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Ensaio Laboratorial de Fitoplâncton – 2011 Discussão de resultados, identificação e determinação de biovolume - formas complexas

Laboratório de Referência do Ambiente, LRA

No âmbito do projecto de colaboração INAG, APA e CIIMAR

Ceratium hirundinellaStaurastrum sp.

RELATÓRIO

DEZEMBRO 2011

LEONOR CABEÇADAS

1

ÍNDICE

LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE FOTOGRAFIAS

1 - INTRODUÇÃO

5

2 - OBJECTIVOS

5

3 - RESULTADOS

6

3.1-Determinação dos biovolumes de fitoplâncton de formas complexas

6

3.2-Identificação de espécies de fitoplâncton

13

3.2.1-Amostra B – ALBUFEIRA DO ALVITO, Junho de 2011

13

3.2.2- Amostra C – ALBUFEIRA DO CALDEIRÃO, Maio de 2011

17

3.3-Discussão dos resultados obtidos no exercício de comparação interlaboratorial

20

3.3.1-Fundamento teórico

20

3.3.2-Contagem vs precisão

20

4 - CONCLUSÕES

21

5 - REFERÊNCIAS

25

ANEXO I- LISTA DAS ESPÉCIES DE FITOPLÂNCTON NAS AMOSTRAS DAS ALBUFEIRAS DO ALVITO E DO CALDEIRÃO

ANEXO II – REFERÊNCIAS PARA IDENTIFICAÇÃO DE FITOPLÂNCTON DE ÁGUA DOCE

2

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Biovolume de Ceratium hirundinella.

Tabela 2 – Biovolume de Staurastrum pseudosebaldi.

Tabela 3 - Relação entre o nº de células contadas e o limite de

confiança (L.C.) (para um nível de confiança de 95%). Caso

teórico.

Tabela 4 – Resultados obtidos na análise quantitativa de fitoplâncton

(cel/ml) para a amostra B – Alvito, Junho de 2011 (n = nº de

participantes, SD = Desvio Padrão e CV% = Coeficiente de

Variação em percentagem).

Tabela 5 - Resultados obtidos na análise quantitativa de Fitoplâncton

(cel/ml) para a amostra C – Caldeirão, Maio de 2011 (n = nº

de participantes, SD = Desvio Padrão e CV% = Coeficiente

de Variação em percentagem).

Tabela 6 – Resultados de Biovolume (mm3/l) para as cinco espécies

mais abundantes na amostra B – Alvito, Junho de 2011 (n =

nº de participantes, SD = Desvio Padrão e CV% =

Coeficiente de Variação em percentagem).

3

LISTA DE FIGURAS

Fig.1 – Relação entre o nº de células contadas e o limite de confiança

(L.C.) (para um nível de confiança de 95%). Caso teórico.

Fig.2 - Relação entre o nº de células contadas pelos participantes e o

limite de confiança (L.C.) (para um nível de confiança de 95%).

Amostra B – Alvito, Junho de 2011.

Fig.3 – Resultados da análise quantitativa de fitoplâncton (cel/ml).

Amostra B – Alvito, Junho de 2011.

Fig.4 - Relação entre o nº de células contadas pelos participantes e o

limite de confiança (L.C.) (para um nível de confiança de 95%).

Amostra C – Caldeirão, Junho de 2011.

Fig.5 - Resultados da análise quantitativa de fitoplâncton (cel/ml).

Amostra C – Caldeirão, Maio de 2011.

Fig.6 – Resultados de Biovolume (mm3/l) para as cinco espécies de

fitoplâncton mais abundantes na Amostra B – Alvito, Junho de

2011.

4

LISTA DE FOTOGRAFIAS

Fot. 1 – Exemplificação das medições necessárias para aplicação da

equação CEN, 2007 à forma complexa de Ceratium

hirundinella.

Fot. 2 – Exemplificação das medições necessárias para aplicação da

equação CEN, 2007 à forma complexa de Ceratium furcoides.

Fot. 3 - Exemplificação das medições necessárias para aplicação da

equação CEN, 2007 à forma complexa de Staurastrum sp..

Fot. 4 – Staurastrum pseudosebaldi.

Fot. 5 – Merismopedia warmingiana e M. tenuíssima.

Fot. 6 – Woronichinia delicatula.

Fot. 7 – Chroomonas acuta e Plagioselmis nannoplanctica.

Fot. 8 – Mallomonas akrokomos e M. akrokomos var. parvula.

Fot. 9 – Tabellaria fenestrata e Fragilaria crotonensis.

Fot. 10 – Paulschulzia pseudovolvox.

Fot. 11 – Volvox aureus e Eudorina elegans.

Fotografias: Leonor Cabeçadas

5

Ensaio Laboratorial de Fitoplâncton – 2011

Discussão de resultados, identificação e determinação do biovolume -

formas complexas

1 - INTRODUÇÃO

A Directiva 2000/60/CE é uma Directiva Comunitária (DQA) que visa estabelecer um

quadro comum para a protecção das águas interiores de superfície e subterrâneas, das

águas de transição e das águas costeiras, da União Europeia. Esta Directiva foi

transposta para a ordem jurídica nacional através da Lei nº58/2005 de 29 de

Dezembro e do Decreto-Lei nº77/2006 de 30 de Março.

O descritor Biológico de qualidade Fitoplâncton é um dos componentes chave no

Sistema de Classificação da Qualidade Ecológica das massas de água que está a ser

aplicado nos Estados Membros.

A implementação da DQA exige uma maior uniformização dos métodos analíticos e,

especificamente no caso de análises de Fitoplâncton (contagem e identificação), dos

métodos de contagem fiáveis tendo em vista a estimativa da respectiva biomassa. A

identificação das espécies exige experiência, acesso a literatura especializada,

trabalhos de âmbito nacional e revisões taxonómicas actualizadas.

2 - OBJECTIVOS

Com o objectivo de harmonizar metodologias de contagem, de identificação e de

determinação da biomassa de Fitoplâncton, e na sequência de exercícios realizados

anteriormente, foi organizado o 4º exercício interlaboratorial em 2011 coordenado

pelo INAG, APA e CIIMAR-Universidade do Porto. No exercício participaram 17

analistas de 11 Instituições Nacionais.

