UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO

NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA

ELDON CARLOS QUERES GOMES

DIVERSIDADE E BIOPROSPECÇÃO DE FUNGOS PRESENTES EM SOLOS

ANTÁRTICOS

Orientador: Prof. Dr. Luiz Henrique Rosa

Coorientadora: Profa. Dra. Valéria Martins Godinho

OURO PRETO

MINAS GERAIS - BRASIL

2017

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO

NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA

ELDON CARLOS QUERES GOMES

DIVERSIDADE E BIOPROSPECÇÃO DE FUNGOS PRESENTES EM SOLOS

ANTÁRTICOS

Dissertação apresentada à Universidade

Federal de Ouro Preto, como parte das

exigências do Programa de Pós-Graduação

em Biotecnologia, para obtenção do título de

Mestre em Biotecnologia, área de

concentração Biotecnologia Industrial.

OURO PRETO

MINAS GERAIS – BRASIL

3

2017

i

Catalogação: www.sisbin.ufop.br

Q35d Queres, Eldon Carlos Gomes. Diversidade e bioprospecção de fungos presentes em solos Antárticos

[manuscrito] / Eldon Carlos Gomes Queres. - 2017. 66f.: il.: color; grafs; tabs; mapas.

Orientador: Prof. Dr. Luiz Henrique Rosa. Coorientadora: Profª. Drª. Valéria Martins Godinho.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia.

Área de Concentração: Biotecnologia Industrial.

1. Biotecnologia. 2. Fungos . 3. Fungos do solo. 4. Solos . 5. Microbiologia. I. Rosa, Luiz Henrique . II. Godinho, Valéria Martins . III. Universidade Federal de Ouro Preto. IV. Titulo.

CDU: 606

ii

iii

"Porque Deus tanto amou o mundo que deu o seu Filho Unigênito, para que todo o que nele

crer não pereça, mas tenha a vida eterna. ” João 3:16

"Vocês são o sal da terra. Mas se o sal perder o seu sabor, como restaurá-lo? Não servirá para

nada, exceto para ser jogado fora e pisado pelos homens.

Vocês são a luz do mundo. Não se pode esconder uma cidade construída sobre um monte.

E, também, ninguém acende uma candeia e a coloca debaixo de uma vasilha. Pelo contrário,

coloca-a no lugar apropriado, e assim ilumina a todos os que estão na casa.

Assim brilhe a luz de vocês diante dos homens, para que vejam as suas boas obras e

glorifiquem ao Pai de vocês, que está nos céus". Mateus 5:13-16

iv

COLABORAÇÕES

Dr. Carlos Augusto Rosa

Laboratório de Taxonomia, Biodiversidade e Biotecnologia de Leveduras

Departamento de Microbiologia da Universidade Federal de Minas Gerais

Dr. Carlos Leomar Zani

Dra. Tânia Maria de Almeida Alves

Dra. Jaquelline Germano de Oliveira

Dra. Silvane Maria Fonseca Murta

Dr. Policarpo Ademar Sales Junior

Centro de Pesquisa René Rachou – Fiocruz (BH)

Dr. Fábio Soares de Oliveira

Laboratório de Geomorfologia

Departamento de Geografia, Universidade Federal de Minas Gerais

v

AGRADECIMENTOS

Certamente não poderia deixar de agradecer a Deus por sua Graça, amor e paciência

para comigo ao longo dos anos. Acima de todos e de tudo, dedico esse trabalho a Ele.

A minha família, que me apoia como sempre, nem sempre sabendo do tamanho dos meus

passos, mas sempre incentivando e divulgando a Biotecnologia!

A minha igreja, Batista Nacional da Esperança que me incentivou e compreendeu esses

momentos de ausência, sou muito grato a todos vocês!

Aos meu eternos e grandes amigos, Joselma e Henrique, vocês foram e serão minhas

referências, mesmo a distância e na correria da vida é como se nós estivéssemos sempre perto,

afinal de contas, somos em grupo ou individualmente o Dinamus! Sou fruto desse projeto!!!

Algumas pessoas foram excepcionalmente importantes ao longo desses dois anos, vamos

a lista:

Ao Prof. Luiz Rosa, que me confiou uma grande missão, um projeto totalmente desafiador e

diferente de tudo que eu já tinha feito, esse projeto despertou o pesquisador que sempre me

motivou e com toda certeza, continuará me motivando ao longo de toda minha vida

acadêmica, Luiz você contribuiu muito para isso!!

Á Profa. Valéria Godinho, pela coorientação, dedicação, pelas madrugadas corrigindo meus

textos, pelos sábados, domingos e feriados, por me ouvir nos problemas gerais que surgiam,

propondo ou não soluções, por me fazer pensar, pelos conselhos, VAL você foi essencial,

muito obrigado!!

As antigas ICS, hoje Biólogas (Maria Theresa, Débora, Bárbara, Gislaine), os resultados desse

trabalho, reflete a dedicação de vocês!

Ao #boratime, que nas madrugas loucas de produção de artigos e resumos contribuíram

grandemente comigo, nessas horas, vejo que fomos mais que colegas de laboratório, minha

enorme gratidão!

vi

Aos meus Professores da Graduação (Daniela Chemim e Raquel Alvarenga) e Myriam

Morato, por me ajudar e muito na época da seleção do Mestrado, vocês são minhas

referências, obrigado!

A toda equipe dos Endofíticos, em especial a Zé e Camila, obrigado!

Ao Centro de Pesquisas René Rachou – FIOCRUZ BH (Zani, Tânia, Fátima, Alisson,

Policarpo, Emerson), pelas portas abertas e pela contribuição que fez a diferença!

Aos colegas do LSBF e LTBBL que me receberam muito bem e que proporcionaram horas de

divertimento nos aniversariantes do mês e nas festas.

Ao Prof. Fábio, que enriqueceu esse trabalho com análises extremamente importantes.

Ao Prof. William Borges da UFOP (Biotecnologia), que sempre foi muito receptivo e me

incentivou a entrar para o programa de Pós-graduação em Biotecnologia.

A Universidade Federal de Ouro Preto, por toda a estrutura física, professores, ao programa

de Pós-graduação em Biotecnologia, em especial ao Josino que me ajudou muito no

relacionamento UFOP-UFMG e nas dúvidas administraticas que foram surgindo.

À Universidade Federal de Minas Gerais e ao Departamento de Microbiologia pelo apoio

acadêmico e institucional, a FAPEMIG, CNPq, PROANTAR, Marinha Brasileira pelo apoio

logístico na realização desse projeto.

vii

SUMÁRIO

COLABORAÇÕES ................................................................................................................ iv

AGRADECIMENTOS ........................................................................................................... v

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS .................................................................. viii

LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................ xi

LISTA DE TABELAS.......................................................................................................... xiii

RESUMO .............................................................................................................................. xiv

ABSTRACT ........................................................................................................................... xv

1 INTRODUÇÃO, RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA .................................................................................. 1

2 REVISÃO DA LITERATURA .......................................................................................................................... 2

2.1 ANTÁRTICA ........................................................................................................................................................ 2 2.1.1 Diversidade de fungos na Antártica ............................................................................................................... 3 2.2 ESTUDO DOS SOLOS ANTÁRTICOS ....................................................................................................................... 4 2.2.1 Classificação dos solos .................................................................................................................................. 4 2.3 BIOTECNOLOGIA DE MICRO-ORGANISMOS E FUNGOS DA ANTÁRTICA ................................................................. 5

3 OBJETIVOS ....................................................................................................................................................... 7

3.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................................................................... 7 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................................................................................... 7

4 MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................................................................. 8

4.1 ÁREA DE ESTUDO ................................................................................................................................................ 8 4.2 PROCESSAMENTO, ISOLAMENTO, PURIFICAÇÃO E PRESERVAÇÃO DAS AMOSTRAS .............................................. 9 4.3 IDENTIFICAÇÃO DOS ISOLADOS ......................................................................................................................... 10 4.3.1 Fungos filamentoso e leveduras ................................................................................................................... 10 4.4 EXTRAÇÃO DNA TOTAL ................................................................................................................................... 11 4.4.1 Fungos filamentosos .................................................................................................................................... 11 4.4.2 Leveduras ..................................................................................................................................................... 12 4.5 OBTENÇÃO DOS AMPLICONS ............................................................................................................................. 12 4.5.1 Amplificação utilizando o iniciador (GTG)5 ................................................................................................ 12 4.5.2 Amplificação da região ITS utilizando os iniciadores ITS-1 e ITS-4 ........................................................... 13 4.5.3 Amplificação do gene de β-tubulina ............................................................................................................ 14 4.5.4 Amplificação da RNA polimerase II ............................................................................................................ 14 4.5.5 Amplificação utilizando iniciadores NL-1 e NL-4 ....................................................................................... 15 4.6 PURIFICAÇÃO DOS PRODUTOS DE PCR.............................................................................................................. 15 4.7 REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO E PRECIPITAÇÃO DAS AMOSTRAS ..................................................................... 16 4.8 ANÁLISES COMPUTACIONAL DAS SEQUÊNCIAS ................................................................................................. 16 4.9 DIVERSIDADE DA COMUNIDADE FÚNGICA: CÁLCULO DOS ÍNDICES DE ABUNDÂNCIA, RIQUEZA E DOMINÂNCIA 17 4.10 CULTIVO DOS FUNGOS E PREPARO DOS EXTRATOS ......................................................................................... 20 4.10.1 Determinação da atividade leishmanicida ................................................................................................. 20 4.10.2 Determinação da atividade tripanossomicida ............................................................................................ 21 4.10.3 Determinação de atividade para Dengue vírus sorotipo 2 e Zika vírus ..................................................... 22 4.10.4 Determinação de atividade herbicida ........................................................................................................ 23

5 RESULTADOS ................................................................................................................................................. 24

5.1 COLETA, ISOLAMENTO, IDENTIFICAÇÃO E DIVERSIDADE DE FUNGOS ................................................................ 24 5.2 ANÁLISES QUÍMICAS DO SOLO .......................................................................................................................... 31 5.3 ENSAIOS LEISHMANICIDA, TRIPANOSSOMICIDA, ANTIVIRAL E HERBICIDA ........................................................ 33

6 DISCUSSÃO ..................................................................................................................................................... 36

6.1 DIVERSIDADE ................................................................................................................................................... 36 6.1.1 Bioprospecção ............................................................................................................................................. 38

7 CONCLUSÕES ................................................................................................................................................. 39

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................................................ 41

viii

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

ºC: Graus Celsius

%: Por cento

ABI: Applied Biosystems

ABS: Absorbância

BDA: Ágar Batata Dextrose

BLAST: Basic Local Alignment Search Tool

BLASTn: Nucleotide Basic Locus Alignment Search Tool

BOD - Demanda Bioquímica de Oxigênio

BSA: Soro Fetal Bovino

CIM: Concentração Inibitória Mínima

CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute

Cm: Centímetro

CMOLC: Centimol de carga

CPRG: Cloreto de β-D-galactopiranósido vermelho de clorofenol

CPqRR/FIOCRUZ: Centro de Pesquisa René Rachou/Fundação Oswaldo Cruz

CTAB: Brometo de Cetil Trimetilamônio

D1/D2: Região da Subunidade Maior do rRNA

DAG: Decagrama

DENV-2: Dengue vírus sorotipo 2

DG18: Ágar Dicloran-Glicerol

Dm3: Decímetro cúbico

DMSO: Demetilsulfóxido

DNA: Ácido Desoxirribonucléico

dNTP: Desoxirribonucleotídeos trifosfato

DRBC: Agar Dicloran Rosa Bengala Cloranfenicol Base

EACF: Estação Antártica Comandante Ferraz

EC50: Concentração eficaz em que o fármaco produz 50% de sua resposta máxima

ECP: Efeito citopático peculiar

EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético

EX: Extrato

g: Grama

g/L: Grama por litro

ix

GPS: Global Positioning System

GYMP: Glucose-Yeasts Extract-Malt Extract-Fosfato de Potássio

h: Horas

IAATO: International Association of Antarctica Tour Operators

IC50: Concentração Inibitória capaz de matar 50% dos parasitos

ICB: Instituto de Ciências Biológicas

ITS1-5.8S-ITS2: Região Transcrita Interna do Gene do rRNA

Kg: Quilogramas

Km2: Quilômetro Quadrado

Km: Quilômetro

L929: Linhagem celular de Fibroblastos em camundongos

L: Litro

LSBF: Laboratório de Sistemática e Biomoléculas de Fungos

m: Metro

m2: Metro quadrado

mg: Miligrama

mg/mL: Miligrama/mililitro

mL: Mililitro

mm: Milímetros

mM: Milimolar

MOPS: Ácido morfolinepropano sulfônico

MTT: Metil Tiazolil Tetrazólio

ng: Nanograma

nm: Nanômetro

μL: Microlitros

μg/mL: Micrograma/mililitro

μg: Micrograma

μm: Micrômetro

μmol: Micromol

MgCl2: Cloreto de Magnésio

NCBI: National Center for Biotechnology Information

NaCl: Cloreto de sódio

PA: Para Análise

PCR: Reação em cadeia da polimerase

x

pH: Potencial Hidrogeniônico

pmol: Picomol

PROANTAR: Programa Antártico Brasileiro

p/v: Peso por volume

Q.S.P: Quantidade suficiente para

R.P.M.: Rotações por minuto

rDNA: Ácido desoxirribonucleico ribossomal

RNA: Ácido Ribonucléico

rRNA: RNA ribossomal

rpm: Rotações por minuto

RPMI: Meio de cultura com glutamina, sem bicarbonato e com indicador vermelho de fenol

s: Segundo

S: Latitude Sul

SDS: Dodecil sulfato de sódio

SI: Índice de Seletividade

TBE: Tris borato

TE: Tampão Tris-EDTA

TRIS: 2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol

U: Unidade

UFC: Unidade formadora de colônia

UFMG: Universidade Federal de Minas Gerais

V: Volts

V: Volume

v/v: Volume por volume

W: Longitude Oeste

W: Longitude

YM: Ágar extrato de malte-extrato de levedura

xi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Complexo de Ilhas Shetland do Sul na Península Antártica (Google, 2017)......8

