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VICTOR NETTO MAIA EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA ADIÇÃO DE ANTIOXIDANTES (GLUTATIONA PEROXIDASE E CISTEÍNA) NA VIABILIDADE DE ESPERMATOZOIDES REFRIGERADOS DE EQUINOS RECIFE 2010

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VICTOR NETTO MAIA

EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SEcircMENreg E ACP-105reg) E DA

ADICcedilAtildeO DE ANTIOXIDANTES (GLUTATIONA PEROXIDASE E

CISTEIacuteNA) NA VIABILIDADE DE ESPERMATOZOIDES

REFRIGERADOS DE EQUINOS

RECIFE

2010

Livros Graacutetis

httpwwwlivrosgratiscombr

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1

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO

PROacute-REITORIA DE PESQUISA E POacuteS-GRADUACcedilAtildeO

PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIA VETERINAacuteRIA

VICTOR NETTO MAIA

EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SEcircMENreg E ACP-105reg) E DA

ADICcedilAtildeO DE ANTIOXIDANTES (GLUTATIONA PEROXIDASE E

CISTEIacuteNA) NA VIABILIDADE DE ESPERMATOZOIDES

REFRIGERADOS DE EQUINOS

Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo

em Ciecircncia Veterinaacuteria do Departamento de Medicina

Veterinaacuteria da Universidade Federal Rural de

Pernambuco como requisito parcial para a obtenccedilatildeo do

grau de Mestre em Ciecircncia Veterinaacuteria

Orientadora Profordf Drordf Maria Madalena Pessoa Guerra

Co-orientador Profordm Drordm Gustavo Ferrer Carneiro

RECIFE - PE

2010

2

Ficha catalograacutefica

M217e Maia Victor Netto Efeito do diluente (Botu-secircmen reg e ACP reg) e da adiccedilatildeo de antioxidante (glutationa peroxidase e cisteiacutena) na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerado de equumlinos Victor Netto Maia ndash 2010 61 p il Orientadora Maria Madalena Pessoa Guerra Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncia Veterinaacuteria) ndash Universidade Federal Rural de Pernambuco Departamento de Medicina Veterinaacuteria Recife 2010 Referecircncias 1 Antioxidantes 2 Secircmen 3Glutationa peroxidase 4 Equumlino 5 Cisteiacutena 6 Secircmen refrigerado I Guerra Maria Madalena Pessoa orientadora II Tiacutetulo CDD 63608926

3

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO

PROacute-REITORIA DE PESQUISA E POacuteS-GRADUACcedilAtildeO

PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIA VETERINAacuteRIA

EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SEcircMENreg E ACP-105reg) E DA

ADICcedilAtildeO DE ANTIOXIDANTES (GLUTATIONA PEROXIDASE E

CISTEIacuteNA) NA VIABILIDADE DE ESPERMATOZOIDES

REFRIGERADOS DE EQUINOS

Dissertaccedilatildeo de Mestrado elaborada e defendida por

VICTOR NETTO MAIA

Aprovada em 30 de agosto de 2010

BANCA EXAMINADORA

Profordf Drordf Maria Madalena Pessoa GuerraUFRPE

Orientadora

Profa Dra Eacuterika Christina Santos OliveiraUFRPE

Prof Dr Karen Mascaro Gonccedilalves da Silva

Dra Zoraide Fernandes Coleto (suplente)

4

A Deus a toda minha famiacutelia e amigos em especial meu

pai minha matildee e minha esposa Todos que formam o

ANDROLAB e minha orientadora a professora

Madalena por terem acreditado confiado e me ajudado

incondicionalmente

Dedico

5

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus por ter me concedido o dom da vida a oportunidade e o

privileacutegio do estudo Pelas inuacutemeras becircnccedilatildeos a mim concedidas diariamente e aos

vaacuterios ldquoanjosrdquo que ELE coloca e colocou junto de mim em toda a minha caminhada

A toda minha famiacutelia em especial meu pai Mauriacutecio e minha matildee Dolores

que sempre me apoiaram e nunca mediram esforccedilos para me ajudar a realizar todos os

meus sonhos inclusive por muitas vezes abrindo matildeo de seus proacuteprios sonhos em

funccedilatildeo dos meus Aos meus irmatildeos Daniel e Juliana e aos meus cunhados que com

toda certeza estatildeo sempre torcendo por mim

A Karinna minha esposa amiga companheira e agora matildee de meu mais novo

amor Mariah Que sempre me deu forccedilas para conseguir ir em frente

Ao vaacuterios professores que contribuiacuteram na minha formaccedilatildeo os quais jamais

esquecerei

Aos meus amigos e soacutecios no Centro de Equinos de Pernambuco-CEPE

Eduardo Andrade Lima Oswaldo Gomes Neto e tambeacutem ao meu co-orientador Prof

Dr Gustavo Ferrer Carneiro pela amizade confianccedila respeito e apoio

Agrave professora e orientadora Maria Madalena Pessoa Guerra com a qual tenho

aprendido e me surpreendido cada vez mais Aleacutem dos conhecimentos cientiacuteficos ela

tornou-se para mim um exemplo de profissional e de ser humano capaz de se

desprender de si em prol do proacuteximo Professora MEU MUITO OBRIGADO

Aos teacutecnicos e funcionaacuterios Alcir Joana Dordf Sonia e Marquinhos pelo carinho

e atenccedilatildeo

Aos companheiros do ANDROLAB Adriana Aacutelvaro Clara Diogo Filipe

Moraes Kaline Lawrence Liacutegia Pedro Profordf Eacuterica e em especial Sildivane que eacute

meu anjo da guarda a Ellen que sempre se preocupou em me ajudar a Andreacute Mariano

(bdquoO Corruptordquo) pela amizade e paciecircncia e a Felipe Costa que foi meu parceiro

fundamental no experimento A todos devo minha eterna gratidatildeo

A todos que formam o Haras Vida Boa ldquopalcordquo deste experimento

Agrave equipe da ACP Biotecnologia em especial ao professor Dr Joseacute Ferreira

Nunes e a Cristiane Salgueiro pelo apoio e fornecimento do ACP-105

6

ldquoO caminho no qual a crianccedila siga e conheccedila em sua

infacircncia nem na velhice o deixaraacuterdquo

(D Helder Cacircmara)

7

LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS

Porcentual

CFDA Diacetato de carboxifluoresceiacutena

CTC Clortetraciclina

DNA Aacutecido desoxirribonucleico

FITC-PNA Fluorescein isothiocyanate-conjugated aglutin

GSH Glutationa reduzida

GPx Gutationa peroxidase

GSSG Glutationa oxidada

H2O2 Peroacutexido de hidrogecircnio

IA Inseminaccedilatildeo artificial

iAC Integridade do acrossoma

iMP Integridade de membrana plasmaacutetica

JC-1 55‟66‟-tetracloro-11‟33‟-tetraetilbenzimidazolil-carbocianine iodide

M Molar

MP Motilidade progressiva

O2 oxigecircnio molecular

OH˙ Radical hidroxila

IP Iodeto de propiacutedeo

PMM Potencial de membrana mitocondrial

PNA Arachis hypogaea agglutinin

PSA Pisum sativum agglutinin

RNA Aacutecido ribonucleacuteico

ROS Espeacutecies reativas ao oxigecircnio

SOD Superoacutexido dismutase

Tris Tris (hidroximetil) aminometano

8

LISTA DE TABELAS

Paacutegina

Tabela 1 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-

105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

54

Tabela 2 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC

(T36h)

55

Tabela 3 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-

105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

56

Tabela 4 ndash

Tabela 5 ndash

Tabela 6 ndash

Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-

105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana

mitocondrial () de espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-

Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou

Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC

(T36h)

Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen

de equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de

substacircncias antioxidantes

57

58

59

9

Tabela 1 - Valores meacutedios de motilidade total vigor

alto porcentual de

membrana

mitocondrial

(aPMM) integridade

de membrana (IM) e

integridade de

acrossoma de

espermatozoides

equinos apoacutes a

refrigeraccedilatildeo com e

sem adiccedilatildeo de

substacircncias

antioxidantes

54

Tabela 2 - Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre

variaacuteveis do secircmen de equinos antes e apoacutes

a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de

substacircncias

antioxidantes

55

Tabela 3 - Valores com a meacutedia geral e o desvio

padratildeo da motilidade total em funccedilatildeo dos

tempos avaliados (T0 T12h T24h e T36h)

para cada grupo

testado

57

10

LISTA DE FIGURAS

Paacutegina

Figura 1 - Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em

funccedilatildeo dos tempos avaliados dos paracircmetros de

motilidade vigor integridade de membrana (IM)

integridade de acrossoma (IAC) e alto potencial de

membrana mitocondrial (APMM) de espermatozoides

equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo adicionados ou natildeo

com diferentes antioxidantes

60

11

RESUMO

Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios estudos

vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores da preservaccedilatildeo e

manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua deposiccedilatildeo no

trato reprodutivo da fecircmea O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito dos diluentes

(Botu-Secircmenreg e ACP-105reg) e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos refrigerados Foram utilizados

quatro reprodutores da raccedila Mangalarga Marchador os quais foram submetidos a

colheitas de secircmen com vagina artificial e uma fecircmea como manequim Apoacutes colheita

as amostras de secircmen de cada garanhatildeo foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg A seguir a fraccedilatildeo de cada diluidor foi fracionada para constituir os grupos

experimentais G1 = Botu-Secircmenreg (sem antioxidante) G2 = ACP-105reg (sem

antioxidante) G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg +

5U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg

+ 5mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen do tipo Botutainerreg As amostras de secircmen foram

submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total vigor integridade de membrana

integridade de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial imediatamente apoacutes a

chegada ao Laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0) assim como apoacutes 12 (T12h)

24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC

Palavras-chave ACP-105reg Botu-Secircmenreg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

12

ABSTRACT

In equine chilled semen is the most used in the IAs Therefore several studies have

been conducted in order to obtain better results in preserving and maintaining the

viability of sperm cells until the time of his deposition in the female reproductive tract

The objective was to study the effect of diluents (Botu-Semen reg and ACP-105 reg) and

the addition of the antioxidants cysteine and glutathione peroxidase in the viability of

equine spermatozoa cooled We used four players Mangalarga Marchador which were

subjected to semen collection with an artificial vagina and as a female mannequin After

harvest samples of semen from each stallion were evaluated and diluted semen-Botu reg

or ACP-105 reg Then the fraction of each extender was fractionated to form the

experimental groups G1 = Botu reg-Semen (no antioxidant) G2 = ACP-105 reg (without

antioxidant) G3 = Botu-Semen reg + 5U of Glutathione Peroxidase G4 = ACP-105 reg +

5U of Glutathione Peroxidase = G5-Botu Semen reg + 5mM cysteine G6 = ACP-105 reg

+ 5mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5U of Glutathione Peroxidase + + and 5 mM

Cysteine G8 = ACP-105 reg + 5U of Glutathione Peroxidase + 5mM cysteine Samples

from each experimental group were placed in triplicate in two boxes of cooling (14 deg C)

semen type Botutainer reg Semen samples were assessed as total motility vigor

membrane integrity acrosome integrity and mitochondrial membrane potential

immediately after arrival at the laboratory making the time zero (T0) and after 12

(T12h) 24 (T24h) and 36 hours (T36h) cooled to 14 oC

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

13

SUMAacuteRIO

Paacutegina

AGRADECIMENTOS

LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

RESUMO

ABSTRACT

1 INTRODUCcedilAtildeO 14

2 REVISAtildeO DE LITERATURA 16

21 Espermatozoacuteides 16

22 Plasma seminal 16

23 Preservaccedilatildeo do secircmen por refrigeraccedilatildeo 17

24 Fatores que afetam a viabilidade do secircmen equumlino refrigerado 18

25 Diluente para secircmen 19

26 Espeacutecies reativas de oxigecircnio e Antioxidantes

261 Glutationa peroxidase (GPx)

262 Cisteiacutena

27 Meacutetodos de avaliaccedilatildeo do secircmen equino com sondas fluorescentes

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio

(IP)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

273 Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin

(FITC-PNA)

3 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

4 EXPERIMENTO

21

22

23

24

25

25

26

28

34

41 Efeito do diluente e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa

peroxidase e cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos

refrigerados

35

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 61

14

1 INTRODUCcedilAtildeO

A inseminaccedilatildeo artificial (IA) em equumlinos eacute uma teacutecnica bastante desenvolvida e vem

sendo usada com grande frequumlecircncia nesta espeacutecie Esta bioteacutecnica tambeacutem eacute muito

utilizada em outras espeacutecies de produccedilatildeo como bovinos caprinos ovinos e animais de

companhia como os caninos As principais vantagens do seu uso satildeo reduccedilatildeo no custo

do transporte dos animais que se encontram em diferentes localidades uso de um

ejaculado para mais de uma fecircmea e proteccedilatildeo contra as doenccedilas sexualmente

transmissiacuteveis Esta teacutecnica eacute relativamente simples e implica na obtenccedilatildeo preacutevia do

secircmen para posterior uso in natura refrigerado ou congelado

Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios

estudos vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores quanto agrave

preservaccedilatildeo e manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua

deposiccedilatildeo no trato reprodutivo da fecircmea Como a refrigeraccedilatildeo trata-se de um processo

de criopreservaccedilatildeo faz-se necessaacuterio a adiccedilatildeo do diluente ao secircmen cuja funccedilatildeo eacute

aumentar o volume do ejaculado e proteger as ceacutelulas espermaacuteticas dos efeitos

deleteacuterios da criopreservaccedilatildeo (PENtildeA 2000)

As propriedades protetoras do diluente satildeo atribuiacutedas aos seus diferentes

componentes agrave interaccedilatildeo com as ceacutelulas espermaacuteticas de uma determinada espeacutecie e ao

indiviacuteduo (CUNHA e LOPES 2003) O diluente mais utilizado na espeacutecie equina satildeo

aqueles agrave base de leite desnatado com disponibilidade comercial de vaacuterios produtos

Com o advento da busca por produtos que natildeo sejam de origem animal a aacutegua

de coco tem se mostrado uma boa alternativa com accedilatildeo beneacutefica sobre a conservaccedilatildeo

celular Todavia existem poucos estudos utilizando este diluente em amostras de secircmen

na espeacutecie equina Na apresentaccedilatildeo em poacute semelhante aos diluentes convencionais

disponiacuteveis no mercado a aacutegua de coco (ACP-105) eacute obtida por um processo de alta

desidrataccedilatildeo a vaacutecuo e proporciona as mesmas vantagens quanto ao transporte e

acondicionamento assim como a praticidade dos diluentes comerciais de origem animal

(SOBREIRA NETO 2008)

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas que vivem em ambiente com condiccedilotildees

aeroacutebicas mas o metabolismo bioloacutegico oxidativo das moleacuteculas eacute potencialmente

toacutexico devido agrave formaccedilatildeo de espeacutecies reativas do oxigecircnio conhecidas como ROS

(BOUNHER et al 2000) As ROS incluem um grande nuacutemero de moleacuteculas

15

quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o

radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso

algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees

normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos

espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados

avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas

substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies

Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente

para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa

peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado

tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-

Secircmenreg)

16

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

21 Espermatozoacuteides

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam

revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios

proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica

esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se

encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA

(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de

parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo

onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de

fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da

zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da

cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em

forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula

(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na

peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute

envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide

(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)

22 Plasma Seminal

Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees

espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros

componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as

proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo

fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e

a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al

1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)

As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa

dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias

17

antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como

vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000

ALMEIDA e BALL 2005)

Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como

aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos

imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias

quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)

Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem

entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al

1996)

A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das

substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que

a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta

com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)

Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em

relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e

HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)

Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos

comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma

deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que

corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua

viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave

criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica

(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de

criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do

ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do

plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos

componentes celulares (BRINSKO et al 2000)

23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo

As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo

reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu

armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A

18

refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves

ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais

elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina

(ENGLAND e PONZIO 1996)

A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste

em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente

controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na

reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)

A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que

proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de

temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da

temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)

Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de

secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg

II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo

elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo

mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais

resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-

Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento

maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o

armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas

(SOBREIRA NETO 2008)

Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de

no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen

for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis

por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado

satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e

ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)

24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado

De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da

temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos

aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de

19

refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o

espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica

apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em

constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO

1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel

e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por

conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo

devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)

Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os

espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em

enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos

reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e

AMANN 1992)

Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram

que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas

moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol

manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)

recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas

decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no

intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas

Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo

de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT

1993)

25 Diluentes para Secircmen Equino

Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado

visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os

espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra

proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os

produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema

enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)

Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada

poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e

20

principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de

proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e

Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica

tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios

na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios

presentes no plasma

Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os

carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico

(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar

em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma

presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-

albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia

dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)

Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em

todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos

(AMMAN e PICKETT 1987)

Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de

coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis

com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e

gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes

necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm

sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando

resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)

ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos

(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES

e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos

espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade

total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito

positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie

(SILVEIRA NETO 2008)

21

26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes

O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade

fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo

A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo

Maxwell e Stojanov (1996)

Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de

ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides

(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de

motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e

extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)

O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa

antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS

principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase

glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de

defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por

sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias

ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)

Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do

agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo

jaacute ocorrida

Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute

limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido

danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila

intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos

protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo

espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios

espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)

Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo

in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios

estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando

substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)

22

261 Glutationa peroxidase (GPx)

Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa

peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa

a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)

A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute

presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de

forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de

proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns

problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais

as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser

bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas

relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As

ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a

exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das

membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de

defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente

em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)

Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em

1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias

A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das

concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da

accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al

2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2

e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em

GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)

A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada

quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta

enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao

restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem

disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos

mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de

DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA

e GUERRA 2007)

23

Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx

3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao

espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2

e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel

pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da

GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da

condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima

tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na

espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide

maduro (MAIA 2003)

262 Cisteiacutena

A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol

com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas

eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante

(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na

prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)

Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na

proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em

experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem

demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente

antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)

Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena

em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos

sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen

No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de

cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a

sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram

diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e

obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen

descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM

de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas

em javalis

24

Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na

proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da

membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a

glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios

com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos

27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes

A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante

A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave

concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de

contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que

apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981

CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um

meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da

maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto

com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de

avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen

Analyses)

Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo

de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e

nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da

integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia

a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de

comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-

se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se

obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz

visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)

Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o

maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em

comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com

a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na

25

estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica

emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com

maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada

devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)

A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de

viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e

IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de

fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)

O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem

interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo

e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana

espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando

expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana

integra (GARNER e JONHSON 1995)

O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este

composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se

observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON

e VICKER 1990)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas

Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela

produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o

movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a

mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular

A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada

em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999

Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser

utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta

espeacutecie

26

O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de

membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui

baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a

detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia

(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros

conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com

elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode

formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo

assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo

(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na

faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com

comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)

Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de

membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no

interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)

273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)

O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel

quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud

OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que

conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o

acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do

amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se

ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a

associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em

suas avaliaccedilotildees de acrossoma

A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia

permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol

ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e

pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a

barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a

fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa

caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A

27

colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da

membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo

sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana

plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas

ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001

RAITHI et al 2001)

28

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4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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infertile men Urology v 55 n 6 p 922-926 2000

54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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1

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO

PROacute-REITORIA DE PESQUISA E POacuteS-GRADUACcedilAtildeO

PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIA VETERINAacuteRIA

VICTOR NETTO MAIA

EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SEcircMENreg E ACP-105reg) E DA

ADICcedilAtildeO DE ANTIOXIDANTES (GLUTATIONA PEROXIDASE E

CISTEIacuteNA) NA VIABILIDADE DE ESPERMATOZOIDES

REFRIGERADOS DE EQUINOS

Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo

em Ciecircncia Veterinaacuteria do Departamento de Medicina

Veterinaacuteria da Universidade Federal Rural de

Pernambuco como requisito parcial para a obtenccedilatildeo do

grau de Mestre em Ciecircncia Veterinaacuteria

Orientadora Profordf Drordf Maria Madalena Pessoa Guerra

Co-orientador Profordm Drordm Gustavo Ferrer Carneiro

RECIFE - PE

2010

2

Ficha catalograacutefica

M217e Maia Victor Netto Efeito do diluente (Botu-secircmen reg e ACP reg) e da adiccedilatildeo de antioxidante (glutationa peroxidase e cisteiacutena) na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerado de equumlinos Victor Netto Maia ndash 2010 61 p il Orientadora Maria Madalena Pessoa Guerra Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncia Veterinaacuteria) ndash Universidade Federal Rural de Pernambuco Departamento de Medicina Veterinaacuteria Recife 2010 Referecircncias 1 Antioxidantes 2 Secircmen 3Glutationa peroxidase 4 Equumlino 5 Cisteiacutena 6 Secircmen refrigerado I Guerra Maria Madalena Pessoa orientadora II Tiacutetulo CDD 63608926

3

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO

PROacute-REITORIA DE PESQUISA E POacuteS-GRADUACcedilAtildeO

PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIA VETERINAacuteRIA

EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SEcircMENreg E ACP-105reg) E DA

ADICcedilAtildeO DE ANTIOXIDANTES (GLUTATIONA PEROXIDASE E

CISTEIacuteNA) NA VIABILIDADE DE ESPERMATOZOIDES

REFRIGERADOS DE EQUINOS

Dissertaccedilatildeo de Mestrado elaborada e defendida por

VICTOR NETTO MAIA

Aprovada em 30 de agosto de 2010

BANCA EXAMINADORA

Profordf Drordf Maria Madalena Pessoa GuerraUFRPE

Orientadora

Profa Dra Eacuterika Christina Santos OliveiraUFRPE

Prof Dr Karen Mascaro Gonccedilalves da Silva

Dra Zoraide Fernandes Coleto (suplente)

4

A Deus a toda minha famiacutelia e amigos em especial meu

pai minha matildee e minha esposa Todos que formam o

ANDROLAB e minha orientadora a professora

Madalena por terem acreditado confiado e me ajudado

incondicionalmente

Dedico

5

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus por ter me concedido o dom da vida a oportunidade e o

privileacutegio do estudo Pelas inuacutemeras becircnccedilatildeos a mim concedidas diariamente e aos

vaacuterios ldquoanjosrdquo que ELE coloca e colocou junto de mim em toda a minha caminhada

A toda minha famiacutelia em especial meu pai Mauriacutecio e minha matildee Dolores

que sempre me apoiaram e nunca mediram esforccedilos para me ajudar a realizar todos os

meus sonhos inclusive por muitas vezes abrindo matildeo de seus proacuteprios sonhos em

funccedilatildeo dos meus Aos meus irmatildeos Daniel e Juliana e aos meus cunhados que com

toda certeza estatildeo sempre torcendo por mim

A Karinna minha esposa amiga companheira e agora matildee de meu mais novo

amor Mariah Que sempre me deu forccedilas para conseguir ir em frente

Ao vaacuterios professores que contribuiacuteram na minha formaccedilatildeo os quais jamais

esquecerei

Aos meus amigos e soacutecios no Centro de Equinos de Pernambuco-CEPE

Eduardo Andrade Lima Oswaldo Gomes Neto e tambeacutem ao meu co-orientador Prof

Dr Gustavo Ferrer Carneiro pela amizade confianccedila respeito e apoio

Agrave professora e orientadora Maria Madalena Pessoa Guerra com a qual tenho

aprendido e me surpreendido cada vez mais Aleacutem dos conhecimentos cientiacuteficos ela

tornou-se para mim um exemplo de profissional e de ser humano capaz de se

desprender de si em prol do proacuteximo Professora MEU MUITO OBRIGADO

Aos teacutecnicos e funcionaacuterios Alcir Joana Dordf Sonia e Marquinhos pelo carinho

e atenccedilatildeo

Aos companheiros do ANDROLAB Adriana Aacutelvaro Clara Diogo Filipe

Moraes Kaline Lawrence Liacutegia Pedro Profordf Eacuterica e em especial Sildivane que eacute

meu anjo da guarda a Ellen que sempre se preocupou em me ajudar a Andreacute Mariano

(bdquoO Corruptordquo) pela amizade e paciecircncia e a Felipe Costa que foi meu parceiro

fundamental no experimento A todos devo minha eterna gratidatildeo

A todos que formam o Haras Vida Boa ldquopalcordquo deste experimento

Agrave equipe da ACP Biotecnologia em especial ao professor Dr Joseacute Ferreira

Nunes e a Cristiane Salgueiro pelo apoio e fornecimento do ACP-105

6

ldquoO caminho no qual a crianccedila siga e conheccedila em sua

infacircncia nem na velhice o deixaraacuterdquo

(D Helder Cacircmara)

7

LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS

Porcentual

CFDA Diacetato de carboxifluoresceiacutena

CTC Clortetraciclina

DNA Aacutecido desoxirribonucleico

FITC-PNA Fluorescein isothiocyanate-conjugated aglutin

GSH Glutationa reduzida

GPx Gutationa peroxidase

GSSG Glutationa oxidada

H2O2 Peroacutexido de hidrogecircnio

IA Inseminaccedilatildeo artificial

iAC Integridade do acrossoma

iMP Integridade de membrana plasmaacutetica

JC-1 55‟66‟-tetracloro-11‟33‟-tetraetilbenzimidazolil-carbocianine iodide

M Molar

MP Motilidade progressiva

O2 oxigecircnio molecular

OH˙ Radical hidroxila

IP Iodeto de propiacutedeo

PMM Potencial de membrana mitocondrial

PNA Arachis hypogaea agglutinin

PSA Pisum sativum agglutinin

RNA Aacutecido ribonucleacuteico

ROS Espeacutecies reativas ao oxigecircnio

SOD Superoacutexido dismutase

Tris Tris (hidroximetil) aminometano

8

LISTA DE TABELAS

Paacutegina

Tabela 1 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-

105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

54

Tabela 2 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC

(T36h)

55

Tabela 3 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-

105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

56

Tabela 4 ndash

Tabela 5 ndash

Tabela 6 ndash

Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-

105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana

mitocondrial () de espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-

Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou

Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC

(T36h)

Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen

de equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de

substacircncias antioxidantes

57

58

59

9

Tabela 1 - Valores meacutedios de motilidade total vigor

alto porcentual de

membrana

mitocondrial

(aPMM) integridade

de membrana (IM) e

integridade de

acrossoma de

espermatozoides

equinos apoacutes a

refrigeraccedilatildeo com e

sem adiccedilatildeo de

substacircncias

antioxidantes

54

Tabela 2 - Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre

variaacuteveis do secircmen de equinos antes e apoacutes

a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de

substacircncias

antioxidantes

55

Tabela 3 - Valores com a meacutedia geral e o desvio

padratildeo da motilidade total em funccedilatildeo dos

tempos avaliados (T0 T12h T24h e T36h)

para cada grupo

testado

57

10

LISTA DE FIGURAS

Paacutegina

Figura 1 - Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em

funccedilatildeo dos tempos avaliados dos paracircmetros de

motilidade vigor integridade de membrana (IM)

integridade de acrossoma (IAC) e alto potencial de

membrana mitocondrial (APMM) de espermatozoides

equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo adicionados ou natildeo

com diferentes antioxidantes

60

11

RESUMO

Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios estudos

vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores da preservaccedilatildeo e

manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua deposiccedilatildeo no

trato reprodutivo da fecircmea O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito dos diluentes

(Botu-Secircmenreg e ACP-105reg) e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos refrigerados Foram utilizados

quatro reprodutores da raccedila Mangalarga Marchador os quais foram submetidos a

colheitas de secircmen com vagina artificial e uma fecircmea como manequim Apoacutes colheita

as amostras de secircmen de cada garanhatildeo foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg A seguir a fraccedilatildeo de cada diluidor foi fracionada para constituir os grupos

experimentais G1 = Botu-Secircmenreg (sem antioxidante) G2 = ACP-105reg (sem

antioxidante) G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg +

5U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg

+ 5mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen do tipo Botutainerreg As amostras de secircmen foram

submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total vigor integridade de membrana

integridade de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial imediatamente apoacutes a

chegada ao Laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0) assim como apoacutes 12 (T12h)

24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC

Palavras-chave ACP-105reg Botu-Secircmenreg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

12

ABSTRACT

In equine chilled semen is the most used in the IAs Therefore several studies have

been conducted in order to obtain better results in preserving and maintaining the

viability of sperm cells until the time of his deposition in the female reproductive tract

The objective was to study the effect of diluents (Botu-Semen reg and ACP-105 reg) and

the addition of the antioxidants cysteine and glutathione peroxidase in the viability of

equine spermatozoa cooled We used four players Mangalarga Marchador which were

subjected to semen collection with an artificial vagina and as a female mannequin After

harvest samples of semen from each stallion were evaluated and diluted semen-Botu reg

or ACP-105 reg Then the fraction of each extender was fractionated to form the

experimental groups G1 = Botu reg-Semen (no antioxidant) G2 = ACP-105 reg (without

antioxidant) G3 = Botu-Semen reg + 5U of Glutathione Peroxidase G4 = ACP-105 reg +

5U of Glutathione Peroxidase = G5-Botu Semen reg + 5mM cysteine G6 = ACP-105 reg

+ 5mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5U of Glutathione Peroxidase + + and 5 mM

Cysteine G8 = ACP-105 reg + 5U of Glutathione Peroxidase + 5mM cysteine Samples

from each experimental group were placed in triplicate in two boxes of cooling (14 deg C)

semen type Botutainer reg Semen samples were assessed as total motility vigor

membrane integrity acrosome integrity and mitochondrial membrane potential

immediately after arrival at the laboratory making the time zero (T0) and after 12

(T12h) 24 (T24h) and 36 hours (T36h) cooled to 14 oC

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

13

SUMAacuteRIO

Paacutegina

AGRADECIMENTOS

LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

RESUMO

ABSTRACT

1 INTRODUCcedilAtildeO 14

2 REVISAtildeO DE LITERATURA 16

21 Espermatozoacuteides 16

22 Plasma seminal 16

23 Preservaccedilatildeo do secircmen por refrigeraccedilatildeo 17

24 Fatores que afetam a viabilidade do secircmen equumlino refrigerado 18

25 Diluente para secircmen 19

26 Espeacutecies reativas de oxigecircnio e Antioxidantes

261 Glutationa peroxidase (GPx)

262 Cisteiacutena

27 Meacutetodos de avaliaccedilatildeo do secircmen equino com sondas fluorescentes

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio

(IP)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

273 Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin

(FITC-PNA)

3 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

4 EXPERIMENTO

21

22

23

24

25

25

26

28

34

41 Efeito do diluente e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa

peroxidase e cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos

refrigerados

35

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 61

14

1 INTRODUCcedilAtildeO

A inseminaccedilatildeo artificial (IA) em equumlinos eacute uma teacutecnica bastante desenvolvida e vem

sendo usada com grande frequumlecircncia nesta espeacutecie Esta bioteacutecnica tambeacutem eacute muito

utilizada em outras espeacutecies de produccedilatildeo como bovinos caprinos ovinos e animais de

companhia como os caninos As principais vantagens do seu uso satildeo reduccedilatildeo no custo

do transporte dos animais que se encontram em diferentes localidades uso de um

ejaculado para mais de uma fecircmea e proteccedilatildeo contra as doenccedilas sexualmente

transmissiacuteveis Esta teacutecnica eacute relativamente simples e implica na obtenccedilatildeo preacutevia do

secircmen para posterior uso in natura refrigerado ou congelado

Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios

estudos vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores quanto agrave

preservaccedilatildeo e manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua

deposiccedilatildeo no trato reprodutivo da fecircmea Como a refrigeraccedilatildeo trata-se de um processo

de criopreservaccedilatildeo faz-se necessaacuterio a adiccedilatildeo do diluente ao secircmen cuja funccedilatildeo eacute

aumentar o volume do ejaculado e proteger as ceacutelulas espermaacuteticas dos efeitos

deleteacuterios da criopreservaccedilatildeo (PENtildeA 2000)

As propriedades protetoras do diluente satildeo atribuiacutedas aos seus diferentes

componentes agrave interaccedilatildeo com as ceacutelulas espermaacuteticas de uma determinada espeacutecie e ao

indiviacuteduo (CUNHA e LOPES 2003) O diluente mais utilizado na espeacutecie equina satildeo

aqueles agrave base de leite desnatado com disponibilidade comercial de vaacuterios produtos

Com o advento da busca por produtos que natildeo sejam de origem animal a aacutegua

de coco tem se mostrado uma boa alternativa com accedilatildeo beneacutefica sobre a conservaccedilatildeo

celular Todavia existem poucos estudos utilizando este diluente em amostras de secircmen

na espeacutecie equina Na apresentaccedilatildeo em poacute semelhante aos diluentes convencionais

disponiacuteveis no mercado a aacutegua de coco (ACP-105) eacute obtida por um processo de alta

desidrataccedilatildeo a vaacutecuo e proporciona as mesmas vantagens quanto ao transporte e

acondicionamento assim como a praticidade dos diluentes comerciais de origem animal

(SOBREIRA NETO 2008)

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas que vivem em ambiente com condiccedilotildees

aeroacutebicas mas o metabolismo bioloacutegico oxidativo das moleacuteculas eacute potencialmente

toacutexico devido agrave formaccedilatildeo de espeacutecies reativas do oxigecircnio conhecidas como ROS

(BOUNHER et al 2000) As ROS incluem um grande nuacutemero de moleacuteculas

15

quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o

radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso

algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees

normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos

espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados

avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas

substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies

Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente

para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa

peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado

tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-

Secircmenreg)

16

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

21 Espermatozoacuteides

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam

revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios

proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica

esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se

encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA

(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de

parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo

onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de

fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da

zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da

cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em

forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula

(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na

peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute

envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide

(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)

22 Plasma Seminal

Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees

espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros

componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as

proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo

fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e

a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al

1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)

As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa

dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias

17

antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como

vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000

ALMEIDA e BALL 2005)

Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como

aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos

imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias

quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)

Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem

entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al

1996)

A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das

substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que

a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta

com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)

Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em

relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e

HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)

Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos

comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma

deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que

corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua

viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave

criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica

(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de

criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do

ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do

plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos

componentes celulares (BRINSKO et al 2000)

23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo

As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo

reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu

armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A

18

refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves

ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais

elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina

(ENGLAND e PONZIO 1996)

A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste

em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente

controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na

reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)

A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que

proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de

temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da

temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)

Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de

secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg

II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo

elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo

mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais

resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-

Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento

maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o

armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas

(SOBREIRA NETO 2008)

Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de

no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen

for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis

por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado

satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e

ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)

24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado

De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da

temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos

aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de

19

refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o

espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica

apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em

constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO

1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel

e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por

conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo

devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)

Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os

espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em

enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos

reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e

AMANN 1992)

Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram

que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas

moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol

manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)

recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas

decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no

intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas

Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo

de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT

1993)

25 Diluentes para Secircmen Equino

Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado

visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os

espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra

proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os

produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema

enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)

Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada

poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e

20

principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de

proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e

Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica

tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios

na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios

presentes no plasma

Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os

carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico

(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar

em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma

presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-

albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia

dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)

Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em

todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos

(AMMAN e PICKETT 1987)

Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de

coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis

com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e

gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes

necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm

sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando

resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)

ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos

(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES

e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos

espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade

total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito

positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie

(SILVEIRA NETO 2008)

21

26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes

O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade

fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo

A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo

Maxwell e Stojanov (1996)

Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de

ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides

(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de

motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e

extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)

O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa

antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS

principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase

glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de

defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por

sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias

ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)

Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do

agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo

jaacute ocorrida

Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute

limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido

danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila

intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos

protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo

espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios

espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)

Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo

in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios

estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando

substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)

22

261 Glutationa peroxidase (GPx)

Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa

peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa

a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)

A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute

presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de

forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de

proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns

problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais

as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser

bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas

relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As

ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a

exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das

membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de

defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente

em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)

Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em

1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias

A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das

concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da

accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al

2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2

e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em

GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)

A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada

quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta

enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao

restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem

disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos

mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de

DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA

e GUERRA 2007)

23

Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx

3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao

espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2

e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel

pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da

GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da

condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima

tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na

espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide

maduro (MAIA 2003)

262 Cisteiacutena

A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol

com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas

eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante

(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na

prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)

Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na

proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em

experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem

demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente

antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)

Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena

em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos

sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen

No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de

cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a

sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram

diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e

obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen

descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM

de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas

em javalis

24

Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na

proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da

membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a

glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios

com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos

27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes

A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante

A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave

concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de

contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que

apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981

CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um

meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da

maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto

com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de

avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen

Analyses)

Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo

de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e

nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da

integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia

a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de

comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-

se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se

obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz

visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)

Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o

maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em

comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com

a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na

25

estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica

emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com

maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada

devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)

A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de

viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e

IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de

fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)

O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem

interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo

e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana

espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando

expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana

integra (GARNER e JONHSON 1995)

O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este

composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se

observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON

e VICKER 1990)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas

Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela

produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o

movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a

mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular

A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada

em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999

Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser

utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta

espeacutecie

26

O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de

membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui

baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a

detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia

(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros

conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com

elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode

formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo

assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo

(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na

faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com

comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)

Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de

membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no

interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)

273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)

O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel

quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud

OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que

conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o

acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do

amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se

ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a

associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em

suas avaliaccedilotildees de acrossoma

A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia

permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol

ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e

pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a

barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a

fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa

caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A

27

colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da

membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo

sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana

plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas

ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001

RAITHI et al 2001)

28

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Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia v 51 p 505-514 1999

Van OVERVELD FWPC HAENEN GRMM RHEMREV J et al Tyrosine as

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Biological Interactions v 127 p 151-161 2000

WATSON PF The causes of reduced fertility of cryiopreserved semen Animal

Reproduction Science v 60-61 n 2 p 481-492 2000

33

ZEGINIADOU T PAPADIMAS J MANTALENAKIS S Acrosome reaction

methods for detection and clinical significance Andrologia v 32 n 9 p 335-343

2000

ZINI A GARRELS K PHANG D Antioxidant activity in the semen of fertile and

infertile men Urology v 55 n 6 p 922-926 2000

34

4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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1

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO

PROacute-REITORIA DE PESQUISA E POacuteS-GRADUACcedilAtildeO

PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIA VETERINAacuteRIA

VICTOR NETTO MAIA

EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SEcircMENreg E ACP-105reg) E DA

ADICcedilAtildeO DE ANTIOXIDANTES (GLUTATIONA PEROXIDASE E

CISTEIacuteNA) NA VIABILIDADE DE ESPERMATOZOIDES

REFRIGERADOS DE EQUINOS

Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo

em Ciecircncia Veterinaacuteria do Departamento de Medicina

Veterinaacuteria da Universidade Federal Rural de

Pernambuco como requisito parcial para a obtenccedilatildeo do

grau de Mestre em Ciecircncia Veterinaacuteria

Orientadora Profordf Drordf Maria Madalena Pessoa Guerra

Co-orientador Profordm Drordm Gustavo Ferrer Carneiro

RECIFE - PE

2010

2

Ficha catalograacutefica

M217e Maia Victor Netto Efeito do diluente (Botu-secircmen reg e ACP reg) e da adiccedilatildeo de antioxidante (glutationa peroxidase e cisteiacutena) na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerado de equumlinos Victor Netto Maia ndash 2010 61 p il Orientadora Maria Madalena Pessoa Guerra Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncia Veterinaacuteria) ndash Universidade Federal Rural de Pernambuco Departamento de Medicina Veterinaacuteria Recife 2010 Referecircncias 1 Antioxidantes 2 Secircmen 3Glutationa peroxidase 4 Equumlino 5 Cisteiacutena 6 Secircmen refrigerado I Guerra Maria Madalena Pessoa orientadora II Tiacutetulo CDD 63608926

3

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO

PROacute-REITORIA DE PESQUISA E POacuteS-GRADUACcedilAtildeO

PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIA VETERINAacuteRIA

EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SEcircMENreg E ACP-105reg) E DA

ADICcedilAtildeO DE ANTIOXIDANTES (GLUTATIONA PEROXIDASE E

CISTEIacuteNA) NA VIABILIDADE DE ESPERMATOZOIDES

REFRIGERADOS DE EQUINOS

Dissertaccedilatildeo de Mestrado elaborada e defendida por

VICTOR NETTO MAIA

Aprovada em 30 de agosto de 2010

BANCA EXAMINADORA

Profordf Drordf Maria Madalena Pessoa GuerraUFRPE

Orientadora

Profa Dra Eacuterika Christina Santos OliveiraUFRPE

Prof Dr Karen Mascaro Gonccedilalves da Silva

Dra Zoraide Fernandes Coleto (suplente)

4

A Deus a toda minha famiacutelia e amigos em especial meu

pai minha matildee e minha esposa Todos que formam o

ANDROLAB e minha orientadora a professora

Madalena por terem acreditado confiado e me ajudado

incondicionalmente

Dedico

5

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus por ter me concedido o dom da vida a oportunidade e o

privileacutegio do estudo Pelas inuacutemeras becircnccedilatildeos a mim concedidas diariamente e aos

vaacuterios ldquoanjosrdquo que ELE coloca e colocou junto de mim em toda a minha caminhada

A toda minha famiacutelia em especial meu pai Mauriacutecio e minha matildee Dolores

que sempre me apoiaram e nunca mediram esforccedilos para me ajudar a realizar todos os

meus sonhos inclusive por muitas vezes abrindo matildeo de seus proacuteprios sonhos em

funccedilatildeo dos meus Aos meus irmatildeos Daniel e Juliana e aos meus cunhados que com

toda certeza estatildeo sempre torcendo por mim

A Karinna minha esposa amiga companheira e agora matildee de meu mais novo

amor Mariah Que sempre me deu forccedilas para conseguir ir em frente

Ao vaacuterios professores que contribuiacuteram na minha formaccedilatildeo os quais jamais

esquecerei

Aos meus amigos e soacutecios no Centro de Equinos de Pernambuco-CEPE

Eduardo Andrade Lima Oswaldo Gomes Neto e tambeacutem ao meu co-orientador Prof

Dr Gustavo Ferrer Carneiro pela amizade confianccedila respeito e apoio

Agrave professora e orientadora Maria Madalena Pessoa Guerra com a qual tenho

aprendido e me surpreendido cada vez mais Aleacutem dos conhecimentos cientiacuteficos ela

tornou-se para mim um exemplo de profissional e de ser humano capaz de se

desprender de si em prol do proacuteximo Professora MEU MUITO OBRIGADO

Aos teacutecnicos e funcionaacuterios Alcir Joana Dordf Sonia e Marquinhos pelo carinho

e atenccedilatildeo

Aos companheiros do ANDROLAB Adriana Aacutelvaro Clara Diogo Filipe

Moraes Kaline Lawrence Liacutegia Pedro Profordf Eacuterica e em especial Sildivane que eacute

meu anjo da guarda a Ellen que sempre se preocupou em me ajudar a Andreacute Mariano

(bdquoO Corruptordquo) pela amizade e paciecircncia e a Felipe Costa que foi meu parceiro

fundamental no experimento A todos devo minha eterna gratidatildeo

A todos que formam o Haras Vida Boa ldquopalcordquo deste experimento

Agrave equipe da ACP Biotecnologia em especial ao professor Dr Joseacute Ferreira

Nunes e a Cristiane Salgueiro pelo apoio e fornecimento do ACP-105

6

ldquoO caminho no qual a crianccedila siga e conheccedila em sua

infacircncia nem na velhice o deixaraacuterdquo

(D Helder Cacircmara)

7

LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS

Porcentual

CFDA Diacetato de carboxifluoresceiacutena

CTC Clortetraciclina

DNA Aacutecido desoxirribonucleico

FITC-PNA Fluorescein isothiocyanate-conjugated aglutin

GSH Glutationa reduzida

GPx Gutationa peroxidase

GSSG Glutationa oxidada

H2O2 Peroacutexido de hidrogecircnio

IA Inseminaccedilatildeo artificial

iAC Integridade do acrossoma

iMP Integridade de membrana plasmaacutetica

JC-1 55‟66‟-tetracloro-11‟33‟-tetraetilbenzimidazolil-carbocianine iodide

M Molar

MP Motilidade progressiva

O2 oxigecircnio molecular

OH˙ Radical hidroxila

IP Iodeto de propiacutedeo

PMM Potencial de membrana mitocondrial

PNA Arachis hypogaea agglutinin

PSA Pisum sativum agglutinin

RNA Aacutecido ribonucleacuteico

ROS Espeacutecies reativas ao oxigecircnio

SOD Superoacutexido dismutase

Tris Tris (hidroximetil) aminometano

8

LISTA DE TABELAS

Paacutegina

Tabela 1 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-

105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

54

Tabela 2 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC

(T36h)

55

Tabela 3 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-

105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

56

Tabela 4 ndash

Tabela 5 ndash

Tabela 6 ndash

Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-

105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana

mitocondrial () de espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-

Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou

Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC

(T36h)

Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen

de equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de

substacircncias antioxidantes

57

58

59

9

Tabela 1 - Valores meacutedios de motilidade total vigor

alto porcentual de

membrana

mitocondrial

(aPMM) integridade

de membrana (IM) e

integridade de

acrossoma de

espermatozoides

equinos apoacutes a

refrigeraccedilatildeo com e

sem adiccedilatildeo de

substacircncias

antioxidantes

54

Tabela 2 - Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre

variaacuteveis do secircmen de equinos antes e apoacutes

a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de

substacircncias

antioxidantes

55

Tabela 3 - Valores com a meacutedia geral e o desvio

padratildeo da motilidade total em funccedilatildeo dos

tempos avaliados (T0 T12h T24h e T36h)

para cada grupo

testado

57

10

LISTA DE FIGURAS

Paacutegina

Figura 1 - Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em

funccedilatildeo dos tempos avaliados dos paracircmetros de

motilidade vigor integridade de membrana (IM)

integridade de acrossoma (IAC) e alto potencial de

membrana mitocondrial (APMM) de espermatozoides

equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo adicionados ou natildeo

com diferentes antioxidantes

60

11

RESUMO

Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios estudos

vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores da preservaccedilatildeo e

manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua deposiccedilatildeo no

trato reprodutivo da fecircmea O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito dos diluentes

(Botu-Secircmenreg e ACP-105reg) e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos refrigerados Foram utilizados

quatro reprodutores da raccedila Mangalarga Marchador os quais foram submetidos a

colheitas de secircmen com vagina artificial e uma fecircmea como manequim Apoacutes colheita

as amostras de secircmen de cada garanhatildeo foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg A seguir a fraccedilatildeo de cada diluidor foi fracionada para constituir os grupos

experimentais G1 = Botu-Secircmenreg (sem antioxidante) G2 = ACP-105reg (sem

antioxidante) G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg +

5U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg

+ 5mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen do tipo Botutainerreg As amostras de secircmen foram

submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total vigor integridade de membrana

integridade de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial imediatamente apoacutes a

chegada ao Laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0) assim como apoacutes 12 (T12h)

24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC

Palavras-chave ACP-105reg Botu-Secircmenreg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

12

ABSTRACT

In equine chilled semen is the most used in the IAs Therefore several studies have

been conducted in order to obtain better results in preserving and maintaining the

viability of sperm cells until the time of his deposition in the female reproductive tract

The objective was to study the effect of diluents (Botu-Semen reg and ACP-105 reg) and

the addition of the antioxidants cysteine and glutathione peroxidase in the viability of

equine spermatozoa cooled We used four players Mangalarga Marchador which were

subjected to semen collection with an artificial vagina and as a female mannequin After

harvest samples of semen from each stallion were evaluated and diluted semen-Botu reg

or ACP-105 reg Then the fraction of each extender was fractionated to form the

experimental groups G1 = Botu reg-Semen (no antioxidant) G2 = ACP-105 reg (without

antioxidant) G3 = Botu-Semen reg + 5U of Glutathione Peroxidase G4 = ACP-105 reg +

5U of Glutathione Peroxidase = G5-Botu Semen reg + 5mM cysteine G6 = ACP-105 reg

+ 5mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5U of Glutathione Peroxidase + + and 5 mM

Cysteine G8 = ACP-105 reg + 5U of Glutathione Peroxidase + 5mM cysteine Samples

from each experimental group were placed in triplicate in two boxes of cooling (14 deg C)

semen type Botutainer reg Semen samples were assessed as total motility vigor

membrane integrity acrosome integrity and mitochondrial membrane potential

immediately after arrival at the laboratory making the time zero (T0) and after 12

(T12h) 24 (T24h) and 36 hours (T36h) cooled to 14 oC

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

13

SUMAacuteRIO

Paacutegina

AGRADECIMENTOS

LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

RESUMO

ABSTRACT

1 INTRODUCcedilAtildeO 14

2 REVISAtildeO DE LITERATURA 16

21 Espermatozoacuteides 16

22 Plasma seminal 16

23 Preservaccedilatildeo do secircmen por refrigeraccedilatildeo 17

24 Fatores que afetam a viabilidade do secircmen equumlino refrigerado 18

25 Diluente para secircmen 19

26 Espeacutecies reativas de oxigecircnio e Antioxidantes

261 Glutationa peroxidase (GPx)

262 Cisteiacutena

27 Meacutetodos de avaliaccedilatildeo do secircmen equino com sondas fluorescentes

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio

(IP)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

273 Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin

(FITC-PNA)

3 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

4 EXPERIMENTO

21

22

23

24

25

25

26

28

34

41 Efeito do diluente e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa

peroxidase e cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos

refrigerados

35

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 61

14

1 INTRODUCcedilAtildeO

A inseminaccedilatildeo artificial (IA) em equumlinos eacute uma teacutecnica bastante desenvolvida e vem

sendo usada com grande frequumlecircncia nesta espeacutecie Esta bioteacutecnica tambeacutem eacute muito

utilizada em outras espeacutecies de produccedilatildeo como bovinos caprinos ovinos e animais de

companhia como os caninos As principais vantagens do seu uso satildeo reduccedilatildeo no custo

do transporte dos animais que se encontram em diferentes localidades uso de um

ejaculado para mais de uma fecircmea e proteccedilatildeo contra as doenccedilas sexualmente

transmissiacuteveis Esta teacutecnica eacute relativamente simples e implica na obtenccedilatildeo preacutevia do

secircmen para posterior uso in natura refrigerado ou congelado

Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios

estudos vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores quanto agrave

preservaccedilatildeo e manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua

deposiccedilatildeo no trato reprodutivo da fecircmea Como a refrigeraccedilatildeo trata-se de um processo

de criopreservaccedilatildeo faz-se necessaacuterio a adiccedilatildeo do diluente ao secircmen cuja funccedilatildeo eacute

aumentar o volume do ejaculado e proteger as ceacutelulas espermaacuteticas dos efeitos

deleteacuterios da criopreservaccedilatildeo (PENtildeA 2000)

As propriedades protetoras do diluente satildeo atribuiacutedas aos seus diferentes

componentes agrave interaccedilatildeo com as ceacutelulas espermaacuteticas de uma determinada espeacutecie e ao

indiviacuteduo (CUNHA e LOPES 2003) O diluente mais utilizado na espeacutecie equina satildeo

aqueles agrave base de leite desnatado com disponibilidade comercial de vaacuterios produtos

Com o advento da busca por produtos que natildeo sejam de origem animal a aacutegua

de coco tem se mostrado uma boa alternativa com accedilatildeo beneacutefica sobre a conservaccedilatildeo

celular Todavia existem poucos estudos utilizando este diluente em amostras de secircmen

na espeacutecie equina Na apresentaccedilatildeo em poacute semelhante aos diluentes convencionais

disponiacuteveis no mercado a aacutegua de coco (ACP-105) eacute obtida por um processo de alta

desidrataccedilatildeo a vaacutecuo e proporciona as mesmas vantagens quanto ao transporte e

acondicionamento assim como a praticidade dos diluentes comerciais de origem animal

(SOBREIRA NETO 2008)

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas que vivem em ambiente com condiccedilotildees

aeroacutebicas mas o metabolismo bioloacutegico oxidativo das moleacuteculas eacute potencialmente

toacutexico devido agrave formaccedilatildeo de espeacutecies reativas do oxigecircnio conhecidas como ROS

(BOUNHER et al 2000) As ROS incluem um grande nuacutemero de moleacuteculas

15

quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o

radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso

algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees

normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos

espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados

avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas

substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies

Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente

para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa

peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado

tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-

Secircmenreg)

16

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

21 Espermatozoacuteides

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam

revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios

proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica

esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se

encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA

(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de

parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo

onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de

fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da

zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da

cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em

forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula

(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na

peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute

envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide

(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)

22 Plasma Seminal

Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees

espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros

componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as

proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo

fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e

a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al

1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)

As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa

dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias

17

antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como

vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000

ALMEIDA e BALL 2005)

Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como

aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos

imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias

quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)

Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem

entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al

1996)

A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das

substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que

a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta

com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)

Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em

relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e

HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)

Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos

comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma

deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que

corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua

viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave

criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica

(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de

criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do

ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do

plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos

componentes celulares (BRINSKO et al 2000)

23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo

As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo

reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu

armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A

18

refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves

ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais

elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina

(ENGLAND e PONZIO 1996)

A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste

em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente

controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na

reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)

A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que

proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de

temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da

temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)

Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de

secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg

II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo

elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo

mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais

resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-

Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento

maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o

armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas

(SOBREIRA NETO 2008)

Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de

no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen

for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis

por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado

satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e

ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)

24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado

De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da

temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos

aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de

19

refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o

espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica

apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em

constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO

1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel

e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por

conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo

devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)

Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os

espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em

enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos

reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e

AMANN 1992)

Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram

que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas

moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol

manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)

recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas

decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no

intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas

Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo

de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT

1993)

25 Diluentes para Secircmen Equino

Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado

visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os

espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra

proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os

produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema

enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)

Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada

poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e

20

principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de

proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e

Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica

tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios

na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios

presentes no plasma

Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os

carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico

(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar

em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma

presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-

albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia

dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)

Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em

todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos

(AMMAN e PICKETT 1987)

Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de

coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis

com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e

gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes

necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm

sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando

resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)

ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos

(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES

e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos

espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade

total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito

positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie

(SILVEIRA NETO 2008)

21

26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes

O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade

fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo

A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo

Maxwell e Stojanov (1996)

Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de

ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides

(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de

motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e

extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)

O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa

antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS

principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase

glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de

defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por

sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias

ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)

Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do

agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo

jaacute ocorrida

Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute

limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido

danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila

intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos

protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo

espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios

espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)

Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo

in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios

estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando

substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)

22

261 Glutationa peroxidase (GPx)

Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa

peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa

a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)

A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute

presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de

forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de

proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns

problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais

as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser

bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas

relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As

ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a

exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das

membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de

defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente

em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)

Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em

1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias

A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das

concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da

accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al

2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2

e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em

GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)

A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada

quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta

enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao

restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem

disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos

mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de

DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA

e GUERRA 2007)

23

Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx

3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao

espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2

e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel

pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da

GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da

condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima

tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na

espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide

maduro (MAIA 2003)

262 Cisteiacutena

A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol

com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas

eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante

(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na

prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)

Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na

proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em

experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem

demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente

antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)

Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena

em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos

sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen

No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de

cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a

sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram

diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e

obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen

descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM

de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas

em javalis

24

Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na

proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da

membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a

glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios

com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos

27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes

A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante

A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave

concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de

contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que

apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981

CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um

meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da

maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto

com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de

avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen

Analyses)

Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo

de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e

nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da

integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia

a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de

comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-

se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se

obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz

visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)

Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o

maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em

comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com

a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na

25

estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica

emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com

maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada

devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)

A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de

viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e

IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de

fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)

O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem

interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo

e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana

espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando

expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana

integra (GARNER e JONHSON 1995)

O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este

composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se

observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON

e VICKER 1990)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas

Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela

produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o

movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a

mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular

A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada

em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999

Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser

utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta

espeacutecie

26

O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de

membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui

baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a

detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia

(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros

conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com

elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode

formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo

assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo

(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na

faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com

comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)

Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de

membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no

interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)

273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)

O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel

quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud

OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que

conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o

acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do

amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se

ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a

associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em

suas avaliaccedilotildees de acrossoma

A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia

permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol

ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e

pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a

barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a

fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa

caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A

27

colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da

membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo

sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana

plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas

ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001

RAITHI et al 2001)

28

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4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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2

Ficha catalograacutefica

M217e Maia Victor Netto Efeito do diluente (Botu-secircmen reg e ACP reg) e da adiccedilatildeo de antioxidante (glutationa peroxidase e cisteiacutena) na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerado de equumlinos Victor Netto Maia ndash 2010 61 p il Orientadora Maria Madalena Pessoa Guerra Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncia Veterinaacuteria) ndash Universidade Federal Rural de Pernambuco Departamento de Medicina Veterinaacuteria Recife 2010 Referecircncias 1 Antioxidantes 2 Secircmen 3Glutationa peroxidase 4 Equumlino 5 Cisteiacutena 6 Secircmen refrigerado I Guerra Maria Madalena Pessoa orientadora II Tiacutetulo CDD 63608926

3

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO

PROacute-REITORIA DE PESQUISA E POacuteS-GRADUACcedilAtildeO

PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIA VETERINAacuteRIA

EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SEcircMENreg E ACP-105reg) E DA

ADICcedilAtildeO DE ANTIOXIDANTES (GLUTATIONA PEROXIDASE E

CISTEIacuteNA) NA VIABILIDADE DE ESPERMATOZOIDES

REFRIGERADOS DE EQUINOS

Dissertaccedilatildeo de Mestrado elaborada e defendida por

VICTOR NETTO MAIA

Aprovada em 30 de agosto de 2010

BANCA EXAMINADORA

Profordf Drordf Maria Madalena Pessoa GuerraUFRPE

Orientadora

Profa Dra Eacuterika Christina Santos OliveiraUFRPE

Prof Dr Karen Mascaro Gonccedilalves da Silva

Dra Zoraide Fernandes Coleto (suplente)

4

A Deus a toda minha famiacutelia e amigos em especial meu

pai minha matildee e minha esposa Todos que formam o

ANDROLAB e minha orientadora a professora

Madalena por terem acreditado confiado e me ajudado

incondicionalmente

Dedico

5

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus por ter me concedido o dom da vida a oportunidade e o

privileacutegio do estudo Pelas inuacutemeras becircnccedilatildeos a mim concedidas diariamente e aos

vaacuterios ldquoanjosrdquo que ELE coloca e colocou junto de mim em toda a minha caminhada

A toda minha famiacutelia em especial meu pai Mauriacutecio e minha matildee Dolores

que sempre me apoiaram e nunca mediram esforccedilos para me ajudar a realizar todos os

meus sonhos inclusive por muitas vezes abrindo matildeo de seus proacuteprios sonhos em

funccedilatildeo dos meus Aos meus irmatildeos Daniel e Juliana e aos meus cunhados que com

toda certeza estatildeo sempre torcendo por mim

A Karinna minha esposa amiga companheira e agora matildee de meu mais novo

amor Mariah Que sempre me deu forccedilas para conseguir ir em frente

Ao vaacuterios professores que contribuiacuteram na minha formaccedilatildeo os quais jamais

esquecerei

Aos meus amigos e soacutecios no Centro de Equinos de Pernambuco-CEPE

Eduardo Andrade Lima Oswaldo Gomes Neto e tambeacutem ao meu co-orientador Prof

Dr Gustavo Ferrer Carneiro pela amizade confianccedila respeito e apoio

Agrave professora e orientadora Maria Madalena Pessoa Guerra com a qual tenho

aprendido e me surpreendido cada vez mais Aleacutem dos conhecimentos cientiacuteficos ela

tornou-se para mim um exemplo de profissional e de ser humano capaz de se

desprender de si em prol do proacuteximo Professora MEU MUITO OBRIGADO

Aos teacutecnicos e funcionaacuterios Alcir Joana Dordf Sonia e Marquinhos pelo carinho

e atenccedilatildeo

Aos companheiros do ANDROLAB Adriana Aacutelvaro Clara Diogo Filipe

Moraes Kaline Lawrence Liacutegia Pedro Profordf Eacuterica e em especial Sildivane que eacute

meu anjo da guarda a Ellen que sempre se preocupou em me ajudar a Andreacute Mariano

(bdquoO Corruptordquo) pela amizade e paciecircncia e a Felipe Costa que foi meu parceiro

fundamental no experimento A todos devo minha eterna gratidatildeo

A todos que formam o Haras Vida Boa ldquopalcordquo deste experimento

Agrave equipe da ACP Biotecnologia em especial ao professor Dr Joseacute Ferreira

Nunes e a Cristiane Salgueiro pelo apoio e fornecimento do ACP-105

6

ldquoO caminho no qual a crianccedila siga e conheccedila em sua

infacircncia nem na velhice o deixaraacuterdquo

(D Helder Cacircmara)

7

LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS

Porcentual

CFDA Diacetato de carboxifluoresceiacutena

CTC Clortetraciclina

DNA Aacutecido desoxirribonucleico

FITC-PNA Fluorescein isothiocyanate-conjugated aglutin

GSH Glutationa reduzida

GPx Gutationa peroxidase

GSSG Glutationa oxidada

H2O2 Peroacutexido de hidrogecircnio

IA Inseminaccedilatildeo artificial

iAC Integridade do acrossoma

iMP Integridade de membrana plasmaacutetica

JC-1 55‟66‟-tetracloro-11‟33‟-tetraetilbenzimidazolil-carbocianine iodide

M Molar

MP Motilidade progressiva

O2 oxigecircnio molecular

OH˙ Radical hidroxila

IP Iodeto de propiacutedeo

PMM Potencial de membrana mitocondrial

PNA Arachis hypogaea agglutinin

PSA Pisum sativum agglutinin

RNA Aacutecido ribonucleacuteico

ROS Espeacutecies reativas ao oxigecircnio

SOD Superoacutexido dismutase

Tris Tris (hidroximetil) aminometano

8

LISTA DE TABELAS

Paacutegina

Tabela 1 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-

105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

54

Tabela 2 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC

(T36h)

55

Tabela 3 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-

105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

56

Tabela 4 ndash

Tabela 5 ndash

Tabela 6 ndash

Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-

105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana

mitocondrial () de espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-

Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou

Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC

(T36h)

Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen

de equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de

substacircncias antioxidantes

57

58

59

9

Tabela 1 - Valores meacutedios de motilidade total vigor

alto porcentual de

membrana

mitocondrial

(aPMM) integridade

de membrana (IM) e

integridade de

acrossoma de

espermatozoides

equinos apoacutes a

refrigeraccedilatildeo com e

sem adiccedilatildeo de

substacircncias

antioxidantes

54

Tabela 2 - Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre

variaacuteveis do secircmen de equinos antes e apoacutes

a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de

substacircncias

antioxidantes

55

Tabela 3 - Valores com a meacutedia geral e o desvio

padratildeo da motilidade total em funccedilatildeo dos

tempos avaliados (T0 T12h T24h e T36h)

para cada grupo

testado

57

10

LISTA DE FIGURAS

Paacutegina

Figura 1 - Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em

funccedilatildeo dos tempos avaliados dos paracircmetros de

motilidade vigor integridade de membrana (IM)

integridade de acrossoma (IAC) e alto potencial de

membrana mitocondrial (APMM) de espermatozoides

equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo adicionados ou natildeo

com diferentes antioxidantes

60

11

RESUMO

Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios estudos

vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores da preservaccedilatildeo e

manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua deposiccedilatildeo no

trato reprodutivo da fecircmea O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito dos diluentes

(Botu-Secircmenreg e ACP-105reg) e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos refrigerados Foram utilizados

quatro reprodutores da raccedila Mangalarga Marchador os quais foram submetidos a

colheitas de secircmen com vagina artificial e uma fecircmea como manequim Apoacutes colheita

as amostras de secircmen de cada garanhatildeo foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg A seguir a fraccedilatildeo de cada diluidor foi fracionada para constituir os grupos

experimentais G1 = Botu-Secircmenreg (sem antioxidante) G2 = ACP-105reg (sem

antioxidante) G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg +

5U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg

+ 5mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen do tipo Botutainerreg As amostras de secircmen foram

submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total vigor integridade de membrana

integridade de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial imediatamente apoacutes a

chegada ao Laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0) assim como apoacutes 12 (T12h)

24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC

Palavras-chave ACP-105reg Botu-Secircmenreg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

12

ABSTRACT

In equine chilled semen is the most used in the IAs Therefore several studies have

been conducted in order to obtain better results in preserving and maintaining the

viability of sperm cells until the time of his deposition in the female reproductive tract

The objective was to study the effect of diluents (Botu-Semen reg and ACP-105 reg) and

the addition of the antioxidants cysteine and glutathione peroxidase in the viability of

equine spermatozoa cooled We used four players Mangalarga Marchador which were

subjected to semen collection with an artificial vagina and as a female mannequin After

harvest samples of semen from each stallion were evaluated and diluted semen-Botu reg

or ACP-105 reg Then the fraction of each extender was fractionated to form the

experimental groups G1 = Botu reg-Semen (no antioxidant) G2 = ACP-105 reg (without

antioxidant) G3 = Botu-Semen reg + 5U of Glutathione Peroxidase G4 = ACP-105 reg +

5U of Glutathione Peroxidase = G5-Botu Semen reg + 5mM cysteine G6 = ACP-105 reg

+ 5mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5U of Glutathione Peroxidase + + and 5 mM

Cysteine G8 = ACP-105 reg + 5U of Glutathione Peroxidase + 5mM cysteine Samples

from each experimental group were placed in triplicate in two boxes of cooling (14 deg C)

semen type Botutainer reg Semen samples were assessed as total motility vigor

membrane integrity acrosome integrity and mitochondrial membrane potential

immediately after arrival at the laboratory making the time zero (T0) and after 12

(T12h) 24 (T24h) and 36 hours (T36h) cooled to 14 oC

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

13

SUMAacuteRIO

Paacutegina

AGRADECIMENTOS

LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

RESUMO

ABSTRACT

1 INTRODUCcedilAtildeO 14

2 REVISAtildeO DE LITERATURA 16

21 Espermatozoacuteides 16

22 Plasma seminal 16

23 Preservaccedilatildeo do secircmen por refrigeraccedilatildeo 17

24 Fatores que afetam a viabilidade do secircmen equumlino refrigerado 18

25 Diluente para secircmen 19

26 Espeacutecies reativas de oxigecircnio e Antioxidantes

261 Glutationa peroxidase (GPx)

262 Cisteiacutena

27 Meacutetodos de avaliaccedilatildeo do secircmen equino com sondas fluorescentes

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio

(IP)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

273 Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin

(FITC-PNA)

3 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

4 EXPERIMENTO

21

22

23

24

25

25

26

28

34

41 Efeito do diluente e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa

peroxidase e cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos

refrigerados

35

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 61

14

1 INTRODUCcedilAtildeO

A inseminaccedilatildeo artificial (IA) em equumlinos eacute uma teacutecnica bastante desenvolvida e vem

sendo usada com grande frequumlecircncia nesta espeacutecie Esta bioteacutecnica tambeacutem eacute muito

utilizada em outras espeacutecies de produccedilatildeo como bovinos caprinos ovinos e animais de

companhia como os caninos As principais vantagens do seu uso satildeo reduccedilatildeo no custo

do transporte dos animais que se encontram em diferentes localidades uso de um

ejaculado para mais de uma fecircmea e proteccedilatildeo contra as doenccedilas sexualmente

transmissiacuteveis Esta teacutecnica eacute relativamente simples e implica na obtenccedilatildeo preacutevia do

secircmen para posterior uso in natura refrigerado ou congelado

Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios

estudos vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores quanto agrave

preservaccedilatildeo e manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua

deposiccedilatildeo no trato reprodutivo da fecircmea Como a refrigeraccedilatildeo trata-se de um processo

de criopreservaccedilatildeo faz-se necessaacuterio a adiccedilatildeo do diluente ao secircmen cuja funccedilatildeo eacute

aumentar o volume do ejaculado e proteger as ceacutelulas espermaacuteticas dos efeitos

deleteacuterios da criopreservaccedilatildeo (PENtildeA 2000)

