Estudo de Fragmentação

• EI - fragmentação de alta energia(carga e radical)

• ESI – fragmentação direcionado pela carga

Cone de extração 5V

Cone de amostra 30V

Hexapolo

CID: Baixa tensão de Cone

Cone de extração 5V

Cone de amostra 70V

Hexapolo

CID: Baixa tensão de Cone

Dissociação por colisãoinduzida ocorre antes daentrada no MS

Etalon 550 pg/ul, ES , FS positif , CV variables

90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340m/z0

100

%

0

100

%

0

100

%

Etalon 10 220 (12.126) 3: Scan ES+ 2.81e4214.36

96.03

89.34

174.16103.44 131.73

110.23 125.55 145.55 163.16 205.39196.16186.21

241.40

279.43263.34 304.36 327.08 337.74 348.20

Etalon 10 221 (12.162) 2: Scan ES+ 4.19e4241.39

214.33

205.30155.4798.15 138.52113.54 174.02 196.20 223.16 282.41264.53249.44 291.95 303.39 330.71312.82 343.97

Etalon 10 221 (12.144) 1: Scan ES+ 3.82e4241.39

130.8197.28 108.28 151.06 223.14171.00 195.59183.04 205.32 234.36 282.41264.47253.29 292.58 310.62 325.69 345.85

20 V

40 V

60 V

CianazinaCianazina

In Source CID (Collision induced dissociation)

Comparativo CID

150 200 250 300 350 400 450m/z0

100

%

0

100

%

3.95e5219.1468

218.1371

205.1370136.8547413.1390

313.1768233.0935 337.0945 431.1246

anafr3_cid 770 (3.436) Cm (696:775) TOF MSMS 479.30ES- 4.92e3275.2504

247.2551163.1904 223.2404

307.2480

479.2776308.2763

ESI+

ESI-

50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000

1000

2000

3000276

219

247

55 91 19177 17765115

149 234 261206107 163131 355 409 501438302 463384 424327

EI

OO

HO OHCHO

OO

OH

OH480 Da

- Tandem-in-Space

TANDEM MS ANALYZER COMBINATIONSTANDEM MS ANALYZER COMBINATIONS

- Tandem-in-Time

QIT

FTICR

Orbitraps

QqQ

Qq-TOF

MALDI-TOF-TOF

Fonte de ionização DetectorQ1 q2 Q3

seleção

varredura

varredura

seleção

seleção seleção

varredura

seleçãovarredura

varredura varreduraCID

CID

CID

CID

Modo de análise

full scan

SIM(monitoramento seletivo de íons)

Products ions(íons filhos)

MRM(monitoramento dereações múltiplas)

Precursor ions(íons precursores)

Neutral loss(perda neutra)

A precursor ion is any ion selected for analysis by CAD

Product ions are those fragment ions produced when the precursor ionundergoes dissociation in the collision cell during CAD

A product-ion spectrum is an array of product ions produced by decompositionof a given precursor

A precursor-ion spectrum is an array of precursor ions each of which is capableof generating a given product ion of a particular m/z value.

A neutral-loss spectrum is an array of ions that undergoes a common loss; e.g.,expulsion of a molecule such as H20