Figura 2. Aspecto geral dos ambientes de coleta de amostras superficiais de solos, sendo A –

área costeira sob stack vulcânico crioclastado no interior de terraços marinhos (Coppermine);

B – Vertentes recobertas por cinzas vulcânicas oxidadas com afloramento de rochas intrusivas

(Pinguim); C – vertentes recobertas por cinzas vulcânicas com caimento para a área costeira

(Pinguim) e D – Base de talus em área de rochas andesiticas ricas em sulfetos (Yellow Point,

Rei George)...............................................................................................................................19

Figura 3. (a) percentual de isolados por ilha e (b) percentual de fungos filamentosos e

leveduras...................................................................................................................................24

Figura 4. Análise filogenética das sequências de fungos (em negrito) a partir de amostras de

solo da Península Antártica em comparação com as sequências tipo das espécies mais

próximas após a análise no BLASTn, depositadas na base de dados GenBank. As árvores (a –

f) foram construídas com base nas sequências da região ITS por meio do parâmetro composto

máximo de Likelihood. As sequências de Mucor circinelloides (NR126116) e Aspergillus

glaucus (AY373887) foram utilizadas como out group (OG)..................................................27

Figura 5. Análise filogenética das sequências de fungos (em negrito) a partir de amostras de

solo da Península Antártica em comparação com as sequências tipo das espécies mais

próximas após a análise no BLASTn, depositadas na base de dados GenBank. As árvores (g –

i) foram construídas com base nas sequências da região ITS por meio do parâmetro composto

máximo de Likelihood. As sequências de Mucor circinelloides (NR126116) e Aspergillus

glaucus (AY373887) foram utilizadas como out group (OG).................................................28

Figura 6. Análise filogenética das sequências de fungos (em negrito) a partir de amostras de

solo da Península Antártica em comparação com as sequências de tipo das espécies mais

próximas após análise BLAST, depositadas no banco de dados GenBank. As árvores (a – f)

foram construídas com base na região D1/D2 por meio do parâmetro composto máximo de

Likelihood. A sequência de Kluyveromyces lactis (AY497689) foi usada como out group

(OG)..........................................................................................................................................29

Figura 7. Análise filogenética das sequências de fungos (em negrito) a partir de amostras de

solo da Península Antártica em comparação com as sequências de tipo das espécies mais

próximas após análise BLAST, depositadas no banco de dados GenBank. A árvore foi

construída com base nos fragmentos gênicos do gene da β-tubulina por meio do parâmetro

composto máximo de Likelihood. A sequência de Mucor circinelloides (KT207682) é usada

como out group (OG)...............................................................................................................30

Figura 8. Análise filogenética das sequências de fungos (em negrito) a partir de amostras de

solo da Península Antártica em comparação com as sequências de tipo das espécies mais

próximas após análise BLAST, depositadas no banco de dados GenBank. A árvore foi

construída com base nas sequências do fragmento gênico da RNA polimerase II por meio do

parâmetro composto máximo de Likelihood. A sequência de Mucor irregularis (JX976280) é

usada como out group (OG)......................................................................................................30

xii

Figura 9. Dendrograma mostrando a similaridade de Sorensen entre as comunidades de

fungos obtidas dos solos das diferentes ilhas da Península Antártica. Pinguim P = solo preto;

Pinguim V = solo vermelho…………………………………………………………………..33

xiii

LISTA TABELAS

Tabela 1. Localização geográfica dos pontos de coleta.............................................................8

Tabela 2. Informações sobre os pontos de coleta dos solos antárticos......................................9

Tabela 4. Fungos obtidos a partir dos solos da Antártica e identificados por meio da

comparação de suas sequências utilizando o programa BLASTn e o banco de dados do NCBI

GenBank....................................................................................................................................25

Tabela 3. Parâmetros físico-químicos e diversidade do conjunto de fungos em solos de

diferentes ilhas antárticas..........................................................................................................32

Tabela 5. Atividades biológicas dos extratos obtidos das espécies de fungos isoladas do solo

da Antártica...............................................................................................................................34

Tabela 6. Atividade herbicida dos extratos obtidos das espécies de fungos isoladas do solo da

Antártica....................................................................................................................................35

xiv

RESUMO

A complexidade do ambiente antártico, associado as condições ambientais extremas

como alta incidência de radiação ultravioleta, extremos de temperatura, fortes ventos, baixa

disponibilidade de água e nutrientes, tornam a Antártica um laboratório de campo para o

estudo de comunidades microbianas. Neste trabalho, relatamos a diversidade de fungos

presentes em diferentes solos amostrados em quatro ilhas da Antártica. Foram obtidos 218

isolados fúngicos (203 fungos filamentosos e 15 leveduras), os quais foram identificados por

meio de técnicas de biologia molecular em táxons pertencentes aos filos Zygomycota,

Ascomycota e Basidiomycota. Os gêneros Mortierella, Antarctomyces e Penicillium foram os

que alcançaram as maiores densidades em UFC g-1. Pseudogymnoascus destructans,

Pseudogymnoascus verrucosus, Penicillium tardochrysogenum, Goffeauzyma gilvescens e

Mortierella sp. foram as espécies mais abundantes. Os solos antárticos apresentaram uma

comunidade de fungos moderada em termos de diversidade (Fisher-α), riqueza (Margalef) e

dominância (Simpson) das espécies. Sete isolados se destacaram em termos de bioatividade

(cinco P. destructans, um M. parvispora e um P. chrysogenum) e foram capazes de inibir

seletivamente formas amastigotas intracelulares de Trypanosoma cruzi com valores

percentuais próximos ao da droga controle. O melhor resultado foi para o extrato de P.

chrysogenum UFMGCB 10240, o qual apresentou o maior índice de seletividade e a melhor

concentração inibitória a 50% (IC50) frente ao parasito. Dezoito extratos fúngicos

apresentaram atividade herbicida, dos quais sete isolados (cinco de P. destructans e dois de P.

tardochrysogenum) apresentaram os resultados mais siginificativos quanto a inibição das

sementes de Allium schoenoprasum; frente a Lactuca sativa, os resultados mais significativos

foram de um extrato de P. destructans e um de Mortierella sp. Na amostra de solo da Ilha

Nelson foi detectada a presença da levedura Saccharomyces cerevisiae, resultado este que

representa um importante achado, pois a distribuição geográfica desta levedura até o momento

não incluia a Antártica. Os isolados antárticos de Saccharomyces cerevisiae podem

representar candidatos para utilização de processos de fermentação em baixas temperaturas,

pois foram obtidas de uma região constantemente fria do planeta. Os resultados deste trabalho

indicam que os solos da Península Antártica abrigam espécies de fungos cosmopolitas

adaptadas ao frio, endêmicas e táxons específicos com capacidade de produção de substâncias

bioativas contra doenças tropicais negligenciadas e propriedades herbicidas para uso na

agricultura.

xv

ABSTRACT

The complexity of the Antarctic environment, associated with extreme environmental

conditions such as high incidence of ultraviolet radiation, extremes of temperature, strong

winds, low availability of water and nutrients, make Antarctica a field laboratory for the study

of microbial communities. In this work, we report the diversity of fungi present in different

soils sampled in four islands of Antarctica. A total of 218 fungal isolates (203 filamentous

fungi and 15 yeasts) were obtained, which were identified by molecular biology techniques in

taxa belonging to the Zygomycota, Ascomycota and Basidiomycota phyla. The genera

Mortierella, Antarctomyces and Penicillium were the ones that reached the highest densities

in CFU g-1. Pseudogymnoascus destructans, Pseudogymnoascus verrucosus, Penicillium

tardochrysogenum, Goffeauzyma gilvescens and Mortierella sp. were the most abundant

species. Antarctic soils presented a moderate fungal community in terms of diversity (Fisher-

α), richness (Margalef) and dominance (Simpson) of the species. Seven isolates stood out in

terms of bioactivity (five P. destructans, one M. parvispora and one P. chrysogenum) and

were able to selectively inhibit intracellular amastigote forms of Trypanosoma cruzi with

percentage values close to control drug. The best result was for the extract of P. chrysogenum

UFMGCB 10240, which had the highest selectivity index and the best 50% inhibitory

concentration (IC50) against the parasite. Eighteen fungal extracts presented herbicide activity,

of which seven isolates (five of P. destructans and two of P. tardochrysogenum) showed the

most significant results regarding the inhibition of Allium schoenoprasum seeds; In contrast to

Lactuca sativa, the most significant results were from an extract of P. destructans and one

from Mortierella sp. In the soil sample of Nelson Island the presence of the yeast

Saccharomyces cerevisiae was detected, an important finding because the geographical

distribution of this yeast to date did not include Antarctica. Antarctic isolates of

Saccharomyces cerevisiae may represent candidates for the use of fermentation processes at

low temperatures, since they were obtained from a constantly cold region of the planet. The

results of this work indicate that the soils of the Antarctic Peninsula shelter species of cold

adapted, endemic, cosmopolitan fungi and specific taxa with capacity to produce bioactive

substances against neglected tropical diseases and herbicidal properties for use in agriculture.

1

1 INTRODUÇÃO, RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA

A Antártica possui cerca de 14 milhões de km2, extensão equivalente a aproximadamente

1,6 vezes a área total do Brasil, e abriga diferentes animais, plantas e micro-organismos. O

continente Antártico está entre os lugares mais extremos e isolados do planeta e quase em sua

totalidade inserido dentro do círculo polar Antártico, tornando os meses de verão um dia

permanente e o inverno uma noite longa. A complexidade do ambiente e das diferentes

comunidades de seres vivos que habitam a Antártica, associado as condições ambientais

extremas, como alta incidência de radiação ultravioleta, extremos de temperatura, fortes

ventos, baixa disponibilidade de água e nutrientes, tornam a região um laboratório de campo

para o estudo de comunidades microbianas.

Os fungos representam um grupo diversificado de micro-organismos com alta

capacidade de adaptação a diferentes condições em ambientes tropicais, temperados e polares

(Ruise et al., 2006). Nas condições extremas da Antártica diferentes espécies de fungos já

foram descritas em diferentes substratos tais como plantas, solo, rochas, gelo, animais (Meyer

et al., 1967; Frate e Carreta, 1990; Ruisi et al., 2006) e neve (de Menezes et al., 2017).

A biotecnologia aplicada a ambientes extremófilos, neste caso a Antártica, vem sendo

ampliada através de estudos siguinificativos como demostra de Menezes et al., (2017), Rosa

et al., (2009), Loque et al., (2010), Rosa et al., (2010), Gonçalves et al., (2012), Godinho et

al. (2013 e 2015), Furbino et al. (2014), Alves (2017), essa aplicação biotecnológica, pode ser

utilizada para o desenvolvimento de novos fármacos através de características únicas de

fungos antárticos.

Apesar das diversas condições extremas da Antártica, os fungos representam um grupo

diversificado com preponderante papel ecológico nos ambientes terrestres e marinhos da

região. Dentre os diferentes substratos já analisados quanto a presença de fungos, os solos da

Antártica foram os mais estudados. Entretanto, a caracterização e avaliação destas

comunidades fúngicas quanto a capacidade de produzir substâncias bioativas ainda é

incipiente.

2

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Antártica

Com uma extensão aproximada de 14 milhões de km2, a Antártica corresponde a cerca

de 10% de toda a superfície terrestre (Brasil, 2006) e possui características únicas para

manutenção do sistema climático terrestre. A Antártica geralmente é dividida em marítima

(compreende as ilhas: Sandwich do Sul e Shetland do Sul) e continental (continente e a costa

leste da Península (Tatur, 1989). O interesse científico no continente Antártico surgiu no

século XIX e se intensificou no século XX, período que foram instaladas cinco estações de

pesquisas (Brasil, 2017). Atualmente, 30 de países mantêm mais de 70 estações científicas na

Antártica (Bischoff, 1996).

O Tratado da Antártica foi assinado em 1959 e está em vigor desde 1961, o que

representa um marco histórico mundial. O acordo foi fechado inicialmente com 12 países

signatários (Argentina, Austrália, Bélgica, Chile, França, Japão, Nova Zelândia, Noruega,

África do Sul, Rússia, Inglaterra e Estados Unidos da América); o Brasil foi adicionado

posteriormente em 1975 (Iaato, 2017).

Este documento estabeleceu o uso de todo o território para fins pacíficos e para

cooperação internacional na pesquisa científica. Em 2008, o total de nações que aderiram ao

tratado aumentou e sendo incluída: Áustria, Bielorrússia, Bulgária, Canadá, China, Colômbia,

Coreia, Cuba, Dinamarca, Equador, Eslováquia, Espanha, Estônia, Finlândia, Grécia,

Guatemala, Holanda, Hungria, Índia, Itália, Mônaco, Papua-Nova Guiné, Peru, Polônia,

República Checa, Romênia, Suécia, Suíça, Turquia, Ucrânia, Uruguai e Venezuela (Iaato,

2017; Sta, 2017).

