GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO SECRETARIA DA CIÊNCIA, TECNOLOGIA E DESENVOLVIMENTO ECONÔMICO FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA . DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA

Dissertação de Mestrado

EFEITO DO ÁCIDO ACÉTICO NAS ENZIMAS

XILOSE REDUTASE E XILITOL DESIDROGENASE

DE Candida guilliermondii

Luanne Helena Augusto Lima i..~"""""""~==~~=ca-·.,.='~7zc=""''"•"'"~

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LORENA - SP - BRASIL

2002

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA

PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

EFEITO DO ÁCIDO ACÉTICO NAS ENZIMAS

XILOSE REDUTASE E XILITOL DESIDROGENASE

DE Candida guilliermondii

Dissertação de mestrado apresentada como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Biotecnologia Industrial

Banca examinadora:

Ora. Maria das Graças de Almeida Felipe (presidente) Dr. Michele Vitelo Ora. Adriane Maria Ferreira Milagres

Estudante:

Luanne Helena Augusto Lima

Lorena - SP - Brasil

2002·

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA

PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

EFEITO DO ÁCIDO ACÉTICO NAS ENZIMAS XILOSE REDUTASE E XILITOL DESIDROGENASE

DE Candida guilliermondii

Este exemplar corresponde à versão final da Dissertação de Mestrado aprovada pela banca examinadora.

Dra. Maria dar:l:!!!:e Almeida Felipe

Presidente da Banca Examinadora

Lorena - SP - Brasil

2002

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Profa. Ora. Maria das Graças de Almeida

Felipe pela amizade e pela confiança, além da paciência e dedicação com que

me orientou durante todo o mestrado.

À mamãe pelo incomensurável apoio em todo e qualquer momento e a

toda a minha família pelo incentivo sempre necessário.

Ao Christian Niel Berlinck pelos novos horizontes, pelos momentos de

escape e pelo apoio logístico na finalização deste trabalho.

Aos amigos do laboratório, principalmente Gilvane, Talita. Ely, Dani, Zéa

e aos "companeros" por compartilhar conhecimento, equipamentos,

micropipetas e por tornar a rotina mais agradável.

Ao Eduardo Gomes Gonçalves pelo incentivo, principalmente nos

momentos decisivos.

Às parceiras de república: Priscila, pela mão estendida na hora certa e

pela catálise de diversas amizades e Karlia, pelas várias gargalhadas e por ter

me mostrado que a FAENQUIL fica muito mais perto do que eu imaginava.

Aos técnicos do DEBIQ, principalmente a Rita, Paulinho, Nica e Zé

Cobrinha pelo auxílio e pela amizade.

Aos meus amigos de Brasília, que mesmo longe fisicamente sempre

estiveram presentes.

Às leveduras que se ofereceram em sacrifício para que este trabalho

pudesse ser realizado.

RESUMO

Efeito do Ácido Acético nas Enzimas Xilose Redutase e Xilitol Desidrogenase de Candida guilliermondii. Luanne Helena Augusto Lima. Dissertação de Mestrado. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial. Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Engenharia Q~::r.:ca de Lorena. Orientadora: Maria das Graças de Almeida Felipe (Departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, C.P.116, 12600-970, Lorena, SP, Brasil). Banca Examinadora: Dr. Michele Vitolo e Ora. Adriane Maria Ferreira Milagres. Abril de 2002.

O xilitol é um produto de grande interesse econormco pelas suas características como poder adoçante, anticariogenicidade e metabolismo independente de insulina. Estas características são exploradas na formulação de produtos alimentícios, odontológicos e farmacêuticos, sendo a utilização de xilitol também permitida para pessoas diabéticas, obesas ou com anemia hemolítica. A etapa inicial do metabolismo de xilose é a formação de xilitol a partir da redução de xilose, catalisada pela enzima xilose redutase (EC 1.1.1.21) na presença de cofatores reduzidos NADPH e/ou NADH. A seguir o xilitol é oxidado a xilulose pela enzima xilitol desidrogenase (EC 1.1.1.9), com participação de NADP+ e/ou NAD+. Assim como na via química, os materiais lignocelulósicos constituem a matéria-prima para a obtenção de xilitol pela via biotecnológica. O bagaço de cana de açúcar consiste em um resíduo promissor para este bioprocesso, apesar de ser utilizado para geração de energia nas próprias usinas. Embora, o hidrolisado de bagaço apresente elevado teor de xilose, ele também possui compostos tóxicos resultantes da hidrólise ácida da estrutura lignocelulósica. Dentre estes compostos, o ácido acético destaca-se pelo seu efeito inibitório na fermentação e na produtividade em xilitol. Desta forma. o objetivo deste projeto foi avaliar o efeito deste ácido nas atividades das enzimas intracelulares xilose redutase (XR) e xilitol desidrogenase (XDH) e consequentemente na formação de xilitol. Para a realização deste estudo, empregou-se Candida guil/iermondii cultivada em meio elaborado à base de hidrolisado ácido de bagaço de cana concentrado e tratado, acrescido de ácido acético em concentrações superiores à inibitória (3,0 g/L). Experimentos também foram realizados em meio sintético contendo os mesmos teores de açúcares do hidrolisado. Para o estudo do efeito na atividade das enzimas, acetato de sódio foi utilizado no ensaio enzimático em diferentes concentrações. Observou-se que os valores de atividade específica para XR e XDH obtidas de células cultivadas no hidrolisado foram menores que em meio sintético, evidenciando que o efeito tóxico do ácido acético na expressão das enzimas foi potencializado pelos outros compostos presentes no hidrolisado. Foi observado aumento na atividade específica das enzimas (58% e 60%, para XR e XDH respectivamente), com o aumento da concentração de acetato de sódio no ensaio, sugerindo que o ácido acético presente no meio de cultura pode aumentar a atividade destas enzimas. Não houve aumento de produtividade do xilitol durante as fermentações do meio com ácido acético, porque embora a formação de xilitol tenha sido favorecida pelo aumento da atividade de XR, seu consumo também foi aumentado por causa da atividade de XDH.