As propriedades protetoras do diluente satildeo atribuiacutedas aos seus diferentes

componentes agrave interaccedilatildeo com as ceacutelulas espermaacuteticas de uma determinada espeacutecie e ao

indiviacuteduo (CUNHA e LOPES 2003) O diluente mais utilizado na espeacutecie equina satildeo

aqueles agrave base de leite desnatado com disponibilidade comercial de vaacuterios produtos

Com o advento da busca por produtos que natildeo sejam de origem animal a aacutegua

de coco tem se mostrado uma boa alternativa com accedilatildeo beneacutefica sobre a conservaccedilatildeo

celular Todavia existem poucos estudos utilizando este diluente em amostras de secircmen

na espeacutecie equina Na apresentaccedilatildeo em poacute semelhante aos diluentes convencionais

disponiacuteveis no mercado a aacutegua de coco (ACP-105) eacute obtida por um processo de alta

desidrataccedilatildeo a vaacutecuo e proporciona as mesmas vantagens quanto ao transporte e

acondicionamento assim como a praticidade dos diluentes comerciais de origem animal

(SOBREIRA NETO 2008)

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas que vivem em ambiente com condiccedilotildees

aeroacutebicas mas o metabolismo bioloacutegico oxidativo das moleacuteculas eacute potencialmente

toacutexico devido agrave formaccedilatildeo de espeacutecies reativas do oxigecircnio conhecidas como ROS

(BOUNHER et al 2000) As ROS incluem um grande nuacutemero de moleacuteculas

15

quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o

radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso

algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees

normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos

espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados

avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas

substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies

Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente

para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa

peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado

tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-

Secircmenreg)

16

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

21 Espermatozoacuteides

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam

revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios

proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica

esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se

encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA

(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de

parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo

onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de

fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da

zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da

cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em

forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula

(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na

peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute

envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide

(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)

22 Plasma Seminal

Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees

espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros

componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as

proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo

fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e

a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al

1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)

As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa

dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias

17

antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como

vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000

ALMEIDA e BALL 2005)

Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como

aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos

imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias

quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)

Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem

entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al

1996)

A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das

substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que

a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta

com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)

Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em

relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e

HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)

Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos

comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma

deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que

corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua

viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave

criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica

(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de

criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do

ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do

plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos

componentes celulares (BRINSKO et al 2000)

23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo

As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo

reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu

armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A

18

refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves

ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais

elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina

(ENGLAND e PONZIO 1996)

A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste

em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente

controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na

reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)

A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que

proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de

temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da

temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)

Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de

secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg

II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo

elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo

mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais

resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-

Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento

maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o

armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas

(SOBREIRA NETO 2008)

Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de

no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen

for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis

por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado

satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e

ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)

24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado

De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da

temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos

aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de

19

refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o

espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica

apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em

constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO

1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel

e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por

conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo

devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)

Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os

espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em

enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos

reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e

AMANN 1992)

Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram

que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas

moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol

manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)

recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas

decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no

intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas

Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo

de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT

1993)

25 Diluentes para Secircmen Equino

Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado

visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os

espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra

proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os

produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema

enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)

Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada

poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e

20

principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de

proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e

Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica

tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios

na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios

presentes no plasma

Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os

carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico

(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar

em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma

presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-

albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia

dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)

Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em

todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos

(AMMAN e PICKETT 1987)

Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de

coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis

com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e

gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes

necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm

sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando

resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)

ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos

(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES

e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos

espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade

total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito

positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie

(SILVEIRA NETO 2008)

21

26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes

O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade

fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo

A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo

Maxwell e Stojanov (1996)

Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de

ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides

(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de

motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e

extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)

O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa

antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS

principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase

glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de

defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por

sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias

ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)

Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do

agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo

jaacute ocorrida

Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute

limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido

danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila

intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos

protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo

espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios

espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)

Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo

in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios

estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando

substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)

22

261 Glutationa peroxidase (GPx)

Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa

peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa

a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)

A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute

presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de

forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de

proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns

problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais

as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser

bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas

relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As

ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a

exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das

membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de

defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente

em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)

Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em

1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias

A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das

concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da

accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al

2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2

e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em

GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)

A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada

quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta

enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao

restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem

disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos

mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de

DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA

e GUERRA 2007)

23

Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx

3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao

espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2

e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel

pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da

GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da

condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima

tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na

espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide

maduro (MAIA 2003)

262 Cisteiacutena

A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol

com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas

eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante

(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na

prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)

Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na

proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em

experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem

demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente

antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)

Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena

em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos

sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen

No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de

cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a

sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram

diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e

obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen

descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM

de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas

em javalis

24

Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na

proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da

membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a

glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios

com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos

27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes

A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante

A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave

concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de

contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que

apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981

CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um

meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da

maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto

com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de

avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen

Analyses)

Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo

de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e

nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da

integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia

a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de

comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-

se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se

obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz

visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)

Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o

maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em

comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com

a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na

25

estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica

emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com

maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada

devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)

A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de

viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e

IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de

fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)

O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem

interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo

e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana

espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando

expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana

integra (GARNER e JONHSON 1995)

O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este

composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se

observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON

e VICKER 1990)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas

Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela

produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o

movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a

mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular

A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada

em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999

Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser

utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta

espeacutecie

26

O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de

membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui

baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a

detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia

(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros

conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com

elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode

formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo

assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo

(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na

faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com

comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)

Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de

membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no

interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)

273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)

O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel

quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud

OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que

conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o

acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do

amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se

ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a

associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em

suas avaliaccedilotildees de acrossoma

A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia

permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol

ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e

pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a

barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a

fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa

caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A

27

colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da

membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo

sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana

plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas

ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001

RAITHI et al 2001)

28

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4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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infertile men Urology v 55 n 6 p 922-926 2000

54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

Livros Graacutetis( httpwwwlivrosgratiscombr )

Milhares de Livros para Download Baixar livros de AdministraccedilatildeoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciecircncia da ComputaccedilatildeoBaixar livros de Ciecircncia da InformaccedilatildeoBaixar livros de Ciecircncia PoliacuteticaBaixar livros de Ciecircncias da SauacutedeBaixar livros de ComunicaccedilatildeoBaixar livros do Conselho Nacional de Educaccedilatildeo - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomeacutesticaBaixar livros de EducaccedilatildeoBaixar livros de Educaccedilatildeo - TracircnsitoBaixar livros de Educaccedilatildeo FiacutesicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmaacuteciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FiacutesicaBaixar livros de GeociecircnciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistoacuteriaBaixar livros de Liacutenguas

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Page 5: EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA …livros01.livrosgratis.com.br/cp150379.pdf · 2016-01-26 · EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA ADIÇÃO DE

3

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO

PROacute-REITORIA DE PESQUISA E POacuteS-GRADUACcedilAtildeO

PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIA VETERINAacuteRIA

EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SEcircMENreg E ACP-105reg) E DA

ADICcedilAtildeO DE ANTIOXIDANTES (GLUTATIONA PEROXIDASE E

CISTEIacuteNA) NA VIABILIDADE DE ESPERMATOZOIDES

REFRIGERADOS DE EQUINOS

Dissertaccedilatildeo de Mestrado elaborada e defendida por

VICTOR NETTO MAIA

Aprovada em 30 de agosto de 2010

BANCA EXAMINADORA

Profordf Drordf Maria Madalena Pessoa GuerraUFRPE

Orientadora

Profa Dra Eacuterika Christina Santos OliveiraUFRPE

Prof Dr Karen Mascaro Gonccedilalves da Silva

Dra Zoraide Fernandes Coleto (suplente)

4

A Deus a toda minha famiacutelia e amigos em especial meu

pai minha matildee e minha esposa Todos que formam o

ANDROLAB e minha orientadora a professora

Madalena por terem acreditado confiado e me ajudado

incondicionalmente

Dedico

5

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus por ter me concedido o dom da vida a oportunidade e o

privileacutegio do estudo Pelas inuacutemeras becircnccedilatildeos a mim concedidas diariamente e aos

vaacuterios ldquoanjosrdquo que ELE coloca e colocou junto de mim em toda a minha caminhada

A toda minha famiacutelia em especial meu pai Mauriacutecio e minha matildee Dolores

que sempre me apoiaram e nunca mediram esforccedilos para me ajudar a realizar todos os

meus sonhos inclusive por muitas vezes abrindo matildeo de seus proacuteprios sonhos em

funccedilatildeo dos meus Aos meus irmatildeos Daniel e Juliana e aos meus cunhados que com

toda certeza estatildeo sempre torcendo por mim

A Karinna minha esposa amiga companheira e agora matildee de meu mais novo

amor Mariah Que sempre me deu forccedilas para conseguir ir em frente

Ao vaacuterios professores que contribuiacuteram na minha formaccedilatildeo os quais jamais

esquecerei

Aos meus amigos e soacutecios no Centro de Equinos de Pernambuco-CEPE

Eduardo Andrade Lima Oswaldo Gomes Neto e tambeacutem ao meu co-orientador Prof

Dr Gustavo Ferrer Carneiro pela amizade confianccedila respeito e apoio

Agrave professora e orientadora Maria Madalena Pessoa Guerra com a qual tenho

aprendido e me surpreendido cada vez mais Aleacutem dos conhecimentos cientiacuteficos ela

tornou-se para mim um exemplo de profissional e de ser humano capaz de se

desprender de si em prol do proacuteximo Professora MEU MUITO OBRIGADO

Aos teacutecnicos e funcionaacuterios Alcir Joana Dordf Sonia e Marquinhos pelo carinho

e atenccedilatildeo

Aos companheiros do ANDROLAB Adriana Aacutelvaro Clara Diogo Filipe

Moraes Kaline Lawrence Liacutegia Pedro Profordf Eacuterica e em especial Sildivane que eacute

meu anjo da guarda a Ellen que sempre se preocupou em me ajudar a Andreacute Mariano

(bdquoO Corruptordquo) pela amizade e paciecircncia e a Felipe Costa que foi meu parceiro

fundamental no experimento A todos devo minha eterna gratidatildeo

A todos que formam o Haras Vida Boa ldquopalcordquo deste experimento

Agrave equipe da ACP Biotecnologia em especial ao professor Dr Joseacute Ferreira

Nunes e a Cristiane Salgueiro pelo apoio e fornecimento do ACP-105

6

ldquoO caminho no qual a crianccedila siga e conheccedila em sua

infacircncia nem na velhice o deixaraacuterdquo

(D Helder Cacircmara)

7

LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS

Porcentual

CFDA Diacetato de carboxifluoresceiacutena

CTC Clortetraciclina

DNA Aacutecido desoxirribonucleico

FITC-PNA Fluorescein isothiocyanate-conjugated aglutin

GSH Glutationa reduzida

GPx Gutationa peroxidase

GSSG Glutationa oxidada

H2O2 Peroacutexido de hidrogecircnio

IA Inseminaccedilatildeo artificial

iAC Integridade do acrossoma

iMP Integridade de membrana plasmaacutetica

JC-1 55‟66‟-tetracloro-11‟33‟-tetraetilbenzimidazolil-carbocianine iodide

M Molar

MP Motilidade progressiva

O2 oxigecircnio molecular

OH˙ Radical hidroxila

IP Iodeto de propiacutedeo

PMM Potencial de membrana mitocondrial

PNA Arachis hypogaea agglutinin

PSA Pisum sativum agglutinin

RNA Aacutecido ribonucleacuteico

ROS Espeacutecies reativas ao oxigecircnio

SOD Superoacutexido dismutase

Tris Tris (hidroximetil) aminometano

8

LISTA DE TABELAS

Paacutegina

Tabela 1 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-

105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

54

Tabela 2 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC

(T36h)

55

Tabela 3 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-

105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

56

Tabela 4 ndash

Tabela 5 ndash

Tabela 6 ndash

Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-

105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana

mitocondrial () de espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-

Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou

Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC

(T36h)

Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen

de equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de

substacircncias antioxidantes

57

58

59

9

Tabela 1 - Valores meacutedios de motilidade total vigor

alto porcentual de

membrana

mitocondrial

(aPMM) integridade

de membrana (IM) e

integridade de

acrossoma de

espermatozoides

equinos apoacutes a

refrigeraccedilatildeo com e

sem adiccedilatildeo de

substacircncias

antioxidantes

54

Tabela 2 - Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre

variaacuteveis do secircmen de equinos antes e apoacutes

a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de

substacircncias

antioxidantes

55

Tabela 3 - Valores com a meacutedia geral e o desvio

padratildeo da motilidade total em funccedilatildeo dos

tempos avaliados (T0 T12h T24h e T36h)

para cada grupo

testado

57

10

LISTA DE FIGURAS

Paacutegina

Figura 1 - Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em

funccedilatildeo dos tempos avaliados dos paracircmetros de

motilidade vigor integridade de membrana (IM)

integridade de acrossoma (IAC) e alto potencial de

membrana mitocondrial (APMM) de espermatozoides

equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo adicionados ou natildeo

com diferentes antioxidantes

60

11

RESUMO

Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios estudos

vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores da preservaccedilatildeo e

manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua deposiccedilatildeo no

trato reprodutivo da fecircmea O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito dos diluentes

(Botu-Secircmenreg e ACP-105reg) e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos refrigerados Foram utilizados

quatro reprodutores da raccedila Mangalarga Marchador os quais foram submetidos a

colheitas de secircmen com vagina artificial e uma fecircmea como manequim Apoacutes colheita

as amostras de secircmen de cada garanhatildeo foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg A seguir a fraccedilatildeo de cada diluidor foi fracionada para constituir os grupos

experimentais G1 = Botu-Secircmenreg (sem antioxidante) G2 = ACP-105reg (sem

antioxidante) G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg +

5U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg

+ 5mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen do tipo Botutainerreg As amostras de secircmen foram

submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total vigor integridade de membrana

integridade de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial imediatamente apoacutes a

chegada ao Laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0) assim como apoacutes 12 (T12h)

24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC

Palavras-chave ACP-105reg Botu-Secircmenreg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

12

ABSTRACT

In equine chilled semen is the most used in the IAs Therefore several studies have

been conducted in order to obtain better results in preserving and maintaining the

viability of sperm cells until the time of his deposition in the female reproductive tract

The objective was to study the effect of diluents (Botu-Semen reg and ACP-105 reg) and

the addition of the antioxidants cysteine and glutathione peroxidase in the viability of

equine spermatozoa cooled We used four players Mangalarga Marchador which were

subjected to semen collection with an artificial vagina and as a female mannequin After

harvest samples of semen from each stallion were evaluated and diluted semen-Botu reg

or ACP-105 reg Then the fraction of each extender was fractionated to form the

experimental groups G1 = Botu reg-Semen (no antioxidant) G2 = ACP-105 reg (without

antioxidant) G3 = Botu-Semen reg + 5U of Glutathione Peroxidase G4 = ACP-105 reg +

5U of Glutathione Peroxidase = G5-Botu Semen reg + 5mM cysteine G6 = ACP-105 reg

+ 5mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5U of Glutathione Peroxidase + + and 5 mM

Cysteine G8 = ACP-105 reg + 5U of Glutathione Peroxidase + 5mM cysteine Samples

from each experimental group were placed in triplicate in two boxes of cooling (14 deg C)

semen type Botutainer reg Semen samples were assessed as total motility vigor

membrane integrity acrosome integrity and mitochondrial membrane potential

immediately after arrival at the laboratory making the time zero (T0) and after 12

(T12h) 24 (T24h) and 36 hours (T36h) cooled to 14 oC

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

13

SUMAacuteRIO

Paacutegina

AGRADECIMENTOS

LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

RESUMO

ABSTRACT

1 INTRODUCcedilAtildeO 14

2 REVISAtildeO DE LITERATURA 16

21 Espermatozoacuteides 16

22 Plasma seminal 16

23 Preservaccedilatildeo do secircmen por refrigeraccedilatildeo 17

24 Fatores que afetam a viabilidade do secircmen equumlino refrigerado 18

25 Diluente para secircmen 19

26 Espeacutecies reativas de oxigecircnio e Antioxidantes

261 Glutationa peroxidase (GPx)

262 Cisteiacutena

27 Meacutetodos de avaliaccedilatildeo do secircmen equino com sondas fluorescentes

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio

(IP)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

273 Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin

(FITC-PNA)

3 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

4 EXPERIMENTO

21

22

23

24

25

25

26

28

34

41 Efeito do diluente e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa

peroxidase e cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos

refrigerados

35

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 61

14

1 INTRODUCcedilAtildeO

A inseminaccedilatildeo artificial (IA) em equumlinos eacute uma teacutecnica bastante desenvolvida e vem

sendo usada com grande frequumlecircncia nesta espeacutecie Esta bioteacutecnica tambeacutem eacute muito

utilizada em outras espeacutecies de produccedilatildeo como bovinos caprinos ovinos e animais de

companhia como os caninos As principais vantagens do seu uso satildeo reduccedilatildeo no custo

do transporte dos animais que se encontram em diferentes localidades uso de um

ejaculado para mais de uma fecircmea e proteccedilatildeo contra as doenccedilas sexualmente

transmissiacuteveis Esta teacutecnica eacute relativamente simples e implica na obtenccedilatildeo preacutevia do

secircmen para posterior uso in natura refrigerado ou congelado

Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios

estudos vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores quanto agrave

preservaccedilatildeo e manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua

deposiccedilatildeo no trato reprodutivo da fecircmea Como a refrigeraccedilatildeo trata-se de um processo

de criopreservaccedilatildeo faz-se necessaacuterio a adiccedilatildeo do diluente ao secircmen cuja funccedilatildeo eacute

aumentar o volume do ejaculado e proteger as ceacutelulas espermaacuteticas dos efeitos

deleteacuterios da criopreservaccedilatildeo (PENtildeA 2000)

As propriedades protetoras do diluente satildeo atribuiacutedas aos seus diferentes

componentes agrave interaccedilatildeo com as ceacutelulas espermaacuteticas de uma determinada espeacutecie e ao

indiviacuteduo (CUNHA e LOPES 2003) O diluente mais utilizado na espeacutecie equina satildeo

aqueles agrave base de leite desnatado com disponibilidade comercial de vaacuterios produtos

Com o advento da busca por produtos que natildeo sejam de origem animal a aacutegua

de coco tem se mostrado uma boa alternativa com accedilatildeo beneacutefica sobre a conservaccedilatildeo

celular Todavia existem poucos estudos utilizando este diluente em amostras de secircmen

na espeacutecie equina Na apresentaccedilatildeo em poacute semelhante aos diluentes convencionais

disponiacuteveis no mercado a aacutegua de coco (ACP-105) eacute obtida por um processo de alta

desidrataccedilatildeo a vaacutecuo e proporciona as mesmas vantagens quanto ao transporte e

acondicionamento assim como a praticidade dos diluentes comerciais de origem animal

(SOBREIRA NETO 2008)

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas que vivem em ambiente com condiccedilotildees

aeroacutebicas mas o metabolismo bioloacutegico oxidativo das moleacuteculas eacute potencialmente

toacutexico devido agrave formaccedilatildeo de espeacutecies reativas do oxigecircnio conhecidas como ROS

(BOUNHER et al 2000) As ROS incluem um grande nuacutemero de moleacuteculas

15

quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o

radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso

algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees

normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos

espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados

avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas

substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies

Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente

para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa

peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado

tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-

Secircmenreg)

16

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

21 Espermatozoacuteides

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam

revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios

proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica

esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se

encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA

(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de

parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo

onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de

fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da

zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da

cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em

forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula

(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na

peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute

envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide

(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)

22 Plasma Seminal

Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees

espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros

componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as

proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo

fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e

a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al

1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)

As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa

dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias

17

antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como

vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000

ALMEIDA e BALL 2005)

Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como

aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos

imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias

quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)

Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem

entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al

1996)

A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das

substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que

a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta

com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)

Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em

relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e

HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)

Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos

comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma

deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que

corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua

viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave

criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica

(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de

criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do

ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do

plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos

componentes celulares (BRINSKO et al 2000)

23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo

As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo

reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu

armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A

18

refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves

ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais

elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina

(ENGLAND e PONZIO 1996)

A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste

em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente

controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na

reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)

A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que

proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de

temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da

temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)

Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de

secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg

II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo

elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo

mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais

resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-

Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento

maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o

armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas

(SOBREIRA NETO 2008)

Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de

no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen

for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis

por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado

satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e

ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)

24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado

De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da

temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos

aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de

19

refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o

espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica

apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em

constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO

1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel

e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por

conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo

devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)

Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os

espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em

enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos

reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e

AMANN 1992)

Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram

que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas

moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol

manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)

recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas

decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no

intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas

Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo

de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT

1993)

25 Diluentes para Secircmen Equino

Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado

visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os

espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra

proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os

produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema

enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)

Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada

poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e

20

principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de

proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e

Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica

tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios

na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios

presentes no plasma

Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os

carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico

(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar

em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma

presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-

albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia

dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)

Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em

todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos

(AMMAN e PICKETT 1987)

Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de

coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis

com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e

gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes

necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm

sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando

resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)

ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos

(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES

e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos

espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade

total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito

positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie

(SILVEIRA NETO 2008)

21

26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes

O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade

fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo

A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo

Maxwell e Stojanov (1996)

Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de

ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides

(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de

motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e

extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)

O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa

antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS

principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase

glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de

defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por

sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias

ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)

Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do

agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo

jaacute ocorrida

Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute

limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido

danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila

intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos

protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo

espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios

espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)

Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo

in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios

estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando

substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)

22

261 Glutationa peroxidase (GPx)

Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa

peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa

a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)

A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute

presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de

forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de

proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns

problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais

as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser

bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas

relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As

ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a

exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das

membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de

defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente

em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)

Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em

1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias

A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das

concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da

accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al

2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2

e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em

GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)

A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada

quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta

enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao

restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem

disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos

mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de

DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA

e GUERRA 2007)

23

Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx

3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao

espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2

e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel

pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da

GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da

condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima

tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na

espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide

maduro (MAIA 2003)

262 Cisteiacutena

A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol

com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas

eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante

(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na

prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)

Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na

proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em

experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem

demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente

antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)

Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena

em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos

sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen

No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de

cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a

sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram

diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e

obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen

descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM

de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas

em javalis

24

Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na

proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da

membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a

glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios

com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos

27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes

A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante

A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave

concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de

contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que

apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981

CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um

meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da

maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto

com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de

avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen

Analyses)

Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo

de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e

nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da

integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia

a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de

comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-

se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se

obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz

visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)

Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o

maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em

comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com

a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na

25

estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica

emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com

maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada

devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)

A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de

viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e

IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de

fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)

O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem

interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo

e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana

espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando

expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana

integra (GARNER e JONHSON 1995)

O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este

composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se

observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON

e VICKER 1990)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas

Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela

produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o

movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a

mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular

A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada

em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999

Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser

utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta

espeacutecie

26

O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de

membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui

baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a

detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia

(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros

conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com

elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode

formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo

assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo

(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na

faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com

comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)

Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de

membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no

interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)

273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)

O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel

quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud

OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que

conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o

acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do

amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se

ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a

associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em

suas avaliaccedilotildees de acrossoma

A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia

permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol

ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e

pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a

barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a

fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa

caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A

27

colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da

membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo

sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana

plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas

ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001

RAITHI et al 2001)

28

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infertile men Urology v 55 n 6 p 922-926 2000

34

4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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Page 6: EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA …livros01.livrosgratis.com.br/cp150379.pdf · 2016-01-26 · EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA ADIÇÃO DE

4

A Deus a toda minha famiacutelia e amigos em especial meu

pai minha matildee e minha esposa Todos que formam o

ANDROLAB e minha orientadora a professora

Madalena por terem acreditado confiado e me ajudado

incondicionalmente

Dedico

5

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus por ter me concedido o dom da vida a oportunidade e o

privileacutegio do estudo Pelas inuacutemeras becircnccedilatildeos a mim concedidas diariamente e aos

vaacuterios ldquoanjosrdquo que ELE coloca e colocou junto de mim em toda a minha caminhada

A toda minha famiacutelia em especial meu pai Mauriacutecio e minha matildee Dolores

que sempre me apoiaram e nunca mediram esforccedilos para me ajudar a realizar todos os

meus sonhos inclusive por muitas vezes abrindo matildeo de seus proacuteprios sonhos em

funccedilatildeo dos meus Aos meus irmatildeos Daniel e Juliana e aos meus cunhados que com

toda certeza estatildeo sempre torcendo por mim

A Karinna minha esposa amiga companheira e agora matildee de meu mais novo

amor Mariah Que sempre me deu forccedilas para conseguir ir em frente

Ao vaacuterios professores que contribuiacuteram na minha formaccedilatildeo os quais jamais

esquecerei

Aos meus amigos e soacutecios no Centro de Equinos de Pernambuco-CEPE

Eduardo Andrade Lima Oswaldo Gomes Neto e tambeacutem ao meu co-orientador Prof

Dr Gustavo Ferrer Carneiro pela amizade confianccedila respeito e apoio

Agrave professora e orientadora Maria Madalena Pessoa Guerra com a qual tenho

aprendido e me surpreendido cada vez mais Aleacutem dos conhecimentos cientiacuteficos ela

tornou-se para mim um exemplo de profissional e de ser humano capaz de se

desprender de si em prol do proacuteximo Professora MEU MUITO OBRIGADO

Aos teacutecnicos e funcionaacuterios Alcir Joana Dordf Sonia e Marquinhos pelo carinho

e atenccedilatildeo

Aos companheiros do ANDROLAB Adriana Aacutelvaro Clara Diogo Filipe

Moraes Kaline Lawrence Liacutegia Pedro Profordf Eacuterica e em especial Sildivane que eacute

meu anjo da guarda a Ellen que sempre se preocupou em me ajudar a Andreacute Mariano

(bdquoO Corruptordquo) pela amizade e paciecircncia e a Felipe Costa que foi meu parceiro

fundamental no experimento A todos devo minha eterna gratidatildeo

A todos que formam o Haras Vida Boa ldquopalcordquo deste experimento

Agrave equipe da ACP Biotecnologia em especial ao professor Dr Joseacute Ferreira

Nunes e a Cristiane Salgueiro pelo apoio e fornecimento do ACP-105

6

ldquoO caminho no qual a crianccedila siga e conheccedila em sua

infacircncia nem na velhice o deixaraacuterdquo

(D Helder Cacircmara)

7

LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS

Porcentual

CFDA Diacetato de carboxifluoresceiacutena

CTC Clortetraciclina

DNA Aacutecido desoxirribonucleico

FITC-PNA Fluorescein isothiocyanate-conjugated aglutin

GSH Glutationa reduzida

GPx Gutationa peroxidase

GSSG Glutationa oxidada

H2O2 Peroacutexido de hidrogecircnio

IA Inseminaccedilatildeo artificial

iAC Integridade do acrossoma

iMP Integridade de membrana plasmaacutetica

JC-1 55‟66‟-tetracloro-11‟33‟-tetraetilbenzimidazolil-carbocianine iodide

M Molar

MP Motilidade progressiva

O2 oxigecircnio molecular

OH˙ Radical hidroxila

IP Iodeto de propiacutedeo

PMM Potencial de membrana mitocondrial

PNA Arachis hypogaea agglutinin

PSA Pisum sativum agglutinin

RNA Aacutecido ribonucleacuteico

ROS Espeacutecies reativas ao oxigecircnio

SOD Superoacutexido dismutase

Tris Tris (hidroximetil) aminometano

8

LISTA DE TABELAS

Paacutegina

Tabela 1 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-

105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

54

Tabela 2 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC

(T36h)

55

Tabela 3 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-

105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

56

Tabela 4 ndash

Tabela 5 ndash

Tabela 6 ndash

Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-

105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana

mitocondrial () de espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-

Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou

Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC

(T36h)

Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen

de equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de

substacircncias antioxidantes

57

58

59

9

Tabela 1 - Valores meacutedios de motilidade total vigor

alto porcentual de

membrana

mitocondrial

(aPMM) integridade

de membrana (IM) e

integridade de

acrossoma de

espermatozoides

equinos apoacutes a

refrigeraccedilatildeo com e

sem adiccedilatildeo de

substacircncias

antioxidantes

54

Tabela 2 - Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre

variaacuteveis do secircmen de equinos antes e apoacutes

a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de

substacircncias

antioxidantes

55

Tabela 3 - Valores com a meacutedia geral e o desvio

padratildeo da motilidade total em funccedilatildeo dos

tempos avaliados (T0 T12h T24h e T36h)

para cada grupo

testado

57

10

LISTA DE FIGURAS

Paacutegina

Figura 1 - Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em

funccedilatildeo dos tempos avaliados dos paracircmetros de

motilidade vigor integridade de membrana (IM)

integridade de acrossoma (IAC) e alto potencial de

membrana mitocondrial (APMM) de espermatozoides

equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo adicionados ou natildeo

com diferentes antioxidantes

60

11

RESUMO

Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios estudos

vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores da preservaccedilatildeo e

manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua deposiccedilatildeo no

trato reprodutivo da fecircmea O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito dos diluentes

(Botu-Secircmenreg e ACP-105reg) e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos refrigerados Foram utilizados

quatro reprodutores da raccedila Mangalarga Marchador os quais foram submetidos a

colheitas de secircmen com vagina artificial e uma fecircmea como manequim Apoacutes colheita

as amostras de secircmen de cada garanhatildeo foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg A seguir a fraccedilatildeo de cada diluidor foi fracionada para constituir os grupos

experimentais G1 = Botu-Secircmenreg (sem antioxidante) G2 = ACP-105reg (sem

antioxidante) G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg +

5U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg

+ 5mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen do tipo Botutainerreg As amostras de secircmen foram

submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total vigor integridade de membrana

integridade de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial imediatamente apoacutes a

chegada ao Laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0) assim como apoacutes 12 (T12h)

24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC

Palavras-chave ACP-105reg Botu-Secircmenreg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

12

ABSTRACT

In equine chilled semen is the most used in the IAs Therefore several studies have

been conducted in order to obtain better results in preserving and maintaining the

viability of sperm cells until the time of his deposition in the female reproductive tract

The objective was to study the effect of diluents (Botu-Semen reg and ACP-105 reg) and

the addition of the antioxidants cysteine and glutathione peroxidase in the viability of

equine spermatozoa cooled We used four players Mangalarga Marchador which were

subjected to semen collection with an artificial vagina and as a female mannequin After

harvest samples of semen from each stallion were evaluated and diluted semen-Botu reg

or ACP-105 reg Then the fraction of each extender was fractionated to form the

experimental groups G1 = Botu reg-Semen (no antioxidant) G2 = ACP-105 reg (without

antioxidant) G3 = Botu-Semen reg + 5U of Glutathione Peroxidase G4 = ACP-105 reg +

5U of Glutathione Peroxidase = G5-Botu Semen reg + 5mM cysteine G6 = ACP-105 reg

+ 5mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5U of Glutathione Peroxidase + + and 5 mM

Cysteine G8 = ACP-105 reg + 5U of Glutathione Peroxidase + 5mM cysteine Samples

from each experimental group were placed in triplicate in two boxes of cooling (14 deg C)

semen type Botutainer reg Semen samples were assessed as total motility vigor

membrane integrity acrosome integrity and mitochondrial membrane potential

immediately after arrival at the laboratory making the time zero (T0) and after 12

(T12h) 24 (T24h) and 36 hours (T36h) cooled to 14 oC

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

13

SUMAacuteRIO

Paacutegina

AGRADECIMENTOS

LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

RESUMO

ABSTRACT

1 INTRODUCcedilAtildeO 14

2 REVISAtildeO DE LITERATURA 16

21 Espermatozoacuteides 16

22 Plasma seminal 16

23 Preservaccedilatildeo do secircmen por refrigeraccedilatildeo 17

24 Fatores que afetam a viabilidade do secircmen equumlino refrigerado 18

25 Diluente para secircmen 19

26 Espeacutecies reativas de oxigecircnio e Antioxidantes

261 Glutationa peroxidase (GPx)

262 Cisteiacutena

27 Meacutetodos de avaliaccedilatildeo do secircmen equino com sondas fluorescentes

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio

(IP)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

273 Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin

(FITC-PNA)