A Antártica é conhecida pelas suas condições abióticas extremas (Ruisi et al., 2006;

Brunati et al., 2009) como ventos que podem atingir 327 km/h, altitude média de 2,3 mil m,

temperatura média de -60 ºC. Por longos anos a temperatura mais baixa registrada foi de -89,2

ºC na estação Russa em 21 de julho de 1983 (Brasil, 2017).

Após o acompanhamento das temperaturas registradas ao longo dos anos, em 10

agosto de 2010 no Platô Antártico Oriental houve um novo recorde, a NASA registrou a

menor temperatura de todos os tempos, chegando a -93,2 ºC (Nasa, 2013). A Antártica possui

3

ainda um manto de gelo com quase 5 km de espessura, formado por um mar congelado de 2,7

milhões de km2 no verão e 22 milhões de km2 no inverno (Brasil, 2006).

É caracterizada por ciclos de congelamento e degelo sucessivos, alta incidência de

radiação ultravioleta, solos oligotróficos, baixa disponibilidade de água e precipitação anual

(Ruisi et al., 2006; Onofri et al., 2007; Shivaji e Prasad, 2009). Mesmo com essas

características, a Antártica abriga diversas forma de vida como mamíferos, aves, plantas e

micro-organismos (Ruisi et al., 2006; Rosa et al., 2009).

2.1.1 Diversidade de fungos na Antártica

Considerando as condições extremas, a biodiversidade na Antártica é elevada, pois os

micro-organismos contribuem para essa diversificação. Segundo Onofri (1999), os micro-

organismos representam uma das principais fontes de diversidade biológica nos diferentes

ecossistemas da Antártica. Dentro da comunidade microbiana antártica, os fungos se

sobressaem pela capacidade adaptativa as condições extremófilas, tendo como vantagem a

capacidade de colonizar diversos substratos, além da sua facilidade de dispersão e colonização

com baixo gasto de energia metabólica (Ruisi et al., 2006).

As principais comunidades de fungos encontrados no ecossistema antártico incluem

espécies dos filos Chytridiomycota, Zygomycota, Glomeromycota, Ascomycota e

Basidiomycota (Ruisi et al., 2006; de Menezes et al., 2017). Os substratos/habitats estudados

na Antártica compreendem rochas, solos, neve, gelo, plantas, água e sedimento de lagos,

macroalgas, sedimentos marinhos (Rosa et al., 2009; Loque et al., 2010; Rosa et al., 2010;

Gonçalves et al., 2012; Godinho et al., 2013; Furbino et al., 2014; Alves, 2017). Em termos

gerais cerca de mil espécies de fungos não-liquenizados já foram descritos para Antártica

(Bridge et al., 2008; Alves, 2017), os quais compreendem aqueles com características

psicrofílicas (capacidade de crescimento a 0 °C, com temperatura ótima de crescimento entre

15 e 20 °C) (Morita, 1975), psicrotolerantes (organismos com capacidade de crescimento em

temperatura a 0 °C, com temperatura ótima de crescimento acima de 20 °C) (Brunati et al.,

2009) e cosmopolitas adaptados ao frio (podem ser encontrados em vários lugares do mundo,

transportados na forma de esporos, que se adaptam e podem adquirir a capacidade de crescer

e se reproduzir em baixas temperaturas (Ruisi et al, 2006).

4

2.2 Estudo dos solos antárticos

Os solos antárticos estão entre os mais antigos, frios e secos encontrados no planeta,

sua formação está restrita às áreas livres de neve e gelo e corresponde a cerca de 0,35% de sua

área total (Campbell et al., 1987). A maior deglaciação (áreas recentemente expostas pela

retração do gelo) na região do continente na Antártica marítima ocorreu a aproximadamente 4

a 5 mil anos atrás quando provavelmente, iniciou-se a formação da maioria dos solos

presentes nas áreas livres de gelo do presente continente (Rosa, 2008; Moura, 2010). Assim

como na maior parte do mundo, os solos antárticos são influenciados pelo clima, tempo e

topografia. Por apresentar o clima mais frio e seco do planeta, a Antártica possui pouca água

no solo, a qual é restrita a curtos períodos no verão (Campbell et al., 1987; Moura, 2010;

Pereira et al., 2014).

Nos últimos 10 anos houve um aumento nos estudos de pedologia da Antártica

(Campbell et al., 1987; Francelino, 2004; Bremer, 2008; Moura, 2010; Pereira et al., 2014;

Godinho et al., 2015; Vianna, 2016) devida as suas condições extremas em interferir no

desenvolvimento das comunidades que o utilizam para se desenvolver, manter e dispersar na

região (Campbell et al., 1987). De forma geral, os minerais que ocorrem nos solos antárticos

incluem cloretos, nitratos e sulfatos de sódio, cálcio e magnésio com concentrações e

disponibilidade variáveis de acordo com a região (Campbell et al., 1987).

2.2.1 Classificação dos solos

Para realizar a classificação dos solos, são utilizadas avaliações dos dados

morfológicos, físicos, químicos e mineralógicos dos perfis a serem analisados. Outros

aspectos incluem também: perfis dos locais ambientais, como clima, vegetação, relevo,

condições hídricas, características externas ao solo e relações do solo-paisagem (Embrapa,

2014).

A primeira tentativa de classificação do solo Antártico, segundo Campbell et al.

(1987), ocorreu em 1960. A classificação do diferentes tipos de solos que ocorrem nas ilhas

antárticas, foi proposta inicialmente em dois eixos: no primeiro eixo, a análise se deu por

comparações com outras partes do mundo, particularmente com solos desérticos, outra

vertente dessa classificação, o segundo eixo, se baseia em uma análise detalhada de cada solo

no continente.

5

Após essa classificação inicial surgiram outras: solos húmicos – importante

reservatório de matéria orgânica; litossolos – família de solos rasos, rochosos, colocados

imediatamente sobre a rocha; solos aviários – onde vivem as aves; solos ornitogênicos –

associados às áreas de nidificação (ação de construção de ninhos) das aves, que contam com

um constante depósito de matéria orgânica (guano, penas, cascas de ovo, carcaças,

vegetação); solos morâinicos – sedimentos encontrados na borda das geleiras; criossolos –

presença de material gélico, com presença de crioturbação (mistura de materiais de vários

horizontes do solo até a rocha matriz devido ao ciclo de congelamento e degelo); leptossolos –

apresenta profundidade limitada por rocha dura e contínua, dentro dos 25cm iniciais, dentre

outros (Campbell et al., 1987; Michel, 2005; Bremer, 2008; Carvalho et al., 2013).

2.3 Biotecnologia de micro-organismos e fungos da Antártica

A utilização de micro-organismos na biotecnologia já foi relatada por diversos autores

e seu destaque está diretamente relacionado com seu uso na indústria farmacêutica e em

outras áreas (Nobre e Sette, 2013). Micro-organismos presentes em ambientes extremos, têm

demonstrado características que podem ser utilizadas de forma biotecnológica para utilização

em diversos processos (Bhadury et al., 2006). A partir deste contexto, a Antártica representa

um ambiente ideal na aplicação da biotecnologia e suas ferramentas em fungos extremos

(Lohan e Johnston, 2005).

A Biotecnologia aplicada a micro-organismos provenientes de ambientes com baixas

temperaturas vem sendo amplamente estudada. Neste contexto, as enzimas adaptadas ao frio

são tipicamente caracterizadas por uma alta atividade, sendo produzidas por micro-

organismos expostos permanentemente a baixas temperaturas. Essas características tornam

estas enzimas altamente importantes para várias aplicações onde podem permitir processos

mais eficientes, econômicos e ambientalmente melhores (Barroca et al., 2017).

A produção de proteínas recombinantes, a partir de bactérias provenientes da

Antártica, endossa o potencial de bactérias adaptadas ao frio como hospedeiros alternativos

para a produção de proteínas recombinantes (Parrilli e Tutino, 2017). Outra aplicação

biotecnológica através de micro-organismos da Antártica, está na produção de novos

antimicrobianos, Borchert et al. (2017) cita que, os micro-organismos psicrofílicos são uma

fonte de substâncias antimicrobianas inexploradas. Brouchkov et al. (2017) relata que

bactérias advindas de permafrost características únicas, Bacillus cereus foi isolado nessa

6

condição e foi capaz de aumentar a longevidade e imunidade em Drosophila e camundongos,

além de apresentar atividade probiótica.

Segundo Chambergo e Valencia (2016), já foram relatados cerca de 250 fungos

filamentosos com potencial biotecnológico, os quais possuem as mais diversas aplicações,

como biorremediação, produção sustentável de produtos existentes, produtos químicos

básicos e produtos químicos de valor agregado, agentes terapêuticos, antibióticos, drogas

anticâncer, antivirais, antifúngicas, biopolímeros e outras biomoléculas.

Em se tratando de fungos adaptados ao frio, seu potencial biotecnológico tem atraído

diversos pesquisadores, pois são capazes de sintetizar enzimas ativas a frio, bem como outros

produtos bioquímicos importantes, conhecido como crioprotetoras, polímeros, lipídios e

outras substâncias (Tasselli et al. 2017). Fungos provenientes da Antártica vêm sendo

estudados como fontes promissoras de metabólitos antiparasitários, antitumorais, antivirais e

herbicidas, as quais tem potencial uso na indústria farmacêutica e na agricultura (Furbino,

2012; Godinho et al., 2013; Godinho et al., 2015).

De acordo com Furbino et al. (2014), dos isolados associados a macroalgas antárticas,

oito apresentaram atividade antimicrobiana; destes, seis contra Candida krusei, um contra

Candida albicans e um contra Cladosporium sphaerospermum. O extrato do fungo Geomyces

pannorum apresentou atividade antimicrobiana considerada promissora (95,2%) frente aos

esporos de Cladosporium sphaerospermum. Godinho et al. (2013), identificaram um táxon

com importante potencial de substâncias bioativas, o gênero Penicillium sp. foi isolado de

espécies endêmicas de Palmaria decipiens e Monostroma hariotii, sendo capaz de produzir

extratos com atividades antifúngicas e tripanosomicida. Já em amostras de solos oligotróficos

do continente Antártico, os extratos de Aspergillus sydowii, Penicillium alliisativi, Penicillium

Brevicompactum, Penicillium chrysogenum e Penicillium rubens apresentaram atividades

antivirais, antibacterianos, antifúngicos, antitumorais, antiprotozoária e herbicida.

7

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Caracterizar a diversidade e distribuição de fungos presentes em diferentes solos de ilhas

da Península Antártica e avaliá-los quanto a capacidade de produzir metabólitos secundários

bioativos contra agentes causadores de doenças tropicais negligenciadas e para uso como

pesticidas menos tóxicos na agricultura.

3.2 Objetivos Específicos

• Coletar solos em diferentes ilhas da Península Antártica e isolar as comunidades de

fungos presentes;

• Ampliar a coleção de micro-organismos e células da UFMG para a montagem de uma

coleção temática de fungos antárticos;

• Identificar todos os fungos obtidos por meio de técnicas macromorfológicas e

moleculares;

• Ampliar as informações sobre a diversidade e distribuição geográfica dos fungos

antárticos;

• Produzir extratos dos fungos e avalia-los quanto a presença de substâncias

antiparasitárias, antivirais e herbicida;

8

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Área de estudo

A Antártica possui cerca de 14 milhões de km2 e compreende um complexo de ilhas

concentradas em sua península. As amostras de solos foram obtidas em três ilhas da Península

Antártica (Figura 1, Tabela 1): Robert (Península Coppermine), Ilhas Nelson (Rip Point), Rei

George (Yellow Point) e Pinguim.

Figura 1. Complexo de Ilhas Shetland do Sul na Península Antártica (Google, 2017).

Tabela 1. Localização geográfica dos pontos de coleta.

Ilha Local de coleta Localização geográfica

Nelson Rip Point S 62°14'279" W 058°439'

Rei George Yellow Point S 62°04'678" W 058°23'686"

Pinguim - S 62°06'327" W 057°55'590"

Robert Península Coppermine S 62°22'725" W 059°41'802"

9

As coletas foram realizadas em dezembro de 2013, durante a Operação Antártica

XXXII, realizada em atividades do Programa Antártico Brasileiro (PROANTAR). As

amostras foram coletadas obedecendo os critérios de solos aparentemente diferentes que são

informados na Tabela 2. Para realização das coletas, foram utilizadas espátulas esterilizadas e

sacos plásticos do tipo WhirlPak (Nasco, Fort, Atkinson, WI, EUA) esterilizados, para cada

tipo de solo, foi coletado aproximadamente 300 g de amostras em triplicata.

Tabela 2. Informações sobre os pontos de coleta dos solos antárticos.

Após a coleta, as amostras foram encaminhadas ao Laboratório de Microbiologia do

Navio Oceanográfico Polar Almirante Maximiano, onde foram mantidas a -20 °C para

preservação das suas características. No Brasil as amostras foram transportadas para o

Microbiologia Polar e Conexões Tropicais (MicroPolar), na Universidade Federal de as

Gerais (UFMG) e mantidas a -20 ºC até o processamento.

4.2 Processamento, isolamento, purificação e preservação das amostras

Para o isolamento dos fungos, 1 g de cada amostra de solo foi inoculado em 9 mL de

solução de NaCl a 0,85%. Após essa diluição foi realizada uma diluição seriada até 10-2 e 100

μL inoculados nos meios YM (0,3% de extrato de levedura, 0,3% de extrato de malte, 0,5%

de peptona, 2% de glucose, 2% de ágar), DG18 (0,5% de peptona, 1% de glicose, 0,1% di-

hidrogeniofosfato de potássio, 0,05% sulfato de magnésio, 0,0002% de dicloran, 2% de ágar e

18% de glicerol) (Oxoid, EUA) e DRBC (0,5% de peptona; 1% de glicose; 0,1% di-

hidrogeniofosfato de potássio; 0,05% sulfato de magnésio; 0,0002% de dicloran; 0, 0025% de

rosa de bengala e 2% de ágar) (Oxoid, EUA) acrescido de 100 μg mL de cloranfenicol

(Sigma). As placas foram então incubadas a 10 ± 2 °C por até 60 dias. As colônias fúngicas

obtidas foram quantificadas em unidades formadoras de colônias e os fungos purificados em

novas placas de Petri contendo meio de cultura YM.

