Elizabeth F. Rangel& Ralph Lainson

organizadores

EDITORA~~

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%étodos de Careta e Preservação de 1fehotomíneos

Mauricio L. Vilela, Elizabeth F. Rangel & Ralph Lainson

COLETA DE FLEBOTOMÍNEOS

Para a coleta de flebotomíneos no campo, alguns métodos podem ser empregados, sejautilizando aspiradores de sucção -tubo aspirador ou capturador de Castro IFig. 11- ou mecânicosITrpis, 196811Fig. 21, ou ainda fazendo uso de diferentes tipos de armadilhas. A captura dosinsetos vai depender fundamentalmente dos objetivos estabelecidos de modo prévio à realizaçãoda pesquisa, além do grau de conhecimento sobre a fauna local e da área a ser investigada. Háalguns anos, no intuito de minimizar possíveis riscos de contaminação com a freqüente aspiraçãode insetos nos mais variados hábitats, adaptou-se ao capturador de Castro um pequeno filtro decombustível de motocicleta, acoplado ao tubo de borracha, periodicamente renovado IVilela &.

Rangel, comunicação pessoal I.No entanto, alguns aspectos relacionados com a biologia desses psicodídeos devem ser

considerados quando da realização de atividades no campo. Um deles se refere ao estudo doscriadouros naturais, uma vez que as fêmeas de flebotomíneos, ao realizarem a oviposição, colocamseus ovos isoladamente no substrato, e as formas imaturas se desenvolvem em microambientesterrestres, ricos em material em decomposição, com pouca luminosidade e elevada umidade. Aexecução de atividades no ambiente natural é muito laboriosa, em vista do pequeno tamanho eao tipo de locomoção das formas imaturas no substrato, o que, de certa forma, explica a dificuldadeem se encontrar larvas e pupas em natureza. As contribuições nesse sentido são extremamenteescassas, e as metodologias utilizadas para esse fim podem ser IForattini, 1973):

.exame de amostras de substrato oriundas do campo ao microsc6pio estereosc6pico;

.peneiramento e análise de amostras de substrato, por intermédio de flutuação em soluçãode açúcar para a pesquisa de larvas e pupas;

.avaliação diária, por períodos prolongados, desse tipo de amostras colocadas em recipientesesmaltados recobertos com funis de vidro para a observação da eclosão de adultos IFig. 31.

O estudo mais bem-sucedido para a procura de estágios imaturos de flebotomíneos foidesenvolvido no Panamá, onde 2.258 larvas de 15 espécies foram coletadas em diversos hábitatsnaturais, por meio da técnica de peneiramento e flutuação em solução de açúcar, além da simplesprocura nesses microambientes IHanson, 1961).

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Fleboromíneos do Brasil

Em relação aos abrigos naturais, alguns ambientes podem constituir locais preferenciaispara a procura de flebotomíneos, dentre os quais podemos citar: ocos de árvores; fendas emrochas; raízes tabulares; espaços em troncos de árvores; escavações no solo ou em tocas deanimais; folhas caídas no solo florestal.

Para a captura nesses abrigos são empregadas algumas metodologias, seja através da simplescoleta por meio do tubo capturador de Castro, ou da utilização de aparatos que dependam deatrativos usados em combinação ou não, incluídas, neste caso, as armadilhas de pano, de luz eaquelas que se pode utilizar isca animal.

Dentre as armadilhas de pano usadas para a captura de flebotomíneos em abrigos naturaisdestaca-se a armadilha de Damasceno (Fig. 41, constituída de um cone de pano aberto em umadas faces. Essa armadilha deve ficar suspensa em locais a serem pesquisados como possíveisabrigos naturais. O indivíduo que atua como capturador fica na parte interna da armadilha comum aspirador manual e uma lanterna, para iluminar o local a ser investigado, tendo o cuidado deenvolver o ambiente com a armadilha. Do lado de fora, outra pessoa auxilia mantendo a estruturade pano esticada. O capturador, usando um grave to, remove levemente a entrada do ecótopo ecoleta, por meio do aspirador de sucção, os insetos pousados na parede interna da armadilha.