Modos de Aquisição - Q

• Full scan MS mode: varredura: 50 - 350

Pesticide Mix

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800Scan0

100

%

Pest03 1: Scan ES+ TIC

5.77e65.054.65

3.820.74

8.62

5.65

8.02

10.62

12.71

Pesticide Mix

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800Scan0

100

%

Pest03 1: Scan ES+ TIC

5.77e65.054.65

3.820.74

8.62

5.65

8.02

10.62

12.71

Pesticide Mix

50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350m/z0

100

%

Pest03 256 (4.719) 1: Scan ES+ 2.06e6229

60

55 21412169 10087 196163143

251

288274 349328

Pesticide Mix

50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350m/z0

100

%

Pest03 256 (4.719) 1: Scan ES+ 2.06e6229

60

55 21412169 10087 196163143

251

288274 349328

Pesticide Mix

50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350m/z0

100

%

Pest03 432 (7.945) 1: Scan ES+ 1.13e6222

60

55 21416512169 9987 143 196

244

236

268 309287 342325

Pesticide Mix

50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350m/z0

100

%

Pest03 432 (7.945) 1: Scan ES+ 1.13e6222

60

55 21416512169 9987 143 196

244

236

268 309287 342325

Pesticide Mix

50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350m/z0

100

%

Pest03 582 (10.696) 1: Scan ES+ 4.34e5263

60

55

214

19612169 9987 113 129 171143 185

223

287 309 334349

Pesticide Mix

50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350m/z0

100

%

Pest03 582 (10.696) 1: Scan ES+ 4.34e5263

60

55

214

19612169 9987 113 129 171143 185

223

287 309 334349

scan 7.9scan 7.9

scan 4.7scan 4.7

scan 10.6scan 10.6

Modos de Aquisição - Q

• Full scan MS mode

Fonte Detector

Q1

Fonte Detector

Q1

Single ion recording (SIR)

Cromatograma de Full ScanCorrente iônica total

• Varredura de uma ampla faixa de massas.• Identificação do composto de interesse dificultada pela co-eluição de compostos de mesma massa.• Pós-processamento do cromatograma com extração de massa de interesse, no entanto, devido ao processo de varredura possui sensibilidade inferior que o monitoramento seletivo de íons.

Pós - processamento do cromatograma de “full scan”: Extração do íon de m/z 78

50ppm. Volatile Organic Analysis Calibration Standard.

10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00Time0

100

%

0

100

%

V50 Scan EI+ TIC

2.07e5Area

19.61

19.27

7.67 14.1013.35

12.6410.43

15.9817.98

26.20

24.87

21.99

20.7022.87

27.58

30.38

36.0634.05

37.85

V50 Scan EI+ 78.11

6.07e4Area

19.27

9.13 17.9836.06

30.38

Modos de Aquisição - Q

• SIM ou SIR Monitoramento Seletivo de Íons

• Espectrômetro de Massas trabalha com seleção de uma pequena faixa de massasou valor unitário de massa.• Quanto menor a faixa de massas = maior a especificidade da análise.• Mais específico que o Full Scan.

Espectrometria de massas sequencial

Fonte Detector

Q1 q2 Q3

Fonte Detector

Q1 q2 Q3

Fonte Detector

Q1 q2 Q3

Fonte Detector

Q1 q2 Q3

Fonte Detector

Q1 q2 Q3

Fonte Detector

Q1 q2 Q3

Multiple reaction monitoring (MRM)

Espectrometria de massas sequencial

O que interessa neste modo de varredura é o cromatograma. O que interessa neste modo de varredura é o cromatograma.

Sinal/Ruído

Ruído

Sinal

(LC/LC/MS/MS)(LC/MS/MS)(LC/MS)(MS)(UV) Energia de Colisão (eV)

Íons filhos

Íons pai

Espectrometria de Massas Sequencial

F2

F4F3

F1

MH+

MH+

F1F2

F3

F4

Q1 q2 Q3

Cromatograma de MRM

• Monitoramento de um par Precursor>Fragmento.• Cromatograma muito simples = geralmente contendo um pico cromatográfico.• Ideal para análise de compostos alvo em matrizes complexas.• Mais seletivo e sensível que Full Scan.• Mais seletivo que SIM ou SIR

Monitoramento de Reações Múltiplas

20 40 60 80 100 120 140Scan0

100

%

0

100

%

Branco_02 MRM of 2 Channels ES+ TIC

2.43e31.64

0.600.52 1.281.020.98 2.181.94 2.722.28

Branco_01 MRM of 2 Channels ES+ TIC

2.26e31.641.040.700.440.24 1.10 2.181.92 2.50

2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0S c a n0

1 0 0

%

_T I C

3 . 1 8 e 4

2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0S c a n0

1 0 0

%

0

1 0 0

%

E x a t i d a o - 0 1 _ 1 1 M R M o f 2 C h a n n e l s E S + 3 2 1 . 9 > 2 7 5 . 9

3 . 0 1 e 4

E x a t i d a o - 0 1 _ 1 1 M R M o f 2 C h a n n e l s E S + 2 8 5 . 8 > 1 9 4 . 3