No âmbito do exercício foram analisadas pelos participantes 2 amostras naturais de

albufeiras de Portugal no período de verão (Maio/Junho de 2011) correspondendo a

águas de diferentes zonas geográficas:

6

1-Amostra B - Barragem do Alvito (Alentejo)

2-Amostra C - Barragem do Caldeirão (Mondego)

Para a amostra B foi ainda proposto que se realizasse a estimativa do biovolume para as cinco

espécies mais abundantes da amostra.

3 - RESULTADOS

3.1 – DETERMINAÇÃO DO BIOVOLUME DE FITOPLÂNCTON

(FORMAS COMPLEXAS)

Em termos de caracterização ecológica das massas de água superficiais, torna-

se necessário proceder-se a medições morfométricas de fitoplâncton expressas

em biovolume visto apresentarem vantagens em relação aos clássicos

descritores taxonómicos em termos da sua classificação.

Apresentam-se 3 exemplos de estimativas de biovolume referentes a formas

complexas de fitoplâncton tais como as pertencentes aos géneros Ceratium e

Staurastrum, utilizando as equações indicadas no documento de trabalho

CEN/TC230/WG2/TG3/ N108, 2007.

As referidas equações normalizam a estimativa do biovolume do fitoplâncton

quando comparado com estimativas baseadas na escolha mais ou menos livre

de sólidos geométricos associados à forma central do corpo da espécie, que no

caso do género Ceratium pode ser esfera, elipsoide, trapezóide e no caso de

Staurastrum, 2 cones truncados, tetraedro, sendo os cornos/espinhos em

ambos os géneros associados a formas geométricas tais como cilindros, cones,

etc.

As espécies estudadas, Ceratium hirundinella, Ceratium furcoides e Staurastrum

pseudosebaldii foram amostradas na Albufeira do Alvito em várias ocasiões no

decorrer do Projecto.

7

f1

f2

f3

f4

f1= corno apicalf2 = corno antapicalf3 = corno antapicalf4 = corno antapical

h2 = diâmetro corno apical

g1 = diâmetro base corno apicalg2 = diâmetro base corno antapicalg3 = diâmetro base corno antapicalg4 = diâmetro base corno antapical

h2

g1

g2

g3

g4

l

l = altura do corpob = largura do corpoh1 = espessura (calculada como 1/3 de b)

b

b

h1

V=(π/12*f1*(h22 + h2*g1+g1

2)+(π/6*l*b*h1) + π/12* (g22*f2+g3

2*f3+g42*f4)

R1672 Ceratium hirundinella (O.F. Müller) Dujardin 1841

V=41 450 μm3; n=8 células (média das dimensões)

V=39 856 µm3 ; n=8 células (mediana)

Fot. 1 – Exemplificação das medições necessárias para aplicação da equação CEN,

2007 à forma complexa de Ceratium hirundinella.

8

nº Cel.

n=8

Larg.(l, μm)

CornoApical(h, μm)

Base CornoApical (d, μm)

CornoAntapical(h, μm)

Base CornoAntapical(d, μm)





CornoApical(d, μm)

Espessura

do corpo(w, μm)

Altura do corpo(h, μm)

Biovolume

(μm3)

b f1 g1 f2 g2 f3 g3 f4 g4 h2 h1 l B

1 72,0 126,0 14,4 79,2 21,6 72 14,4 54 10,8 3,6 24,0 32,4 53 156

2 63,6 99,6 10,2 71,3 9,0 73,2 9,0 30,6 5,0 3,6 26,8 36,6 39 662

3 61,2 108,0 10,8 90 9,0 90,0 9,0 32,4 5,0 3,6 20,4 32,4 29 767

4 57,6 79,2 7,2 62,1 9,0 72,0 9,0 28,8 5,0 3,6 19,1 43,2 29 593

5 72,0 108,0 10,8 72,0 9,0 61,3 9,0 25,2 5,0 3,6 24,0 36,0 40 050

6 64,8 97,2 10,8 72,0 9,0 61,2 9,0 25,2 5,0 3,6 21,6 36,0 33 429

7 72,0 126,0 18,0 54,0 18,0 72,0 14,4 43,2 7,2 9,0 24,0 28,8 53 466

8 90,0 118,8 18,0 72,0 10,5 30,0 14,4 36 7,2 10,8 30,0 30,0 66 021

Mediana

Média

68,4

69,2

108,0

107,9

10,8

12,5

72,0

71,6

9,0

11,9

72,0

66,5

9,0

11,0

31,5

34,4

5,0

6,3

3,6

5,2

24,0

23,7

34,2

34,4

39 856

41 386

CV% 12,8 13,0 27,8 13,1 37,7 23,0 23,1 25,5 29,9 51,3 13,0 11,7 28,1

Tabela 1 - Biovolume de Ceratium hirundinella; 12 parâmetros; n=8 células; CEN, 2007

9

R1671 Ceratium furcoides (Levander) Langhans 1925

f1

f2

f3

f4

h2

g1

g2

g3

g4

b

l

f1= corno apical, 89,4 μmf2 = corno antapical, 71,9 μmf3 = corno antapical, 32,2 μmf4 = corno antapical, 35,5 μm

h2 = diâmetro corno apical, 3,5 μm

g1 = diâmetro base corno apical, 14,1 μmg2 = diâmetro base corno antapical, 10,8 μmg3 = diâmetro base corno antapical, 14,0 μmg4 = diâmetro base corno antapical, 10,5 μm

l = altura do corpo, 32,7 μmb = largura do corpo, 42,8 μmh1 = espessura, 14,3 μm(calculada como 1/3 de b)

V=25 743 μm3; n=8 células (média das dimensões)V= 26 016 µm3;n=8 células (mediana)

Fot. 2 – Exemplificação das medições necessárias para aplicação da equação CEN, 2007

à forma complexa de Ceratium furcoides.