3 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

4 EXPERIMENTO

21

22

23

24

25

25

26

28

34

41 Efeito do diluente e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa

peroxidase e cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos

refrigerados

35

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 61

14

1 INTRODUCcedilAtildeO

A inseminaccedilatildeo artificial (IA) em equumlinos eacute uma teacutecnica bastante desenvolvida e vem

sendo usada com grande frequumlecircncia nesta espeacutecie Esta bioteacutecnica tambeacutem eacute muito

utilizada em outras espeacutecies de produccedilatildeo como bovinos caprinos ovinos e animais de

companhia como os caninos As principais vantagens do seu uso satildeo reduccedilatildeo no custo

do transporte dos animais que se encontram em diferentes localidades uso de um

ejaculado para mais de uma fecircmea e proteccedilatildeo contra as doenccedilas sexualmente

transmissiacuteveis Esta teacutecnica eacute relativamente simples e implica na obtenccedilatildeo preacutevia do

secircmen para posterior uso in natura refrigerado ou congelado

Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios

estudos vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores quanto agrave

preservaccedilatildeo e manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua

deposiccedilatildeo no trato reprodutivo da fecircmea Como a refrigeraccedilatildeo trata-se de um processo

de criopreservaccedilatildeo faz-se necessaacuterio a adiccedilatildeo do diluente ao secircmen cuja funccedilatildeo eacute

aumentar o volume do ejaculado e proteger as ceacutelulas espermaacuteticas dos efeitos

deleteacuterios da criopreservaccedilatildeo (PENtildeA 2000)

As propriedades protetoras do diluente satildeo atribuiacutedas aos seus diferentes

componentes agrave interaccedilatildeo com as ceacutelulas espermaacuteticas de uma determinada espeacutecie e ao

indiviacuteduo (CUNHA e LOPES 2003) O diluente mais utilizado na espeacutecie equina satildeo

aqueles agrave base de leite desnatado com disponibilidade comercial de vaacuterios produtos

Com o advento da busca por produtos que natildeo sejam de origem animal a aacutegua

de coco tem se mostrado uma boa alternativa com accedilatildeo beneacutefica sobre a conservaccedilatildeo

celular Todavia existem poucos estudos utilizando este diluente em amostras de secircmen

na espeacutecie equina Na apresentaccedilatildeo em poacute semelhante aos diluentes convencionais

disponiacuteveis no mercado a aacutegua de coco (ACP-105) eacute obtida por um processo de alta

desidrataccedilatildeo a vaacutecuo e proporciona as mesmas vantagens quanto ao transporte e

acondicionamento assim como a praticidade dos diluentes comerciais de origem animal

(SOBREIRA NETO 2008)

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas que vivem em ambiente com condiccedilotildees

aeroacutebicas mas o metabolismo bioloacutegico oxidativo das moleacuteculas eacute potencialmente

toacutexico devido agrave formaccedilatildeo de espeacutecies reativas do oxigecircnio conhecidas como ROS

(BOUNHER et al 2000) As ROS incluem um grande nuacutemero de moleacuteculas

15

quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o

radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso

algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees

normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos

espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados

avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas

substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies

Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente

para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa

peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado

tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-

Secircmenreg)

16

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

21 Espermatozoacuteides

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam

revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios

proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica

esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se

encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA

(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de

parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo

onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de

fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da

zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da

cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em

forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula

(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na

peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute

envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide

(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)

22 Plasma Seminal

Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees

espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros

componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as

proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo

fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e

a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al

1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)

As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa

dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias

17

antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como

vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000

ALMEIDA e BALL 2005)

Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como

aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos

imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias

quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)

Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem

entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al

1996)

A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das

substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que

a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta

com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)

Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em

relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e

HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)

Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos

comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma

deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que

corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua

viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave

criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica

(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de

criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do

ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do

plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos

componentes celulares (BRINSKO et al 2000)

23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo

As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo

reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu

armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A

18

refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves

ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais

elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina

(ENGLAND e PONZIO 1996)

A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste

em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente

controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na

reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)

A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que

proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de

temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da

temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)

Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de

secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg

II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo

elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo

mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais

resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-

Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento

maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o

armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas

(SOBREIRA NETO 2008)

Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de

no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen

for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis

por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado

satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e

ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)

24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado

De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da

temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos

aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de

19

refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o

espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica

apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em

constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO

1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel

e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por

conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo

devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)

Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os

espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em

enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos

reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e

AMANN 1992)

Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram

que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas

moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol

manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)

recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas

decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no

intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas

Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo

de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT

1993)

25 Diluentes para Secircmen Equino

Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado

visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os

espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra

proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os

produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema

enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)

Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada

poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e

20

principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de

proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e

Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica

tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios

na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios

presentes no plasma

Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os

carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico

(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar

em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma

presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-

albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia

dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)

Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em

todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos

(AMMAN e PICKETT 1987)

Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de

coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis

com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e

gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes

necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm

sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando

resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)

ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos

(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES

e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos

espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade

total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito

positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie

(SILVEIRA NETO 2008)

21

26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes

O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade

fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo

A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo

Maxwell e Stojanov (1996)

Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de

ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides

(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de

motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e

extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)

O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa

antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS

principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase

glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de

defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por

sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias

ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)

Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do

agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo

jaacute ocorrida

Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute

limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido

danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila

intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos

protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo

espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios

espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)

Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo

in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios

estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando

substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)

22

261 Glutationa peroxidase (GPx)

Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa

peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa

a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)

A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute

presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de

forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de

proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns

problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais

as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser

bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas

relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As

ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a

exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das

membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de

defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente

em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)

Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em

1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias

A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das

concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da

accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al

2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2

e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em

GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)

A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada

quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta

enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao

restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem

disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos

mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de

DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA

e GUERRA 2007)

23

Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx

3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao

espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2

e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel

pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da

GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da

condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima

tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na

espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide

maduro (MAIA 2003)

262 Cisteiacutena

A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol

com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas

eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante

(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na

prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)

Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na

proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em

experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem

demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente

antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)

Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena

em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos

sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen

No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de

cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a

sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram

diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e

obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen

descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM

de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas

em javalis

24

Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na

proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da

membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a

glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios

com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos

27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes

A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante

A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave

concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de

contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que

apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981

CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um

meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da

maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto

com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de

avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen

Analyses)

Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo

de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e

nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da

integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia

a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de

comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-

se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se

obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz

visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)

Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o

maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em

comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com

a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na

25

estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica

emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com

maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada

devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)

A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de

viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e

IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de

fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)

O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem

interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo

e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana

espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando

expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana

integra (GARNER e JONHSON 1995)

O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este

composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se

observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON

e VICKER 1990)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas

Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela

produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o

movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a

mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular

A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada

em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999

Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser

utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta

espeacutecie

26

O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de

membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui

baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a

detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia

(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros

conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com

elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode

formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo

assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo

(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na

faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com

comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)

Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de

membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no

interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)

273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)

O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel

quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud

OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que

conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o

acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do

amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se

ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a

associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em

suas avaliaccedilotildees de acrossoma

A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia

permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol

ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e

pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a

barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a

fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa

caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A

27

colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da

membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo

sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana

plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas

ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001

RAITHI et al 2001)

28

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4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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Page 7: EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA …livros01.livrosgratis.com.br/cp150379.pdf · 2016-01-26 · EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA ADIÇÃO DE

5

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus por ter me concedido o dom da vida a oportunidade e o

privileacutegio do estudo Pelas inuacutemeras becircnccedilatildeos a mim concedidas diariamente e aos

vaacuterios ldquoanjosrdquo que ELE coloca e colocou junto de mim em toda a minha caminhada

A toda minha famiacutelia em especial meu pai Mauriacutecio e minha matildee Dolores

que sempre me apoiaram e nunca mediram esforccedilos para me ajudar a realizar todos os

meus sonhos inclusive por muitas vezes abrindo matildeo de seus proacuteprios sonhos em

funccedilatildeo dos meus Aos meus irmatildeos Daniel e Juliana e aos meus cunhados que com

toda certeza estatildeo sempre torcendo por mim

A Karinna minha esposa amiga companheira e agora matildee de meu mais novo

amor Mariah Que sempre me deu forccedilas para conseguir ir em frente

Ao vaacuterios professores que contribuiacuteram na minha formaccedilatildeo os quais jamais

esquecerei

Aos meus amigos e soacutecios no Centro de Equinos de Pernambuco-CEPE

Eduardo Andrade Lima Oswaldo Gomes Neto e tambeacutem ao meu co-orientador Prof

Dr Gustavo Ferrer Carneiro pela amizade confianccedila respeito e apoio

Agrave professora e orientadora Maria Madalena Pessoa Guerra com a qual tenho

aprendido e me surpreendido cada vez mais Aleacutem dos conhecimentos cientiacuteficos ela

tornou-se para mim um exemplo de profissional e de ser humano capaz de se

desprender de si em prol do proacuteximo Professora MEU MUITO OBRIGADO

Aos teacutecnicos e funcionaacuterios Alcir Joana Dordf Sonia e Marquinhos pelo carinho

e atenccedilatildeo

Aos companheiros do ANDROLAB Adriana Aacutelvaro Clara Diogo Filipe

Moraes Kaline Lawrence Liacutegia Pedro Profordf Eacuterica e em especial Sildivane que eacute

meu anjo da guarda a Ellen que sempre se preocupou em me ajudar a Andreacute Mariano

(bdquoO Corruptordquo) pela amizade e paciecircncia e a Felipe Costa que foi meu parceiro

fundamental no experimento A todos devo minha eterna gratidatildeo

A todos que formam o Haras Vida Boa ldquopalcordquo deste experimento

Agrave equipe da ACP Biotecnologia em especial ao professor Dr Joseacute Ferreira

Nunes e a Cristiane Salgueiro pelo apoio e fornecimento do ACP-105

6

ldquoO caminho no qual a crianccedila siga e conheccedila em sua

infacircncia nem na velhice o deixaraacuterdquo

(D Helder Cacircmara)

7

LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS

Porcentual

CFDA Diacetato de carboxifluoresceiacutena

CTC Clortetraciclina

DNA Aacutecido desoxirribonucleico

FITC-PNA Fluorescein isothiocyanate-conjugated aglutin

GSH Glutationa reduzida

GPx Gutationa peroxidase

GSSG Glutationa oxidada

H2O2 Peroacutexido de hidrogecircnio

IA Inseminaccedilatildeo artificial

iAC Integridade do acrossoma

iMP Integridade de membrana plasmaacutetica

JC-1 55‟66‟-tetracloro-11‟33‟-tetraetilbenzimidazolil-carbocianine iodide

M Molar

MP Motilidade progressiva

O2 oxigecircnio molecular

OH˙ Radical hidroxila

IP Iodeto de propiacutedeo

PMM Potencial de membrana mitocondrial

PNA Arachis hypogaea agglutinin

PSA Pisum sativum agglutinin

RNA Aacutecido ribonucleacuteico

ROS Espeacutecies reativas ao oxigecircnio

SOD Superoacutexido dismutase

Tris Tris (hidroximetil) aminometano

8

LISTA DE TABELAS

Paacutegina

Tabela 1 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-

105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

54

Tabela 2 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC

(T36h)

55

Tabela 3 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-

105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

56

Tabela 4 ndash

Tabela 5 ndash

Tabela 6 ndash

Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-

105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana

mitocondrial () de espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-

Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou

Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC

(T36h)

Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen

de equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de

substacircncias antioxidantes

57

58

59

9

Tabela 1 - Valores meacutedios de motilidade total vigor

alto porcentual de

membrana

mitocondrial

(aPMM) integridade

de membrana (IM) e

integridade de

acrossoma de

espermatozoides

equinos apoacutes a

refrigeraccedilatildeo com e

sem adiccedilatildeo de

substacircncias

antioxidantes

54

Tabela 2 - Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre

variaacuteveis do secircmen de equinos antes e apoacutes

a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de

substacircncias

antioxidantes

55

Tabela 3 - Valores com a meacutedia geral e o desvio

padratildeo da motilidade total em funccedilatildeo dos

tempos avaliados (T0 T12h T24h e T36h)

para cada grupo

testado

57

10

LISTA DE FIGURAS

Paacutegina

Figura 1 - Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em

funccedilatildeo dos tempos avaliados dos paracircmetros de

motilidade vigor integridade de membrana (IM)

integridade de acrossoma (IAC) e alto potencial de

membrana mitocondrial (APMM) de espermatozoides

equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo adicionados ou natildeo

com diferentes antioxidantes

60

11

RESUMO

Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios estudos

vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores da preservaccedilatildeo e

manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua deposiccedilatildeo no

trato reprodutivo da fecircmea O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito dos diluentes

(Botu-Secircmenreg e ACP-105reg) e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos refrigerados Foram utilizados

quatro reprodutores da raccedila Mangalarga Marchador os quais foram submetidos a

colheitas de secircmen com vagina artificial e uma fecircmea como manequim Apoacutes colheita

as amostras de secircmen de cada garanhatildeo foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg A seguir a fraccedilatildeo de cada diluidor foi fracionada para constituir os grupos

experimentais G1 = Botu-Secircmenreg (sem antioxidante) G2 = ACP-105reg (sem

antioxidante) G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg +

5U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg

+ 5mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen do tipo Botutainerreg As amostras de secircmen foram

submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total vigor integridade de membrana

integridade de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial imediatamente apoacutes a

chegada ao Laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0) assim como apoacutes 12 (T12h)

24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC

Palavras-chave ACP-105reg Botu-Secircmenreg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

12

ABSTRACT

In equine chilled semen is the most used in the IAs Therefore several studies have

been conducted in order to obtain better results in preserving and maintaining the

viability of sperm cells until the time of his deposition in the female reproductive tract

The objective was to study the effect of diluents (Botu-Semen reg and ACP-105 reg) and

the addition of the antioxidants cysteine and glutathione peroxidase in the viability of

equine spermatozoa cooled We used four players Mangalarga Marchador which were

subjected to semen collection with an artificial vagina and as a female mannequin After

harvest samples of semen from each stallion were evaluated and diluted semen-Botu reg

or ACP-105 reg Then the fraction of each extender was fractionated to form the

experimental groups G1 = Botu reg-Semen (no antioxidant) G2 = ACP-105 reg (without

antioxidant) G3 = Botu-Semen reg + 5U of Glutathione Peroxidase G4 = ACP-105 reg +

5U of Glutathione Peroxidase = G5-Botu Semen reg + 5mM cysteine G6 = ACP-105 reg

+ 5mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5U of Glutathione Peroxidase + + and 5 mM

Cysteine G8 = ACP-105 reg + 5U of Glutathione Peroxidase + 5mM cysteine Samples

from each experimental group were placed in triplicate in two boxes of cooling (14 deg C)

semen type Botutainer reg Semen samples were assessed as total motility vigor

membrane integrity acrosome integrity and mitochondrial membrane potential

immediately after arrival at the laboratory making the time zero (T0) and after 12

(T12h) 24 (T24h) and 36 hours (T36h) cooled to 14 oC

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

13

SUMAacuteRIO

Paacutegina

AGRADECIMENTOS

LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

RESUMO

ABSTRACT

1 INTRODUCcedilAtildeO 14

2 REVISAtildeO DE LITERATURA 16

21 Espermatozoacuteides 16

22 Plasma seminal 16

23 Preservaccedilatildeo do secircmen por refrigeraccedilatildeo 17

24 Fatores que afetam a viabilidade do secircmen equumlino refrigerado 18

25 Diluente para secircmen 19

26 Espeacutecies reativas de oxigecircnio e Antioxidantes

261 Glutationa peroxidase (GPx)

262 Cisteiacutena

27 Meacutetodos de avaliaccedilatildeo do secircmen equino com sondas fluorescentes

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio

(IP)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

273 Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin

(FITC-PNA)

3 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

4 EXPERIMENTO

21

22

23

24

25

25

26

28

34

41 Efeito do diluente e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa

peroxidase e cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos

refrigerados

35

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 61

14

1 INTRODUCcedilAtildeO

A inseminaccedilatildeo artificial (IA) em equumlinos eacute uma teacutecnica bastante desenvolvida e vem

sendo usada com grande frequumlecircncia nesta espeacutecie Esta bioteacutecnica tambeacutem eacute muito

utilizada em outras espeacutecies de produccedilatildeo como bovinos caprinos ovinos e animais de

companhia como os caninos As principais vantagens do seu uso satildeo reduccedilatildeo no custo

do transporte dos animais que se encontram em diferentes localidades uso de um

ejaculado para mais de uma fecircmea e proteccedilatildeo contra as doenccedilas sexualmente

transmissiacuteveis Esta teacutecnica eacute relativamente simples e implica na obtenccedilatildeo preacutevia do

secircmen para posterior uso in natura refrigerado ou congelado

Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios

estudos vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores quanto agrave

preservaccedilatildeo e manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua

deposiccedilatildeo no trato reprodutivo da fecircmea Como a refrigeraccedilatildeo trata-se de um processo

de criopreservaccedilatildeo faz-se necessaacuterio a adiccedilatildeo do diluente ao secircmen cuja funccedilatildeo eacute

aumentar o volume do ejaculado e proteger as ceacutelulas espermaacuteticas dos efeitos

deleteacuterios da criopreservaccedilatildeo (PENtildeA 2000)

As propriedades protetoras do diluente satildeo atribuiacutedas aos seus diferentes

componentes agrave interaccedilatildeo com as ceacutelulas espermaacuteticas de uma determinada espeacutecie e ao

indiviacuteduo (CUNHA e LOPES 2003) O diluente mais utilizado na espeacutecie equina satildeo

aqueles agrave base de leite desnatado com disponibilidade comercial de vaacuterios produtos

Com o advento da busca por produtos que natildeo sejam de origem animal a aacutegua

de coco tem se mostrado uma boa alternativa com accedilatildeo beneacutefica sobre a conservaccedilatildeo

celular Todavia existem poucos estudos utilizando este diluente em amostras de secircmen

na espeacutecie equina Na apresentaccedilatildeo em poacute semelhante aos diluentes convencionais

disponiacuteveis no mercado a aacutegua de coco (ACP-105) eacute obtida por um processo de alta

desidrataccedilatildeo a vaacutecuo e proporciona as mesmas vantagens quanto ao transporte e

acondicionamento assim como a praticidade dos diluentes comerciais de origem animal

(SOBREIRA NETO 2008)

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas que vivem em ambiente com condiccedilotildees

aeroacutebicas mas o metabolismo bioloacutegico oxidativo das moleacuteculas eacute potencialmente

toacutexico devido agrave formaccedilatildeo de espeacutecies reativas do oxigecircnio conhecidas como ROS

(BOUNHER et al 2000) As ROS incluem um grande nuacutemero de moleacuteculas

15

quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o

radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso

algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees

normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos

espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados

avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas

substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies

Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente

para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa

peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado

tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-

Secircmenreg)

16

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

21 Espermatozoacuteides

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam

revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios

proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica

esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se

encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA

(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de

parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo

onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de

fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da

zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da

cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em

forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula

(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na

peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute

envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide

(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)

22 Plasma Seminal

Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees

espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros

componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as

proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo

fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e

a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al

1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)

As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa

dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias

17

antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como

vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000

ALMEIDA e BALL 2005)

Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como

aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos

imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias

quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)

Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem

entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al

1996)

A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das

substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que

a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta

com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)

Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em

relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e

HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)

Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos

comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma

deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que

corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua

viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave

criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica

(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de

criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do

ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do

plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos

componentes celulares (BRINSKO et al 2000)

23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo

As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo

reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu

armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A

18

refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves

ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais

elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina

(ENGLAND e PONZIO 1996)

A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste

em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente

controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na

reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)

A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que

proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de

temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da

temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)

Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de

secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg

II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo

elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo

mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais

resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-

Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento

maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o

armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas

(SOBREIRA NETO 2008)

Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de

no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen

for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis

por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado

satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e

ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)

24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado

De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da

temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos

aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de

19

refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o

espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica

apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em

constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO

1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel

e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por

conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo

devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)

Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os

espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em

enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos

reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e

AMANN 1992)

Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram

que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas

moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol

manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)

recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas

decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no

intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas

Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo

de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT

1993)

25 Diluentes para Secircmen Equino

Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado

visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os

espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra

proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os

produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema

enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)

Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada

poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e

20

principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de

proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e

Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica

tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios

na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios

presentes no plasma

Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os

carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico

(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar

em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma

presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-

albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia

dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)

Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em

todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos

(AMMAN e PICKETT 1987)

Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de

coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis

com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e

gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes

necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm

sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando

resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)

ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos

(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES

e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos

espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade

total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito

positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie

(SILVEIRA NETO 2008)

21

26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes

O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade

fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo

A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo

Maxwell e Stojanov (1996)

Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de

ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides

(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de

motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e

extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)

O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa

antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS

principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase

glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de

defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por

sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias

ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)

Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do

agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo

jaacute ocorrida

Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute

limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido

danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila

intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos

protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo

espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios

espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)

Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo

in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios

estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando

substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)

22

261 Glutationa peroxidase (GPx)

Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa

peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa

a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)

A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute

presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de

forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de

proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns

problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais

as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser

bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas

relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As

ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a

exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das

membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de

defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente

em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)

Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em

1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias

A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das

concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da

accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al

2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2

e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em

GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)

A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada

quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta

enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao

restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem

disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos

mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de

DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA

e GUERRA 2007)

23

Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx

3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao

espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2

e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel

pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da

GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da

condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima

tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na

espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide

maduro (MAIA 2003)

262 Cisteiacutena

A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol

com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas

eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante

(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na

prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)

Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na

proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em

experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem

demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente

antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)

Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena

em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos

sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen

No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de

cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a

sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram

diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e

obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen

descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM

de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas

em javalis

24

Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na

proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da

membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a

glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios

com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos

27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes

A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante

A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave

concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de

contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que

apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981

CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um

meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da

maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto

com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de

avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen

Analyses)

Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo

de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e

nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da

integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia

a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de

comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-

se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se

obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz

visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)

Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o

maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em

comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com

a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na

25

estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica

emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com

maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada

devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)

A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de

viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e

IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de

fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)

O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem

interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo

e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana

espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando

expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana

integra (GARNER e JONHSON 1995)

O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este

composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se

observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON

e VICKER 1990)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas

Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela

produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o

movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a

mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular

A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada

em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999

Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser

utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta

espeacutecie

26

O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de

membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui

baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a

detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia

(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros

conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com

elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode

formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo

assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo

(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na

faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com

comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)

Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de

membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no

interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)

273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)

O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel

quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud

OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que

conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o

acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do

amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se

ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a

associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em

suas avaliaccedilotildees de acrossoma

A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia

permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol

ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e

pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a

barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a

fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa

caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A

27

colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da

membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo

sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana

plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas

ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001

RAITHI et al 2001)

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4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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53

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UCHOA DC CARDOSO RCS SILVA LDM Inseminaccedilatildeo artificial a fresco em

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utilizaccedilatildeo de antioxidantes na criopreservaccedilatildeo do secircmen suiacuteno Revista Brasileira de

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ZEGINIADOU T PAPADIMAS J MANTALENAKIS S Acrosome reaction

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2000

ZINI A GARRELS K PHANG D Antioxidant activity in the semen of fertile and

infertile men Urology v 55 n 6 p 922-926 2000

54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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Page 8: EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA …livros01.livrosgratis.com.br/cp150379.pdf · 2016-01-26 · EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA ADIÇÃO DE

6

ldquoO caminho no qual a crianccedila siga e conheccedila em sua

infacircncia nem na velhice o deixaraacuterdquo

(D Helder Cacircmara)

7

LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS

Porcentual

CFDA Diacetato de carboxifluoresceiacutena

CTC Clortetraciclina

DNA Aacutecido desoxirribonucleico

FITC-PNA Fluorescein isothiocyanate-conjugated aglutin

GSH Glutationa reduzida

GPx Gutationa peroxidase

GSSG Glutationa oxidada

H2O2 Peroacutexido de hidrogecircnio

IA Inseminaccedilatildeo artificial

iAC Integridade do acrossoma

iMP Integridade de membrana plasmaacutetica

JC-1 55‟66‟-tetracloro-11‟33‟-tetraetilbenzimidazolil-carbocianine iodide

M Molar

MP Motilidade progressiva

O2 oxigecircnio molecular

OH˙ Radical hidroxila

IP Iodeto de propiacutedeo

PMM Potencial de membrana mitocondrial

PNA Arachis hypogaea agglutinin

PSA Pisum sativum agglutinin

RNA Aacutecido ribonucleacuteico

ROS Espeacutecies reativas ao oxigecircnio

SOD Superoacutexido dismutase

Tris Tris (hidroximetil) aminometano

8

LISTA DE TABELAS

Paacutegina

Tabela 1 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-

105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

54

Tabela 2 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC

(T36h)

55

Tabela 3 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-

105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

56

Tabela 4 ndash

Tabela 5 ndash

Tabela 6 ndash

Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-

105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana

mitocondrial () de espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-

Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou

Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC

(T36h)

Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen

de equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de

substacircncias antioxidantes

57

58

59

9

Tabela 1 - Valores meacutedios de motilidade total vigor

alto porcentual de

membrana

mitocondrial

(aPMM) integridade

de membrana (IM) e

integridade de

acrossoma de

espermatozoides

equinos apoacutes a

refrigeraccedilatildeo com e

sem adiccedilatildeo de

substacircncias

antioxidantes

54

Tabela 2 - Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre

variaacuteveis do secircmen de equinos antes e apoacutes

a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de

substacircncias

antioxidantes

55

Tabela 3 - Valores com a meacutedia geral e o desvio

padratildeo da motilidade total em funccedilatildeo dos

tempos avaliados (T0 T12h T24h e T36h)

para cada grupo

testado

57

10

LISTA DE FIGURAS

Paacutegina

Figura 1 - Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em

funccedilatildeo dos tempos avaliados dos paracircmetros de

motilidade vigor integridade de membrana (IM)

integridade de acrossoma (IAC) e alto potencial de

membrana mitocondrial (APMM) de espermatozoides

equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo adicionados ou natildeo

com diferentes antioxidantes

60

11

RESUMO

Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios estudos

vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores da preservaccedilatildeo e

manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua deposiccedilatildeo no

trato reprodutivo da fecircmea O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito dos diluentes

(Botu-Secircmenreg e ACP-105reg) e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos refrigerados Foram utilizados

quatro reprodutores da raccedila Mangalarga Marchador os quais foram submetidos a

colheitas de secircmen com vagina artificial e uma fecircmea como manequim Apoacutes colheita

as amostras de secircmen de cada garanhatildeo foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg A seguir a fraccedilatildeo de cada diluidor foi fracionada para constituir os grupos

experimentais G1 = Botu-Secircmenreg (sem antioxidante) G2 = ACP-105reg (sem

antioxidante) G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg +

5U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg

+ 5mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen do tipo Botutainerreg As amostras de secircmen foram

submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total vigor integridade de membrana

integridade de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial imediatamente apoacutes a

chegada ao Laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0) assim como apoacutes 12 (T12h)

24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC

Palavras-chave ACP-105reg Botu-Secircmenreg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

12

ABSTRACT

In equine chilled semen is the most used in the IAs Therefore several studies have

been conducted in order to obtain better results in preserving and maintaining the

viability of sperm cells until the time of his deposition in the female reproductive tract

The objective was to study the effect of diluents (Botu-Semen reg and ACP-105 reg) and

the addition of the antioxidants cysteine and glutathione peroxidase in the viability of

equine spermatozoa cooled We used four players Mangalarga Marchador which were

subjected to semen collection with an artificial vagina and as a female mannequin After

harvest samples of semen from each stallion were evaluated and diluted semen-Botu reg

or ACP-105 reg Then the fraction of each extender was fractionated to form the

experimental groups G1 = Botu reg-Semen (no antioxidant) G2 = ACP-105 reg (without

antioxidant) G3 = Botu-Semen reg + 5U of Glutathione Peroxidase G4 = ACP-105 reg +

5U of Glutathione Peroxidase = G5-Botu Semen reg + 5mM cysteine G6 = ACP-105 reg

+ 5mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5U of Glutathione Peroxidase + + and 5 mM

Cysteine G8 = ACP-105 reg + 5U of Glutathione Peroxidase + 5mM cysteine Samples

from each experimental group were placed in triplicate in two boxes of cooling (14 deg C)

semen type Botutainer reg Semen samples were assessed as total motility vigor

membrane integrity acrosome integrity and mitochondrial membrane potential

immediately after arrival at the laboratory making the time zero (T0) and after 12

(T12h) 24 (T24h) and 36 hours (T36h) cooled to 14 oC

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

13

SUMAacuteRIO

Paacutegina

AGRADECIMENTOS

LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

RESUMO

ABSTRACT

1 INTRODUCcedilAtildeO 14

2 REVISAtildeO DE LITERATURA 16

21 Espermatozoacuteides 16

22 Plasma seminal 16

23 Preservaccedilatildeo do secircmen por refrigeraccedilatildeo 17

24 Fatores que afetam a viabilidade do secircmen equumlino refrigerado 18

25 Diluente para secircmen 19

26 Espeacutecies reativas de oxigecircnio e Antioxidantes

261 Glutationa peroxidase (GPx)

262 Cisteiacutena

27 Meacutetodos de avaliaccedilatildeo do secircmen equino com sondas fluorescentes

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio

(IP)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

273 Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin

(FITC-PNA)

3 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

4 EXPERIMENTO

21

22

23

24

25

25

26

28

34

41 Efeito do diluente e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa

peroxidase e cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos

refrigerados

35

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 61

14

1 INTRODUCcedilAtildeO

A inseminaccedilatildeo artificial (IA) em equumlinos eacute uma teacutecnica bastante desenvolvida e vem

sendo usada com grande frequumlecircncia nesta espeacutecie Esta bioteacutecnica tambeacutem eacute muito

utilizada em outras espeacutecies de produccedilatildeo como bovinos caprinos ovinos e animais de

companhia como os caninos As principais vantagens do seu uso satildeo reduccedilatildeo no custo

do transporte dos animais que se encontram em diferentes localidades uso de um

ejaculado para mais de uma fecircmea e proteccedilatildeo contra as doenccedilas sexualmente

transmissiacuteveis Esta teacutecnica eacute relativamente simples e implica na obtenccedilatildeo preacutevia do

secircmen para posterior uso in natura refrigerado ou congelado

Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios

estudos vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores quanto agrave

preservaccedilatildeo e manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua

deposiccedilatildeo no trato reprodutivo da fecircmea Como a refrigeraccedilatildeo trata-se de um processo

de criopreservaccedilatildeo faz-se necessaacuterio a adiccedilatildeo do diluente ao secircmen cuja funccedilatildeo eacute

aumentar o volume do ejaculado e proteger as ceacutelulas espermaacuteticas dos efeitos

deleteacuterios da criopreservaccedilatildeo (PENtildeA 2000)

As propriedades protetoras do diluente satildeo atribuiacutedas aos seus diferentes

componentes agrave interaccedilatildeo com as ceacutelulas espermaacuteticas de uma determinada espeacutecie e ao

indiviacuteduo (CUNHA e LOPES 2003) O diluente mais utilizado na espeacutecie equina satildeo

aqueles agrave base de leite desnatado com disponibilidade comercial de vaacuterios produtos

Com o advento da busca por produtos que natildeo sejam de origem animal a aacutegua

de coco tem se mostrado uma boa alternativa com accedilatildeo beneacutefica sobre a conservaccedilatildeo

celular Todavia existem poucos estudos utilizando este diluente em amostras de secircmen

na espeacutecie equina Na apresentaccedilatildeo em poacute semelhante aos diluentes convencionais

disponiacuteveis no mercado a aacutegua de coco (ACP-105) eacute obtida por um processo de alta

desidrataccedilatildeo a vaacutecuo e proporciona as mesmas vantagens quanto ao transporte e

acondicionamento assim como a praticidade dos diluentes comerciais de origem animal

(SOBREIRA NETO 2008)

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas que vivem em ambiente com condiccedilotildees

aeroacutebicas mas o metabolismo bioloacutegico oxidativo das moleacuteculas eacute potencialmente

toacutexico devido agrave formaccedilatildeo de espeacutecies reativas do oxigecircnio conhecidas como ROS

(BOUNHER et al 2000) As ROS incluem um grande nuacutemero de moleacuteculas

15

quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o

radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso

algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees

normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos

espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados

avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas

substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies

Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente

para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa

peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado

tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-

Secircmenreg)

16

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

21 Espermatozoacuteides

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam

revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios

proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica

esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se

encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA

(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de

parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo

onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de

fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da

zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da

cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em

forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula

(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na

peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute

envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide

(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)

22 Plasma Seminal

Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees

espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros

componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as

proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo

fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e

a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al

1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)

As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa

dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias

17

antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como

vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000

ALMEIDA e BALL 2005)

Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como

aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos

imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias

quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)

Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem

entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al

1996)

A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das

substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que

a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta

com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)

Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em

relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e

HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)

Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos

comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma

deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que

corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua

viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave

criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica

(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de

criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do

ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do

plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos

componentes celulares (BRINSKO et al 2000)

23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo

As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo

reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu

armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A

18

refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves

ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais

elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina

(ENGLAND e PONZIO 1996)

A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste

em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente

controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na

reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)

A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que

proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de

temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da

temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)

Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de

secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg

II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo

elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo

mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais

resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-

Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento

maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o

armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas

(SOBREIRA NETO 2008)

Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de

no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen

for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis

por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado

satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e

ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)

24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado

De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da

temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos

aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de

19

refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o

espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica

apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em

constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO

1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel

e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por

conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo

devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)

Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os

espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em

enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos

reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e

AMANN 1992)

Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram

que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas

moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol

manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)

recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas

decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no

intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas

Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo

de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT

1993)

25 Diluentes para Secircmen Equino

Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado

visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os

espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra

proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os

produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema

enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)

Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada

poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e

20

principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de

proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e

Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica

tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios

na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios

presentes no plasma

Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os

carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico

(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar

em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma

presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-

albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia

dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)

Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em

todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos

(AMMAN e PICKETT 1987)

Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de

coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis

com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e

gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes

necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm

sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando

resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)

ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos

(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES

e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos

espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade

total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito

positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie

(SILVEIRA NETO 2008)

21

26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes

O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade

fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo

A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo

Maxwell e Stojanov (1996)

Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de

ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides

(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de

motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e

extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)

O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa

antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS

principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase

glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de

defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por

sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias

ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)

Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do

agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo

jaacute ocorrida

Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute

limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido

danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila

intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos

protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo

espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios

espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)

Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo

in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios

estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando

substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)

22

261 Glutationa peroxidase (GPx)

Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa

peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa

a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)

A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute

presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de

forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de

proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns

problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais

as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser

bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas

relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As

ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a

exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das

membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de

defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente

em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)

Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em

1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias

A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das

concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da

accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al

2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2

e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em

GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)

A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada

quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta

enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao

restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem

disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos

mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de

DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA

e GUERRA 2007)

23

Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx

3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao

espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2

e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel

pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da

GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da

condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima

tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na

espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide

maduro (MAIA 2003)

262 Cisteiacutena

A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol

com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas

eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante

(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na

prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)

Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na

proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em

experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem

demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente

antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)

Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena

em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos

sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen

No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de

cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a

sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram

diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e

obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen

descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM

de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas

em javalis

24

Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na

proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da

membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a

glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios

com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos

27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes

A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante

A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave

concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de

contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que

apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981

CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um

meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da

maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto

com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de

avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen

Analyses)

Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo

de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e

nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da

integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia

a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de

comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-

se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se

obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz

visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)

Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o

maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em

comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com

a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na

25

estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica

emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com

maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada

devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)

A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de

viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e

IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de

fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)

O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem

interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo

e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana

espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando

expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana

integra (GARNER e JONHSON 1995)

O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este

composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se

observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON

e VICKER 1990)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas

Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela

produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o

movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a

mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular

A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada

em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999

Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser

utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta

espeacutecie

26

O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de

membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui

baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a

detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia

(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros

conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com

elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode

formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo

assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo

(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na

faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com

comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)

Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de

membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no

interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)

273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)

O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel

quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud

OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que

conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o

acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do

amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se

ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a

associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em

suas avaliaccedilotildees de acrossoma

A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia

permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol

ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e

pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a

barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a

fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa

caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A

27

colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da

membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo

sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana

plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas

ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001

RAITHI et al 2001)

28

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4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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7

LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS

Porcentual

CFDA Diacetato de carboxifluoresceiacutena

CTC Clortetraciclina

DNA Aacutecido desoxirribonucleico

FITC-PNA Fluorescein isothiocyanate-conjugated aglutin

GSH Glutationa reduzida

GPx Gutationa peroxidase

GSSG Glutationa oxidada

H2O2 Peroacutexido de hidrogecircnio

IA Inseminaccedilatildeo artificial

iAC Integridade do acrossoma

iMP Integridade de membrana plasmaacutetica

JC-1 55‟66‟-tetracloro-11‟33‟-tetraetilbenzimidazolil-carbocianine iodide

M Molar

MP Motilidade progressiva

O2 oxigecircnio molecular

OH˙ Radical hidroxila

IP Iodeto de propiacutedeo

PMM Potencial de membrana mitocondrial

PNA Arachis hypogaea agglutinin

PSA Pisum sativum agglutinin

RNA Aacutecido ribonucleacuteico

ROS Espeacutecies reativas ao oxigecircnio

SOD Superoacutexido dismutase

Tris Tris (hidroximetil) aminometano

8

LISTA DE TABELAS

Paacutegina

Tabela 1 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-

105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

54

Tabela 2 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC

(T36h)

55

Tabela 3 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-

105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

56

Tabela 4 ndash

Tabela 5 ndash

Tabela 6 ndash

Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-

105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana

mitocondrial () de espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-

Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou

Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC

(T36h)

Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen

de equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de

substacircncias antioxidantes

57

58

59

9

Tabela 1 - Valores meacutedios de motilidade total vigor

alto porcentual de

membrana

mitocondrial

(aPMM) integridade

de membrana (IM) e

integridade de

acrossoma de

espermatozoides

equinos apoacutes a

refrigeraccedilatildeo com e

sem adiccedilatildeo de

substacircncias

antioxidantes

54

Tabela 2 - Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre

variaacuteveis do secircmen de equinos antes e apoacutes

a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de

substacircncias

antioxidantes

55

Tabela 3 - Valores com a meacutedia geral e o desvio

padratildeo da motilidade total em funccedilatildeo dos

tempos avaliados (T0 T12h T24h e T36h)

para cada grupo

testado

57

10

LISTA DE FIGURAS

Paacutegina

Figura 1 - Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em

funccedilatildeo dos tempos avaliados dos paracircmetros de

motilidade vigor integridade de membrana (IM)

integridade de acrossoma (IAC) e alto potencial de

membrana mitocondrial (APMM) de espermatozoides

equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo adicionados ou natildeo

com diferentes antioxidantes

60

11

RESUMO

Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios estudos

vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores da preservaccedilatildeo e

manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua deposiccedilatildeo no

trato reprodutivo da fecircmea O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito dos diluentes

(Botu-Secircmenreg e ACP-105reg) e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos refrigerados Foram utilizados

quatro reprodutores da raccedila Mangalarga Marchador os quais foram submetidos a

colheitas de secircmen com vagina artificial e uma fecircmea como manequim Apoacutes colheita

as amostras de secircmen de cada garanhatildeo foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg A seguir a fraccedilatildeo de cada diluidor foi fracionada para constituir os grupos

experimentais G1 = Botu-Secircmenreg (sem antioxidante) G2 = ACP-105reg (sem

antioxidante) G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg +

5U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg

+ 5mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen do tipo Botutainerreg As amostras de secircmen foram

submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total vigor integridade de membrana

integridade de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial imediatamente apoacutes a

chegada ao Laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0) assim como apoacutes 12 (T12h)

24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC

Palavras-chave ACP-105reg Botu-Secircmenreg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

12

ABSTRACT

In equine chilled semen is the most used in the IAs Therefore several studies have

been conducted in order to obtain better results in preserving and maintaining the

viability of sperm cells until the time of his deposition in the female reproductive tract

The objective was to study the effect of diluents (Botu-Semen reg and ACP-105 reg) and

the addition of the antioxidants cysteine and glutathione peroxidase in the viability of

equine spermatozoa cooled We used four players Mangalarga Marchador which were

subjected to semen collection with an artificial vagina and as a female mannequin After

harvest samples of semen from each stallion were evaluated and diluted semen-Botu reg

or ACP-105 reg Then the fraction of each extender was fractionated to form the

experimental groups G1 = Botu reg-Semen (no antioxidant) G2 = ACP-105 reg (without

antioxidant) G3 = Botu-Semen reg + 5U of Glutathione Peroxidase G4 = ACP-105 reg +

5U of Glutathione Peroxidase = G5-Botu Semen reg + 5mM cysteine G6 = ACP-105 reg

+ 5mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5U of Glutathione Peroxidase + + and 5 mM

Cysteine G8 = ACP-105 reg + 5U of Glutathione Peroxidase + 5mM cysteine Samples

from each experimental group were placed in triplicate in two boxes of cooling (14 deg C)

semen type Botutainer reg Semen samples were assessed as total motility vigor

membrane integrity acrosome integrity and mitochondrial membrane potential

immediately after arrival at the laboratory making the time zero (T0) and after 12

(T12h) 24 (T24h) and 36 hours (T36h) cooled to 14 oC

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

13

SUMAacuteRIO

Paacutegina

AGRADECIMENTOS

LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

RESUMO

ABSTRACT

1 INTRODUCcedilAtildeO 14

2 REVISAtildeO DE LITERATURA 16

21 Espermatozoacuteides 16

22 Plasma seminal 16

23 Preservaccedilatildeo do secircmen por refrigeraccedilatildeo 17

24 Fatores que afetam a viabilidade do secircmen equumlino refrigerado 18

25 Diluente para secircmen 19

26 Espeacutecies reativas de oxigecircnio e Antioxidantes

261 Glutationa peroxidase (GPx)

262 Cisteiacutena

27 Meacutetodos de avaliaccedilatildeo do secircmen equino com sondas fluorescentes

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio

(IP)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

273 Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin

(FITC-PNA)

3 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

4 EXPERIMENTO

21

22

23

24

25

25

26

28

34

41 Efeito do diluente e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa

peroxidase e cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos

refrigerados

35

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 61

14

1 INTRODUCcedilAtildeO

A inseminaccedilatildeo artificial (IA) em equumlinos eacute uma teacutecnica bastante desenvolvida e vem

sendo usada com grande frequumlecircncia nesta espeacutecie Esta bioteacutecnica tambeacutem eacute muito

utilizada em outras espeacutecies de produccedilatildeo como bovinos caprinos ovinos e animais de

companhia como os caninos As principais vantagens do seu uso satildeo reduccedilatildeo no custo

do transporte dos animais que se encontram em diferentes localidades uso de um

ejaculado para mais de uma fecircmea e proteccedilatildeo contra as doenccedilas sexualmente

transmissiacuteveis Esta teacutecnica eacute relativamente simples e implica na obtenccedilatildeo preacutevia do

secircmen para posterior uso in natura refrigerado ou congelado

Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios

estudos vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores quanto agrave

preservaccedilatildeo e manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua

deposiccedilatildeo no trato reprodutivo da fecircmea Como a refrigeraccedilatildeo trata-se de um processo

de criopreservaccedilatildeo faz-se necessaacuterio a adiccedilatildeo do diluente ao secircmen cuja funccedilatildeo eacute

aumentar o volume do ejaculado e proteger as ceacutelulas espermaacuteticas dos efeitos

deleteacuterios da criopreservaccedilatildeo (PENtildeA 2000)

As propriedades protetoras do diluente satildeo atribuiacutedas aos seus diferentes

componentes agrave interaccedilatildeo com as ceacutelulas espermaacuteticas de uma determinada espeacutecie e ao

indiviacuteduo (CUNHA e LOPES 2003) O diluente mais utilizado na espeacutecie equina satildeo

aqueles agrave base de leite desnatado com disponibilidade comercial de vaacuterios produtos

Com o advento da busca por produtos que natildeo sejam de origem animal a aacutegua

de coco tem se mostrado uma boa alternativa com accedilatildeo beneacutefica sobre a conservaccedilatildeo

celular Todavia existem poucos estudos utilizando este diluente em amostras de secircmen

na espeacutecie equina Na apresentaccedilatildeo em poacute semelhante aos diluentes convencionais

disponiacuteveis no mercado a aacutegua de coco (ACP-105) eacute obtida por um processo de alta

desidrataccedilatildeo a vaacutecuo e proporciona as mesmas vantagens quanto ao transporte e

acondicionamento assim como a praticidade dos diluentes comerciais de origem animal

(SOBREIRA NETO 2008)

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas que vivem em ambiente com condiccedilotildees

aeroacutebicas mas o metabolismo bioloacutegico oxidativo das moleacuteculas eacute potencialmente

toacutexico devido agrave formaccedilatildeo de espeacutecies reativas do oxigecircnio conhecidas como ROS

(BOUNHER et al 2000) As ROS incluem um grande nuacutemero de moleacuteculas

15

quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o

radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso

algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees

normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos

espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados

avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas

substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies

Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente

para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa

peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado

tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-

Secircmenreg)

16

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

21 Espermatozoacuteides

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam

revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios

proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica

esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se

encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA

(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de

parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo

onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de

fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da

zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da

cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em

forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula

(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na

peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute

envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide

(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)

22 Plasma Seminal

Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees

espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros

componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as

proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo

fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e

a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al

1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)

As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa

dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias

17

antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como

vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000

ALMEIDA e BALL 2005)

Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como

aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos

imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias

quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)

Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem

entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al

1996)

A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das

substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que

a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta

com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)

Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em

relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e

HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)

Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos

comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma

deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que

corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua

viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave

criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica

(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de

criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do

ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do

plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos

componentes celulares (BRINSKO et al 2000)

23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo

As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo

reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu

armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A

18

refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves

ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais

elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina

(ENGLAND e PONZIO 1996)

A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste

em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente

controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na

reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)

A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que

proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de

temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da

temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)

Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de

secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg

II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo

elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo

mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais

resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-

Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento

maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o

armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas

(SOBREIRA NETO 2008)

Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de

no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen

for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis

por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado

satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e

ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)

24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado

De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da

temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos

aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de

19

refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o

espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica

apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em

constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO

1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel

e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por

conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo

devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)

Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os

espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em

enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos

reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e

AMANN 1992)

Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram

que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas

moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol

manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)

recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas

decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no

intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas

Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo

de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT

1993)

25 Diluentes para Secircmen Equino

Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado

visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os

espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra

proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os

produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema

enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)

Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada

poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e

20

principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de

proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e

Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica

tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios

na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios

presentes no plasma

Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os

carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico

(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar

em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma

presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-

albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia

dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)

Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em

todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos

(AMMAN e PICKETT 1987)

Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de

coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis

com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e

gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes

necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm

sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando

resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)

ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos

(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES

e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos

espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade

total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito

positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie

(SILVEIRA NETO 2008)

21

26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes

O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade

fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo

A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo

Maxwell e Stojanov (1996)

Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de

ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides

(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de

motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e

extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)

O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa

antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS

principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase

glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de

defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por

sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias

ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)

Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do

agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo

jaacute ocorrida

Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute

limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido

danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila

intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos

protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo

espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios

espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)

Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo

in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios

estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando

substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)

22

261 Glutationa peroxidase (GPx)

Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa

peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa

a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)

A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute

presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de

forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de

proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns

problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais

as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser

bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas

relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As

ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a

exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das

membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de

defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente

em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)

Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em

1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias

A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das

concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da

accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al

2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2

e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em

GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)

A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada

quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta

enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao

restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem

disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos

mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de

DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA

e GUERRA 2007)

23

Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx

3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao

espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2

e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel

pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da

GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da

condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima

tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na

espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide

maduro (MAIA 2003)

262 Cisteiacutena

A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol

com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas

eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante

(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na

prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)

Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na

proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em

experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem

demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente

antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)

Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena

em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos

sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen

No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de

cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a

sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram

diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e

obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen

descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM

de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas

em javalis

24

Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na

proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da

membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a

glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios

com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos

27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes

A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante

A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave

concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de

contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que

apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981

CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um

meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da

maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto

com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de

avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen

Analyses)

Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo

de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e

nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da

integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia

a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de

comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-

se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se

obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz

visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)

Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o

maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em

comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com

a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na

25

estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica

emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com

maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada

devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)

A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de

viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e

IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de

fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)

O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem

interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo

e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana

espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando

expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana

integra (GARNER e JONHSON 1995)

O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este

composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se

observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON

e VICKER 1990)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas

Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela

produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o

movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a

mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular

A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada

em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999

Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser

utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta

espeacutecie

26

O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de

membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui

baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a

detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia

(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros

conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com

elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode

formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo

assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo

(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na

faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com

comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)

Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de

membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no

interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)

273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)

O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel

quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud

OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que

conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o

acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do

amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se

ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a

associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em

suas avaliaccedilotildees de acrossoma

A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia

permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol

ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e

pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a

barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a

fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa

caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A

27

colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da

membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo

sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana

plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas

ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001

RAITHI et al 2001)

28

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34

4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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ZINI A GARRELS K PHANG D Antioxidant activity in the semen of fertile and

infertile men Urology v 55 n 6 p 922-926 2000

54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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Page 10: EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA …livros01.livrosgratis.com.br/cp150379.pdf · 2016-01-26 · EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA ADIÇÃO DE

8

LISTA DE TABELAS

Paacutegina

Tabela 1 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-

105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

54

Tabela 2 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC

(T36h)

55

Tabela 3 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-

105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

56

Tabela 4 ndash

Tabela 5 ndash

Tabela 6 ndash

Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-

105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes

incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana

mitocondrial () de espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-

Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou

Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC

(T36h)

Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen

de equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de

substacircncias antioxidantes

57

58

59

9

Tabela 1 - Valores meacutedios de motilidade total vigor

alto porcentual de

membrana

mitocondrial

(aPMM) integridade

de membrana (IM) e

integridade de

acrossoma de

espermatozoides

equinos apoacutes a

refrigeraccedilatildeo com e

sem adiccedilatildeo de

substacircncias

antioxidantes

54

Tabela 2 - Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre

variaacuteveis do secircmen de equinos antes e apoacutes

a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de

substacircncias

antioxidantes

55

Tabela 3 - Valores com a meacutedia geral e o desvio

padratildeo da motilidade total em funccedilatildeo dos

tempos avaliados (T0 T12h T24h e T36h)

para cada grupo

testado

57

10

LISTA DE FIGURAS

Paacutegina

Figura 1 - Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em

funccedilatildeo dos tempos avaliados dos paracircmetros de

motilidade vigor integridade de membrana (IM)

integridade de acrossoma (IAC) e alto potencial de

membrana mitocondrial (APMM) de espermatozoides

equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo adicionados ou natildeo

com diferentes antioxidantes

60

11

RESUMO

Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios estudos

vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores da preservaccedilatildeo e

manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua deposiccedilatildeo no

trato reprodutivo da fecircmea O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito dos diluentes

(Botu-Secircmenreg e ACP-105reg) e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos refrigerados Foram utilizados

quatro reprodutores da raccedila Mangalarga Marchador os quais foram submetidos a

colheitas de secircmen com vagina artificial e uma fecircmea como manequim Apoacutes colheita

as amostras de secircmen de cada garanhatildeo foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg A seguir a fraccedilatildeo de cada diluidor foi fracionada para constituir os grupos

experimentais G1 = Botu-Secircmenreg (sem antioxidante) G2 = ACP-105reg (sem

antioxidante) G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg +

5U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg

+ 5mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen do tipo Botutainerreg As amostras de secircmen foram

submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total vigor integridade de membrana

integridade de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial imediatamente apoacutes a

chegada ao Laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0) assim como apoacutes 12 (T12h)

24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC

Palavras-chave ACP-105reg Botu-Secircmenreg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

12

ABSTRACT

In equine chilled semen is the most used in the IAs Therefore several studies have

been conducted in order to obtain better results in preserving and maintaining the

viability of sperm cells until the time of his deposition in the female reproductive tract

The objective was to study the effect of diluents (Botu-Semen reg and ACP-105 reg) and

the addition of the antioxidants cysteine and glutathione peroxidase in the viability of

equine spermatozoa cooled We used four players Mangalarga Marchador which were

subjected to semen collection with an artificial vagina and as a female mannequin After

harvest samples of semen from each stallion were evaluated and diluted semen-Botu reg

or ACP-105 reg Then the fraction of each extender was fractionated to form the

experimental groups G1 = Botu reg-Semen (no antioxidant) G2 = ACP-105 reg (without

antioxidant) G3 = Botu-Semen reg + 5U of Glutathione Peroxidase G4 = ACP-105 reg +

5U of Glutathione Peroxidase = G5-Botu Semen reg + 5mM cysteine G6 = ACP-105 reg

+ 5mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5U of Glutathione Peroxidase + + and 5 mM

Cysteine G8 = ACP-105 reg + 5U of Glutathione Peroxidase + 5mM cysteine Samples

from each experimental group were placed in triplicate in two boxes of cooling (14 deg C)

semen type Botutainer reg Semen samples were assessed as total motility vigor

membrane integrity acrosome integrity and mitochondrial membrane potential

immediately after arrival at the laboratory making the time zero (T0) and after 12

(T12h) 24 (T24h) and 36 hours (T36h) cooled to 14 oC

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

13

SUMAacuteRIO

Paacutegina

AGRADECIMENTOS

LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

RESUMO

ABSTRACT

1 INTRODUCcedilAtildeO 14

2 REVISAtildeO DE LITERATURA 16

21 Espermatozoacuteides 16

22 Plasma seminal 16

23 Preservaccedilatildeo do secircmen por refrigeraccedilatildeo 17

24 Fatores que afetam a viabilidade do secircmen equumlino refrigerado 18

25 Diluente para secircmen 19

26 Espeacutecies reativas de oxigecircnio e Antioxidantes

261 Glutationa peroxidase (GPx)

262 Cisteiacutena

27 Meacutetodos de avaliaccedilatildeo do secircmen equino com sondas fluorescentes

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio

(IP)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

273 Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin

(FITC-PNA)

3 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

4 EXPERIMENTO

21

22

23

24

25

25

26

28

34

41 Efeito do diluente e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa

peroxidase e cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos

refrigerados

35

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 61

14

1 INTRODUCcedilAtildeO

A inseminaccedilatildeo artificial (IA) em equumlinos eacute uma teacutecnica bastante desenvolvida e vem

sendo usada com grande frequumlecircncia nesta espeacutecie Esta bioteacutecnica tambeacutem eacute muito

utilizada em outras espeacutecies de produccedilatildeo como bovinos caprinos ovinos e animais de

companhia como os caninos As principais vantagens do seu uso satildeo reduccedilatildeo no custo

do transporte dos animais que se encontram em diferentes localidades uso de um

ejaculado para mais de uma fecircmea e proteccedilatildeo contra as doenccedilas sexualmente

transmissiacuteveis Esta teacutecnica eacute relativamente simples e implica na obtenccedilatildeo preacutevia do

secircmen para posterior uso in natura refrigerado ou congelado

Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios

estudos vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores quanto agrave

preservaccedilatildeo e manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua

deposiccedilatildeo no trato reprodutivo da fecircmea Como a refrigeraccedilatildeo trata-se de um processo

de criopreservaccedilatildeo faz-se necessaacuterio a adiccedilatildeo do diluente ao secircmen cuja funccedilatildeo eacute

aumentar o volume do ejaculado e proteger as ceacutelulas espermaacuteticas dos efeitos

deleteacuterios da criopreservaccedilatildeo (PENtildeA 2000)

As propriedades protetoras do diluente satildeo atribuiacutedas aos seus diferentes

componentes agrave interaccedilatildeo com as ceacutelulas espermaacuteticas de uma determinada espeacutecie e ao

indiviacuteduo (CUNHA e LOPES 2003) O diluente mais utilizado na espeacutecie equina satildeo

aqueles agrave base de leite desnatado com disponibilidade comercial de vaacuterios produtos

Com o advento da busca por produtos que natildeo sejam de origem animal a aacutegua

de coco tem se mostrado uma boa alternativa com accedilatildeo beneacutefica sobre a conservaccedilatildeo

celular Todavia existem poucos estudos utilizando este diluente em amostras de secircmen

na espeacutecie equina Na apresentaccedilatildeo em poacute semelhante aos diluentes convencionais

disponiacuteveis no mercado a aacutegua de coco (ACP-105) eacute obtida por um processo de alta

desidrataccedilatildeo a vaacutecuo e proporciona as mesmas vantagens quanto ao transporte e

acondicionamento assim como a praticidade dos diluentes comerciais de origem animal

(SOBREIRA NETO 2008)

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas que vivem em ambiente com condiccedilotildees

aeroacutebicas mas o metabolismo bioloacutegico oxidativo das moleacuteculas eacute potencialmente

toacutexico devido agrave formaccedilatildeo de espeacutecies reativas do oxigecircnio conhecidas como ROS

(BOUNHER et al 2000) As ROS incluem um grande nuacutemero de moleacuteculas

15

quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o

radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso

algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees

normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos

espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados

avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas

substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies

Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente

para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa

peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado

tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-

Secircmenreg)

16

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

21 Espermatozoacuteides

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam

revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios

proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica

esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se

encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA

(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de

parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo

onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de

fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da

zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da

cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em

forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula

(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na

peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute

envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide

(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)

22 Plasma Seminal

Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees

espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros

componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as

proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo

fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e

a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al

1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)

As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa

dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias

17

antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como

vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000

ALMEIDA e BALL 2005)

Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como

aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos

imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias

quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)

Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem

entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al

1996)

A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das

substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que

a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta

com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)

Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em

relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e

HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)

Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos

comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma

deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que

corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua

viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave

criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica

(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de

criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do

ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do

plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos

componentes celulares (BRINSKO et al 2000)

23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo

As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo

reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu

armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A

18

refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves

ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais

elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina

(ENGLAND e PONZIO 1996)

A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste

em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente

controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na

reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)

A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que

proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de

temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da

temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)

Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de

secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg

II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo

elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo

mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais

resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-

Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento

maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o

armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas

(SOBREIRA NETO 2008)

Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de

no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen

for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis

por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado

satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e

ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)

24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado

De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da

temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos

aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de

19

refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o

espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica

apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em

constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO

1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel

e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por

conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo

devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)

Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os

espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em

enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos

reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e

AMANN 1992)

Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram

que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas

moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol

manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)

recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas

decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no

intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas

Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo

de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT

1993)

25 Diluentes para Secircmen Equino

Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado

visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os

espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra

proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os

produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema

enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)

Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada

poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e

20

principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de

proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e

Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica

tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios

na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios

presentes no plasma

Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os

carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico

(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar

em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma

presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-

albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia

dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)

Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em

todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos

(AMMAN e PICKETT 1987)

Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de

coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis

com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e

gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes

necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm

sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando

resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)

ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos

(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES

e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos

espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade

total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito

positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie

(SILVEIRA NETO 2008)

21

26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes

O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade

fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo

A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo

Maxwell e Stojanov (1996)

Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de

ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides

(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de

motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e

extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)

O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa

antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS

principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase

glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de

defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por

sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias

ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)

Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do

agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo

jaacute ocorrida

Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute

limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido

danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila

intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos

protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo

espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios

espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)

Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo

in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios

estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando

substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)

22

261 Glutationa peroxidase (GPx)

Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa

peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa

a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)

A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute

presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de

forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de

proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns

problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais

as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser

bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas

relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As

ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a

exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das

membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de

defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente

em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)

Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em

1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias

A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das

concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da

accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al

2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2

e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em

GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)

A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada

quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta

enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao

restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem

disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos

mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de

DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA

e GUERRA 2007)

23

Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx

3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao

espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2

e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel

pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da

GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da

condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima

tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na

espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide

maduro (MAIA 2003)

262 Cisteiacutena

A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol

com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas

eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante

(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na

prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)

Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na

proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em

experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem

demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente

antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)

Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena

em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos

sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen

No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de

cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a

sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram

diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e

obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen

descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM

de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas

em javalis

24

Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na

proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da

membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a

glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios

com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos

27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes

A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante

A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave

concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de

contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que

apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981

CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um

meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da

maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto

com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de

avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen

Analyses)

Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo

de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e

nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da

integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia

a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de

comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-

se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se

obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz

visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)

Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o

maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em

comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com

a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na

25

estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica

emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com

maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada

devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)

A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de

viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e

IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de

fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)

O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem

interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo

e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana

espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando

expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana

integra (GARNER e JONHSON 1995)

O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este

composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se

observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON

e VICKER 1990)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas

Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela

produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o

movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a

mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular

A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada

em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999

Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser

utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta

espeacutecie

26

O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de

membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui

baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a

detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia

(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros

conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com

elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode

formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo

assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo

(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na

faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com

comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)

Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de

membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no

interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)

273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)

O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel

quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud

OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que

conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o

acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do

amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se

ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a

associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em

suas avaliaccedilotildees de acrossoma

A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia

permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol

ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e

pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a

barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a

fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa

caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A

27

colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da

membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo

sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana

plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas

ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001

RAITHI et al 2001)

28

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4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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9

Tabela 1 - Valores meacutedios de motilidade total vigor

alto porcentual de

membrana

mitocondrial

(aPMM) integridade

de membrana (IM) e

integridade de

acrossoma de

espermatozoides

equinos apoacutes a

refrigeraccedilatildeo com e

sem adiccedilatildeo de

substacircncias

antioxidantes

54

Tabela 2 - Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre

variaacuteveis do secircmen de equinos antes e apoacutes

a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de

substacircncias

antioxidantes

55

Tabela 3 - Valores com a meacutedia geral e o desvio

padratildeo da motilidade total em funccedilatildeo dos

tempos avaliados (T0 T12h T24h e T36h)

para cada grupo

testado

57

10

LISTA DE FIGURAS

Paacutegina

Figura 1 - Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em

funccedilatildeo dos tempos avaliados dos paracircmetros de

motilidade vigor integridade de membrana (IM)

integridade de acrossoma (IAC) e alto potencial de

membrana mitocondrial (APMM) de espermatozoides

equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo adicionados ou natildeo

com diferentes antioxidantes

60

11

RESUMO

Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios estudos

vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores da preservaccedilatildeo e

manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua deposiccedilatildeo no

trato reprodutivo da fecircmea O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito dos diluentes

(Botu-Secircmenreg e ACP-105reg) e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos refrigerados Foram utilizados

quatro reprodutores da raccedila Mangalarga Marchador os quais foram submetidos a

colheitas de secircmen com vagina artificial e uma fecircmea como manequim Apoacutes colheita

as amostras de secircmen de cada garanhatildeo foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg A seguir a fraccedilatildeo de cada diluidor foi fracionada para constituir os grupos

experimentais G1 = Botu-Secircmenreg (sem antioxidante) G2 = ACP-105reg (sem

antioxidante) G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg +

5U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg

+ 5mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen do tipo Botutainerreg As amostras de secircmen foram

submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total vigor integridade de membrana

integridade de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial imediatamente apoacutes a

chegada ao Laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0) assim como apoacutes 12 (T12h)

24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC

Palavras-chave ACP-105reg Botu-Secircmenreg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

12

ABSTRACT

In equine chilled semen is the most used in the IAs Therefore several studies have

been conducted in order to obtain better results in preserving and maintaining the

viability of sperm cells until the time of his deposition in the female reproductive tract

The objective was to study the effect of diluents (Botu-Semen reg and ACP-105 reg) and

the addition of the antioxidants cysteine and glutathione peroxidase in the viability of

equine spermatozoa cooled We used four players Mangalarga Marchador which were

subjected to semen collection with an artificial vagina and as a female mannequin After

harvest samples of semen from each stallion were evaluated and diluted semen-Botu reg

or ACP-105 reg Then the fraction of each extender was fractionated to form the

experimental groups G1 = Botu reg-Semen (no antioxidant) G2 = ACP-105 reg (without

antioxidant) G3 = Botu-Semen reg + 5U of Glutathione Peroxidase G4 = ACP-105 reg +

5U of Glutathione Peroxidase = G5-Botu Semen reg + 5mM cysteine G6 = ACP-105 reg

+ 5mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5U of Glutathione Peroxidase + + and 5 mM

Cysteine G8 = ACP-105 reg + 5U of Glutathione Peroxidase + 5mM cysteine Samples

from each experimental group were placed in triplicate in two boxes of cooling (14 deg C)

semen type Botutainer reg Semen samples were assessed as total motility vigor

membrane integrity acrosome integrity and mitochondrial membrane potential

immediately after arrival at the laboratory making the time zero (T0) and after 12

(T12h) 24 (T24h) and 36 hours (T36h) cooled to 14 oC

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

13

SUMAacuteRIO

Paacutegina

AGRADECIMENTOS

LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

RESUMO

ABSTRACT

1 INTRODUCcedilAtildeO 14

2 REVISAtildeO DE LITERATURA 16

21 Espermatozoacuteides 16

22 Plasma seminal 16

23 Preservaccedilatildeo do secircmen por refrigeraccedilatildeo 17

24 Fatores que afetam a viabilidade do secircmen equumlino refrigerado 18

25 Diluente para secircmen 19

26 Espeacutecies reativas de oxigecircnio e Antioxidantes

261 Glutationa peroxidase (GPx)

262 Cisteiacutena

27 Meacutetodos de avaliaccedilatildeo do secircmen equino com sondas fluorescentes

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio

(IP)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

273 Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin

(FITC-PNA)

3 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

4 EXPERIMENTO

21

22

23

24

25

25

26

28

34

41 Efeito do diluente e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa

peroxidase e cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos

refrigerados

35

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 61

14

1 INTRODUCcedilAtildeO

A inseminaccedilatildeo artificial (IA) em equumlinos eacute uma teacutecnica bastante desenvolvida e vem

sendo usada com grande frequumlecircncia nesta espeacutecie Esta bioteacutecnica tambeacutem eacute muito

utilizada em outras espeacutecies de produccedilatildeo como bovinos caprinos ovinos e animais de

companhia como os caninos As principais vantagens do seu uso satildeo reduccedilatildeo no custo

do transporte dos animais que se encontram em diferentes localidades uso de um

ejaculado para mais de uma fecircmea e proteccedilatildeo contra as doenccedilas sexualmente

transmissiacuteveis Esta teacutecnica eacute relativamente simples e implica na obtenccedilatildeo preacutevia do

secircmen para posterior uso in natura refrigerado ou congelado

Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios

estudos vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores quanto agrave

preservaccedilatildeo e manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua

deposiccedilatildeo no trato reprodutivo da fecircmea Como a refrigeraccedilatildeo trata-se de um processo

de criopreservaccedilatildeo faz-se necessaacuterio a adiccedilatildeo do diluente ao secircmen cuja funccedilatildeo eacute

aumentar o volume do ejaculado e proteger as ceacutelulas espermaacuteticas dos efeitos

deleteacuterios da criopreservaccedilatildeo (PENtildeA 2000)