Ilha Data de coleta Ponto de coleta Material coletado

Nelson 11/12/2013 Rip Point Solo superficial

Rei George 07/12/2013 Yellow Point Solo rico em enxofre

Pinguim 09/12/2013 Topo da ilha Solo vermelho

Pinguim 09/12/2013 Topo da ilha Solo preto

Robert 06/12/2013 Península de Coppermine Solo morâinico

10

As culturas purificadas foram cultivadas em YM por 7 a 15 dias e preservados em

Castellani (Castellani, 1967). Para a criopreservação, os isolados foram cultivados em ágar

YM por 7 a 15 dias, em seguida 15 fragmentos do micélio (com aproximadamente 5 mm de

diâmetro) foram transferidos para tubos criogênicos esterilizados, sendo adicionado 1 mL da

solução de glicerol a 15% esterilizado. Para a criopreservação das leveduras, uma alçada de

cada isolado foi inoculada em tubo de ensaio contendo 2 mL de caldo GYMP (2% de glicose,

0,5% de extrato de levedura, 1% de extrato de malte, 0,2% de fosfato de potássio dibásico) e

incubados por 24 a 48 horas a 10 ºC. Transcorrido esse período, 0,8 mL de cada amostra foi

transferido para tubos criogênicos esterilizados onde foram adicionados 0,2 mL de glicerol

esterilizado. Os criotubos foram estocados em ultrafreezer a -80 ºC. Todos os isolados obtidos

foram preservados e armazenados na Coleção de Micro-organismos e Células do

Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biológicas (ICB), da UFMG, sob o

código UFMGCB.

4.3 Identificação dos isolados

4.3.1 Fungos filamentoso e leveduras

Os isolados obtidos foram agrupados utilizando características macromoforlógicas –

cor da colônia (frente e verso), aspecto da borda, textura da superfície (frente e verso) e em

seguida, os grupos isolados foram submetidos à análise molecular para confirmação do

agrupamento por meio da PCR, utilizando-se o iniciador (GTG)5 (5’-

GTGGTGGTGGTGGTG-3’), de acordo com Lieckfeldt et al. (1993).

Após a amplificação dos produtos obtidos pela PCR, um isolado dentre os que

apresentaram um mesmo padrão de bandas foi selecionado para sequenciamento da região

transcrita interna, ITS1-5.8S-ITS2, da região gênica do rRNA, utilizando-se os iniciadores

ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) e ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC) (White et

al., 1989), alguns táxons de fungos filamentosos, também foram submetidos ao

sequenciamento dos fragmentos gênicos da β-butulina BT2a

(GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC) e BT2b (ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC)

e RNA polimerase II (RPB2) 5F (GAYGAYMGWGATCAYTTYGG) e RPB2 7R

(CCCATRGCTTGYTTRCCCAT) (Godinho et al., 2015).

11

Para leveduras foi utilizada a região D1/D2 da subunidade maior do rDNA, utilizando

os iniciadores NL-1 (5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’) e NL-4 (5’-

GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’), segundo Lachance et al. (1999).

4.4 Extração DNA total

4.4.1 Fungos filamentosos

Após o crescimento dos isolados em ágar YM, a extração de DNA dos fungos

filamentosos foi realizada de acordo com Rosa et al. (2009). Os fungos filamentosos foram

crescidos por sete dias em meio YM e então os fragmentos de micélio foram colocados em

tubos estéreis de 1,5 mL acrescidos de 400 μL de tampão de lise – Tris-HCl

(trishidroximetilaminometano 0,05 M), EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético 0,005 M),

NaCl 0,1 M e SDS (sódio dodecil sulfato 1%) e deixado a – 20 ºC até o momento da extração

de DNA. O micélio foi triturado com auxílio de esferas de aço inoxidável (beads) (3,175 mm

de diâmetro) em homogeneizador Next Adva nce Bullet Blender®. Após essa etapa, foram

adicionados 162 μL de CTAB (Tris 2M, NaCl 8,2%, EDTA 2M CTAB 0,2%), seguido de

homogeneização e incubação por 30 minutos a 65 ºC. Posteriormente, foram acrescentados

570 μL da mistura clorofórmio/álcool isoamílico (24:1).

Após homogeneização, os tubos foram incubados por 30 minutos a 0 °C (em gelo).

Em seguida, o conteúdo foi centrifugado a 13.200 r.p.m. por 10 minutos e o sobrenadante

transferido para um novo tubo esterilizado de 1,5 mL, e acrescido 10% do volume de uma

solução de acetato de sódio 3 M. O tubo foi vertido para homogeneização, incubado a 0 ºC

por 30 minutos e centrifugado a 13.200 r.p.m. por 10 minutos. O sobrenadante foi transferido

para um novo tubo esterilizado e, em seguida, adicionado 50% do volume de isopropanol

(Merck) e a suspensão foi cuidadosamente homogeneizada. Posteriormente, a amostra foi

centrifugada a 13.200 r.p.m. por 10 minutos e o sobrenadante desprezado por inversão. Em

seguida, foram adicionados 200 μL de etanol 70% gelado (Merck), sendo os tubos

homogeneizados e submetidos à centrifugação a 13.200 r.p.m. por 5 minutos. O sobrenadante

foi descartado novamente por inversão e os tubos deixados por 2 minutos para secar. Foi

realizada outra lavagem com 200 μL de etanol 70% p/v gelado (Merck) e, por último, uma

nova centrifugação 13.200 r.p.m. por 5 minutos, seguido de descarte do sobrenadante. A

amostra foi deixada a temperatura ambiente overnight para secagem, e então foi adicionado

50 μL de Tris-EDTA (Tris-HCl 0,01 M e EDTA 0,001 M). A amostra foi incubada a 65 ºC

12

por 60 minutos para hidratação do DNA e, posteriormente, armazenada em freezer a -20 ºC. O

DNA obtido a partir dos isolados foi quantificado em espectrofotômetro (NanoDrop ND 1000

Technologies) (Scientific, 2008) e armazenado a –20 °C até sua utilização.

4.4.2 Leveduras

Para extração do DNA total das leveduras, os isolados foram crescidos em meio ágar

YM. Após o crescimento, as colônias foram ressuspendidas em 100 μL de tampão de lise

[Tris-HCl – trishidroximetilaminometano 0,05M), EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético

0,005 M), NaCl 0,1 M e SDS [sódio dodecil sulfato 1% (p/v)] e incubadas em banho-maria a

65 ºC por 30 minutos. Após essa etapa, foram adicionados 100 μL de fenol-clorofórmio-

álcool isoamílico – 25:24:1 (Sigma, EUA) aos tubos e os mesmos vedados com parafilme,

homogeneizados em vórtex e centrifugados a 14.000 r.p.m. durante 15 minutos. O

sobrenadante foi retirado com auxílio de pipeta e transferido para outro tubo, ao qual foi

adicionado isopropanol (Merck) (v/v). Os tubos foram homogeneizados por inversão e

deixados em repouso à temperatura ambiente durante 15 minutos para precipitação do DNA.

Após essa etapa, os tubos foram centrifugados a 14.000 r.p.m. por 10 minutos. O

sobrenadante foi descartado por inversão, e ao pellet formado foi acrescentado 200 μL de

etanol 70% (Merck) refrigerado. Efetuou-se novamente uma centrifugação a 14.000 r.p.m. por

10 minutos. O sobrenadante foi novamente descartado por inversão e uma segunda lavagem

com 200 μL de etanol 70% gelado e centrifugação a 14.000 r.p.m. por 10 minutos foram

realizadas. Após o descarte do sobrenadante por inversão, os tubos foram incubados overnight

à temperatura ambiente para total evaporação do etanol. Após essa etapa, o DNA foi

ressuspendido em 50 μL de tampão Tris-EDTA 0,1M (TE), pH 8,0 e estocado a -20 ºC.

4.5 Obtenção dos amplicons

4.5.1 Amplificação utilizando o iniciador (GTG)5

Para confirmação do agrupamento macromorfológico, os isolados foram submetidos à

PCR fingerprinting utilizando o iniciador (GTG)5 para amplificação de regiões de

microssatélite, conforme descrito por Lieckfeldt et al. (1993). A PCR foi realizada para um

volume final de 25 μL contendo de 1,0 a 5,0 μL de DNA - variando de acordo com a

concentração do DNA, a qual deve estar entre 50-500 ng/μL, 2,0 μL do iniciador GTG5 10

μmol-1 (Invitrogen) 2,5 μL de tampão de PCR 5X (Fermentas), 1,5 μL de MgCl2 25mM, 1,0

13

μL de dNTP (Invitrogen), 10 mM, 0,2 μL de Taq DNA polimerase 5U (Fermentas) e o

volume final completado com água ultrapura esterilizada. As reações de PCR foram

realizadas utilizando o termociclador Eppendorf Mastercycler nexus GSX1. O programa

consistiu de uma desnaturação inicial a 94 ºC por cinco minutos, seguido por 40 ciclos de 15

segundos de desnaturação a 94 ºC, 45 segundos de anelamento a 55 ºC e 90 segundos de

extensão a 72 ºC, e uma extensão final por 6 minutos a 72 ºC. Os produtos de PCR foram

analisados por eletroforese (Loccus biotecnologia model LPS – 300h), em gel de agarose

1,5% (Avati Mod.: AV – 0110), em tampão TBE 0,5X (54 g de tris base, 27,5 g de ácido

bórico), 20 mL de EDTA 0,5M, pH 8,0, resolvidos durante aproximadamente uma hora e

meia a 80 V. As bandas foram coradas com solução de GelRedTM (Biotium), e os géis

visualizados sob luz ultravioleta (UV) e fotografados pelo sistema de foto documentação de

gel (Vilber Lourmat, serial 0518816 – França).

4.5.2 Amplificação da região ITS utilizando os iniciadores ITS-1 e ITS-4

Para amplificação da região transcrita interna ITS1-5.8S da região do gene rRNA

foram utilizados os iniciadores ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) e ITS4

(TCCTCCGCTTATTGATATGC), conforme descrito por White e colaboradores (1990). A

reação de PCR foi realizada em um volume final de 50 μL contendo 5 μL de tampão de PCR

10X (Fermentas), 3 μL de MgCl2 25mM (Fermentas), 2 μL de dNTP 10 mM, 1 μL de cada

iniciador ITS1 e ITS4 a 10 pmol-1 (Invitrogen), 0,2 μL de Taq DNA polimerase 1,25U

(Fermentas),1 a 5 μL do DNA - de modo que a reação contenha entre 50-500 ng/μL e água

ultrapura esterilizada q.s.p. 50 μL. As reações de PCR foram realizadas utilizando o

termociclador Eppendorf Mastercycler nexus GSX1. O programa de ciclagem consistiu de

uma desnaturação inicial a 94 ºC por 5 min, seguido por 35 ciclos de 1 minuto de

desnaturação a 94 ºC, 1 minuto de anelamento a 55 ºC, 1 minuto de extensão a 72 ºC, e uma

extensão final por 5 minutos a 72 ºC. Os amplicons foram resolvidos por eletroforese (Loccus

biotecnologia model LPS – 300h), em gel de agarose 1,0% (Avati Mod.: AV – 0110), em

tampão TBE 0,5X, eluídos durante aproximadamente 30 minutos a 120 V. As amostras foram

coradas pela adição de GelRedTM (Biotium), e os géis visualizados sob luz UV e

fotografados pelo sistema de foto documentação de gel (Vilber Lourmat, serial 0518816 –

França).

14

4.5.3 Amplificação do gene de β-tubulina

Para amplificação do fragmento gênico da β-tubulina foram utilizados os iniciadores

Bt2a (GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC) e Bt2b

(ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC), conforme descrito por (Glass e Donaldson, 1995).

A PCR foi realizada em um volume final de 50 μL contendo de 1 a 2 μL de DNA (de modo

que a reação continha entre 50-300 ng/μL), 1,0 μL de cada iniciador Bt2a e Bt2b 10 pmol-1

(Sinapse), 5 μL de tampão de PCR 10X (Fermentas), 2 μL de MgCl2 1,5 mM (Fermentas), 2,0

μL de dNTP 0,05 mM, 0,2 μL de Taq DNA polimerase 1U (Fermentas), e o volume final

completado com água de injeção esterilizada para 50 μL. As reações de PCR foram realizadas

utilizando o termociclador Eppendorf Mastercycler nexus GSX1. O programa consistiu de

uma desnaturação inicial a 94 ºC por 5 minutos, seguido por 35 ciclos de 1 minuto de

desnaturação a 94 ºC, 1 minuto de anelamento a 59 ºC e 90 segundos de extensão a 72 ºC e

uma extensão final por 7 minutos a 72 ºC. Os amplicons foram analisados por eletroforese

(Loccus biotecnologia model LPS – 300h), em gel de agarose 1,0% (Avati Mod.: AV –

0110), em tampão TBE 0,5X, resolvidos durante aproximadamente 30 minutos a 120 V. As

amostras foram coradas pela adição GelRedTM (Biotium), e os géis visualizados sob luz UV

e fotografados pelo sistema de foto documentação de gel (Vilber Lourmat, serial 0518816 –

França).

