (4.5)* 0.866 (4.0)* 35,4
2 0.5 (5.5) 0.866 (4.0) 12,8
3 1.0 (6.0) 0 (3.0) 122,6
4 0.5 (5.5) - 0.866 (2.0) 97,6
5 - 0.5 (4.5) - 0.866 (2.0) 90,8
6 -1.0 (4.0) 0 (3.0) 83,8
7 0 (5.0) 0 (3.0) 113,8
8 0 (5.0) 0 (3.0) 132,9
9 0 (5.0) 0 (3.0) 128,1
* Valores reais
Os resultados deste planejamento também foram avaliados e um modelo
quadrático foi obtido (Equação 4) usando os valores codificados para as
variáveis: concentração de ácido clorídrico ([HCl]) e a concentração de
borohidreto de sódio ([NaBH4])
Equação 4:
R= 1128.40 + 271.73[HCl] – 21,73[HCl]2 + 400,55[NaBH4] – 60.35[NaBH4]2 –
14.71[HCl][NaBH4]
Os valores críticos encontrados através da equação 4 foram:
concentração de ácido clorídrico 5,3 mol L-1 e concentração de borohidreto de
sódio 2,6 % (m v-1). Esses valores foram calculados conforme descritos na
literatura [155]. A superfície de resposta está apresentada na Figura 6, onde
pode observar uma região de máximo.
A avaliação do modelo quadrático ajustado aos dados experimentais foi
feito por meio do teste de falta de ajuste. Se o valor de p for maior que 0,05
significa que o modelo matemático de segunda ordem descreve perfeitamente
o domínio experimental estudado. Na Tabela 15 é apresentado a ANOVA para
os dados obtidos pela aplicação da matriz de Doehlert na otimização da
75
concentração do ácido clorídrico e do borohidreto de sódio. O valor de p para a
falta de ajuste é igual a 0,347819, o que significa que os dados obtidos estão
sendo satisfatoriamente descritos.
Através da análise do gráfico dos valores preditos versus os valores
observados pode-se verificar que houve concordância dos valores observados
em relação aos valores que o modelo quadrático prevê (Figura 7).
Tabela 15: Análise da variância (ANOVA) para os dados referentes á tabela 14.
Fator SS df MS F P
(1) HCl (L) 318,27 1 318,270 1,37520 0,325564
HCl (Q) 566,81 1 566,805 2,44908 0,215558 (2)NaBH4 (L) 4914,01 1 4914,010 21,23274 0,019223 NaBH4 (Q) 7769,86 1 7769,861 33,57246 0,010228 1L x 2L 216,09 1 216,090 0,93369 0,405182 Falta de ajuste 694,31 3 231,436 0,347819
SQ Total 13952,30 8
Figura 6: Superfície de resposta da otimização da geração de hidreto do
selênio.
76
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Valores Observados
0
20
40
60
80
100
120
140
Valo
res p
reditos
Figura 7: Gráfico dos valores preditos X valores observados para geração do
hidreto de selênio
2. Validação do Método
Os pontos da curva de calibração foram preparados a partir de uma
solução padrão de Se4+ 1000 mg L-1. A curva de calibração foi construída
utilizando-se 7 pontos, cujas concentrações variaram de 0,5 μg L-1 a 10 μg L-1.
A curva de calibração analítica apresentou boa linearidade com valor de R2 =
0,9994 e inclinação da curva representada pela equação y = 206,09x + 12,494.
Os limites de detecção (3 sd/S) e de quantificação (10 sd/S) calculados
como recomendado pela IUPAC [ 156 ] e foram: 0,03 e 0,1 ng g-1,
respectivamente, para Se total, mostrando-se adequado para a determinação
de selênio em amostras de ovos.
A precisão (RSD) do método proposto foi avaliada em termos de
reprodutibilidade dos resultados analíticos. O RSD variou de 0,9 a 4,7%
demonstrando boa repetibilidade.
Um material de referência padrão do tecido de ostra (NIST SRM 1566b)
foi analisado para avaliar a exatidão do método. As concentrações médias dos
analitos são apresentadas na Tabela 16. O teste estatístico não apresentou
77
diferenças significativas ao nível de confiança de 95% entre os valores médios
de selênio. A exatidão do método proposto também foi verificada por meio de
testes de adição e de recuperação em duas concentrações: 10 e 40 µg L-1e os
resultados variaram entre 96 a 107%.