Outra forma de captura com a mesma armadilha é o uso de pequena quantidade de fumaçaobtida de mechas de algodão queimadas, ou de parte de um cigarro aceso, o que é colocada nointerior do ecótopo, realizando-se, a seguir, o procedimento anterior. Vale ressaltar que a lanternanão apenas auxilia na iluminação, mas seu facho de luz proporciona incômodo aos insetos, o quefaz com que saltitem e sejam capturados mais facilmente.

Alguns autores se serviram de outros métodos para coletar esses psicodídeos em seus abrigosnaturais. Uma armadilha de funis de polietileno de tamanhos distintos, acoplados por meio deuma rolha de cortiça a um tubo de vidro, era disposta sobre a superfície de tocas de animais paracoletar flebotomíneos adultos (Fig. 51 (Chaniotis, 19781. Já em capturas para o estabelecimento decolônia de Lutzomyia shannoni, em ocos de árvores na Ilha de Ossabaw, nos Estados Unidos, foiusada armadilha de funil modificada do método anterior, o qual consistia do mesmo princípio,porém, com uma garrafa plástica fixada ao tubo de vidro, que por sua vez estava preso ao funil poruma tampa (Comer & Com, 19911.

Outra armadilha usada na captura de pequenos dípteros, também continuamente utilizadanas capturas de flebotomíneos adultos, é a AImadilha de Shannon (19391 (Fig. 6). Consiste deuma armação central em forma retangular, com duas superfícies externas igualmente de pano.No campo, a armadilha deve permanecer suspensa e fixada por meio de cordas em quatro pontosamarrados a árvores ou a estacas. Em seu interior podem ser colocados outros atrativos, comofonte de luz, ou em alguns casos, pequenos animais em gaiolas. Nesse caso, considera-se que ohomem também pode funcionar como atrativo, objetivando avaliar a antropofilia. Os insetosatraídos podem ser coletados nas paredes internas, através do tubo aspirador de Castro.

Alguns tipos de armadilhas de pano, como a Malaise (Townes, 1962) e suas modificações,também podem ser utilizadas em capturas de flebotomíneos, entretanto, não constituem armadilhapreferencial dos especialistas (Young & Duncan, 19941.

As armadilhas luminosas são as mais freqüentemente utilizadas pelos especialistas para acoleta de pequenos insetos (Lumsden, 1958; Minter, 1961; Chaniotis & Anderson, 19681, incluídosaí os flebotomíneos. Barretto (19431 comenta que a utilização de armadilhas com fonte luminosatem como objetivo a obtenção de machos, mas em algumas ocasiões, dependendo das espéciescoletadas, pode-se observar a predominância de fêmeas sobre machos em capturas com armadilhasluminosas (Chaniotis & Anderson, 1967, 1968; Williams 1970, 1970a; Chaniotis et aI., 1971;

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Métodos de Coleta

Christensen et ai., 1972; Aguiar et ai., 19851. Em estudos realizados em Belize, foi possível observarque o uso de armadilhas com fonte luminosa constituiu-se suporte bastante útil para a coleta deespécies de flebotomíneos não encontradas com o uso de outras metodologias (Williams, 1970,

1970aj.Um dos tipos de armadilha luminosa mais empregado nas capturas desses dípteros é a

luminosa miniatura do tipo CDC (Fig. 71 (Sudia &. Chamberlain, 19621 e suas modificações.Inicialmente, ela foi desenvolvida para a coleta de mosquitos; apresenta o corpo constituído deacrílico e pode ser alimentada por pilhas, preferencialmente as de longa duração (alcalinas! oupor bateria de motocicletas, com o intuito de manter o pequeno motor que aciona a hélice etambém a fonte luminosa. Sua grande vantagem é que os insetos podem ser transportados vivospara o laboratório, uma vez que o corpo da armadilha está acoplado a uma gaiola de manutençãode flebotomíneos (Fig. 81 (Barraud, 19291. No entanto, apresenta uma desvantagem: dependendoda densidade de insetos na coleta, estes podem ser danificados ou mortos, já que têm queobrigatoriamente transpassar a hélice.