iv

ABSTRACT

Effect of the acetic acid on the enzymes xylose reductase and xylitol dehydrogenase of Candida guilliermondii

Xylitol is a produr+ of great economic interest due !:- its characteristics, such as sweetening power, anticariogenicity and insulin-independent metabolism. These qualities have been exploited in the production of foodstuffs, odontological products and pharmaceuticals. Besides, xylitol can be ingested by people with diabetes, obesity and hemolytic anemia. This sweetener is commercialy produced by chemical process, but it can also be obtained biotecnologically. ln the biotecnological process, the initial stage of the xylose metabolism is the formation of xylitol from the reduction of xylose catalyzed by the xylose reductase enzyme (EC 1.1.1.21) when the reduced cofactors NADH are present. Next, xylitol is oxidized to xylulose by the xylitol dehydrogenase enzyme (EC 1.1.1.9), with the participation of NADP+ and/or NAD+. Like the chemical path, the biotechnological process also utilizes lignocellulosics, not only because they have high contents of xylan, which can be hydrolysed to xylose, but also because they are low-cost renewable resources. A good example of lignocellulosic materiais is sugar cane bagasse. ln general bagasse is utilized to produce electrical power for the mill itself. Another good use however, would be the generation of a product of high aggregate value, like xylitol. Although bagasse hydrolysate has a high xylose content, it also has toxic compounds coming from acid hydrolysis of the lignocellulosic structure. One of such compounds is acetic acid, which inhibitis fermentation, reducing the xylitol productivity as a consequence. The aim of this project was to evaluate the effects of this acid on the activities of xylose reductase (XR) and xylitol dehidrogenase (XDH) enzymes and therefore on xylitol formation. ln this study Candida guilliermondii yeast was used for fermentation of concentrated and treated hydrolysate medium with acetic acid concentration considered as inhibitory (higher than 3.0 g/1). Experiments were also performed with syntetic medium containing the sarne amounts of sugar as the hydrolysate. To study the effect of the acid on the enzyme activity, sodium acetate was used at different concentrations. The XR and XDH specific activities in the hydrolysate were lower than in the synthetic medium, which provided the evidence that the toxic effect of the acetic acid on these enzyme was potentiated by the other compounds found in the hydrolysate. lncreases in the XR and XDH specific activities (58% and 60% respectively) were observed together with an increase in sodium acetate in the reaction medium, suggesting that the acetic acid present in the culture medium enhanced the activities of these enzymes. No xylitol productivity increase was observed during the fermentation of medium containing acetic acid, because although the xylitol formation was favored by the enhancement of XR activity, the xylitol consumption also íncreased as a result of the XDH activity.

CONTEÚDO

RESUMO

..... asTRAcr

LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

iv

V

viii

X

1. INTRODUÇÃO 1

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3

2.1 Xilitol 2.1.1 Propriedades e Aplicações 2.1.2 Tolerância e Toxicidade

3 3 5

2.2 Obtenção de Xilitol 6

2.3 Bioconversão de Xilose em Xilitol 2.3.1 Aspectos Bioquímicos 2.3.2 Fatores que influenciam o metabolismo

8 8

10

2.4 Matéria-Prima 2.4.1 Bagaço de Cana de Açúcar

15 16

2.5 Efeito Tóxico dos Hidrolisados Hemicelulósicos 2.5.1 Efeito do Ácido Acético

17 19

3. OBJETIVOS 22

3.1 Geral 22

3.2 Específicos 22

4. MATERIAL E MÉTODOS 23 4.1 Microrganismo e Preparo do lnóculo 23

4.2 Preparo do Hidrolisado de Bagaço de Cana de Açúcar 23

4.3 Concentração e Tratamento 24

4.4 Meios e Condições de Fermentação 24

4.5 Métodos Analíticos 4.5.1 Viabilidade e Pureza da Cultura 4.5.2 Determinação da Concentração Celular 4.5.3 Determinação de pH 4.5.4 Determinação da Concentração de Açúcares e Ácido Acético 4.5.5 Determinação da Concentração de Furfural e Hidroximetilfuriural 4.5.6 Determinação da Concentração de Fenóis

