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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE NUTRIÇÃO
Efeitos de extratos de frutos na ativação de bactérias patogênicas e ácido láticas
PRISCILLA DEBESA BELIZÁRIO SILVA
Cuiabá-MT, Outubro de 2018
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE NUTRIÇÃO
Efeitos de extratos de frutos na ativação de bactérias patogênicas e ácido láticas
PRISCILLA DEBESA BELIZÁRIO SILVA
Trabalho de Graduação apresentado ao Curso de Nutrição da Universidade Federal de Mato Grosso como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Bacharel em Nutrição, sob orientação da Profª. Drª. Maressa Caldeira Morzelle.
Cuiabá-MT, Outubro de 2018
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE NUTRIÇÃO
Efeitos de extratos de frutos na ativação de bactérias patogênicas e ácido láticas
PRISCILLA DEBESA BELIZÁRIO SILVA
Orientador:
Profª. Drª. Maressa Caldeira Morzelle
MEMBROS DA BANCA EXAMINADORA
Julgado em: 05/10/2018
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DEDICATÓRIA
Dedico esse trabalho a toda a minha família que sempre me apoiou em todas as
decisões tomadas em minha vida.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por me permitir viver todas as experiências passadas até aqui, que me deu saúde para cursar até o fim o curso de Nutrição, aproveitando cada momento, cumprindo com todas as responsabilidades que me foram designadas, e por ter me proporcionado ter ao meu lado pessoas muito especiais.
A minha família, que sempre me apoiou em todas as decisões que tomei em minha vida, que estiveram ao meu lado durante todo o curso e que me fizeram acreditar que era possível realizar todos os meus sonhos, só bastava ter fé e dedicação.
As minhas avós Maria e Lourdes (in memorian) por todo o amor, dedicação e por ter me ensinado a ter união e princípios que nunca passarei por cima, mediante a circunstância alguma. E ao meu avô David pela dedicação a nossa família.
Aos meus pais Cícero e Odila por me darem a vida, a educação e o amor sem dimensões. Que me ensinaram a ser independente e a escolher com discernimento o caminho por onde devo seguir.
A minha irmã Melissa eu agradeço por existir e ser tão presente em minha vida! Por ser minha melhor amiga, minha companheira, por ser exemplo de integridade e honestidade, por me ensinar e ser prova viva de que Deus só dá grandes batalhas a grandes guerreiros.
Ao meu irmão Gabriel por ser tão amoroso, parceiro e um dos motivos que eu tenho nessa vida para lutar.
Ao meu marido Henderson por ser meu companheiro, estar ao meu lado nos momentos felizes, mas principalmente por não me abandonar nos momentos mais difíceis que passei na vida! Agradeço pelo amor, carinho e paciência dedicados diariamente a mim e por me ajudar a ser uma pessoa melhor a cada dia.
Aos meus padrinhos Messias e Sandra que além de todo o carinho, me proporcionaram a realização de um sonho, o baile de formatura!
Aos meus tios José Saraiva, Margarida e minha prima Jéssica, que me ensinaram a ver a vida por outro ângulo, a ter esperança e amor no coração sempre, independente das circunstâncias. Além da paciência e de me doarem o espaço de suas casas sempre que foi necessário para desenvolver este trabalho.
Ao meu primo, irmão e cunhado Thiago (in memorian), que teve sua passagem por essa vida tão curta deixando saudade imensa, porém em tão pouco tempo foi capaz de me dedicar tanto companheirismo, amor e carinho.
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As minhas amigas Camila Kaziuk, Michelly, Rafaela e Regiane obrigada por todos esses 5 anos juntas, por todas as madrugadas estudando, por todas as broncas, por todos os momentos felizes e tristes, por todo o apoio e por todo companheirismo. Aprendi muito com a personalidade e amizade de cada uma!
Aos meus amigos de infância Alex e sua esposa Eduarda, Alexandre, Maiza, Michelle, Ohanna e Nathália que sempre estiveram presentes em minha vida de forma muito amorosa, por estarem comigo nas horas de desabafo e pelas boas gargalhadas em momentos de comunhão.
A minha orientadora, Profª. Drª. Maressa Caldeira Morzelle que é um exemplo de profissional, de pesquisadora, que compartilhou de seus conhecimentos, teve paciência e se disponibilizou a desenvolver essa pesquisa junto a mim. Obrigada por tudo, essa experiência eu carregarei para a vida!
A minha coorientadora Profª. Drª. Sabrina Neves Casarotti por compartilhar conosco suas experiências em microbiologia, sendo parte importantíssima para o desenvolvimento dessa pesquisa.
Ao Dr. Márcio, técnico do laboratório de microbiologia, pela paciência e por ter colaborado para o desenvolvimento dessa pesquisa.
E a todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram em alguma etapa do meu desenvolvimento acadêmico, bem como dessa pesquisa, o meu muito obrigado!
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Todos saboreiam o fruto e ninguém vê a semente germinar.
Os que veem a riqueza não veem a economia.
Os que veem a obra não veem a labuta.
Os que veem o saber não veem os estudos.
Os que veem a prosperidade não veem o trabalho.
E os que veem a recompensa não veem as privações!
(Autor desconhecido)
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RESUMO
A microbiota intestinal é composta por uma variedade de microrganismos, sendo que uns possuem efeitos benéficos enquanto outros podem trazer malefícios à saúde do hospedeiro. Estudos recentes indicam que compostos bioativos presentes em alimentos podem influenciar estimulando e/ou inibindo o crescimento dos microrganismos, colaborando assim para o equilíbrio da microbiota intestinal. Diante do exposto, o objetivo deste estudo foi analisar o efeito de extratos aquosos à base de frutos não convencionais no crescimento de bactérias ácido láticas com potencial probiótico e de bactérias patogênicas. Foram testados os seguintes frutos: abiu roxo (Chrysophyllum cainito); atemoia (Annona cheriola); baru (Dipteryx alata); cacau (Theobroma cacao); caju (Anacardium occidentale); jabuticaba (Plinia cauliflora); jambo-rosa (Syzygium samarangense); pequi (Caryocar brasiliense) e tamarindo (Tamarindus indica). Para a análise do efeito no crescimento, os extratos foram inseridos em discos de 6 mm juntamente com cepas de bactérias patogênicas (Escherichia coli; Salmonella entérica e Staphylococcus aureus) e ácido láticas (Lactobacillus fermentum; Lactobacillus casei; Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus). Os resultados indicaram que o extrato de tamarindo inibiu o crescimento das bactérias patogênicas testadas e estimulou o crescimento de Lactobacillus fermentum cepa 30 e Lactobacillus casei cepa 37. O extrato de atemoia promoveu o crescimento de todas as cepas de bactérias ácido láticas utilizadas. Estes dados demonstram o possível benefício do consumo de atemoia e tamarindo na microbiota intestinal humana. Palavras-chaves: compostos fenólicos; microbiota intestinal; extrato aquoso; Salmonella; Lactobacillus.