Tabela 16: Resultados para determinação de Se no material de referência certificado de tecido de ostra empregando o método proposto (mg kg-1, n=3).
Amostra Valor Certificado Valor Encontrado RSD (%)
CRM – Tecido de Ostra
NIST® 1566b
2,06 ± 0,15
2,10 ± 0,20
4,0
As amostras também foram analisadas no Espectrômetro de Massa com
Plasma Indutivamente Acoplado (ICP-MS), mostrando a concordância de
resultados (Tabela 18), confirmado pelo teste t a 95% de confiança, atestando
a confiabilidade do método proposto.
3. Aplicação do método desenvolvido
O método proposto foi utilizado para determinar o Se em amostras de
ovos e os resultados para as quatro amostras, separados em três categorias
(clara, gema e inteiro), são apresentadas na Tabela 17. As concentrações
mínimas e máximas foram de 0,35 ± 0,01 e 0,88 ± 0,03 mg g-1, para clara do
ovo de codorna e gema de ovo vermelho, respectivamente. Na maioria das
amostras se observou que as concentrações mais elevadas de selênio são na
gema.
78
Tabela 17: Concentração de Se nas amostras de ovos por HG AFS e ICP-MS.
Amostras HG AFS
([µg g-1] ± IC* )
RSD
(%)
ICP-MS
([µg g-1] ± IC )
RSD
(%)
Ovo branco
Clara 0,42 ± 0,04 4,3 0,43 ± 0,07 3,8
Gema 0,72 ± 0,03 1,5 0,70 ± 0,09 4,2
Inteiro 0,48 ± 0,01 1,1 0,49 ± 0,08 3,2
Ovo
vermelho
Clara 0,47 ± 0,04 3,9 0,45 ± 0,09 4,3
Gema 0,88 ± 0,03 1,1 0,87 ± 0,07 2,1
Inteiro 0,73 ± 0,08 4,7 0,74 ± 0,02 1,3
Ovo de
Pata
Clara 0,43 ± 0,07 3,9 0,40 ± 0,07 1,0
Gema 0,64 ± 0,01 0,9 0,66 ± 0,09 4,5
Inteiro 0,57 ± 0,05 3,7 0,55 ± 0,08 3,7
Ovo de
codorna
Clara 0,35 ± 0,01 1,6 0,34 ± 0,06 2,4
Gema 0,84 ± 0,01 0,3 0,82 ± 0,09 5,0
Inteiro 0,67 ± 0,04 2,2 0,65 ± 0,03 3,8
* Intervalo de confiança (n=3)
79
CONSIDERAÇÕES FINAIS _______________________________________________________________________
O método de digestão em bloco, com a utilização do sistema de refluxo
“dedo-frio” apresentou-se eficiente, prevenindo contaminação externa e
impedindo a perda de espécies voláteis de selênio durante o processo de
digestão, o que pôde ser evidenciado com a validação do método.
A otimização multivariada demonstrou ser um instrumento adequado
para a otimização do processo de pré-redução e geração de hidretos de
selênio para determinação em ovos.
A alta sensibilidade, faixa linear, velocidade analítica, facilidade de
manuseio do equipamento e custo relativamente baixo, demonstrou a
viabilidade da determinação de selênio total em amostras de ovos pela
espectrometria de fluorescência atômica com geração de hidretos (HG-AFS).
80
CAPITULO III ____________________________________________________________________________
Determinação de arsênio
total em amostras de
atum e sardinha
enlatados por HG AFS
81
INTRODUÇÃO _____________________________________________________________________________
Os organismos marinhos tendem a acumular mais arsênio do que
aqueles que vivem em ambientes de água doce ou terrestres, pois absorvem
arsenato da água do mar, devido sua similaridade estrutural ao fosfato
essencial [ 157 ]. No ambiente marinho, as principais formas de arsênio
inorgânico encontradas são arsênito (As3+) e arsenato (As5+). Dentre as formas
orgânicas presentes estão a arsenobetaína, arsenocolina, ácido
monometilarsônico (MMA), ácido dimetilarsênico, dimetil-arsinl-ribosídeo,
dentre outras[158].
