efeito do ni(ii) em neutrófilos humanos
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ESTUDO DA ACTIVAÇÃO DE NEUTRÓFILOS
HUMANOS PELO NITRATO DE NÍQUEL
Marisa Andreia Carvalho de Freitas
Orientadora:
Professora Doutora Eduarda das Graças Rodrigues Fernandes
Co-orientador:
Professor Doutor José Luís Fontes da Costa Lima
ii
Dissertação apresentada à Faculdade
de Farmácia da Universidade do Porto
para a obtenção do grau de Mestre em
Química Analítica Ambiental
iii
AGRADECIMENTOS
Na apresentação deste trabalho gostaria de exprimir o meu sincero agradecimento:
À Professora Doutora Eduarda Fernandes, pela extraordinária ajuda na
estruturação e planeamento do trabalho, pelos preciosos conselhos e sugestões dados ao
longo de todo este trabalho, pela cuidada revisão do texto, pela cedência de bibliografia,
pela paciência e disponibilidade sempre presentes a cada pedido de ajuda e acima de
tudo, pela amizade demonstrada.
Ao Professor Doutor José Luís Fontes da Costa Lima, coordenador do Mestrado
Europeu em Química Analítica Ambiental, pelos valiosos conhecimentos e orientações
transmitidos ao longo do Mestrado, pela ajuda prestada na revisão do presente trabalho,
pela bibliografia facultada e pelo apoio, incentivo e confiança sempre demonstrados.
Ao Laboratório de Química-Física da Faculdade de Farmácia da Universidade
do Porto, na pessoa do Professor Doutor José Luís Fontes da Costa Lima, por ter
proporcionado as condições necessárias à realização deste trabalho.
Ao Laboratório de Toxicologia da Faculdade de Farmácia da Universidade do
Porto, na pessoa da Professora Doutora Maria de Lourdes Bastos, pelo acolhimento e
pelas condições disponibilizadas para a concretização deste trabalho.
Á Prof. Doutora Beatriz Porto do Hospital Geral de Santo António, pela sua
disponibilidade e preciosa contribuição para a realização deste trabalho.
Ao David Costa e Ana Gomes, a quem manifesto a maior gratidão, pela
amizade, espírito de camaradagem, incentivo e ajuda prestados durante a elaboração
deste trabalho.
Aos restantes colegas dos Laboratórios de Química-Física e Toxicologia da
Faculdade de Farmácia do Porto pela forma paciente e simpática com que me
acolheram, bem como, pelo bom ambiente de trabalho que proporcionaram, tornando a
realização deste trabalho muito mais gratificante;
Aos meus pais e ao David por estarem sempre presentes, pelo carinho,
compreensão e confiança em mim tantas vezes depositados;
iv
Por último, a todos aqueles que com a sua dádiva de sangue, contribuíram para a
realização deste trabalho.
v
ABREVIATURAS
ABAH- Ácido 4-aminobenzóico hidrazida
ADP- Adenosina difosfato
ATP- Adenosina trifosfato
ATSDR- Agency for Toxic Substances and Disease Registry
cNOS- Óxido nítrico sintetases constitutivas
CO3.--Anião radical carbonato
DAG- Diacilglicerol
DNA- Ácido desoxirribonucleico
DPI- Cloreto de difenilenoiodónio
ECF-A- Factor quimiotáctico eosinofilico da anafilaxia
EDTA- Ácido etilenodiamino tetra-acético
EGTA- Etileno glicol-bis �-aminoetil éter
H2O2- Peróxido de hidrogénio
HO.- Radical hidroxilo
HO2.- Radical hidroperoxilo
HOCl- Ácido hipocloroso
HO--Ião hidroxilo
IARC- International Agency for Research on Cancêr
IFN-�- Interferon α
vi
IgA- Imunoglobina A
IgE- Imunoglobina E
IgG- Imunoglobina G
IL-1�- Interleucina-1�
KDa- Quilodalton
iNOS- Óxido nítrico sintetases indutíveis
.NO- Óxido nítrico
NOS- Óxido nítrico sintetase
IP3 - Inositol 1,4,5-trifosfato
L-NAME- Cloridrato do éster metílico da N-nitro-L-arginina
MPO- Mieloperoxidase
NADPH- Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (forma reduzida)
1O2- Oxigénio singuleto
O2-.- Anião radical superóxido
ONOO-- Anião peroxinitrito
ONOOCO2- Anião nitrosoperoxicarbonato
ONOOH- Ácido peroxinitroso
PBS- Solução salina de tampão fosfato isotónica
PKC- Proteína quinase C
PMA- Acetato de miristato de forbol
PMN- Neutrófilos
vii
RCHO- Aldeído
RNS- Espécies reactivas de azoto
ROS- Espécies reactivas de oxigénio
RPE- Ressonância paramagnética electrónica
rpm- Rotações por minuto
SOD- Superóxido dismutase
TC- Células T citotóxicas
TH- Células T auxiliares
TNF-�- Factor de necrose tumoral α
TS- Células T supressoras
u.m.a.- Unidades de massa atómica
viii
RESUMO
Evidências crescentes têm indicado que a exposição humana a metais pesados
pode desencadear reacções imunológicas prejudiciais para o hospedeiro. Entre os
diversos metais, tem-se demonstrado que o níquel (Ni), na sua forma iónica, é
particularmente capaz de induzir efeitos biológicos adversos, nomeadamente efeitos
alergénicos, pró-inflamatórios e tóxicos, quer in vivo quer in vitro.
Os neutrófilos (leucócitos polimorfonucleares) são os leucócitos mais abundantes
da corrente sanguínea e participam activamente na defesa inata do hospedeiro. Estas
células são as primeiras a chegar à zona de inflamação, tendo um papel importante no
processo inflamatório e subsequentes danos teciduais.
Apesar do interesse actual relacionado com os efeitos pró-inflamatórios do Ni
pouco se sabe ainda sobre a interacção dos iões de Ni com os neutrófilos humanos.
Assim, o objectivo deste estudo é o de implementar e aplicar uma metodologia
experimental, in vitro, para avaliar a possível activação de neutrófilos humanos pelo
nitrato de níquel.
O primeiro trabalho experimental realizado no âmbito da presente dissertação de
mestrado visou a implementação de uma metodologia para o isolamento de neutrófilos
humanos, pelo método de centrifugação de gradiente de densidade. Neste estudo,
utilizaram-se diferentes anticoagulantes no processo de recolha de amostras sanguíneas,
como o citrato, ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) e heparina, com o objectivo
de avaliar a sua influência na eficácia do isolamento dos neutrófilos, ou seja, na
viabilidade celular e número de neutrófilos isolados. Constatou-se que existem
diferenças significativas relativamente ao número de neutrófilos isolados, tendo sido o
EDTA o que permitiu um maior número de neutrófilos isolados por mL de sangue
(1,7×106 ± 1,5×105 neutrófilos/mL sangue), quando comparado com a heparina e com o
citrato (6,6×105 ± 1,5×104 neutrófilos/mL sangue e 4,6×105 ± 9,5×104 neutrófilos/mL
sangue, respectivamente) (média ± erro padrão da média). A viabilidade celular dos
neutrófilos isolados foi sempre superior a 98%, independentemente do anticoagulante
utilizado.
No trabalho experimental seguinte, implementou-se uma técnica de
quimioluminescência, para avaliar a activação dos neutrófilos isolados, pelo acetato de
ix
miristato de forbol (PMA). O objectivo foi verificar se a utilização de diferentes
anticoagulantes influencia a resposta dos neutrófilos ao PMA. Verificou-se que a
activação dos neutrófilos foi diferente consoante o anticoagulante utilizado durante o
isolamento, tendo o EDTA originado um menor grau de activação relativamente ao
citrato e à heparina. Obteve-se as seguintes percentagens de activação dos neutrófilos,
relativamente ao controlo, com EDTA, citrato e heparina: 370 ± 30%, 830 ± 98% e 827
± 77 %, respectivamente (média ± erro padrão da média).
No terceiro trabalho experimental efectuou-se a quantificação do cálcio livre
intracelular em neutrófilos isolados de sangue tratado com citrato, EDTA ou heparina.
O objectivo deste estudo foi verificar se existiam diferenças nos níveis de cálcio
intracelulares em neutrófilos tratados com os diferentes anticoagulantes. Constatou-se
que a concentração de cálcio livre foi inferior com EDTA (94,4 ± 3,1 nM) quando
comparado com citrato e heparina (156,2 ± 28,7 nM e 165,3 ± 14,8 nM,
respectivamente) (média ± erro padrão da média).
No quarto trabalho avaliou-se a activação dos neutrófilos humanos pelo nitrato de
níquel, utilizando as condições experimentais implementadas anteriormente. Foram
testadas várias concentrações de nitrato de níquel, 3,9; 7,8; 15,6; 31,3; 62,5 e 125 µM.
Todas levaram a uma activação dos neutrófilos, sendo essa activação dependente da
concentração. Tal como o PMA, também o nitrato de níquel levou a uma activação
diferente consoante o anticoagulante utilizado durante o isolamento dos neutrófilos.
Como exemplo representativo, o nitrato de níquel na concentração de 125 µM originou
as seguintes percentagens de activação dos neutrófilos, relativamente ao controlo, com
heparina, citrato e EDTA: de 263 ± 28%, 233 ± 29% e 129 ± 10%, respectivamente
(média ± erro padrão da média).
No quinto trabalho experimental avaliaram-se os processos envolvidos na geração
de espécies reactivas durante a activação dos neutrófilos pelo nitrato de níquel. Para o
efeito, foram realizados estudos com inibidores específicos de enzimas responsáveis
pela geração espécies reactivas ou captadores específicos de espécies reactivas,
nomeadamente o cloreto de difenilenoiodónio (DPI) [inibidor da nicotinamida adenina
dinucleótido fosfato oxidase (NADPH oxidase)], ácido 4-aminobenzóico hidrazida
(ABAH) [inibidor da mieloperoxidase (MPO)], tiron [captador do anião radical
superóxido (O2-.)], catalase [enzima metabolizadora do peróxido de hidrogénio (H2O2)]
x
e manitol [captador do radical hidroxilo (HO.)]. A inibição da activação dos neutrófilos
foi independente dos anticoagulantes utilizados no processo de isolamento. Verificou-se
que as seguintes espécies reactivas de oxigénio (ROS): O2-., H2O2, HO. e ácido
hipocloroso (HOCl), participam no processo de activação dos neutrófilos e que a
NADPH oxidase e a MPO têm um papel preponderante na sua geração. O envolvimento
das espécies reactivas de azoto (RNS) foi testado com a utilização de cloridrato de éster
metílico da n-nitro-L-arginina (L-NAME), inibidor da enzima óxido nítrico sintetase
(NOS). Os resultados obtidos indicam que a activação dos neutrófilos não foi alterada
pelo L-NAME, sugerindo que, nas presentes condições experimentais, o óxido nítrico
(.NO) e o anião peroxinitrito (ONOO-) não têm uma participação relevante na activação
das células.
xi
ABSTRACT
Increasing evidence indicates that human exposure to heavy metals may trigger
immunological reactions that may be highly detrimental to the host. Among metals,
nickel has been shown to induce adverse biological effects that have cast uncertainty on
its safety for use in the body. Nickel ions are the most allergenic and pro-inflammatory
metal ions known, and has been shown to elicit toxic effects in vitro and in vivo.
Neutrophils (polymorphonuclear leukocytes) are the most abundant leukocytes of
the blood and participate actively in the innate host defence response. These are also the
first type of cells to arrive at an inflammatory site where they play a major role in the
inflammation and subsequent tissue damage.
In spite of the interest related to nickel pro-inflammatory effects, little is known
concerning the interaction of nickel ions with human neutrophils. Thus, the objective of
the present study is to implement a human neutrophil activation assay and use it to
evaluate the putative activation of these cells by nickel nitrate.
The first experimental work, aimed the implementation of a methodology for the
isolation of human neutrophils by the gradient density centrifugation method. In this
study, different anticoagulants were used in the blood samples collecting process,
namely citrate, ethylene diaminetetracetic acid (EDTA) and heparin, in order to evaluate
their influence in the effectiveness of the neutrophils isolation, that is, in the cellular
viability and number of isolated neutrophils. Significant differences were observed in
the number of isolated neutrophils. The greatest number of isolated neutrophils per mL
of blood was obtained for EDTA (1,7×106 ± 1,5×105 neutrophils/mL blood), when
compared with heparin and citrate (6,6×105 ± 1,5×104 neutrophils/mL blood and
4,6×105 ± 9,5×104 neutrophils/mL blood, respectively) (mean ± standard error of the
mean). The viability of the isolated neutrophils was always above 98%, independently
of the anticoagulant used.
In the second experimental work, one chemiluminescence technique was
implemented to evaluate the activation of the isolated neutrophils by phorbol myristate
acetate (PMA). The aim of this work was to verify if the use of different anticoagulants
influences the neutrophils response to PMA. It was verified that the activation of
neutrophils was different with citrate, EDTA and heparin. EDTA originated less degree
of activation (370 ± 30%) relatively to citrate (830 ± 98%) and heparin (827 ± 77 %).
xii
In the thirth experimental work, the intracellular free calcium was quantified in
neutrophils isolated from blood trated with citrate, EDTA or heparin. The aim of this
study was to verify if there were any differences in the intracellular levels of free
calcium in neutrophils treated with different anticoagulants. It was observed that the
concentration of free calcium was lower with EDTA (94,4 ± 3,1 nM) when compared
with citrate and heparin (156,2 ± 28,7 nM e 165,3 ± 14,8 nM, respectively) (mean ±
standard error of the mean).
In the fourth experimental work, it was evaluated the activation of human
neutrophils by nickel nitrate, using the previously implemented methodology. Different
nickel nitrate concentrations were tested, 3,9; 7,8; 15,6; 31,3; 62,5 e 125 µM. It was
observed that nickel nitrate activated the neutrophils in a concentration-dependent
manner. Similarly to PMA, the nickel nitrate-induced activation, was dependent on the
previous use of citrate, EDTA or heparin. As a representative example, the nickel nitrate
in the concentration of 125 µM originated the following percentages of neutrophils
activation, relatively to the control, for citrate, EDTA and heparin: 263 ± 28%, 233 ±
29% e 129 ± 10%, respectively (mean ± standard error of the mean).
In the fifth experimental work, the processes involved in the generation of reactive
species during the neutrophils activation by nickel nitrate were evaluated. For this
purpose, different studies were performed, involving specific inhibitors of the enzymes
reponsible for the generation of reactive species namely diphenyleneiodonium chloride
(DPI) [inhibitor of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase (NADPH
oxidase)], 4-aminobenzoic acid hydrazide (ABAH) [inhibitor of myeloperoxidase
(MPO)] or specific scanvengers of reactive species namely tiron [superoxide radical
(O2-.) scavenger], catalase [metbolize enzyme of hydrogen peroxide (H2O2)] and
mannitol [hydroxyl radical (HO.)scavenger]. The inhibition of the neutrophils activation
was independent of the anticoagulants used in the isolation process. It was verified that
the reactive oxygen species (ROS): O2-., H2O2, HO. hypochlorous acid and (HOCl),
participate in the neutrophils activation process and that NADPH oxidase and MPO
have a preponderant paper in their generation. The envolvement of reactive nitrogen
species (RNS) was tested with an inhibitor of oxide nitric sintetase (NOS), the N-nitro-
L-arginine methyl ester (L-NAME). The results indicate that the neutrophils activation
was not modified by the L-NAME, suggesting that, in the present experimental
xiii
conditions, nitric oxide (.NO) and peroxynitrite anion (ONOO-), do not have an
important participation in the activation process.
Índice
1
ÍNDICE
1 INTRODUÇÃO GERAL ....................................................................................... 4
1.1 Considerações Gerais ....................................................................................... 5
1.2 Objectivos do trabalho e estrutura da dissertação ............................................ 6
2 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 7
2.1 Níquel............................................................................................................... 8
2.1.1 Abundância e obtenção............................................................................. 8
2.1.2 Principais características físico-químicas................................................. 9
2.1.3 Aplicações .............................................................................................. 10
2.1.4 Papel Biológico ...................................................................................... 11
2.1.5 Estudos epidemiológicos ........................................................................ 15
2.2 Sangue............................................................................................................ 18
2.2.1 Origem das células do sangue ................................................................ 19
2.2.2 Componentes do sangue ......................................................................... 21
2.2.2.1 Plasma................................................................................................. 21
2.2.2.2 Glóbulos vermelhos............................................................................ 22
2.2.2.3 Plaquetas............................................................................................. 25
2.2.2.4 Glóbulos Brancos ............................................................................... 27
2.3 Espécies reactivas de oxigénio e azoto ........................................................ 35
3 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................. 45
3.1 Reagentes ....................................................................................................... 46
3.2 Equipamento ................................................................................................. 46
3.3 Isolamento de neutrófilos humanos pelo método de centrifugação de
gradiente de densidade............................................................................................. 47
Índice
2
3.3.1 Fundamento do método .......................................................................... 47
3.3.2 Utilização de EDTA, citrato e heparina como anticoagulantes no
isolamento dos neutrófilos humanos ...................................................................... 49
3.3.3 Fundamento do método .......................................................................... 49
3.3.4 Procedimento experimental .................................................................... 52
3.4 Avaliação da viabilidade celular e cálculo do número de neutrófilos
isolados....................................................................................................................... 53
3.4.1 Fundamento do método .......................................................................... 53
3.4.2 Procedimento experimental .................................................................... 53
3.5 Avaliação da activação de neutrófilos humanos pelo PMA, com utilização
de uma técnica de quimioluminescência................................................................. 55
3.5.1 Fundamento da técnica ........................................................................... 56
3.5.2 Procedimento experimental .................................................................... 58
3.6 Quantificação do cálcio livre intracelular nos neutrófilos humanos
isolados, com utilização de uma técnica de fluorescência ..................................... 59
3.6.1 Fundamento da técnica ........................................................................... 59
3.6.2 Procedimento experimental .................................................................... 61
3.7 Avaliação da activação de neutrófilos humanos pelo nitrato de níquel,
com utilização de uma técnica de quimioluminescência ....................................... 62
3.7.1 Fundamento da técnica ........................................................................... 62
3.7.2 Procedimento experimental .................................................................... 62
3.8 Estudo das espécies reactivas envolvidas no processo de activação dos
neutrófilos, pelo nitrato de níquel, com a utilização de uma técnica de
quimioluminescência ................................................................................................ 63
3.8.1 Fundamento da técnica ........................................................................... 63
3.8.2 Procedimento experimental .................................................................... 64
3.8.3 Estudos complementares ........................................................................ 65
3.9 Análise estatística.......................................................................................... 65
Índice
3
4 RESULTADOS..................................................................................................... 66
4.1 Viabilidade dos neutrófilos humanos isolados a partir de amostras de sangue
tratadas com os anticoagulantes EDTA, citrato e heparina ........................................ 67
4.2 Número de neutrófilos humanos isolados a partir de amostras de sangue
tratadas com os anticoagulantes EDTA, citrato e heparina ........................................ 67
4.3 Activação de neutrófilos humanos pelo PMA................................................ 68
4.4 Quantificação do cálcio livre intracelular nos neutrófilos humanos isolados 69
4.5 Activação de neutrófilos humanos pelo nitrato de níquel .............................. 70
4.6 Processos envolvidos na geração de espécies reactivas durante a activação dos
neutrófilos pelo nitrato de níquel................................................................................ 71
5 DISCUSSÃO ......................................................................................................... 73
6 CONCLUSÕES FINAIS ...................................................................................... 83
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 85
Introdução geral
4
1 INTRODUÇÃO GERAL
Introdução geral
5
1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS
Esta dissertação foi realizada no âmbito do Curso de Mestrado em Química
Analítica e Ambiental. O tema escolhido para a dissertação teve como base geral a
preocupação actual sobre o impacto negativo da contaminação ambiental por metais
pesados na saúde dos organismos, nomeadamente no Homem, estando assim em
armonia com os objectivos deste Curso de Mestrado.
O metal pesado escolhido para os estudos relacionados com esta dissertação foi o
Ni. Devido às suas propriedades físico-químicas, o Ni metálico e os seus compostos são
muito utilizados na indústria moderna. O elevado consumo dos produtos que contêm Ni
é inevitável e origina poluição, quer durante a produção, reciclagem e mesmo durante a
sua utilização. A exposição humana ao Ni ocorre principalmente via inalação e ingestão,
embora a utilização de jóias que contenham este elemento na sua composição seja
também um factor importante de exposição pois leva ao desenvolvimento de alergias
em aproximadamente 10 a 20% da população. Estudos epidemiológicos realizados nas
últimas décadas a pessoas expostas ocupacionalmente a este elemento, comprovam que
os compostos de Ni, excepto o Ni metálico, são pró-inflamatórios e pró-cancerígenos
em humanos.
Apesar do interesse actual relacionado com os efeitos pro-inflamatórios do Ni
pouco se sabe ainda sobre a interacção dos iões de Ni com os neutrófilos humanos. Os
neutrófilos constituem os leucócitos mais abundantes da corrente sanguínea e
participam activamente na defesa inata do hospedeiro. Uma vez iniciada a resposta
inflamatória, estas células são as primeiras a serem recrutadas para os locais afectados,
devido à sua elevada mobilidade e capacidade fagocitária. Os neutrófilos utilizam
mecanismos dependentes e independentes do oxigénio para a eficiente destruição de
agentes invasores. Os mecanismos independentes do oxigénio são a quimiotaxia,
fagocitose, desgranulação e libertação de enzimas líticas e péptidos bactericidas. Já os
dependentes do oxigénio incluem a produção de ROS e RNS. A sobre-activação dos
neutrófilos, poderá levar à geração sustentada de ROS e RNS em níveis elevados,
resultando em efeitos deletérios para o organismo. Assim, a metodologia experimental
escolhida para avaliar possíveis efeitos adversos do Ni envolveu a utilização de
neutrófilos humanos isolados para estudar a sua possível activação por este metal.
Introdução geral
6
1.2 OBJECTIVOS DO TRABALHO E ESTRUTURA DA DISSERTAÇÃO
O objectivo principal deste estudo foi o de implementar e aplicar uma
metodologia experimental, in vitro, para avaliar a possível activação de neutrófilos
humanos pelo nitrato de níquel. Para atingir este objectivo dividiu-se o trabalho
experimental em várias fases complementares. A primeira fase visou a implementação
de uma metodologia para o isolamento de neutrófilos humanos, pelo método de
centrifugação de gradiente de densidade. Na segunda fase implementou-se uma técnica
de quimioluminescência, para avaliar a activação dos neutrófilos isolados, pelo PMA.
Na terceira fase, quantificou-se o cálcio livre intracelular dos neutrófilos isolados. Na
quarta fase avaliou-se a activação dos neutrófilos humanos pelo nitrato de níquel, bem
como os processos envolvidos na geração de espécies reactivas durante a activação.
Em todas as fases do estudo, foram utilizados diferentes anticoagulantes no
processo de recolha de amostras sanguíneas, nomeadamente o citrato, EDTA e heparina,
com o objectivo de avaliar a sua influência na eficácia do isolamento dos neutrófilos, ou
seja, na viabilidade celular e número de neutrófilos isolados bem como na sua activação
pelo PMA e pelo nitrato de níquel.
Esta dissertação divide-se em 6 capítulos. O primeiro, designado Introdução,
consiste num enquadramento teórico em que se faz uma abordagem às principais
características do níquel. Também neste capítulo se caracterizam todos os componentes
do sangue e a produção de ROS e RNS por algumas células de defesa, nomeadamente
pelos neutrófilos. No segundo capítulo são descritos os Materiais e Métodos utilizados
na fase experimental deste trabalho. Este capítulo inclui o fundamento teórico das
técnicas utilizadas e os procedimentos experimentais efectuados. Os Resultados obtidos
são apresentados num terceiro capítulo, a que se segue a Discussão e Conclusões no
quarto e quinto capítulo, respectivamente. Por último são apresentadas as Referências
Bibliográficas que sustentaram o desenvolvimento do presente trabalho.