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ABSTRACT
The intestinal microbiota is composed of a variety of microorganisms in which some have beneficial effects while others can bring harm to the host's health. The quantity and quality of the colonies present in the intestinal microbiota are directly influenced by diet. Fruits have been the subject of research because they contain numerous bioactive compounds that may be beneficial to the human organism. Considering the above, the objective of the present study was to analyze the effect of aqueous extracts based on unconventional fruits on the growth of lactic acid bacteria with probiotic potential and pathogenic bacteria. The following fruits were tested: purple abiu (Chrysophyllum cainito); atemoia (Annona cheriola); baru (Dipteryx alata); cocoa (Theobroma cacao); cashew (Anacardium occidentale); jabuticaba (Plinia cauliflora); jambo-pink (Syzygium samarangense); pequi (Caryocar brasiliense) and tamarind (Tamarindus indica). For analysis of the effect on growth the extracts were inserted in 6 mm discs along with strains of pathogenic bacteria (Escherichia coli; Enteric Salmonella and Staphylococcus aureus) and lactic acid (Lactobacillus fermentum; Lactobacillus casei; Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus). The tamarind extract inhibited the growth of the pathogenic bacteria tested. In relation to the lactic acid bacteria, the extract of atemoia promoted the growth of all the strains used, while the tamarind extract promoted the growth of Lactobacillus fermentum strain 30 and Lactobacillus casei strain 37. These results suggest that atemoia and tamarind fruits may benefit the human intestinal microbiota. Keywords: phenolic compounds; intestinal microbiota; aqueous extract; Salmonella; Lactobacillus.
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AGCC- Ácidos graxos de cadeia curta ATCC- American Type Culture Collection BAL- Bactérias ácido láticas BHI- Brain Hearth Infusion DCNT- Doenças crônicas não transmissíveis SNC- Sistema Nervoso Central DP- Desvio Padrão MA- Média aritmética TGI- Trato Gastrointestinal
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 12
2.OBJETIVO ................................................................................................................... 14
3. REFERENCIAL TEÓRICO ....................................................................................... 15
3.1 MICROBIOTA INTESTINAL E SAÚDE HUMANA ............................................... 15
3.2 PREBIÓTICOS E PROBIÓTICOS ........................................................................... 16
3.3 COMPOSTOS FENÓLICOS .................................................................................... 17
3.4 FRUTOS NÃO CONVENCIONAIS ......................................................................... 18
4. MATERIAL E METÓDOS ......................................................................................... 20
4.1 AQUISIÇÃO DA MATÉRIA PRIMA ...................................................................... 20
4.2 ELABORAÇÃO DOS EXTRATOS .......................................................................... 21
4.3 ANÁLISES DO EFEITO DOS EXTRATOS EM BACTÉRIAS................................. 22
4.3.1 Bactérias patogênicas ....................................................................................... 22
4.3.2 Bactérias ácido láticas ...................................................................................... 23
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................. 25
5.1 BACTÉRIAS PATOGÊNICAS ................................................................................ 25
5.2 BACTÉRIAS ÁCIDO LÁTICAS .............................................................................. 27
6. CONCLUSÃO ............................................................................................................. 30
REFERÊNCIAS .............................................................................................................. 31
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1 INTRODUÇÃO
Os probióticos são os microrganismos vivos capazes de melhorar o equilíbrio
microbiano intestinal produzindo efeitos benéficos à saúde do indivíduo (BRASIL, 2002).
Há crescente interesse por parte da indústria de alimentos, especialmente as de
produtos lácteos, na comercialização de produtos com ações probióticas (BRASIL, 2000). As
bactérias comumente utlizadas para a fabricação desses produtos são Lactobacillus
acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus,
Bifidobacterium sp., Streptococus thermophilus. Estas bactérias, quando consumidas
regularmente e associadas a hábitos de vida saudáveis, trazem benefícios a saúde do
consumidor como por exemplo, o auxílio na absorção de nutrientes, a modulação da
microbiota intestinal e do sistema imunológico, bem como a prevenção de doenças
neurodegenerativas (BRASIL, 2000; BORGONOVI, 2018).
Atualmente, alimentos que contém substâncias capazes de aumentar o crescimento de
bactérias ácido láticas (BALs) com potencial probiótico, como por exemplo as frutas que são
ricas em compostos fenólicos, têm sido amplamente estudadas. Na produção de alimentos
probióticos, os polifenóis não interferem nos processos de fermentação que ocorrem na matriz
alimentar, contudo podem desempenhar papel fundamental estimulando a atividade
metabólica de microrganismos, bem como melhorar a viabilidade in vitro e in vivo de culturas
do probiótico (COMAN et al., 2018).
Estudos indicam que os compostos fenólicos podem ser usados, no intestino, como
nutriente pelas BAL. Além disso, o consumo de nutrientes pode ser aumentado pelos
constituintes fenólicos disponíveis e, portanto, estimular o crescimento bacteriano (IRKIN et
al., 2015).
Compostos fenólicos influenciam no crescimento e viabilidade de bactérias ácido
lácticas. Alguns estudos estão disponíveis sobre o efeito dos polifenóis em crescimento e
viabilidade de bactérias probióticas, sendo elas Lactobacilos casei, Lactobacilos plantarum,
Lactobacilos fermentum, Lactobacilos rhamnosus, Lactobacilos acidophilus, Lactobacilos
bulgaricus, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis e
Bifidobacterium bifidum (RODRIGUEZ, 2009 e RAPEANU, 2014). Entretanto, a maioria
destes estudos utilizou compostos fenólicos na forma isolada e não o alimento como um todo.