Um outro modelo de armadilha, cujo corpo é feito de um tubo de acn1ico, foi desenvolvidopor Chaniotis &. Anderson (19681 (Fig. 91. Esse modelo utiliza um motor de aeromodelismo paraacionar a hélice. O mesmo é montado na parte superior do corpo da armadilha, assim como afonte luminosa, que fica exposta no centro. Abaixo da luz é colada uma tela de tecido nylon paraque os insetos não ultrapassem essa porção do corpo da armadilha. Na base inferior, no centro,situa-se o orifício por onde os insetos são sugados, em decorrência do vento emitido pela hélice.

Outro tipo de armadilha luminosa empregada para coletar pequenos insetos, usada tambémpara capturar flebotomíneos, é a chamada armadilha Falcão (19811. Esta apresenta alguns fatorespositivos no seu uso: é portátil, resistente e, por ser feita de PVC, proporciona maior concentraçãode luz. O material para sua confecção é de baixo custo. Uma modificação desse último modelo(Fig. 101 foi feita e aspectos práticos da armadilha foram salientados. Estudos comparativosrealizados entre ambas mostrou haver equih'brio em relação ao número de insetos coletados(Aguiar et ai., 1985 I. Já em pesquisas realizadas sobre a fauna de dípteros em área de transmissãode leishmaniose tegumentar, no Vale do Rio Doce, estado de Minas Gerais, foi comparado odesempenho das armadilhas Chaniotis e CDC. Os resultados, apesar de se mostrareminconclusivos, apontam para um melhor desempenho do segundo modelo.

Algumas armadilhas utilizam como atrativo uma isca animal. A de uso mais freqüente nascoletas de flebotomíneos é a armadilha Disney (1966) (Fig. 111, composta de uma superfície lisa,geralmente uma bandeja de alumínio ou aço inoxidável, em cujo centro existe uma aberturaonde é colocada a gaiola que irá abrigar o animal a ser servido de isca para os flebotomíneos; essagaiola é sustentada, na parte inferior, por outra bandeja de menor dimensão, e a área que acircunda é untada em óleo vegetal. Em geral, essa armadilha é colocada no solo. Para evitar oataque de formigas, é apropriado colocá-Ia sobre quatro tocos de madeira ou em pequenas estacasuntadas, também em óleo vegetal. Os insetos atraídos pela isca animal, considerando seucomportamento saltitante, ficam aderidos à superfície recoberta com óleo e, posteriormente, sãoremovidos facilmente com um pincel ao natural. É importante relatar que todo o aparato pode serprotegido por uma cobertura do mesmo material ou por um mesmo plástico ou similar, com oobjetivo de não permitir a exposição, em demasia, à luz e à chuva.

Uma modificação da armadilha Disney foi realizada por Thatcher (19681, que sugere acolocação de duas bandejas concomitantemente, uma na parte superior e outra na inferior; aisca é posta na primeira. As duas bandejas podem ser untadas de óleo ao mesmo tempo, ou emapenas uma delas.

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FlebotomÍneos do Brasil

Utilizando roedores como isca, Ward (19771 desenvolveu uma armadilha do tipo funil {Fig.121, com o objetivo de coletar fêmeas vivas e alimentadas de Lutzomyia flaviscutellata, paracolonizar e realizar semelhantes estudos experimentais. A caixa usada para conter os insetos éidêntica à descrita por Turner &. Hoogstraal (19651, porém, com modificações. A armadilha écomposta por uma estrutura de madeira coberta com tecido de nylon, com entrada cônica dealumínio. O orifício interno do cone tem cerca de dez centímetros e o roedor usado na coleta ésuspenso em uma caixa fixa por meio de gancho de arame na parte interna da entrada da armadilha.A parte inferior é recoberta com uma camada úmida, onde os insetos coletados podem se refugiardurante à noite. No dia seguinte, os flebotomíneos que estão dentro da armadilha são capturadoscom o auxílio do aspirador manual.