Os organismos marinhos apresentam grandes quantidades deste
elemento na forma orgânica, sendo a arsenobetaina a mais abundante em
peixes, carangueijos, lagosta e camarões [159]. Li e colaboradores verificaram
as concentrações de As total e de outras formas químicas desse elemento em
peixes da China e observaram que a arsenobetaína representou a maior fração
do As total extraído. Estudos mostram que esta forma orgânica do arsênio é
relativamente estável, não apresentando toxicidade aos seres humanos, sendo
excretado através da urina [160].
Desconsiderando o eventual consumo de água contaminada com
arsênio, a principal forma de ingestão desse elemento pelos seres humanos é
pelo consumo de produtos de origem marinha, principalmente peixes, que
compõem cerca de 90 % de todo o arsênio consumido [161, 162]. De acordo
com WHO, 2000, a ingestão de arsênio pela população japonesa é maior do
que na Europa e nos Estudos Unidos, por exemplo, devido ao fato da dieta
oriental ser rica em alimentos de origem marinha.
Olmedo e colaboradores determinaram arsênio em diversos alimentos
de origem marinha, como: peixes frescos, enlatados e congelados, e em
mariscos. As amostras foram mineralizadas em forno de micro-ondas e
quantificadas por GF AAS, sendo que a maior concentração de arsênio foi
encontrado em camarões frescos e congelado. Eles concluíram que o consumo
de peixe e crustáceos é seguro, mas que se esse consumo for excessivo, pode
82
acarretar contaminação. Foram encontradas concentrações de 0,561 µg g-1 de
arsênio na sardinha [163].
Alguns organoarsênicos (como a arsenobetaina) mostram uma
extraordinária estabilidade química, pois nesses compostos o arsênio está
ligado ao carbono, o que impede a formação de hidretos voláteis. Para
converter todo o arsênio dessas espécies em arsênio livre para a formação de
hidretos voláteis é necessário se fazer a quebra da ligação C-As, e para isso a
eficiência do preparo de amostra é de grande importância para a determinação
precisa de arsênio nas amostras [160,162].
Em função dos argumentos apresentados, este trabalho buscou
estabelecer condições adequadas para determinação de arsênio total em
amostras de atum e sardinha enlatados por HG AFS. Os estudos envolveram
sistemas por geração de hidreto após preparo das amostras empregando
decomposição em bloco digestor e em forno de micro-ondas.
83
EXPERIMENTAL _____________________________________________________________________________
1. Instrumentação
As digestões das amostras usando sistemas condutivos abertos foram
efetuadas empregando-se bloco digestor (TECNAL, São Paulo, Brasil), modelo
TE-040/25 com controlador de temperatura analógico e capacidade para 40
tubos micro em borossilicato com dimensões de 25 x 250 mm.
Os procedimentos de digestão em fornos de micro-ondas foram
conduzidos em um forno com cavidade modelo Ethos EZ (Milestone, Sorisole,
Itália), que possui rotor para 10 frascos de 100 mL confeccionados em TFM®
(PTFE modificado) e opera sob altas temperaturas e pressões. Esse sistema
permite o acoplamento de sensores de temperatura e pressão que possibilitam
o acompanhamento do sistema de digestão e promovem maior segurança
operacional.
As soluções obtidas após digestão, para todos os procedimentos de
preparo de amostra utilizados, foram transferidas para frascos de polietileno de
50,0 ou 15,0 mL.
Para a determinação do analito foi empregado Espectrômetro de
fluorescência atômica com geração de hidretos (HG AFS) Aurora modelo AI
3300 (Vancouver, British Columbia, Canadá) com Software (AI 3300 control).
Uma lâmpada de catodo oco foi usada como fonte de radiação. Os parâmetros
operacionais do espectrômetro de fluorescência atômica para a determinação
de arsênio total são apresentados na Tabela 12.