Um estudo que avaliou o efeito de compostos fenólicos com propriedades
antioxidantes em L. casei, como representante dos microrganismos probióticos, mostrou que
compostos isolados de catequina em concentração de 100-400 μM e de ácido clorogênico em
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concentração de 400 μM tiveram efeito estimulador no crescimento da bactéria. Já os extratos
de café, fruta de rosa canina e arônia não podem ser utilizados como aditivos para alimentos
probióticos, pois inibiram significativamente o crescimento de L. casei (DUDA, 2008).
O Brasil possui uma diversidade de frutos nativos, sendo que muitos não são
popularmente conhecidos e consumidos, ainda que apresentem sabores peculiares, elevado
valor nutricional e sejam ricos em compostos bioativos capazes de prevenir e/ou reduzir o
risco do desenvolvimento de doenças crônicas não transmissíveis (DCNT) (INFANTE et al.,
2016). Diante da comprovação científica dos benefícios causados pelo consumo dos
compostos fenólicos, houve crescente interesse tanto da população quanto da comunidade
científica por alimentos que sejam fontes desses compostos, especialmente as frutas (IRKIN
et al., 2015).
Muitos estudos investigam a capaciade antioxidante dos frutos, porém poucos estão
disponíveis mostrando seus compostos bioativos e possíveis benefícios a saúde humana. Além
disso, os frutos que foram avaliados neste estudo, foram escolhidos devido ao consumo raro e
irregular em nosso país.
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2 OBJETIVO
Avaliar o impacto de extrato aquoso dos frutos sobre a ativação de bactérias
patogênicas e ácido láticas.
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3 REFERENCIAL TEÓRICO
3.1 MICROBIOTA INTESTINAL E SAÚDE HUMANA
A microbiota intestinal é um ecossistema complexo e organizado, que além de ter
participação na digestão, desempenha papel crítico no desenvolvimento do sistema
imunológico e na manutenção da fisiologia intestinal. Evidências mostram que a microbiota
intestinal vai além do intestino, influenciando na obesidade, doenças neurodegenerativas,
cardiovasculares, entre outras (CARACCIOLO et al., 2014).
A modulação da microbiota intestinal ocorre por fatores internos e individuais que
podem ser a genética ou até mesmo o tipo de nascimento, parto normal ou cesariana, bem
como por fatores externos que envolvem o estilo de vida adotado pelo indivíduo como hábitos
de higiene, fatores ambientais ou pela alimentação (MORAES et al., 2014).
De acordo com Moraes et al (2014), a principal fonte de modulação da microbiota
intestinal é pelo fator externo representado pela dieta e por fenótipos do hospedeiro, onde os
microrganismos presentes no intestino podem alterar a expressão genética da mucosa
intestinal e até mesmo a função do trato gastrointestinal (TGI). Os hábitos alimentares a longo
prazo influenciam tanto na qualidade como na quantidade da colonização de bactérias no TGI.
Alimentos que favorecem o desenvolvimento de probióticos como os que contem prebióticos
em sua composição são capazes de diminuir o crescimento de colônias de bactérias
patogênicas (CUEVA et al., 2015).
A microbiota intestinal tem impacto no comportamento alimentar e no sistema
nervoso central (SNC) influenciando a regulação central do apetite e da saciedade através do
eixo cérebro-intestinal. O intestino humano realiza a digestão de fibras dietéticas na maior
parte por conta da síntese de enzimas pela microbiota intestinal, as quais realizam a
metabolização de polissacarídeos que não são digeríveis reduzindo-os em monossacarídeos e
ácidos graxos de cadeia curta (AGCC). Os AGCC são importantes fontes de energia
favorecendo a adiposidade corporal, como também podem atuar como sinalizadores celulares.
Entretanto, também existem efeitos indiretos que influenciam na motilidade intestinal e na
produção de hormônios intestinais capazes de desempenhar função na regulação da saciedade
no SNC (MORAES, et al., 2014).
O metabolismo das bactérias colonizadoras do intestino causa a quebra de compostos
indigestíveis durante a fermentação anaeróbica, como por exemplo o amido resistente e
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polissacarídeos vegetais, o que resulta em produção de AGCCs, além da vitamina K,
produção de B12 e síntese de aminoácidos (DUDA, 2012). Além disso, resultam ainda em
peptídeos antimicrobianos e a maioria dos neurotransmissores comumente encontrados no
cérebro (DINAN, CRYAN, 2017).
A comunicação entre a microbiota intestinal e o cérebro pode ocorrer por meio de
múltiplas vias que incluem o nervo vago, neuropeptídeos secretados no intestino, nervos
sensoriais, citocinas, triptofano e AGCCs (HOLZER, FARZI, 2014).
A microbiota intestinal humana está envolvida no metabolismo de compostos
químicos e compostos bioativos que estão presentes nos alimentos provenientes da dieta. Sua
importância se dá por conta de que seus metabólitos são diferentes daqueles que podem ser
gerados por enzimas humanas, pois suas atividades metabólicas ocorrem sob condições
anaeróbicas e são caracterizados principalmente por reações de redução e/ou hidrólise. Além
de causar grande atividade metabólica e processos fermentativos de substâncias que não
foram digeridas no intestino delgado. No caso dos compostos bioativos, por exemplo, as
reações microbianas podem melhorar a biodisponibilidade e a atividade de compostos
fenólicos (ROBERFROID et al., 2010; DUDA, 2012; DUDA, 2015)
Ao nascer, a microbiota do bebê é composta por microrganismos aeróbios sendo que
os principais são enterobactérias, estreptococos, enterococos e estafilococos. Primeiro, essses
microrganismos consomem o oxigênio existente no TGI gerando um ambiente anaeróbico,
permitindo assim o acentamento e proliferação de microrganismos anaeróbios como
bifidobactérias, lactobacilos e bacteroides spp. (DUDA, 2015).