4.5.4 Amplificação da RNA polimerase II

Na amplificação parcial da RNA polimerase II (RPB2) foram utilizados os iniciadores

RBP2 5F (GAYGAYMGWGATCAYTTYGG) e RPB2 7R

(CCCATRGCTTGYTTRCCCAT) conforme descrito por (Malkus et al., 2006). A PCR foi

realizada em um volume final de 50 μL contendo de 1,0 a 5,0 μL de DNA (de modo que a

reação contenha entre 50-500 ng/μL), 1,0 μL de cada iniciador RBP2 5F e RPB2 7R a 10

μmol-1 (Invitrogen), 5,0 μL de tampão de PCR 10X (Fermentas), 3,0 μL de MgCl2 mM, 2,0

μL de dNTP 10 mM, 0,2 μL de Taq DNA polimerase 1.25U (Fermentas) e o volume final

completado com água de injeção esterilizada. As reações de PCR foram realizadas utilizando

o termociclador Eppendorf Mastercycler Nexus GSX1. O programa consistiu de uma

desnaturação inicial a 94 ºC por 3 minutos, seguido por 35 ciclos de 20 segundos de

desnaturação a 94 ºC, 55 segundos de anelamento a 55 ºC e 1 minuto de extensão a 72 ºC e

uma extensão final por 10 minutos a 72 ºC. Os amplicons foram analisados por eletroforese

15

(Loccus biotecnologia model LPS – 300h), em gel de agarose 1,0% (Avati Mod.: AV – 0110),

em tampão TBE 0,5X, resolvidas durante aproximadamente 30 minutos a 120 V. As amostras

foram coradas pela adição (Biotium), e os géis visualizados sob luz UV e fotografados pelo

sistema de foto documentação de gel (Vilber Lourmat, serial 0518816 – França).

4.5.5 Amplificação utilizando iniciadores NL-1 e NL-4

Das leveduras que apresentaram perfis moleculares iguais um isolado foi selecionado

para o sequenciamento da região D1/D2 da subunidade maior do rDNA, utilizando os

iniciadores NL-1 (5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’) e NL-4 (5’-

GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’), segundo Lachance et al. (1999). A reação de PCR foi

realizada em um volume final de 50 μL contendo 5 μL de tampão de PCR 10X (Fermentas), 3

μL de MgCl2 25 Mm (Fermentas), 2 μL de dNTP 10 mM, 1 μL de cada iniciador NL-1 e NL-

4 a 10 pmol-1 (Invitrogen), 1 a 5 μL do DNA – de modo que a reação final contenha entre 50-

500 ng/μL, 0,2 μL de TaqDNA polimerase 1.25 U (Fermentas) e água ultrapura esterilizada

q.s.p. 50 μL. As reações de PCR foram realizadas utilizando o termociclador Eppendorf

Mastercycler nexus GSX1.

O programa de ciclagem consistiu de uma desnaturação inicial a 95 ºC por 2 minutos,

seguido por 35 ciclos de 15 segundos de desnaturação a 95 ºC, 25 segundos de anelamento do

iniciador a 54 ºC e 20 segundos de extensão a 72 ºC, e uma extensão final por 10 minutos a 72

ºC. Os amplicons foram analisados por eletroforese (Loccus biotecnologia model LPS –

300h), em gel de agarose 1,0% (Avati Mod.: AV – 0110), em tampão TBE 0,5X, resolvidos

durante aproximadamente 30 minutos a 120 V. As amostras foram coradas pela adição de

GelRedTM (Biotium), e os géis visualizados sob luz UV e fotografados pelo sistema de foto

documentação de gel (Vilber Lourmat, serial 0518816 – França).

4.6 Purificação dos produtos de PCR

Os amplicons gerados pela reação de PCR foram purificados utilizando etanol-EDTA.

Ao produto de PCR – 47 μL, foram adicionados 11,25 μL de EDTA e 141 μL de etanol

absoluto e deixados a temperatura ambiente por 15 minutos. O tubo foi centrifugado a 13.200

r.p.m. por 25 minutos e o sobrenadante descartado por inversão. A seguir, foram adicionados

120 μL de etanol 70% gelado, o tubo centrifugado a 13.200 r.p.m. por 10 minutos e o etanol

descartado por inversão. O tubo foi deixado à temperatura ambiente para evaporação de todo

16

o excesso de etanol. Foram adicionados 10 μL de água ultrapura e o conteúdo do tubo

homogeneizado em vórtex por 15 segundos. Em seguida, o tubo foi incubado em estufa a 37

ºC por 30 minutos. O produto da PCR purificado foi dosado em NanoDrop ND 1000

(NanoDrop Technologies, EUA) (Scientific, 2008) e armazenado a –20 °C até o momento da

reação de sequenciamento.

4.7 Reação de sequenciamento e precipitação das amostras

As reações de sequenciamento foram realizadas utilizando o kit Big Dye versão 3.1

(Applied Biosystems, EUA), em combinação com o sistema de sequenciamento automatizado

ABI 3730 (Applied Biosystems, EUA). A reação de sequenciamento foi realizada em

microplacas de 96 poços (Applied Biosystems, EUA) preparada para um volume final de 10

μL, em que foram colocados: 1 μL do inciador – 5 μmol-1, 1 μL de tampão – presente no kit

de sequenciamento, 1 μL de Big Dye, 1 a 5 μL de DNA – de modo que a reação final

contenha entre 50-500 ng/μL e o restante de água para injeção esterilizada para completar o

volume. O programa de ciclagem utilizado consistiu de uma desnaturação inicial a 36 °C por

1 minuto, 36 ciclos de anelamento a 96 °C por 15 segundos, seguido por 15 segundos de

extensão a 50 ºC e 4 minutos de extensão final a 60 ºC.

Os produtos do sequenciamento foram submetidos ao processo de precipitação com o

acréscimo de 1 μL de EDTA a 125 mM, 1 μL de acetato de amônio e 50 μL de etanol 96%

(Merck) em cada poço. A placa foi homogeneizada com auxílio de um vórtex brevemente e

então incubada por 15 minutos à temperatura ambiente, protegida da luz. Após incubação, as

amostras foram centrifugadas por 45 minutos a 3.700 r.p.m. à temperatura ambiente e o

sobrenadante descartado por inversão. Em seguida, foram acrescentados 100 μL de etanol

70% (Merck) e as amostras novamente centrifugadas por 15 minutos a 3.700 r.p.m. à

temperatura ambiente. Após a centrifugação, o sobrenadante foi descartado por inversão e em

cada poço foi acrescentado 10 μL de Formamida HI-DI (Applied Biosystems, EUA). A placa

foi armazenada a 4 ºC, protegida da luz, até injeção das amostras no sistema automatizado

ABI 3730 (Applied Biosystens, EUA).

4.8 Análises computacional das sequências

As sequências de DNA foram comparadas com as sequências de espécies tipo ou

referência de fungos depositadas no GenBank e pertencentes a coleções de culturas

17

internacionais, utilizando o programa BLASTn – Basic Local Alignment Search Tool (versão

2.215) do BLAST 2.0 disponível no portal NCBI –http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/,

desenvolvido pelo National Center For Biotechnology. Os fungos que apresentaram

sequências com valor de E = 0, cobertura e identidade ≥ 99%, bem como proximidade quando

analisadas filogeneticamente utilizando o programa MEGA 6 (Molecular Evolutionary

Genetics Analysis) (Tamura et al., 2013) foram considerados como pertencentes à mesma

espécie. Para fungos com sequências com valor de E diferente de 0 e cobertura, e identidade ≤

98%, os mesmos foram identificados em nível de gênero ou níveis hierárquicos mais altos

após a análise filogenética. Além disso, para alguns táxons o termo ‘cf.’ (latim for confer =

comparado com) foi utilizado para indicar a espécie a qual se assemelha, mas apresenta

pequenas diferenças com a espécie referência.

Para identificação molecular foram utilizadas as sequências ≥ 300 pares de bases. As

árvores filogenéticas foram construídas utilizando o algoritmo de Neighbor-joining. O modelo

Maximum composite likelihood foi usado para estimar a distância evolucionária. Uma análise

de bootstrap foi feita com 1.000 repetições utilizando os programas incluídos no MEGA 6.

Informações sobre os níveis hierárquicos utilizados na taxonomia dos fungos foram obtidas

no MycoBank (http://www.mycobank.org), Index Fungorum

(http://www.indexfungorum.org/) e Kirk et al. (2008).

4.9 Diversidade da comunidade fúngica: cálculo dos índices de abundância, riqueza e

dominância

A abundância de cada táxon foi calculada de acordo com a seguinte fórmula: porcentagem de

abundância do táxon A = número de isolados do táxon A x 100/soma de isolados de todos os

táxons. Estes dados foram utilizados para determinar a prevalência de cada táxon em

comparação com o total de táxons presente nas comunidades fúngicas na área de coleta. Para

avaliar a diversidade de espécies no local de coleta, foram utilizados os seguintes índices: (a)

Fisher-ɑ (diversidade), (b) Margalef (riqueza) e (c) Simpson (dominância). O índice de

diversidade de Fisher-ɑ é adequado para frequências em que diferentes espécies ocorrem de

forma aleatória onde, comumente algumas espécies são tão raras que sua chance de inclusão é

pequena (Fisher et al., 1943).Este índice é calculado pela fórmula S = a*ln(1+n/a) onde, S é o

número de táxons presente na amostra, n é o número de indivíduos e a representa o índice de

Fisher-ɑ. O Índice de Margalef é uma medida utilizada em ecologia para estimar a riqueza de

espécies de uma comunidade com base na distribuição numérica dos indivíduos das diferentes

18

espécies em função do número total de indivíduos existentes na amostra analisada. Sua

fórmula é dada por S = (n-1)/ln(N), onde n é o número de táxons encontrados e N representa o

número de indivíduos. Quanto mais alto o valor de S maior a riqueza de espécies do local

amostrado. O índice de Simpson é muitas vezes utilizado para quantificar a biodiversidade de

um ecossistema. Ele leva em conta o número de espécies presentes no local, bem como a

abundância de cada espécie. Trata-se de um índice de dominância que mede a probabilidade

de dois indivíduos, selecionados ao acaso na amostra, pertencer à mesma espécie. O cálculo

da Dominância de Simpson é dado pela fórmula D =Σ(n/N)2, onde n é o número total de

organismos de uma mesma espécie e N o número total de organismos de todas as espécies. O

valor estimado de D pode variar de 0 a 1, quanto mais alto for, maior a probabilidade de os

indivíduos serem da mesma espécie, ou seja, maior a dominância e menor a diversidade.

Sendo assim, uma comunidade de espécies com maior diversidade terá uma menor

dominância. Para comparação entre as comunidades de solos diferentes, bem como as ilhas

amostradas, foram utilizados os índices de Sorensen. Todos os resultados foram obtidos com

95% de confiança, e os valores de bootstrap calculados a partir de 1.000 repetições. Todos os

índices foram calculados utilizando o programa computacional PAST 1.90 (Hammer et al.,

2001).

4.9.1.1 Análises físico-químicas do solo

Foram coletadas cinco amostras superficiais de solos, todas na profundidade de 0 – 10

cm. As amostras das Ilhas Robert (Península Coppermine) e Nelson (Rip Point) estão

localizadas no domínio litorâneo, especificamente em áreas de stacks vulcânicos com terraços

marinhos associados (Figura 2A). Esses stacks, bem como os terraços, tem sua exposição

causada pelo soerguimento das ilhas a partir da compensação glacio-isostática associada ao

recuo das geleiras. Posteriormente passam a ser cioclastados em superfície, podendo também

serem colonizados pela avifauna. Na Ilha Pinguim, as amostras superficiais de solo foram

amostradas em dois contextos litológicos semelhantes, porém em estados de oxidação

diferentes, ambos na porção superior da paisagem, acima de 250 m de altitude. Os solos de

cor vermelha (Figura 2B) derivam de cinzas vulcânicas oxidadas, ao passo que os solos de cor

preta (Figura 2C) tem como material de origem as mesmas cinzas vulcânicas, porém sem

oxidação como as anteriores. A diferença de cor se deve, assim, a uma transição no estado de

valência do Fe, que ao ser oxidado na superfície da forma Fe2+ para Fe3+ passa a manifestar a

cor vermelha. Na Ilha Rei George, em área conhecida como Yellow Point (Figura 2D), as

coletas ocorreram na base da saia de talus, próxima ao terraço marinho, sendo o solo derivado

19

de andesitos piritizados, isto é, rochas vulcânicas enriquecidas em sulfeto de ferro,

principalmente pirita. Todas as amostras foram coletadas em triplicatas, sendo posteriormente

homogeneizadas e peneiradas em malha de 2mm. Foram realizadas análises químicas de

rotina. O pH, nutrientes trocáveis e textura foram determinados em amostras de terra fina seca

ao ar (TFSA) (Embrapa, 2014). Cátions trocáveis, Ca2+, Mg2+ e Al3+ foram extraídos com 1M

KCl e P, Na+ e K+ com extrator Mehlich-1 (dupla diluição 0,05 mol/L de HCl em 0,0125

mol/L de H2SO4) (Embrapa, 2014). Os teores dos nutrientes (Ca2+ e Mg2+) e Al3+ nos extratos

foram determinados por espectrometria de absorção atômica e emissão de chama (Na+ e K+) e

fotocolorimetria (P).