2. Reagentes e soluções
As soluções padrão de arsênio III (1000 mg mL -1) foram obtidas por
diluição de quantidades apropriadas de Na3AsO3 (Sigma - St. Loius, MO, EUA)
em ácido nítrico a 0,05 % (m v-1). Soluções de trabalho (0,5 a 10,0 µg L-1 de As
(III)) foram preparadas diariamente nas mesmas condições das amostras. Uma
84
solução de ácido clorídrico (6,0 mol L-1) foi preparada a partir de HCl
concentrado (37%, (v v-1), Merck).
O agente redutor utilizado foi uma solução de borohidreto de sódio 2 %
(m v-1), que foi estabilizado com 0,5 % (m v-1) de hidróxido de sódio, que foi
preparada diariamente utilizando-se reagentes de grau analítico da Merck.
O pré-redutor utilizado foi o iodeto de potássio, uma solução a 10 % (m
v-1) em ácido ascórbico 2% (m v-1) preparada por diluição do reagente da Merck
com água ultra-pura.
Todas as soluções foram preparadas com reagentes de grau analítico e
água ultrapura, com resistividade específica de 18,2 MΩ cm-1, de um sistema
de purificação Milli-Q® (Millipore, Bedford, MA, USA). Foram utilizados os
seguintes reagentes: ácido nítrico 65% (m m-1) (Merck, Alemanha), ácido
sulfúrico 98% (Merck, Alemanha) e peróxido de hidrogênio 30% v v-1 (Merck,
Alemanha).
A descontaminação de vidrarias, frascos plásticos e materiais em geral,
foi realizada em banho ácido contendo HNO3 10% v v-1, por no mínimo 12 h.
Posteriormente, os materiais foram lavados abundantemente com água
deionizada. Quando necessário, os frascos de TFM®, utilizados no forno de
micro-ondas com cavidade, eram submetidos à descontaminação em estufa a
180 º C por 3 h.
3. Amostras e material de referência certificado
As amostras foram adquiridas em supermercados da cidade de Salvador
em abril de 2013. Apesar de comercializadas em Salvador a origem das
amostras é variada, sendo proveniente de outros estados do país. Foram
adquiridas 21 amostras de sardinha e atum enlatados de 10 marcas diferentes
e três tipos de conservas (óleo, molho de tomate e molho de ervas).
O peixe foi separado da conserva utilizando peneiras plásticas
devidamente descontaminadas e armazenado em recipientes plásticos e
congelados por 2 dias para serem submetidos à liofilização por mais 3 dias e
tamisadas em malha de 300 mesh. As amostras foram mantidas em
dessecador até o momento da análise. As conservas foram armazenas em
85
recipientes devidamente descontaminados e mantidos no freezer até o
momento da análise.
Foi utilizado um material de referência certificado de tecido de ostra
NIST 1566 b (Gaithersburg, Maryland, USA), para avaliar a exatidão dos
procedimentos analíticos propostos.
4. Procedimentos para digestão das amostras
4.2 Digestão das amostras de sardinha e atum enlatados em bloco
digestor com dedo frio
Após a etapa de pré-tratamento, pesou-se em triplicata 0,2 g das
amostras em tubos de digestão, sendo em seguida adicionado 2 mL de ácido
nítrico 14 mol L-1. A cada tubo de digestão, foi acoplado um condensador,
denominado “dedo-frio”, acoplado na parte superior do tubo de digestão. Nesse
condensador é adicionado água, e durante o processo de digestão da amostra,
esse sistema de refluxo impede a perda de espécies voláteis de arsênio e
potencializa o processo de decomposição da matéria orgânica. A digestão foi
realizada por um período de aproximadamente 3 horas, numa faixa de
temperatura compreendida entre 120-140° C, aumentada de forma gradual.
Após o início da ebulição, foi adicionado 0,5 mL de H2O2, de maneira vagarosa,
sendo adicionado mais 0,5 mL de H2O2, 30 minutos após a primeira adição,
visando, dessa maneira, potencializar a degradação da matéria-orgânica. Ao
final da digestão 1 mL de HCl 6 mol L-1 foi adicionado, para obtenção de
melhores resultados na geração de hidretos.
A digestão das conservas procedeu da mesma forma, sendo utilizado 1
mL da amostra na digestão. Conservas mais oleosas demoravam mais a serem
digeridas, cerca de 4 horas.