10

hm

lmin

lb

ds

lst

hm = altura, µmlmin = largura do istmo, µmlb = largura máxima sem processos, µmds = diâmetro espinho, µmlst = comprimento do processo, µm

RXXXX Staurastrum pseudosebaldi Wille

V= 2/3*hm*(√3/4* (lmin2+lb

2) + √(3/16*lmin2*lb

2)) + π/2*ds2*lst

V=19 587 µm3; n=17 células (média das dimensões)V=17 479 µm3; n=17 células (mediana)

Fot. 3 - Exemplificação das medições necessárias para aplicação da equação CEN,

2007 à forma complexa de Staurastrum sp.

11

Tabela 2 - Biovolume de Staurastrum pseudosebaldi ; 5 parâmetros; n = 17 células;

CEN, 2007

Nº Cél.

n=15

Altura

hm, µm

Larg. Istmo

lmin, µm

Lar. máx. sem espinhos

lb, µm

Diâmetro do espinhods, µm

Comp. do

espinho

lst, µm

Biovolume

µm3

1 14,4 12,6 21,6 5,4 45,0 26 246

2 18,0 12,6 27,0 3,6 32,4 19 011

3 16,2 9,0 21,6 3,6 28,8 12 427

4 18,0 12,6 27,0 5,4 28,8 26 961

5 16,2 9,0 18,0 3,6 36,0 12 524

6 14,4 9,0 25,2 3,6 41,4 15 064

7 14,4 12,6 21,6 3,6 28,8 12 023

8 14,4 10,8 18,0 3,6 32,4 10 860

9 18,0 14,4 23,9 5,4 43,2 33 792

10 18,0 12,6 27,0 3,6 36,0 19 894

11 18,0 9,0 21,6 3,6 27,0 13 366

12 18,0 9,0 18,0 5,4 39,1 26 669

13 18,0 10,8 19,8 3,6 45,0 17 479

14 18,0 12,6 21,6 3,6 36,0 16 795

15 16,2 12,6 21,6 3,6 39,1 15 801

16 21,6 12,6 21,6 5,4 36,0 33 405

17 23,4 12,6 19,8 3,6 36,0 20 667

MedianaMédiaCV%

18,017,413,4

12,611,415,0

21,622,113,0

3,64,126,3

36,035,915,0

17 47919 58735,0

Apresentam-se 3 exemplos de estimativas de biovolume de formas complexas de

fitoplâncton, nomeadamente as pertencentes aos géneros Ceratium e Staurastrum,

empregando as equações indicadas no documento CEN/TC230/WG2/TG3/ N108, 2007

– Water Quality – Draft proposal – Phytoplankton biovolume determination using

inverted microscopy (Utermöhl technique).

A utilização das equações referidas permite normalizar a estimativa do

biovolume quando comparado com estimativas baseadas na escolha mais ou

menos livre de sólidos geométricos associados à forma central do corpo da

espécie e dos processos.

As equações referidas corrigem a forte compressão dorso-ventral que

caracteriza as células pertencentes às espécies referidas.

12

Na amostra da Albufeira do Alvito - Amostra B obtida em Junho de 2011 as 3

espécies mais importantes em termos de biovolume foram: Ceratium

hirundinella, Ceratium furcoides e Staurastrum pseudosebaldi.

Os biovolumes foram calculados de acordo com o que está exemplificado nas

Tabelas 1 e 2 :

1 - a partir da mediana de uma determinada série de biovolumes individuais de

células de uma mesma espécie (segundo o documento de trabalho CEN, 2007).

2 - a partir da média das medições efectuadas num determinado número de

células da mesma espécie.

13

3.2 - IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES DO FITOPLÂNCTON

Apresentam-se os resultados referentes à identificação do fitoplâncton nas amostras

naturais, nomeadamente da Amostra B – Barragem do Alvito e da Amostra C-

Barragem do Caldeirão/Mondego, respectivamente em Junho e Maio de 2011.

3.2.1 - Amostra B – Albufeira do Alvito – Junho de 2011

Composição específica

Foram identificadas 104 unidades taxonómicas de fitoplâncton, pertencentes às

Chlorophyceae (47), Conjugatophyceae (8), Cyanobacteria (16), Bacillariophyceae (10),

Cryptophyceae (7), Euglenophyceae (7), Klebsormidiophyceae (2), Dinophyceae (3),

Chrysophyceae (4) e diversos fitoflagelados.

Espécies mais importantes em termos de biovolume:

Ceratium hirundinella

Ceratium furcoides

Staurastrum pseudosebaldi

Espécies mais importantes em termos de abundância:

Merismopedia tenuissima,

Merismopedia warmingiana (Sin: Merismopedia minima ?)

Chroomonas acuta, Plagioselmis nannoplanctica

Coelastrum reticulatum

Sphaerocystis schroeteri

Ankyra judayi

Mallomonas akrokomos

14

RXXXX Staurastrum pseudosebaldi Wille R1304 Staurastrum planctonicum Teiling 1946

Larg. do istmo: 9 – 13 µm; 12,5 µmLarg. da célula sem os espinhos = 20 - 67 µm; 25 µmLarg. da célula com os espinhos = 70- 117 µm; 75 µmComp./Altura da célula (h)= 50-65 µm; 43,8 µmComp. dos espinhos = 25 µm; 25 µm

Larg. do istmo: 9-12,6; 11,4 µmLarg. da célula sem os espinhos: 18-25,2 µm ; 22,1 µmLarg. da célula com osespinhos: 75,6-111,2 µm; 93,9 µmComp./Altura (h) da célula :28,8-46,8 µm; 33,1 µmComp. dos espinhos = 27-45 µm; 35,9 µm

2 séries de grânulos acima do istmo, margem superior recta ou suavemente convexa, ângulos prologados em espinhos longos, levemente curvos, convergentes, margens crenuladas, extremidade 3-4-denticulada. Vista apical da célula 3-radiada, margens verrucosas, 1 série de espinhos intramarginais.