Na fase adulta, apesar da grande diversidade de espécies bacterianas, a microbiota tem
em sua maioria (98% de todas as espécies) quatro filos bacterianos: Firmicutes (64%),
Bacteroidetes (23%), Proteobactérias (8%) e Actinobacteria (3%) e três enterotipos diferentes,
que são descritos independente de sexo, nacionalidade, idade ou índice de massa corporal, que
são Prevotella, Ruminococcus e Bacteroides (TURNBAUGH et al., 2006; FRANK, et al.,
2007 e ARUMUGAM et al., 2011).
3.2 PREBIÓTICOS E PROBIÓTICOS
Prebiótico tem por definição, ser um ingrediente que sofre uma fermentação seletiva
que permite mudanças específicas, tanto na composição e/ou atividade na microflora
gastrointestinal, e confere benefícios à saúde do hospedeiro. Um ingrediente pode ser
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classificado como prebiótico se não for hidrolisado nem absorvido na parte superior do TGI;
se for um substrato seletivo para uma, ou um número limitado de bactérias comensais ao
cólon, que são estimuladas a crescer e/ou são metabolicamente ativadas; consequentemente,
ser capaz de alterar a microbiota resultando em uma composição mais saudável e se induzir
efeitos sistêmicos que são benéficos para a saúde do hospedeiro (GIBSON et al., 2004).
Exemplo de prebióticos são os polissacarídeos vegetais que apresentam resistência no
amido e os oligossacáridios que sofrem fermentação bacteriana no intestino. Indigestos pelo
organismo, o complexo de polissacarídeos são convertidos pelo degradador primário das
bactérias resultando na liberação de AGCCs (principalmente acetato, propionato e butirato) e
outros metabolitos (lactato, piruvato, etanol, succinato, oligossacarídeos solúveis, gases)
sendo usados como combustíveis pelas bactérias presentes no cólon (CANDELA, et al., 2010;
FLINT, et al., 2012).
Já os probióticos são microrganismos vivos que quando administrados em quantidades
adequadas causam benefícios a saúde do hospedeiro (FAO/WHO, 2002). Dentre os efeitos
atribuídos ao consumo de probióticos se destacam a modulação do sistema imunológico
através de ações anti-inflamatórias, modulação da microbiota intestinal bem como a redução
de doenças intestinais, auxilia no aumento da absorção de nutrientes, promove a redução do
risco de câncer de cólon e doenças cardiovasculares (FONTANA et al., 2013).
Os gêneros mais comuns de probióticos são os Bifidobacterium e Lactobacillus
comumente encontrados em alimentos derivados de leite como iogurtes, leites fermentados,
entre outros (RAIZEL, et al., 2011).
3.3 COMPOSTOS FENÓLICOS
Compostos fenólicos são metabólitos secundários de plantas e incluem flavonóides,
lignanas, estilbenos, cumarinas e taninos (GHOSH E SCHEEPENS, 2009). De acordo com
sua estrutura bioquímica, os flavonóides são classificados em antocianinas, flavonas,
isoflavonas, flavonóis, flavanonas ou flavanols. Estão presentes em frutas, vegetais,
especiarias, azeite, ervas, bebidas como chás e são particularmente abundantes em frutas
(STEVENSON E HURST, 2007).
Dentre os benefícios causados pelo consumo regular destes compostos podemos citar
a melhoria do sistema imune (CANDIDO et al., 2015), regulação do estresse oxidativo
(STEVENSON E HURST, 2007), prevenção de doenças como as cardiovasculares (COMAN
et al. ,2018), cânceres, diabetes, osteoporose e doenças neurodegenerativas
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(GWIAZDOWSKA et al 2015; IRKIN et al.,2015). A ação protetora ocorre devido aos efeitos
antioxidante, antiplaquetário, anti-inflamatório, a promoção do aumento do HDL e melhoria
da função endotelial.
3.4 FRUTOS NÃO CONVENCIONAIS
O Brasil possui uma flora com significativo número de espécies produtoras de frutos
comestíveis. Inúmeros frutos não são comumente conhecidos, como por exemplo, os frutos do
Cerrado, fazendo com que a população os utilize de maneira extrativista, em sua maioria na
produção de doces, biscoitos, sorvetes, geleias e licores. As populações regionais possuem
importante reserva alimentícia que deveria ser melhor aproveitada como o consumo destes
frutos in natura e pelo tamanho da disponibilidade em suas épocas de maturação, poderiam
fazer parte também da alimentação escolar, tendo em vista que tais frutos nativos possuem
interessante valor nutricional (SOARES JUNIOR et al., 2007).
O abiu roxo tem origem da Amazônia Ocidental e zonas limítrofes do Peru, Colômbia
e Venezuela (MANICA, 2000). Embora pouco explorada comercialmente, o abiu é uma fruta
bastante consumida nos trópicos na forma in natura. No Brasil, seu consumo é mais difundido
nos estados da região Norte, mais especificamente no Acre, Amapá e Pará.
A atemoia é um fruto híbrido derivado do cruzamento da fruta-do-conde com a
cherimoia. Cerca de 18% de sua plantação no Brasil está localizada em Minas Gerais, Paraná
e Bahia, sendo destaque a cidade de São Paulo, responsável por 43,8% do volume total do
mercado brasileiro (CAXITO, 2009). A fruta apresenta sabor doce, levemente acidulado, e
menor número de sementes em relação a fruta-do-conde (MOSCA; LIMA, 2003). Um estudo
que avaliou a atemoia da variedade Gefner, mostrou que sua casca é rica em vitamina C e
potássio, enquanto sua semente apresenta níveis elevados de cálcio e fósforo (CRUZ, 2011).
A castanha de baru é um fruto presente na planta de baruzeiro que é um arbusto nativo
do bioma do cerrado, que produz frutos de julho a outubro. Este fruto é rico em lipídeos de
alta qualidade, principalmente ácidos graxos insaturados como oleico e linolênico, proteínas,
cálcio, zinco, ferro, fitatos e taninos (BAILÃO, et al., 2015).