Introdução
7
2 INTRODUÇÃO
Introdução
8
2.1 NÍQUEL
O níquel é um elemento químico de símbolo Ni, número atómico 28 (28 protões e
28 electrões) e massa atómica 58,7 u.m.a.. À temperatura ambiente, o Ni encontra-se no
estado sólido. É um elemento de transição situado no grupo 10 (8 B) da Classificação
Periódica dos Elementos (The Merck Index, 2001).
O uso do Ni remonta aproximadamente ao século IV A.C. geralmente junto com o
cobre já que aparece com frequência em ligas com este metal. Bronzes originários da
actual Síria têm conteúdos de Ni superiores a 2%. Manuscritos chineses sugerem que o
«cobre branco» era utilizado no Oriente desde 1400-1700 A.C.. Entretanto, a facilidade
de confundir as minas de Ni com as de prata induzem a pensar que, na realidade, o uso
do Ni foi posterior, a partir do século IV A.C. (Soine e Wilson, 1957; Maibach e
Menné, 1989; Lide, 1998). Os mineiros de Hartz atribuem ao «viejo Nick» (o diabo) o
motivo pelo qual alguns minerais de cobre não poderiam ser trabalhados. O metal
responsável por isso foi descoberto em 1751 por Axel Frederik Cronstedt, quando
tentava extrair cobre da niquelina, o qual denominou o kupfernickel, diabo do cobre
(Maibach e Menné, 1989; Soine e Wilson, 1957).
2.1.1 Abundância e obtenção
O Ni existe em abundância na crosta terrestre, representando 0,01% das rochas
ígneas. Trata-se, de facto, do vigésimo quarto elemento mais abundante no nosso
planeta. Está presente em quase todos meteoritos, juntamente com o ferro (formando as
ligas kamacita e taenita) e é um dos constituintes fundamentais do núcleo da Terra. Os
minérios que possuem Ni na sua composição, mais representativos, são a pentlandite
[(Fe, Ni)9S8], a nicolite (NiAs) e a garnierite [3(Mg, Ni)O.2SiO2.2H2O] (The Merck
Index, 2001; ATSDR, 2005).
As minas de Nova Caledônia, Austrália e Canadá produzem actualmente 70% do
Ni consumido. Outros produtores são Cuba, Porto Rico, Rússia e China (Lide 1998;
Denkhaus e Salnikow, 2002; ATSDR, 2005).
Introdução
9
Os processos de extracção do Ni são muito complexos: nas suas fases finais, o NiS
obtido é ustulado a NiO e o óxido é reduzido com gás de água (mistura de CO e H2)
(Equação 1) (Soine e Wilson, 1957; The Merck Index, 2001).
Equação 1:
2NiO (s) + CO (g) + H2 (g) 2Ni (s) + CO2 (g) + H2O (g)
Sendo o metal obtido bastante impuro, pode ser purificado pelo processo de
Mond, que se traduz no seguinte equilíbrio químico (Equação 2) (Soine e Wilson, 1957;
The Merck Index, 2001):
Equação 2:
Ni + 4CO (g) Ni(CO)4 (g)
2.1.2 Principais características físico-químicas
É um metal de transição de coloração branco/prateada, condutor de electricidade e
calor, dúctil e maleável. Não pode ser laminado, polido ou forjado facilmente,
apresentando certo carácter ferro-magnético. A densidade do Ni é 8,90 vezes a
densidade da água a 20ºC, funde-se a 1453ºC e entra em ebulição a 2732ºC (Soine e
Wilson, 1957; Lide, 1989; The Index Merck, 2001; ATSDR, 2005).
O catião Ni (II) (aq) é um ácido bastante fraco (pka =10,92), motivo pelo qual se
pode obter soluções aquosas límpidas de Ni (II) sem adição de ácido. O seu estado de
oxidação mais comum é +2 podendo apresentar estados de oxidação -1, 0, +1, +3 e +4
em complexos, sendo porém pouco comuns (Gould, 1959; Maibach e Menné, 1989;
Denkhaus e Salnikow, 2001; ATSDR, 2005). Há muitos compostos de Ni pouco
solúveis em água (por exemplo NiCO3, NiC2O4, Ni(CN)2).
Uma propriedade notável do Ni, é a sua capacidade de absorver monóxido de
carbono: 100 g de Ni(CO)4 podem absorver 500-800 mL de monóxido de carbono
(Denkhaus e Salnikow, 2002).
Introdução
10
Na natureza são encontrados 5 isótopos estáveis: Ni-58, Ni-60, Ni-61, Ni-62 e Ni-
64, sendo o mais leve o mais abundante (68,27%). Foram caracterizados 18
radioisótopos, dos quais os mais estáveis são o Ni-59, o Ni-63 e o Ni-56 com tempos de
meia-vida de 76000 anos, 100,1 anos e 6,077 dias, respectivamente. Os demais
radioisótopos com massas atómicas desde 52 u.m.a. (Ni-52) a 74 u.m.a. (Ni-74),
apresentam tempo de meia-vida inferior a 60 horas, embora a maioria não alcance os 30
segundos. O Ni tem também um estado metaestável (The Merck Index, 2001; Denkhaus
e Salnikow, 2002).
2.1.3 Aplicações
O Ni puro é usado em galvanoplastia, sendo depositado galvanicamente nas
superfícies de peças metálicas para lhes conferir resistência à corrosão, conferindo-lhes
também um aspecto bastante liso e brilhante. Cerca de 65% do Ni consumido é
empregado na fabricação de aço inoxidável e outros 12% em superligas de níquel. Os
restantes 23% são repartidos na produção de outras ligas metálicas, baterias
recarregáveis, cunhagem de moedas, revestimentos metálicos e fundição (Lide, 1989;
The Index Merck, 2001; ATSDR, 2005).
A seguir referem-se algumas ligas metálicas fabricadas a partir deste elemento
(Lide, 1989; The Index Merck, 2001; ATSDR, 2005):
- Alnico (Al, Ni, Fe e Co), ligas para ímanes permanentes.
- Monel (Ni, Cu e algum Fe), são muito resistentes à corrosão, utilizando-se em
motores marítimos e indústria química.
- Nitinol-55 (Ni e Ti), apresenta o fenómeno de memória de forma e é usado em
robótica. Também existe em ligas que apresentam superelasticidade.
- Raney, ou o chamado Ni de Raney é obtido por tratamento de uma liga de Al e Ni
com NaOH (aq), é muito utilizado como catalisador de hidrogenações, como por
exemplo, na conversão de gorduras insaturadas não comestíveis em gorduras
alimentares, como a margarina.
Introdução
11
2.1.4 Papel Biológico
O Ni é um elemento essencial para todas as formas de vida. Este metal ocupa o
centro activo de sete enzimas microbianas (superóxido dismutase (SOD), urease,
hiderogenase, CO-desidrogenase e Acetil Coenzima A sintetase, Metil-Coenzima M
reductase, glioxalase I e cis-trans isomerase) (Watt e Ludden, 1999).
As enzimas que contêm Ni no centro activo são vulgares no metabolismo de
bactérias anaeróbias, como por exemplo, as chamadas bactérias metanogénicas, que
podem crescer na presença de uma mistura de H2 e CO2, e são sistemas altamente
especializados, sendo os únicos organismos capazes de produzir metano (CH4) como
produto final do seu metabolismo (Baran, 1995; Watt e Ludden, 1999).
• Superóxido dismutase
A enzima Ni-superóxido dismutase (Ni-SOD) foi isolada em 1996 a partir de duas
espécies de Streptomyces. É uma proteína homotetramérica com 4 subunidades de 13
KDa. O Ni induz a sua expressão, reprime a FeZn-SOD (SOD que contém zinco e ferro)
e encontra-se envolvido na maturação de um precursor polipeptídico. Resultados de
Ressonância Paramagnética Electrónica (RPE), indicam que o Ni está no estado Ni (III)
e está axialmente coordenado por um ligando de azoto, provavelmente histidina.
Estudos recentes revelam que o Ni pode também conter um ligando de enxofre
presumivelmente um derivado da cisteína (Baran, 1995; Ragsdale, 1998; Watt e
Ludden, 1999). Esta enzima cataliza a reacção de dismutação do O2-. com formação de
H2O2 e O2 (Equação 3).
Equação 3:
2H+ + 2O2-. H2O2 + O2
Introdução
12
• Urease
Esta enzima é conhecida há mais de 100 anos e foi, historicamente, a primeira
enzima obtida sob a forma cristalina (1926). Após a sua descoberta, a enzima urease foi
identificada como uma metaloproteína que contém dois átomos de Ni (II) no seu centro
activo, e é capaz de catalisar a hidrólise da ureia em CO2 e amónia, acelerando a reacção
1014 vezes (Equação 4). A geometria de coordenação é octaédrica distorcida e a
configuração electrónica do Ni (II) é de alto spin. A esfera de coordenação dos átomos
de Ni é constituída por oxigénios e azotos, não contendo enxofre. Esta enzima tem um
papel crucial em ruminantes pois permite a utilização da ureia como fonte de azoto para
a síntese de proteínas, de acordo com a Equação 4 (Kaim e Schwederski, 1994; Watt e
Ludden, 1999).
Equação 4:
H2N-CO-NH2 + 2H2O 2NH3 + H2CO3
• Hidrogenase
A hidrogenase é uma enzima que catalisa a geração e o consumo de hidrogénio
gasoso (Equação 5), com a participação de dadores ou aceitadores electrónicos
adequados. Esta reacção possui um papel importante durante a fixação de azoto e
durante a fermentação de biomassa com a produção de CH4. Tanto os microorganismos
aeróbios como os anaeróbios contêm hidrogenases. Por outro lado, o H2 pode ser
utilizado como fonte de energia ou aparecer como produto final de processos redutores
(Kaim e Schwederski, 1994; Baran, 1995; Ragsadale, 1998). As hidrogenases podem
ser classificadas, de um modo geral, em: i) hidrogenases apenas de ferro, também
conhecidas como Hase [Fe], de ocorrência rara, não apresentando Ni e contendo dois
agregados [4Fe-4S], além de um agregado de ferro-enxofre, o centro H, considerado ser
o centro catalítico. A estrutura deste centro H é ainda desconhecida; ii) hidrogenases de
Ni e com ferro-enxofre, também denominadas Hase [NiFe], sendo de longe as mais
comuns e apresentam dois agregados [4Fe-4S], um agregado [3Fe-4S] e um centro
Introdução
13
metálico contendo Ni. Pode ser feita ainda uma sub-divisão dentro desta classe de modo
a incluir hidrogenases em que um dos ligandos do níquel é uma seleno-cisteína
(Hase[NiSeFe]). Estas últimas não possuem um agregado [3Fe-4S] (Baran, 1995;
Ragsdale, 1998; Watt e Ludden, 1999). De acordo com Baran (1995), o átomo de Ni das
enzimas Hase [NiFe], está coordenado por dois ou três átomos de enxofre e por dois a
quatro átomos de O e N, o que leva a uma coordenação octaédrica distorcida. Durante a
actividade, o Ni parece variar o seu estado de oxidação entre Ni (III) e Ni (II).
Equação 5:
H+ + H- H22H+ + 2e
• CO-desidrogenase e Acetil Coenzima A sintetase
Muitas bactérias metanogénicas ou acetonogénicas, contêm uma proteína
bifuncional com duas subunidades, uma CO-desidrogenase e uma acetil-Coenzima A
sintetase. Por sua vez, a bactéria fotossintética púrpura Rhodospirillum rubrum, contém
apenas uma subunidade com uma CO-desidrogenase, que catalisa somente a oxidação
de CO. Esta enzima catalisa a oxidação de CO a CO2 e como se trata de uma reacção
reversível, pode também servir para a fixação do CO2 pelas bactérias fotossintéticas. A
enzima tem um efeito duplo, já que, para além de catalisar a redução de CO2 a CO, a
sua função biológica essencial está associada à síntese de acetil coenzima A, actuando
conjuntamente com a coenzima A, daí denominar-se acetil CoA sintetase. Nas bactérias
metanogénicas o acetato degrada-se a CH4 e CO2, aparentemente através da formação
intermédia de CO (Kaim e Schwederski, 1994; Ragsadale, 1998; Watt e Ludden, 1999).
Diversos estudos espectroscópios e estruturais sugerem que este sistema contém
um centro muito particular de composição Fe3NiS4. Outra possibilidade é a existência
de um centro constituído por [4Fe-4S] acopolado ao Ni através de um ligando. Este
último parece ter uma esfera de coordenação rica em enxofre (Baran, 1995; Watt e
Ludden, 1999).
Introdução
14
• Metil-Coenzima M reductase
Esta enzima é utilizada por bactérias metanogénicas para gerar CH4 por catálise da
redução da metil-coenzima M, sendo esta a última etapa da geração de CH4 a partir de
CO2 (Equação 6). A metil-coenzima M reductase é constituída por vários componentes,
indispensáveis para a actividade enzimática. O centro activo propriamente dito está
localizado numa proteína dimérica formada por várias subunidades de peso molecular
de aproximadamente 300 KDa. Da mesma pode-se isolar uma unidade de baixo peso
molecular, factor F-430, a qual contém Ni. A conformação desta enzima permite que o
Ni (II) tenha a sua reactividade aumentada e que possa ocorrer a sua redução (Ni
(II)→Ni (I)). Por outro lado, diversos estudos espectroscópios sugerem que na proteína
a coordenação do Ni (II) seria octaédrica e a configuração do metal de alto spin (Kaim e
Schwederski, 1994; Baran, 1995; Ragsdale, 1998; Watt e Ludden, 1999).
Equação 6:
CH3S(CH2)2SO3- + 2e- + 2H+ CH4 + HS(CH2)2SO3
-
• Glioxalase I
Esta enzima pertence a um sistema de duas enzimas, a glioxalase I e glioxalase II.
A glioxalase I, é uma metaloproteína tipicamente de zinco, que catalisa a isomerização
de hemitioacetal formado não enzimaticamente através da glutationa e α-cetoaldeídos
citotóxicos como o metilglioxal. Esta enzima foi isolada da bactéria E. coli, e não é
activada pelo zinco, que é o metal nativo nos seres humanos e leveduras. A activação
ocorre com Ni (II). Esta foi a primeira glioxalase cujas funções são activadas por um
metal diferente do zinco (Clugston et al., 1998; Watt e Ludden, 1999).
Introdução
15
• Isomerase
Esta enzima foi isolada da bactéria E. coli, por cromatografia de afinidade com
metal imobilizado. É uma cis-trans-isomerase que possui uma susposta ligação ao Ni
(Watt e Ludden, 1999).
2.1.5 Estudos epidemiológicos
O Ni pode ser absorvido pelo organismo por inalação (fumo de cigarro), ingestão
(alguns alimentos, nomeadamente derivados de plantas, podem conter 1 mg Ni /Kg) e
penetração pela pele (várias jóias, moedas, utensílios diversos contêm na sua
composição este metal) (Denkhaus e Salnikow, 2002; Kasprzak et al., 2003; Lu et al.,
2005), sendo a última forma a menos relevante, pois os compostos de Ni ionizados não
conseguem penetrar na pele, desde que esta esteja intacta (Denkhaus e Salnikow, 2002).
A quantidade de Ni absorvido no sistema gastrointestinal depende das espécies de Ni
ingeridas, do conteúdo total neste elemento e da absorção individual. Contudo, sabe-se
que 1 a 2% do Ni ingerido numa dieta normal é absorvido, enquanto o resto é excretado
na urina e fezes (Kasprzak et al., 2003; Silvulka, 2005).
Estudos epidemiológicos realizados nas últimas décadas a pessoas expostas
ocupacionalmente a este elemento, comprovam que os compostos de Ni, excepto o Ni
metálico, são cancerígenos em humanos (Denkhaus e Salnikow, 2002; Sivulka, 2005).
Tendo em conta que a principal via de exposição ao Ni é por inalação, é compreensível
que se verifique com maior frequência cancro nas vias respiratórias e pulmões
(International Agency for Research on Câncer (IARC), 1997). Em 1990, o IARC
sugeriu que haveria riscos de contrair cancro nas vias respiratórias, quando existia uma
exposição a Ni solúvel em concentrações superiores a 1 mg/m3 enquanto que a
exposição a formas de Ni menos solúveis, se poderá tolerar concentrações até 10
mg/m3. Todavia, esta organização não conseguiu definir com confiança as
concentrações a partir das quais este elemento se torna efectivamente perigoso (IARC,
1997). Neste momento, existe a preocupação de descobrir sob que forma química é que
Introdução
16
o Ni se torna carcinogénico. Ensaios laboratoriais demonstraram que partículas
insolúveis (menores que 5 µm) podem ser fagocitadas por culturas de células e formam
vacúolos intracelulares que geram Ni (II) perto do núcleo. Quanto mais negativa for a
carga da superfície da partícula, mais facilmente é fagocitada. Após a fagocitose, as
partículas do interior dos vacúolos são rapidamente dissolvidas a pH 4,5 o que leva a
um aumento dos níveis intracelulares de Ni. Consequentemente, consideráveis
quantidades de Ni (II) são libertadas desses vacúolos, podendo atingir o núcleo (Figura
1) (Costa et al., 2001; Costa et al., 2002; Lu et al., 2005).
Figura 1. Modelo da fagocitose e dissolução intracelular de NiS e Ni3S2 cristalinos, NiS
amorfo e sais solúveis de Ni (adaptado de Costa et al., 2002).
Os catiões de Ni (II) podem também ser transportados através da membrana
celular por difusão ou através de canais de cálcio, sendo contudo processos mais
ineficientes e inefectivos quando comparados com a fagocitose (Costa et al., 2001;
Costa et al., 2002; Denkhaus e Salnikow, 2002). Foi recentemente descoberto que iões
solúveis de Ni entram na célula por uma via transportadora de metais divalentes (Costa
et al., 2002), podendo afectar a homeostase do ferro de várias formas. Pode competir
com o ferro para entrar na célula, a nível extracelular, mas pode também competir a
nível intracelular, por exemplo, com enzimas que contenham este metal. Esta
competição ocorre devido às semelhanças das estruturas atómicas destes elementos
(Davidson et al., 2005).
Introdução
17
Através da quantificação directa da concentração de Ni no interior da célula, foi
demonstrado que a exposição das células a sais de Ni solúveis em água, resulta em
níveis elevados deste elemento no citoplasma e baixos no núcleo, enquanto que uma
exposição a Ni3S2 cristalino leva a elevados níveis no núcleo. Esta diferença é
concordante com a baixa actividade cancerígena dos compostos de Ni (II) solúveis em
água (NiSO4), quando comparados com os insolúveis em água (Ni3S2, NiS, NiO) (Haber
et al., 2000; Costa et al., 2001, Costa et al., 2002).
Após vários estudos realizados em animais, concluiu-se que os compostos de Ni
são os únicos da classe de cancerígenos que induzem cancro no local sujeito á exposição
e podem ser responsáveis por diferentes tipos de cancro (Costa et al., 2001; Denkhaus et
al., 2002; Lu et al., 2005).
A produção de ROS está envolvida no mecanismo de toxicidade e
carcinogenicidade do Ni. Essa produção pode causar peroxidação lipídica, alterações no
DNA, tais como mutações em pares de base, rearranjos, delecções, inserções, podendo
afectar o sinal de transducção e, consequentemente, ter implicações irreversíveis na
sequência de DNA (Denkhaus e Salnikow, 2002; Cavallo et al., 2003; Chen et al.,
2003a, Babu et al., 2006). O Ni tem dois mecanismos de indução de danos oxidativos
no DNA. Um deles é directo, em que o Ni (II) que entra nas células e reage com H2O2,
formando um complexo oxo-Ni (IV) ou um complexo Ni (III) peróxido, levando à
produção de outras ROS, nomeadamente HO. (Kawanishi et al., 2002). Segundo Chen
et al. (2003a) o radical HO. pode danificar as bases do DNA, causar quebras nas
ligações do DNA e causar ligações cruzadas DNA-proteína. Esta genotoxicidade parece
contribuir para o efeito carcinogénico deste metal. O outro mecanismo é indirecto,
provocado por inflamação, o que leva à produção de ROS pelas células de defesa
(neutrófilos e macrófagos). O ONOO- gerado nos tecidos inflamados pode causar danos,
inclusive no DNA, nas células adjacentes (Kawanishi et al., 2002). Segundo o estudo
realizado por Kawanishi et al. (2002), o NiSO4, NiO e Ni3S2 provocam danos indirectos
no DNA através da inflamação. O Ni3S2 pode provocar também danos directos no
DNA.
Alguns estudos demonstram que existem células que desenvolvem mecanismos de
resistência contra o stresse oxidativo provocado pelo Ni, como por exemplo um
aumento de cerca de 1,8 vezes de glutationa em células expostas a este metal (Denkhaus
et al., 2002). Contudo, outros revelam que a aplicação de Ni a células pode danificar os
Introdução
18
mecanismos de defesa antioxidantes, bem como, os mecanismos de reparação do DNA
(Lynn et al., 1997; Cavallo et al., 2003).
De acordo com Denkhaus e Salnikow (2002), Cavallo et al. (2003), Chen et al.
(2003a) e Babu et al. (2006), conclui-se que a exposição das células a compostos de Ni
induz a produção de ROS, que por sua vez, têm uma forte interferência nos mecanismos
biológicos da própria célula, estando directamente envolvidos na carcinogenicidade
deste metal. De referir que apesar da carcinogeniciade atribuída ao Ni, o
desenvolvimento de cancro em humanos depende de muitos factores, como a extensão
do dano no DNA, o sistema de reparação do DNA e dos genes reguladores de sinal.
2.2 SANGUE
O sangue é um tecido líquido que circula pelo sistema vascular sanguíneo dos
animais vertebrados. Num homem adulto representa cerca de 1/12 do peso do seu corpo,
o que corresponde a 5-6 L (Tagliasacchi e Carboni, 1997). Trata-se de um tecido
conjuntivo especializado, constituído, em volume, por 45% de células sanguíneas,
também designadas como elementos figurados e 55% de plasma sanguíneo. As células
sanguíneas são de três tipos funcionais (Figura 2): (i) hemácias (ou eritrócitos, glóbulos
vermelhos) que transportam oxigénio dos pulmões para os tecidos periféricos; (ii)
leucócitos (ou glóbulos brancos) que possuem um papel defensivo, destruindo os
organismos infectantes como bactérias e vírus, assim como auxiliando na remoção dos
tecidos mortos ou lesados; (iii) plaquetas (trombócitos), os quais constituem a primeira
linha de defesa contra a lesão dos vasos sanguíneos, aderindo às soluções de
continuidade e participando no sistema de coagulação do sangue. O plasma, é formado
por 90% de água, meio que facilita a circulação de muitos factores indispensáveis de
que é constituído (Young e Heath, 2000; Seeley et al., 2001; Gartner e Hiatt, 2003).
Introdução
19
Figura 2. Composição do sangue (adaptado de www.oxfordreference.com).
2.2.1 Origem das células do sangue
O tempo de vida limitado das células do sangue exige a sua renovação regular, a
fim de manter constante a população de células circulantes. O processo pelo qual as
células sanguíneas maduras se desenvolvem a partir de células precursoras é
denominado hematopoese (também denominado hemocitopoese ou hemopoeise)
(Young e Heath, 2000; Gartner e Hiatt, 2003).