Após a etapa de digestão, os digeridos foram transferidos para balões
volumétricos de 10 mL, sendo posteriormente aferidos com água ultra-pura e
acondicionados em geladeira até o momento da análise.
86
4.2. Digestão das amostras de sardinha e atum enlatados em forno de
micro ondas
Foram pesadas cerca de 200 mg de amostra diretamente nos frascos de
PTFE do forno de micro-ondas com cavidade. Antes de iniciar o programa de
aquecimento foram adicionados 4,0 mL de HNO3 concentrado, 1 mL de
peróxido de hidrogênio 30% v v-1. e 3,0 mL de água ultra-pura. Os frascos
foram selados e colocados dentro da cavidade e o programa de aquecimento
usado está descrito na Tabela 18. Os digeridos foram aferidos com água ultra-
pura até 20,0 mL.
Tabela 18. Programa de aquecimento em forno de micro-ondas com cavidade
Etapa t (min) P (W) Texterna (°C)
1 4 750 90
2 2 750 90
3 6 1000 180
4 10 1000 180
Ventilação 10 - -
5. Otimização Multivariada da pré-redução e geração do hidreto
de arsênio
Planejamento fatorial e desenho Doehlert foram aplicados para otimizar
a pré-redução e a geração de hidreto para determinação de arsênio nas
amostras de atum e sardinha. O planejamento fatorial foi utilizado para avaliar
os efeitos de quatro variáveis, em dois níveis, o software Statistic 7.0 foi
utilizado para processar os resultados. As variáveis estudadas foram: tempo
de pré-redução (10 e 40 min.), volume do pré-redutor KI (1,0 e 2,0 mL),
concentração do HCl (3,0 e 6,0 mol L-1) e concentração do NaBH4 (1 e 4 % m v-
1). O número total de experimentos exigidos por este método foi dado pela
equação: nK=24=16. Para avaliar o erro experimental, as medições do ponto
central foram repetidas três vezes, aumentando o número total de
experimentos para 19.
87
Os resultados obtidos pelo planejamento fatorial foram avaliados, e as
variáveis com maior influencia no sistema foram investigadas através da
metodologia de superfície de resposta, matrix de Doehlert. As variáveis estudas
foram: concentração de ácido clorídrico em cinco níveis e tempo de pré-
redução em três níveis.
Foram estudados os efeitos estatisticamente significativos das variáveis
e interações entre eles foram avaliados através da aplicação de análise de
variância (ANOVA) utilizando o software Statistica 7.0. Todos os experimentos
foram realizados em sequência aleatória.
6. Etapa de pré-redução
Após a digestão das amostras, estas foram submetidas a uma etapa de
pré-redução, tendo em vista que após o processo de digestão toda espécie de
As contida na amostra é oxidada a As5+, espécie esta que só gera hidreto em
pH específico.
Para a pré-redução do As, foi adicionado 2,0 mL do digerido em um
balão volumétrico de 10 mL, adicionando em seguida 3,0 mL de HCl 4,7 mol L-1
e 1,0 mL de KI a 10% (m v-1). Após a adição dos reagentes, a solução
permaneceu em repouso por 21 minutos, aferindo o balão volumétrico com
água ultra-pura, e submetendo em seguida a amostra à análise.
88
RESULTADOS E DISCUSSÃO
1. Otimização multivariada do sistema proposto para a
geração de hidreto
A otimização foi conduzida utilizando 10,0 mL de uma solução 5,0 µg L-1 de
As (III) e os experimentos foram realizados em ordem aleatória.
1.1. Planejamento Fatorial
Um planejamento fatorial completo (24) foi empregado para avaliar o
nível de significância dos fatores. Os domínios experimentais para cada fator
foram definidos com base em dados da literatura. Valores codificados e valores
reais, bem como sinais analíticos (intensidade), estão apresentados na Tabela
19.
Através do gráfico de pareto observou-se que a interação
entre concentração de ácido clorídrico e concentração de borohidreto de sódio
foi significativa (p <0,05) para o processo de pré-redução e geração de hidreto
do arsênio (Figura 8). Esses fatores foram investigados utilizando a matriz
Doehlert. Os níveis em que foi estudada cada variável foi baseado nos
experimentos realizados para o planejamento fatorial.