Outras armadilhas desenvolvidas para abrigar animais de maior porte como iscas foramdescritas (Roberts, 1965; Schmidtmann et ai., 19801. Entretanto, sua utilização no campo é maisrestrita no que se refere aos flebotomíneos, pois, em alguns casos, nessas circunstâncias, acoleta é realizada por meio de armadilhas luminosas colocadas nos locais destinados a abrigaranimais domésticos, ou então mediante o uso do capturador manual.

Os processos de coletas de flebotomíneos utilizando-se de superfícies adesivas ou feitas depapel ou plástico, e recobertas com óleos, podem ser empregados próximos aos abrigos naturais.Todavia, esse procedimento deve ser mais empregado em áreas de clima seco, uma vez que emregiões de clima quente e úmido essa metodologia pode não apresentar resultados satisfatórios

(Young &. Duncan, 19941.

PRESERVAÇÃO DOS FLEBOTOMÍNEOS

Os insetos coletados no campo, destinados à identificação e estudos taxonômicos, devem serentorpecidos com mechas de algodão embebidas em éter, clorofórmio, ou acetato de etila, vistoque são os métodos mais freqüentemente empregados ou/ ainda, podem ser abatidos em geloseco. Após a morte, os fIebotomíneos podem ser colocados em tubos de hemólise com dois terçosde álcool a 70%/ recobertos por mechas de algodão, com o intuito de não danificar os insetos e,posteriormente, identificados quanto à procedência do materiallSherlock &. Pessoa, 1964). Ostubos de hemólise podem ser substituídos por pequenos frascos de vidro com tampa plásticacontendo álcool a 70%/ já que ambos conservam o material por longa data.

Os procedimentos utilizados para preparação dos fIebotomíneos, objetivando a montagem eposterior identificação, apresentam algumas pequenas variações, dependendo dos autores. Young&. Duncan 119941 preconizam a seguinte técnica, baseada em Young &. Perkins 119841/ utilizada

para montagens permanentes:.colocar os insetos mortos numa soluÇãO de detergente e água a 2%-5%/ por 1 hora ou até

que fiquem completamente amolecidos;.após isso, os insetos são colocados em solução de hidr6xido de sódio INaOHI a 10%-20%/

em água;.aquecer em solução de NaOH até atingir o ponto de ebulição e, posteriormente, deixar

esfriar em temperatura ambiente cerca de 30 minutos a 2 horas;

.transferir os insetos, por meio de estiletes, para uma lâmina de vidro com uma gota de fenola 90%-95%; o lactofenol- uma parte de fenol + 0/75 partes de ácido lático) pode ser usado

como um substituto;

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Métodos de Coleta

.colocar uma gota de bálsamo do Canadá em outra lâmina de vidro e misturar com 2-5 gotasde feno I, colocando alguns especimens na mistura;

.em se tratando de fêmeas, a dissecção é realizada em uma gota da mistura bálsamo doCanadá + fenol, destacando a cabeça e as asas, posicionando as peças bucais e o abdômenna posição dorso-ventral para que possam ser observadas as estruturas internas (cibário eespermatecal; na montagem dos machos, deve-se tomar o cuidado em posicionar a genitáliade forma que as estruturas fiquem expostas e possam ser visualizadas;

.cobrir o espécime com uma lamínula de vidro e deixar secar horizontalmente.