No início da gravidez, o embrião retira os alimentos de que precisa das paredes do
útero materno. Por volta das três semanas de gestação, inicia-se a hematopoese no saco
vitelino onde se formam pequenas massas celulares, que se vão transformando em
agrupamentos sanguíneos, designados ilhotas de Wolff. Estas ilhotas desenvolvem-se a
partir de hemocitoblastos, os progenitores das células hematopoiéticas e endoteliais
(Kierszenbaum, 2004). As células que delimitam o contorno das ilhotas vão originar as
paredes dos primeiros vasos sanguíneos. Gradualmente, o interior dessas ilhotas vai
ficando vazio e as células mais internas transformam-se em glóbulos vermelhos
primitivos. No início do segundo mês, o sangue já tem glóbulos vermelhos, brancos e
plaquetas. Os vasos sanguíneos e glóbulos vermelhos são de origem extra-embrionária,
ou seja, fora do embrião. Após o segundo trimestre, a hematopoese fetal continua no
fígado e depois no baço (Kierszenbaum, 2004). Durante o sétimo mês de vida intra-
uterina, inicia-se a fase mielóide (de myelos, medula) de produção de sangue, em que a
medula óssea (tecido gelatinoso que preenche a cavidade interna dos ossos longos e
Introdução
20
esterno) começa a desempenhar o papel de principal estrutura produtora de sangue, e
assim permanece durante toda a vida (Young e Heath, 2000; Gartner e Hiatt, 2003;
Kierszenbaum, 2004). Na altura do nascimento, a medula óssea vermelha é o principal
local de produção de eritrócitos, o que lhe confere uma cor vermelha profunda, daí o
nome medula vermelha (Young e Heath, 2000). Como a medula óssea apenas atende às
necessidades normais, qualquer demanda maior (por exemplo devido à perda excessiva
de sangue ou no caso de destruição extensa da medula óssea) pode levar à retoma de
actividade hemopoiética por parte do fígado e baço (Stevens e Lowe, 1995). No adulto,
um volume de cerca de 1,7 L de medula contém 1012 células hematopoiéticas
(Kierszenbaum, 2004). Com o passar dos anos, a maior parte da medula vai perdendo a
sua função, sendo substituída por um tecido gorduroso, passando a ser designada
medula amarela. Esta pode ser reactivada se surgir a necessidade de hematopoese
aumentada (Young e Heath, 2000). Segundo Seeley et al. (2001), todos os elementos
figurados do sangue derivam de uma única população de células indiferenciadas
denominadas hemocitoblastos (Figura 3).
Figura 3. Células envolvidas na hematopoese (adaptado de www.msd-brazil.com).
Introdução
21
Essas células dão origem aos progenitores imediatos dos vários tipos de células do
sangue: os proeritroblastos, que originam os eritrócitos; os mieloblastos, que originam
os granulócitos; os linfoblastos, que originam os linfóciotos; os megacarioblastos que
originam as plaquetas.
2.2.2 Componentes do sangue
2.2.2.1 Plasma
Mais de 50% do sangue consiste num líquido de cor amarela pálida, que é
composto por cerca de 91% de água e 9% de outras substâncias, (Tagliasacchi e
Carboni, 1997; Seeley et al., 2001), tais como proteínas plasmáticas, que correspondem
a 7%, 0,9% de sais inorgânicos, sendo o restante formado por compostos orgânicos
diversos (gases, aminoácidos, vitaminas, hormonas e glicose) (Junqueira e Carneiro,
2004). As proteínas plasmáticas são responsáveis por diversas características biofísicas
do plasma, como a densidade, a viscosidade e a pressão oncótica. As proteínas do
plasma são de três tipos principais, a albumina, a globulina e o fibrogénio. A albumina
representa 58% do total de proteínas plasmáticas, e como não passa facilmente do
sangue para os tecidos, possui a importante função de manutenção da pressão oncótica
do sangue. Isto é possível porque esta proteína extrai água dos tecidos para os capilares,
dificultando, por outro lado, a sua saída dos capilares para os tecidos (Seeley et al.,
2001; Gartner e Hiatt, 2003). As globulinas correspondem a 38% das proteínas
plamáticas, funcionando algumas como moléculas de transporte e participando outras
no sistema de defesa e nos mecanismos de imunidade e alergia. O fibrogénio constitui
4% do total de proteínas do plasma e é fundamental nos fenómenos de coagulação
sanguínea.
Introdução
22
2.2.2.2 Glóbulos vermelhos
Os glóbulos vermelhos, também designados hemácias ou eritrócitos (erythros,
vermelho; kitos, célula), são as células maioritárias do sangue (cerca de 700 vezes mais
numerosas que os leucócitos e 17 vezes mais que as plaquetas) (Seeley et al., 2001). A
quantidade de eritrócitos no sangue varia com o sexo. No homem adulto normal, a sua
concentração é de aproximadamente 5,2 milhões de eritrócitos por mL3 de sangue
(variando entre 4,2 e 5,8 milhões), enquanto que na mulher normal é 4,5 milhões por
mL3 (variando entre 3,6 e 5,2 milhões) (Seeley et al., 2001; Junqueira e Carneiro,
2004). Os glóbulos vermelhos não se movem activamente. São movidos através da
circulação pelas forças responsáveis pela circulação sanguínea. São células de forma
bicôncava, anucleadas, medindo em média 7,5 µm de diâmetro (Junqueira e Carneiro,
2004; Kierszenbaum, 2004), 2 µm de espessura na sua região mais larga e menos de 1
µm no centro (Gartner e Hiatt, 2003). A forma bicôncava dos eritrócitos favorece a
existência de uma grande superfície de difusão, em relação ao seu tamanho e volume,
acentuando desse modo a troca de gases. Essa forma, juntamente com a fluidez da
membrana plasmática, permite que o eritrócito se deforme prontamente tornando mais
fácil o seu movimento através dos pequenos vasos sanguíneos (3-4 µm), sem que ocorra
o rompimento da membrana celular (Young e Heath, 2000; Seeley et al., 2001; Gartner
e Hiatt, 2003). Apesar das células precursoras dos eritrócitos dentro da medula óssea
serem nucleadas, durante o seu desenvolvimento e maturação, expelem, não somente o
núcleo, como também todos os seus organelos, antes de serem libertadas na circulação
sanguínea (Gartner e Hiatt, 2003). Esse facto favorece o transporte de oxigénio, pois as
células podem conter maior quantidade de hemoglobina, contribuindo para uma maior
eficiência por unidade de volume. Aproximadamente 60% da célula do glóbulo
vermelho é constituída por água e o restante pelos elementos sólidos. Da parte sólida,
cerca de 90% é ocupada por hemoglobina, proteína responsável pela sua cor vermelha.
Fazem ainda parte do eritrócito, lípidos, adenosina trifosfato (ATP) e a enzima anídrase
carbónica (Seeley et al., 2001). Esta enzima, possui a importante função de catalisar a
reacção entre o CO2 e água dando origem a ácido carbónico, que por sua vez, se
dissocia formando iões bicarbonato e hidrogénio (Equação 7). É sob a forma de
bicarbonato que grande parte do CO2 é transportado para os pulmões onde é expelido. A
Introdução
23
produção de iões bicarbonato é também importante para a regulação do pH do sangue
(Seeley et al., 2001; Gartner e Hiatt, 2003).
Equação 7:
CO2 + H2O H2CO3 H+ + HCO3-
A hemoglobina possui a função vital de transporte dos gases respiratórios,
nomeadamente a distribuição do oxigénio pelo organismo. Quimicamente é uma
molécula bastante complexa, podendo ser dividida em mais de 500 aminoácidos. É
composta por quatro cadeias de proteínas e quatro grupos heme. Cada proteína,
chamada globina, está ligada a um grupo heme. Cada grupo heme é uma molécula
pigmentada de vermelho contendo um átomo de ferro, sendo este responsável por
manter o oxigénio ligado à molécula. O corpo humano adulto, normalmente contém
cerca de 4 g de ferro, 2/3 dos quais, associados à hemoglobina (Seeley et al., 2001). Já o
dióxido de carbono, não se combina com os átomos de ferro, mas liga-se aos grupos
amina da molécula globina (Seeley et al., 2001). A configuração química da
hemoglobina permite um aproveitamento excepcional do oxigénio (cada molécula pode
transportar quatro moléculas de oxigénio). Em zonas onde a pressão de oxigénio é alta,
como nos pulmões, as moléculas de hemoglobina combinam-se com moléculas de
oxigénio, formando a oxi-hemoglobina, cuja coloração é vermelho viva. Esta
combinação é reversível, e o oxigénio transportado por esta proteína é transferido para
os tecidos, onde a pressão de oxigénio é baixa. A combinação de hemoglobina com o
dióxido de carbono produzido nos tecidos também é facilmente reversível quando o
sangue chega aos pulmões. Essa combinação designa-se carbamino-hemoglobina, sendo
a sua coloração vermelho escura. Contudo, grande parte do CO2 é transportada dos
tecidos para os pulmões, dissolvida no plasma (Junqueira e Carneiro, 2004).
O.NO é uma substância neurotransmissora que também pode ser captada pela
hemoglobina. Provoca a dilatação dos vasos sanguíneos tornando possível a libertação
de mais oxigénio e a captação de uma maior quantidade de dióxido de carbono pelos
eritrócitos presentes nos tecidos do corpo (Gartner e Hiatt, 2003).
Com base na sequência de aminoácidos, existem quatro cadeias polipeptídicas
humanas normais de hemoglobina do feto, denominadas α, γ, β e δ. Segundo Gartner e
Hiatt (2003), a principal hemoglobina do feto, a hemoglobina fetal (HbF) é constituída
Introdução
24
por duas cadeias α e duas cadeias γ. Representa cerca de 100% da hemoglobina do feto
e cerca 80% da hemoglobina do recém-nascido, baixando a sua taxa progressivamente
até ao oitavo mês de idade, quando atinge a percentagem encontrada nos adultos (cerca
de 1%) (Junqueira e Carneiro, 2004). Este tipo de hemoglobina, tem uma enorme
afinidade para o oxigénio, e constitui uma adaptação fisiológica, com a finalidade de
extrair mais oxigénio da circulação materna da placenta. Há dois tipos normais de
hemoglobina no adulto, HbA1 (α2β2) e HbA2 (α2δ2), sendo esta última forma muito mais
rara. Num adulto normal a HbA1 representa 97%, a HbA2, cerca de 2% da hemoglobina
e os restantes 1% dizem respeito à HbF (Gartner e Hiatt, 2003; Junqueira e Carneiro,
2004). A vida média das hemácias é de 100 a 120 dias (Young e Heath, 2000; Seeley et
al., 2001) e é regida, em parte, pela sua capacidade de manter a forma bicôncova. À
medida que as suas proteínas, enzimas, componentes da membrana celular e outras
estruturas degeneram, os glóbulos vermelhos ficam velhos, tornando-se anormais quer
na forma, quer na função. Os eritrócitos também ficam sujeitos a sofrer diversos danos
durante a circulação pelos vasos. Os glóbulos vermelhos anormais, velhos ou alterados
são removidos do sangue por macrófagos, localizados principalmente no fígado e baço,
mas também noutros tecidos linfáticos. No interior do macrófago, enzimas lisossómicas
iniciam a assimilação da hemoglobina. (Young e Heath, 2000; Seeley et al., 2001),
ocorrendo um fraccionamento da globina nos aminoácidos que a constituem, muitos dos
quais são reutilizados na produção de outras proteínas. Os átomos de ferro também são
libertados para que possam ser reaproveitados. Os grupos heme são convertidos em
bilirrubina, que por sua vez, é conjugada com o ácido glucurónico no fígado e excretada
pela bílis, sendo convertida em pigmentos por microorganismos intestinais, conferindo
às fezes a sua cor característica amarelo-acastanhada. Alguns desses pigmentos são
reabsorvidos do intestino e eliminados na urina, dando-lhe uma cor característica
(Seeley et al., 2001).
Em condições normais, cerca de 2,5 milhões de glóbulos vermelhos são destruídos
por segundo. Este número surpreendente, todavia, representa somente 0,00001% do
total de 25 triliões contidos na circulação de um adulto normal. Mais surpreendente
ainda, é o facto desses 2,5 milhões de glóbulos vermelhos serem substituídos pela
produção de um número igual em cada segundo (Seeley et al., 2001). A quantidade de
glóbulos vermelhos no sistema circulatório é controlada pelo organismo, de tal forma
que um número adequado está sempre disponível para o transporte de oxigénio para os
Introdução
25
tecidos. Qualquer condição que diminua a quantidade de oxigénio nos tecidos, tende a
aumentar a produção de glóbulos vermelhos. A produção de eritrócitos pela medula é
bastante estimulada por uma proteína presente no plasma, denominada eritropoietina
(Seeley et al., 2001). A produção de eritrócitos exige a presença de vitamina B12 e um
factor da mucosa do estômago, designado factor intrínseco, que se combina com a
vitamina B12. Outro componente importante no processo de formação e maturação de
eritrócitos é o ácido fólico.
2.2.2.3 Plaquetas
As plaquetas, também designadas como trombócitos, são pequenos fragmentos (2-
4 µm), anucleados, derivados dos megacarioblastos. Estes são células extremamente
grandes (com diâmetros superiores a 100 µm) formadas na medula óssea, que
desenvolvem projecções citoplasmáticas originando as pró-plaquetas, que por sua vez se
fragmentam dando origem às plaquetas. Este é um processo que pode levar 10 a 12 dias
(Tagliasacchi e Carboni, 1997; Seeley et al., 2001; Kierszenbaum, 2004). Existem entre
250 000 e 400 000 plaquetas por mm3 de sangue, sendo formadas cerca de 30 000
plaquetas por dia/mL de sangue (Gartner e Hiatt, 2003).
A estrutura interna das plaquetas é bastante complexa. Observadas ao microscópio
electrónico, mostram 10 a 15 microtúbulos dispostos paralelamente uns aos outros e
formando um anel no hialómero (região periférica). Na região central apresentam o
granulómero. Os microtúbulos contêm monómeros de actina e miosina e contribuem
para manter a morfologia discóide das plaquetas, bem como, para formar alongamentos
ou pseudópodes, além de contrair as plaquetas quando estimuladas pelo aumento de
cálcio no interior do citoplasma. A contracção desses microfilamentos comprime os
organelos e grânulos do citoplasma, fazendo com que o seu conteúdo passe para o
plasma através do sistema tubular aberto. Esta disposição permite um aumento da área
de superfície da plaqueta e facilita a libertação de moléculas activas armazenadas nas
plaquetas (Young e Heath, 2000; Gartner e Hiatt, 2003). O granulómero contém
algumas mitocôndrias, depósitos de glicogénio, peroxissomas e alguns tipos de grânulos
(delimitados por membrana): grânulos α, grânulos δ e grânulos λ (lisossomas), cujas
Introdução
26
características se encontram listadas no Quadro 1. O granulómero também contém um
sistema de enzimas que possibilita às plaquetas catabolizar o glicogénio, consumir
oxigénio e gerar ATP.
As plaquetas são de fundamental importância nos processos de hemopatia (visa
impedir a perda de sangue) e coagulação do sangue. A participação das plaquetas na
coagulação do sangue pode ser resumida da forma que se segue (Stevens e Lowe, 1995;
Seeley et al., 2001; Gartner e Hiatt, 2003):
• Agregação primária: após uma lesão num vaso, ocorre perda do endotélio de
revestimento dos vasos, segue-se uma adesão das plaquetas ao colagéneo,
formando o denominado tampão plaquetário.
• Agregação secundária: as plaquetas do tampão libertam adenosina difosfato
(ADP), este é um potente indutor da agregação plaquetária, levando a um
aumento do número de plaquetas.
• Coagulação do sangue: quando há uma hemorragia considerável, há necessidade
de se formar um coágulo sanguíneo, já que este é mais consistente e firme do
que o tampão plaquetário. Um coágulo sanguíneo é uma rede de fibras proteicas
filiformes, denominada fibrina, que retém células sanguíneas, plaquetas e
líquido.
• Retracção do coágulo: inicialmente o coágulo faz uma grande projecção para o
interior do vaso. Entretanto, por acção da actina, miosina e ATP das plaquetas,
contrai-se.
• Remoção do coágulo: a parede do vaso, protegida pelo coágulo, forma novo
tecido, acabando por se restaurar. O coágulo é então removido maioritariamente
pela enzima plasmina e também por enzimas libertadas pelos lisossomas.
Introdução
27
Quadro 1. Caracterização dos grânulos das plaquetas.
Estrutura (Tamanho) Conteúdo Função
Grânulos α
(300- 500 nm)
Fibrogénio, factor de
crescimento derivado das
plaquetas, tromboplastina
plaquetária,
trombospondina, factores
de coagulação.
Facilitam a reparação dos
vasos, a agregação
plaquetária e a coagulação
do sangue.
Grânulos δ
(250- 300 nm)
Cálcio, ADP, ATP,
serotonina, histamina,
pirofosfatase.
Facilitam a agregação e a
adesão plaquetária, bem
como, a vasoconstrição.
Grânulos λ (lisossomas)
(200-250 nm) Enzimas hidrolíticas.
Auxiliam a reabsorção do
coágulo.
ADP: adenosina difosfato; ATP: adenosina trifosfato.
2.2.2.4 Glóbulos Brancos
As células brancas do sangue (leucócitos) são assim designadas por estarem
presentes na camada branca que flutua acima das células vermelhas quando o sangue
coagula num tubo de ensaio (Stevens e Lowe, 1995). O número de leucócitos é muito
menor do que os glóbulos vermelhos, tendo um adulto normal entre 6500 a 10000
glóbulos brancos por mm3 de sangue. A principal função destas células é proteger o
corpo contra microorganismos invasores e remover células mortas e corpos estranhos do
organismo. Ao contrário dos eritrócitos, os leucócitos não agem na corrente sanguínea,
utilizam-na como veículo para o trânsito entre os locais de formação, de armazenamento
e de actividade (Gartner e Hiatt, 2003). Estas células saem da corrente sanguínea e
entram nos tecidos por diapedese. Durante este processo, os leucócitos estreitam-se e
alongam-se passando entre ou, em alguns casos, através das células que formam as
paredes dos vasos. Os glóbulos brancos são tradicionalmente divididos em dois grupos,
com base na sua forma nuclear e nos grânulos citoplasmáticos: granulócitos
(neutrófilos, eosinófilos e basófilos) e os agranulócitos (linfócitos e monócitos). Os
Introdução
28
granulócitos são assim designados devido aos seus grânulos secretores citoplasmáticos
proeminentes, podendo também ser denominados células mielóides, pois são originados
na medula óssea. De acordo com o tipo de coloração dos grânulos específicos,
distinguem-se três tipos de granulócitos: neutrófilos, eosinófilos e basófilos. Além dos
grânulos específicos, estas células possuem grânulos azurófilos (lisossomas). Têm como
característica o facto de possuírem um único núcleo multilobulado (Young e Heath,
2000; Gartner e Hiatt, 2003).
Os agranulócitos têm forma mais regular e o citoplasma não possui granulações
específicas, podendo apresentar grânulos azurófilos, inespecíficos, presentes também
noutros tipos celulares (Young e Heath, 2000; Gartner e Hiatt, 2003).
2.2.2.4.1 Neutrófilos
Os neutrófilos, também denominados polimorfonucleares (PMN), são o tipo mais
comum de leucócitos no sangue e constituem de 60 a 75% dos glóbulos brancos
circulantes (Gartner e Hiatt, 2003). Os neutrófilos representam a primeira linha de
defesa contra agentes invasores e actuam em consonância com os linfócitos e
macrófagos. Uma vez iniciada a resposta inflamatória, estas células são as primeiras a
serem recrutadas para os locais afectados, devido à sua elevada mobilidade e capacidade
fagocitária (Costa et al., 2006). Os neutrófilos normalmente permanecem na circulação
durante 10 a 12 horas, migrando em seguida para outros tecidos, onde têm uma vida
média de cerca de um a dois dias (Júlio, 1999; Seeley et al., 2001). Estas células
possuem núcleos formados por dois a cinco lóbulos (mais frequentemente três) ligados
entre si por finas pontes de cromatina. Nas células jovens o núcleo não é lobulado e tem
forma de um bastonete curvo. Nos neutrófilos de indivíduos do sexo feminino, o
cromossoma x condensado, ou corpúsculo de Barr, existe sob a forma de um apêndice
pequeno em formato de raquete (Young e Heath, 2000; Junqueira e Carneiro, 2004). O
citoplasma dos PMN apresenta três tipos de granulações: os grânulos primários ou
azurófilos (lisossomas), os grânulos secundários e os grânulos terciários. Os grânulos
azurófilos são os primeiros grânulos a aparecer durante a diferenciação dos neutrófilos.
Contêm hidrolases ácidas, típicas dos lisossomas, e uma quantidade considerável de
Introdução
29
agentes microbicidas, inclusive a MPO (Stevens e Lowe, 1995; Young e Heath, 2000).
Os grânulos secundários são específicos dos neutrófilos. Estes grânulos contêm e
secretam substâncias envolvidas na resposta inflamatória aguda, como mediadores
inflamatórios e activadores do complemento. Os grânulos terciários contêm enzimas
(por exemplo gelatinase que degrada o colagénio lesado) que são secretadas para o
ambiente extracelular. Também inserem algumas glicoproteínas nas membranas
celulares, o que pode promover a adesão celular, e desse modo possivelmente facilitar a
fagocitose (Stevens e Lowe, 1995; Young e Heath, 2000).
A exposição dos granulócitos a vários tipos de estímulos induz a activação da
actividade celular, nomeadamente a fagocitose. Para chegar a uma área de infecção, ou
lesão tecidual, os neutrófilos deixam a circulação aderindo às células endoteliais por
meio de moléculas de adesão expressas em resposta à secreção local de citocinas e
movem-se através do endotélio e da membrana basal. Uma vez no tecido de
sustentação, os neutrófilos respondem a factores quimiotáticos (quimiotaxinas),
libertados pelo tecido lesado e gerados pela interacção dos anticorpos com os antigénios
na superfície dos microorganismos, movendo-se para a região de concentração mais alta
(Stevens e Lowe, 1995; et al., 1995; Young e Heath, 2000). O processo pelo qual os
microorganismos ou partículas são recobertos por anticorpos e complemento ou outros
factores, sendo então preparados para o reconhecimento e posterior ingestão pelas
células fagocíticas denomina-se opsonização. Os anticorpos (imunoglobina G, (IgG),
imunoglobina A (IgA) e imunoglobina E (IgE)) têm uma importante capacidade
opsonizante. Os PMN têm nas suas membranas receptores para o complemento, os
quais também facilitam a fagocitose. Os anticorpos podem ser opsonizantes
directamente ou através da capacidade de activar o sistema complemento (Júlio, 1999).
Segundo Young e Heath (2000) os organismos que não geram quimiotaxinas ou que não
são opsonizados são portanto relativamente resistentes à fagocitose neutrofílica e
consequentemente altamente patogénicos. Como primeira etapa da fagocitose, o
organismo é circundado por pseudópodes que então se fundem para englobá-lo
completamente numa vesícula endocitária designada fagossoma. Os lisossomas e outros
grânulos citoplasmáticos unem-se ao fagossoma, formando o fagolisossoma (Figura 4).
Esses grânulos descarregam o seu conteúdo, expondo o organismo entre outros
componentes, a uma mistura potente de enzimas lisossómicas.
Introdução
30
Figura 4. Esquema de fagocitose pelos neutrófilos (adaptado de www.wikipedia.org).
Os PMN utilizam mecanismos dependentes e independentes do oxigénio para a
eficiente destruição de patogénios. Os mecanismos independentes do oxigénio são os já
referidos quimiotaxia, fagocitose, desgranulação e libertação de enzimas líticas e
péptidos bactericidas. Já os dependentes do oxigénio incluem a produção de ROS e
RNS (Quinn e Gauss, 2004; Barreiros et al., 2006; Costa et al., 2006). Tendo executado
a sua função, ocorre a morte dos PMN por um processo designado por apoptose (morte
celular programada), permitindo o seu reconhecimento e a consequente retirada pelos
macrófagos dos tecidos. É evitada, deste modo, a libertação de produtos indesejáveis
potencialmente tóxicos dos grânulos para o meio extracelular. Contudo, a morte destas
células pode resultar na formação de pus, ou seja, a acumulação de leucócitos, bactérias
mortas e fluido extracelular (Júlio, 1999; Gartner e Hiatt, 2002).
2.2.2.4.2 Basófilos
Os basófilos são os menos comuns dos leucócitos constituindo menos de 1% dos
leucócitos no sangue. Os basófilos são caracterizados por grânulos citoplasmáticos
grandes, que muitas vezes obscurecem o núcleo. São provavelmente os precursores dos
mastócitos e são intensamente basófilos (Stevens e Lowe, 1995;Young e Heath, 2000).