O cacau é um fruto proveniente do cacaueiro, é rico em taninos e flavonoides. Os
flavonoides presentes incluem flavanóis, flavonóis, antocianinas, flavonas e flavanonas. Entre
os flavonoides presentes estão em abundância a (+)-catequina e a (–)-epicatequina
(WOLLGAST e ANKLAM, 2000). As sementes do cacau também contêm uma série
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complexa de procianidinas, formadas a partir da condensação de unidades individuais de
catequinas ou epicatequinas, por isso são conhecidas como taninos condensados (De
PASCUAL-TERESA et al., 2000).
De acordo com Silva et al. (2004), o caju do cerrado é um pseudofruto amarelo ou
vermelho, que possui sabor característico meio adstringente, com amadurecimento após a
chuva da época de seca no cerrado, que geralmente ocorre em setembro, entretanto é rico em
vitamina C, compostos fenólicos e fibras.
A jabuticaba vem de uma árvore de ocorrência espontânea em grande parte do Brasil,
principalmente nos estados de Minas Gerais, Espírito Santo, Rio de Janeiro e Paraná
BRUNINI et al., 2004). Caracteriza-se por ser um fruto globoso, com casca avermelhada
próxima ao negro, de polpa mucilaginosa, agridoce, altamente saborosa, e pode apresentar de
uma a quatro sementes (REYNERTSON et al., 2006; LIMA et al., 2011; BORGES, 2014;
LAGE, 2014; ANDRADE et al., 2015). As frutas tropicais de coloração vermelha e roxa
geralmente são ricas em flavonóides, compostos capazes de inibir o processo de oxidação dos
radicais livres, doando átomos de hidrogênio de maneira a inibir a reação de cadeia desses
radicais (BIANCHI, ANTUNES, 1999; MAIA, 2013).
O jambo é um fruto proveniente do jambeiro, apresenta cor vermelho escuro, tem
sabor levemente adocicado, exala aroma de rosas, persistente e bastante agradável ao olfato.
Ele contém vitaminas A, B1, B12, proteínas, antocianinas, além de cálcio, ferro e fósforo
(AUGUSTA, 2010).
De acordo com Bailão (2015), o pequi é um fruto do cerrado, onde seu mesocarpo é
composto por uma camada de polpa com cor amarela sendo a única parte comestível do fruto,
caracterizado por um sabor peculiar sendo muito valioso na culinária regional e, seu
endocarpo é composto por espinhos. Sua polpa é rica em lipídios (33,4%), possui importante
fonte de fibra alimentar (10,02%), proteína (3%) e vitaminas, sendo encontrados também
hidrocarbonetos e ácidos graxos insaturados correspondente a (61,35%) sendo na maior parte
o ácido oleico (55,87%) e o ácido palmítico (35,17%) (LIMA et al., 2007).
O tamarindo é uma vagem alongada, com 5 a 15 cm de comprimento, com casca
pardo-escura, lenhosa e quebradiça, contendo 3 a 8 sementes envolvidas por uma polpa parda
e ácida, nativo da África Tropical (DONADIO, et al., 1988; HAMACEK, et al., 2011). O seu
fruto apresenta significativo nível de vitaminas C, E e do complexo B, além de cálcio, ferro,
fósforo, potássio, manganês e fibra dietética. Há também compostos orgânicos que o tornam
um poderoso antioxidante e um agente anti-inflamatório (URSZULA, et al., 2014).
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4 MATERIAL E METÓDOS
4.1 AQUISIÇÃO DA MATÉRIA PRIMA
O Caju, Pequi e Jabuticaba foram adquiridos em um centro de distribuição de insumos
e o Abiu roxo, Atemoia, Baru, Cacau, Jambo rosa e Tamarindo em um supermercado
abastecido pelo Companhia de Entrepostos e Armazéns Gerais de São Paulo (CEAGESP),
ambos localizados na cidade de Cuiabá, em Mato Grosso. Foram adquiridos um quilo e meio
de cada fruta, em estágio maduro.
Fonte:
Figura 1. Frutos utilizados na pesquisa: Abiu roxo (A), Atemoia (B), Baru (C), Cacau (D), Caju (E), Jabuticaba (F), Jambo rosa (G), Pequi (H) e Tamarindo (I).
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Estes frutos foram escolhidos devido ao consumo raro e irregular em nosso país.
Foram utilizadas tanto polpa quanto as partes não comestíveis como apresentado na Tabela 1.
Tabela 1. Nome popular, científico e partes que foram utilizadas dos frutos na pesquisa.
Nome popular Nome científico Parte utilizada no estudo
Abiu roxo Chrysophyllum cainito Polpa
Atemoia Annona cheriola Polpa
Baru Dipteryx alata Semente
Cacau Theobroma cacao Polpa, polpa envolta na semente e semente.
Caju Anacardium occidentale Polpa
Jabuticaba Plinia cauliflora Casca
Jambo rosa Syzygium samarangense Polpa
Pequi Caryocar brasiliense Polpa
Tamarindo Tamarindus indica Polpa
4.2 ELABORAÇÃO DOS EXTRATOS
As frutas utilizadas foram lavadas em água corrente, higienizadas com hipoclorito de
sódio 2,5% por 10 minutos e posteriormente enxaguadas em água corrente. Em seguida, as
frutas foram cortadas manualmente e trituradas em mini processador (Black+Decker, modelo
HC31T- TIPO2), a fim de aumentar a superfície de contato para posterior extração dos
compostos.
Os extratos foram elaborados de acordo com o esquema apresentado na Figura 2.
Figura 2. Processo de elaboração dos extratos.
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4.3 EFEITOS DOS EXTRATOS NO CRESCIMENTO E INIBIÇÃO DE BACTÉRIAS
O efeito dos frutos no crescimento das bactérias foi detectado através do teste de
difusão em ágar utilizando a metodologia proposta por Irkin, Abay e Aydin (2010) com
modificações (Figura 3).
4.3.1 Bactérias patogênicas
As bactérias patogênicas analisadas foram: Escherichia coli ATCC 25922; Salmonella
entérica subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC 14028 e Staphylococcus aureus subsp.
aureus ATCC 25923, originadas do American Type Culture Collection (ATCC).