3 . 0 3 e 4

20 40 60 80 100 120 140S can0

100

%

0

100

%

0

100

%

tes te01 S m (M n , 2x3) M R M o f 2 C hanne ls E S + 749 .7 > 591 .2

9 .35e3

tes te01 S m (M n , 2x3) M R M o f 2 C hanne ls E S + 734 .6 > 576 .2

3 .84e4

tes te01 S m (M n , 2x3) M R M o f 2 C hanne ls E S + T IC

4 .55e4

Plasma Branco

Minutes0 2 4 6 8 10 12

0,00

0,01

0,02

0,03

(Met

roni

dazo

l)

(Tin

idaz

ol)

Minutes0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0

Vol

ts

0,00

0,01

0,02

(Am

oxic

ilina

)

(Cef

adro

xil)

Espectro e cromatograma de MRM

MRM de 3 transições

15pg/ml std

1.00 2.00 3.00Time0

100

%

0

100

%

0

100

%

Assay09 Sm (Mn, 2x3) MRM of 3 Channels AP+ 294.1 > 64

3.55e32.79

Assay09 Sm (Mn, 2x3) MRM of 3 Channels AP+ 288.1 > 58

2.72e42.79

Assay09 Sm (Mn, 2x3) MRM of 3 Channels AP+ 274.1 > 182.1

1.53e42.65

15pg/ml std

1.00 2.00 3.00Time0

100

%

Assay09 Sm (Mn, 2x3) MRM of 3 Channels AP+ TIC

3.52e42.77

OBS: Modo de varredura de Quadrupolos tandem

Otimização das condições do MS/MS.

50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350m/z0

100

%

0

100

%

0

100

%

0

100

%

CID_ABZ-SO01 213 (3.937) Sm (Mn, 2x1.00); Cm (210:226) Daughters of 282ES+ 5.25e6159.0226

130.9524121.9298

208.1454191.1028

CID_ABZ-SO01 320 (5.915) Sm (Mn, 2x1.00); Cm (311:322) Daughters of 282ES+ 8.09e6208.1454

159.0226 191.1028 239.9749

CID_ABZ-SO01 38 (0.702) Sm (Mn, 2x1.00); Cm (37:46) Daughters of 282ES+ 9.36e6240.2256

208.1454

191.1028 222.1805 282.0802

CID_ABZ-SO01 10 (0.185) Sm (Mn, 2x1.00); Cm (10:22) Daughters of 282ES+ 7.81e6282.0802

240.2256

E. colisão= 5 eV

E. colisão = 12 eV

E. colisão = 25 eV

E. colisão = 35 eV

C3H6

CH3OH

SOH

p g p ( )

100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340m/z0

100

%

0

100

%

3702SPECTS-18 1 (1.030) Scan ES+ 3.65e9285

287326

288 328

3702SPECTS-24 1 (1.030) Daughters of 287ES+ 3.69e7156

105 117127 147

193

181172169

287222

221207 230 243 259

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500m/z0

100

%

0

100

%

4202CPSPI003 1 (0.502) Scan ES+ 1.11e9377.222

378.223

4202CPSPI010 1 (0.502) Daughters of 377ES+ 6.53e7234.293

160.263130.163

117.146 134.293

303.192

377.096

Analise Multi resíduos

Proteoma-MS

MS ?

Gel MS

Sequenciamento de aminoácidos

Roepstorff and Fohlman in 1984 [1] and modified by Johnson in 1987

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200M/z0

100

%

1: TOF MSMS 544.00ES+

169.16

156.10

110.08

1088.84(M+H) +

892.57197.16

243.15 311.23

503.38

356.26458.36 631.53

537.42

778.57

650.54875.61

991.77

933.50 1070.83

1089.20

Sequenciamento de aminoácidos

Ionização a Pressão Atmosférica (API). Eletrospray (ESI)

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200M/z0

100

%

H S L F K F N V P yMax169.16

a2

156.10y1

110.08H

1088.84(M+H) +

892.57y7

197.16b2

243.15y2

311.23b3 503.38

y4356.26

y3

458.36b4

631.53y5

537.42

778.57y6

650.54875.61

991.77y8

933.50b8

1070.83

1089.20

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200M/z0

100

%

PV N F K F L S H bMax169.16

a2

156.10y1

110.08H

1088.84(M+H) +

892.57y7

197.16b2

243.15y2

311.23b3 503.38

y4356.26

y3

458.36b4

631.53y5

537.42

778.57y6

650.54875.61

991.77y8

933.50b8

1070.83

1089.20