As propriedades protetoras do diluente satildeo atribuiacutedas aos seus diferentes

componentes agrave interaccedilatildeo com as ceacutelulas espermaacuteticas de uma determinada espeacutecie e ao

indiviacuteduo (CUNHA e LOPES 2003) O diluente mais utilizado na espeacutecie equina satildeo

aqueles agrave base de leite desnatado com disponibilidade comercial de vaacuterios produtos

Com o advento da busca por produtos que natildeo sejam de origem animal a aacutegua

de coco tem se mostrado uma boa alternativa com accedilatildeo beneacutefica sobre a conservaccedilatildeo

celular Todavia existem poucos estudos utilizando este diluente em amostras de secircmen

na espeacutecie equina Na apresentaccedilatildeo em poacute semelhante aos diluentes convencionais

disponiacuteveis no mercado a aacutegua de coco (ACP-105) eacute obtida por um processo de alta

desidrataccedilatildeo a vaacutecuo e proporciona as mesmas vantagens quanto ao transporte e

acondicionamento assim como a praticidade dos diluentes comerciais de origem animal

(SOBREIRA NETO 2008)

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas que vivem em ambiente com condiccedilotildees

aeroacutebicas mas o metabolismo bioloacutegico oxidativo das moleacuteculas eacute potencialmente

toacutexico devido agrave formaccedilatildeo de espeacutecies reativas do oxigecircnio conhecidas como ROS

(BOUNHER et al 2000) As ROS incluem um grande nuacutemero de moleacuteculas

15

quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o

radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso

algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees

normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos

espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados

avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas

substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies

Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente

para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa

peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado

tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-

Secircmenreg)

16

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

21 Espermatozoacuteides

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam

revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios

proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica

esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se

encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA

(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de

parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo

onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de

fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da

zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da

cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em

forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula

(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na

peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute

envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide

(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)

22 Plasma Seminal

Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees

espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros

componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as

proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo

fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e

a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al

1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)

As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa

dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias

17

antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como

vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000

ALMEIDA e BALL 2005)

Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como

aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos

imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias

quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)

Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem

entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al

1996)

A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das

substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que

a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta

com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)

Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em

relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e

HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)

Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos

comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma

deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que

corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua

viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave

criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica

(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de

criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do

ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do

plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos

componentes celulares (BRINSKO et al 2000)

23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo

As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo

reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu

armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A

18

refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves

ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais

elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina

(ENGLAND e PONZIO 1996)

A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste

em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente

controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na

reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)

A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que

proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de

temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da

temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)

Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de

secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg

II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo

elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo

mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais

resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-

Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento

maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o

armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas

(SOBREIRA NETO 2008)

Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de

no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen

for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis

por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado

satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e

ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)

24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado

De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da

temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos

aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de

19

refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o

espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica

apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em

constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO

1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel

e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por

conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo

devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)

Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os

espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em

enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos

reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e

AMANN 1992)

Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram

que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas

moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol

manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)

recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas

decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no

intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas

Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo

de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT

1993)

25 Diluentes para Secircmen Equino

Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado

visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os

espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra

proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os

produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema

enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)

Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada

poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e

20

principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de

proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e

Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica

tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios

na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios

presentes no plasma

Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os

carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico

(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar

em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma

presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-

albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia

dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)

Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em

todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos

(AMMAN e PICKETT 1987)

Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de

coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis

com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e

gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes

necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm

sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando

resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)

ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos

(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES

e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos

espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade

total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito

positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie

(SILVEIRA NETO 2008)

21

26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes

O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade

fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo

A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo

Maxwell e Stojanov (1996)

Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de

ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides

(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de

motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e

extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)

O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa

antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS

principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase

glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de

defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por

sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias

ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)

Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do

agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo

jaacute ocorrida

Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute

limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido

danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila

intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos

protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo

espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios

espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)

Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo

in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios

estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando

substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)

22

261 Glutationa peroxidase (GPx)

Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa

peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa

a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)

A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute

presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de

forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de

proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns

problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais

as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser

bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas

relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As

ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a

exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das

membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de

defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente

em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)

Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em

1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias

A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das

concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da

accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al

2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2

e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em

GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)

A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada

quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta

enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao

restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem

disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos

mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de

DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA

e GUERRA 2007)

23

Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx

3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao

espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2

e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel

pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da

GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da

condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima

tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na

espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide

maduro (MAIA 2003)

262 Cisteiacutena

A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol

com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas

eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante

(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na

prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)

Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na

proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em

experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem

demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente

antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)

Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena

em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos

sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen

No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de

cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a

sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram

diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e

obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen

descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM

de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas

em javalis

24

Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na

proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da

membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a

glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios

com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos

27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes

A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante

A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave

concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de

contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que

apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981

CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um

meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da

maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto

com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de

avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen

Analyses)

Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo

de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e

nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da

integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia

a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de

comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-

se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se

obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz

visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)

Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o

maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em

comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com

a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na

25

estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica

emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com

maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada

devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)

A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de

viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e

IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de

fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)

O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem

interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo

e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana

espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando

expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana

integra (GARNER e JONHSON 1995)

O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este

composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se

observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON

e VICKER 1990)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas

Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela

produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o

movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a

mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular

A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada

em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999

Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser

utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta

espeacutecie

26

O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de

membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui

baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a

detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia

(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros

conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com

elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode

formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo

assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo

(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na

faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com

comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)

Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de

membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no

interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)

273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)

O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel

quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud

OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que

conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o

acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do

amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se

ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a

associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em

suas avaliaccedilotildees de acrossoma

A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia

permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol

ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e

pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a

barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a

fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa

caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A

27

colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da

membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo

sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana

plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas

ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001

RAITHI et al 2001)

28

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34

4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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infertile men Urology v 55 n 6 p 922-926 2000

54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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10

LISTA DE FIGURAS

Paacutegina

Figura 1 - Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em

funccedilatildeo dos tempos avaliados dos paracircmetros de

motilidade vigor integridade de membrana (IM)

integridade de acrossoma (IAC) e alto potencial de

membrana mitocondrial (APMM) de espermatozoides

equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo adicionados ou natildeo

com diferentes antioxidantes

60

11

RESUMO

Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios estudos

vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores da preservaccedilatildeo e

manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua deposiccedilatildeo no

trato reprodutivo da fecircmea O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito dos diluentes

(Botu-Secircmenreg e ACP-105reg) e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos refrigerados Foram utilizados

quatro reprodutores da raccedila Mangalarga Marchador os quais foram submetidos a

colheitas de secircmen com vagina artificial e uma fecircmea como manequim Apoacutes colheita

as amostras de secircmen de cada garanhatildeo foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg A seguir a fraccedilatildeo de cada diluidor foi fracionada para constituir os grupos

experimentais G1 = Botu-Secircmenreg (sem antioxidante) G2 = ACP-105reg (sem

antioxidante) G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg +

5U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg

+ 5mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen do tipo Botutainerreg As amostras de secircmen foram

submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total vigor integridade de membrana

integridade de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial imediatamente apoacutes a

chegada ao Laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0) assim como apoacutes 12 (T12h)

24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC

Palavras-chave ACP-105reg Botu-Secircmenreg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

12

ABSTRACT

In equine chilled semen is the most used in the IAs Therefore several studies have

been conducted in order to obtain better results in preserving and maintaining the

viability of sperm cells until the time of his deposition in the female reproductive tract

The objective was to study the effect of diluents (Botu-Semen reg and ACP-105 reg) and

the addition of the antioxidants cysteine and glutathione peroxidase in the viability of

equine spermatozoa cooled We used four players Mangalarga Marchador which were

subjected to semen collection with an artificial vagina and as a female mannequin After

harvest samples of semen from each stallion were evaluated and diluted semen-Botu reg

or ACP-105 reg Then the fraction of each extender was fractionated to form the

experimental groups G1 = Botu reg-Semen (no antioxidant) G2 = ACP-105 reg (without

antioxidant) G3 = Botu-Semen reg + 5U of Glutathione Peroxidase G4 = ACP-105 reg +

5U of Glutathione Peroxidase = G5-Botu Semen reg + 5mM cysteine G6 = ACP-105 reg

+ 5mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5U of Glutathione Peroxidase + + and 5 mM

Cysteine G8 = ACP-105 reg + 5U of Glutathione Peroxidase + 5mM cysteine Samples

from each experimental group were placed in triplicate in two boxes of cooling (14 deg C)

semen type Botutainer reg Semen samples were assessed as total motility vigor

membrane integrity acrosome integrity and mitochondrial membrane potential

immediately after arrival at the laboratory making the time zero (T0) and after 12

(T12h) 24 (T24h) and 36 hours (T36h) cooled to 14 oC

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

13

SUMAacuteRIO

Paacutegina

AGRADECIMENTOS

LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

RESUMO

ABSTRACT

1 INTRODUCcedilAtildeO 14

2 REVISAtildeO DE LITERATURA 16

21 Espermatozoacuteides 16

22 Plasma seminal 16

23 Preservaccedilatildeo do secircmen por refrigeraccedilatildeo 17

24 Fatores que afetam a viabilidade do secircmen equumlino refrigerado 18

25 Diluente para secircmen 19

26 Espeacutecies reativas de oxigecircnio e Antioxidantes

261 Glutationa peroxidase (GPx)

262 Cisteiacutena

27 Meacutetodos de avaliaccedilatildeo do secircmen equino com sondas fluorescentes

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio

(IP)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

273 Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin

(FITC-PNA)

3 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

4 EXPERIMENTO

21

22

23

24

25

25

26

28

34

41 Efeito do diluente e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa

peroxidase e cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos

refrigerados

35

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 61

14

1 INTRODUCcedilAtildeO

A inseminaccedilatildeo artificial (IA) em equumlinos eacute uma teacutecnica bastante desenvolvida e vem

sendo usada com grande frequumlecircncia nesta espeacutecie Esta bioteacutecnica tambeacutem eacute muito

utilizada em outras espeacutecies de produccedilatildeo como bovinos caprinos ovinos e animais de

companhia como os caninos As principais vantagens do seu uso satildeo reduccedilatildeo no custo

do transporte dos animais que se encontram em diferentes localidades uso de um

ejaculado para mais de uma fecircmea e proteccedilatildeo contra as doenccedilas sexualmente

transmissiacuteveis Esta teacutecnica eacute relativamente simples e implica na obtenccedilatildeo preacutevia do

secircmen para posterior uso in natura refrigerado ou congelado

Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios

estudos vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores quanto agrave

preservaccedilatildeo e manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua

deposiccedilatildeo no trato reprodutivo da fecircmea Como a refrigeraccedilatildeo trata-se de um processo

de criopreservaccedilatildeo faz-se necessaacuterio a adiccedilatildeo do diluente ao secircmen cuja funccedilatildeo eacute

aumentar o volume do ejaculado e proteger as ceacutelulas espermaacuteticas dos efeitos

deleteacuterios da criopreservaccedilatildeo (PENtildeA 2000)

As propriedades protetoras do diluente satildeo atribuiacutedas aos seus diferentes

componentes agrave interaccedilatildeo com as ceacutelulas espermaacuteticas de uma determinada espeacutecie e ao

indiviacuteduo (CUNHA e LOPES 2003) O diluente mais utilizado na espeacutecie equina satildeo

aqueles agrave base de leite desnatado com disponibilidade comercial de vaacuterios produtos

Com o advento da busca por produtos que natildeo sejam de origem animal a aacutegua

de coco tem se mostrado uma boa alternativa com accedilatildeo beneacutefica sobre a conservaccedilatildeo

celular Todavia existem poucos estudos utilizando este diluente em amostras de secircmen

na espeacutecie equina Na apresentaccedilatildeo em poacute semelhante aos diluentes convencionais

disponiacuteveis no mercado a aacutegua de coco (ACP-105) eacute obtida por um processo de alta

desidrataccedilatildeo a vaacutecuo e proporciona as mesmas vantagens quanto ao transporte e

acondicionamento assim como a praticidade dos diluentes comerciais de origem animal

(SOBREIRA NETO 2008)

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas que vivem em ambiente com condiccedilotildees

aeroacutebicas mas o metabolismo bioloacutegico oxidativo das moleacuteculas eacute potencialmente

toacutexico devido agrave formaccedilatildeo de espeacutecies reativas do oxigecircnio conhecidas como ROS

(BOUNHER et al 2000) As ROS incluem um grande nuacutemero de moleacuteculas

15

quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o

radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso

algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees

normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos

espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados

avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas

substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies

Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente

para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa

peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado

tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-

Secircmenreg)

16

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

21 Espermatozoacuteides

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam

revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios

proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica

esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se

encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA

(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de

parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo

onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de

fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da

zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da

cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em

forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula

(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na

peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute

envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide

(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)

22 Plasma Seminal

Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees

espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros

componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as

proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo

fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e

a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al

1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)

As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa

dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias

17

antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como

vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000

ALMEIDA e BALL 2005)

Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como

aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos

imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias

quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)

Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem

entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al

1996)

A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das

substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que

a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta

com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)

Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em

relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e

HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)

Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos

comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma

deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que

corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua

viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave

criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica

(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de

criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do

ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do

plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos

componentes celulares (BRINSKO et al 2000)

23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo

As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo

reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu

armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A

18

refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves

ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais

elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina

(ENGLAND e PONZIO 1996)

A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste

em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente

controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na

reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)

A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que

proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de

temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da

temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)

Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de

secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg

II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo

elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo

mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais

resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-

Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento

maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o

armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas

(SOBREIRA NETO 2008)

Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de

no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen

for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis

por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado

satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e

ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)

24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado

De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da

temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos

aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de

19

refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o

espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica

apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em

constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO

1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel

e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por

conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo

devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)

Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os

espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em

enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos

reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e

AMANN 1992)

Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram

que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas

moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol

manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)

recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas

decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no

intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas

Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo

de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT

1993)

25 Diluentes para Secircmen Equino

Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado

visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os

espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra

proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os

produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema

enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)

Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada

poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e

20

principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de

proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e

Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica

tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios

na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios

presentes no plasma

Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os

carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico

(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar

em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma

presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-

albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia

dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)

Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em

todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos

(AMMAN e PICKETT 1987)

Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de

coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis

com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e

gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes

necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm

sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando

resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)

ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos

(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES

e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos

espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade

total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito

positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie

(SILVEIRA NETO 2008)

21

26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes

O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade

fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo

A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo

Maxwell e Stojanov (1996)

Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de

ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides

(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de

motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e

extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)

O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa

antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS

principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase

glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de

defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por

sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias

ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)

Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do

agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo

jaacute ocorrida

Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute

limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido

danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila

intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos

protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo

espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios

espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)

Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo

in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios

estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando

substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)

22

261 Glutationa peroxidase (GPx)

Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa

peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa

a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)

A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute

presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de

forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de

proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns

problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais

as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser

bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas

relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As

ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a

exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das

membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de

defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente

em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)

Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em

1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias

A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das

concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da

accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al

2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2

e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em

GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)

A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada

quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta

enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao

restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem

disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos

mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de

DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA

e GUERRA 2007)

23

Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx

3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao

espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2

e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel

pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da

GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da

condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima

tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na

espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide

maduro (MAIA 2003)

262 Cisteiacutena

A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol

com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas

eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante

(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na

prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)

Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na

proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em

experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem

demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente

antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)

Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena

em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos

sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen

No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de

cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a

sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram

diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e

obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen

descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM

de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas

em javalis

24

Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na

proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da

membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a

glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios

com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos

27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes

A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante

A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave

concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de

contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que

apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981

CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um

meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da

maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto

com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de

avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen

Analyses)

Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo

de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e

nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da

integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia

a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de

comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-

se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se

obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz

visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)

Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o

maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em

comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com

a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na

25

estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica

emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com

maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada

devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)

A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de

viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e

IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de

fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)

O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem

interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo

e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana

espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando

expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana

integra (GARNER e JONHSON 1995)

O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este

composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se

observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON

e VICKER 1990)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas

Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela

produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o

movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a

mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular

A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada

em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999

Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser

utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta

espeacutecie

26

O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de

membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui

baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a

detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia

(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros

conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com

elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode

formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo

assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo

(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na

faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com

comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)

Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de

membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no

interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)

273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)

O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel

quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud

OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que

conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o

acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do

amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se

ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a

associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em

suas avaliaccedilotildees de acrossoma

A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia

permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol

ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e

pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a

barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a

fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa

caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A

27

colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da

membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo

sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana

plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas

ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001

RAITHI et al 2001)

28

3 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

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4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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Page 13: EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA …livros01.livrosgratis.com.br/cp150379.pdf · 2016-01-26 · EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA ADIÇÃO DE

11

RESUMO

Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios estudos

vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores da preservaccedilatildeo e

manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua deposiccedilatildeo no

trato reprodutivo da fecircmea O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito dos diluentes

(Botu-Secircmenreg e ACP-105reg) e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos refrigerados Foram utilizados

quatro reprodutores da raccedila Mangalarga Marchador os quais foram submetidos a

colheitas de secircmen com vagina artificial e uma fecircmea como manequim Apoacutes colheita

as amostras de secircmen de cada garanhatildeo foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg A seguir a fraccedilatildeo de cada diluidor foi fracionada para constituir os grupos

experimentais G1 = Botu-Secircmenreg (sem antioxidante) G2 = ACP-105reg (sem

antioxidante) G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg +

5U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg

+ 5mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen do tipo Botutainerreg As amostras de secircmen foram

submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total vigor integridade de membrana

integridade de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial imediatamente apoacutes a

chegada ao Laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0) assim como apoacutes 12 (T12h)

24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC

Palavras-chave ACP-105reg Botu-Secircmenreg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

12

ABSTRACT

In equine chilled semen is the most used in the IAs Therefore several studies have

been conducted in order to obtain better results in preserving and maintaining the

viability of sperm cells until the time of his deposition in the female reproductive tract

The objective was to study the effect of diluents (Botu-Semen reg and ACP-105 reg) and

the addition of the antioxidants cysteine and glutathione peroxidase in the viability of

equine spermatozoa cooled We used four players Mangalarga Marchador which were

subjected to semen collection with an artificial vagina and as a female mannequin After

harvest samples of semen from each stallion were evaluated and diluted semen-Botu reg

or ACP-105 reg Then the fraction of each extender was fractionated to form the

experimental groups G1 = Botu reg-Semen (no antioxidant) G2 = ACP-105 reg (without

antioxidant) G3 = Botu-Semen reg + 5U of Glutathione Peroxidase G4 = ACP-105 reg +

5U of Glutathione Peroxidase = G5-Botu Semen reg + 5mM cysteine G6 = ACP-105 reg

+ 5mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5U of Glutathione Peroxidase + + and 5 mM

Cysteine G8 = ACP-105 reg + 5U of Glutathione Peroxidase + 5mM cysteine Samples

from each experimental group were placed in triplicate in two boxes of cooling (14 deg C)

semen type Botutainer reg Semen samples were assessed as total motility vigor

membrane integrity acrosome integrity and mitochondrial membrane potential

immediately after arrival at the laboratory making the time zero (T0) and after 12

(T12h) 24 (T24h) and 36 hours (T36h) cooled to 14 oC

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

13

SUMAacuteRIO

Paacutegina

AGRADECIMENTOS

LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

RESUMO

ABSTRACT

1 INTRODUCcedilAtildeO 14

2 REVISAtildeO DE LITERATURA 16

21 Espermatozoacuteides 16

22 Plasma seminal 16

23 Preservaccedilatildeo do secircmen por refrigeraccedilatildeo 17

24 Fatores que afetam a viabilidade do secircmen equumlino refrigerado 18

25 Diluente para secircmen 19

26 Espeacutecies reativas de oxigecircnio e Antioxidantes

261 Glutationa peroxidase (GPx)

262 Cisteiacutena

27 Meacutetodos de avaliaccedilatildeo do secircmen equino com sondas fluorescentes

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio

(IP)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

273 Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin

(FITC-PNA)

3 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

4 EXPERIMENTO

21

22

23

24

25

25

26

28

34

41 Efeito do diluente e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa

peroxidase e cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos

refrigerados

35

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 61

14

1 INTRODUCcedilAtildeO

A inseminaccedilatildeo artificial (IA) em equumlinos eacute uma teacutecnica bastante desenvolvida e vem

sendo usada com grande frequumlecircncia nesta espeacutecie Esta bioteacutecnica tambeacutem eacute muito

utilizada em outras espeacutecies de produccedilatildeo como bovinos caprinos ovinos e animais de

companhia como os caninos As principais vantagens do seu uso satildeo reduccedilatildeo no custo

do transporte dos animais que se encontram em diferentes localidades uso de um

ejaculado para mais de uma fecircmea e proteccedilatildeo contra as doenccedilas sexualmente

transmissiacuteveis Esta teacutecnica eacute relativamente simples e implica na obtenccedilatildeo preacutevia do

secircmen para posterior uso in natura refrigerado ou congelado

Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios

estudos vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores quanto agrave

preservaccedilatildeo e manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua

deposiccedilatildeo no trato reprodutivo da fecircmea Como a refrigeraccedilatildeo trata-se de um processo

de criopreservaccedilatildeo faz-se necessaacuterio a adiccedilatildeo do diluente ao secircmen cuja funccedilatildeo eacute

aumentar o volume do ejaculado e proteger as ceacutelulas espermaacuteticas dos efeitos

deleteacuterios da criopreservaccedilatildeo (PENtildeA 2000)

As propriedades protetoras do diluente satildeo atribuiacutedas aos seus diferentes

componentes agrave interaccedilatildeo com as ceacutelulas espermaacuteticas de uma determinada espeacutecie e ao

indiviacuteduo (CUNHA e LOPES 2003) O diluente mais utilizado na espeacutecie equina satildeo

aqueles agrave base de leite desnatado com disponibilidade comercial de vaacuterios produtos

Com o advento da busca por produtos que natildeo sejam de origem animal a aacutegua

de coco tem se mostrado uma boa alternativa com accedilatildeo beneacutefica sobre a conservaccedilatildeo

celular Todavia existem poucos estudos utilizando este diluente em amostras de secircmen

na espeacutecie equina Na apresentaccedilatildeo em poacute semelhante aos diluentes convencionais

disponiacuteveis no mercado a aacutegua de coco (ACP-105) eacute obtida por um processo de alta

desidrataccedilatildeo a vaacutecuo e proporciona as mesmas vantagens quanto ao transporte e

acondicionamento assim como a praticidade dos diluentes comerciais de origem animal

(SOBREIRA NETO 2008)

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas que vivem em ambiente com condiccedilotildees

aeroacutebicas mas o metabolismo bioloacutegico oxidativo das moleacuteculas eacute potencialmente

toacutexico devido agrave formaccedilatildeo de espeacutecies reativas do oxigecircnio conhecidas como ROS

(BOUNHER et al 2000) As ROS incluem um grande nuacutemero de moleacuteculas

15

quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o

radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso

algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees

normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos

espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados

avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas

substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies

Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente

para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa

peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado

tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-

Secircmenreg)

16

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

21 Espermatozoacuteides

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam

revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios

proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica

esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se

encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA

(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de

parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo

onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de

fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da

zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da

cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em

forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula

(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na

peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute

envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide

(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)

22 Plasma Seminal

Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees

espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros

componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as

proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo

fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e

a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al

1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)

As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa

dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias

17

antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como

vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000

ALMEIDA e BALL 2005)

Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como

aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos

imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias

quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)

Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem

entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al

1996)

A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das

substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que

a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta

com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)

Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em

relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e

HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)

Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos

comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma

deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que

corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua

viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave

criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica

(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de

criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do

ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do

plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos

componentes celulares (BRINSKO et al 2000)

23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo

As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo

reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu

armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A

18

refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves

ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais

elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina

(ENGLAND e PONZIO 1996)

A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste

em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente

controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na

reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)

A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que

proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de

temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da

temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)

Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de

secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg

II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo

elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo

mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais

resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-

Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento

maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o

armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas

(SOBREIRA NETO 2008)

Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de

no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen

for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis

por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado

satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e

ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)

24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado

De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da

temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos

aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de

19

refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o

espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica

apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em

constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO

1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel

e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por

conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo

devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)

Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os

espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em

enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos

reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e

AMANN 1992)

Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram

que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas

moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol

manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)

recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas

decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no

intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas

Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo

de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT

1993)

25 Diluentes para Secircmen Equino

Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado

visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os

espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra

proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os

produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema

enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)

Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada

poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e

20

principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de

proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e

Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica

tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios

na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios

presentes no plasma

Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os

carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico

(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar

em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma

presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-

albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia

dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)

Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em

todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos

(AMMAN e PICKETT 1987)

Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de

coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis

com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e

gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes

necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm

sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando

resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)

ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos

(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES

e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos

espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade

total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito

positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie

(SILVEIRA NETO 2008)

21

26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes

O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade

fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo

A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo

Maxwell e Stojanov (1996)

Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de

ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides

(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de

motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e

extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)

O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa

antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS

principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase

glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de

defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por

sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias

ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)

Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do

agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo

jaacute ocorrida

Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute

limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido

danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila

intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos

protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo

espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios

espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)

Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo

in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios

estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando

substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)

22

261 Glutationa peroxidase (GPx)

Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa

peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa

a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)

A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute

presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de

forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de

proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns

problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais

as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser

bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas

relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As

ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a

exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das

membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de

defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente

em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)

Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em

1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias

A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das

concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da

accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al

2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2

e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em

GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)

A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada

quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta

enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao

restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem

disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos

mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de

DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA

e GUERRA 2007)

23

Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx

3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao

espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2

e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel

pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da

GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da

condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima

tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na

espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide

maduro (MAIA 2003)

262 Cisteiacutena

A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol

com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas

eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante

(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na

prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)

Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na

proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em

experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem

demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente

antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)

Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena

em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos

sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen

No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de

cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a

sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram

diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e

obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen

descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM

de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas

em javalis

24

Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na

proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da

membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a

glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios

com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos

27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes

A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante

A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave

concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de

contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que

apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981

CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um

meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da

maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto

com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de

avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen

Analyses)

Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo

de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e

nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da

integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia

a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de

comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-

se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se

obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz

visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)

Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o

maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em

comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com

a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na

25

estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica

emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com

maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada

devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)

A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de

viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e

IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de

fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)

O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem

interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo

e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana

espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando

expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana

integra (GARNER e JONHSON 1995)

O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este

composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se

observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON

e VICKER 1990)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas

Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela

produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o

movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a

mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular

A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada

em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999

Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser

utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta

espeacutecie

26

O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de

membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui

baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a

detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia

(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros

conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com

elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode

formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo

assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo

(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na

faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com

comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)

Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de

membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no

interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)

273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)

O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel

quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud

OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que

conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o

acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do

amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se

ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a

associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em

suas avaliaccedilotildees de acrossoma

A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia

permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol

ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e

pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a

barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a

fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa

caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A

27

colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da

membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo

sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana

plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas

ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001

RAITHI et al 2001)

28

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4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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12

ABSTRACT

In equine chilled semen is the most used in the IAs Therefore several studies have

been conducted in order to obtain better results in preserving and maintaining the

viability of sperm cells until the time of his deposition in the female reproductive tract

The objective was to study the effect of diluents (Botu-Semen reg and ACP-105 reg) and

the addition of the antioxidants cysteine and glutathione peroxidase in the viability of

equine spermatozoa cooled We used four players Mangalarga Marchador which were

subjected to semen collection with an artificial vagina and as a female mannequin After

harvest samples of semen from each stallion were evaluated and diluted semen-Botu reg

or ACP-105 reg Then the fraction of each extender was fractionated to form the

experimental groups G1 = Botu reg-Semen (no antioxidant) G2 = ACP-105 reg (without

antioxidant) G3 = Botu-Semen reg + 5U of Glutathione Peroxidase G4 = ACP-105 reg +

5U of Glutathione Peroxidase = G5-Botu Semen reg + 5mM cysteine G6 = ACP-105 reg

+ 5mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5U of Glutathione Peroxidase + + and 5 mM

Cysteine G8 = ACP-105 reg + 5U of Glutathione Peroxidase + 5mM cysteine Samples

from each experimental group were placed in triplicate in two boxes of cooling (14 deg C)

semen type Botutainer reg Semen samples were assessed as total motility vigor

membrane integrity acrosome integrity and mitochondrial membrane potential

immediately after arrival at the laboratory making the time zero (T0) and after 12

(T12h) 24 (T24h) and 36 hours (T36h) cooled to 14 oC

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

13

SUMAacuteRIO

Paacutegina

AGRADECIMENTOS

LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

RESUMO

ABSTRACT

1 INTRODUCcedilAtildeO 14

2 REVISAtildeO DE LITERATURA 16

21 Espermatozoacuteides 16

22 Plasma seminal 16

23 Preservaccedilatildeo do secircmen por refrigeraccedilatildeo 17

24 Fatores que afetam a viabilidade do secircmen equumlino refrigerado 18

25 Diluente para secircmen 19

26 Espeacutecies reativas de oxigecircnio e Antioxidantes

261 Glutationa peroxidase (GPx)

262 Cisteiacutena

27 Meacutetodos de avaliaccedilatildeo do secircmen equino com sondas fluorescentes

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio

(IP)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

273 Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin

(FITC-PNA)

3 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

4 EXPERIMENTO

21

22

23

24

25

25

26

28

34

41 Efeito do diluente e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa

peroxidase e cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos

refrigerados

35

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 61

14

1 INTRODUCcedilAtildeO

A inseminaccedilatildeo artificial (IA) em equumlinos eacute uma teacutecnica bastante desenvolvida e vem

sendo usada com grande frequumlecircncia nesta espeacutecie Esta bioteacutecnica tambeacutem eacute muito

utilizada em outras espeacutecies de produccedilatildeo como bovinos caprinos ovinos e animais de

companhia como os caninos As principais vantagens do seu uso satildeo reduccedilatildeo no custo

do transporte dos animais que se encontram em diferentes localidades uso de um

ejaculado para mais de uma fecircmea e proteccedilatildeo contra as doenccedilas sexualmente

transmissiacuteveis Esta teacutecnica eacute relativamente simples e implica na obtenccedilatildeo preacutevia do

secircmen para posterior uso in natura refrigerado ou congelado

Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios

estudos vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores quanto agrave

preservaccedilatildeo e manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua

deposiccedilatildeo no trato reprodutivo da fecircmea Como a refrigeraccedilatildeo trata-se de um processo

de criopreservaccedilatildeo faz-se necessaacuterio a adiccedilatildeo do diluente ao secircmen cuja funccedilatildeo eacute

aumentar o volume do ejaculado e proteger as ceacutelulas espermaacuteticas dos efeitos

deleteacuterios da criopreservaccedilatildeo (PENtildeA 2000)

As propriedades protetoras do diluente satildeo atribuiacutedas aos seus diferentes

componentes agrave interaccedilatildeo com as ceacutelulas espermaacuteticas de uma determinada espeacutecie e ao

indiviacuteduo (CUNHA e LOPES 2003) O diluente mais utilizado na espeacutecie equina satildeo

aqueles agrave base de leite desnatado com disponibilidade comercial de vaacuterios produtos

Com o advento da busca por produtos que natildeo sejam de origem animal a aacutegua

de coco tem se mostrado uma boa alternativa com accedilatildeo beneacutefica sobre a conservaccedilatildeo

celular Todavia existem poucos estudos utilizando este diluente em amostras de secircmen

na espeacutecie equina Na apresentaccedilatildeo em poacute semelhante aos diluentes convencionais

disponiacuteveis no mercado a aacutegua de coco (ACP-105) eacute obtida por um processo de alta

desidrataccedilatildeo a vaacutecuo e proporciona as mesmas vantagens quanto ao transporte e

acondicionamento assim como a praticidade dos diluentes comerciais de origem animal

(SOBREIRA NETO 2008)

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas que vivem em ambiente com condiccedilotildees

aeroacutebicas mas o metabolismo bioloacutegico oxidativo das moleacuteculas eacute potencialmente

toacutexico devido agrave formaccedilatildeo de espeacutecies reativas do oxigecircnio conhecidas como ROS

(BOUNHER et al 2000) As ROS incluem um grande nuacutemero de moleacuteculas

15

quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o

radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso

algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees

normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos

espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados

avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas

substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies

Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente

para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa

peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado

tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-

Secircmenreg)

16

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

21 Espermatozoacuteides

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam

revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios

proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica

esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se

encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA

(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de

parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo

onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de

fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da

zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da

cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em

forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula

(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na

peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute

envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide

(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)

22 Plasma Seminal

Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees

espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros

componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as

proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo

fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e

a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al

1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)

As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa

dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias

17

antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como

vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000

ALMEIDA e BALL 2005)

Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como

aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos

imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias

quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)

Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem

entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al

1996)

A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das

substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que

a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta

com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)

Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em

relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e

HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)

Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos

comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma

deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que

corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua

viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave

criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica

(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de

criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do

ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do

plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos

componentes celulares (BRINSKO et al 2000)

23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo

As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo

reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu

armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A

18

refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves

ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais

elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina

(ENGLAND e PONZIO 1996)