EQAT

Conjugatophyceae/ Desmidiales

EQAT – External Quality Assessment Trials Phytoplanktonhttp://www.planktonforum.eu/

2 séries de grânulos acima do istmo

RXXXX Staurastrum pseudosebaldi Wille

Fot. 4 - Staurastrum pseudosebaldi

15

R1479 Merismopedia tenuissimaLemmermann 1898

R1481 Merismopedia warmingianaLagerheim 1883(Sin. R1476 M. minima Beck 1897)

Célula: 0,5 –1(-1,2) µm Célula: 0,4 – 1,6 µm

Cyanophyceae/ Chroococcales

Colónia normalmente plana e rectangular, frequentementeagregada em grupos de colónias, cada uma tipicamentecom 16 células, por vezes mais. Células normalmentemuito perto umas das outras, esféricas, elipsoidais ou(após divisão recente) hemisféricas, 0,4 – 1,6 µm.

Colónia regular, plana, com células mais ou menos densamente agrupadas 4-16(-64) , por vezes agrupadas em tetraedros e composta por subcolónias de fácil desintegração. Mucilagem difluente, normalmente larga rodeando as células. Células esféricas 0,5-1(-1,2) µm.

Fot. 5 – Merismopedia warmingiana e M. tenuissima

R1522 Worinichinia delicatula (Skuja) Komárek et Hindák 1988 In vivo

Colónia em 2 planos de focagem

Colónia: d=72 µm; 63 µmCélula: d=0,9 µm; 0,4 µm

Salienta-se que estas colónias depois de a amostra ser fixada com Lugol desaparecem

Cyanophyceae/ Chroococcales

FOT. 6 – Woronichinia delicatula

16

pirenóide

R1368 Chroomonas acuta UtermöhlCélula: 7-10 x 4,5-5,5 μm

Células obovadas em vista lateral, póloposterior afilado, voltado para a regiãoventral; 1 cloroplasto lobado, 1 pirenóidedorsal mediano fora do cromatóforocercado de grânulos de amido. Flagelos dediferente comprimento não inseridos nacitofaringe.

pirenóide

R2162 Plagioselmis nannoplanctica (Skuja) Novarino, Lucas & Morrall [Rhodomonas minuta var.

nannoplanctica Skuja]

Célula: 7,5-11 x 3,5-6 μm

Células sub ovóides, curvadas e piriformes em vistalateral, em vista frontal e dorsal apresentam-sepiriformes, mas não curvadas lateralmente. Póloanterior obliquamente truncado. Pólo posteriorcurvado e fortemente ponteagudo. Um únicocromatóforo laminado. Um pirenóide, proeminente,no lado dorso-ventral. Flagelos de diferentecomprimento não inseridos na citofaringe.

Chryptophyceae/Cryptomonadales

Fig.7 – Chroomonas acuta e Plagioselmis nannoplanctica

Membrana hialinasiliciosa

sedas

flagelo

R1097 Mallomonas akrokomos Ruttner in Pascher 1913

2 cloroplastos parietais

Chrysophyceae/Synurales

5,4 - 7,2 µm x 25,2 – 36 µm

Célula em forma de agulha, esguia e longa, envolvida por envelope de sílica, alargada junto ao ápice, cauda ponteaguda; sedas presentes formando um agrupamento apical ; um flagelo cerca de metade do comprimento do corpo; 2 cloroplastos parietais.

R1098 Mallomonas akrokomos var. parvula Conrad 19272 – 3 µm x 8 – 12 µmConsiderávelmente mais pequena que a anterior e com 4 ou menos sedas

Fot. 8 – Mallomonas akrokomos e M.akrokomos var.parvula

17

3.2.2 - Amostra C – Albufeira do Caldeirão/Mondego, Maio de 2011

Composição específica

Foram identificadas 42 unidades taxonómicas de fitoplâncton pertencentes aos

gruposdiversos Chlorophyceae (22), Cryptophyceae (4), Bacillariophyceae (9),

Chrysophyceae (2), Euglenophyceae (1) e diversos fitoflagelados.

Espécies mais importantes em termos de abundância:

Tabellaria fenestrata

Fragilaria crotonensis

Anabaena catenula var. affinis

Outras espécies presentes:

Eudorina elegans

Paulschulzia pseudovolvox

Volvox aureus

18

R0440 Tabellaria fenestrata (Lyngbye) Kützing 1844

Baccillariophyceae/Pennales

R0223 Fragilaria crotonensisKitton 1869

Fot.9 – Tabellaria fenestrata e Fragilaria crotonensis

7,2 μm

18 μm

Pseudocilia 36 µm

Chlorophyceae/Tetrasporales

R0906 Paulschulzia pseudovolvox (Schulz) Skuja 1948

Fot.10 – Paulschulzia pseudovolvox

19

Chlorophyceae/Volvocales

R0998 Volvox aureus Ehrenberg 1832

360 µm

3,6 μm

R0963 Eudorina elegansEhrenberg 1832

54 μm

2 Flagelos iguais

Fot. 11 – Vovox aureus e Eudorina elegans

20

3.3 – DISCUSSÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS NO EXERCÍCIO DE

COMPARAÇÃO INTERLABORATORIAL (ECI)

3.3.1 - Fundamento teórico

Para uma contagem de fitoplâncton estatisticamente aceitável, recomenda-se serem

contadas pelo menos 50 unidades de cada um dos taxon dominantes (células, colónias

ou filamentos). A contagem total deve atingir os 500 indivíduos (Venrick, 1978).

Tabela 3 - Relação entre o nº de células contadas e o limite de confiança (L.C.), (para um nível de confiança de 95%) (Anderson & Thröndsen 2003).

Nº de células contadas

L.C. ± (%)

1 200

2 1413 116

4 1005 896 827 768 719 67

10 6315 5220 4525 4040 3250 2875 23

100 20200 14400 10500 9700 8

1000 62000 55000 3

0

50

100

150

200

250

0 200 400 600 800

L.C. ( %)

Fig.1 - Relação entre o nº de células contadas e o limite de confiança (L.C.), (para um nível de confiança de 95%).

3.3.2 - Contagem vs precisão

É de salientar que um esforço de contagem acima de um certo patamar (por ex. 500

células, coenobia/colónias e filamentos) não se traduz necessariamente num aumento

significativo de precisão (Fig.1).