Figura 2. Aspecto geral dos ambientes de coleta de amostras superficiais de solos, sendo A –

área costeira sob stack vulcânico crioclastado no interior de terraços marinhos (Coppermine);

B – Vertentes recobertas por cinzas vulcânicas oxidadas com afloramento de rochas intrusivas

(Pinguim); C – vertentes recobertas por cinzas vulcânicas com caimento para a área costeira

(Pinguim) e D – Base de talus em área de rochas andesiticas ricas em sulfetos (Yellow Point,

Rei George).

20

4.10 Cultivo dos fungos e preparo dos extratos

Cada isolado fúngico foi cultivado em cinco placas de Petri contendo meio YM e

incubados a 10 ºC para obtenção dos metabólitos produzidos. Após 15 dias de crescimento,

todo o conteúdo de cada uma das cinco placas (meio de cultura com o crescimento micelial)

foram picotados e transferidos para frascos Erlenmeyers de 250 mL, congelados a –80 ºC por

24 horas e posteriormente submetidos ao processo de liofilização (Liofilizador LíoTop –

K105). Em seguida foi acrescido 50 mL de diclorometano PA (Vetec) que permaneceram a

temperatura ambiente e após 72 horas. Em seguida o sobrenadante (fase diclorometânica) de

cada frasco foi filtrado em papel filtro e transferido para frascos de cintilação. Todos os

extratos diclorometânicos obtidos foram secos à temperatura ambiente, solubilizados em

dimetilsufóxido (DMSO), a uma concentração de 20 mg.mL-1 e depositados na Extratoteca do

Laboratório de Química de Produtos Naturais do CPqRR/FIOCRUZ a – 20 °C onde foram

triados e testados.

4.10.1 Determinação da atividade leishmanicida

A atividade leishmanicida seguiu os protocolos estabelecidos por (Campos et al.,

2008), onde promastigotas de Leishmania amazonensis (linhagem IFLA/BR/196/PH-8) foram

obtidas a partir de lesões de hamsters infectados experimentalmente. Os parasitas foram

incubados durante 9 dias a 26 ºC em meio Schneider pH 7,2. As formas promastigotas foram

então estimuladas para se diferenciarem em formas semelhantes a amastigotas, para isso, a

temperatura de incubação foi de 32 ºC, além da redução do pH do meio para 6,0. Após 7 dias

nestas condições, 90% dos parasitas estavam sob as formas amastigotas. A concentração

parasitária foi ajustada para 1 x 108 células mL-1 e em seguida, foi adicionado 90 μL em

microplacas de cultura de tecidos com 96 poços, seguindo-se 10 μL das soluções contendo as

amostras e o fármaco de controle (0,2 mg mL-1 de anfotericina B) Fungisona Bristol-Myers

Squibb, Brasil. As placas foram incubadas a 32 ºC durante 72 horas e o número de parasitas

estimado utilizando o ensaio colorimétrico baseado em MTT (metil tiazolil tetrazólio).

Os resultados foram calculados a partir das absorbâncias medidas utilizando a seguinte

equação:

[1 – (Absexperimento / Abscontrole)] x 100

21

A equação matemática expressa o percentual de morte parasitária em relação aos

controles sem fármaco. Todas as amostras foram testadas em duplicata e os experimentos

repetidos no mínimo uma vez. Os experimentos para determinar as curvas de resposta à dose

e a EC50 (concentração eficaz para matar 50% dos parasitas) foram executadas como descrito

anteriormente, utilizando diluições seriadas 1: 2 dos compostos de teste a fim de atingir as

concentrações apropriadas. Os experimentos foram executados em duplicata e repetidos no

mínimo uma vez.

4.10.2 Determinação da atividade tripanossomicida

4.10.2.1 Ensaio in vitro com formas tripomastigotas e formas amastigotas intracelulares

de Trypanosoma cruzi

Os ensaios in vitro com formas amastigotas e tripomastigotas de Trypanosoma cruzi

foram realizados de acordo com protocolos estabelecidos por Buckner et al. (1996) com

algumas modificações de (Romanha et al., 2010). Resumidamente, os parasitas e os

procedimentos de cultura foram realizados conforme a seguir. O T. cruzi (cepa Tulahuen) que

expressa o gene da β-galactosidase de Escherichia coli foi cultivada numa monocamada de

fibroblastos L929 de murganho. As culturas foram testadas quanto à atividade de β-

galactosidase e foram cultivadas em meio RPMI 1640, pH 7,2-7,4, sem vermelho de fenol,

mais 10% de soro fetal bovino e glutamina 2 mM. Os fibroblastos L929 foram adicionados

em microplacas de cultura de tecidos com 96 poços a uma concentração de 4,0 x 103 por

poço, com volume de 80 μL e incubados overnight.

As formas tripomastigotas que expressam a enzima β-galactosidase foram então

adicionados a uma concentração de 4,0 x 104 por poço com volume de 20 μL. Após 2 horas, o

meio contendo tripomastigotas que não penetram nas células foi descartado e substituído por

200 μL de meio fresco. Após 48 horas, o meio foi descartado novamente e substituído por 180

μL de meio fresco e 20 μL dos extratos de teste. Cada extrato foi testado em triplicata. Após 7

dias de incubação, adicionou-se às placas de cloreto de β-D-galactopiranósido vermelho de

clorofenol (CPRG), concentração final de 100 μM e Nonidet P-40 – 0,1% de concentração

final, seguido de incubação durante a noite a 37° C e a absorbância foi medida a 570 nm num

leitor de microplacas automatizado. O benznidazol na IC50 de 1 μg mL-1 = 3,81 μM foi

utilizado como controle positivo. Os resultados foram expressos como a percentagem de

22

inibição do crescimento. As quadruplicatas foram executadas na mesma placa e os

experimentos repetidos pelo menos uma vez.

4.10.2.2 Ensaio citotóxico in vitro de extratos tripanossomicida

Os extratos ativos foram testados in vitro para determinação da toxicidade celular em

células L929 não infectadas utilizando o corante alamarBlue® (Romanha et al., 2010). As

células foram expostas a extratos com concentrações crescentes a partir do valor de IC50 para

T. cruzi. Após 96 horas de incubação com os compostos, o alamarBlue® foi adicionado e a

absorbância foi medida em 570 e 600 nm após 4-6 horas. A viabilidade celular foi expressa

como a percentagem de diferença na redução entre células tratadas e não tratadas. Os valores

de IC50 foram calculados por interpolação linear e o índice de seletividade (SI), foi

determinado com base na razão entre o valor de IC50 na célula hospedeira dividido pelo valor

de IC50 do parasita. Os quadruplicados foram executados na mesma placa, e os experimentos

foram repetidos pelo menos uma vez.

4.10.3 Determinação de atividade para Dengue vírus sorotipo 2 e Zika vírus

Para os ensaios de atividade antiviral contra Dengue vírus sorotipo 2 (DENV-2) e o

Zika vírus (ZIKV), monocamadas de células (BHK-21) e Vero, foram crescidas em placas de

96 poços de fundo chato utilizandoo meio Eagle modificado por Dulbecco suplementado com

5% de SFB (soro fetal bovino), 100 U mL-1 de penicilina, 100 μg / mL de estreptomicina e

0,25 μg / mL de anfotericina B (todos Gibco, Thermo Sci, EUA) foram expostos a diferentes

concentrações dos extratos fúngicos por 72 h (DENV-2) ou 120 h (ZIKV) na presença dos

vírus. Os extratos a concentração de 20 mg mL-1 e em DMSO 100% foram incluídos em

placas de 96 poços (1 μL de cada extrato por poço). As suspensões de vírus com múltiplas

infecções (m.o.i) de 2 para DENV-2 e para ZIKV e extratos, com uma concentração de 25 μg

mL-1, foram adicionadas simultaneamente às placas em duas repetições. Controle celular

(células não-infectadas e não tratadas), controle de vírus (células não tratadas infectadas) na

presença ou não de DMSO e controle positivo (células infectadas tratadas com 200 UI mL-1

interferão alfa 2b [INREC]) foram executadas em paralelo durante cada experimento. A

atividade antiviral foi avaliada pelo sistema de classificação do efeito citopático peculiar

(CPE) causado por DENV-2 ou ZIKV observado por microscopia óptica seguido de ensaio

colorimétrico utilizando 3-(4,5-Dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólio (MTT) (Sigma

Aldrich-USA) (Mosmann, 1983). Os resultados são expressos como a porcentagem de

23

inibição viral em relação aos controles virais sem extratos. Todos os ensaios antivirais foram

repetidos pelo menos três vezes.

4.10.4 Determinação de atividade herbicida

A determinação da atividade herbicida foi realizada de acordo com Ferreira et al.

(2017) com modificações. A atividade herbicida é determinada utilizando-se sementes de

alface crespa (Lactuca sativa) como modelo para dicotiledôneas e sementes de cebolinha

(Allium schoenoprasum) como modelo para monocotiledôneas. Para a realização dos ensaios,

todas as sementes foram desinfestadas superficialmente em álcool 70% (1 minuto),

hipoclorito de sódio a 2-2,5% (7 minutos e meio). Posteriormente lavadas em água deionizada

autoclavada por quatro vezes e secas ao ar em um ambiente esterilizado. Os bioensaios foram

realizados em duplicata em placas de poliestireno de 24 poços esterilizadas (TPP 92024). Um

disco de papel de filtro qualitativo (50 X 50, 80g), foi colocado em cada poço a ser utilizado.

Aos poços controle foram adicionados 400 L de água deionizada autoclavada. Para

avaliação de toxicidade do solvente utilizado na solubilização dos extratos foi realizado o

controle de solvente. Para tanto, foi adicionado ao poço 360 L de água e 40 L de acetona

P.A. Aos poços testes foram adicionados 360 L de água e 40 L da diluição da amostra na

concentraçao de 1 mg mL-1. Toda a preparação da placa foi realizada em um ambiente

esterelizado para diminuir as chances de qualquer possivel contaminação. Posteriormente,

cinco sementes de cada vegetal teste foram adicionadas a cada poço. As placas foram

tampadas e seladas com parafilme. As placas foram incubadas em BOD sob condições de luz

contínua (120,1 umol s-1 m-2) a 26 C por 14 dias. Após este período, uma estimativa

qualitativa de fitotoxicidade foi feita atribuindo-se uma classificação de 0 para onde não

ocorreu nenhum efeito de inibição da germinaçao (as plantas dos poços teste encontraram-se

idênticas às plantas controle), 2 para menos de 50% de inibição da germinação, 3 para cerca

de 50% de inibição de germinação, 4 para mais de 50% de inibição de germinação e 5 para

não germinação das sementes. O Glifosato foi utilizado como controle positivo de inibição da

germinação.

24

5 RESULTADOS

5.1 Coleta, isolamento, identificação e diversidade de fungos

Foram isolados e identificados 218 fungos (Tabela 3; Figuras 4, 5, 6 7, 8). Desses, 203

fungos foram fungos filamentosos e 15 leveduras (Figura 3) pertencentes aos filos

Zygomycota, Ascomycota e Basidiomycota. Os gêneros Mortierella, Antarctomyces e

Penicillium foram os que alcançaram as maiores densidades em UFC g-1. Pseudogymnoascus

destructans, P. verrucosus, Penicillium tardochrysogenum, Goffeauzyma gilvescens e

Mortierella sp. foram as espécies mais abundantes.

Figura 3. (a) percentual de isolados por ilha e (b) percentual de fungos filamentosos e

leveduras.

25

Tabela 3. Fungos obtidos a partir dos solos da Antártica e identificados por meio da comparação de suas sequências utilizando o programa BLASTn e

o banco de dados do NCBI GenBank

Ilha/Região Densidade

(UFC g-1) UFMGCBa

Resultado Top BLAST (número de acesso no

GenBank)

Cobertura

(%)

Identidade

(%)

Nº de bp

analisados

Espécie ou grupo

taxonômico proposto

Nelson/Rip Point 100 10163 Mortierella antarctica (NR111580)b 98 100 531 M. antarctica

300 10364 Mortierella parvispora (NR077185)b 98 95 625 Mortierella sp.

150 10363

Penicillium tardochrysogenum (NR138308)b

Penicillium chrysogenum (AY495981)c

Penicillium chrysogenum (JF909937)d

100

100

97

100

98

99

475

477

990

P. chrysogenum

300 10164 Preussia flanaganii (NR077168)b 100 99 422 P. flanaganii

206.83 10378 Pseudogymnoascus destructans (NR111838)b 100 99 441 P. cf. destructans

140 11125 Mrakia frigida (NG042346)d 100 100 440 M. frigida

183.25 11122 Saccharomyces uvarum (LT594195)e

Saccharomyces cerevisiae (KC881067)b

99

85

98

99

708

689 S. cerevisiae

300 11133 Vishniacozyma victoriae (AF363647)e 100 100 426 V. victoriae

300 11126 Phenoliferia glacialis (EF151258)e 100 99 416 P. glacialis

Rei George/Yellow

Point 167.24 10226

Pseudogymnoascus destructans (NR1118381)b

Pseudogymnoascus verrucosus

(XM018269756)c

81

45

98

98

649

462 P. cf. destructans

150 10278 Geomyces pannorum (DQ117444)b 100 99 431 P. pannorum

100 10271 Glarea lozoyensis (NR137138)b 71 89 651 Glarea sp.

200 10493 Gyoerffyella tricapillata (KC834059)b 100 93 529 Gyoerffyella sp.

100 10254 Mortierella amoeboidea (NR111579)b 99 99 553 M. amoeboidea

400 10281 Mortierella parvispora (NR077185)b 99 99 583 M. parvispora

100 10323 Mucor aligarensis (NR103634)b 96 86 593 Mucor sp.