Inicialmente realizou-se a ativação das bactérias que se encontravam congeladas. Em
tubo de ensaio contendo 10 mL de ágar Brain Hearth Infusion (BHI) (HIMEDIA) estéril,
foram adicionados, com auxílio de micropipeta automática (KASVI basic), 100μL da cepa
pura das respectivas bactérias. Em seguida, cada tubo foi identificado com nome da bactéria e,
incubado em estufa (FAMEM LTDA., São Paulo) a 35±1°C por 24 horas.
No segundo passo, 100µL do conteúdo do tubo foram transferidos para outro tubo que
foi incubado em estufa a 35±1°Cpor 24 horas.
No terceiro passo, foi realizado o plaqueamento em triplicata. Foram colocados, com
auxílio de uma pipeta, 10 mL de ágar De man, Rogosa, Sharpe (MRS) (OXOID) na placa de
Petri. Aguardou-se até a solidificação do meio. Em seguida, foram adicionados às placas
100µL do conteúdo que estava no tubo preparado no segundo dia contendo as cepas, sendo
espalhados ao meio de cultura com auxílio da alça de Drigalski até secar.
Posteriormente, foram adicionados 4 discos de filtro de papel de 6mm autoclavados,
posicionados em pontos estratégicos de cada placa. Em cima de cada disco foram colocados
40µL do extrato aquoso das frutas. Cada placa continha três extratos diferentes e um controle,
feito com água destilada. Por fim, as placas ficaram secando sob chama de fogo em uma
bancada de aço inoxidável, e em seguida foram incubadas invertidas em estufa (FAMEM
LTDA., São Paulo) a 35 ±1°C.
Após 24h e 48h, foi realizada a leitura do crescimento ou inibição das bactérias.
Quanto ao resultado, atividade positiva foi definida com um crescimento intenso zona de
23
microrganismo > 10 mm ao redor de um disco, e atividade negativa foi definida com uma
inibição zona> 10 mm ao redor de um disco (IRKIN et al., 2010).
4.3.2 Bactérias ácido láticas
As bactérias ácido láticas analisadas foram: Lactobacillus fermentum cepa 30;
Lactobacillus casei cepa 37; Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus cepa 57;
Lactobacillus casei cepa 146. Tais bactérias foram obtidas através de isolamento no
processamento de queijo de muçarela de búfala (SILVA, 2015).
Inicialmente realizou-se a ativação das bactérias que se encontravam congeladas. Em
tubo de ensaio contendo 10 mL de caldo De man, Rogosa, Sharpe (MRS) (DIFCO) estéril,
foram adicionados, com auxílio de micropipeta automática (KASVI basic), 100μL da cepa
pura das respectivas bactérias. Em seguida, cada tubo foi identificado com nome da bactéria e,
incubado em estufa (FAMEM LTDA., São Paulo) a 35±1°C por 24 horas.
No segundo passo, 100µL do conteúdo do tubo foram transferidos para outro tubo que
foi incubado em estufa a 35±1°Cpor 24 horas.
No terceiro passo, foi realizado o plaqueamento em triplicata. Foram colocados, com
auxílio de uma pipeta, 10 mL de ágar De man, Rogosa, Sharpe (MRS) (OXOID) na placa de
Petri. Aguardou-se até a solidificação do meio. Em seguida, foram adicionados às placas
100µL do conteúdo que estava no tubo preparado no segundo dia contendo as cepas, sendo
espalhados ao meio de cultura com auxílio da alça de Drigalski até secar.
Posteriormente, foram adicionados 4 discos de filtro de papel de 6mm autoclavados,
posicionados em pontos estratégicos de cada placa. Em cima de cada disco foram colocados
40µL do extrato aquoso das frutas. Cada placa continha três extratos diferentes e um controle,
feito com água destilada. Por fim, as placas ficaram secando sob chama de fogo em uma
bancada de aço inoxidável, e em seguida foram incubadas invertidas em estufa (FAMEM
LTDA., São Paulo) a 35 ±1°C.
Após 24h e 48h, foi realizada a leitura do crescimento ou inibição das bactérias.
Quanto ao resultado, atividade positiva foi definida com um crescimento intenso zona de
microrganismo > 10 mm ao redor de um disco, e atividade negativa foi definida com uma
inibição zona> 10 mm ao redor de um disco (IRKIN et al., 2010).
24
Figura 3. Ilustração do processo de plaqueamento. Ativação das bactérias [1], Reativação das bactérias [2], Placas contendo as bactérias [3], Placas contendo bactérias + extratos [4], Leitura de 24h [5] e leitura de 48h [6].
25
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 EFEITOS INIBITÓRIOS DOS EXTRATOS DE FRUTAS NAS BACTÉRIAS
PATOGÊNICAS
Na tabela 2 estão apresentados os resultados verificados 24h e 48h após a incubação
dos extratos aquosos dos frutos com as cepas de bactérias patogênicas.
Tabela 2. Análises dos extratos aquosos de frutos não convencionais aplicados nas cepas de bactérias patogênicas, expressados através de média aritmética (MA) dos halos formados e Desvio Padrão (DP).
Extratos
Cepas
MA/DP 24h
MA/DP 48h
Cepas
MA/DP 24h
MA/DP 48h
Cepas
MA/DP 24h
MA/DP 48h
[1] SA - - SL - - E. coli - -
[2] SA - - SL - - E. coli - -
[3] SA - - SL - - E. coli - -
[4] SA - - SL - - E. coli - -
[5] SA - - SL - - E. coli - -
[6] SA - - SL - - E. coli - -
[7] SA - - SL - - E. coli - -
[8] SA - - SL - - E. coli - -
[9] SA - - SL - - E. coli - -
[10] SA - - SL - - E. coli - -
[11] SA 9/3,5 11,33/3,29 SL 12,66/2,06 14/2,15 E. coli 21/0,81 22,66/0,93
Cepas: Staphylococcus aureus subsp. aureus (SA); Salmonella entérica subsp. enterica serovar Typhimurium (SL) e Escherichia coli (E. coli).