Na Fig.2 podem ser observados o resultados do esforço de contagem vs precisão

referentes aos participantes no Exercício Comparação Interlaboratorial (ECI) de 2011

para a amostra B - Alvito. Todos os participantes efectuaram um esforço de contagem

acima do patamar exigido para uma contagem estatisticamente significativa.

21

Os resultados referentes à análise quantitativa de fitoplâncton obtidos pelos

participantes variaram entre 1 947 cel/ml (Lab1112) e 13 654 cel/ml (Lab1118) com

valores de média e desvio padrão (SD) respectivamente de 6 132 e 3 653 cel/ml

(Tabela 4). Os resultados da análise de fitoplâncton da amostra B – Alvito encontram-

se representados na Fig.3.

Fig.2 – Relação entre o nº de células contadas e o limite de confiança, L.C. (nível de confiança 95%).

ELab1101ELab1102

ELab1103

ELab1105

ELab1108

ELab1110

ELab1111

ELab1112

ELab1113

ELab1115

ELab1116

ELab1117

ELab1118

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 2000 4000 6000 8000 10000

nº cel. contadas

L.C. 95%

Fitoplâncton - Amostra B – Alvito, Junho 2011

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000 cel/ml

Participantes cel/ml

ELab1112 1947

ELab1113 1980

ELab1101 3362

ELab1105 3466

ELab1117 3766

ELab1115 4098

ELab1116 4112

ELab1107 4886

ELab1114 4950

ELab1104 5654

ELab1111 6180

ELab1110 6975

ELab1102 9604

ELab1103 10882

ELab1108 12593

ELab1118 13654

média 6132

SD 3653CV% 59,6

n=16

Fig. 3 – Resultados referentes à análise quantitativa de Fitoplâncton (cel/ml)

Tabela 4 – Resultados obtidos no ECI 2011

Fitoplâncton – Amostra B – Alvito, Junho 2011

22

Na Fig.4 podem ser observados os resultados do esforço de contagem vs precisão

referentes aos participantes no Exercício Comparação Interlaboratorial (ECI) de 2011

para a amostra C - Caldeirão. Todos os participantes efectuaram um esforço de

contagem acima do patamar exigido para uma contagem estatisticamente significativa.

Os resultados referentes à análise quantitativa de fitoplâncton obtidos pelos

participantes variaram entre 3 120 cel/ml (Lab1113) e 13 052 cel/ml (Lab1110) com

valores de média e desvio padrão (SD) respectivamente de 6 882 e 2 890 cel/ml

(Tabela 5). Os resultados da análise de fitoplâncton da amostra C – Caldeirão

encontram-se representados na Fig.5.

Fig.4 – Relação entre o nº de células contadas e o limite de confiança, L.C. (nível de confiança 95%).

ELab1113

ELab1111

ELab1112

ELab1102

ELab1115

ELab1101

ELab1118

ELab1118

ELab1103

ELab1116

ELab1117

ELab1110

ELab1105

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000

LC

95

%

nº cel. contadas

Fitoplâncton – Amostra C – Caldeirão, Maio 2011

Em relação à determinação do biovolume (mm3/l) relativo ao exercício realizado para

as cinco espécies mais abundantes na amostra B - Alvito, foi obtido o coeficiente de

variação de 23,5% correspondente aos resultados de treze laboratórios. (Fig.6, Tabela

6). Considerou-se este resultado francamente bom.

Três laboratórios obtiveram resultados sobre estimados, facto que ficou a dever-se a

problemas pontuais fáceis de corrigir, relacionados com a contagem de colónias na

ampliação mais alta.

23

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

Participantes cel/ml

ELab1113 3120ELab1111 3575ELab1112 3859ELab1104 4198ELab1102 4834ELab1115 5120ELab1114 5217ELab1101 6289ELab1108 6395ELab1118 7856ELab1103 8014ELab1116 8573ELab1117 9625ELab1107 9629ELab1105 10750ELab1110 13052média 6882SD 2890CV% 42,0n=16

Fig.5 - Resultados referentes à análise quantitativa de Fitoplâncton (cel/ml)

Tabela 5 – Resultados obtidos no ECI 2011

Fitoplâncton – Amostra C – Caldeirão, Maio 2011

cel/ml

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

Fig.6 – Resultados expressos em biovolume (mm3/l), para as cincoespécies de fitoplâncton mais abundantes na amostra B –Alvito, referentes a treze laboratórios.

Tabela 6- Resultados obtidos no ECI 2011

Biovolume do Fitoplâncton– Amostra B – Alvito, Junho 2011

mm3/l

Participantes mm3/L

ELab1116 0,05

ELab1117 0,05

ELab1118 0,06

ELab1107 0,06

ELab1112 0,07

ELab1108 0,08

ELab1113 0,08

ELab1105 0,09

ELab1103 0,09

ELab1115 0,09

ELab1101 0,09

ELab1111 0,10

ELab1114 0,10

média 0,08

SD 0,02

CV% 23,5

n 13

24

4 - CONCLUSÕES

Todos os participantes contaram um número total de unidades de contagem

suficiente para a contagem ser estatisticamente significativa (>500) (precisão

>9%, para um L.C. 95%). Este foi um dos aspectos observados que correspondeu a

uma melhoria em relação aos resultados de Exercícios de Comparação

Interlaboratorial (ECI) realizados anteriormente, em que nalguns casos se observaram

contagens de base manifestamente insuficientes.

No caso de alguns participantes, contudo o esforço de contagem vs precisão,

pode ainda ser ajustado, reduzindo-se o esforço de contagem em função da

estratégia de contagem, como sugerido no exercício prático realizado no

Laboratório de Referência do Ambiente (Cabeçadas & Ferreira, 2011).

Os coeficientes de variação entre os participantes para as amostras B e C

analisadas no Exercício de Comparação Interlaboratorial de 2011 foram

respectivamente de 60 e 40%. Estes resultados são considerados encorajadores

para o tipo de amostras naturais.

Em relação à determinação do biovolume (mm3/l) segundo a metodologia

proposta no exercício para as cinco espécies mais abundantes na amostra B -

Alvito, foi obtido o coeficiente de variação de 23,5% correspondendo aos

resultados de treze laboratórios. Considera-se este resultado francamente bom

e indicando que quando os resultados são expressos em biovolume (mm3/l) há

um decréscimo acentuado de variabilidade entre os laboratórios.