O basófilo (de 14 a 16 µm de diâmetro) tem um tamanho intermédio entre o neutrófilo e
o eosinófilo, tem um núcleo volumoso, com forma retorcida e irregular, geralmente com
o aspecto da letra S (Young e Heath, 2000; Gartner e Hiatt, 2003). Os grânulos
específicos dos basófilos são metacromáticos, medem aproximadamente 0,5 µm de
Introdução
31
diâmetro e estão, frequentemente, comprimidos contra a periferia da célula tornando a
periferia rugosa característica do basófilo, quando vista ao microscópio óptico (Gartner
e Hiatt, 2003). Contêm histamina, factores quimiotácticos para eosinófilos e neutrófilos,
leucotrienos e heparina, que é responsável pela metacromasia do grânulo (Junqueira e
Carneiro, 2004). Os grânulos contêm também outros mediadores dos processos
inflamatórios, por exemplo, a substância de reacção lenta da anafilaxia (SRS-A) e o
factor quimiotáctico eosinofílico da anafilaxia (ECF-A). A principal função dos
basófilos é provavelmente a resposta imunológica a certos parasitas (Young e Heath,
2000). Os basófilos contêm na membrana receptores específicos para o segmento Fc da
IgE, que é produzida pelos plasmócitos em resposta a uma variedade de antigénios
ambientais. A ligação de antigénios às moléculas de IgE na superfície dos basófilos leva
à libertação do conteúdo dos seus grânulos específicos para o espaço extracelular
(desgranulação). A libertação de histamina e outros mediadores vasoactivos, é
responsável pela chamada reacção de hipersensibilidade imediata (anafiláctica),
característica da rinite alérgica, de algumas formas de asma e de urticária. Os basófilos
participam também na reacção de hipersensibilidade tardia, que leva a reacção alérgica
da pele (Kierrszenbaum, 2004). Os leucotrienos têm efeitos semelhantes à histamina,
embora com acções mais lentas e mais persistentes. Além disso, os leucotrienos activam
os leucócitos levando-os a migrar para o local do desafio antigénico (Young e Heath,
2000; Gartner e Hiatt, 2003).
2.2.2.4.3 Eosinófilos
Os eosinófilos perfazem de 1 a 6% dos leucócitos no sangue circulante. O seu
número exibe uma variação diurna acentuada, sendo mais numerosos pela manhã e
menos numerosos à tarde (Stevens e Lowe, 1995). Estas células têm aproximadamente
o mesmo tamanho dos neutrófilos (12 a 17 µm de diâmetro), o seu núcleo é bilobulado e
são facilmente identificadas devido à presença de granulações ovóides que coram pela
eosina (granulações acidófilas). As microradiografias electrónicas revelam grânulos
específicos que apresentam um centro de elevada densidade, assemelhando-se a um
cristal, denominado internum, cujo principal componente é uma proteína básica, rica em
Introdução
32
arginina, que constitui 50% das proteínas do grânulo, possuindo também enzimas
hidrolíticas lisossómicas e uma peroxidase diferente da MPO dos neutrófilos. A camada
que envolve o internum possui menor densidade, sendo rica em fosfatase ácida e
designa-se externum. Os grânulos inespecíficos são os lisossomas, que contêm enzimas
hidrolíticas semelhantes às encontradas nos neutrófilos. Estas funcionam na destruição
de vermes parasitários e na hidrólise de complexos antigénio-anticorpo internalizados
pelos eosinófilos (Young e Heath, 2000; Gartner e Hiatt, 2003).
Os eosinófilos são células fagocitárias, com um metabolismo semelhante ao dos
neutrófilos, parecendo ser, todavia, menos microbicidas do que estes. No entanto, têm
uma afinidade fagocitária particular pelos complexos antigénio-anticorpo. Tal como os
neutrófilos, os eosinófilos movem-se quimiotaticamente em resposta a produtos
bacterianos e componentes do complemento. São atraídos preferencialmente por
substâncias libertadas pelos mastócitos, nomeadamente histamina e o ECF-A, assim
como por linfócitos activados. Todos os eosinófilos têm receptores para a IgE que
podem ser importantes na destruição dos parasitas e não estão presentes nos neutrófilos
(Stevens e Lowe, 1995; Young e Heath, 2000). A fagocitose ocorre da maneira usual,
embora, se o objecto for muito grande (por exemplo um parasita), o eosinófilo o elimine
libertando o conteúdo dos seus grânulos para o ambiente externo. Os eosinófilos podem
ter um papel na melhoria de certos aspectos das reacções de hipersensibilidade, pois são
capazes de neutralizar a histamina e de produzir um factor (inibidor derivado do
eosinófilo) que é provavelmente composto por prostaglandinas E1 e E2, que se acredita
ser capaz de inibir a desgranulação dos mastócitos. Os eosinófilos quando activados
inibem substâncias vasoactivas (por exemplo o leucotrieno, SRS-A) produzidas pelos
mastócitos e basófilos.
2.2.2.4.4 Monócitos
Os monócitos constituem cerca de 3 a 8% dos leucócitos e são as maiores células
do sangue circulante (até 20 µm de diâmetro) (Young e Heath, 2000). Os monócitos têm
o núcleo ovóide, em forma de rim, geralmente excêntrico, que se cora menos
intensamente que o dos outros leucócitos, devido ao arranjo pouco denso da sua
Introdução
33
cromatina (Junqueira e Carneiro, 2004). O citoplasma possui dois tipos de grânulos, os
grânulos azurófilos (lisossomas) que contêm fosfatase ácida, aril sulfatase e peroxidase,
que são análogos aos grânulos azurófilos dos neutrófilos. O conteúdo do outro tipo de
grânulo não é bem conhecido. Numerosos pequenos pseudópodes são visíveis nestas
células, reflectindo a sua habilidade fagocitária e movimentos amebóides. Os monócitos
são precursores localizados na medula óssea e no sangue dos macrófagos encontrados
nos tecidos e órgãos linfóides, sendo membros de uma mesma unidade funcional o
sistema mononuclear fagocitário. Os monócitos permanecem na circulação durante
somente alguns dias, e atravessam, por diapedese, a parede dos capilares e vénulas,
migrando para o tecido conjuntivo, onde se diferenciam em macrófagos (Stevens e
Lowe, 1995; Young e Heath, 2000; Gartner e Hiatt, 2003). Os monócitos respondem à
presença de material necrótico (necrotaxia), aos microorganismos invasores
(quimiotaxia) e à inflamação, diferenciando-se em macrófagos que com a sua grande
capacidade de fagocitose e o abundante conteúdo de enzimas hidrolíticas, engolfam e
destroem os detritos dos tecidos e material estranho, como parte do processo de cura e
de restauração da função normal. Algumas dessas funções formam parte integrante dos
mecanismos imunológicos, p. ex. a apresentação do antigénio e a destruição final do
antigénio. Nesse caso, a activação dos linfócitos resulta na produção de factores que
acentuam a actividade fagocitária dos macrófagos. Em resposta a partículas estranhas de
elevadas dimensões, os macrófagos fundem-se uns com os outros, formando células
gigantes, capazes de fagocitar esse tipo de partículas (Young e Heath, 2000; Gartner e
Hiatt, 2003).
2.2.2.4.5 Linfócitos
Os linfócitos constituem 20 a 25% da população total de leucócitos circulantes e
são responsáveis pelo funcionamento adequado do sistema imunológico (Gartner e
Hiatt, 2003). Esta percentagem varia muito de acordo com a saúde do paciente, sendo o
seu número bastante aumentado no caso de infecções virais. Os linfócitos podem ser
subdivididos em três categorias funcionais: linfócitos B (células B), linfócitos T (células
T) e células nulas. Estas categorias são indiferenciadas quando analisadas por
microscopia, sendo, no entanto, diferenciáveis por técnicas imunocitoquímicas para
detecção de receptores específicos da membrana. Cerca de 80% dos linfócitos
Introdução
34
circulantes são células T, as células B representam 15% e o restante são células nulas.
Os seus tempos de vida variam de alguns anos no caso das células T a alguns meses nas
células B. Os linfócitos são os leucócitos mais pequenos, medindo geralmente 6 a 8 µm
de diâmetro (Seeley et al., 2001). Contudo, existem cerca de 3% de linfócitos grandes,
que podem atingir os 18 µm (Junqueira e Carneiro, 2004). Possuem um núcleo esférico,
preenchendo quase toda a célula, deixando o citoplasma com uma pequena área,
abrigando entre outros grânulos, um pequeno número de lisossomas. Embora tenham
origem na medula óssea, estas células migram através do sangue até aos tecidos
linfáticos onde amadurecem e expressam marcadores e receptores de superfície. As
células B migram para zonas ainda não identificadas da medula óssea, enquanto que as
células T migram para o timo (Phipps et al., 1993). Ao contrário dos outros leucócitos
que não retornam ao sangue depois de migrarem para os tecidos, os linfócitos voltam
dos tecidos para o sangue circulando continuamente, sendo que a maior parte destas
células se encontra nos tecidos linfáticos: gânglios linfáticos, baço, amígdalas e timo
(Seeley et al., 2001). Depois de serem estimuladas por um antigénio específico, tanto as
células B como as T proliferam e diferenciam-se em duas subpopulações: as células de
memória não participam na resposta imunológica, mas permanecem como parte de um
clone com uma “memória imunológica”, prontas para montar uma resposta contra uma
exposição subsequente a um determinado antigénio ou substância estranha; as células
efectoras podem ser classificadas em células B e células T (e seus subtipos). As células
B são responsáveis pelo sistema imunológico mediado pelos fluidos do corpo, ou seja,
são caracterizadas pela sua capacidade de sintetizar anticorpos, os quais são
glicoproteínas destinadas a ligarem-se a antigénios específicos. Os anticorpos podem
circular no sangue, ou nos fluidos corporais ou permanecer ligados à superfície da
célula B onde se comportam como receptores de antigénios, activando a célula B
quando o antigénio apropriado é encontrado. As células T são responsáveis pelo sistema
imunológico mediado por células. Diversos subconjuntos de células T agem para
regular a função das mesmas e aumentar a produção de anticorpos pelas células B.
Temos as células T auxiliares (TH), que são essenciais para activar outros linfócitos T,
linfócitos B, “natural killers” e macrófagos. As células T citotóxicas (TC) atacam e
destroem as células malignas e as infectadas por vírus. As células T conhecidas como
células T supressoras (TS), operam para evitar ou modificar as funções dos dois
sistemas. Pensa-se que podem desligar a reacção imunitária específica quando a mesma
já não é necessária. Os linfócitos T trabalham principalmente através da segregação de
Introdução
35
mensageiros químicos potentes, conhecidos como citocinas (linfocinas), que recrutam e
activam fagócitos reactivos não-específicos, incluindo componentes da resposta
inflamatória e células “natural killer”. As células nulas são compostas por duas
populações distintas: células tronco que dão origem a todos os elementos figurados do
sangue e células “natural killer”, matam algumas células estranhas e as alteradas por
vírus, sem influência do timo ou de linfócitos T (Phipps et al., 1993; Stevens e Lowe,
1995; Gartner e Hiatt, 2003).
2.3 ESPÉCIES REACTIVAS DE OXIGÉNIO E AZOTO
No organismo humano, as ROS e RNS são geradas de forma basal em processos
fisiológicos, verificando-se um aumento da sua produção em vários processos de
agressão ao organismo, nomeadamente em processos inflamatórios, envolvendo
macrófagos, neutrófilos e eosinófilos. Estas espécies são de extrema importância no
combate a agentes invasores. No entanto, o seu excesso está associado ao denominado
stresse oxidativo, que se pode definir como um desiquilíbrio entre espécies pró-
oxidantes e antioxidandes a favor das primeiras, num sistema biológico (Ferreira e
Matsubara, 1997; Barreiros e David, 2006; Vieira, 2006). Os alvos maioritários do
stresse oxidativo a nível celular são a membrana celular (inactivação de enzimas e
alterações do transporte transmembranar), o citoplasma e os seus constituintes
(proteínas e lípidos) e, fundamentalmente, o DNA do núcleo das células eucarióticas
(mutagénese) (Ferreira e Matsubara, 1997; Barreiros et al., 2006). As doenças
cardiovasculares, a carcinogénese e o envelhecimento são exemplos representativos de
consequências que decorrem do stresse oxidativo.
As ROS, de que são exemplo o O2-., HO., HO2
., 1O2, H2O2, HOCl, são derivados
de oxigénio molecular com actividade redox, apresentando maior reactividade do que
este. Já as RNS, que englobam o .NO2 ONOO-, ONOOH, N2O3, são derivados do .NO
que também possuem actividade redox (Cheesman e Slater, 1993; Vieira, 2006). Ambas
são constituídas por elementos radicalares e não radicalares. Os radicalares definem-se
como qualquer átomo, grupo de átomos ou molécula com um ou mais que um electrão
desemparelhado ocupando uma órbita externa (Vieira, 2006). O não emparelhamento do
Introdução
36
electrão leva a uma elevada instabilidade electrónica, e por esta razão, mesmo tendo um
tempo de vida muito curto, apresentam elevada reactividade, pois possuem uma forte
tendência para doar ou receber electrões. O O2-., HO. e .NO, são exemplos de radicais
(Cheesman e Slater, 1993; Campos e Yoshida, 2004). As espécies não radicalares, como
por exemplo H2O2, ONOO- e oxigénio singuleto (1O2) também apresentam reactividade,
mas não possuem um electrão desemparelhado na última camada, não podendo ser
classificadas como radicais (Cheesman e Slater, 1993; Campos e Yoshida, 2004; Vieira,
2006).
Sendo os neutrófilos as células alvo do presente estudo, interessa referir que estas
células constituem os leucócitos mais abundantes da corrente sanguínea, e participam
activamente na resposta inflamatória. Quando os neutrófilos são activados por contacto
com estímulos solúveis ou por ingestão de materiais estranhos para os fagossomas
(fagocitose), estes iniciam um “burst” respiratório, com consumo de oxigénio
molecular, o que resulta na formação de radical superóxido (O2.-) através da acção da
NADPH oxidase (Figura 4) (Babior, 2004; Quinn e Gauss, 2004). A NADPH oxidase
situa-se na membrana plasmática dos neutrófilos e é composta por várias subunidades: a
glicoproteína gp91phox e os polipéptidos p22phox, p67phox, p47phox e p40phox, todos
codificados pelo gene phox (phagocyte oxidase) no cromossoma X. O flavocitrocomo,
conhecido como citocromo b558, forma um complexo associado à membrana e é
constituído por uma molécula de gp91phox e duas moléculas de p22phox. Os polipéptidos
p67phox, p47phox e p40phox encontram-se distribuídos no citoplasma (Nixon e McPhail,
1999, Seguchi e Kobayashi, 2002). Também fazem parte da NADPH oxidase activada,
proteínas G de baixo peso molecular (Rac 1 e Rac 2) que se encontram dissociadas da
enzima quando esta está inactiva (Quinn e Gauss, 2004; Klebanoff, 2005). Alguns
estudos têm demonstrado que o citrocomo b558 pode ser encontrado na membrana dos
grânulos específicos (Angosto, 2005), grânulos de gelatinase, e vesículas secretoras de
neutrófilos humanos (Borregaard e Cowland, 1997; Seguchi e Kobayashi, 2002)
migrando até à membrana plasmática ou membrana dos fagossomas quando se dá a
activação dos neutrófilos (Seguchi e Kobayashi, 2002; Angosto, 2005). Esta enzima
pode ser activada na ausência de fagossoma, sugerindo que a activação da oxidase pode
ocorrer na membrana dos grânulos que contêm citocromo b558. A activação da
NADPH oxidase leva a uma deslocação das proteínas citosólicas até à membrana onde
se unem às subunidades lá existentes, resultando numa oxidase activa (Figura 5).
Introdução
37
Figura 5. Activação do complexo NADPH oxidase. Á esquerda mostram-se os
componentes da NADPH oxidase quando a enzima está inactiva. Á direita representa-se
o complexo activo (adaptado de Angosto, 2005).
É geralmente aceite que a NADPH oxidase é activada quer na membrana
plasmática do PMN, quer na membrana do fagossoma. Quando a produção das ROS
resulta da activação na membrana plasmática, estas são libertadas da célula. Quando a
activação se dá na membrana do fagossoma, as ROS ficam retidas no seu interior
(Dahlgren e Karlsson, 1999; Babior, 2000; Karlsson e Dahlgren, 2002; Quinn e Gauss,
2004). A activação da enzima inicia-se com a fosforilação da subunidade p47phox, que
segundo Angosto (2005), é o primeiro elemento a interagir com o citocromo b558. Esta
subunidade forma um complexo com os componentes citosólicos p67phox e p47phox e é
responsável pelo transporte do complexo para a membrana durante a activação (Babior,
2000; Angosto, 2005).
A proteína quinase C (PKC) é responsável pela fosforilação da subunidade
p47phox, sendo portanto essencial para a activação da NADPH oxidase. A PKC, por sua
vez, é activada pelo diacilglicerol (DAG), produzido pela fosfolipase. A produção do
DAG ocorre quando um receptor membranar é estimulado por diversos factores tais
como o factor C5a do complemento, ou complexos imunológicos (Nauseef et al., 1991;
El Benna et al., 1995; Seguchi e Kobayashi, 2002).
Introdução
38
O O2-. funciona como redutor ou oxidante, é solúvel em água e não é capaz de
permear a membrana celular, atravessando-a via canais aniónicos (Hampton et al.,
1998). Isoladamente este radical é pouco reactivo e, portanto, não é altamente citotóxico
(Campos e Yoshida, 2004; Misso e Thompson, 2005), todavia, tem alguma capacidade
para danificar o DNA (Ferreira e Matsubara, 1997; Shackelford et al., 2000). O HO2. é a
forma protonada do O2-. (Equação 8). É mais reactivo que o O2
-. e, como não possui
carga, atravessa mais facilmente as membranas celulares. Embora a pH fisiológico a
razão [O2-.]/[HO2
.] seja elevada (100/1 a pH=6,8 e 1000/1 a pH=7,8), devido às suas
características o HO2. poderá ter alguma relevância se existirem condições propícias à
sua formação, nomeadamente a diminuição dos valores de pH nos locais de geração de
O2-. (Grey, 2002).
Equação 8:
O2-. + H+ HO2
.
O O2-., é convertido, espontaneamente (Equação 9) ou pela acção da enzima SOD
(Equação 10), em H2O2 e O2 (Cheesman e Slater, 1993; Campana et al., 2004).
Equação 9:
HO2. HO2
.+ H2O2 + O2
Equação 10:
O H2O2 apesar de não ser um radical, pois não tem electrões desemparelhados na
última camada, é importante porque participa nas reacções que produzem o radical HO.,
seja via reacção de Fenton (Equação 11) ou de Haber-Weiss (Equação 12). Pelas
reacções apresentadas pode-se constatar o papel relevante dos metais de transição na
formação de ROS (Ferreira e Matsubara, 1997; Mladenka et al., 2006). Embora o cobre
possa também catalisar a reacção de Haber-Weiss, o ferro é o metal pesado mais
abundante no organismo e está biologicamente mais capacitado para catalisar as
2O2-. + 2H+ H2O2 + O2
SOD
Introdução
39
reacções de oxidação de biomoléculas (Ferreira e Matsubara, 1997). No homem, em
condições fisiológicas, o ferro livre é escasso. Quase todo o ferro é sequestrado pelas
proteínas. No plasma encontra-se ligado à transferrina, em várias células está fortemente
ligado à ferritina, nos glóbulos vermelhos está firmemente incorporado na hemoglobina
e nos músculos está ligado à mioglobina (Mladenka et al., 2006). Em situações de
inflamação, o ferro (III) é libertado, pois o O2-. tem capacidade de o mobilizar da
ferritina (Barbosa et al., 2006), já o H2O2 pode reagir com a membrana eritrocitária e
levar à libertação de ferro da hemoglobina (Tolando et al., 2000).
Equação 11:
Fe (III) + O2-. Fe (II) + O2
H2O2 + Fe (II) Fe (III) + HO. + HO-
Equação 12:
O2-. + H2O2 O2 + HO. + HO-
Fe
O H2O2 é uma ROS que pode funcionar como agente oxidante ou como agente
redutor, embora a sua reactividade seja fraca. O H2O2 parece ser capaz de inactivar
algumas enzimas, normalmente por oxidação dos grupos sulfidrilo (-SH) dos locais
activos (Halliwell e Gutteridge, 1999). Apesar da sua fraca reactividade, o H2O2 pode
ser altamente citotóxico, sendo que esta citotoxicidade pode ser aumentada de dez para
mil vezes quando em presença de ferro, como ocorre, por exemplo, na hemocromatose
transfusional (Ferreira e Matsubara, 1997).
As enzimas catalase, glutationa peroxidase e tiorredoxina peroxidase removem o
H2O2 das células humanas, levando à formação de água (Halliwell e Gutteridge, 1999;
Barbosa et al., 2006).
O HO. é considerado a ROS mais reactiva em sistemas biológicos. As reacções em
que o HO. participa podem ser classificadas em três tipos principais: adição de
hidrogénio, remoção de hidrogénio e transferência de electrões. Este radical é capaz de
remover átomos de hidrogénio do grupo metileno de ácidos gordos polinsaturados,
dando início à peroxidação lipídica que pode levar à lise da membrana celular (Ferreira
e Matsubara, 1997; Campos e Yoshida, 2004). As reacções do HO. com compostos
aromáticos procedem-se normalmente por adição, como acontece nas reacções com a
Introdução
40
guanina e timina no DNA. Assim, se o HO. for produzido próximo de DNA, poderão
ocorrer alterações das suas bases, levando à inactivação ou mutação do DNA (Ferreira e
Matsubara, 1997; Hampton et al., 1998; Barreiros et al., 2006). O HO. participa ainda
em reacções de transferência de electrões com iões halogeneto, como é o caso do ião
cloreto (Equação 13) bem como com o ião nitrito (NO2-) (Equação 14). Da reacção do
HO. com o ião carbonato (CO32-), resulta um poderoso agente oxidante, o anião radical
carbonato (CO3.-) (Equação 15) (Halliwell e Gutteridge, 1999).
Equação 13:
Cl- + HO. Cl. + HO-
Equação 14:
NO2- + HO. NO2 + HO-
Equação 15:
CO32- + HO. CO3
-. + HO-
Os grânulos azurófilos dos neutrófilos contêm elevadas quantidades de MPO, que
pode ser libertada quer para o meio extracelular, quer para o interior dos fagossomas.
Esta enzima reage com H2O2 e Cl- produzindo ácido hipocloroso (HOCl) (Equação 16)
(Hampton et al., 1998; Peskin e Winterbourn, 2001; Splettstoesser e Werner, 2002).
Este é um poderoso agente antimicrobiano e, como tal, tem um papel de destaque na
defesa imunitária do organismo desencadeada pelos neutrófilos (Prütz, 1996). A MPO é
uma enzima heme que contém no seu grupo prostético o mesmo heme encontrado na
hemoglobina. Ao contrário da hemoglobina e outras proteínas heme, a MPO não é
vermelha, possuindo uma cor verde, responsável pela coloração esverdeada do pus
(Babior, 2000; Arnhold, 2004). In vivo, o HOCl pode atacar vários alvos. Uma das suas
principais acções é a inactivação da α1-antiproteinase (pelo ataque ao resíduo da
metionina), um importante protector das células contra o ataque de enzimas proteolíticas
como a elastase (Nève et al., 2001). O HOCl, pode reagir com aminoácidos dos
microorganismos, para formar cloraminas. A cloramina decompõe-se espontaneamente
em: aldeído (RCHO), tóxico para microorganismos; amónio, CO2 e cloreto. Tanto o
HOCl como as cloraminas parecem interferir com o DNA, nomeadamente com os
mecanismos de reparação do DNA (Hampton, 1998; Nève et al., 2001). O HOCl oxida
Introdução
41
grupos sulfidrilo, o ascorbato, o NADPH e promove a coloração das bases do DNA,
especialmente as pirimidínicas, e dos resíduos de tirosina nas proteínas. Caso o HOCl
passe pelas membranas celulares, pode provocar danos nas proteínas das mesmas, os
danos nos constituintes celulares ocorrem se houver passagem para o citoplasma (Prütz,
1996).