89
Tabela 19: Planejamento fatorial dois níveis completo - otimização do processo de HG de arsênio
Experimentos Vol. KI*
(mL)
[HCl]*
(mol L-1)
TR* (min.) NaBH4]*
(%))
Int. sinal*
1 - - - - 489,50
2 + - - - 521,70
3 - + - - 494,10
4 + + - - 518,90
5 - - + - 629,30
6 + - + - 698,90
7 - + + - 527,30
8 + + + - 554,80
9 - - - + 530,30
10 + - - + 555,00
11 _ + - + 589,00
12 + + - + 576,40
13 - - + + 563,10
14 + - + + 582,00
15 - + + + 494,90
16 + + + + 482,00
17 0 0 0 0 597,00
18 0 0 0 0 537,30
19 0 0 0 0 521,00
*TR: tempo de pré-redução; Vol KI: volume de pré-redutos; [HCl]: concentração de HCl e [NaBH4]: concentração de borohidreto de sódio.
90
Figura 8: Gráfico de Pareto para otimização das condições experimentais da geração do hidreto de arsênio
0,40
- 0,73
- 1,41
-1,63
1,86
2,05
3,07
-3,96
-5,92
-6,14
p=,05
Efeito Estimado (valor absoluto)
1 e 3
(4)[NaBH4]
1 e 2
1 e 4
2 e 4
(1)[KI]
(3)TR
(2)[HCl]
2 e 3
3 e 4
0,40
- 0,73
- 1,41
-1,63
1,86
2,05
3,07
1.2. Planejamento Doehlert
Com base nos resultados do planejamento fatorial a matriz Doehlert foi
realizada a fim de ajustar um modelo quadrático para os dados e identificar as
condições ótimas para o procedimento [164]. A matriz é apresentada na Tabela
20, que inclui três repetições do ponto central para avaliar o erro experimental,
resultando em nove experimentos no total. A concentração de ácido clorídrico
foi estudada em cinco níveis, enquanto que o tempo de pré-redução foi
estudado em três níveis.
91
Tabela 20: Matrix Doehlert para otimização da pré-redução e geração do
hidreto de arsênio
Exp. [HCl]* (mol L-1) TR* (min.) Int. signal*
1 - 0.5 (4.5)* 0.866 (30)* 275,20
2 0.5 (5.5) 0.866 (30) 298,20
3 1.0 (6.0) 0 (20) 291, 70
4 0.5 (5.5) - 0.866 (10) 352, 70
5 - 0.5 (4.5) - 0.866 (10) 360,00
6 -1.0 (4.0) 0 (20) 379,50
7 0 (5.0) 0 (20) 370,70
8 0 (5.0) 0 (20) 416,10
9 0 (5.0) 0 (20) 400,00
* Valores reais
Os resultados deste planejamento também foram avaliados, e um modelo
quadrático foi obtido (Equação 5) usando os valores codificados para as
variáveis: concentração de ácido clorídrico ([HCl]) e o tempo de pré-redução
(TR).
Equação 5:
R= 1464,6 + 660,15[HCl] – 66,5[HCl]2 + 32,76[TR] – 0,54[TR]2 – 2,17[HCl][TR]
Através da equação 5 os valores críticos foram determinados, sendo
concentração de ácido clorídrico 4,7 mol L-1 e tempo de reação para pré-
redução do arsênio foi de 21 minutos. Esses valores foram calculados
conforme descritos na literatura [155]. A superfície de resposta apresentou
região de máximo como pode ser observado na Figura 9. As condições
experimentais otimizadas foram utilizadas na pré-redução e geração de hidreto
de arsênio em todo trabalho experimental, inclusive na validação.
A avaliação do modelo quadrático ajustado aos dados experimentais foi
feito por meio do teste de falta de ajuste. Como o valor de p foi maior que 0,05,
significa que o modelo matemático de segunda ordem descreve perfeitamente
92
o domínio experimental estudado. Na Tabela 21 é apresentado a ANOVA para
os dados obtidos pela aplicação da matriz de Doehlert na otimização do tempo
de agitação (TA) e da concentração do ácido (CA).
Tabela 21: Análise da variância (ANOVA) para os dados referentes á Tabela
20.