Todos os laboratórios identificaram os géneros mais importantes em termos de

biovolume na amostra B (Ceratium sp. e Staurastrum sp.). Nesta amostra em

termos de abundância foram identificados por todos os laboratórios como

unidades taxonómicas mais abundantes Merismopedia spp.

Chroomonas/Plagioselmis e o grupo das Chlorococcales. Todos os laboratórios

identificaram os géneros mais importantes em termos de abundância na

amostra C (Tabellaria sp., Anabaena sp. e Fragilaria sp.).

25

5 – REFERÊNCIAS

Andersen, P & J. Throndsen, 2003. Estimating cell numbers. In Hallegraeff, G.M.

Anderson D.M. & A.D. Cembella (eds) Manual on Harmful Marine Microalgae.

Monogr. on Oceanogr. Method. no. 11. p.99-130. UNESCO Publishing, Paris.

Cabeçadas, L. & J. Ferreira, 2011. Análise de Fitoplâncton - Exercício realizado na

Agência Portuguesa do Ambiente, (APA) Laboratório de Referência do Ambiente,

(LRA) em Abril/Maio 2011. Relatório, 27 pp + anexo.

CEN, TC 230/WG 2/TG 3, 2007. Draft Proposal of “ Phytoplankton biovolume

determination using inverted microscopy (Utermöhl technique)”.

Förster, K., 1969. Amazonische Desmidieen, 1 Teil: Areal Santarem. Amazoniana, Kiel,

Vol. II, 5-232.

Venrick, E. L., 1978. How many cells to count ? – In: Sournia (ed.). Phytoplankton

manual. UNESCO Monogr. Oceanogr. Method. 6: 167-180.

26

ANEXO I – LISTA DAS ESPÉCIES DE FITOPLÂNCTON DAS AMOSTRAS B –

ALBUFEIRA DO ALVITO E AMOSTRA C – ALBUFEIRA DO CALDEIRÃO

EM 2011

Fitoplâncton - Lista de Espécies – Albufeira do ALVITO- Amostra B, Junho 2011

105 unidades taxonómicas identificadas

CIANOPHYCEAE

Chroococcales

R1423 Aphanocapsa Nägeli 1849

R1413 Aphanocapsa delicatissima W & G. S. West 1912

R1432 Aphanotece Nägeli 1849

R1476 Merismopedia minima Beck 1897

R1479 Merismopedia tenuissima Lemmermann 1898

R1481 Merismopedia warmingiana Lagerheim 1883 (Sin: R1476 Merismopedia minima

Beck 1897

R1482 Microcystis aeruginosa Kützing 1846

R1487 Microcystis flos-aquae (Wittrock) Kirchner 1898

R1510 Snowella lacustris (Chodat) Komárek et Hindák 1988, Gomphophaeria lacustris

Chodat 1898

R1522 Woronichinia delicatula (Skuja) Komárek et Hindák 1988

R1525 Woronichinia naegaeliana (Unger) Elenkin 1933, Coelosphaerium naegelianum

Unger, Gomphosphaeria naegeliana (Unger) Lemmerman

Nostocales

R1548 Anabaena Bory De Saint Vincent ex Bornet & Flahaut 1886

R1581 Limnothrix planctonica (Woloszynska) M.F. Meffert 1988

R1613 Planktothrix agardhii (Gomont) Anagnostidis & Komárek 1988

27

Fitoplâncton - Lista de Espécies – Albufeira do ALVITO-Amostra B, Junho 2011

Oscillatoriales

R1621Pseudanabaena limnetica (Skuja) M.E. Meffert 1987

R1631 Spirulina Turpin ex Gomont 1892

CHLOROPHYCEAE

Chlorococcales

R0489 Ankyra judayi (G.M. Smith) Fott 1957

R0527 Coelastrum microporum Nägeli in A. Braun 1855

R2269 Coelastrum polychordum (Korshikov) Hindák 1977

R0529 Coelastrum pseudomicroporum Korshikov 1953

R2510 Coelastrum pulchrum Schmidle 1892, Coelastrum cambricum Archer 1868

R0530 Coelastrum reticulatum (Dangeard) Senn 1899

R0535 Coenochloris Korshikov 1953

R0533 Coenochloris fottii (Hindák) Tsarenko 1990, Eutetramorus fottii (Hindák)

Komárek 1979

R2272 Coenochloris pyrenoidosa Korshikov 1953

R0550 Crucigenia tetrapedia (Kirchner) W.& G. S. West 1902

R0555 Crucigeniella rectangularis (Nageli) Komárek 1974, Crucigenia rectangularis

(Nägeli) Gay 1891

R0571 Dictyosphaerium pulchellum Wood 1872

R0617 Golenkinia Chodat 1894

R0616 Golenkinia radiata Chodat 1894

R0660 Micractinium pusillum Fresenius 1858, Richteriella botryoides (Schmidle)

Lemmermann, Tetrastum multisetum (Schmidle) Chodat

28


R0670 Monoraphidium griffithii (M. J. Berkeley) Komárkova-Legnorová 1969,

Ankistrodesmus acicularis (Braun) Korshikov 1953, Dactylococcopsis acicularis

Lemmermann 1900

R0677 Monoraphidium nanum (Ehrenberg) Hindák 1980

R0693 Nephrocytium Nägeli 1849

R0705 Oocystis A. Braun 1855

R0699 Oocystis minuta Guillard H. C. Bold & MacEntee 1975

R0701 Oocystis parva W. & G. S. West 1898, Oocystella parva (W. et G.S. West) Hindák

1988

R0702 Oocystis pusilla Hansgirg 1890

R0723 Pediastrum Meyen 1829

R0722 Pediastrum simplex Meyen 1829, Pediastrum strumii Reinsch 1867

R2407 Pediastrum simplex var. biwaense Fukushima 1956

R0716 Pediastrum duplex Meyen 1829

R0725 Pediastrum tetras (Ehrenberg) Ralfs 1844

R2112 Raphidocelis contorta (Schmidle) Marvan et al. 1984, Kirchneriella contorta var.