Equação 16:
H2O2 + Cl- MPO
HOCl + HO-
A interacção de O2.-, H2O2 e HOCl pode originar o 1O2. Constitui a forma excitada
de oxigénio molecular e não possui electrões desemparelhados na última camada
(Ferreira e Matsubara, 1997). Os compostos naturais que melhor captam o 1O2 são os
carotenóides, devido às múltiplas insaturações conjugadas. Assim, o 1O2 reage mais
lentamente com os ácidos gordos do que com o �-caroteno, e quanto maior o número de
insaturações presentes nos ácidos gordos, mais rapidamente eles irão reagir (Barreiros et
al., 2006).
Outro radical com alguma relevância nos mecanismos de defesa fagocitários é o .NO. É um radical gasoso que se difunde rápida e facilmente entre as células
(Heiduschka e Thanos, 1998). Este radical é sintetizado nos organismos vivos por uma
família de enzimas designadas oxido nítrico sintetases NOS, que convertem o
aminoácido L-arginina em .NO e noutro aminoácido, a L-citrulina (Equação 17). Esta
reacção é dependente do oxigénio e do NADPH (Fernandes et al., 2003; Ricciardolo et
al., 2006).
Equação 17:
L-arginina .NO + L-CitrulinaNOS
As NOS podem ser classificadas em constitutivas (cNOS) e indutíveis (iNOS). As
formas constitutivas estão presentes no endotélio vascular, nas plaquetas e em alguns
neurónios do sistema nervoso central e do sistema nervoso periférico. A actividade das
cNOS é dependente do Ca2+ e da calmodulina e produzem quantidades relativamente
baixas de .NO, da ordem dos nanomolar. As iNOS geram uma maior quantidade de .NO
Introdução
42
(próxima do micromolar), comparativamente com as cNOS, sendo que essa libertação
pode permanecer algumas horas e mesmo dias após a exposição das células (Fernandes
et al., 2003; Hofseth et al., 2003; Ricciardolo et al., 2006). Esta isoforma pode ser
induzida por agentes proinflamatórios, tais como endotoxinas, factor de necrose
tumoral-α (TNF-α), interferon-γ (IFN-γ) e interleucina-1β (IL-1β). Nas iNOS, a síntese
de .NO é independente dos níveis intracelulares de cálcio. As iNOS encontram-se nos
macrófagos e neutrófilos activados mas também noutros tipos de células como as do
músculo liso, hepatócitos, cálulas β do pâncreas e vários tipos de células tumorais
(Hofseth et al., 2003; Ricciardolo et al., 2006).
O efeito do .NO nas células depende de vários factores como a sua taxa de
produção e difusão, do tipo de célula, da sua interacção com ROS, iões metálicos e
proteínas (Hofseth et al., 2003; Dedon e Tannenbaum, 2004). As reacções a que este
radical pode estar sujeito resumem-se aos seguintes processos: i) autoxidação do .NO na
presença de O2, com formação de N2O3 (Equação 18), um potente agente nitrosante; ii)
reacção com O2-. para formar ONOO- (Equação 19) (Dedon e Tannenbaum, 2004).
Alguns estudos revelam que o .NO pode ter efeitos deletérios para a célula e os tecidos
que a circundam, nomeadamente induzir danos no DNA. Já outros estudos comprovam
os benefícios do .NO, como um protector da citotoxicidade (Wink et al., 1996; Hofseth
et al., 2003; Dedon e Tannenbaum, 2004).
Equação 18:
2.NO + O2 2.NO2
2.NO + 2.NO2 2.N2O3
Equação 19: .NO + O2
-. ONOO-
A reacção do .NO com o O2.- aparece referida na literatura no sentido da formação
do ONOO-. Contudo, de acordo com Coddington et al. (1999), a reacção inversa
também é possível, embora ocorra muito mais lentamente. Como o .NO é neutro e
hidrofóbico, capaz de atravessar membranas, enquanto que o O2.- é aniónico a pH
neutro, a formação do ONOO- ocorre predominantemente perto dos local de formação
do O2.- (Alvarez e Radi, 2003). Por sua vez, o ONOO- atravessa as membranas por
Introdução
43
difusão passiva, sob a forma do seu ácido conjugado, o ácido peroxinitroso (ONOOH)
ou através de canais aniónicos, quando na sua forma aniónica. O ONOO- é muito mais
reactivo do que os seus precursores (Whiteman et al., 2002; Alvarez e Radi, 2003). Em
condições fisiológicas o ONOO- tem um tempo vida inferior a 1 segundo sendo
imediatamente convertido à sua forma protonada, ONOOH, que por fissão homolítica
origina .NO2 e HO. (Equação 20) (Coddington et al., 1999; Whiteman et al., 2002;
Alvarez e Radi, 2003). A reacção directa do ONOO- com CO2 é particularmente
importante devido à elevada concentração deste elemento in vivo e à rapidez com que a
reacção ocorre. A maior parte do CO2 que se encontra dissolvido no plasma está em
equilíbrio com o HCO3-, sendo o sistema HCO3
-/CO2 um dos principais sistemas tampão
do sangue. Da reacção do ONOO- com CO2 resulta noutro RNS, o
nitrosoperoxicarbonato (ONOOCO2-), cuja decomposição origina cerca de 70% de CO2
e NO3- e 30% dos radicais .NO2 e CO3
.- (Denicola et al., 1998; Coddington et al., 1999;
Whiteman et al., 2002).
Equação 20:
ONOO- + H+ ONOOH .NO2 + .HO
O ONOO- e seus derivados podem induzir oxidação dos grupos tiol de proteínas,
nitração da tirosina, peroxidação lipídica e outras reacções de nitração que alteram o
metabolismo da célula e provocam danos a nível celular. Podem contribuir também para
a ocorrência de danos no DNA, quebra da cadeia de DNA, nitração e desaminação de
bases de DNA (especialmente guanina) e a nitração dos resíduos de aminoácidos
aromáticos em proteína. A formação excessiva de ONOO- pode estar envolvida em
doenças de que são exemplo: a doença de Alzheimer e Parkinson, cancro, asma, artrite
reumatóide (Squadrito e Pryor, 1998; Coddington et al., 1999; Choi et al., 2002;
Whiteman et al., 2002; Denicola e Radi, 2005).
Introdução
44
Figura 6. Esquema resumo da produção de ROS e RNS pelos neutrófilos durante a
fagocitose (adaptado de www.bioscience.org).
Material e métodos
45
3 MATERIAL E MÉTODOS
Material e métodos
46
3.1 Reagentes
O Histopaque 1077, Histopaque 1119, azul tripano 0.4%, solução salina de
tampão fosfato isotónico sem Ca2+ e Mg2+ (PBS), solução salina de tampão fosfato
isotónico com Ca2+ e Mg2+ (PBS com Ca2+ e Mg2+), luminol, PMA, tiron, L-NAME,
catalase, DPI, etileno glicol-bis �-aminoetil éter (EGTA), fura PE3, calcimicina
(A23187) foram adquiridos à Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). O cloreto de
sódio foi adquirido à Panrec Química S.A. (Barcelona, Espanha). O manitol foi
adquirido à Riedel de Haën (Alemanha). O ABAH foi adquirido à Calbiochem (San
Diego, CA, USA). O nitrato de níquel foi adquirido à Fluka Chemie GmbH (Steinheim,
Alemanha). Os tubos de vácuo com citrato, EDTA e heparina foram adquiridos à
Vacutainer Systems (U.K.).
3.2 Equipamento
As leituras de quimioluminescência foram realizadas em leitor de microplacas
Synergy HT (BIO-TEK), com detecção espectrofotométrica, fluorimétrica e
quimioluminométrica, de acordo com a técnica utilizada. As centrifugações foram
efectuadas numa centrífuga 5810 R (Eppendorf). As leituras de microscopia foram
realizadas num microscópio óptico Eclipse E 400 (Nikon). A contagem das células foi
realizada em câmara de Neubauer. Foram ainda utilizados um banho termostatado NE5-
10D (Clifton) e uma balança analítica AG285 (Metler Toledo).
Material e métodos
47
3.3 Isolamento de neutrófilos humanos pelo método de centrifugação de
gradiente de densidade
Neste ensaio procedeu-se ao isolamento dos neutrófilos de todos os outros
componentes do sangue humano.
3.3.1 Fundamento do método
Os neutrófilos foram isolados pelo método de centrifugação de gradiente de
densidade. Este método foi descrito em 1968 por Boyum e melhorado por English e
Anderson em 1974. Consiste na separação das células mononucleares e granulócitos do
sangue. Esse objectivo é conseguido utilizando duas soluções de diferentes densidades,
Histopaque 1077 (densidade de 1,077) e Histopaque 1119 (densidade de 1,119),
respectivamente. Num tubo de centrífuga de polipropileno (material que evita a adesão
das células à parede do tubo) é adicionado igual volume das soluções acima referidas,
ficando a mais densa em baixo, a menos densa por cima. O sangue é cuidadosamente
adicionado por último. Por acção da força centrífuga, as células serão distribuídas de
acordo com a sua densidade, pelo que, os eritrócitos ficam no fundo do tubo, os
granulócitos, na interface 1077/1119, e os mononucleares e as plaquetas ficam na
interface plasma/1077 (Figura 7). Esta centrifugação é realizada a 20ºC, pois
temperaturas inferiores podem resultar na aglutinação celular e numa má recuperação.
Os neutrófilos são recolhidos para um tubo de centrífuga ao qual se adiciona solução
tampão PBS sem Ca2+ e Mg2+, no sentido de se proceder a uma lavagem das células,
seguindo-se uma centrifugação durante cinco minutos a uma temperatura de 4ºC. Esta
temperatura permite preservar a integridade das células. Para garantir que não há
contaminação dos neutrófilos por eritrócitos, decanta-se o sobrenadante resultante da
centrifugação e ressuspende-se as células com solução tampão PBS sem Ca2+ e Mg2+.
Adiciona-se água destilada e aguarda-se cerca de dois minutos, tempo após o qual é
restabelecida a isotonia do meio adicionando NaCl 3% (m/v). Esta suspensão é
Material e métodos
48
novamente centrifugada a 4ºC durante cinco minutos, o sobrenadante decantado e os
neutrófilos ressuspendidos com solução tampão PBS com Ca2+ e Mg2+.
Figura 7. Esquema resumo do procedimento efectuado referente ao isolamento dos
neutrófilos.
Centrifugação: 2100 rpm a
20ºC durante 30 min.
Retirar a camada dos neutrófilos; adicionar
PBS, pH 7,4.
Aspirar o sobrenadante e proceder à
lise dos glóbulos vermelhos.
Centrifugação: 2000 rpm a
4ºC durante 5 min.
Aspirar o sobrenadante e ressuspender os neutrófilos com
PBS, pH 7,4.
Contagem dos neutrófilos em câmara
de Neubauer
Centrifugação: 2000 rpm a 4ºC durante
5 min.
Material e métodos
49
3.3.2 Utilização de EDTA, citrato e heparina como anticoagulantes no
isolamento dos neutrófilos humanos
Neste ensaio, utilizaram-se diferentes anticoagulantes, nomeadamente o citrato,
EDTA e heparina, no processo de recolha de amostras sanguíneas.
3.3.3 Fundamento do método
Durante a recolha, o sangue deve ser tratado com agentes que evitem a sua
coagulação, de forma a ser possível proceder-se ao isolamento dos seus componentes
celulares. No entanto, a escolha do anticoagulante deve ser criteriosa de forma a
permitir não só um bom isolamento dos neutrófilos mas também que estes possuam
boas condições de funcionamento após este processo.
A formação de um coágulo sanguíneo depende de um conjunto de proteínas
existentes no plasma, denominadas factores de coagulação. A activação do mecanismo
de coagulação sanguínea tem início por duas vias diferentes: via intrínseca e via
extrínseca. A denominação de via intrínseca deriva do facto de que na activação tomam
parte, apenas, os factores circulantes da coagulação, enquanto na via extrínseca um
factor não circulante, factor tecidular, proveniente da célula endotelial, é o principal
desencadeador. A via de coagulação extrínseca resume-se ao seguinte: os tecidos
danificados libertam o factor tecidular, que com o factor VII e iões cálcio, activam o
factor X. O factor X activado, o factor V, os fosfolípidos e iões cálcio, formam a
protombinase. Esta converte a protrombina em trombina, que por sua vez, converte o
fibrogénio em fibrina, que é responsável pela formação de um coágulo (Figura 8). Na
via de coagulação intrínseca, os vasos danificados causam a activação do factor XII, que
vai activar o factor XI que, por sua vez, activa o factor IX. Este, conjuntamente com o
factor VIII e os fosfolípidos das plaquetas, activa o factor X. A partir daqui o processo é
o mesmo da via de coagulação extrínseca (Figura 8) (Seeley et al., 2001; Kierszenbaum,
2004).
Material e métodos
50
Figura 8. Mecanismo de coagulação sanguínea e mecanismo de anticoagulação do
citrato, EDTA e heparina.
A heparina é uma mistura heterogénea de polímeros de um polissacarídeo natural,
extraído de vísceras animais, com peso molecular variando entre 3000 e 30000 Da
(Figura 9). Constitui um anticoagulante natural produzido pelos basófilos e mastócitos.
A interacção com a antitrombina III confere-lhe o seu principal efeito anticoagulante,
através de uma mudança na conformação da antitrombina III, que acelera a sua
habilidade em inactivar as enzimas da coagulação: trombina e factores Xa e IXa (Figura
8). A ligação da heparina com o anticoagulante natural antitrombina III, aumenta a
actividade deste factor cerca de 1000 vezes (Hamerschlak e Rosenfeld, 1996;
Sadagopan et al., 2003).
Material e métodos
51
Figura 9. Estrutura química da heparina (adaptado de www.wikipedia.org).
EDTA é o acrónimo em inglês: EthyleneDiamineTetrAcetic acid (ácido
etilenodiamino tetra-acético). É um ácido poliprótico contendo quatro grupos
carboxílicos e dois grupos amina (Figura 10). Constitui um composto quelante que age
como ligante polidentado, formando complexos muito estáveis com diversos iões
metálicos. Actua como agente anticoaguante quelatando iões cálcio, essenciais a
algumas reacções químicas indispensáveis à formação do coágulo sanguíneo (Figura 8)
(Lanigan e Yamarik, 2002; Cerón et al., 2004).
OHO
NN
O
O-
HO
O
O O-K+
K+
Figura 10. Estrutura química do EDTA(adaptado de www.wikipedia.org).
Material e métodos
52
O citrato (Figura 11) tem um modo de acção muito semelhante ao EDTA. Quelata
iões cálcio, que promovem a coagulação sanguínea (Figura 8) (Bagshaw et al., 2005)
Na+O-
OO O-
O-Na+
ONa+
OH
Figura 11. Estrutura química do citrato de sódio (adaptado de www.wikipedia.org).
3.3.4 Procedimento experimental
Recolheu-se sangue venoso, de voluntários humanos saudáveis, do sexo
masculino, por venipunctura antecubital, para tubos de vácuo cada um dos quais com
um tipo de anticoagulante e procedeu-se ao isolamento dos neutrófilos de acordo com o
descrito por Costa et al. (2006). Num tubo de centrífuga de 12 mL adicionou-se 3 mL
de Histopaque 1077, sobre 3 mL de Histopaque 1119. De seguida, colocou-se
cuidadosamente uma camada de 6 mL de sangue sobre a camada superior do tubo.
Centrifugou-se a 2100 rpm durante 30 min a 20oC. Concluída a centrifugação, foram
aspiradas, por vácuo, as camadas que ficam por cima da camada dos granulócitos. Os
granulócitos, foram recolhidos cuidadosamente com o auxílio de uma pipeta Pasteur de
vidro para um tubo de centrífuga, ao qual se adicionou solução tampão PBS sem Ca2+ e
Mg2+ até completar 12 mL. Agitou-se levemente para homogeneizar e efectuou-se uma
centrifugação a 2000 rpm durante 5 min a uma temperatura de 4oC. Aspirou-se o
sobrenadante e adicionou-se 1,25 mL de solução tampão PBS sem Ca2+ e Mg2+, mais
5,25 mL de água destilada. Passados 2 min adicionou-se 2,2 mL de NaCl a 3% (m/v).
Esta suspensão foi novamente sujeita a uma centrifugação a 2000 rpm durante 5 min a
uma temperatura de 4oC, após a qual se recolheu o sobrenadante e se ressuspendeu os
neutrófilos com solução tampão PBS com Ca2+ e Mg2+.
Material e métodos
53
3.4 Avaliação da viabilidade celular e cálculo do número de neutrófilos isolados
Com este ensaio pretendeu-se avaliar a influência da utilização dos
anticoagulantes, citrato, EDTA e heparina, durante o isolamento dos neutrófilos
humanos, no número de neutrófilos isolados e viabilidade celular.
3.4.1 Fundamento do método
Para a determinação da viabilidade dos neutrófilos e cálculo do número de
neutrófilos isolados, utilizou-se o método da exclusão do azul tripano. O azul tripano é
um corante orgânico azul que é excluído pelas células que possuem as respectivas
membranas citoplasmáticas intactas, enquanto que as células com membranas
danificadas o incluem rapidamente. Este corante, tem carga negativa e é excluído pelos
neutrófilos como resultado de uma manutenção do potencial de membrana. A perda
deste potencial, devido a danos celulares, permite a penetração do corante. Para que a
inclusão se efectue não é exigida a existência de danos em grande extensão uma vez
que, geralmente, as membranas citoplasmáticas das células coradas aparecem
frequentemente intactas quando vistas ao microscópio óptico (Fernandes, 1996).
3.4.2 Procedimento experimental
Num tubo tipo eppendorf adicionou-se 20 µL de suspensão de neutrófilos a 20 µL
de azul tripano 0,4% e homogeneizou-se a mistura. Deixou-se em repouso, num banho
de gelo, durante 2 minutos. Com o auxílio de uma micropipeta, encheu-se a câmara de
Neubauer e procedeu-se à contagem dos neutrófilos ao microscópio óptico (ampliação
de 40×).
A determinação da viabilidade celular foi efectuada a partir da Equação 21.
Material e métodos
54
Equação 21:
Viabilidade (%) =nº de neutrófilos viáveis
nº de neutrófilos viáveis + nº de neutrófilos não viáveisx 100
O número de neutrófilos isolados por mL de sangue recolhido foi calculado
segundo a Equação 22.
Equação 22:
N
Vx 2 x Y
Volume total de sangue=Nº neutrófilos/mL sangue
N- nº de neutrófilos viáveis
V- volume da câmara de Neubauer (0,1 mm3)
2- factor de diluição aplicado quando se adiciona 20 µL de azul tripano a 20 µL da
suspensão de neutrófilos.
Y- volume total de suspensão
O número de neutrófilos/mL de suspensão fez-se de acordo com a Equação 23 e
resultou da média da contagem de dois quadrantes da câmara de Neubauer.
Equação 23:
N
Vx 2 x Y=Nº neutrófilos/mL suspensão
N- nº de neutrófilos viáveis
V- volume da câmara de Neubauer (0,1 mm3).
2- factor de diluição aplicado quando se adiciona 20 µL de azul tripano a 20 µL da
suspensão de neutrófilos.
Material e métodos
55
Y- volume total de suspensão
O número de neutrófilos obtido durante o isolamento foi ajustado para 4 × 106/mL
de suspensão com solução tampão PBS com Ca2+ e Mg2+, segundo a Equação 24.
Equação 24:
N
Vx 2 x Y
4 x 106= - YV1
V1- volume de solução tampão PBS com Ca2+ e Mg 2+ a adicionar à suspensão dos
neutrófilos para obter 4×106 neutrófilos/mL de suspensão.
N- nº de neutrófilos viáveis
V- volume da câmara de Neubauer (0,1 mm3).
2- factor de diluição aplicado quando se adiciona 20 µL de azul tripano a 20 µL da
suspensão de neutrófilos.
4 × 106- corresponde ao nº de neutrófilos/mL de suspensão necessários para a realização
do ensaio.
Y- volume total de suspensão
3.5 Avaliação da activação de neutrófilos humanos pelo PMA, com utilização de
uma técnica de quimioluminescência
Este ensaio teve como objectivo avaliar a activação de neutrófilos isolados de
sangue tratado com citrato, EDTA e heparina, pelo PMA.
Material e métodos
56
3.5.1 Fundamento da técnica
O PMA é um composto solúvel obtido por síntese química, capaz de activar os
neutrófilos (Robinson et al., 1987; Downey et al., 1992; Nixon e McPhail; 1999;
Seguchi e Kobayashi, 2002; Saito et al., 2005). O seu mecanismo de acção é muito
semelhante ao DAG, activando directamente a PKC (Figura 12) (Robinson et al., 1987;
Downey et al., 1992; Nixon e McPhail; 1999; Seguchi e Kobayashi, 2002; Saito et al.,
2005), a qual por sua vez tem um papel crucial na activação da NADPH oxidase.
Figura 12. Mecanismo de activação dos neutrófilos pelo PMA
Segundo Karlsson e Dahlgren (2002) existem cinco isoenzimas PKC nos
neutrófilos humanos, a PKC-α, βI, βII (classificadas como convencionais: cPKC, são
cálcio-dependentes, activadas pela fosfatildilserina e pelo DAG), PKC-δ (classificadas
como não convencionais: nPKC, são cálcio-independentes, reguladas pelo DAG e
fosfatildilserina) e PKC-ζ (denominada atípica: aPKC, requer apenas fosfatildilserina
para a sua activação) (Majumdar, et al., 1991). A PKC-α, PKC-β ou PKC-δ, constituem
Material e métodos
57
os primeiros candidatos a mediar a resposta do PMA (Nixon e McPhail, 1999). Sendo a
PKC-β a isoforma mais comum dos neutrófilos, é a mais susceptível à acção deste
activador (Majumdar, et al., 1991; Downey et al., 1992).
O PMA promove a translocação da PKC do citosol para a membrana, onde ocorre
a fosforilação do p47phox, etapa fundamental para a activação da NADPH oxidase
(Majumdar, et al., 1991; Downey et al., 1992; Nixon e McPhail, 1999; Karlsson e
Dahlgren, 2002) (Figura 12). Uma vez activada a NADPH oxidase, inicia-se a produção
de O2.-, com a consequente geração de outras espécies reactivas (ver 1.3 da introdução).
A detecção de espécies reactivas geradas durante a activação dos neutrófilos
isolados foi feita por quimioluminescência. Em 1888 Eilhardt Weidemann apresentou
pela primeira vez o termo quimioluminescência, definindo-a como a emissão de
radiação luminosa resultante de uma reacção química (Ferreira e Rossi, 2002). Tendo
em conta a exactidão, sensibilidade e baixo custo do equipamento de medida, a
quimioluminescência tem sido frequente utilizada na avaliação da capacidade dos
neutrófilos produzirem ROS (Briheim et al., 1984; Hasegawa et al., 1997; Kopprasch et
al., 2003). Todavia, para a luminescência das células ser detectável, normalmente
recorre-se a luminóforos, sendo o luminol um dos mais utilizados. A luz emitida pelo
luminol (Figura 13) advém da sua oxidação e da consequente formação de uma espécie
electronicamente excitada que se decompõe originando o di-anião 3-aminoftalato no
estado excitado, que ao regressar ao estado fundamental, emite fotões (Rost et al., 1998;
Ferreira e Rossi, 2002). O comprimento de onda de emissão máxima da reacção
quimioluminescente do luminol depende do solvente utilizado, podendo variar entre 431
e 500 nm (Ferreira e Rossi, 2002).
O luminol pode ser oxidado por várias ROS (Caldefie-Chézet et al., 2002) como é
o caso do HO. (Oosthuizen e Greyling, 2001), do O2˙- (Kopprasch et al., 2003), do 1O2
(Oosthuizen et al., 1997; Myhre et al., 2003), do H2O2 (Briheim et al 1984; Rost et al.,
1998; Ferreira e Rossi, 2002; Kopprasch et al., 2003) e do HOCl, bem como por RNS,
nomeadamente o ONOO- (Radi et al., 1993; Chen et al., 2003a). O .NO não parece ser
capaz de oxidar o luminol (Radi et al., 1993).
Material e métodos
58
N
N N2
O
O
O
O
+ + + hν
Luminol 3-Aminoftalato
H2OROS
ONOO-
NH2 OH
OH
NH2
Figura 13. Reacção de oxidação do luminol com a formação do di-anião 3 aminoftalato
e emissão de luz (adaptado de Rost et al., 1998).