Uma outra preparação dos flebotomíneos -vale salientar que os meios usados nessametodologia são para montagens temporárias -pode ser realizada mediante a seguinte técnica:

.os insetos são colocados em pequenas placas de Petri, numa solução de hidróxido de potassa(KOHI a 10%, onde permanecem entre 2-3 horas, para que haja o amolecimento da quitina;

.após esse período são transferidos para outras placas de Petri com ácido acético, por umperíodo de 15-20 minutos, para retirar o excesso de hidróxido de potassa;

.a seguir, lava-se em água destilada por 20 minutos;

.os insetos permanecem em lactofenol por 24 horas, para diafanizar;

.em seguida são montados entre lâmina e lamínula, em líquido de Berlese, e as lâminascolocadas para secar horizontalmente.

Após realizar os procedimentos de preparação e montagem, em ambas as técnicas, as lâminasmontadas são levadas ao microscópio bacteriológico para identificação.

DISSECÇÃO DOS FLEBOTOMÍNEOS VIVOS

Os insetos provenientes do campo, com o objetivo de se realizar a procura de formas flageladas,são dissecados por meio de estiletes, em lâmina de vidro, em uma gota de soluÇão salina a 0,85 %contendo anticontaminantes, e posteriormente recobeno por uma lamínula de vidro. É importanteressaltar que todo o material deve ser esterilizado previamente, com o intuito de não possibilitara proliferação de bactérias ou fungos.

Os procedimentos mencionados são encontrados de forma detalhada em Lainson (19971.

ALGUMAS FORMULAÇOES USADAS NA PREP ARAÇÁO DOS FLEBOTOMÍNEOS

Líquido de Berlese:

Hidrato de cloral- 74 g

Goma arábica -8 g

Agua destilada -10 ml

Xarope de glicose -5 ml

Acido acético cristalizável- 3 ml

Líquido de Berlese (modificado por Lee Ryanj:

Hidrato de cloral- 20 g

Goma arábica -12 g

Água destilada -35 ml

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Flebotomíneos do Brasil

Xarope de glicose -5 rol

Ácido acético cristalizável- 5 rol

Preparo:

colocar o hidrato de cloral em um Becker de 500 ml e adicionar a água destilada.Acrescentar goma arábica em pó e misturar. Em seguida, adicionar xarope de glicose eo ácido acético. Misturar e aquecer gradualmente sem permitir que a mistura ferva,para que dissolva ao máximo a goma arábica em pó. Posteriormente, filtre toda a misturaem papel-filtro e deixe em repouso por 24 horas até posterior utilização.

Lactofenol:

Fenol cristalizado -100 g

Ácido lático -100 g

Glicerina -200 ml

Água destilada -200ml

Preparo: Misturar todos os componentes, iniciando pelo fenol cristalizado, para em seguidaadicionar o ácido lático, a glicerina e a água destilada.

Figura 1 -Capturador manual de Castro

Foto: Mechas R, 2000.

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Métodos de Coleta

Figura 2 -Capturador mecânico

Foto: Trpis M., 1968.

Figura 3 -Metodologia utilizada para identificação de criadouros de flebotomíneos

Foto: Aguiar GM, 1991

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Flebotomíneos do Brasil

Fi~ura

4 a, b -Armadilha Damasceno

roto:

Aguiar GM, 1991.

Fi~ura

4 a, b -Armadilha Damasceno

Métodos de

Armadilha para coletas de adulabrigos naturais

aniotis BN &. Anderson JR

Armadilha de Shannonigura 6

to:

Souza NA, 1997.

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Flebotomfneos do Brasil

Figura 7 -Armadilha luminosa CDC

Foto: Souza NA, 1997.

Figura 8 -Am1adilha luminosa CDC com gaiolapara transporte de flebotomíneosvivos

Foto: Souza NA, 1997.

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Métodos de Coleta

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Flebotomíneos do Brasil

Figura 10 -Armadilha luminosa Falcão modificado

Foto: Aguiar et alo, 1985.

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Métodos de Coleta

Figura -Armadilha Disney

fll!(): AgUl.U, (l}l).!

Figura 12 ~ Armadilha par3 colet3 dc flcbotomíncos

Foto: Ward, 1977.

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Flebotomíneos do Brasil

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