elongata (G.M. Smith) Komárek 1979, Kirchneriella contorta (Schmidle) Bohlin

1897

R0811 Scenedesmus Meyen 1829

R0763 Scenedesmus bicaudatus Dedusenko 1925

R0781 Scenedesmus ecornis (Ehrenberg) Chodat 1926

R0806 Scenedesmus quadricauda (Turpin) Brébisson 1835

R0866 Tetrastum komareckii Hindák 1977

29


R1922 Scenedesmus verrucosus Y. van Roll 1925, Scenedesmus disciformis (Chodat)

Fott & Komárek 1960


R0820 Schroederia setigera (Schröder) Lemmermann 1898

R0993 Sphaerocystis schroeteri Chodat 1897, Gloeococcus schroeteri (Chodat)

Lemmermann 1915

R0856 Tetraëdron Kützing 1845

R0848 Tetraëdron minimum (A. Braun) Hansgirg 1888, Tetraëdron quadratum

(Reinsch) Hansgirg 1889

R0843 Tetraëdron caudatum (Corda) Hansgirg 1888

Volvocales

R0923 Carteria Diesing em. France 1893

R0941 Clamydomonas Ehrenberg 1834

R0935 Clamydomonas globosa J. Snow 1902

RXXXX Polytoma cordatum Skvortov

Tetrasporales

R0929 Chlamydocapsa ampla (Kützing) Fott 1972, Gloeocystis ampla Kützing

R0911 Tetrasporales Pasher 1914

R0905 Chlorophyceae Wille 1884

30


CONJUGATOPHYCEAE

Desmidiales

R1176 Closterium aciculare T. West 1860

R1178 Closterium acutum Brébisson 1848

R1181 Closterium acutum var. variabile (Lemmermann) Willi Krieger 1935

R1233 Cosmarium Corda ex Ralfs 1848

R1309 Staurastrum (Meyen) Ralfs 1848

RXXXX Staurastrum pseudosebaldi Wille 1980, Staurastrum manfeldtii var. annulatum

W.et G.S.West 1902

R1413 Staurastrum tetracerum Ralfs 1948

R1282 Staurastrum chaetoceras (Schröder) G. M. Smith 1924

KLEBSORMIDIOPHYCEAE

Klebsormidiales

R0596 Elakatothrix gelatinosa Wille 1898

R0597 Elakatothrix genevensis (Reverdin) Hindák 1962

BACILLARIOPHYCEAE

Centrales

R0017 Actinocyclus normanii (Gregory) Hustedt 1957

R0020 Aulacoseira ambigua (Grunow) Simonsen 1979

R0021 Aulacoseira distans (Ehrenberg) Simonsen 1979

R0038 Cyclostephanos dubius (Hustedt) Round 1982, Stephanodiscus dubius (F. Fricke)

(Hustedt), Cyclotella dubia F. Fricke

31


R0053 Cyclotella (Kützing) Brébisson 1838

R0048 Cyclotella ocellata Pantocsek 1901

R0062 Melosira varians Agardh 1827

Pennales

R0135 Asterionella formosa Hassall 1850

R0335 Navicula Bory de Saint Vincent 1822

R0394 Nitzschia Hassall 1845

CRYPTOPHYCEAE

Cryptomonadales

R1368 Chroomonas acuta Utermöhl 1925

R1394 Cryptomonas Ehrenberg 1832

R1378 Cryptomonas erosa Ehrenberg 1838

R1382 Cryptomonas marssonii Skuja 1948

R1384 Cryptomonas obovata Skuja 1948

R2557 Plagioselmis lacustris (Pascher & Ruttner) Javornick 2001, Rhodomonas lacustris

Pascher & Ruttner 1913, Rhodomonas minuta Skuja

R2162 Plagioselmis nannoplanctica (H. Skuja) G. Novarino, I. A. N. Lucas & Morrall

1994, Rhodomonas minuta var. nannoplanctica Skuja,

CHRYSOPHYCEAE

Synurales

R1109 Mallomonas Perty 1852

R1096 Mallomonas acaroides Perty 1852

32

Fitoplâncton - Lista de Espécies – Albufeira do ALVITO –Amostra B, Junho 2011

R1097 Mallomonas akrokomos Ruttner in Pascher 1913

R1098 Mallomonas akrokomos var. parvula Conrad 1927

DINOPHYCEAE

Peridinales

R1671 Ceratium furcoides (Levander) Langhans 1925

R1672 Ceratium hirundinella (O. F. Muller) Dujardin 1841

Gymnodiniales

R1654 Gymnodinium F.Stein

EUGLENOPHYCEAE

Euglenales

R1721 Euglena oxyuris Schmarda 1846

R1735 Phacus acuminatus Stokes 1885

R1738 Phacus caudatus K. Hübner 1886

R1741 Phacus longicauda (Ehrenberg) Dujardin 1841

R1773 Trachelomonas Ehrenberg 1835

R1776 Trachelomonas volvocina (Ehrenberg) Ehrenberg 1833

R1777 Trachelomonas volvocinopsis Swirenko 1914

R1793 Nanofitoflagelados não identificados

33

Fitoplâncton - Lista de Espécies – Albufeira do Caldeirão–Amostra C, Maio 2011

CYANOPHYCEAE

Chroococcales

R1413 Aphanocapsa delicatissima W. & G. S. West 1912

Nostocales

R1548 Anabaena Bory de Saint Vincent ex Bornet & Flahault 1886

CHLOROPHYCEAE

Chlorococcales

R0550 Crucigenia tetrapedia (Kirchner) W.& G. S. West 1902

R0533 Coenochloris fothii (Hindák) Tsarenko 1990, Eutetramorus fothii (Hindák)