Extratos: [1] Abiu roxo; [2] Atemoia; [3] Baru (semente); [4] Cacau (polpa envolta na semente); [5] Cacau (polpa); [6] Cacau (semente); [7] Caju; [8] Jabuticaba (casca); [9] Jambo rosa; [10] Pequi; [11] Tamarindo.
O extrato de tamarindo inibiu o crescimento em todas as três espécies de bactérias
patogênicas analizadas (Staphylococcus aureus subsp. aureus, Salmonella entérica subsp.
enterica serovar Typhimurium e Escherichia coli), formando halos de inibição em torno dos
discos. Os demais extratos não apresentaram halo de inibição quando combinadas com as
bactérias.
Em um estudo de Coman et al 2018, foram desenvolvidos extratos etanólicos de casca
de uva italiana vermelha, de pele da ameixa e partes de sabugueiro. Do sabugueiro, foram
utilizados a pele sozinha, a fruta inteira (polpa,pele e semente), e a pele e a semente juntas,
somando ao todo cinco extratos diferentes. Foi realizado avaliação antimicrobiana desses
26
extratos em bactérias patogênicas Gram-positivas, Bacillus cereus DSM 345 e Staphylococcus
aureus ATCC 25923, Gram-negativas, Escherichia coli ATCC 13706 e Candida albicans
ATCC 10261, e em cepas probióticas de Lactobacillus rhamnosus IMC 501 ®, e
Lactobacillus paracasei IMC 502 ®, Lactobacillus plantarum IMC 509 e SYNBIO ® (uma
cultura probiótica a partir da combinação 1:1 de L. rhamnosus IMC 501 ® e L. paracasei IMC
502 ®).
Os agentes patogênicos foram classificados quanto sua resistência ou sensibilidade, de
acordo com a medição da zona de inibição tendo como sigla em inglês (IZ). Quando (IZ) <5
mm é considerado resistente (R), quando IZ = 5–20 mm é considerado sensível (S) e quando
IZ> 20 mm é considerado supersensível (SS) (HOMAYOUNI et al., 2012).
As cepas bacterianas Gram-positivas, B. cereus DSM 345 e S. aureus ATCC 25923
foram altamente sensíveis a todos os três extratos de sabugueiro e ao extrato de casca de uva
italiana vermelha. A respeito de bactérias Gram-negativas, E. coli ATCC 13706 foi sensível a
pele de sabugueiro e extratos de casca de uva italiana vermelha, enquanto C. albicans ATCC
10261 foi inibido apenas pelo extrato de pele de sabugueiro (COMAN et al., 2018).
Já a respeito na avaliação antimicrobiana nas cepas probióticas, todas foram
estimuladas na presença de extratos de frutas, exceto L. paracasei IMC 502 ®, que foi
ligeiramente estimulado pela presença dos extratos, e inibido no caso do extrato de pele e,
pele e sementes de sabugueiro, e de L. rhamnosus IMC 501 ® que também foi inibido quando
combinado com extrato de pele e semente do sabugueiro (COMAN et al., 2018).
Portanto, segundo Homayouni et al., (2012), de acordo com as médias aritméticas
expressadas na Tabela 2, podemos considerar que quando combinadas com extrato de
tamarindo, Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 25923 é sensível; Salmonella entérica
subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC 14028 é sensível e Escherichia coli ATCC 25922
é supersensível.
Ainda que os compostos fenólicos dos extratos das frutas não tenham sido avaliados
na forma isolada notou-se resultado significativo para os extratos. É de amplo conhecimento
que determinados compostos fenólicos são potentes catadores de ferro e a disponibilidade de
ferro afeta o crescimento de certas bactérias pela redução do precursor ribonucleotídico de
DNA (SMITH et al., 2005; LIM et al., 2013).
Além disso, o anel B dos flavonóides pode desempenhar um papel de intercalação ou
ligação de hidrogênio com o empilhamento de ácido nucleico, explicando a ação inibitória no
DNA e RNA síntese (CUSHINE e LAMB, 2005). Plaper et al., (2003), relataram que a
quercetina se liga ao GyrB (subunidade b) da DNA-girase de E. coli e inibe a atividade da
27
enzima ATPase. Gradisar et al. 2007, afirmaram que as catequinas inibem a DNA-girase
ligando-se ao sítio de ligação do ATP (adenosina trifosfato) na subunidade B da girase.
Polifenóis da dieta também podem atuar contra o Helicobacter Pylori. O mecanismo
pode incluir a supressão da atividade da urease, afetando a proliferação e danificando as
membranas bacterianas, tornando as células mais sensíveis a compostos externos, como
antibióticos e a uma ruptura da força motriz do próton através da perda de H + - ATPase e
funções associadas à membrana (LIN et al., 2005).
Nakayama et al., (2012) avaliaram a ação inibitória de extrato de chá verde, rico em
catequina, frente a Escherichia coli e Staphylococcus aureus. As bactérias foram expostas ao
extrato durante uma hora. Através de um microscópio eletrônico, foram realizadas análises
onde pode-se perceber que a catequina do extrato de chá verde se ligava a proteínas na
superfície das bactérias para formar complexos de alto peso molecular, sugerindo a
possibilidade de que o extrato inibisse a captação e secreção de substratos, inibindo também a
atividade enzimática.
5.2 EFEITO DOS EXTRATOS NO CRESCIMENTO DE BACTÉRIAS ÁCIDO LÁTICAS
Na Tabela 3 serão apresentados os resultados da incubação dos extratos aquosos dos
frutos não convencionais aplicados nas cepas de bactérias ácido láticas.
Tabela 3. Análises dos extratos aquosos de frutos não convencionais aplicados nas cepas de bactérias ácido láticas, expressados através de Média Aritmética (MA) dos halos formados e Desvio Padrão (DP).