Fator SS df MS F P
(1) HCl (L) 6955,27 1 6955,267 7,334214 0,073277
HCl (Q) 5306,70 1 5306,700 5,595827 0,098901 (2) TR (L) 26,52 1 26,523 0,027968 0,877822 TR (Q) 6266,97 1 6266,965 6,608411 0,082444 1L por 2L 468,72 1 468,723 0,494260 0,532680 Falta de ajuste 2845,00 3 948,332 0,235606
Total SS 19948,54 8
Figura 9: Superfície de resposta para otimização da pré-redução e
geração do hidreto de arsênio.
93
Através da análise do gráfico dos valores preditos versus os valores
observados pode-se verificar que houve concordância dos valores observados
em relação aos valores que o modelo quadrático prevê (Figura 9).
260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
Valores Observados
260
280
300
320
340
360
380
400
420
Va
lore
s p
red
ito
s
Figura 9: Gráfico dos valores preditos X valores observados para
otimização da geração de hidreto do arsênio.
2. Validação do Método
Os pontos da curva de calibração foram preparados a partir de uma
solução padrão de As3+ 1000 mg L-1. A curva de calibração foi construída
utilizando-se 7 pontos, cujas concentrações variaram de 1,0 μg L-1 a 10 μg L-1,
apresentando boa linearidade com valor de R2 = 0,999 e inclinação da curva
representada pela equação Y = 54,088[As3+] - 6,187.
Os limites de detecção (3 sd/S) e de quantificação (10 sd/S) calculados
como recomendado pela IUPAC [165] foram: 0,002 e 0,006 µg g-1 para As total,
mostrando-se adequado para a determinação de arsênio nas amostras de
sardinha e atum.
A precisão (RSD) do método proposto foi avaliada em termos de
reprodutibilidade dos resultados analíticos e o RSD variou de 1,3 a 7,0 %.
94
Um material de referência certificado de tecido de ostra (NIST SRM
1566b) foi analisado para avaliar a exatidão do método. O material foi
submetido a 2 procedimentos de digestão, em bloco digestor utilizando o dedo
frio e em forno de micro-ondas com cavidade. Os resultados estão
apresentados na Tabela 22.
O valor de arsênio no certificado é de 7,65 ± 0,65 µg g-1. Através da
análise dos resultados pode-se observar que o valor obtido no forno de micro-
ondas e no bloco digestor foi cerca de metade do valor certificado.
De acordo com a literatura a arsenobetaina (Asb), arsenocolina (AsC) e
o íon tetrametilarsônio (TETRA) não produzem hidretos voláteis. Por isso é
necessário que a mineralização das amostras seja completa quando se deseja
determinar o arsênio total. Quando essa digestão é incompleta, esses
compostos orgânicos do arsênio (AsB, AsC, TETRA) não são disponibilizados
na forma de arsinas para que assim possam gerar os hidretos voláteis. A
arsenobetaina necessita de um procedimento de preparo de amostra que
alcance temperaturas próxima a 300 º C, para que assim a ligação As-C seja
quebrada, nos procedimentos de preparo de amostra utilizados nesse trabalho,
chegamos a uma temperatura máxima de 180 º C, devido a limitações do
equipamento, dessa forma a fração do arsênio que não foi quantificado nas
amostras e no material de referência certificado deve ser a arsenobetaina, pois
ela é a espécie dominante em alimentos de origem marinha [166].
Tabela 22: Resultados para determinação de As no CRM de tecido de ostra utilizando os três métodos de preparo de amostra. (µg g-1, n=3).
Amostra Valor Certificado Micro-ondas Bloco
Digestor
Tecido de Ostra - SRM
NIST 1566b
7,65 ± 0,65
3,45 ± 0,53
3,51 ± 0,81
95
3. Aplicação
O método proposto foi aplicado para determinar arsênio em vinte
amostras de sardinha e atum enlatados sendo: 12 de sardinha e 8 de atum. As
amostras foram nomeadas da seguinte forma: Tipo de amostra; (A ou S) atum
ou sardinha, respectivamente; a segunda letra a marca (foram 10 marcas
diferentes) e a terceira letra o tipo de conserva óleo, molho de tomate, Light (O,
MT, L, respectivamente). Os resultados estão apresentados na Tabela 23. Em
algumas conservas não foi possível quantificar, pois não conseguimos
resultados reprodutíveis devido a falta de homogeneidade da amostra. Através
da análise dos resultados percebe-se que a concentração do arsênio nas
conservas foi sempre maior do que apenas no peixe, acredita-se então que
esse molho ou óleo realiza uma extração desse arsênio nas amostras.