Komárek 1979

R0571 Dictyosphaerium pulchellum Wood 1872

R0705 Oocystis A. Braun 1855

R0699 Oocystis minuta H.C. Guillard Bold & MacEntee 1975

R0716 Pediastrum duplex Meyen 1829

R0725 Pediastrum tetras (Ehrenberg) Ralfs 1844

R0811 Scenedesmus Meyen 1829

R0781 Scenedesmus ecornis (Ehrenberg) Chodat 1926


R0832 Chlorococcales não identificadas

Tetrasporales

R0906 Paulschulzia pseudovolvox (Schulze) Skuja 1948

R0908 Paulschulzia tenera (Korshikov) J.W.G. Lund 1960

34

Fitoplâncton - Lista de Espécies – Albufeira do Caldeirão-Amostra C, Maio 2011

R0912 Tetrasporales Pasher 1914

Volvocales

R0923 Carteria Diesing em. France 1893

R0941 Clamydomonas Ehrenberg 1834

R0935 Clamydomonas globosa J. Snow 1902

R0964 Eudorina Ehrenberg 1831

R0998 Eudorina elegans Ehrenberg 1831

R0980 Polytoma Ehrenberg 1838

RXXXX Polytoma cordatum Skvortzov

R2211 Volvox (Linnaeus) Ehrenberg 1838

R0998 Volvox aureus Ehrenberg 1832

R0905 Chlorophyceae Wille 1884

BACILLARIOPHYCEAE

Centrales

R0020 Aulacoseira ambigua (Grunow) Simonsen 1979; Melosira ambigua (Grunow) O.

Müller

R0023 Aulacoseira granulata (Ehrenberg) Simonsen 1979

R0053 Cyclotella (Kützing) Brébisson 1838

R2060 Discostella stelligera (Cleve & Grunow) Houk & Klee 2004

35

Fitoplâncton - Lista de Espécies – Albufeira do Caldeirão-Amostra B, Maio 2011

Pennales

R0135 Asterionella formosa Hassall 1850

R0223 Fragilaria crotonensis Kitton 1869

R0335 Navicula Bory de Saint Vincent 1822

R0440 Tabellaria fenestrata (Lyngbye) Kutzing 1844

R0442 Tabellaria flocculosa (Roth) Kützing 1844

CRYPTOPHYCEAE

Cryptomonadales

R1368 Chroomonas acuta Utermöhl 1925

R1382 Cryptomonas marssonii Skuja 1948

R1394 Cryptomonas Ehrenberg 1838

R2162 Plagioselmis nannoplanctica (H. Skuja) G. Novarino, I. A. N. Lucas & Morrall

1994, Rhodomonas minuta var. nannoplanctica Skuja,

EUGLENOPHYCEAE

Euglenales

R1773 Trachelomonas Ehrenberg 1835

CHRYSOPHYCEAE

Chromulinales

R1115 Monas M. F . Müller 1773

R1171 Chrysophyceae Pasher

36

ANEXO II - REFERÊNCIAS - IDENTIFICAÇÃO DE FITOPLÂNCTON DE ÁGUA DOCE

Recentes monografias das séries Süβwasserflora von Mitteleuropa compiladas

por A. Pascher e Das Phytoplankton des Süβwassers, segundo G. Huber-

Pestalozzi.

Taxonomia das Chroococcales actualizada segundo Komárek, J. & K.

Anagnostidis (1968).

Taxonomia das Nostocales actualizada de acordo com artigos específicos (e.g.

Komarková-Legnerová & Eloranta 1992).

Taxonomia das Oscillatoriales actualizada segundo Anagnostidis & Komárek

(1988) e Komarková-Legnerová & Cronberg (1992).

Taxonomia das Stigonematales actualizada segundo Anagnostidis & Komárek

(1990).

Anagnostidis, K. & J. Komárek, 1988. Modern approach to the classification system of

Cyanophytes. 3 - Oscillatoriales. Arch. Hydrobiol., Algol. Stud., 50-53: 327-

472.

Anagnostidis, K. & J. Komárek, 1990. Modern approach to the classification system of

Cyanophytes, 5 - Stigonematales. Arch. Hydrobiol., Algol. Stud., 59: 1-73 .

Bourrelly, P. 1966. Les algues d´eau douce. Initiation à la systématique. Tome I : Les

algues vertes. Édition N. Boubée & Cie, Paris, 511pp.

Bourrelly, P. 1968. Les algues d´eau douce. Tome II : Les algues jaunes et brunes.

Édition N. Boubée & Cie, Paris, 440 pp.

Bourrelly, P. 1970. Les Algues d´éau douce. Tome III. Les Algues Bleus et Rouges.

Édition N. Boubée & Cie, Paris, 512 pp.

37

Cleve-Euler, A., 1951. Die Diatomeen von Schweden und Finland. Almquist & Wiksells,

Bokyryckeri, Stockholm, 1580 pp.

Cox, E. J., 1996. Identification of the freshwater diatoms from live material. London,

Chapmann & Hall.

Cronberg, G., Carpenter, E. J. & W. W. Carmichael, 2004. Taxonomy of harmful

cyanobacteria. - In Hallegraff, G. M., Anderson, D. M. & A. D. Cembella,

(eds.), UNESCO, Monographs on Oceanographic Methodology, p. 523-562.

Geitler, L., 1932. Cyanophyceae. Leipzig. In Rabenhorst´s Kryptogamen-Flora 14.

Johnason reprint Corporation, N.Y., 1196 p.

Javornický, P., 2003. Taxonomic notes on some freshwater planktonic Cryptophyceae

based on light microscopy. Hydrobiologia 502 (Dev. Hydrobiol. 172): 271–283.

John, D., Whitton, B. & A. Brook, 2011. The Freshwater Algal Flora of the British Isles.

An Identification Guide to Freshwater and Terrestrial Algae, 2nd ed.,

Cambridge Univ. Press, Cambridge, 878pp + DVD.

Komárek, J. & K. Anagnostidis, 1968. Modern approach to the classification system of

Cyanophytes 2 – Chroococcales. Algol. Stud., 73: 157-226.

Komáreck, J. & K. Anagnostidis, 1989. Modern approach to the classification system of

Cyanophytes. 3 - Nostocales. Arch Hydrobiol. Suppl., 82: 247-345.

Komáreck, J. & H. Kling, 1991. Variation in six planktonic cyanophyte genera in Lake

Victoria (East Africa). Algol. Stud., 61: 21-45.

Komarková-Legnerová, J. & G. Cronberg, 1992. New and recombined filamentous

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