A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste

em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente

controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na

reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)

A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que

proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de

temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da

temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)

Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de

secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg

II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo

elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo

mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais

resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-

Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento

maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o

armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas

(SOBREIRA NETO 2008)

Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de

no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen

for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis

por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado

satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e

ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)

24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado

De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da

temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos

aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de

19

refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o

espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica

apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em

constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO

1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel

e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por

conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo

devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)

Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os

espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em

enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos

reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e

AMANN 1992)

Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram

que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas

moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol

manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)

recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas

decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no

intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas

Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo

de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT

1993)

25 Diluentes para Secircmen Equino

Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado

visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os

espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra

proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os

produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema

enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)

Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada

poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e

20

principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de

proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e

Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica

tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios

na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios

presentes no plasma

Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os

carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico

(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar

em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma

presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-

albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia

dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)

Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em

todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos

(AMMAN e PICKETT 1987)

Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de

coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis

com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e

gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes

necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm

sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando

resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)

ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos

(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES

e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos

espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade

total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito

positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie

(SILVEIRA NETO 2008)

21

26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes

O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade

fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo

A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo

Maxwell e Stojanov (1996)

Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de

ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides

(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de

motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e

extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)

O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa

antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS

principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase

glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de

defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por

sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias

ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)

Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do

agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo

jaacute ocorrida

Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute

limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido

danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila

intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos

protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo

espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios

espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)

Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo

in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios

estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando

substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)

22

261 Glutationa peroxidase (GPx)

Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa

peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa

a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)

A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute

presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de

forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de

proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns

problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais

as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser

bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas

relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As

ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a

exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das

membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de

defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente

em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)

Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em

1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias

A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das

concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da

accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al

2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2

e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em

GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)

A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada

quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta

enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao

restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem

disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos

mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de

DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA

e GUERRA 2007)

23

Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx

3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao

espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2

e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel

pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da

GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da

condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima

tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na

espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide

maduro (MAIA 2003)

262 Cisteiacutena

A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol

com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas

eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante

(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na

prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)

Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na

proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em

experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem

demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente

antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)

Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena

em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos

sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen

No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de

cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a

sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram

diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e

obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen

descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM

de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas

em javalis

24

Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na

proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da

membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a

glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios

com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos

27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes

A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante

A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave

concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de

contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que

apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981

CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um

meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da

maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto

com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de

avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen

Analyses)

Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo

de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e

nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da

integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia

a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de

comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-

se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se

obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz

visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)

Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o

maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em

comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com

a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na

25

estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica

emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com

maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada

devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)

A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de

viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e

IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de

fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)

O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem

interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo

e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana

espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando

expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana

integra (GARNER e JONHSON 1995)

O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este

composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se

observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON

e VICKER 1990)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas

Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela

produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o

movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a

mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular

A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada

em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999

Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser

utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta

espeacutecie

26

O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de

membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui

baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a

detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia

(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros

conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com

elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode

formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo

assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo

(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na

faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com

comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)

Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de

membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no

interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)

273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)

O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel

quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud

OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que

conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o

acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do

amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se

ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a

associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em

suas avaliaccedilotildees de acrossoma

A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia

permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol

ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e

pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a

barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a

fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa

caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A

27

colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da

membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo

sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana

plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas

ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001

RAITHI et al 2001)

28

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34

4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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13

SUMAacuteRIO

Paacutegina

AGRADECIMENTOS

LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

RESUMO

ABSTRACT

1 INTRODUCcedilAtildeO 14

2 REVISAtildeO DE LITERATURA 16

21 Espermatozoacuteides 16

22 Plasma seminal 16

23 Preservaccedilatildeo do secircmen por refrigeraccedilatildeo 17

24 Fatores que afetam a viabilidade do secircmen equumlino refrigerado 18

25 Diluente para secircmen 19

26 Espeacutecies reativas de oxigecircnio e Antioxidantes

261 Glutationa peroxidase (GPx)

262 Cisteiacutena

27 Meacutetodos de avaliaccedilatildeo do secircmen equino com sondas fluorescentes

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio

(IP)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

273 Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin

(FITC-PNA)

3 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

4 EXPERIMENTO

21

22

23

24

25

25

26

28

34

41 Efeito do diluente e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa

peroxidase e cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos

refrigerados

35

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 61

14

1 INTRODUCcedilAtildeO

A inseminaccedilatildeo artificial (IA) em equumlinos eacute uma teacutecnica bastante desenvolvida e vem

sendo usada com grande frequumlecircncia nesta espeacutecie Esta bioteacutecnica tambeacutem eacute muito

utilizada em outras espeacutecies de produccedilatildeo como bovinos caprinos ovinos e animais de

companhia como os caninos As principais vantagens do seu uso satildeo reduccedilatildeo no custo

do transporte dos animais que se encontram em diferentes localidades uso de um

ejaculado para mais de uma fecircmea e proteccedilatildeo contra as doenccedilas sexualmente

transmissiacuteveis Esta teacutecnica eacute relativamente simples e implica na obtenccedilatildeo preacutevia do

secircmen para posterior uso in natura refrigerado ou congelado

Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios

estudos vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores quanto agrave

preservaccedilatildeo e manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua

deposiccedilatildeo no trato reprodutivo da fecircmea Como a refrigeraccedilatildeo trata-se de um processo

de criopreservaccedilatildeo faz-se necessaacuterio a adiccedilatildeo do diluente ao secircmen cuja funccedilatildeo eacute

aumentar o volume do ejaculado e proteger as ceacutelulas espermaacuteticas dos efeitos

deleteacuterios da criopreservaccedilatildeo (PENtildeA 2000)

As propriedades protetoras do diluente satildeo atribuiacutedas aos seus diferentes

componentes agrave interaccedilatildeo com as ceacutelulas espermaacuteticas de uma determinada espeacutecie e ao

indiviacuteduo (CUNHA e LOPES 2003) O diluente mais utilizado na espeacutecie equina satildeo

aqueles agrave base de leite desnatado com disponibilidade comercial de vaacuterios produtos

Com o advento da busca por produtos que natildeo sejam de origem animal a aacutegua

de coco tem se mostrado uma boa alternativa com accedilatildeo beneacutefica sobre a conservaccedilatildeo

celular Todavia existem poucos estudos utilizando este diluente em amostras de secircmen

na espeacutecie equina Na apresentaccedilatildeo em poacute semelhante aos diluentes convencionais

disponiacuteveis no mercado a aacutegua de coco (ACP-105) eacute obtida por um processo de alta

desidrataccedilatildeo a vaacutecuo e proporciona as mesmas vantagens quanto ao transporte e

acondicionamento assim como a praticidade dos diluentes comerciais de origem animal

(SOBREIRA NETO 2008)

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas que vivem em ambiente com condiccedilotildees

aeroacutebicas mas o metabolismo bioloacutegico oxidativo das moleacuteculas eacute potencialmente

toacutexico devido agrave formaccedilatildeo de espeacutecies reativas do oxigecircnio conhecidas como ROS

(BOUNHER et al 2000) As ROS incluem um grande nuacutemero de moleacuteculas

15

quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o

radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso

algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees

normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos

espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados

avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas

substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies

Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente

para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa

peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado

tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-

Secircmenreg)

16

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

21 Espermatozoacuteides

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam

revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios

proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica

esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se

encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA

(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de

parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo

onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de

fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da

zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da

cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em

forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula

(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na

peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute

envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide

(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)

22 Plasma Seminal

Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees

espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros

componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as

proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo

fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e

a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al

1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)

As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa

dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias

17

antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como

vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000

ALMEIDA e BALL 2005)

Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como

aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos

imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias

quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)

Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem

entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al

1996)

A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das

substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que

a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta

com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)

Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em

relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e

HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)

Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos

comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma

deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que

corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua

viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave

criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica

(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de

criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do

ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do

plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos

componentes celulares (BRINSKO et al 2000)

23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo

As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo

reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu

armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A

18

refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves

ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais

elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina

(ENGLAND e PONZIO 1996)

A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste

em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente

controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na

reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)

A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que

proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de

temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da

temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)

Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de

secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg

II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo

elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo

mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais

resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-

Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento

maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o

armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas

(SOBREIRA NETO 2008)

Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de

no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen

for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis

por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado

satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e

ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)

24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado

De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da

temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos

aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de

19

refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o

espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica

apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em

constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO

1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel

e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por

conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo

devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)

Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os

espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em

enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos

reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e

AMANN 1992)

Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram

que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas

moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol

manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)

recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas

decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no

intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas

Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo

de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT

1993)

25 Diluentes para Secircmen Equino

Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado

visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os

espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra

proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os

produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema

enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)

Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada

poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e

20

principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de

proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e

Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica

tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios

na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios

presentes no plasma

Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os

carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico

(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar

em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma

presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-

albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia

dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)

Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em

todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos

(AMMAN e PICKETT 1987)

Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de

coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis

com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e

gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes

necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm

sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando

resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)

ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos

(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES

e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos

espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade

total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito

positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie

(SILVEIRA NETO 2008)

21

26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes

O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade

fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo

A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo

Maxwell e Stojanov (1996)

Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de

ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides

(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de

motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e

extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)

O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa

antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS

principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase

glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de

defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por

sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias

ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)

Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do

agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo

jaacute ocorrida

Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute

limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido

danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila

intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos

protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo

espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios

espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)

Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo

in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios

estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando

substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)

22

261 Glutationa peroxidase (GPx)

Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa

peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa

a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)

A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute

presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de

forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de

proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns

problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais

as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser

bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas

relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As

ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a

exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das

membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de

defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente

em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)

Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em

1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias

A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das

concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da

accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al

2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2

e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em

GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)

A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada

quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta

enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao

restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem

disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos

mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de

DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA

e GUERRA 2007)

23

Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx

3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao

espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2

e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel

pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da

GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da

condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima

tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na

espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide

maduro (MAIA 2003)

262 Cisteiacutena

A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol

com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas

eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante

(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na

prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)

Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na

proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em

experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem

demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente

antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)

Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena

em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos

sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen

No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de

cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a

sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram

diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e

obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen

descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM

de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas

em javalis

24

Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na

proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da

membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a

glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios

com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos

27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes

A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante

A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave

concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de

contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que

apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981

CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um

meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da

maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto

com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de

avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen

Analyses)

Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo

de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e

nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da

integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia

a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de

comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-

se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se

obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz

visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)

Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o

maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em

comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com

a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na

25

estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica

emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com

maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada

devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)

A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de

viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e

IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de

fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)

O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem

interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo

e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana

espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando

expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana

integra (GARNER e JONHSON 1995)

O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este

composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se

observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON

e VICKER 1990)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas

Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela

produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o

movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a

mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular

A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada

em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999

Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser

utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta

espeacutecie

26

O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de

membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui

baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a

detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia

(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros

conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com

elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode

formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo

assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo

(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na

faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com

comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)

Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de

membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no

interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)

273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)

O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel

quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud

OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que

conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o

acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do

amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se

ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a

associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em

suas avaliaccedilotildees de acrossoma

A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia

permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol

ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e

pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a

barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a

fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa

caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A

27

colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da

membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo

sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana

plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas

ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001

RAITHI et al 2001)

28

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4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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14

1 INTRODUCcedilAtildeO

A inseminaccedilatildeo artificial (IA) em equumlinos eacute uma teacutecnica bastante desenvolvida e vem

sendo usada com grande frequumlecircncia nesta espeacutecie Esta bioteacutecnica tambeacutem eacute muito

utilizada em outras espeacutecies de produccedilatildeo como bovinos caprinos ovinos e animais de

companhia como os caninos As principais vantagens do seu uso satildeo reduccedilatildeo no custo

do transporte dos animais que se encontram em diferentes localidades uso de um

ejaculado para mais de uma fecircmea e proteccedilatildeo contra as doenccedilas sexualmente

transmissiacuteveis Esta teacutecnica eacute relativamente simples e implica na obtenccedilatildeo preacutevia do

secircmen para posterior uso in natura refrigerado ou congelado

Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios

estudos vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores quanto agrave

preservaccedilatildeo e manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua

deposiccedilatildeo no trato reprodutivo da fecircmea Como a refrigeraccedilatildeo trata-se de um processo

de criopreservaccedilatildeo faz-se necessaacuterio a adiccedilatildeo do diluente ao secircmen cuja funccedilatildeo eacute

aumentar o volume do ejaculado e proteger as ceacutelulas espermaacuteticas dos efeitos

deleteacuterios da criopreservaccedilatildeo (PENtildeA 2000)

As propriedades protetoras do diluente satildeo atribuiacutedas aos seus diferentes

componentes agrave interaccedilatildeo com as ceacutelulas espermaacuteticas de uma determinada espeacutecie e ao

indiviacuteduo (CUNHA e LOPES 2003) O diluente mais utilizado na espeacutecie equina satildeo

aqueles agrave base de leite desnatado com disponibilidade comercial de vaacuterios produtos

Com o advento da busca por produtos que natildeo sejam de origem animal a aacutegua

de coco tem se mostrado uma boa alternativa com accedilatildeo beneacutefica sobre a conservaccedilatildeo

celular Todavia existem poucos estudos utilizando este diluente em amostras de secircmen

na espeacutecie equina Na apresentaccedilatildeo em poacute semelhante aos diluentes convencionais

disponiacuteveis no mercado a aacutegua de coco (ACP-105) eacute obtida por um processo de alta

desidrataccedilatildeo a vaacutecuo e proporciona as mesmas vantagens quanto ao transporte e

acondicionamento assim como a praticidade dos diluentes comerciais de origem animal

(SOBREIRA NETO 2008)

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas que vivem em ambiente com condiccedilotildees

aeroacutebicas mas o metabolismo bioloacutegico oxidativo das moleacuteculas eacute potencialmente

toacutexico devido agrave formaccedilatildeo de espeacutecies reativas do oxigecircnio conhecidas como ROS

(BOUNHER et al 2000) As ROS incluem um grande nuacutemero de moleacuteculas

15

quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o

radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso

algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees

normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos

espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados

avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas

substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies

Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente

para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa

peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado

tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-

Secircmenreg)

16

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

21 Espermatozoacuteides

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam

revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios

proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica

esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se

encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA

(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de

parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo

onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de

fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da

zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da

cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em

forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula

(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na

peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute

envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide

(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)

22 Plasma Seminal

Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees

espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros

componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as

proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo

fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e

a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al

1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)

As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa

dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias

17

antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como

vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000

ALMEIDA e BALL 2005)

Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como

aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos

imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias

quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)

Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem

entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al

1996)

A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das

substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que

a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta

com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)

Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em

relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e

HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)

Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos

comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma

deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que

corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua

viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave

criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica

(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de

criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do

ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do

plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos

componentes celulares (BRINSKO et al 2000)

23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo

As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo

reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu

armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A

18

refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves

ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais

elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina

(ENGLAND e PONZIO 1996)

A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste

em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente

controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na

reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)

A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que

proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de

temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da

temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)

Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de

secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg

II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo

elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo

mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais

resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-

Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento

maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o

armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas

(SOBREIRA NETO 2008)

Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de

no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen

for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis

por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado

satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e

ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)

24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado

De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da

temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos

aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de

19

refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o

espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica

apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em

constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO

1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel

e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por

conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo

devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)

Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os

espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em

enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos

reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e

AMANN 1992)

Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram

que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas

moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol

manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)

recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas

decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no

intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas

Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo

de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT

1993)

25 Diluentes para Secircmen Equino

Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado

visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os

espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra

proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os

produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema

enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)

Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada

poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e

20

principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de

proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e

Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica

tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios

na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios

presentes no plasma

Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os

carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico

(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar

em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma

presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-

albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia

dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)

Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em

todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos

(AMMAN e PICKETT 1987)

Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de

coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis

com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e

gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes

necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm

sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando

resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)

ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos

(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES

e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos

espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade

total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito

positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie

(SILVEIRA NETO 2008)

21

26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes

O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade

fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo

A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo

Maxwell e Stojanov (1996)

Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de

ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides

(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de

motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e

extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)

O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa

antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS

principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase

glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de

defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por

sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias

ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)

Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do

agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo

jaacute ocorrida

Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute

limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido

danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila

intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos

protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo

espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios

espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)

Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo

in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios

estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando

substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)

22

261 Glutationa peroxidase (GPx)

Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa

peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa

a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)

A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute

presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de

forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de

proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns

problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais

as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser

bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas

relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As

ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a

exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das

membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de

defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente

em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)

Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em

1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias

A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das

concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da

accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al

2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2

e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em

GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)

A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada

quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta

enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao

restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem

disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos

mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de

DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA

e GUERRA 2007)

23

Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx

3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao

espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2

e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel

pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da

GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da

condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima

tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na

espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide

maduro (MAIA 2003)

262 Cisteiacutena

A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol

com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas

eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante

(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na

prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)

Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na

proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em

experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem

demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente

antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)

Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena

em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos

sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen

No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de

cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a

sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram

diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e

obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen

descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM

de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas

em javalis

24

Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na

proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da

membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a

glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios

com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos

27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes

A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante

A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave

concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de

contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que

apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981

CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um

meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da

maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto

com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de

avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen

Analyses)

Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo

de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e

nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da

integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia

a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de

comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-

se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se

obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz

visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)

Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o

maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em

comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com

a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na

25

estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica

emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com

maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada

devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)

A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de

viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e

IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de

fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)

O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem

interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo

e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana

espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando

expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana

integra (GARNER e JONHSON 1995)

O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este

composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se

observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON

e VICKER 1990)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas

Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela

produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o

movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a

mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular

A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada

em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999

Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser

utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta

espeacutecie

26

O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de

membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui

baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a

detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia

(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros

conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com

elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode

formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo

assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo

(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na

faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com

comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)

Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de

membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no

interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)

273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)

O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel

quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud

OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que

conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o

acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do

amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se

ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a

associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em

suas avaliaccedilotildees de acrossoma

A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia

permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol

ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e

pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a

barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a

fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa

caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A

27

colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da

membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo

sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana

plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas

ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001

RAITHI et al 2001)

28

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4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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Page 17: EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA …livros01.livrosgratis.com.br/cp150379.pdf · 2016-01-26 · EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA ADIÇÃO DE

15

quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o

radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso

algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees

normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos

espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados

avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas

substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies

Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente

para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa

peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado

tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-

Secircmenreg)

16

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

21 Espermatozoacuteides

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam

revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios

proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica

esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se

encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA

(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de

parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo

onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de

fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da

zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da

cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em

forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula

(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na

peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute

envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide

(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)

22 Plasma Seminal

Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees

espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros

componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as

proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo

fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e

a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al

1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)

As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa

dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias

17

antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como

vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000

ALMEIDA e BALL 2005)

Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como

aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos

imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias

quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)

Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem

entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al

1996)

A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das

substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que

a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta

com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)

Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em

relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e

HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)

Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos

comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma

deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que

corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua

viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave

criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica

(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de

criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do

ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do

plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos

componentes celulares (BRINSKO et al 2000)

23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo

As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo

reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu

armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A

18

refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves

ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais

elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina

(ENGLAND e PONZIO 1996)

A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste

em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente

controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na

reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)

A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que

proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de

temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da

temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)

Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de

secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg

II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo

elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo

mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais

resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-

Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento

maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o

armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas

(SOBREIRA NETO 2008)

Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de

no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen

for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis

por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado

satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e

ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)

24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado

De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da

temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos

aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de

19

refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o

espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica

apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em

constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO

1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel

e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por

conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo

devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)

Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os

espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em

enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos

reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e

AMANN 1992)

Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram

que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas

moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol

manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)

recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas

decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no

intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas

Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo

de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT

1993)

25 Diluentes para Secircmen Equino

Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado

visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os

espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra

proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os

produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema

enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)

Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada

poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e

20

principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de

proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e

Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica

tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios

na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios

presentes no plasma

Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os

carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico

(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar

em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma

presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-

albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia

dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)

Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em

todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos

(AMMAN e PICKETT 1987)

Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de

coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis

com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e

gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes

necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm

sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando

resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)

ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos

(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES

e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos

espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade

total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito

positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie

(SILVEIRA NETO 2008)

21

26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes

O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade

fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo

A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo

Maxwell e Stojanov (1996)

Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de

ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides

(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de

motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e

extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)

O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa

antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS

principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase

glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de

defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por

sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias

ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)

Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do

agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo

jaacute ocorrida

Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute

limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido

danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila

intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos

protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo

espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios

espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)

Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo

in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios

estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando

substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)

22

261 Glutationa peroxidase (GPx)

Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa

peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa

a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)

A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute

presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de

forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de

proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns

problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais

as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser

bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas

relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As

ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a

exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das

membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de

defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente

em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)

Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em

1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias

A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das

concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da

accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al

2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2

e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em

GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)

A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada

quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta

enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao

restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem

disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos

mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de

DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA

e GUERRA 2007)

23

Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx

3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao

espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2

e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel

pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da

GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da

condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima

tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na

espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide

maduro (MAIA 2003)

262 Cisteiacutena

A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol

com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas

eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante

(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na

prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)

Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na

proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em

experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem

demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente

antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)

Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena

em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos

sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen

No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de

cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a

sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram

diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e

obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen

descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM

de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas

em javalis

24

Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na

proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da

membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a

glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios

com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos

27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes

A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante

A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave

concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de

contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que

apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981

CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um

meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da

maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto

com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de

avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen

Analyses)

Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo

de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e

nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da

integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia

a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de

comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-

se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se

obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz

visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)

Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o

maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em

comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com

a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na

25

estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica

emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com

maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada

devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)

A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de

viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e

IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de

fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)

O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem

interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo

e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana

espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando

expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana

integra (GARNER e JONHSON 1995)

O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este

composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se

observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON

e VICKER 1990)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas

Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela

produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o

movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a

mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular

A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada

em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999

Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser

utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta

espeacutecie

26

O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de

membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui

baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a

detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia

(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros

conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com

elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode

formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo

assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo

(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na

faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com

comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)

Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de

membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no

interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)

273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)

O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel

quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud

OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que

conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o

acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do

amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se

ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a

associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em

suas avaliaccedilotildees de acrossoma

A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia

permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol

ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e

pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a

barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a

fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa

caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A

27

colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da

membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo

sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana

plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas

ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001

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4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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Page 18: EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA …livros01.livrosgratis.com.br/cp150379.pdf · 2016-01-26 · EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA ADIÇÃO DE

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2 REVISAtildeO DE LITERATURA

21 Espermatozoacuteides

Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam

revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios

proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica

esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se

encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA

(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de

parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo

onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de

fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da

zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da

cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em

forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula

(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na

peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute

envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide

(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)

22 Plasma Seminal

Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees

espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros

componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as

proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo

fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e

a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al

1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)

As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa

dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias

17

antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como

vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000

ALMEIDA e BALL 2005)

Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como

aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos

imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias

quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)

Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem

entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al

1996)

A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das

substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que

a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta

com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)

Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em

relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e

HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)

Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos

comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma

deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que

corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua

viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave

criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica

(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de

criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do

ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do

plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos

componentes celulares (BRINSKO et al 2000)

23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo

As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo

reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu

armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A

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refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves

ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais

elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina

(ENGLAND e PONZIO 1996)

A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste

em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente

controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na

reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)

A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que

proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de

temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da

temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)

Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de

secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg

II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo

elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo

mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais

resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-

Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento

maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o

armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas

(SOBREIRA NETO 2008)

Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de

no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen

for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis

por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado

satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e

ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)

24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado

De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da

temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos

aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de

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refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o

espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica

apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em

constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO

1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel

e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por

conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo

devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)

Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os

espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em

enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos

reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e

AMANN 1992)

Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram

que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas

moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol

manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)

recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas

decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no

intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas

Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo

de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT

1993)

25 Diluentes para Secircmen Equino

Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado

visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os

espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra

proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os

produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema

enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)

Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada

poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e

20

principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de

proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e

Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica

tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios

na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios

presentes no plasma

Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os

carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico

(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar

em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma

presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-

albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia

dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)

Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em

todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos

(AMMAN e PICKETT 1987)

Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de

coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis

com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e

gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes

necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm

sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando

resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)

ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos

(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES

e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos

espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade

total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito

positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie

(SILVEIRA NETO 2008)

21

26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes

O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade

fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo

A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo

Maxwell e Stojanov (1996)

Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de

ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides

(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de

motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e

extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)

O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa

antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS

principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase

glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de

defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por

sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias

ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)

Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do

agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo

jaacute ocorrida

Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute

limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido

danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila

intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos

protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo

espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios

espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)

Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo

in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios

estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando

substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)

22

261 Glutationa peroxidase (GPx)

Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa

peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa

a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)

A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute

presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de

forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de

proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns

problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais

as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser

bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas

relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As

ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a

exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das

membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de

defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente

em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)

Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em

1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias

A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das

concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da

accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al

2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2

e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em

GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)

A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada

quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta

enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao

restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem

disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos

mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de

DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA

e GUERRA 2007)

23

Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx

3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao

espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2

e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel

pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da

GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da

condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima

tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na

espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide

maduro (MAIA 2003)

262 Cisteiacutena

A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol

com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas

eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante

(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na

prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)

Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na

proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em

experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem

demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente

antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)

Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena

em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos

sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen

No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de

cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a

sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram

diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e

obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen

descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM

de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas

em javalis

24

Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na

proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da

membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a

glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios

com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos

27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes

A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante

A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave

concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de

contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que

apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981

CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um

meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da

maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto

com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de

avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen

Analyses)

Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo

de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e

nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da

integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia

a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de

comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-

se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se

obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz

visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)

Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o

maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em

comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com

a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na

25

estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica

emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com

maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada

devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)

A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de

viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e

IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de

fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)

O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem

interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo

e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana

espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando

expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana

integra (GARNER e JONHSON 1995)

O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este

composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se

observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON

e VICKER 1990)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas

Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela

produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o

movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a

mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular

A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada

em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999

Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser

utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta

espeacutecie

26

O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de

membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui

baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a

detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia

(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros

conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com

elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode

formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo

assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo

(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na

faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com

comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)

Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de

membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no

interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)

273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)

O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel

quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud

OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que

conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o

acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do

amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se

ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a

associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em

suas avaliaccedilotildees de acrossoma

A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia

permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol

ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e

pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a

barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a

fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa

caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A

27

colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da

membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo

sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana

plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas

ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001

RAITHI et al 2001)

28

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4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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Page 19: EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA …livros01.livrosgratis.com.br/cp150379.pdf · 2016-01-26 · EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA ADIÇÃO DE

17

antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como

vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000

ALMEIDA e BALL 2005)

Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como

aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos

imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias

quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)

Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem

entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al

1996)

A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das

substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que

a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta

com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)

Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em

relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e

HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)

Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos

comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma

deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que

corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua

viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave

criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica

(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de

criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do

ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do

plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos

componentes celulares (BRINSKO et al 2000)

23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo

As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo

reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu

armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A

18

refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves

ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais

elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina

(ENGLAND e PONZIO 1996)

A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste

em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente

controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na

reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)

A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que

proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de

temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da

temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)

Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de

secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg

II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo

elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo

mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais

resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-

Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento

maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o

armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas

(SOBREIRA NETO 2008)

Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de

no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen

for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis

por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado

satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e

ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)

24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado

De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da

temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos

aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de

19

refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o

espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica

apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em

constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO

1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel

e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por

conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo

devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)

Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os

espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em

enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos

reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e

AMANN 1992)

Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram

que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas

moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol

manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)

recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas

decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no

intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas

Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo

de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT

1993)

25 Diluentes para Secircmen Equino

Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado

visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os

espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra

proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os

produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema

enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)

Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada

poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e

20

principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de

proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e

Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica

tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios

na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios

presentes no plasma

Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os

carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico

(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar

em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma

presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-

albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia

dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)

Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em

todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos

(AMMAN e PICKETT 1987)

Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de

coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis

com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e

gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes

necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm

sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando

resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)

ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos

(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES

e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos

espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade

total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito

positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie

(SILVEIRA NETO 2008)

21

26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes

O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade

fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo

A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo

Maxwell e Stojanov (1996)

Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de

ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides

(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de

motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e

extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)

O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa

antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS

principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase

glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de

defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por

sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias

ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)

Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do

agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo

jaacute ocorrida

Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute

limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido

danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila

intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos

protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo

espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios

espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)

Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo

in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios

estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando

substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)

22

261 Glutationa peroxidase (GPx)

Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa

peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa

a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)

A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute

presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de

forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de

proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns

problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais

as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser

bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas

relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As

ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a

exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das

membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de

defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente

em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)

Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em

1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias

A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das

concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da

accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al

2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2

e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em

GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)

A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada

quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta

enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao

restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem

disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos

mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de

DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA

e GUERRA 2007)

23

Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx

3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao

espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2

e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel

pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da

GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da

condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima

tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na

espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide

maduro (MAIA 2003)

262 Cisteiacutena

A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol

com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas

eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante

(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na

prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)

Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na

proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em

experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem

demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente

antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)

Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena

em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos

sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen

No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de

cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a

sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram

diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e

obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen

descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM

de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas

em javalis

24

Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na

proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da

membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a

glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios

com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos

27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes

A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante

A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave

concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de

contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que

apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981

CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um

meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da

maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto

com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de

avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen

Analyses)

Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo

de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e

nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da

integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia

a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de

comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-

se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se

obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz

visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)

Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o

maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em

comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com

a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na

25

estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica

emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com

maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada

devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)

A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de

viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e

IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de

fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)

O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem

interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo

e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana

espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando

expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana

integra (GARNER e JONHSON 1995)

O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este

composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se

observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON

e VICKER 1990)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas

Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela

produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o

movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a

mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular

A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada

em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999

Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser

utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta

espeacutecie

26

O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de

membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui

baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a

detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia

(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros

conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com

elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode

formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo

assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo

(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na

faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com

comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)

Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de

membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no

interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)

273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)

O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel

quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud

OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que

conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o

acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do

amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se

ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a

associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em

suas avaliaccedilotildees de acrossoma

A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia

permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol

ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e

pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a

barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a

fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa

caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A

27

colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da

membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo

sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana

plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas

ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001

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4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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Page 20: EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA …livros01.livrosgratis.com.br/cp150379.pdf · 2016-01-26 · EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA ADIÇÃO DE

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refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves

ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais

elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina

(ENGLAND e PONZIO 1996)

A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste

em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente

controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na

reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)

A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que

proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de

temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da

temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)

Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de

secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg

II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo

elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo

mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais

resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-

Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento

maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o

armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas

(SOBREIRA NETO 2008)

Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de

no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen

for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis

por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado

satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e

ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)

24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado

De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da

temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos

aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de

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refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o

espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica

apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em

constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO

1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel

e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por

conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo

devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)

Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os

espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em

enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos

reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e

AMANN 1992)

Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram

que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas

moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol

manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)

recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas

decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no

intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas

Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo

de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT

1993)

25 Diluentes para Secircmen Equino

Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado

visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os

espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra

proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os

produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema

enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)

Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada

poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e

20

principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de

proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e

Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica

tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios

na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios

presentes no plasma

Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os

carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico

(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar

em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma

presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-

albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia

dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)

Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em

todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos

(AMMAN e PICKETT 1987)

Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de

coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis

com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e

gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes

necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm

sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando

resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)

ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos

(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES

e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos

espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade

total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito

positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie

(SILVEIRA NETO 2008)

21

26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes

O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade

fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo

A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo

Maxwell e Stojanov (1996)

Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de

ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides

(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de

motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e

extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)

O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa

antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS

principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase

glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de

defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por

sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias

ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)

Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do

agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo

jaacute ocorrida

Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute

limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido

danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila

intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos

protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo

espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios

espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)

Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo

in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios

estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando

substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)

22

261 Glutationa peroxidase (GPx)

Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa

peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa

a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)

A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute

presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de

forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de

proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns

problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais

as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser

bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas

relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As

ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a

exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das

membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de

defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente

em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)

Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em

1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias

A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das

concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da

accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al

2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2

e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em

GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)

A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada

quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta

enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao

restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem

disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos

mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de

DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA

e GUERRA 2007)

23

Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx

3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao

espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2

e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel

pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da

GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da

condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima

tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na

espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide

maduro (MAIA 2003)

262 Cisteiacutena

A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol

com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas

eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante

(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na

prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)

Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na

proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em

experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem

demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente

antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)

Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena

em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos

sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen

No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de

cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a

sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram

diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e

obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen

descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM

de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas

em javalis

24

Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na

proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da

membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a

glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios

com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos

27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes

A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante

A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave

concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de

contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que

apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981

CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um

meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da

maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto

com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de

avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen

Analyses)

Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo

de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e

nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da

integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia

a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de

comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-

se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se

obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz

visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)

Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o

maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em

comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com

a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na

25

estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica

emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com

maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada

devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)

A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de

viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e

IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de

fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)

O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem

interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo

e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana

espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando

expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana

integra (GARNER e JONHSON 1995)

O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este

composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se

observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON

e VICKER 1990)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas

Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela

produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o

movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a

mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular

A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada

em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999

Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser

utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta

espeacutecie

26

O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de

membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui

baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a

detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia

(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros

conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com

elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode

formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo

assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo

(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na

faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com

comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)

Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de

membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no

interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)

273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)

O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel

quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud

OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que

conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o

acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do

amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se

ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a

associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em

suas avaliaccedilotildees de acrossoma

A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia

permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol

ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e

pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a

barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a

fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa

caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A

27

colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da

membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo

sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana

plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas

ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001

RAITHI et al 2001)

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4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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Page 21: EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA …livros01.livrosgratis.com.br/cp150379.pdf · 2016-01-26 · EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA ADIÇÃO DE

19

refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o

espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica

apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em

constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO

1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel

e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por

conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo

devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)

Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os

espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em

enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos

reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e

AMANN 1992)

Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram

que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas

moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol

manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)

recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas

decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no

intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas

Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo

de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT

1993)

25 Diluentes para Secircmen Equino

Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado

visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os

espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra

proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os

produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema

enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)

Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada

poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e

20

principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de

proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e

Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica

tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios

na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios

presentes no plasma

Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os

carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico

(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar

em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma

presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-

albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia

dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)

Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em

todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos

(AMMAN e PICKETT 1987)

Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de

coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis

com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e

gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes

necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm

sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando

resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)

ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos

(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES

e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos

espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade

total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito

positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie

(SILVEIRA NETO 2008)

21

26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes

O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade

fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo

A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo

Maxwell e Stojanov (1996)

Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de

ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides

(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de

motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e

extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)

O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa

antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS

principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase

glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de

defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por

sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias

ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)

Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do

agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo

jaacute ocorrida

Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute

limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido

danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila

intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos

protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo

espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios

espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)

Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo

in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios

estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando

substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)

22

261 Glutationa peroxidase (GPx)

Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa

peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa

a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)

A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute

presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de

forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de

proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns

problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais

as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser

bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas

relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As

ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a

exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das

membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de

defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente

em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)

Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em

1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias

A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das

concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da

accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al

2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2

e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em

GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)

A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada

quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta

enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao

restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem

disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos

mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de

DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA

e GUERRA 2007)

23

Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx

3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao

espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2

e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel

pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da

GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da

condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima

tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na

espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide

maduro (MAIA 2003)

262 Cisteiacutena

A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol

com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas

eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante

(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na

prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)

Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na

proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em

experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem

demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente

antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)

Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena

em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos

sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen

No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de

cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a

sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram

diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e

obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen

descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM

de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas

em javalis

24

Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na

proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da

membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a

glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios

com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos

27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes

A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante

A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave

concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de

contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que

apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981

CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um

meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da

maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto

com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de

avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen

Analyses)

Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo

de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e

nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da

integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia

a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de

comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-

se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se

obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz

visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)

Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o

maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em

comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com

a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na

25

estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica

emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com

maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada

devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)

A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de

viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e

IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de

fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)

O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem

interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo

e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana

espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando

expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana

integra (GARNER e JONHSON 1995)

O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este

composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se

observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON

e VICKER 1990)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas

Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela

produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o

movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a

mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular

A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada

em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999

Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser

utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta

espeacutecie

26

O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de

membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui

baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a

detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia

(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros

conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com

elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode

formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo

assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo

(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na

faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com

comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)

Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de

membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no

interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)

273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)

O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel

quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud

OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que

conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o

acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do

amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se

ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a

associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em

suas avaliaccedilotildees de acrossoma

A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia

permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol

ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e

pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a

barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a

fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa

caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A

27

colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da

membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo

sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana

plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas

ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001

RAITHI et al 2001)

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4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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ZINI A GARRELS K PHANG D Antioxidant activity in the semen of fertile and

infertile men Urology v 55 n 6 p 922-926 2000

54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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20

principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de

proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e

Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica

tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios

na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios

presentes no plasma

Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os

carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico

(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar

em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma

presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-

albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia

dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)

Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em

todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos

(AMMAN e PICKETT 1987)

Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de

coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis

com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e

gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes

necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm

sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando

resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)

ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos

(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES

e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos

espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade

total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito

positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie

(SILVEIRA NETO 2008)

21

26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes

O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade

fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo

A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo

Maxwell e Stojanov (1996)

Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de

ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides

(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de

motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e

extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)

O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa

antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS

principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase

glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de

defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por

sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias

ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)

Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do

agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo

jaacute ocorrida

Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute

limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido

danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila

intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos

protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo

espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios

espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)

Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo

in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios

estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando

substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)

22

261 Glutationa peroxidase (GPx)

Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa

peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa

a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)

A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute

presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de

forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de

proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns

problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais

as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser

bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas

relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As

ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a

exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das

membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de

defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente

em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)

Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em

1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias

A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das

concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da

accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al

2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2

e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em

GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)

A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada

quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta

enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao

restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem

disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos

mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de

DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA

e GUERRA 2007)

23

Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx

3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao

espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2

e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel

pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da

GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da

condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima

tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na

espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide

maduro (MAIA 2003)

262 Cisteiacutena

A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol

com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas

eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante

(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na

prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)

Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na

proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em

experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem

demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente

antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)

Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena

em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos

sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen

No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de

cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a

sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram

diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e

obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen

descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM

de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas

em javalis

24

Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na

proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da

membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a

glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios

com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos

27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes

A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante

A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave

concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de

contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que

apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981

CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um

meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da

maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto

com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de

avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen

Analyses)

Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo

de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e

nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da

integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia

a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de

comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-

se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se

obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz

visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)

Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o

maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em

comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com

a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na

25

estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica

emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com

maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada

devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)

A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de

viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e

IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de

fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)

O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem

interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo

e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana

espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando

expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana

integra (GARNER e JONHSON 1995)

O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este

composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se

observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON

e VICKER 1990)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas

Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela

produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o

movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a

mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular

A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada

em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999

Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser

utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta

espeacutecie

26

O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de

membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui

baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a

detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia

(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros

conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com

elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode

formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo

assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo

(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na

faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com

comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)

Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de

membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no

interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)

273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)

O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel

quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud

OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que

conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o

acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do

amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se

ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a

associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em

suas avaliaccedilotildees de acrossoma

A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia

permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol

ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e

pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a

barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a

fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa

caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A

27

colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da

membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo

sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana

plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas

ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001

RAITHI et al 2001)

28

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4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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21

26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes

O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade

fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo

A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo

Maxwell e Stojanov (1996)

Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de

ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides

(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de

motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e

extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)

O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa

antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS

principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase

glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de

defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por

sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias

ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)

Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do

agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo

jaacute ocorrida

Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute

limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido

danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila

intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos

protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo

espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios

espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)

Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo

in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios

estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando

substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)

22

261 Glutationa peroxidase (GPx)

Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa

peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa

a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)

A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute

presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de

forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de

proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns

problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais

as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser

bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas

relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As

ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a

exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das

membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de

defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente

em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)

Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em

1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias

A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das

concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da

accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al

2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2

e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em

GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)

A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada

quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta

enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao

restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem

disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos

mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de

DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA

e GUERRA 2007)

23

Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx

3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao

espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2

e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel

pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da

GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da

condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima

tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na

espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide

maduro (MAIA 2003)

262 Cisteiacutena

A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol

com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas

eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante

(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na

prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)

Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na

proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em

experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem

demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente

antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)

Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena

em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos

sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen

No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de

cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a

sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram

diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e

obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen

descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM

de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas

em javalis

24

Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na

proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da

membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a

glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios

com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos

27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes

A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante

A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave

concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de

contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que

apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981

CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um

meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da

maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto

com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de

avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen

Analyses)

Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo

de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e

nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da

integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia

a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de

comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-

se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se

obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz

visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)

Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o

maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em

comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com

a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na

25

estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica

emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com

maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada

devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)

A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de

viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e

IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de

fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)

O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem

interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo

e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana

espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando

expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana

integra (GARNER e JONHSON 1995)

O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este

composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se

observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON

e VICKER 1990)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas

Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela

produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o

movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a

mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular

A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada

em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999

Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser

utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta

espeacutecie

26

O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de

membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui

baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a

detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia

(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros

conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com

elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode

formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo

assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo

(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na

faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com

comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)

Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de

membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no

interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)

273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)

O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel

quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud

OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que

conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o

acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do

amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se

ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a

associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em

suas avaliaccedilotildees de acrossoma

A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia

permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol

ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e

pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a

barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a

fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa

caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A

27

colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da

membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo

sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana

plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas

ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001

RAITHI et al 2001)

28

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4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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22

261 Glutationa peroxidase (GPx)

Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa

peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa

a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)

A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute

presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de

forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de

proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns

problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais

as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser

bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas

relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As

ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a

exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das

membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de

defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente

em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)

Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em

1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias

A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das

concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da

accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al

2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2

e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em

GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)

A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada

quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta

enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao

restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem

disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos

mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de

DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA

e GUERRA 2007)

23

Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx

3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao

espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2

e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel

pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da

GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da

condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima

tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na

espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide

maduro (MAIA 2003)

262 Cisteiacutena

A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol

com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas

eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante

(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na

prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)

Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na

proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em

experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem

demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente

antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)

Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena

em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos

sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen

No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de

cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a

sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram

diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e

obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen

descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM

de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas

em javalis

24

Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na

proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da

membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a

glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios

com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos

27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes

A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante

A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave

concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de

contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que

apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981

CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um

meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da

maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto

com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de

avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen

Analyses)

Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo

de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e

nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da

integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia

a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de

comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-

se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se

obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz

visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)

Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o

maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em

comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com

a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na

25

estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica

emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com

maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada

devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)

A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de

viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e

IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de

fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)

O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem

interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo

e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana

espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando

expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana

integra (GARNER e JONHSON 1995)

O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este

composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se

observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON

e VICKER 1990)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas

Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela

produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o

movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a

mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular

A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada

em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999

Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser

utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta

espeacutecie

26

O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de

membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui

baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a

detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia

(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros

conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com

elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode

formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo

assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo

(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na

faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com

comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)

Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de

membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no

interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)

273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)

O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel

quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud

OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que

conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o

acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do

amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se

ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a

associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em

suas avaliaccedilotildees de acrossoma

A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia

permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol

ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e

pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a

barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a

fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa

caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A

27

colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da

membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo

sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana

plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas

ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001

RAITHI et al 2001)

28

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4 EXPERIMENTO

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41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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23

Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx

3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao

espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2

e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel

pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da

GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da

condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima

tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na

espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide

maduro (MAIA 2003)

262 Cisteiacutena

A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol

com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas

eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante

(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na

prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)

Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na

proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em

experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem

demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente

antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)

Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena

em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos

sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen

No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de

cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a

sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram

diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e

obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen

descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM

de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas

em javalis

24

Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na

proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da

membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a

glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios

com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos

27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes

A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante

A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave

concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de

contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que

apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981

CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um

meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da

maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto

com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de

avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen

Analyses)

Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo

de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e

nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da

integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia

a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de

comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-

se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se

obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz

visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)

Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o

maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em

comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com

a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na

25

estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica

emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com

maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada

devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)

A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de

viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e

IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de

fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)

O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem

interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo

e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana

espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando

expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana

integra (GARNER e JONHSON 1995)

O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este

composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se

observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON

e VICKER 1990)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas

Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela

produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o

movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a

mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular

A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada

em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999

Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser

utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta

espeacutecie

26

O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de

membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui

baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a

detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia

(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros

conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com

elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode

formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo

assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo

(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na

faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com

comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)

Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de

membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no

interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)

273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)

O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel

quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud

OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que

conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o

acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do

amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se

ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a

associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em

suas avaliaccedilotildees de acrossoma

A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia

permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol

ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e

pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a

barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a

fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa

caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A

27

colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da

membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo

sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana

plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas

ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001

RAITHI et al 2001)

28

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4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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Page 26: EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA …livros01.livrosgratis.com.br/cp150379.pdf · 2016-01-26 · EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA ADIÇÃO DE

24

Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na

proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da

membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a

glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios

com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos

27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes

A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante

A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave

concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de

contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que

apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981

CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um

meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da

maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto

com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de

avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen

Analyses)

Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo

de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e

nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da

integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia

a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de

comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-

se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se

obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz

visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)

Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o

maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em

comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com

a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na

25

estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica

emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com

maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada

devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)

A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de

viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e

IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de

fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)

O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem

interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo

e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana

espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando

expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana

integra (GARNER e JONHSON 1995)

O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este

composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se

observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON

e VICKER 1990)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas

Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela

produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o

movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a

mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular

A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada

em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999

Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser

utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta

espeacutecie

26

O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de

membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui

baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a

detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia

(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros

conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com

elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode

formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo

assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo

(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na

faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com

comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)

Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de

membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no

interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)

273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)

O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel

quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud

OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que

conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o

acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do

amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se

ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a

associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em

suas avaliaccedilotildees de acrossoma

A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia

permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol

ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e

pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a

barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a

fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa

caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A

27

colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da

membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo

sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana

plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas

ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001

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4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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Page 27: EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA …livros01.livrosgratis.com.br/cp150379.pdf · 2016-01-26 · EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA ADIÇÃO DE

25

estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica

emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com

maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada

devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)

271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)

A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de

viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e

IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de

fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)

O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem

interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo

e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana

espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando

expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana

integra (GARNER e JONHSON 1995)

O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este

composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se

observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON

e VICKER 1990)

272 Carboxianina fluorescente (JC-1)

A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas

Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela

produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o

movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a

mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular

A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada

em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999

Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser

utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta

espeacutecie

26

O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de

membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui

baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a

detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia

(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros

conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com

elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode

formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo

assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo

(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na

faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com

comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)

Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de

membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no

interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)

273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)

O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel

quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud

OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que

conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o

acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do

amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se

ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a

associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em

suas avaliaccedilotildees de acrossoma

A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia

permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol

ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e

pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a

barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a

fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa

caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A

27

colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da

membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo

sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana

plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas

ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001

RAITHI et al 2001)

28

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4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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26

O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de

membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui

baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a

detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia

(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros

conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com

elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode

formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo

assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo

(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na

faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com

comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)

Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de

membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no

interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)

273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)

O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel

quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud

OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que

conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o

acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do

amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se

ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a

associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em

suas avaliaccedilotildees de acrossoma

A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia

permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol

ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e

pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a

barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a

fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa

caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A

27

colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da

membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo

sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana

plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas

ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001

RAITHI et al 2001)

28

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4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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27

colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da

membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo

sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana

plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas

ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001

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28

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34

4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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34

4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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34

4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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34

4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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VALENCcedilA RMB GUERRA MMP Espeacutecies Reativas ao Oxigecircnio (ROS) e a

utilizaccedilatildeo de antioxidantes na criopreservaccedilatildeo do secircmen suiacuteno Revista Brasileira de

Reproduccedilatildeo Animal v 31 n 1 p 47-53 2007

VALLE GR SILVA FILHO JM PALHARES MS et al Utilizaccedilatildeo de um

container modelo CELLE modificado para resfriamento e transporte de secircmen equumlino

Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia v 51 p 505-514 1999

Van OVERVELD FWPC HAENEN GRMM RHEMREV J et al Tyrosine as

important contributor to the antioxidant capacity of seminal plasma Chemico-

Biological Interactions v 127 p 151-161 2000

ZEGINIADOU T PAPADIMAS J MANTALENAKIS S Acrosome reaction

methods for detection and clinical significance Andrologia v 32 n 9 p 335-343

2000

ZINI A GARRELS K PHANG D Antioxidant activity in the semen of fertile and

infertile men Urology v 55 n 6 p 922-926 2000

54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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34

4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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33

ZEGINIADOU T PAPADIMAS J MANTALENAKIS S Acrosome reaction

methods for detection and clinical significance Andrologia v 32 n 9 p 335-343

2000

ZINI A GARRELS K PHANG D Antioxidant activity in the semen of fertile and

infertile men Urology v 55 n 6 p 922-926 2000

34

4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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Van OVERVELD FWPC HAENEN GRMM RHEMREV J et al Tyrosine as

important contributor to the antioxidant capacity of seminal plasma Chemico-

Biological Interactions v 127 p 151-161 2000

ZEGINIADOU T PAPADIMAS J MANTALENAKIS S Acrosome reaction

methods for detection and clinical significance Andrologia v 32 n 9 p 335-343

2000

ZINI A GARRELS K PHANG D Antioxidant activity in the semen of fertile and

infertile men Urology v 55 n 6 p 922-926 2000

54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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34

4 EXPERIMENTO

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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Page 37: EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA …livros01.livrosgratis.com.br/cp150379.pdf · 2016-01-26 · EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA ADIÇÃO DE

35

41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-

secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos

Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg

extenders on the viability of equine chilled spermatozoa

Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer

Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra

Resumo

Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides

refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga

Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como

manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou

ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-

105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de

Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5

mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de

Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As

amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de

refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT

evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto

no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior

(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O

vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +

GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg

e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)

entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no

T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-

secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes

12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo

se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o

uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas

Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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Page 38: EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA …livros01.livrosgratis.com.br/cp150379.pdf · 2016-01-26 · EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA ADIÇÃO DE

36

Abstract

The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase

and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine

chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial

vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-

Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2

= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg

Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5

mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine

G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each

experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)

and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome

and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36

hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-

Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of

ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had

higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg

cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-

cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx

and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-

105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt

005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h

was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The

mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24

and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a

good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and

cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells

Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine

1 INTRODUCcedilAtildeO

A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida

em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram

distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para

mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser

uma teacutecnica de custo relativamente baixo

A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa

proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria

das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas

Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo

equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide

durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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Page 39: EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA …livros01.livrosgratis.com.br/cp150379.pdf · 2016-01-26 · EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA ADIÇÃO DE

37

viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes

componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando

prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)

Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a

geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do

metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano

sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio

(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial

integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL

e BAUMBER 2001)

Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen

armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias

antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)

visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a

viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve

como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e

cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides

refrigerados de equinos

2 MATERIAL E MEacuteTODOS

21 Local do Experimento

A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para

refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de

Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de

2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia

(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da

Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de

avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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Page 40: EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA …livros01.livrosgratis.com.br/cp150379.pdf · 2016-01-26 · EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA ADIÇÃO DE

38

22 Animais

Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade

variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo

nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia

contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte

(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum

Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e

androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees

estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)

23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen

Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24

horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina

artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como

manequim foi utilizada uma eacutegua em estro

Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de

nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes

de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram

avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril

e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total

e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)

colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula

previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo

de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)

24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen

Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a

diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou

ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada

soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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Page 41: EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA …livros01.livrosgratis.com.br/cp150379.pdf · 2016-01-26 · EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA ADIÇÃO DE

39

com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =

Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)

G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de

Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena

G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-

105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo

experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata

etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-

boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol

Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um

termocircmetro digital com visor externo

25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica

As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total

vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial

imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim

como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com

temperatura de aproximadamente 18 oC

251 Motilidade e vigor espermaacutetico

A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo

de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas

(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo

das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)

respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)

252 Integridade da membrana plasmaacutetica

Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina

(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)

de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico

1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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Page 42: EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA …livros01.livrosgratis.com.br/cp150379.pdf · 2016-01-26 · EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA ADIÇÃO DE

40

mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37

oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630

nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se

apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em

vermelho

253 Integridade do acrossoma

Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e

Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-

Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para

esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1

mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final

de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas

juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15

minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas

foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz

Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05

mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com

lamiacutenula

Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob

oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515

nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores

de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com

fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde

fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam

fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula

254 Potencial de membrana mitocondrial

Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)

duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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Page 43: EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA …livros01.livrosgratis.com.br/cp150379.pdf · 2016-01-26 · EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA ADIÇÃO DE

41

com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10

minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200

espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss

Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de

emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na

peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial

(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial

de membrana

26 Anaacutelise Estatiacutestica

Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de

variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3

G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de

refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos

tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em

funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no

programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o

procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas

realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o

seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =

efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se

tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo

Little e Hills (1978)

3 RESULTADOS

Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente

aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35

Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que

as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram

maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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ZINI A GARRELS K PHANG D Antioxidant activity in the semen of fertile and

infertile men Urology v 55 n 6 p 922-926 2000

54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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Page 44: EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA …livros01.livrosgratis.com.br/cp150379.pdf · 2016-01-26 · EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA ADIÇÃO DE

42

24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena

apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +

cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx e Botu-

secircmenreg

+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-

105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena

Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-

secircmenreg

+ GPx Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg

+ GPx +

cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen

diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as

amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram

reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h

Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de

incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+

GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-

105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +

GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-

105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +

cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente

evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg

+

cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo

(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen

reg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo

(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen

reg + GPx e

Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes

36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)

A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de

incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de

gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-

se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o

porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo

A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo

de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena

43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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43

apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as

diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena

e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de

acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg

Botu-secircmenreg

+ GPx ACP-

105reg + GPx e Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se

que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena

apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no

T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-

secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena apresentaram

menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de

avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores

porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

em comparaccedilatildeo agraves

diluiacutedas em Botu-secircmen

reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as

anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg

+ GPx e

Botu-secircmenreg

+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas

com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-

secircmenreg

ACP-105reg Botu-secircmenreg

+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram

menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas

em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo

(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h

Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta

correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana

mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial

Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana

do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial

com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que

motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e

integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo

entre si

Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo

considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no

decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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Page 46: EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA …livros01.livrosgratis.com.br/cp150379.pdf · 2016-01-26 · EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA ADIÇÃO DE

44

espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h

natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles

4 DISCUSSAtildeO

A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada

ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen

reg foi avaliada

como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na

avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos

obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto

(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando

diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo

na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza

valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por

Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de

aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco

como diluente para secircmen equino

A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo

surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica

potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que

neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e

Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a

baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os

espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo

O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem

proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por

Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em

12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos

Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica

de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a

raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)

Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na

preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados

em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente

45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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45

agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que

observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides

ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos

encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes

ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses

antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral

do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural

encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no

percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen

caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto

Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)

com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica

poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle

Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de

carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a

motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso

da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em

TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e

potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-

secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se

manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode

ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os

equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho

individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e

caracteriacutesticas fenotiacutepicas

No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada

manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo

com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo

artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram

melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen

ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de

leite (Botu-secircmenreg

) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em

relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida

46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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46

provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos

provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares

Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de

garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato

de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de

congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente

estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente

convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em

relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na

preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave

incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120

microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser

observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de

congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada

que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula

espermaacutetica

Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor

das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de

membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena

isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa

peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da

biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo

Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com

ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-

Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade

para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas

do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo

se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra

hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua

composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de

vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo

do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal

47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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47

5 CONCLUSOtildeES

O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como

diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-

secircmenreg

O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio

quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e

integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg

O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para

secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de

diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de

extrema necessidade

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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemaacuteticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterinaacuteriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MuacutesicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuiacutemicaBaixar livros de Sauacutede ColetivaBaixar livros de Serviccedilo SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo

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51

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pentoxifilina na motilidade integridade do acrossoma e do DNA de espermatozoides

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Zootecnia v 61 n1 p 42-49 2009

NORDBERG J ARNEacuteR ESJ Reactive oxygen species antioxidants and the

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PENtildeA AI Flow cytometry in the assessment of fresh and frozen-thawed dog

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52

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em suiacuteno Disponiacutevel em httpbibliotecauniversianethtml_burafichaparamsid

49066546html 17-oct-2009

SMILEY ST REERS M MOTTOLA-HARTSHORN C et al Intracellular

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aacutegua de coco em poacute (ACP105) e refrigerada a 5 Cordm Dissertaccedilatildeo de mestrado-

Universidade de BrasiacuteliaFaculdade de Agronomia e Medicina Veterinaacuteria 2008

SQUIRES EL PICKETT BW GRAHAM DKet al Cooled and frozen stallion

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acrosome reaction an analysis using ionophore A23187 Journal of Experimental

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53

TONIOLLI R MESQUITA DSM Fertilidade de porcas inseminadas com secircmen

diluiacutedo em aacutegua de coco estabilizada e com BTS Revista Brasileira de Reproduccedilatildeo

Animal v 14 p 249-254 1990

UCHOA DC CARDOSO RCS SILVA LDM Inseminaccedilatildeo artificial a fresco em

cadelas da raccedila Boxer com diferentes diluidores de secircmen Revista Brasileira de

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VALLE GR SILVA FILHO JM PALHARES MS et al Utilizaccedilatildeo de um

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2000

ZINI A GARRELS K PHANG D Antioxidant activity in the semen of fertile and

infertile men Urology v 55 n 6 p 922-926 2000

54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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Page 54: EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA …livros01.livrosgratis.com.br/cp150379.pdf · 2016-01-26 · EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SÊMEN® E ACP-105®) E DA ADIÇÃO DE

52

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Production v 57 p 246-250 1997

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aacutegua de coco em poacute (ACP105) e refrigerada a 5 Cordm Dissertaccedilatildeo de mestrado-

Universidade de BrasiacuteliaFaculdade de Agronomia e Medicina Veterinaacuteria 2008

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semen Animal Reproduction and Biotechnology Laboratory n 9 p 3-36 1999

TALBOT P SUMMERS R G HYLANDER B L et al The role of calcium in the

acrosome reaction an analysis using ionophore A23187 Journal of Experimental

Zoology v 198 n 3 p 383-392 1976

53

TONIOLLI R MESQUITA DSM Fertilidade de porcas inseminadas com secircmen

diluiacutedo em aacutegua de coco estabilizada e com BTS Revista Brasileira de Reproduccedilatildeo

Animal v 14 p 249-254 1990

UCHOA DC CARDOSO RCS SILVA LDM Inseminaccedilatildeo artificial a fresco em

cadelas da raccedila Boxer com diferentes diluidores de secircmen Revista Brasileira de

Reproduccedilatildeo Animal supl n 5 p 150-152 2002

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utilizaccedilatildeo de antioxidantes na criopreservaccedilatildeo do secircmen suiacuteno Revista Brasileira de

Reproduccedilatildeo Animal v 31 n 1 p 47-53 2007

VALLE GR SILVA FILHO JM PALHARES MS et al Utilizaccedilatildeo de um

container modelo CELLE modificado para resfriamento e transporte de secircmen equumlino

Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia v 51 p 505-514 1999

Van OVERVELD FWPC HAENEN GRMM RHEMREV J et al Tyrosine as

important contributor to the antioxidant capacity of seminal plasma Chemico-

Biological Interactions v 127 p 151-161 2000

ZEGINIADOU T PAPADIMAS J MANTALENAKIS S Acrosome reaction

methods for detection and clinical significance Andrologia v 32 n 9 p 335-343

2000

ZINI A GARRELS K PHANG D Antioxidant activity in the semen of fertile and

infertile men Urology v 55 n 6 p 922-926 2000

54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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53

TONIOLLI R MESQUITA DSM Fertilidade de porcas inseminadas com secircmen

diluiacutedo em aacutegua de coco estabilizada e com BTS Revista Brasileira de Reproduccedilatildeo

Animal v 14 p 249-254 1990

UCHOA DC CARDOSO RCS SILVA LDM Inseminaccedilatildeo artificial a fresco em

cadelas da raccedila Boxer com diferentes diluidores de secircmen Revista Brasileira de

Reproduccedilatildeo Animal supl n 5 p 150-152 2002

VALENCcedilA RMB GUERRA MMP Espeacutecies Reativas ao Oxigecircnio (ROS) e a

utilizaccedilatildeo de antioxidantes na criopreservaccedilatildeo do secircmen suiacuteno Revista Brasileira de

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VALLE GR SILVA FILHO JM PALHARES MS et al Utilizaccedilatildeo de um

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Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia v 51 p 505-514 1999

Van OVERVELD FWPC HAENEN GRMM RHEMREV J et al Tyrosine as

important contributor to the antioxidant capacity of seminal plasma Chemico-

Biological Interactions v 127 p 151-161 2000

ZEGINIADOU T PAPADIMAS J MANTALENAKIS S Acrosome reaction

methods for detection and clinical significance Andrologia v 32 n 9 p 335-343

2000

ZINI A GARRELS K PHANG D Antioxidant activity in the semen of fertile and

infertile men Urology v 55 n 6 p 922-926 2000

54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

Livros Graacutetis( httpwwwlivrosgratiscombr )

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54

Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides

equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com

GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e

18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab

ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc

Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad

ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb

Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd

ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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55

Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos

em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena

(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18

oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB

a 267plusmn098ABC

a 192plusmn100ABCD

b

ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B

b 142plusmn100BC

c 058plusmn090CD

c

Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB

a 217plusmn111ABC

b

ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A

b 242plusmn116AB

bc

Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB

ad 208plusmn116ABC

bd 092plusmn116BCD

c

ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC

bc 033plusmn089D

d

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A

a 283plusmn094A

b

ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB

ab 225plusmn114ABC

bc 125plusmn154ABCD

c

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

Livros Graacutetis( httpwwwlivrosgratiscombr )

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Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemaacuteticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterinaacuteriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MuacutesicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuiacutemicaBaixar livros de Sauacutede ColetivaBaixar livros de Serviccedilo SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo

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56

Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965

A

a 6008plusmn939A

a 4913plusmn1294

A

a

ACP-105reg 6483plusmn1004 A

a 5583plusmn1851A

a 5179plusmn2064A

a 4654plusmn2426

A

a

Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A

a 6238plusmn1481

A

a 5779plusmn1566

A

a 6021plusmn1322

A

a

ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A

a 6308plusmn1784

A

a 6275plusmn1447

A

a 5550plusmn1934

A

a

Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A

a 5600plusmn1666

A

a 4467plusmn2320

A

a 4788plusmn2727

A

a

ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A

a 5725plusmn2420

A

a 4842plusmn2523

A

a 5108plusmn2788

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A

a 6617plusmn1668

A

a 5950plusmn761

A

a 7042plusmn2025

A

a

ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A

a 3750plusmn1970A

b 5725plusmn2469A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

775plusmn583Bb

ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B

b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A

a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B

cd

ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A

a 3325plusmn1683

AB

a 2958plusmn1569A

a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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57

Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B

bc

ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab

3167plusmn1461ABab

1675plusmn804ABbc

Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab

1763plusmn1788ABab

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b

Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A

a 3017plusmn1416

AB

a 1733plusmn821AB

b

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a 3775plusmn1591A

a 2908plusmn1612

A

a

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cd

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AB

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a

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

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bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

60

Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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58

Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de

espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg

suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC

(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)

Grupos

Experimentais

Tempo de incubaccedilatildeo

T0h T12h T24h T36h

Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A

abc 4508plusmn2619A

b 4992plusmn2066A

c

ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A

b

Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A

c 5775plusmn2214A

c 4438plusmn2636A

b

ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A

bd

Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab

4825plusmn2324Abd

3146plusmn2571Ace

ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab

4713plusmn1898Abc

3842plusmn1959Ac

Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd

5679plusmn2368Acd

4483plusmn2350Abd

ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A

ac 4596plusmn1907A

a 3546plusmn2059A

bd

Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na

mesma coluna indicam Plt005

59

Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

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Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

61

5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas

localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta

condiccedilatildeo eacute uma crescente

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Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos

antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes

Vigor aPMM IM IAc

Motilidade

r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830

plt00001 plt00001 plt00001 00743

Vigor

r = 070357 r = 039356 r = 016194

plt00001 pgt00001 00678

aPMM

r = 047289 r = 034340

plt00001 plt00001

IM

r = 013976

01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de

acrossoma

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Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

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5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

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Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de

incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana

(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial

(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo

adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

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Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)

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5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa

limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

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5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade

de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen

equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso

de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros

sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade

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limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo

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