Extratos
Cepas
MA/DP 24h
MA/DP 48h
Cepas
MA/DP 24h
MA/DP 48h
Cepas
MA/DP 24h
MA/DP 48h
Cepas
MA/DP 24h
MA/DP 48h
[1] 30 - - 37 - - 57 - - 146 - - [2] 30 12/0,81 14/0,81 37 11/4,64 16/3,16 57 14/1,63 16/1,63 146 14,66/1,66 16/2,15 [3] 30 - - 37 - - 57 - - 146 - - [4] 30 - - 37 - - 57 - - 146 - - [5] 30 - - 37 - - 57 - - 146 - - [6] 30 - - 37 - - 57 - - 146 - - [7] 30 - - 37 - - 57 - - 146 - - [8] 30 - - 37 - - 57 - - 146 - - [9] 30 - - 37 - - 57 - - 146 - -
[10] 30 - - 37 - - 57 - - 146 - - [11] 30 14,66/1,66 16/2,15 37 18,33/2,05 19,66/2,49 57 - - 146 - -
Cepas: (30) Lactobacillus fermentum; (37) Lactobacillus casei; (57) Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus; (146) Lactobacillus casei.
Extratos: [1] Abiu roxo; [2] Atemoia; [3] Baru (semente); [4] Cacau (polpa comestível); [5] Cacau (polpa não comestível); [6] Cacau semente; [7] Caju; [8] Jabuticaba (casca); [9] Jambo rosa; [10] Pequi; [11] Tamarindo.
28
O extrato de atemoia contribuiu para o crescimento aumentado nas quatro cepas
analizadas (Lactobacillus fermentum (30); Lactobacillus casei (37); Lactobacillus delbrueckii
subsp. Bulgaricus (57); Lactobacillus casei (146)), enquanto o extrato tamarindo contribuiu
para o crescimento aumentado somente nas cepas 30 e 37, formando colônias aumentadas
extamente no local onde estava contido os extratos das frutas. Os demais extratos não
apresentaram crescimento microbiano aumentado quando combinadas com as bactérias ácido
láticas.
Na Tabela 3 mostramos o resultado de leitura de 24 e 48 horas dos extratos aplicados
nas cepas de bactérias ácido láticas. Os resultados foram expressos através da média
aritmética dos halos de desenvolvimento microbiano e desvio padrão do tamanho desses
halos.
Irkin et al., (2015), analizaram suco de frutas cítricas e extratos de suas cascas
(tangerina, limão, laranja e toranja) no desenvolvimento de bactérias ácido láticas
(Lactobacillus acidophilus NRRL B 4495, Lactobacillus casei NRRL B 1922 e Libra.
delbrueckii NRRL B 548). A extração dos sucos foram através de um espremedor de frutas
convencional, posteriormente coado e centrifugado. Em relação as cascas, foram removidas
com um descascador manual e cortadas em pequenos pedaços. Posteriormente, foram secas a
45ºC em forno de aquecimento a seco e trituradas até a formação de um pó fino. Em seguida,
as amostras em pó foram agitadas em vórtice, extraídos em solução aquosa a 80% metanol (v
/ v) a 4 ° C durante 1 noite e então foram centrifugados.
A atividade positiva foi definida com um crescimento intenso da zona de
microrganismo > 10 mm ao redor de um disco, e atividade negativa foi definida com uma
inibição da zona de microrganismos > 10 mm ao redor de um disco (IRKIN et al., 2015).
Neste estudo de Irkin et al., (2015), foram observados efeitos de inibição causados por
toranja e suco de limão em Lb. Delbrueckii NRRL B5448 e Lb. casei NRRL B1922,
provavelmente causada pelo pH muito baixo desses frutos.
O desenvolvimento microbiológico observado em Libra. delbrueckii NRRL B5448
pode estar relacionado a presença do ácido clorogênico e hesperidina (79.003 ppm) em casca
de limão, naringina e hesperidina (170.044 ppm) em casca de laranja, ácido clorogênico em
casca de tangerina e hesperidina (133,18 ppm) em suco de laranja (IRKIN et al., 2015).
Os efeitos promotores de crescimento observados em Lb. Casei pode estar relacionado
a presença de a hesperidina e ácido cafeico presentes nas amostras. Hesperidina da casca de
limão (79,003 ppm), ácido cafeico da casca de toranja (0,166 ppm), ácido cafeico (0,19 ppm)
com hesperidina (170,044 ppm) da casca de laranja, ácido cafeico (0,07 ppm) com
29
hesperidina (133,18 ppm) do suco de laranja e hesperidina (81,674 ppm) do suco de tangerina
(IRKIN et al., 2015).
Inúmeros autores estudaram as interações entre bactérias probióticas e fibras cítricas
em produtos probióticos. Censur (2014), pesquisou cascas de frutas cítricas secas (laranja,
tangerina e limão) que foram usados em tipo de produto lácteo fermentado chamado "kefir".
Seu resultado determinou que em Lactobacillus total e Lactococcus os números de
microorganismos estavam acima de 8,66 e 11,41 log CFU / mL durante os 27 dias,
respectivamente.
Sendra et al., (2008), descobriram que as fibras cítricas aumentam a sobrevivência de
L. acidophilus CECT 903 e Lb. casei CECT 475 no caldo MRS durante o armazenamento
refrigerado.
Algumas pesquisas anteriores como as de (Hervert-Hernandez et al., (2009); Hervert-
Hernandez e Goni, (2011); Parkar et al., (2008); Limkhuansuwan e Chairpraset, (2010)),
apontam que os fenólicos podem ser usados como um nutriente pelas bactérias ácido lácticas.
Os resultados sugerem que as antocianinas e seus metabólitos pode exercer uma modulação
positiva sobre a população das bactérias.
As bactérias ácido láticas contribuem para um bom funcionamento do intestino,
realizando a modulação da microbiota, do sistema imune, auxiliando na absorção de
nutrientes, ajudando assim na prevenção de doenças. Tais resultados mostram como a
alimentação tem grande influência na colonização dessas bactérias no intestino, podendo
trazer inúmeros benefícios à saúde humana.
30
6 CONCLUSÃO
O extrato aquoso de tamarindo e de atemoia mostraram-se potenciais estimulantes no
crescimento das ácido láticas testadas. Além disso, o extrato de tamarindo inibiu o
crescimento das bactérias patogênicas testadas, podendo ser estudado como um possível
conservante natural para a indústria de alimentos. Ainda que os resultados sejam promissores,
estudos in vivo precisam ser desenvolvidos para confirmação do potencial descrito acima.
31
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