ENGENHARIA BIOQUÍMICA/ BIOQUÍMICA INDUSTRIAL IMOBILIZAÇÃO DE IMOBILIZAÇÃO DE

ENZIMASENZIMAS

DefiniçõesDefinições MétodosMétodos AplicaçõesAplicações

O que são?O que são? Enzimas confinadas podendo ter o seu uso em Enzimas confinadas podendo ter o seu uso em

processos contínuos, possibilidade de processos contínuos, possibilidade de reaproveitamento do catalisador e um aumento da reaproveitamento do catalisador e um aumento da estabilidade da enzima.estabilidade da enzima.

Enzimas imobilizadas

Métodos de imobilização

Os métodos de imobilização de enzimas podem ser Os métodos de imobilização de enzimas podem ser classificados em quatro tipos básicos:classificados em quatro tipos básicos:

Separação por membranasSeparação por membranas Entrelaçamento em PolímerosEntrelaçamento em Polímeros AdsorçãoAdsorção Formação de ligações covalentesFormação de ligações covalentes

Separação por membranasSeparação por membranas

Este método a enzima encontra-se fisicamente separada do Este método a enzima encontra-se fisicamente separada do meio de reação, através de uma película (membrana) meio de reação, através de uma película (membrana) semipermeável, e que por sua vez pode ser subdividida em:semipermeável, e que por sua vez pode ser subdividida em:

EncapsulamentoEncapsulamento Membranas fibrosas semipermeáveisMembranas fibrosas semipermeáveis MicroencapsulamentoMicroencapsulamento Entrelaçamento em Triacetato de celuloseEntrelaçamento em Triacetato de celulose

Entrelaçamento em PolímerosEntrelaçamento em Polímeros

Em linhas gerais consiste no aprisionamento das moléculas Em linhas gerais consiste no aprisionamento das moléculas de enzima entre as malhas de um polímero geliforme, o qual de enzima entre as malhas de um polímero geliforme, o qual é preparado da seguinte maneira: num recipiente adequado é preparado da seguinte maneira: num recipiente adequado são colocados a enzima, um agente bifuncional (por ex., são colocados a enzima, um agente bifuncional (por ex., bisacrilamida) um monômero ( por ex., 2-bisacrilamida) um monômero ( por ex., 2-hidroximetilacrilamida) e uma substância geradora de hidroximetilacrilamida) e uma substância geradora de radicais livres (por ex., persulfato de amônio). Depois de um radicais livres (por ex., persulfato de amônio). Depois de um certo tempo ocorre a gelificação, e em seguida o gel é certo tempo ocorre a gelificação, e em seguida o gel é dividido em partículas de dimensões conhecidas. A dividido em partículas de dimensões conhecidas. A eficiência do entrelaçamento, a permeabilidade do gel e sua eficiência do entrelaçamento, a permeabilidade do gel e sua resistência mecânica dependerão da composição da resistência mecânica dependerão da composição da mistura reagente e da natureza do monômero utilizado.mistura reagente e da natureza do monômero utilizado.

AdsorçãoAdsorção

Este método consiste da união entre a molécula enzimática e Este método consiste da união entre a molécula enzimática e um suporte inerte através de ligações eletrostáticas, um suporte inerte através de ligações eletrostáticas, estabelecidas entre grupos de cargas opostas. É um estabelecidas entre grupos de cargas opostas. É um processo simples, suave e não deletério para a maioria das processo simples, suave e não deletério para a maioria das enzimas, sendo desprezíveis os efeitos difusionais. Os enzimas, sendo desprezíveis os efeitos difusionais. Os suportes para adsorção podem ser orgânicos (derivados da suportes para adsorção podem ser orgânicos (derivados da DEAE-celulose,, Dowex) e inorgânicos (celite, bentonita e DEAE-celulose,, Dowex) e inorgânicos (celite, bentonita e alumina)alumina)

Formação de ligações covalentesFormação de ligações covalentes

A enzima é ligada ao suporte inerte mediante ligações A enzima é ligada ao suporte inerte mediante ligações químicas covalentes, que são, normalmente, estabelecidas químicas covalentes, que são, normalmente, estabelecidas entre os aminogrupos primários e o anel fenólico dos entre os aminogrupos primários e o anel fenólico dos aminoácidos constituintes da enzima com os grupos relativos aminoácidos constituintes da enzima com os grupos relativos do suporte (-CHO; -NCS, dentre outros). Em geral, as do suporte (-CHO; -NCS, dentre outros). Em geral, as reações são feitas em meio aquoso, à temperatura entre 0ºC reações são feitas em meio aquoso, à temperatura entre 0ºC e 25ºC e o pH próximo à neutralidade. A escolha das e 25ºC e o pH próximo à neutralidade. A escolha das condições irá depender da estabilidade da enzima e do condições irá depender da estabilidade da enzima e do suporte frente ao pH de formação das ligações covalentes, suporte frente ao pH de formação das ligações covalentes, assim como da estabilidade das ligações suporte-enzima assim como da estabilidade das ligações suporte-enzima frente ao pH de utilização do sistema imobilizadofrente ao pH de utilização do sistema imobilizado..