A monitorização da luminescência resultante da reacção do luminol com cada uma
das espécies reactivas supramencionadas pode ser utilizada como meio de estudar a
potencial capacidade de determinados compostos para captarem as mesmas (Cynshi et
al., 1990; Mira et al., 1994; Demiryürek et al., 1998; Rao et al., 1998), já que estes
compostos, ao captarem uma determinada espécie reactiva, vão competir com o luminol
na sua reacção com estas originando assim uma diminuição da luminescência. Tendo
em conta que o luminol pode ser oxidado por várias ROS, constitui um bom indicador
da sua geração pelos neutrófilos activados (Hasegawa et al., 1997).
3.5.2 Procedimento experimental
A avaliação da activação dos neutrófilos realizou-se por quimioluminescência,
amplificada pelo luminol, de acordo com o descrito por Oosthuizen e Greyling (2001).
A mistura reaccional continha, num volume final de 200 µL, os seguintes constituintes
nas concentrações finais indicadas: luminol (500 µM), solução tampão PBS com Ca2+ e
Mg2+, pH 7,4, PMA (1,6 × 10-7 M) e neutrófilos (106 neutrófilos/mL). Todos os
compostos foram dissolvidos em solução tampão PBS com Ca2+ e Mg2+, pH 7,4.
Durante todo o ensaio a mistura reaccional esteve sujeita a uma agitação suave e a uma
temperatura de incubação de 37ºC. As leituras da luminescência (L) foram efectuadas
Material e métodos
59
durante 25 min e os valores de luminescência lidos nos picos obtidos nessas cinéticas (≅
15 min). Cada estudo correspondeu, no mínimo, a quatro ensaios realizados em
duplicado. O efeito de activação dos neutrófilos foi expresso sob a forma de
percentagem oxidação do luminol induzida pelas espécies reactivas de acordo com a
equação 25.
Equação 25:
LPMA x 100( )
Lbranco
- 100=
Activação de neutrófiloshumanos pelo PMA (%)
LPMA- Luminescência do ensaio que contem PMA.
Lbranco- Luminescência do ensaio sem PMA.
3.6 Quantificação do cálcio livre intracelular nos neutrófilos humanos isolados,
com utilização de uma técnica de fluorescência
Este ensaio teve como objectivo avaliar a influência da utilização dos
anticoagulantes citrato, EDTA e heparina, durante o processo de isolamento dos
neutrófilos, na concentração do cálcio livre intracelular nos neutrófilos isolados.
3.6.1 Fundamento da técnica
O ião Ca2+ é um mensageiro intracelular ubiquitário que regula diversas funções,
incluindo contracção, secreção, metabolismo, expressão genética, sobrevivência e morte
celulares (Yan et al., 2006). Como tal, a quantificação do Ca2+ livre presente no
citoplasma é importante para se entender a fisiologia de qualquer tipo de célula. No caso
dos neutrófilos torna-se ainda mais relevante, já que a quimiotaxia, fagocitose, apoptose
Material e métodos
60
e exocitose são muito influenciadas pela concentração de Ca2+ no citoplasma (Hallet et
al., 1999), sendo a activação da NADPH oxidase também dependente da concentração
deste ião (Yan et al., 2006).
Para a quantificação dos níveis de Ca2+ pode recorrer-se a sondas fluorescentes e
ionóforos. No presente trabalho utilizou-se uma sonda fluorescente, o Fura PE3 (Figura
14) que é um derivado do Fura 2, sendo o espectro de absorção e emissão muito
semelhante ao original Fura 2 (364/508 nm).
N
O
O
N
N
N
N
CO2- CO2
-
CO2-
O O
C O
CH2CO2-
CO2- CO2
-
Figura 14. Estrutura química da sonda fluorescente Fura PE3 (adaptado de
www.wikipedia.org).
Tem como vantagem relativamente ao Fura 2 o facto de ser estruturalmente capaz
de permanecer mais tempo no citoplasma (Takahashi et al., 1999). O Fura PE3 constitui
um grupo éster capaz de atravessar a membrana plasmática. No interior da célula, fica
sujeito à acção de esterases inespecíficas que quebram a molécula originando a forma
ácida da sonda. Esta forma é hidrofílica e portanto, dificilmente atravessa a membrana
citoplasmática. É sob a forma protonada que a sonda se liga aos iões cálcio e emite
fluorescência (Davies et al., 1997; Hallett et al., 1999; Takahashi et al., 1999). A
concentração do cálcio livre é calculada segundo a seguinte equação:
Material e métodos
61
Equação 26:
Ca2+ = Kd x F - Fmin
Fmax - F
Onde Kd representa a constante de dissociação, que reflecte a afinidade da sonda para o
cálcio (quanto menor a Kd, maior a afinidade da sonda para os iões cálcio) (Hallett et
al., 1999). Segundo Vondran et al. (1995) o valor de Kd para o Fura PE3 é 290 nM. F é
a fluorescência da amostra celular incubada com a sonda. Fmax representa a
fluorescência máxima obtida tratando as células com um ionóforo, calcimicina
(A23187). Este é derivado de Streptomyces chartreusensis e tem capacidade de
transportar iões cálcio para o interior da célula e assim saturar a sonda, originando a
fluorescência máxima. Fmin significa fluorescência mínima e é obtida adicionando
MnCl2 às células tratadas com A23187. Os iões Mn2+ têm a capacidade de libertar os
iões Ca2+ da sonda, permitindo avaliar o valor de Fmin (Sela et al., 2002).
3.6.2 Procedimento experimental
A concentação de cálcio livre intracelular foi determinada por uma técnica de
fluorimetria, monitorizando-se a fluorescência da sonda Fura PE3 de acordo com o
descrito por Sela et al. (2002), com modificações.
Para a determinação do F, incubou-se numa microplaca de fluorescência, a
mistura reaccional que continha, num volume final de 210 µL, os seguintes constituintes
nas concentrações finais indicadas: suspensão celular (3×106 células/mL) e sonda
fluorescente Fura PE3 (10 µM). Procedeu-se à leitura da fluorescência (comprimento de
onda de excitação e emissão 364 e 508 nm, respectivamente). Seguidamente adicionou-
se o ionóforo A23187 (5 µmol/L), efectuou-se a leitura de fluorescência e obteve-se o
Fmax. Para a determinação do Fmin adicionou-se MnCl2 (2 mM). Durante todo o ensaio a
mistura reaccional esteve sujeita a uma agitação suave e a uma temperatura de
incubação de 37ºC.
Material e métodos
62
3.7 Avaliação da activação de neutrófilos humanos pelo nitrato de níquel, com
utilização de uma técnica de quimioluminescência
Este ensaio teve como objectivo avaliar a activação de neutrófilos isolados de
sangue tratado com citrato, EDTA e heparina, pelo nitrato de níquel.
3.7.1 Fundamento da técnica
A avaliação da activação de neutrófilos humanos pelo nitrato de níquel, foi
realizada através de uma técnica de quimioluminescência cujo fundamento se encontra
discutido em 2.5.1.
3.7.2 Procedimento experimental
A mistura reaccional continha, num volume final de 200 µL, os seguintes
constituintes nas concentrações finais indicadas: luminol (500 µM), solução tampão
PBS com Ca2+ e Mg2+, pH 7,4, nitrato de níquel (3,9; 7,8; 15,6; 31,3; 62,5 e 125 µM) e
neutrófilos (4×106 células/mL). Todos os compostos foram dissolvidos em solução
tampão PBS, pH 7,4, excepto o nitrato de níquel, que não sendo solúvel nessa solução,
foi dissolvido em água. Durante todo o ensaio a mistura reaccional esteve sujeita a uma
agitação suave e a uma temperatura de incubação de 37ºC. As leituras da luminescência
(L) foram efectuadas durante 25 min e os valores de luminescência lidos nos picos
obtidos nessas cinéticas (≅ 15 min). Cada estudo correspondeu, no mínimo, a quatro
ensaios realizados em duplicado. O efeito de activação dos neutrófilos foi expresso sob
a forma de percentagem oxidação do luminol induzida pelas espécies reactivas de
acordo com a equação 27.
Material e métodos
63
Equação 27:
Activação de neutrófiloshumanos pelo nitratode níquel (%)
LNiNO3 x 100( )
Lbranco
- 100=
LNiNO3- Luminescência do ensaio que contem NiNO3.
Lbranco- Luminescência do ensaio sem NiNO3.
3.8 Estudo das espécies reactivas envolvidas no processo de activação dos
neutrófilos, pelo nitrato de níquel, com a utilização de uma técnica de
quimioluminescência
O objectivo deste ensaio foi identificar os processos envolvidos na geração de
espécies reactivas durante a activação dos neutrófilos pelo nitrato de níquel.
3.8.1 Fundamento da técnica
A produção de espécies reactivas pelos neutrófilos inicia-se com a activação da
enzima NADPH oxidase, com produção de O2-. (Majumdar, et al., 1991; Downey et al.,
1992; Nixon e McPhail, 1999; Karlsson e Dahlgren, 2002). Este radical é rapidamente
convertido, espontaneamente ou pela acção da enzima SOD, em H2O2 (Cheesman e
Slater, 1993; Campana et al., 2004). O H2O2 é importante pois origina, via reacção de
Fenton ou de Haber-Weiss o radical HO. (Ferreira e Matsubara, 1997; Barbosa et al.,
2006; Mladenka et al., 2006). O H2O2, pela acção da MPO resulta na formação de
HOCl (Hampton et al., 1998; Peskin e Winterbourn, 2001; Splettstoesser e Werner,
2002). A interacção de O2-., H2O2 e HOCl pode originar uma molécula muito reactiva, o
1O2 (Ferreira e Matsubara, 1997; Splettstoesser e Werner, 2002). A enzima NOS
converte o aminoácido L-arginina em .NO e L-citrulina (Fernandes et al., 2003;
Material e métodos
64
Ricciardolo et al., 2006). O .NO reage rapidamente com o O2-. para formar ONOO-
(Dedon e Tannenbaum, 2004).
Tendo em conta que que o luminol permite detectar várias espécies reactivas (ver
ponto 2.5.1), utlizou-se inibidores enzimáticos e captadores de espécies reactivas, já que
estes compostos, ao inibirem uma determinada enzima ou captarem uma determinada
espécie reactiva, vão competir com o luminol na sua reacção com estas, originando
assim, uma diminuição da luminescência. Os inibidores enzimáticos escolhidos foram o
DPI (NADPH oxidase), ABAH (MPO) e o L-NAME (NOS). Os captadores utilizados
foram o tiron, manitol e catalase, que captam o O2-., HO. e H2O2, respectivamente.
3.8.2 Procedimento experimental
As condições experimentais utilizadas neste ensaio foram semelhantes às
utilizadas no ensaio anterior. A mistura reaccional continha, num volume final de 200
µL, os seguintes constituintes nas concentrações finais indicadas: luminol (500 µM); um
dos seguintes inibidores enzimáticos DPI (1 µM), ABAH (10 µM) ou L-NAME (1 µM)
ou captadores de espécies reactivas tiron (2 mM e 50 µM), manitol (10 mM) ou catalase
(2,5 U/mL); nitrato de níquel (125 µM) e neutrófilos (106 células/mL). Durante todo o
ensaio a mistura reaccional esteve sujeita a uma agitação suave e a uma temperatura de
incubação de 37ºC. As leituras da luminescência (L) foram efectuadas durante 25 min e
os valores de luminescência lidos nos picos obtidos nessas cinéticas (≅ 15 min). Cada
estudo correspondeu, no mínimo, a quatro ensaios realizados em duplicado.
O efeito da inibição activação dos neutrófilos foi expresso sob a forma de
percentagem de inibição da oxidação do luminol pelas espécies reactivas e calculado de
acordo com a equação 28.
Material e métodos
65
Equação 28:
Inibição da activação de neutrófilos humanos pelo nitrato de níquel125 µM (%)
=Lcaptador ou inibidor Lbranco- )( x 100
L controlo - Lbranco
100 -
Lcaptador ou inibidor- Luminescência do ensaio na presença de captadores das espécies
reactivas ou inibidores enzimáticos e nitrato de níquel na concentração de 125 µM.
Lbranco- Luminescência do ensaio na ausência dos captadores das espécies reactivas ou
inibidores enzimáticos e do nitrato de níquel.
Lcontrolo- Luminescência do ensaio na ausência dos captadores das espécies reactivas ou
inibidores enzimáticos e na presença de nitrato de níquel na concentração de 125 µM.
3.8.3 Estudos complementares
Traçaram-se os espectros dos compostos testados tendo-se verificado que estes
não absorviam na região próxima de 431 nm (região em que o luminol oxidado
apresenta um máximo de emissão (Ferreira e Rossi, 2002), o que permite eliminar a
possibilidade destes compostos actuarem como quenchers da luz emitida pelo luminol
oxidado.
3.9 Análise estatística
Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média. A análise
estatística foi realizada usando o método não paramétrico de análise de variância
(ANOVA) seguido pelo teste Bonferroni. Valores de p inferiores a 0,05 foram
considerados estatisticamente significantes.
Resultados
66
4 RESULTADOS
Resultados
67
4.1 Viabilidade dos neutrófilos humanos isolados a partir de amostras de sangue
tratadas com os anticoagulantes EDTA, citrato e heparina
A viabilidade celular dos neutrófilos isolados foi sempre superior a 98%,
independentemente do anticoagulante utilizado.
4.2 Número de neutrófilos humanos isolados a partir de amostras de sangue
tratadas com os anticoagulantes EDTA, citrato e heparina
Na Figura 15 estão representados os resultados obtidos no estudo do número de
neutrófilos isolados de sangue tratado com cada um dos anticoagulantes estudados,
citrato, EDTA e heparina. Da análise da mesma ressaltam as diferenças no número de
células isoladas com cada um dos três anticoagulantes. O número de neutrófilos
isolados por mL de sangue recolhido foi o seguinte: EDTA (1,7×106 ± 1,5×105
neutrófilos/mL de sangue) > heparina (6,6×105 ± 1,5×104 neutrófilos/mL de sangue) >
citrato (4,6×105 ± 9,5×104 neutrófilos/mL de sangue) (média ± erro padrão da média).
Citrato EDTA Heparina0
250000
500000
750000
1000000
1250000
1500000
1750000
2000000**
Anticoagulante
Nº n
eutr
ófilo
s hu
man
os is
olad
os p
or m
L d
e sa
ngue
Figura 15. Número de neutrófilos isolados de sangue tratado com cada um dos três
anticoagulantes em estudo (citrato, EDTA e heparina) por mL de sangue. Os valores são
Resultados
68
apresentados como a média ± erro padrão da média (n = 10); ** p < 0.01,
comparativamente ao tratamento com citrato ou com heparina.
4.3 Activação de neutrófilos humanos pelo PMA
Na figura 16 estão representados os resultados obtidos no estudo da activação de
neutrófilos, isolados de sangue tratado com diferentes anticoagulantes, pelo PMA.
Verificou-se uma activação dos neutrófilos pelo PMA, muito semelhante com citrato e
heparina (830 ± 98% e 827 ± 77%, respectivamente) e menor com EDTA (370 ± 30%)
(média ± erro padrão da média).
Citrato EDTA Heparina0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
**
Anticoagulante
Act
ivaç
ão d
e ne
utró
filo
s hu
man
os p
elo
PMA
(%)
Figura 16. Activação de neutrófilos humanos isolados de sangue tratado com diferentes
anticoagulantes (citrato, EDTA e heparina), pelo PMA, relativamente ao ensaio em
branco (%). Os valores são apresentados como a média ± erro padrão da média (n = 6);
** p < 0.01, comparativamente ao tratamento com citrato ou com heparina.
Resultados
69
4.4 Quantificação do cálcio livre intracelular nos neutrófilos humanos isolados
Na figura 17 estão representados os resultados obtidos na quantificação do cálcio
livre intracelular em neutrófilos isolados de sangue tratado com EDTA, citrato e
heparina. Verificou-se que os neutrófilos tratados com EDTA possuem uma menor
concentração de cálcio livre intracelular (94,4 ± 3,1 nM) quando comparado com os
neutrófilos tratados com citrato e heparina (156,2 ± 28,7 nM e 165,3 ± 14,78 nM,
respectivamente) (média ± erro padrão da média).
Citrato EDTA Heparina0
25
50
75
100
125
150
175
200
*
Tipo de anticoagulante
Con
cent
raçã
o de
cál
cio
intr
acel
ular
(nM
)
Figura 17. Quantificação do cálcio livre intracelular em neutrófilos humanos isolados
de sangue tratado com diferentes anticoagulantes (citrato, EDTA e heparina). Os valores
são apresentados como a média ± erro padrão da média (n = 3); * p < 0.05,
comparativamente ao tratamento com heparina.
Resultados
70
4.5 Activação de neutrófilos humanos pelo nitrato de níquel
Na figura 18 estão representados os resultados obtidos no estudo da activação de
neutrófilos isolados, de sangue tratado com diferentes anticoagulantes, pelo nitrato de
níquel. Pela análise da mesma, verificou-se que houve uma activação dos neutrófilos
pelo nitrato de níquel. Esta activação das células foi dependente da concentração de
Ni2+, tendo-se registado maior activação para uma concentração de nitrato de níquel 125
µM. A activação dos neutrófilos foi diferente dependendo do anticoagulante utilizado.
Por exemplo, verificou-se que a concentração mais baixa de Ni2+, 3,9 µM, levou a uma
activação de 50 ± 9% com citrato, 36 ± 7% com EDTA e 107 ± 16% (média ± erro
padrão da média) com heparina. Já a concentração de 125 µM originou uma activação
de 263 ± 28%, 233 ± 29% e 130 ± 10% (média ± erro padrão da média) com a heparina,
o citrato e o EDTA, respectivamente.
0.0 3.9 7.8 15.6 31.2 62.5 125.00
50
100
150
200
250
300Ci trato
EDTA
Heparina
ζζζ
ι
**
ζζζ
ζζζ
ζζ
ζζ ζζι
ιι
Concentração de Ni 2+ (µµµµM)
Act
ivaç
ão d
e ne
utró
filo
s hu
man
os p
elo
nitr
ato
de n
íque
l (%
)
Figura 18. Activação de neutrófilos humanos isolados de sangue tratado com diferentes
anticoagulantes (citrato, EDTA e heparina), pelo nitrato de níquel, relativamente ao
ensaio em branco (%). Os valores são apresentados como a média ± erro padrão da
média (n = 10). * p < 0.05; comparação dos valores de citrato vs EDTA. ζζ p< 0.01 e
ζζζ<0.001, comparação dos valores de EDTA vs heparina. ι p < 0.05 e ιι p < 0.01,
comparação dos valores de heparina vs citrato.
Resultados
71
4.6 Processos envolvidos na geração de espécies reactivas durante a activação
dos neutrófilos pelo nitrato de níquel
Na figura 19 estão representados os resultados obtidos no estudo da identificação
das espécies reactivas envolvidas no processo de activação dos neutrófilos pelo nitrato
de níquel. Foram testados inibidores enzimáticos e/ou captadores de várias espécies
reactivas, sendo a % de inibição da produção de espécies reactivas pelos neutrófilos
isolados de sangue tratado com citrato, EDTA e heparina, representada no Quadro 2.
Como se pode verificar, os resultados foram muitos semelhantes entre os diferentes
anticoagulantes estudados.
Tiron 2
mM Mµµµµ
Tiron 50
Man
itol 1
0 mM Mµµµµ
DPI 1
Catalas
e 2.5
U/mL
L. NAM
E 1mM Mµµµµ
ABAH 10
0
25
50
75
100
125Citrato EDTA Heparina
Inib
ição
da
acti
vaçã
o de
neu
tróf
ilos
hum
anos
(%)
Figura 19. Percentagem de inibição da activação de neutrófilos pela acção do tiron,
manitol, DPI, catalase, L-NAME, e ABAH, quando estimulados pelo nitrato de níquel
(125 µM). Os valores são apresentados como a média ± erro padrão da média (n = 10).
Resultados
72
Quadro 2. Percentagem de inibição da activação de neutrófilos pela acção do tiron,
manitol, DPI, catalase, L-NAME, e ABAH, quando estimulados pelo nitrato de níquel
(125 µM). Os valores são apresentados como a média ± erro padrão da média (n = 10).
Inibição (%) (média ±±±± erro padrão da média) COMPOSTOS ESTUDADOS
CITRATO EDTA HEPARINA
DPI 1 µµµµM 100 ± 13 100 ± 7 100 ± 5
ABAH 10 µµµµM 99 ± 8 100 ± 4 89 ± 7
INIB
IDO
RE
S
EN
ZIM
ÁT
ICO
S
L-NAME 1 mM 6 ± 7 4 ± 8 8 ± 9
Tiron 2 mM 100 ± 8 100± 6 100 ± 1
Tiron 50 µµµµM 53 ± 13 37 ± 7 59 ± 9
Manitol 10 mM 33 ± 7 29 ± 7 38 ± 5
CA
PTA
DO
RE
S
DE
ESP
ÉC
IES
RE
AC
TIV
AS
Catalase (2,5 U/mL) 47 ± 14 48 ± 10 27 ± 6
Discussão
73
5 DISCUSSÃO
Discussão
74
Os resultados obtidos no presente estudo permitiram atingir os objectivos
inicialmente propostos. Ficou demonstrado que o número de neutrófilos isolados
depende do anticoagulante utilizado, sendo o EDTA o que proporcionou o maior
número, enquanto que a heparina e o citrato não diferem significativamente entre si. Por
outro lado, a viabilidade celular dos neutrófilos isolados foi sempre superior a 98%,
independentemente do anticoagulante utilizado. Verificou-se, no entanto, que o grau de
activação, pelo PMA, dos neutrófilos isolados de sangue tratado com EDTA,
relativamente à heparina e ao citrato, era significativamente menor, tendo estes últimos
originado, mais uma vez, valores semelhantes entre si. Finalmente, confirmou-se que o
nitrato de níquel possui o potencial de activar os neutrófilos humanos isolados, tendo
sido obtido um perfil relativo de activação semelhante ao do PMA, tendo em conta os
anticoagulantes utilizados. Estes dados ainda não tinham sido divulgados na literatura
científica, pelo que poderão contribuir significativamente para os conhecimentos
relativos ao isolamento e activação de neutrófilos humanos in vitro e na sua activação
pelo nitrato de níquel.
Os neutrófilos foram isolados pelo método de centrifugação de gradiente de
densidade, no qual se utilizou duas soluções de diferentes densidades, Histopaque 1077
(densidade de 1,077) e Histopaque 1119 (densidade de 1,119). Esta metodologia
permitiu encontrar grandes diferenças entre o número de células isoladas com cada um
dos três anticoagulantes estudados, citrato, EDTA e heparina. Foi efectuada a contagem
do número de neutrófilos antes de se proceder ao isolamento, com o aparelho
autoanalizador hematológico Sysmex SF 3000 (Roche). Não se verificaram diferenças
no número de neutrófilos de sangue tratado com citrato, EDTA e heparina, o que sugere
que o diferente número de neutrófilos isolados está estreitamente relacionado com o
processo de isolamento. Ao longo dos ensaios verificou-se que existia uma melhor
separação dos gradientes com o EDTA, o que permitiu uma recolha muito mais
eficiente da camada dos granulócitos. Com citrato e heparina a separação dos gradientes
não foi tão eficaz, o que resultou numa pior recolha das células alvo deste estudo e
consequentemente no menor número de células isoladas por mL de sangue. Estes
resultados corroboram um estudo realizado anteriormente por Nielsen (1985), que
estudou a influência de cinco anticoagulantes no isolamento e actividade funcional de
monócitos humanos. Neste estudo, o isolamento foi efectuado por um método de
centrifugação de gradiente de densidade utilizando sangue tratado com EDTA, citrato,
Discussão
75
heparina, oxalato e EGTA. O número de monócitos isolados foi superior com EDTA e
heparina. A viabilidade celular e a actividade funcional não apresentaram variações com
os anticoagulantes. Globalmente, o presente trabalho e o estudo realizado anteriormente
por Nielsen (1985) indicam que a utilização de diferentes anticoagulantes durante a
recolha de sangue poderá ter uma grande influência nos níveis de cálcio nos
componentes sanguíneos e consequentemente com os resultados de ensaios a realizar
posteriormente.