As concentrações mínimas e máximas no peixe foram: 0,49 ± 0,02 e
3,28 ± 0,2 µg g-1, conservas de 1,32 ± 0,9 e 6,78 ± 0,3 µg L-1 para atum e
sardinha, respectivamente. As concentrações mais elevadas de arsênio foram
nas amostras de sardinha.
96
Tabela 23: Concentração de arsênio em sardinha e atum enlatados, após
digestão em bloco digestor com dedo frio e em forno de micro-ondas com
cavidade (n=3), ([As] ± IC).
Amostra Peixe µg g-1
(Bloco digestor)
RSD
%
Conserva µg L-1
(Bloco digestor)
RSD
%
Peixe µg g-1
(Micro ondas)
RSD
%
SGOL 0,96 ± 0,05 2,0 5,98 ± 0,2 3,4 0,96 ± 0,1 4,8
SGO 0,93 ± 0,3 5,7 6,43 ± 0,1 0,7 0,91 ± 0,1 4,6
SGM 0,64 ± 0,1 6,9 ----- 0,63 ± 0,1 4,9
S8O 1,52 ± 0,2 5,1 4,56 ± 0,3 2,3 1,54 ± 0,2 4,0
S8M 1,37 ± 0,3 7,0 5,02 ± 0,2 3,2 1,39 ± 0,1 1,6
SEO 2,76 ± 0,01 0,7 --- 2,78 ± 0,3 3,9
SRO 0,91 ± 0,3 6,0 1,32 ± 0,9 2,2 0,89 ± 0,1 3,8
SCM 0,76 ± 0,1 5,7 ---- 0,78 ± 0,1 3,5
SCO 1,13 ± 0,2 5,2 4,13 ± 0,4 0,4 1,15 ± 0,1 3,6
SBM 2,38 ± 0,4 4,7 5,32 ± 0,7 4,9 2,35 ± 0,1 3,5
SBO 2,22 ± 0,3 4,7 6,78 ± 0,3 1,7 2,20 ± 0,5
SUO 0,67 ± 0,06 3,6 ---- 0,63 ± 0,1 3,5
SPO 3,25 ± 0,3 6,0 4,05 ± 0,1 2,2 3,28 ± 0,2 2,6
AGO 1,05 ± 0,02 0,7 3,42 ± 0,3 3,4 1,07 ± 0,1 3,4
A8O 0,92 ± 0,09 2,0 ---- 0,86 ± 0,1 4,6
AFO 0,50 ± 0,003 0,3 --- 0,49 ± 0,02 1,6
ABO 0,73 ± 0,05 4,3 3,07 ± 0,2 2,5 0,71 ± 0,1 4,8
ASO 0,69 ± 0,01 2,1 ----- 0,73 ± 0,02 1,3
AGM 1,30 ± 0,2 4,5 2,76 ± 0,2 2,9 1,27 ± 0,1 3,5
AGL 1,03 ± 0,4 4,2 2,19 ± 0,2 4,3 0,95 ± 0,1 4,8
AOL 1,50 ± 0,4 4,8 2,30 ± 0,05 1,5 1,55 ± 0,2 4,2
97
CONSIDERAÇÕES FINAIS _____________________________________________________________________________
A otimização multivariada demonstrou ser um instrumento adequado
para a otimização do processo de pré-redução e geração de hidretos de
arsênio.
A alta sensibilidade, faixa linear, velocidade de análise, facilidade de
manuseio do equipamento e custo relativamente baixo faz com que a
espectrometria de fluorescência atômica com geração de hidretos seja uma
boa alternativa para determinação de arsênio em amostras de atum e sardinha.
Os resultados apresentados neste trabalho são resultados preliminares
pois não foi possível a quantificação do arsênio total nas amostras de atum e
sardinha devido a alta estabilidade térmica da arsenobetaina.
98
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