Tipos de SuportesTipos de SuportesNa literatura existem inúmeros materiais inertes que Na literatura existem inúmeros materiais inertes que

podem ser usados para imobilizar enzimas. A natureza física podem ser usados para imobilizar enzimas. A natureza física desses produtos pode variar, desde materiais geliformes até desses produtos pode variar, desde materiais geliformes até superfícies sólidas (lâminas de aço, pérolas de vidro, por ex.), superfícies sólidas (lâminas de aço, pérolas de vidro, por ex.), recobertas com alguma substância capaz de interagir com a recobertas com alguma substância capaz de interagir com a enzima. A escolha do método de imobilização e do tipo de enzima. A escolha do método de imobilização e do tipo de suporte dependerá, essencialmente de dois fatores: a) das suporte dependerá, essencialmente de dois fatores: a) das características peculiares da enzima; b) das condições de uso características peculiares da enzima; b) das condições de uso da enzima imobilizada. Dado a variabilidade desses fatores, da enzima imobilizada. Dado a variabilidade desses fatores, pode-se afirmar que não existe um método geral de imobilização pode-se afirmar que não existe um método geral de imobilização e nem sempre um suporte universal. e nem sempre um suporte universal. Geralmente as condições de imobilização para uma dada Geralmente as condições de imobilização para uma dada enzima só poderão ser estabelecidas empiricamente. O enzima só poderão ser estabelecidas empiricamente. O procedimento consiste em se imobilizar a enzima em vários procedimento consiste em se imobilizar a enzima em vários suportes por meio de diferentes métodos, avaliando-se , a suportes por meio de diferentes métodos, avaliando-se , a seguir, a atividade do sistema imobilizado. seguir, a atividade do sistema imobilizado. Logicamente o binômio suporte-método mais adequado será Logicamente o binômio suporte-método mais adequado será aquele que propiciar maior atividade após a imobilização.aquele que propiciar maior atividade após a imobilização.

TIPO DE SUPORTETIPO DE SUPORTE MATERIAISMATERIAIS POROSIDADEPOROSIDADE ESTABILIDADEESTABILIDADE

Não porosoNão poroso Vidro, silica, açoVidro, silica, aço -- AltaAlta

MicroencapsuladoMicroencapsulado Triacetato de celuloseTriacetato de celulose 35 Aº35 Aº ModeradaModerada

EntrelaçadoEntrelaçado Poliacrilamida, PVPPoliacrilamida, PVP VariadaVariada BaixaBaixa

MacroporosoMacroporoso Alumina, silicaAlumina, silica 200 - 1000 Aº200 - 1000 Aº altaalta

TIPO DE SUPORTETIPO DE SUPORTE MÉTODOMÉTODO POROS (Aº)POROS (Aº) (UI/g)(UI/g)

Acetato de celuloseAcetato de celulose EntrelaçamentoEntrelaçamento 0,020,02 4545

PoliacrilamidaPoliacrilamida EntrelaçamentoEntrelaçamento 2,52,5 5050

Pérolas de vidroPérolas de vidro Ligação covalenteLigação covalente 0,2 - 0,10,2 - 0,1 200200

DEAE-Sephadex A25DEAE-Sephadex A25 AdsorçãoAdsorção 0,10,1 650650

Dowex 1X1Dowex 1X1 AdsorçãoAdsorção 0,40,4 820820

DEAE - celuloseDEAE - celulose AdsorçãoAdsorção 0,060,06 42004200

Efeitos causados pela imobilização

Ao se agregar uma enzima a um material inerte, por mais suave que seja o procedimento, é razoável esperar algum tipo de efeito sobre sua atividade catalítica, a qual está intimamente relacionada com a estrutura da macromolécula. Dentre os vários efeitos que a imobilização pode causar salientam-se:

Efeitos estéricos e conformacionais Efeitos do microambiente Efeitos difusionais

Resistências difusionais externasEfeitos difusionais internos

Conclusão

A técnica da imobilização de enzima trouxe como vantagens imediatas a possibilidade de reaproveitamento do catalisador, uso de processos contínuos, e o aumento da estabilidade da enzima.

Por outro lado as desvantagens mais notórias são a aleatoriedade da interação suporte-enzima, a inexistência de um método geral de imobilização e a redução da atividade catalítica devida aos efeitos difunsionais, de microambiente e estéricos/conformacionais.

Contudo demonstrou-se que onde o uso da enzima imobilizada foi possível, os custos de processo diminuíram em pelo menos 50%.

Com o advento da técnica de imobilização foi possível diversificar as aplicações de enzimas, podendo citar:a) Adaptação de reatores químicos convencionais a processos enzimáticos contínuos.b) Eletrodos enzimáticos, dispositivos formados basicamente de um sensor e da enzima imobilizada.c) A técnica para diagnóstico clínico chamado enzimaimunoensaio.d) A latenciação de fármacos através do aprisionamento de enzimas em lipossomas e microcápsulas ou em dispositivos extracorpóreos.