Estando a metodologia utilizada para a separação das células relacionada com
diferenças de densidade, o que permite a separação em gradiente de diferentes camadas
de células, estes resultados sugerem que a heparina e o citrato alteram de alguma forma
a densidade das mesmas, originando uma menor eficiência na sua distribuição pelos
gradientes, nomeadamente na camada dos granulócitos. Em termos práticos, com o
citrato, verificou-se um arrastamento de mononucleares praticamente até à camada dos
granulócitos. Esta por sua vez não se encontrava bem definida, prolongando-se até à
camada dos glóbulos vermelhos. Com a heparina, a diferenciação das camadas era
ligeiramente melhor do que com o citrato mas pior do que com o EDTA. Isto pode
indicar que o citrato e heparina originam uma agregação das células, resultando em
diferenças na densidade e consequentemente numa pior disposição das camadas. Esta
hipótese é corroborada por Mahony e Ferguson (1992), cujo estudo teve como objectivo
comparar as características de sangue tratado com heparina ou citrato. Após análise ao
microscópio de sangue do mesmo dador, tratado com heparina, os autores detectaram
que existia agregação de células. Esse agregado era composto maioritariamente por
plaquetas, alguns neutrófilos e uma pequena quantidade de linfócitos. A análise, por
ultrasons, de sangue tratado com citrato revelou uma agregação de plaquetas e
neutrófilos, embora menos considerável em quantidade e tamanho do que com a
heparina. De certa forma, estes resultados podem explicar o diferente número de
neutrófilos isolados com os três anticoagulantes estudados no presente trabalho. De
facto, a pior visualização das camadas de células com citrato e heparina, parece ter
origem nas diferenças de densidade resultantes da agregação de células, nomeadamente
plaquetas e neutrófilos. Passada a fase da recolha dos granulócitos para outro tubo,
procede-se a uma lavagem com solução tampão PBS e a um processo de lise, no sentido
de eliminar alguma contaminação por glóbulos vermelhos. Nesta etapa, verificou-se que
com citrato e heparina a contaminação por glóbulos vermelhos era superior, o que
Discussão
76
advém do facto da camada de granulócitos ser menos visível com estes anticoagulantes.
Essa maior contaminação levou a que se repetisse a lise até se conseguir eliminar todos
os glóbulos vermelhos. Este tarefa foi difícil quando os neutrófilos foram tratados com
citrato, em que se chegou a efectuar três lises. A agregação de componentes celulares
verificada anteriormente por Mahony e Ferguson (1992), poderá explicar a maior
resistência dos eritrócitos aos processos de lise, embora sejam ainda necessários estudos
experimentais para confirmar esta hipótese.
Os resultados obtidos no estudo seguinte, no qual se testou a activação, pelo PMA,
de neutrófilos humanos isolados de sangue tratado com citrato, EDTA ou heparina,
permitiram verificar o grau de estimulação dos neutrófilos isolados. Vários autores
referiram já a capacidade deste composto solúvel, obtido por síntese química, em
estimular os PMN (Robinson et al., 1987; Downey et al., 1992; Nixon e McPhail; 1999;
Seguchi e Kobayashi, 2002; Saito et al., 2005). O seu mecanismo de acção é muito
semelhante ao DAG, promovendo a translocação da PKC do citoplasma para a
membrana plasmática, onde ocorre a fosforilação do p47phox, etapa crucial na activação
da NADPH oxidase. Após activação da enzima há produção de O2-., que constitui o
primeiro produto para a geração de espécies reactivas (Majumdar, et al., 1991; Downey
et al., 1992; Nixon e McPhail, 1999; Karlsson e Dahlgren, 2002). Este radical é
rapidamente convertido, espontaneamente ou pela acção da enzima SOD, em H2O2
(Cheesman e Slater, 1993; Campana et al., 2004). O H2O2 é importante pois origina, via
reacção de Fenton ou de Haber-Weiss, o radical mais reactivo e deletério para o
organismo, o radical HO. (Ferreira e Matsubara, 1997; Barbosa et al., 2006; Mladenka
et al., 2006). O H2O2 pode também ficar sujeito à acção da MPO, presente nos grânulos
azurófilos dos neutrófilos. Esta enzima contribui consideravelmente para a capacidade
bactericida dos PMN, via formação de HOCl (Hampton et al., 1998; Peskin e
Winterbourn, 2001; Splettstoesser e Werner, 2002). A interacção de O2-., H2O2 e HOCl
pode originar uma molécula muito reactiva, o 1O2 (Ferreira e Matsubara, 1997;
Splettstoesser e Werner, 2002). Segundo Tepperman et al. (2000), a PKC tem também a
capacidade de activar a iNOS, responsável pela conversão do aminoácido L-arginina em .NO e L-citrulina (Fernandes et al., 2003; Ricciardolo et al., 2006). O .NO reage
rapidamente com o O2-. para formar ONOO- (Dedon e Tannenbaum, 2004). Em
condições fisiológicas o ONOO- tem um tempo vida inferior a 1 segundo, sendo
imediatamente convertido à sua forma protonada, ONOOH, que por fissão homolítica
Discussão
77
origina .NO2 e HO. (Coddington et al., 1999; Whiteman et al., 2002; Alvarez e Radi,
2003). A reacção directa do ONOO- com CO2 é particularmente importante devido à
elevada concentração deste elemento in vivo e à rapidez com que a reacção ocorre.
Dessa reacção resulta um novo aducto, o ONOOCO2-, cuja decomposição origina cerca
de 70% de CO2 e NO3- e 30% dos radicais .NO2 e CO3
-. (Denicola et al., 1998;
Coddington et al., 1999; Whiteman et al., 2002).
Verificou-se que o grau de activação dos neutrófilos pelo PMA foi diferente
consoante o anticoagulante utilizado, sendo menor com o EDTA e semelhante com
citrato e heparina. Este perfil manteve-se quando os PMN foram estimulados com
nitrato de níquel. Engstad et al. (1997) compararam o efeito de quatro anticoagulantes,
EDTA, citrato, heparina e hirudina, noutras funções desempenhadas por monócitos,
PMN e plaquetas de sangue humano, nomeadamente a activação dos monócitos, no
sangue total, induzida pela adição de 5 ng/mL de lipopolissacarídeos durante 1 a 6
horas, a activação dos PMN, que foi determinada pela medição da concentração da
lactoferrina no sangue total após 90 min de incubação, com ou sem, lipopolissacarídeos.
Nas plaquetas, os autores estudaram a capacidade dos anticoagulantes modificarem a
libertação dos grânulos α por parte destas células. Embora estes resultados tenham sido
observados noutro tipo de funções, o perfil relativo de activação foi semelhante ao
obtido no presente trabalho, ou seja, verificou-se uma maior activação dos neutrófilos
com heparina, e menor com citrato e EDTA. A maior activação dos neutrófilos tratados
com heparina, pode estar relacionada com o facto deste anticoagulante levar a uma
maior expressão de moléculas de adesão. Quando o neutrófilo recebe a informação de
uma reacção inflamatória em curso, ocorre uma profunda alteração no seu metabolismo
com a consequente activação da célula. Essa activação passa pela expressão das suas
moléculas de adesão, com a posterior produção de espécies reactivas. As moléculas de
adesão são glicoproteínas expressas na superfície celular, que medeiam o contacto entre
duas células ou entre células e a matriz extracelular (Sgarbi et al., 2006). O processo de
adesão pode ser dividido em pelo menos três etapas distintas. Num primeiro momento,
o neutrófilo circulante, que em situações normais ocupa a região central do vaso
sanguíneo, aproxima-se da parede vascular e rola sobre o endotélio. Numa segunda fase,
o neutrófilo entra em contacto com o vaso, sofre a acção de substâncias solúveis
libertadas no local (citocinas quimiotácticas) e passa a expressar moléculas activadas
que vão determinar uma ligação firme à superfície endotelial. Somente, então, o
Discussão
78
leucócito é capaz de migrar através do vaso em direcção ao tecido (Quintaes e Noronha,
1998; Sgarbi et al., 2006). Diferentes moléculas estão envolvidas em cada uma das
etapas de adesão e migração. Assim, de maneira geral, as moléculas de adesão dividem-
se em i) selectinas; ii) integrinas e iii) superfamília das imunoglobulinas. As selectinas
promovem uma fraca ligação inicial do neutrófilo ao endotélio (Cavalcanti, 1997;
Quintaes e Noronha, 1998). A superfamília das imunoglobulinas compreende uma
variedade de proteínas de cadeia única com múltiplos domínios de características
semelhantes às das imunoglobulinas e actuam como ligantes de outras moléculas de
adesão (Cavalcanti, 1997; Quintaes e Noronha, 1998). As integrinas são heterodímeros,
expressos na superfície dos leucócitos, que formam uma classe especial de receptores
constituídos por subunidades α e β. Entre os diversos membros da família das
integrinas, três estão especialmente envolvidos na adesão do leucócito ao vaso:
CD11a/CD18, CD11b/CD18 e CD49d/CD29. As demais integrinas são responsáveis
por interacções com a matriz extracelular (Cavalcanti, 1997; Quintaes e Noronha,
1998). Segundo vários autores, a heparina, ao contrário do citrato e EDTA, leva à
activação de moléculas de adesão dos neutrófilos, nomeadamente as integrinas CD11b e
a CD18 (Habbal et al., 1995; Repo et al., 1995; 1996; Shalekoff et al., 1998). Ambas
constituem um marcador da activação dos neutrófilos e são expressas na superfície dos
neutrófilos ou podem ser mobilizadas de três organelos intracelulares, os grânulos
específicos, grânulos de gelatinase e vesículas secretoras (Shalekoff et al., 1998; Caimi
et al., 2006). Habbal et al. (1995) alertam para a escolha adequada do anticoagulante,
pois a elevada expressão da CD11b com a consequente estimulação de neutrófilos
tratados com heparina pode levar a falsos positivos. A expressão da CD11b ocorre
facilmente durante os processos de isolamento das células, entre outros factores, porque
é muito dependente da temperatura, como tal, os neutrófilos devem ser mantidos em
gelo e de preferência todo o manuseamento das células ser efectuado a baixas
temperaturas. Uma alteração de temperatura de 4ºC para 37ºC origina uma expressão
elevada desta integrina (Repo et al., 1995; Youssef et al. 1995). O mesmo pode ter
acontecido no presente trabalho, já que a heparina per si leva à expressão da
CD11b/CD18, o que associado ao facto das leituras no leitor de placas serem realizadas
a 37ºC, pode ter levado a uma maior expressão dessas integrinas e assim, explicar a
superior sensibilidade dos neutrófilos a activadores do “burst” respiratório. De acordo
com a bibliografia consultada, o EDTA não aumenta a expressão das integrinas
CD11b/CD18 nos neutrófilos. Este facto parece estar relacionado com a sua capacidade
Discussão
79
de quelatar iões cálcio do meio extracelular, que são essenciais para a estrutura e função
de adesão das integrinas. O citrato, embora também actue como quelante de iões, não
afecta tanto a expressão da CD11b, sugerindo que não interfere com os locais de ligação
do cálcio às moléculas CD11b (Repo et al., 1995).
A menor activação dos neutrófilos tratados com EDTA foi também verificada por
Wu et al. (1999), que estudaram o efeito do anticoagulante na percentagem de
neutrófilos activados. Sugeriram que a heparina seria uma melhor opção ao EDTA, pois
o último inibia a activação dos PMN. A menor activação dos neutrófilos tratados com
EDTA pode estar relacionada com o seu mecanismo de anticoagulação passar pela
quelatação de iões cálcio (Engstad et al., 1997). Estes constituem um elemento crucial
na transdução de sinais extracelulares, responsáveis pela activação de algumas respostas
por parte dos neutrófilos, como desgranulação, a activação de oxidases como a NADPH
oxidase com produção de superóxido e consequentemente de outras espécies reactivas
(Geiszt et al., 1997). O fluxo de cálcio no interior dos neutrófilos pode ocorrer de duas
formas: i) rápida, com aumento de cálcio intracelular devido à libertação deste ião
armazenado no interior da célula, nomeadamente no retículo endoplasmático, induzida
pelo inositol 1,4,5-trifosfato (IP3); ii) aumento do cálcio intracelular devido ao seu
influxo do meio extracelular. Há evidências de que a libertação do cálcio armazenado
no interior da célula leva a um aumento do influxo deste ião pelos canais membranares
(Geiszt et al., 1997). O cálcio extracelular tem um papel importante na resposta
oxidativa das células, possivelmente através da activação da fosfolipase A2. Esta enzima
hidrolisa fosfolípidos da membrana, libertando ácido araquidónico, que tem um papel
importante na activação da NADPH oxidase (Tithof et al., 1998). Porém, os
mecanismos pelos quais o cálcio intracelular origina um aumento da geração de
superóxido são ainda pouco claros (Valentin et al., 2001). Rac1 é uma proteína G
monomérica, que faz parte da NADPH oxidase. Fazem parte desta enzima outras
subunidades: p67phox, p47phox e p40phox, que se encontram distribuídas no
citoplasma, o flavocitocromo b558, que pode estar na membrana plasmática ou na
membrana de alguns grânulos dos neutrófilos e outra proteína G, a Rac 2. A activação
da NADPH oxidase leva a uma deslocação das proteínas citoplasmáticas até à
membrana onde se unem às subunidades lá existentes, resultando numa oxidase activa,
capaz de produzir superóxido (Nixon e McPhail, 1999, Seguchi e Kobayashi, 2002,
Klebanoff, 2005). Segundo Valentin et al. (2001) a mobilização do cálcio intracelular
Discussão
80
leva à activação da Rac 1, que por sua vez, estimula a actividade da NADPH oxidase.
Um estudo realizado por Movitz et al. (1997) refere que a translocação das subunidades
citoplasmáticas não é induzida pelo cálcio per si, mas sim por moléculas de sinalização
celular geradas em resposta a um aumento da cálcio intracelular (de referir que essas
moléculas não estão ainda identificadas). Um aumento dos níveis de cálcio intracelular
é suficiente para activar a NADPH oxidase situada nos grânulos dos neutrófilos, tal não
se verificando com a NADPH oxidase localizada na membrana plasmática (Karlsson e
Dahlgren, 2002). Tendo em conta a importância deste ião na activação dos neutrófilos,
efectuou-se um estudo no âmbito de quantificar o cálcio livre intracelular em neutrófilos
isolados de sangue tratado com citrato, EDTA e heparina. Os resultados revelaram que
os neutrófilos tratados com EDTA possuem uma menor concentração de cálcio livre
intracelular. Este é um resultado concordante com a forma de acção deste
anticoagulante, ou seja, sendo um agente quelante, tem a capacidade de quelatar iões
cálcio e consequentemente originar uma menor entrada de cálcio para o interior da
célula. Portanto, a menor activação verificada com o EDTA poderá estar relacionada
com uma diminuição dos níveis de cálcio durante o processo de isolamento.
No estudo referente à activação pelo nitrato de níquel, de neutrófilos humanos,
tratados com diferentes anticoagulantes, verificou-se que os sais de Ni têm capacidade
para activar os neutrófilos, induzindo a produção de espécies reactivas. Em trabalhos
anteriores, Huang et al. (2001) realizaram medidas por ressonância electrónica de spin e
demonstraram que fibroblastos de rato em cultura, em contacto com 10 µg de Ni3S2 ou
2 mM de NiCl2 aumentam significativamente a geração de ROS. Testaram inibidores
enzimáticos e capatadores de espécies reactivas e concluíram que a estimulação dos
fibroblastos pelos compostos de Ni gera HO., e que o O2-. e o H2O2 estão envolvidos no
mecanismos de geração desse radical. Também Chen et al (2003b), através da oxidação
da diclorofluoresceína, revelaram que NiCl2 leva à produção de ROS, de uma forma
dependente da concentração (0-10 mM), em linfócitos humanos. Um estudo por
citometria de fluxo, realizado por Cavallo et al. (2003) demonstrou um aumento dos
níveis de ROS numa linha de células humanas (Jurkat) expostas durante quatro horas a
uma concentração de 0,17 µM de NiSO4. O processo pelo qual ocorre a produção de
espécies reactivas ainda não está totalmente esclarecido. A produção de espécies
reactivas depende muito da habilidade do Ni em formar o par redox Ni(III)/Ni(II). O Ni
(II) pode reagir com O2 ou H2O2, gerando HO. (Kasprzak et al., 2003). A geração do
Discussão
81
radical HO. pode ocorrer através da reacção Fenton/Haber-Weiss (Torreilles e Guérin,
1990). Segundo alguns autores, o Ni leva a um aumento dos níveis intracelulares de
cálcio (Salnikow e Costa, 1999; Memba-Meka et al., 2005). De acordo com M’Bemba-
Meka et al. (2005), embora o Ni possa funcionar como bloqueador dos canais de cálcio
ou competir com este pela entrada na célula pelos mesmos canais, o Ni tem um efeito
compensatório, aumentando os níveis de cálcio por duas vias, pela libertação pela
mitocôndria e pelo retículo endoplasmático. Tendo em conta o supracitado acerca da
importância do cálcio na activação dos neutrófilos, este pode ser considerado um dos
mecanismos pelos quais o Ni levou a uma activação dos PMN, embora sejam
necessários mais estudos para corroborar esta hipótese.
Com a utilização do luminol como luminóforo podemos saber se existem espécies
reactivas envolvidas no processo de activação dos neutrófilos. Contudo, não é possível
inferir sobre quais as que efectivamente participam no processo. Nesse sentido,
realizou-se um estudo com inibidores enzimáticos e captadores de espécies reactivas, já
que estes compostos, ao captarem uma determinada espécie reactiva, ou inibirem a sua
produção, vão competir com o luminol na sua reacção com estas originando assim uma
diminuição da luminescência. As enzimas NADPH oxidase e mieloperoxidase são
determinantes na produção de ROS, sendo a primeira responsável pela formação de O2.-
com subsequente formação de H2O2 e HO. e a segunda pela formação de HOCl. Tendo
isso em conta, foram utilizados inibidores das enzimas acima referidas, DPI (1 µM) e
ABAH (10 µM), respectivamente. O DPI e o ABAH originaram uma inibição
praticamente completa da activação dos neutrófilos independentemente dos
anticoagulantes anteriormente utilizados. Este resultados permitem confirmar que o O2.-
e o HOCl estão envolvidos no processo de activação dos neutrófilos. Testou-se também
um captador do O2.-, o tiron, cuja concentração de 2 mM levou a uma inibição completa
da activação, o que corrobora o supracitado. Com a catalase (2,5 U/mL), captador do
H2O2, obteve-se uma inibição da produção de espécies reactivas inferior mas ainda
assim efectiva. Os resultados obtidos indicam que no processo de activação dos
neutrófilos, para além do H2O2, existem outras espécies que contribuem para a oxidação
do luminol. Tendo em conta os efeitos do DPI e tiron sobre a produção de espécies
reactivas, pode-se concluir que o O2-. participa na activação dos neutrófilos,
contribuindo para a oxidação do luminol na presença de catalase. A aplicação do
manitol, captador do HO., aos neutrófilos isolados com citrato originou também alguma
Discussão
82
inibição da activação dos neutrófilos. Poderá concluir-se que há produção de várias
espécies reactivas, decorrente da estimulação dos neutrófilos, nomeadamente o O2.-,
H2O2 , o HO. e o HOCl. A enzima NOS é muito relevante na produção de RNS, levando
à libertação de .NO e subsequentemente de ONOO-. Como tal, testou-se o L. NAME,
cujo efeito é inibir a acção desta enzima. Os resultados obtidos indicaram que a
activação dos neutrófilos foi apenas ligeiramente inibida, sugerindo que, nas presentes
condições experimentais, as RNS não têm uma participação preponderante na activação
das células. Segundo Radi et al. (1993) o .NO não é capaz de oxidar o luminol. Contudo
no interior do neutrófilo, este é rapidamente convertido em ONOO-, e este sim tem
capacidade para oxidar o luminol (Radi et al., 1993; Chen et al., 2003a). De referir que
os resultados dos captadores de espécies reactivas e inibidores enzimáticas foram
semelhantes com os três anticoagulantes alvo deste estudo, sugerindo que o tipo de
espécies reactivas produzidas pelos neutrófilos não variam consoante o anticoagulante
utilizado.
Conclusões finais
83
6 CONCLUSÕES FINAIS
Conclusões finais
84
O trabalho realizado permitiu a obtenção de novos conhecimentos acerca do
isolamento e estimulação de neutrófilos humanos. As conclusões mais relevantes dos
estudos realizados são as seguintes:
1. A eficiência no isolamento dos neutrófilos depende do anticoagulante utilizado,
sendo o EDTA o que proporciona o isolamento de um maior número de neutrófilos.
2. O grau de activação dos neutrófilos pelo PMA depende do anticoagulante,
verificando-se maior estimulação das células com heparina e citrato do que com EDTA.
3. Os neutrófilos isolados de sangue tratado com EDTA possuem uma menor
concentração de cálcio livre intracelular, relativamente aos obtidos de sangue tratado
com heparina e com citrato.
4. O grau de activação dos neutrófilos isolados de sangue tratado com EDTA está
estreitamente correlacionado com os níveis de cálcio intracelulares quantificados após o
isolamento destas células.
5. Constatou-se que o nitrato de níquel possui o potencial de activar os neutrófilos
humanos isolados de sangue tratado com heparina citrato e EDTA, tendo sido obtido
um perfil relativo de activação semelhante ao do PMA.
6. Nas presentes condições experimentais, os neutrófilos activados pelo nitrato de
níquel originam as seguintes ROS: O2-., H2O2, HO. e HOCl. O .NO não parece ter um
papel relevante durante a estimulção dos neutrófilos pelo nitrato de níquel.
Referências bibliográficas
85
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Referências bibliográficas
86
Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR). 2005. Toxicological
profile for nickel. U.S. Departmant of Health and Human Services, Georgia.
Alvarez B. e Radi R. 2003. Peroxynitrite reactivity with amino acids and proteins.
Review. Amino Acids, 25:295-311.
Angosto M. C. 2005. Estallido respiratorio de los fagocitos. Anal. Real Acad. Nac.
Farm., 71: 365-386.
Arnhold J. 2004. Free radicals-friends or foes? Review. Biochemistry, 69:8-15.
Babior, B. M. 2000. Phagocytes and oxidative stress. Am. J. Med., 109:33-44.
Babu R., Rajmohan K., Rao H. R., Murthy B. K. 2006. Plasma lipid peroxidation and
erythrocyte antioxidants status in workers exposed to nickel. Biomarkers, 11:241-249.
Bagshaw S. M., Laupland K. B., Boiteau P. J., Godinez-Luna T. 2005. Is regional
citrate superior to systemic heparin anticoagulation for continuous renal replacement
therapy? A prospective observational study in an adult regional critical care system. J.
Crit. Care, 20:155-61.
Baran, E. J. 1995. Química Bioinorgânica. Isabel Capella, Espanha.
Barbosa L. F., Medeiros, M. H. G., Augusto O. 2006. Danos oxidativos e
neurodegeneração: o quê aprendemos com animais transgénicos e nocautes?. Quim.
Nova, 29:1-9.
Barreiros A. L. B. S., David J. M., David J. P. 2006. Estresse oxidativo: relação entre
geração de espécies reativas e defesa do organismo. Quim. Nova, 29:113-123.
Borregaard N. e Cowland J. B. 1997. Granules of the human neutrophilic
polymorphonuclear leukocyte. Blood, 89:3503-3521.
Boyum A. 1968. Separation of leukocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin.
Lab. Invest. 21:97-77.
Briheim G., Stendahl O., Dahlgren C. 1984. Intra- and extracellular events in luminol-
Referências bibliográficas
87
dependent chemiluminescence of polymorphonuclear leukocytes. Infect. Immun., 45:1-
5.
Caimi G., Lo Presti R., Carollo C., Musso M., Porreto F., Canino B., Catania A.,
Cerasola G. 2000. Polymorphonuclear integrins, membrane fluidity, and cytosolic Ca2+
content after activation in essential hypertension. Hypertension, 36:813-817.