250 10240

Penicillium chrysogenum (AY495981)b

Penicillium chrysogenum (NR111815)c

Penicillium chrysogenum (JF909937)d

100

100

100

98

98

99

451

451

965

P. chrysogenum

26

Pinguim/Solo Vermelho 200 10297 Antarctomyces pellizariae (KX576510)b 100 100 406 A. pellizariae

300 10171

Pseudogymnoascus destructans (NR111838)b

Pseudogymnoascus verrucosus

(XM018269756)c

83

43

97

98

410

450 P. cf. destructans

100 10296 Mortierella parvispora (NR077185)b 99 94 614 Mortierella sp.

Pinguim/Solo Preto 116.66 10193

Penicillium tardochrysogenum (NR138308)

Penicillium chrysogenum (AY495981)c

Penicillium chrysogenum (AY495981)d

100

100

97

100

98

99

458

454

1008

P. chrysogenum

100 10197 Pseudogymnoascus appendiculatus

(NR137875)b 100 99 374 P. appendiculatus

165.38 10326 Pseudogymnoascus destructans (NR111838)b 96 98 548 P. cf. destructans

100 10192 Pseudogymnoascus verrucosus (KJ755525)b 100 99 408 P. verrucosus

Robert/Coppermine

Península 175 10311 Antarctomyces pellizariae (KX576510)b 100 100 479 A. pellizariae

987.5 10188 Pseudogymnoascus destructans (NR111838)b 94 97 503 P. cf. destructans

229.83 10320 Geomyces destructans (EU884921)b 100 99 481 G. destructans

400 10160 Goffeauzyma gilvescens (KY107769)e 100 100 427 G. gilvescens

433.33 10292 Mortierella amoeboidea (NR111579)b 100 99 544 M. amoeboidea

400 10313 Mortierella antarctica (NR111580)b 98 100 528 M. antarctica

850 10336 Mortierella elongatula (NR111582)b 93 95 628 Mortierella sp.

100 10325 Mortierella parvispora (NR077185)b 100 95 601 Mortierella sp.

350

10210

Penicillium rubens (NR111815)b

Penicillium chrysogenum (AY495981)c

Penicillium chrysogenum (JF909937)d

100

100

100

100

98

99

471

450

967

P. chrysogenum

750 10198 Pseudogymnoascus verrucosus (KJ755525)b 99 99 418 P. verrucosus

100 10161 Rhodotorula mucilaginosa (KY109056)e 100 100 448 R. mucilaginosa aUFMGCB = Coleção de micro-organismos e células da Universidade Federal de Minas Gerais. Táxon sujeito a análise filogenética baseada no

sequenciamento da região bITS, cβ-tubulina, dPolimerase II e eD1/D2 regiões da subunidade maior do gene do rRNA. fPosição taxonômica sugerida

pelas análises filogenéticas de acordo com bITS, cβ-tubulina dPolimerase II e/ou eD1/D2 sequências depositadas no GenBank.

27

Figura 4. Análise filogenética das sequências de fungos (em negrito) a partir de amostras de solo da Península Antártica em comparação com as

sequências tipo das espécies mais próximas após a análise no BLASTn, depositadas na base de dados GenBank. As árvores (a – f) foram construídas

com base nas sequências da região ITS por meio do parâmetro composto máximo de Likelihood. As sequências de Mucor circinelloides (NR126116) e

Aspergillus glaucus (AY373887) foram utilizadas como out group (OG).

28

Figura 5. Análise filogenética das sequências de fungos (em negrito) a partir de amostras de solo da Península Antártica em comparação com as

sequências tipo das espécies mais próximas após a análise no BLASTn, depositadas na base de dados GenBank. As árvores (g – i) foram construídas

com base nas sequências da região ITS por meio do parâmetro composto máximo de Likelihood. As sequências de Mucor circinelloides (NR126116) e

Aspergillus glaucus (AY373887) foram utilizadas como out group (OG).

29

Figura 6. Análise filogenética das sequências de fungos (em negrito) a partir de amostras de solo da Península Antártica em comparação com as

sequências de tipo das espécies mais próximas após análise BLAST, depositadas no banco de dados GenBank. As árvores (a – f) foram construídas

com base na região D1/D2 por meio do parâmetro composto máximo de Likelihood. A sequência de Kluyveromyces lactis (AY497689) foi usada como

out group (OG).

30

Figura 7. Análise filogenética das sequências de fungos (em negrito) a partir de amostras de

solo da Península Antártica em comparação com as sequências de tipo das espécies mais

próximas após análise BLAST, depositadas no banco de dados GenBank. A árvore foi

construída com base nos fragmentos gênicos do gene da β-tubulina por meio do parâmetro

composto máximo de Likelihood. A sequência de Mucor circinelloides (KT207682) é usada

como out group (OG).

Figura 8. Análise filogenética das sequências de fungos (em negrito) a partir de amostras de

solo da Península Antártica em comparação com as sequências de tipo das espécies mais

próximas após análise BLAST, depositadas no banco de dados GenBank. A árvore foi

construída com base nas sequências do fragmento gênico da RNA polimerase II por meio do

parâmetro composto máximo de Likelihood. A sequência de Mucor irregularis (JX976280) é

usada como out group (OG).

31

5.2 Análises químicas do solo

O resultado da composição química do complexo sortivo é apresentado na Tabela 3.

De maneira geral, os solos amostrados são jovens e refletem as condições de baixo grau de

intemperismo da Antártica. Todas as amostras apresentaram pH variando de neutro a alcalino.

O solo localizado no Yellow Point apresentou o menor valor de pH (5,9), justificado pelo fato

de que sua gênese está associada à oxidação de sulfetos. Esse processo já foi descrito em

outras áreas da Península Antártica (Souza et al., 2014) e Antártica Marítima (Simas et al.,

2007; Lopes et al., 2017) sendo sempre reportado como um dos processos responsáveis por

formar os solos mais desenvolvidos da Antártica, conhecidos como solos sulfatados.

Outro destaque revelado pelas análises químicas é a pouca influência ornitogênica nos

solos estudados. Em muitas áreas da Antártica, a intensa colonização por aves faz com que

ocorra a interação dos excrementos dessas e os substratos (rochas e sedimentos). A

decomposição da matéria orgânica destes excrementos também cria condições de acidez

(processo de nitrificação – processo químico-biológico de formação de nitrito no solo), que

permite intensificar o intemperismo químico das rochas e incorporar ao solo diversos

elementos químicos contidos no guano (fezes de aves). Esse processo gera os solos

ornitogênicos, que junto com os solos sulfatados, representam a máxima expressão da

pedogênese nas condições Antárticas. A acumulação de P (fósforo) cria verdadeiros

reservatórios de nutrientes e o processo associado é conhecido como fosfatização.

Pioneiramente estudada na Antártica por Syroyetschkovskiy em 1959 (Tatur, 1989) a

fosfatização é considerada hoje um importante processo na geração de condições favoráveis à

colonização biológica, na medida em que proporciona reservatórios de nutrientes para micro-

organismos e a vegetação. Como os teores de P são extremamente alto nos solos

ornitogênicos, tal como revelado por Tatur et al. (1984); Oliveira (2008); Tatur e Barczuk,

(1985); Tatur (1989); Myrcha e Tatur (1985) e Pereira et al. (2013), entre outros, e

considerando o limite mínimo de 500 mg/dm3 proposto por Simas et al. (2007) para a

classificação como ornitogênicos, percebe-se que as amostras superficiais dos solos estudados

não revelaram uma participação ativa da avifauna, motivo pelo qual se entende que o

conteúdo de P pode estar relacionada a uma fosfatização incipiente (poucos ou esporádicos

ninhais nas áreas de coleta) ou do próprio material de origem dos solos.

Por fim, as análises revelam um alto conteúdo de Na (sódio) no complexo sortivo, com

valores que chagam quase 400 cmolc/dm3. Ainda que as rochas que constituem os solos

32

estudados possam conter minerais que possuem Na em sua composição, esses valores

parecem estar mais relacionados à interferência de sprays salinos. É comum no ambiente

Antártico que a forte incidência de vento associada à alta salinidade das áreas oceânicas

resulte na dispersão de sódio e consequente enriquecimento absolutos dos solos da Antártica

Marinha (Francelino et al., 2011).

Os índices de diversidade mostraram que as comunidades de fungos são

moderadamente diversas, ricas e com domínio de alguns táxons (Tabela 4). O solo da Ilha

Nelson foi o mais rico e diverso, em contraste com a comunidade da Ilha Pinguim, o qual

apresentou os menores valores. O índice de similaridade de Sorensen (Figura 9) mostra a

distribuição das comunidades de fungos nas diferentes ilhas. A comunidade de fungos da Ilha

Pinguim Vermelho e Ilha Robert são as mais próximas, já a Ilha Rei George registrou as

espécies mais diferentes. Somente a espécie de P. destructans ocorreu em todos os solos de

todas as ilhas amostradas.

Tabela 4. Parâmetros físico-químicos e diversidade do conjunto de fungos em solos de

diferentes ilhas antárticas.

apH em água; bextraído com Melich-1 em mg dm3-1; ctroca de cátions em cmolc dm3-1; dPinguim V = solo vermelho; Pinguim P = solo preto.

Solos da ilhas antárticas

Análises físico-

químicas /Índices de

diversidade

Rei George Pinguim Vd Pinguim Pd Nelson Robert

pHa 5,47 6,47 6,64 7,34 6,77

Fósforob 125,3 95,4 21,85 71,15 174

Potássiob 110 14,5 63 76 250,5

Sódiob 200,1 65,2 180,4 393 321,95

Cálcioc 17,09 0,45 0,8 43,33 10,38

Magnésioc 8,92 0,085 0,45 5,88 28,34

Alumínioc 1,3 0 0 0 0

Número de Táxons 9 3 4 12 13

Fisher α 1,24 0,41 0,6 1,63 1,57

Margalef 1,07 0,31 0,5 1,4 1,37

Simpson 0,86 0,61 0,7 0,9 0,88

33

Figura 9. Dendrograma mostrando a similaridade de Sorensen entre as

comunidades de fungos obtidas dos solos das diferentes ilhas da Península

Antártica. Pinguim P = solo preto; Pinguim V = solo vermelho.

5.3 Ensaios leishmanicida, tripanossomicida, antiviral e herbicida

Um total de 218 extratos fora avaliados no painel de ensaios biológicos. Não houve

atividade significativa contra L. amazonensis, Dengue soroto tipo 2 e Zika vírus. Entretanto,

sete isolados se destacaram (cinco P. destructans, um M. parvispora e um P. chrysogenum) e

foram capazes de inibir seletivamente as formas amastigotas intracelulares de T. cruzi com

valores percentuais próximos ao da droga controle. O melhor resultado foi para o extrato de P.

chrysogenum UFMGCB 10240, o qual apresentou o maior índice de seletividade (menor

toxicidade para as células de mamiferos) e a melhor IC50 frente ao parasito (Tabela 5).

Dezoito apresentaram atividade herbicida (Tabela 6), dos quais sete isolados (cinco P.

destructans e dois P. tardochrysogenum) apresentaram os resultados mais siginificativos,

quanto a inibição das sementes de A. schoenoprasum. Frente a L. sativa os resultados mais

significativos foram de um extrato de P. destructans e um de Mortierella sp..

34

Tabela 5. Atividades biológicas dos extratos obtidos das espécies de fungos isoladas do solo da Antártica.

Espécies UFMGCBa % Atividade

antiviral Atividade antiparasitária

DENV-2b Zika

vírusf

% redução

de T. cruzi IC50 (mg mL-1)c

IC50 célula

L929d

Índice de

Seletividadee

% morte L.

amazonensis

Mortierella sp. 10364 4 ± 3 0 ± 9 59,9 ± 3 23 ± 9 30 ± 14 1,3 33 ± 1

Penicillium chrysogenum 10240 6 ± 1 0 ± 5 66 ± 10 10,1 ± 6,2 90 ± 14 5,5 59 ± 2

Pseudogymnoascus

destructans 10169 10 ± 3 0 ± 5 69,5 ± 13 20,6 ± 13,2 90 ± 14 2,7 12 ± 3

P. destructans 10453 8 ± 5 0 ± 3 73,5 ± 7 15,3 ± 5,1 70 ± 42 2 68,5 ± 1

P. destructans 10312 0 ± 3 0 ± 3 78,1 ± 1 20 ± 10,7 45 ± 7 1,4 37 ± 1

P. destructans 10185 6 ± 10 0 ± 2 61,6 ± 2 23 ± 4,2 >100 >3,5 24 ± 5

P. destructans 10387 0 ± 7 0 ± 0,6 63,4 ± 6 34,5 ± 34,2 90 ± 14 1,4 1 ± 1

Controles anfoterecina B - - - - - - 76

benznidazol - - 82 1 625 625 -

IFNA α 2b 30 ± 1 35 ± 3,6 - - - - -

aUFMGCB = Coleção de micro-organismos e Células da Universidade Federal de Minas Gerais; bResultado expresso pela concentração em que o

extrato é capaz de produzir 50% de sua resposta máxima (EC50) a 1,18 μg de extrato mL-1 Dengue vírus sorotipo 2 em células BHK-21, teste MTT;

cConcentração do extrato que inibe 50% do crescimento de Trypanosoma cruzi; d50% da viabilidade celular (L929). eIC50 célula L929/IC50 parasito;

fEnsaio MTT, em Células Vero.

35

Tabela 6. Atividade herbicida dos extratos obtidos das espécies de fungos isoladas do solo da

Antártica.