Caldefie-Chézet F., Walrand S., Moinard C., Tridon A., Chassagne J., Vasson M.-P.
2002. Is the neutrophil reactive oxygen species production measured by luminol and
lucigenin chemiluminescence intra or extracellular? Comparison with DCFH-DA flow
cytometry and cytochrome c reduction. Clin. Chim. Acta, 319:9-17.
Campana F., Zervoudis S., Perdereau B., Gez E., Fourquet A., Badiu C., Tsakiris G.,
Koulaloglou S. 2004. Topical superoxide dismutase reduces post-irradiation breast
cancer fibrosis. J. Cell. Mol. Med., 8:109-116.
Campos E. B. P. e Yoshida W. B. 2004. O papel dos radicais livres na fisiopatologia da
isquemia e reperfusão em retalhos cutâneos: modelos experimentais e estratégias de
tratamento. J. Vasc. Br., 3:357-366.
Cavalcanti F. C. B. 1997. Revisão/Atualização em Transplante Renal: Moléculas de
adesão na isquemia e no transplante de órgãos. J. Bras. Nefrol., 19:98-104.
Cavallo D., Ursini C. L., Setini A., Chianese C., Piegari P., Perniconi B., Iavicoli S.
2003. Evaluation of oxidative damage and inhibition of DNA repair an in vitro study.
Toxicology in Vitro, 17:603-607.
Cerón J. J., Martinez-Subiela S., Hennemann C., Tecles F. 2004. The effects of different
anticoagulants on routine canine plasma biochemistry. Vet. J., 167:294-301.
Cheeseman K. H. e Slater T. F. 1993. An introduction to free radical biochemistry. Br.
Med. Bull., 49:481-493.
Chen C., Wang Y., Huang W., Huang Y. 2003b. Nickel induces oxidative stress and
genotoxicity in human lymphocytes. Toxicol. Appl. Pharmacol., 189:153-159.
Chen S. L., Jian L., Lang H. Q. 2003a. Optimization of peroxynitrite-luminol
chemiluminescence system for detecting peroxynitrite in cell culture solution exposed
Referências bibliográficas
88
to carbon disulphide. Luminescence.,18:249-253.
Choi H. R., Choi J. S., Han Y. N., Bae S. J., Chung H. Y. 2002. Peroxynitrite
scavenging activity of herb extracts. Phytother. Res., 16:364-367.
Clugston S L, Barnard J F, Kinach R, Miedema D, Ruman R, Daub E, Honek J F. 1998.
Overproduction and characterization of a dimeric non-zinc glyoxalase I from
Escherichia coli: evidence for optimal activation by nickel ions. Biochemistry, 37:8754-
9763
Coddington J. W., Hurst J. K., Lymar S. V. 1999. Hydroxyl radical formation during
peroxynitrous acid decomposition. J. Am. Chem. Soc., 121:2438-2443.
Costa D., Marques A. P., Reis R. L., Lima J. L. F. C., Fernandes E. 2006. Inhibition of
human neutrophil oxidative burst by pyrazole derivatives. Free Radic Biol Med.,
40:632-640.
Costa M., Salnikow K., Surtherland J. E., Broday L., Peng W., Zhang Q., Kluz T. 2002.
The role of oxidative stress in nickel and chromate genotoxicity. Mol. Cell. Biochem.,
234/235:265-275.
Costa M., Sutherland J. E., Peng W., Salnikow K., Broday L., Kluz T. 2001. Molecular
biology of nickel carcinogenesis. Mol. Cell. Biochem., 222:205–211.
Cynshi O., Saitoh M., Cynshi F., Tanemura M., Hata S-I., Nakano M. 1990. Anti-
oxidative profile of lobenzarit disodium (CCA). Biochem. Pharmacol., 40:2117:2122
Dahlgren C. e Karlsson A. 1999. Respiratory burst in human neutrophils. J. Immunol.
Methods., 232:3-14.
Davidson T., Chen H., Garrick M. D., D’Angelo G., Costa M. 2005. Soluble nickel
interferes with cellular iron homeostasis. Mol. Cell. Biochem., 279:157-162.
Davies E., Blanchfield H., Hallett M. 1997. Use of fluorescent dyes for measurement
and localization of organelles associated with Ca2+ store release in human neutrophils.
Cell. Biol. Int., 21:655-663.
Dedon P. C. e Tannenbaum S. R. 2004. Reactive nitrogen species in the chemical
Referências bibliográficas
89
biology of inflammation. Arch. Biochem. Biophys., 423:12-22.
Demiryürek A. T., Cinel I., Kahraman S., Tecder-Ünal M., Gögüs N., Aypar Ü., Kanzik
I. 1998. Propofol and intralipid interact with reactive oxygen species: a
chemiluminescence study. Br. J. Anaesth., 80:649-654.
Denicola A. e Radi R. 2005. Peroxynitrite and drug-dependent toxicity. Toxicology,
208:273-88.
Denkhaus E. e Salnikow K. 2002. Nickel essentiality, toxicity, and carcinogenicity.
Crit. Rev. Oncol. Hematol., 42:35–56.
Downey G. P., Chan C. K., Lea P., Takai A., Grinstein S. 1992. Phorbol ester-induced
actin assembly in neutrophils: role of protein kinase C. J. Cell Biol., 116:695-706.
El Benna J., Park J., Ruedi J. M., Babior B. M. 1995. Cell-free activation of the
respiratory burst oxidase by protein kinase C. Blood Cells. Mol. Dis., 15:201-206.
Engstad C. S., Gutteberg T. J., Osterud B. 1997. Modulation of blood cell activation by
four commonly used anticoagulants. Thromb. Haemost., 77:690-696.
Fernandes E. G. R. 1996. Síntese e elucidação estrutural de xantonas, xantonolignóides
e determinação da actividade biológica. Tese de doutoramento, Faculdade de Farmácia
da Universidade do Porto.
Fernandes E., Lima J. L. F. C., Reis S. 2003. Involvement of reactive oxygen and
nitrogen species in inflammatory processses. Implications for the potential therapeutic
use of NSAIDs with antioxidant activity. Medicinal Chemistry, 3:221-236.
Ferreira A. L. A. e Matsubara L. S. 1997. Radicais livres: conceitos, doenças
relacionadas, sistemas de defesa e estresse oxidativo. Rev. Assoc. Med. Bras., 43:61-68.
Ferreira E. C. e Rossi A. V. 2002. A quimiluminescência como ferramenta analítica: do
mecanismo a aplicações da reacção do luminol em métodos de análise. Quim. Nova,
25:1003-1011.
Gartner L. P. e Hiatt J. L. 2003. Tratado de histologia em cores. 2ª edição. Guanabara
Koogan S. A., Rio de Janeiro, Brasil.
Referências bibliográficas
90
Geiszt M., Kapus A., Nemet K., Farkas L., Ligeti E. 1997. Regulation of capacitative
Ca2+ influx in human neutrophil granulocytes. Alterations in chronic granulomatous
disease. J. Biol. Chem., 272:26471-26478.
Glasser L. e Fiederlein R. L. 1990. The effect of various cell separation procedures on
assays of neutrophil function. A critical appraisal. Am. J. Clin. Pathol., 93:662-669.
Gould E. S. 1959. Inorganic Reactions and structure. Henry Holt and Company, New
York.
Grey A. D. N. J. 2002. HO2.: The forgotten radical. Review. DNA and Cell Biology,
21:251-257.
Habbal M. H., Smith L., Elliot M. J., Strobel S. 1995. Effect of heparin anticoagulation
on neutrophil adhesion molecules and release of IL8:C3 is not essential. Cardiovasc.
Res., 30:676-681.
Haber L. T., Erdreicht L., Diamond G. L., Maier A. M., Ratney R., Zhao Q., Dourson L.
2000. Hazard identification and dose response of inhaled nickel-soluble salts. Regul.
Toxicol. Pharmacol., 31:210-230.
Hallett M., Hodges R., Cadman M., Blanchfield H., Dewitt S., Pettit E., Laffafian I.,
Davies, E. 1999. Techniques for measuring and manipulating free Ca2+ in the cytosol
and organelles of neutrophils. J. Immunol. Methods, 232:77-88.
Halliwel B. e Gutteridge J. M. C. 1999. Free radicals in biology and medicine. Oxford
University Press, Oxford, UK.
Hamerschlak N. e Rosenfeld L. G. M. 1996. Utilização da heparina e dos anticoagulants
orais na prevenção e tratamento da trmbose venosa profunda e da embolia pulmonar.
Arq. Bras. Cardiol., 67:209-213.
Hampton M. B., Kettle A. J., Winterbourn C. C. 1998. Inside the neutrophil
phagossome: oxidants, myeloperoxidase, and bacterial killing. Review. Blood, 92:3007-
3017.
Hasegawa H., Suzuki K., Nakaji S., Kazuo S. 1997. Analysis and assessment of the
Referências bibliográficas
91
capacity of neutrophils to produce reactive species in a 96-well microplate format using
lucigenin- and luminol- dependent chemiluminescence. J. Immunol. Methods, 210:1-10.
Heiduschka P. e Thanos S. 1998. NO production during neuronal cell death can be
directly assessed by a chemical reaction in vivo. NeuroReport, 9:4051-4057.
Hofseth L. J., Hussain S. P., Wogan G. N., Harris C. C. 2003. Nitric oxide in cancer and
chemoprevention. Free Radic. Biol. Med., 34:955-968.
Huang C., Li J., Costa M., Zhang Z., Leonard S. S., Castranova V., Vallyathan V., Ju
G., Shi X. 2001. Hydrogen Peroxide Mediates Activation of Nuclear Factor of
Activated T Cells (NFAT) by Nickel Subsulfide. Cancer Res., 61:8051-8057.
International Agency for Research on Câncer: IARC monographs. 1997. Risks to
Humans, Chromium, Nickel and Welding, 49:1-16.
Júlio I. 1999. Acção dos neutrófilos na inflamação.Artigo de revisão. Revista da
Faculdade de Medicina de Lisboa, 4:105-111.
Junqueira L. C. e Carneiro J. 2004 . Histologia Básica. 10ª edição., Guanabara Koogan
S. A., Rio de Janeiro, Brasil.
Kaim W e Schwederski B. 1994. Bioinorganic chemistry: inorganic elements in the
chemistry of life. John Wiley & Sons, New York.
Karlsson A. e Dahlgren C. 2002. Assembly and activation of the neutrophil NADPH
oxidase in granule membranes. Antioxid. Redox. Signal., 4:49-60.
Kasprzak K., Sunderman F., Salnikow K. 2003. Nickel carcinogenesis. Review
Mutation Research, 533:67-97.
Kawanishi S., Oikawa S., Inoue S., Nishino K. 2002. Distinct mechanisms of oxidative
DNA damage induced by carcinogenic nickel subsulfide and nickel oxides. Metals
Toxicity, 110:789-791.
Kierszenbaum A. L. 2004. Histologia e biologia cellular- Uma introdução à patologia.
Elsevier Lda. Rio de Janeiro, Brasil.
Referências bibliográficas
92
Klebanoff S. J. 2005. Myeloperoxidase: friend and foe. J. Leukoc. Biol., 77:598-625.
Kopprasch S., Pietzsch J., Graessler J. 2003. Validation of different chemiluminegic
substrates for detecting extracellular generation of reactive oxygen species by
phagocytes and endothelial cells. Luminescence, 18:268-273.
Lanigan R. S. e Yamarik T. A. 2002. Final report on the safety assessment of EDTA,
calcium disodium EDTA, diammonium EDTA, dipotassium EDTA, disodium EDTA,
TEA-EDTA, tetrasodium EDTA, tripotassium EDTA, trisodium EDTA, HEDTA, and
trisodium HEDTA. Int. J. Toxicol., 21:95-142.
Lide D. R. 1998. Handbook of Chemistry and Physics. 78th edition. CRC Press, USA.
Lu H., Shi X., Costa M., Huang C. 2005. Carcinogenic effect of nickel compounds.
Mol. Cell. Biochem., 279:45-67.
Lynn S., Yew F. H., Chen K. S., Jan K. Y. 1997. Reactive oxygen species are involved
in nickel inhibition of DNA repair. Environ. Mol. Mutagen., 29:208-216.
Mahony C. e Ferguson J. 1992. The effect of heparin versus citrate on blood
echogenicity in vitro: the role of platelet and platelet-neutrophil aggregates. Ultrasound
Med Biol.,18:851-859.
Maibach H. I. e Menné T. 1989. Nickel and the skin: immunology and toxicology. CRC
Press, USA.
Majumdar S., Rossi M. W., Fujiki T., Philips W. A., Disa S., Queen C. F., Johnston R.
B., Rosent O. M., Corkey B. E., Korchak H. M. 1991. Protein kinase C isotypes and
signaling in neutrophils. J. Biol. Chem., 266:9285-9294.
M'Bemba-Meka P., Lemieux N., Chakrabarti S. K. 2005. Role of oxidative stress,
mitochondrial membrane potential, and calcium homeostasis in nickel sulfate-induced
human lymphocyte death in vitro. Chem. Biol. Interact., 156:69-80.
Mira L., Silva M., Manso C. F. 1994. Scavening of reactive oxygen species by silibinin
dihemisuccinate. Biochem. Pharmacol., 48:753-759.
Misso N. L. e Thompson P. J. 2005. Oxidative stress and antioxidant deficiencies in
Referências bibliográficas
93
asthma potential modification by diet. Redox Report, 10:247-255.
Mladenka P., Simunek T., Hübl M., Hrdina R. 2006. The role of reactive species in
cellular iron metabolism. Free Radic. Res., 40:263-272.
Movitz C., Sjölin C., Dahlgren C. 1997. A rise in ionized calcium activates the
neutrophil NADPH-oxidase but is not sufficient to directly translocate cytosolic
p47phox or p67phox to b cytochrome containing membranes. Inflammation, 21:531-
540.
Myhre O., Andersen J. M., Aarnes H., Fonnum F. 2003. Evaluation of the probes 2’, 7’-
dichlorofluorescin diacetate, luminol and lucigenin as indicators of reactive species
formation. Biochem. Pharmacol., 65:1575-1582.
Nauseef W. M., Volpp B. D., McCormick S., Leidal K. G., Clark R. A. 1991. Assembly
of the neutrophil respiratory burst oxidase. J. Biol. Chem., 266:5911-5917.
Nève J., Parij N., Moguilevsky N. 2001. Inibition of the myeloperoxidase chlorinating
activity by non-steroidal anti-inflammatory drugs investigated with a human
recombinant enzyme. Eur. J. Pharmacol., 417:3-43.
Nielsen H. 1985. Influence of five anticoagulants on human blood monocytes isolation
and functional activities. Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand., 93:49-52.
Nixon J. B., McPhail L. C. 1999. Protein kinase C (PKC) isoforms translocate to Triton
insoluble fraction in stimulated human neutrophils: correlation of conventional PKC
with activation of NADPH oxidase. J. Immunol., 163:4574-4582.
Oosthuizen M. M. J. e Greyling D. 2001. Hydroxyl radical generation: the effect of
bicarbonate, dioxygen and buffer concentration on pH-dependent chemiluminescence.
Redox Rep., 6:105-116.
Oosthuizen M. M. J., Engelbrecht M. E., Lambrechts H., Greyling D., Levy R. D. 1997.
The effect of pH on chemiluminescence of different probes exposed to superoxide and
singlet oxygen generators. J. Biolumin. Chemilumin., 12:277-284.
Peskin A. V. e Winterbourn C. C. 2001. Kinetics of the reactions of hypochlorous acid
and amino acid chloramines with thiols, methione and ascorbate. Free Radic. Biol.
Referências bibliográficas
94
Med., 30:572-579.
Phipps W. J., Sands J. K., Marek J. F. 1993. Enfermagem medico-cirúrgica, Volume IV.
Lusociência, E.U.A.
Prütz W. A. 1996. Hypochlorous acid interactions with thiols, nucleotides, DNA and
other biological substrates. Arch. Biochem. Biophys., 332:110-120.
Quinn M. T. e Gauss K. A. 2004. Structure and regulation of the neutrophil respiratory
burst oxidase: comparison with nonphagocyte oxidases. J. Leukoc. Biology, 76:760-781.
Quintaes P. S. L. e Noronha I. L. 1998. Revisão/Atualização em Insuficiência Renal
Aguda: Papel dos neutrófilos e moléculas de adesão na fisiopatologia da insuficiência
renal aguda isquêmica. J. Bras. Nefrol., 20:74-77.
Radi R., Cosgrove T. P., Beckman J. S., Freeman B. A. 1993. Peroxynitrite-induced
luminol chemiluminescence. Biochem. J., 290:51-57.
Ragsadale S. W. 1998. Nickel biochemistry. Curr Opin Chem Biol., 2:208-215.
Rao P. S., Luber J. M., Milinowicz J., Lalezari P., Mueller H. S. 1998. Specificity of
oxygen radical scavengers and assessment of free radical scavenger efficiency using
luminol enhanced chemiluminescence. Biochem. Biophys. Res. Commun., 150:39-44.
Repo H., Jansson S. E., Leirisalo-Repo M. 1995. Anticoagulant selection influences
flow cytometric determination of CD11b upregulation in vivo and ex vivo. J. Immunol.
Methods, 185:65-79.
Ricciardolo F. L. M., Stefano A. D., Sabatini F., Folkerts G. 2006. Reactive nitrogen
species in the respiratory tract. J. Pharmac., 522:240-252.
Robinson J. M., Badwey J. A., Karnovsky M. L., Karnovsky M. J. 1987. Cell surphace
dynamics of neutrophils stimulated with phorbol esters or retinoids. J. Cell Biol.,
105:417-426.
Rost M., Karge E., Kinger W. 1998. What do we measure with luminol-, lucigenin- and
penicillin- amplified chemiluminescence? 1. Investigations with hydrogen peroxide and
sodium hypochlorite. J. Biolumin. Chemilumin., 13:355-363.
Referências bibliográficas
95
Sadagopan N. P., Li W., Cook J. A., Galvan B., Weller D. L., Fountain S. T., Cohen L.
H. 2003. Investigation of EDTA anticoagulant in plasma to improve the throughput of
liquid chromatography/tandem mass spectrometric assays. Rapid Commun. Mass
Spectrom., 17:1065-1070.
Saito T., Takahashi H., Doken H., Koyama H., Aratani Y. 2005. Phorbol myristate
acetate induces neutrophil death through activation of p38 mitogen-activated protein
kinase that requires endogenous reactive oxygen species other than HOCl. Biosci.
Biotechnol. Biochem., 69:2207-2212.
Salnikow K., Kluz T., Costa M. 1999. Role of Ca(2+) in the regulation of nickel-
inducible Cap43 gene expression. Toxicol. Appl. Pharmacol. 160:127-132.
Seeley R. R., Stephens T. D., Tate P. 2001. Anatomia & Fisiologia, 1ª edição.
Lusodidacta, Lisboa, Portugal.
Seguchi H. e Kobayashi T. 2002. Study of NADPH oxidase-activated sites in human
neutrophils. J. Electron. Microsc., 51:87-91.
Sela S., Shurtz-Swirski R., Farah R., Levy R., Shapiro G., Chezar J., Shasha S. M.,
Kristal B. 2002. A link between polymorphonuclear leukocyte intracellular calcium,
plasma insulin, and essential hypertension. Am. J. Hypertens., 15:291-295.
Sgarbi M. W. M., Junior B. A. S., Neto J. S. H. 2006. Importância da resposta
inflamatória sistêmica (SIRS) no prognóstico dos pacientes politraumatizados. Rev Bras
Ortop., 41:1-6.
Shackelford R. E., Kaufmann W. K., Paules R. S. 2000. Oxidative stresss and cell cycle
checkpoint function. Free Radic. Biol. Med., 28:1387-1404.
Shalekoff S., Page-Shipp L., Tiemessen C. T. 1998. Effects of anticoagulants and
temperature on expression of activation markers CD11b and HLA-DR on human
leukocytes. Clin. Diagn. Lab. Immunol., 5:695-702.
Sivulka D. J. 2005. Assessment of respiratory carcinogenicity associated with exposure
to metallic nickel. Review. Regul. Toxicol. Pharmacol., 43:117-133.
Referências bibliográficas
96
Soine T. O. e Wilson C. O. 1957. Rogers’ inorganic pharmaceutical chemistry. Henry
Kimpton, Londres.
Splettstoesser W. D. e Werner P. S. 2002. Oxidative stress in phagocytes- “The enemy
within”. Microsc. Res. Tech., 57:441-455.
Squadrito G. e Pryor W. A. 1998. Oxidative chemistry of nitric oxide: the roles of
superoxide, peroxynitrite, and carbon dioxide. Free Radic. Biol. Med., 25:392-403.
Stevens A. e Lowe J. S. 1995. Histologia. Manole Lda, São Paulo, Brasil.
Tagliasacchi D. e Carboni G. 1997. Let’s observe the blood cells. www.funsci.com
Takahashi A., Camacho P., Lechleiter J., Herman B. 1999. Measurement of intracellular
calcium. Physiol. Rev., 79:1089-1125.
Tepperman B. L., Chang Q., Soper B. D., 2000. Protein Kinase C Mediates
Lipopolysaccharide- and Phorbol-Induced Nitric-Oxide Synthase Activity and Cellular
Injury in the Rat Colon. J. Pharmacol. Exp. Ther., 295:1249-1257.
The Merck Index. 2001. Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals. 13th
Edition. Merck & Co., Inc., N. J., U.S.A.
Tithof P. K., Peters-Golden M., Ganey P. E. 1998. Distinct phospholipases A2 regulate
the release of arachidonic acid for eicosanoid production and superoxide anion
generation in neutrophils. J. Immunol., 160:953-960.
Tolando R., Jovanovi A., Brigelius-Flohé R., Ursini F., Maiorino M. 2000. Reactive
oxygen species and proinflammatory cytokine signaling in endothelial cells: effect of
selenium supplementation. Free Radic. Biol. Med., 28:979-086.
Torreilles J. e Guérin M. C. 1990. Nickel (II) as a temporary catalyst for hydroxyl
radical generation. FEBS Lett., 272:58-60.
Valentin F., Bueb J., Capdeville-Atkinson C., Tschirhart E. 2001. Rac-1-mediated O2-
secretion requires Ca2+ influx in neutrophil-like HL-60 cells. Cell Calcium., 29:409-415.
Vieira A. J. S. C. 2006. Radicais oxidantes: da química à biologia. Química, 100:66-71.
Referências bibliográficas
97
Vorndran C., Minta A. Poenie M. 1995. New Fluorescent calcium indicators designed
for cytosolic retention or measuring calcium near membranes. Biophys J., 69:2112-
2124.
Watt R. K. e Ludden P. W. 1999. Nickel-binding proteins. Review. Cell. Mol. Life Sci.
56:604-625.
Whiteman M., Ketsawatsakul U., Halliwell B. 2002. A reassessment of the peroxynitrite
scavenging activity of uric acid. Ann. N. Y. Acad. Sci., 962:242-259.
Wink D. A., Cook J. A., Pacelli R., DeGraff W. Gamson J., Liebmann J., Krishna M.
C., Mitchell J. B. 1996. The effect of various nitric oxide-donor agents on hydrogen
peroxide-mediates toxicity: a direct correlation between nitric oxide formation and
protection. Arch. Biochem. Biophys., 331:241-248.
Wu L., Chen H., Deng L. 1999. Effects of anticoagulants, temperature and sex on the
spontaneous activation of neutrophils in vitro. Abstract. Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng
Xue Za Zhi., 16:350-354.
Yan Y., Wei C., Zhang W., Cheng H., Liu J. 2006. Cross-talk between calcium and
reactive oxygen species signaling. Acta Pharmacologica Sinica, 27:821-826.
Young B. e Heath J. W. 2000. Histologia functional. Editora: Guanabara Koogan S. A.,
Rio de Janeiro, Brasil.
Youssef P. P., Mantzioris B. X., Roberts-Thomson P. J., Ahern M. J., Smith M. D.
1995. Effects of ex vivo manipulation on the expression of cell adhesion molecules on
neutrophils. J. Immunol. Methods., 186:217-224.