Espécies UFMGCBa Atividade herbicida

A. schoenoprasum

Monocotiledôneas

L. sativa

Dicotiledôneas

Mortierella sp. 10316 3 ± 0 2 ± 0

Mortierella sp. 10351 2 ± 0,5 4 ± 0

Pseudogymanoascus sp. 10344 3 ± 0,5 3 ± 0

Pseudogymnoascus destructans 10312 4 ± 0 1 ± 1

P. destructans 10238 4 ± 0,5 1 ± 1

P. destructans 10263 3 ± 0 1 ± 0

P. destructans 10268 0 ± 0 3 ± 0

P. destructans 10286 2 ± 0,5 3 ± 0

P. destructans 10294 3 ± 0 2 ± 1

P. destructans 10310 4 ± 0,5 1 ± 0,5

P. destructans 10339 2 ± 0 3 ± 0

P. destructans 10342 3 ± 0 4 ± 0,5

P. destructans 10356 0 ± 0 3 ± 0

P. destructans 10378 3 ± 0 2 ± 1

P. destructans 10441 3 ± 0 0 ± 0

P. destructans 10454 2 ± 0,5 3 ± 0

Penicillium tardochrysogenum 10379 4 ± 0,5 2 ± 0,5

P. tardochrysogenum 10498 4 ± 1 0 ± 0

Controle Glifosato 4 ± 0 5 ± 0

aEstimativa de fitotoxicidade usando uma escala de classificação de 0-5, onde 0 = sem efeito e

5 = sem crescimento ou sem germinação das sementes. Alvos: L. sativa = Lactuca sativa

(alface crespa), A. schoenoprasum = Allium schoenoprasum (cebolinha verde).

36

6 DISCUSSÃO

6.1 Diversidade

Apesar das condições extremas, os solos antárticos abrigam diferentes gêneros de

fungos, dentro os quais Pseudogymnoascus, Mortierella e Penicillium foram os mais

recorrentes. Entre as espécies destes gêneros, P. destructans apresentou as maiores densidades

e ampla distribuição geográfica nas ilhas amostras; seguido de P. tardochrysogenum e M.

elongulata.

Pseudogymnoascus (Geomyces) inclui espécies que ocorrem nos solos do Ártico,

Alpes, regiões temperada e da Antártica (Mercantini et al., 1989; Onofri, 1999). Espécies de

Pseudogymnoascus parecem ter a capacidade de colonizar e utilizar diferentes fontes de

carbono e são abundantes em ecossistemas com temperaturas mais baixas (Arenz, 2011).

Pseudogymnoascus já foram obtidas de diferentes substratos na Antártica como solos

(Mercantini et al., 1989; Arenz, 2011), musgos (Tosi, 2002), como endofíticos de C. quitensis

(Rosa et al., 2010), associados a macroalgas (Loque et al., 2010; Furbino et al., 2014), em

água de lagos (Gonçalves et al., 2012) e na líquenosfera (Santiago et al., 2015). Entre as

espécies de Pseudogymnoascus, P. destructans é o mais conhecido, pois representa um fungo

psicrofílico patogênico capaz de reduzir a população de morcegos por meio da síndrome do

nariz-branco [white nose syndrome (WNS)] em regiões temperadas da América do Norte e

Europa (Lorch et al., 2011). De acordo com Langwig et al. (2015), durante a hibernação o

sistema imunológico dos morcegos diminui tornando-os vulneráveis à infecção por P.

destructans. No que se refere aos isolados antárticos de P. destructans, até o momento não há

nenhuma informação sobre ao seu potencial virulento frente aos animais da região.

O segundo gênero mais abundante encontrado nos solos antárticos foi Penicilium, o

qual é ubíquo e presente em diferentes substratos e ambientes (Arenz, et al., 2006; Godinho et

al., 2015). Na Antártica as espécies de Penicillium já foram descritas em solos com presença

de plantas, solos ornitogênicos (Mcrae et al., 1999), permafrost (Zucconi et al., 2012) e

associadas a macroalgas (Godinho et al., 2013). Entre estas espécies, P. tardochrysogenum é

considerado endêmico da Antártica e até o momento já foi isolado do solo dos vales secos de

McMurdo (Houbraken et al., 2012) e em solos continentais oligotróficos (Godinho et al.,

2015).

37

De acordo com Kirk et al. (2008), Mortierella possui 85 espécies e ocorre em

diferentes tipos de solo e algumas ocorrem em ambientes com baixas temperaturas (Sogonov

et al., 2004). Na Antártica, espécies de Mortierella foram isoladas de musgos (Tosi, 2002;

Melo et al., 2014), líquens (Santiago et al., 2015), solos (Bridge e Newsham, 2009), água de

lagos (Gonçalves et al., 2012), associados a macroalgas (Godinho et al., 2013) e rizosfera de

D. antartica (Gonçalves et al., 2015). Entre as espécies de Mortierella que foram isoladas

neste estudo, apenas a espécie Mortierella antartica é considerada como endêmica da

Antártica. Mortierella antarctica já foi isolada a partir de amostras de solo (Adams et al.,

2006; (Frate e Carreta, 1990; Zucconi et al., 1996) e musgos (Tosi, 2002) na Antártica, essa

espécie, assim como outras do gênero Mortierella, possuem capacidade de biotransformação

e/ou acumulação de ácidos graxos insaturados, podendo ser utlizadas em aplicações

biotecnológicas (Wagner et al., 2013). De acordo com Onofri et al. (2004), M. Antarctica

possui capacidade de produção de ácidos importantes para seu desenvolvimento a baixas

temperaturas (ácido linoleico e ácido araquidônico), sendo capaz de crescer e esporular a 0 ºC.

Segundo Maggi et al. (2013), a ausência ou presença dos ácidos citados anteriormente,

ajudam na identificação das espécies de Mortierella que já foram relatadas.

Gyoerffyella inclui espécies de fungos aquáticos (Kirk et al., 2008). Na Antárica, já foi

isolado de C. Quitensis (Santiago et al., 2016), água de lagos (Gonçalves et al., 2012) e

associado a musgos (YU et al., 2013) . Nas análises filogenéticas a sequência de Gyoerffyella

sp. UFMGCB 10493 agrupou com as sequências de G. entomobryoides e Gyoerffyella

tricapillata, as quais são descritas como patógenos de plantas (Borema e Von Arx, 1964) e

hifomicetos aquáticos (Baschien et al., 2013). Gyoerffyella sp. UFMGCB 10493 obtido do

solo antártico pode ter um papel importante em processos de decomposição no ambiente

terrestre e aquático da Antártica.

Algumas espécies de Vishniacozyma (anteriormente reportadas como Cryptococcus)

ocorrem em diferentes substratos na Antártica (Vishniac, 2017) como em solos de

pinguineiras, solos normais, sedimentos e água de lagos, rizosfera de D. antarctica (Vaz et

al., 2011), macroalgas (Furbino et al., 2014), líquens (Santiago et al., 2015) e endofíticos de

D. antarctica e C. quitensis (Santiago et al., 2016). Espécies de Mrakia são relatadas como

leveduras adaptadas ao frio obtidas de substratos de ambientes extremos como no Ártico

(Pathan et al., 2010; Singh e Singh, 2012), Alpes (Thomas-Hall et al., 2010) e Patagônia (De

Garcia et al., 2007). Na Antártica, Mrakia ocorre em solos e sedimentos de lagos (Di Menna,

38

1966; Tsuji et al., 2013; Tsuji, 2016). Phenoliferia possui quatro espécies e também ocorre

em ambientes extremos (Wang et al., 2016). Phenoliferia glacialis (Rhodoturula glacialis) é

uma levedura psicrofílica oleaginosa originalmente isolada de geleiras na Áustria (Margesin

et al., 2007; Amaretti et al., 2010). Na Antártica, P. glacialis já foi obtida de sedimento

marinho na península da Antártica (Vaz et al., 2011). Já R. mucilaginosa é uma espécie

ubíqua presente em diferentes habitats e substratos, incluindo ambientes frios e extremos

(Alves, 2017). Na Antártica, R. mucilaginosa já foi isolada de substratos terrestres e marinhos

(Godinho et al., 2013; Vaz et al., 2011).

Isolados da levedura S. cerevisiae foram obtidos de amostras de solo em Rip Point,

Ilha Nelson. Saccharomyces cerevisiae é uma levedura com propriedades fermentativas e

capacidade criotolerante. Já foi isolada de carvalhos (Fagaceae) na floresta Patagônica (Flores

et al., 2017; Libkind, 2011) e de cascas de Araucaria araucana (Rodríguez et al., 2017). No

entanto, até o momento, não há relato sobre a ocorrência de S. cerevisiae na Antártica.

6.1.1 Bioprospecção

Cinco isolados de P. destructans forneceram extratos com atividade seletiva contra T.

cruzi com baixos danos as células normais. Além disso, os extratos de P. destructans se

mostraram herbicidas; alguns com valores iguais ao controle utilizado. Táxons de

Pseudogymnoascus foram relatados com substâncias bioativas. (Li et al., 2008) isolaram as

geomicinas B e C, que apresentaram atividades antifúngicas e antibacterianas contra

Aspergillus fumigatus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Streptococcus pneumoniae.

(Zhang et al., 2013) relataram que Pseudogymnoascus possui atividade antimicrobiana e

antifúngica. Furbino et al. (2014) relataram duas espécies de Pseudogymnoascus associadas

com macroalgas antárticas capazes de produzir atividade antifúngica contra Candida albicans

e Cladosporium sphaerospermum.

Brunati et al. (2009) relataram que algumas espécies de Penicillium obtidas de lagos

da Antártica são capazes de produzir substâncias citotóxicas e antimicrobianas; entre elas P.

chrysogenum foi capaz de inibir S. aureus, Enterococcus faecium e E. coli. Algumas espécies

de Penicillium até hoje são considerados fontes de novos fármacos com atividades

antimicrobianas e antitumorais (Godinho et al., 2013, 2015). Nesse trabalho, o extrato do

isolado P. chrysogenum UFMGCB 10240 apresentou forte atividade tripanosomicida e os

obtidos de P. tardochrysogenum (UFMGCB 10379 e UFMGCB 10498) significativas

39

atividades herbicidas. Estes resultados estão de acordo Godinho et al. (2015) que também

verificaram atividade herbicida de espécies de Penicillium obtidos de solos ultra-oligotróficos

da região continental da Antártica.

As espécies de Mortierella são conhecidas como produtoras de ácidos graxos

bioativos. Mortierella alpina obtida a partir de lagos antárticos produz altos níveis de ácidos

graxos poliinsaturados, ácido γ linolênico e ácido araquidônico com atividades antioxidantes e

antibacterianas (Melo et al., 2014). Mortierella parvispora é produtora de ácido araquidônico

e ácido di-homo-γ-linolênico (Hou, 2008). O extrato de Mortierella sp. UFMGCB 10351

também apresentou atividade herbicida. A utilização de M. antarctica com características de

desenvolvimento de novos produtos ou agregar valor a processos, já vem sendo analisada por

diversos autores (Onofri et al., 2004; Maggi et al., 2013; Wagner et al., 2013), esses autores

trabalham principalmente no isolamento de substâncias para avaliação da capacidade

antimicrobiana, antibacteriana e antifúngica, há ainda análises de suplementação com M.

antarctica para aumento da produção de Ácido eicosapentaenóico (rico em ômega 3) em

grãos, essa suplementação estimula o aumento de ácido araquidônico, o que aumenta o valor

agregado do produto (Jacobs et al., 2009). Os resultados obtidos nesse trabalho, agregam

valor a utilização de Mortierella sp. na investigação de atividade antiparasitária e com fortes

características herbicidas, sendo possível sua utilização na agricultura.

7 CONCLUSÕES

Os resultados obtidos neste trabalho indicam que os solos da Península Antártica

abrigam espécies de fungos cosmopolitas adaptadas ao frio e também endêmicas.

Pseudogymnoascus destructans foi a espécie mais abundante e geograficamente distribuída

nos solos amostrados. Esse resultado corrobora com anteriores obtidos, os quais relatam

isolados de P. destructans da Antártica com aqueles capazes de atacar morcegos na América

do Norte, Europa e Ásia Paleártica. No entanto, serão necessários estudos mais aprofundados

para comparar se os isolados de P. destructans da Antártica são capazes de causar doenças em

morcegos ou em outros animais; estudos estes de suma importância, pois os solos da

Península Antártica podem estar sob os efeitos de alterações climáticas, o que pode levar a

liberação desses isolados para fora da Antártica.

Apesar de ser relatado como fungo patógeno para morcegos, diferentes isolados de P.

destructans exibiram atividades seletivas com características tripanossomicida com toxicidade

40

celular moderada, alta seletividade e forte atividade herbicida. Estes dados sugerem que P.

destructans também pode representar uma fonte promissora de substâncias bioativas

A detecção de S. cerevisiae nos solos da Antártica representa um importante achado,

pois sua distribuição geográfica até o momento não incluia a Antártica. Saccharomyces

cerevisiae já foi relatada em todos os continentes; em alguns deles com a determinação de seu

substrato natural e em outros não. Os isolados de antárticos de S. cerevisiae podem

representar fortes candidatos para utilização de processos de fermentação em baixas

temperaturas, pois foram obtidas de uma região constantemente fria na ilha Nelson. Contudo,

para determinação se S. cerevisiae ocorre naturalmente na Antártica, serão necessários novos

estudos de campo (re-coleta e re-isolamento em diferentes pontos da ilha Nelson e regiões

próximas), taxonômicos, moleculares e fermentativos.

41

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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1996. 880 ISBN 978-0-471-52229-4. Disponível em: <

http://www.wiley.com/WileyCDA/WileyTitle/productCd-0471522295.html >.

ALVES, I. M. S. Fungos presentes em rochas da Antártica: taxonomia, diversidade,

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