25 25 26 26 26 26 27

vi

4.6 Rompimento Celular 27

4.7 Determinação de Proteína Solúvel 28

4.8 Medida das Atividades Enzimáticas 28

4.9 Efeito do Acetato de Sódio nas Atividades Enzimáticas 29

4.10 Determinação dos Parâmetros Fermentativos 29

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 31

5.1 Efeito do Ácido Acético na Fermentação em Meio Sintético 31 5.1.1 Efeito do Ácido Acético no Consumo de Açúcares 31 5.1.2 Consumo de Ácido Acético Durante a Fermentação 34 5.1.3 Formação de Células na Presença de Ácido Acético 37 5.1.4 Efeito do Ácido Acético na Formação de Xilitol 38 5.1.5 Efeito do Ácido Acético nas Enzimas Xilose Redutase e Xilitol Desidrogenase 40

5.2 Efeito do Ácido Acético na Fermentação em Hidrolisado 42 5.2.1 Caracterização do Hidrolisado 42 5.2.2 Efeito do Ácido Acético no Consumo de Açúcares 44 5.2.3 Consumo de Ácido Acético Durante a Fermentação 46 5.2.4 Formação de Células na Presença de Ácido Acético 48 5.2.5 Efeito do Ácido Acético na Formação de Xilitol 49 5.2.6 Efeito do Ácido Acético nas Enzimas Xilose Redutase e Xilitol Desidrogenase 50

5.3 Efeito do Acetato de Sódio na Atividade das Enzimas Xilose Redutase e Xilitol Desidrogenase 52

6. CONCLUSÕES 54

7. RECOMENDAÇÕES 55

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 56

vii

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 - Leveduras identificadas como produtoras de xilitol a partir de

xilose 7

TABELA li - Características dos meios de cultura após a adição de ácido

acético 30

TABELA li 1 - Concentrações de arabinose durante cultivo de C. guilliermondii

em meio sintético contendo ácido acético em diferentes

concentrações 32

TABELA IV - Ácido acético consumido durante cultivo de C. guilliermondii em

meio sintético contendo diferentes concentrações de ácido acético 33

TABELA V - Valores de pH durante cultivo de C. guilliermondii em meio

sintético contendo ácido acético em diferentes concentrações 35

TABELA VI - Concentrações celulares de C. guil/iermondii durante as

fermentações em meio sintético contendo ácido acético em diferentes

concentrações 36

TABELA VII - Proporções de células inviáveis durante cultivo de

C. guilliermondii em meio sintético contendo ácido acético em diferentes

concentrações 37

TABELA VIII - Produtividade (Op), rendimento (Yp1s) e eficiência de conversão

(ri) de xilitol após 58 horas de cultivo de C. guilliermondii em meio

sintético contendo ácido acético em diferentes concentrações 39

TABELA IX - Atividades específicas de xilose redutase durante cultivo de

C. guilliermondii em meio sintético contendo ácido acético em diferentes

concentrações 39

TABELA X - Atividades específicas de xilitol desidrogenase durante cultivo de

C. guilliermondii em meio sintético contendo ácido acético em diferentes

concentrações 40

TABELA XI - Características do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana

de açúcar original, após a concentração e depois do

tratamento 41

TABELA XI 1 - Características dos meios de cultura preparados com hidrolisado

contendo ácido acético em diferentes concentrações .42

viii

TABELA XIII - Concentrações de arabinose durante cultivo de C. guilliermondii

em meio formulado a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de

cana, contendo ácido acético em diferentes concentrações 44

TABELA XIV - Ácido acético consumido durante cultivo de C. guilliermondii em

meio formulado él partir de hidrolisado hera .icelulósico de bagaço de cana,

contendo diferentes concentrações de ácido acético .45

TABELA XV - Valores de pH durante cultivo de C. guilliermondii em meio

formulado a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana,

contendo ácido acético em diferentes concentrações .46

TABELA XVI - Concentrações celulares de C. guilliermondii durante as

fermentações em meio formulado a partir de hidrolisado hemicelulósico de

bagaço de cana, contendo ácido acético em diferentes

concentrações 47

TABELA XVII - Proporções de células inviáveis durante cultivo de

C. guilliermondii em meio formulado a partir de hidrolisado hemicelulósico

de bagaço de cana, contendo ácido acético em diferentes

concentrações 48

TABELA XVIII - Produtividade (Qp), rendimento (Ypts) e eficiência de conversão

(11) de xilitol após 58 horas de cultivo de C. guilliermondii em meio

formulado a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana,

contendo diferentes concentrações de ácido acético .49

TABELA XIX - Atividades específicas de xilose redutase durante cultivo de

C. guil/iermondii em meio formulado a partir de hidrolisado hemicelulósico

de bagaço de cana, contendo diferentes concentrações de ácido

acético 50

TABELA XX - Atividades específicas de xilitol desidrogenase durante cultivo de

C. guilliermondii em meio formulado a partir de hidrolisado hemicelulósico

de bagaço de cana. contendo diferentes concentrações de ácido

acético 50

ix

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 - Esquema do metabolismo de xilose e regeneração de

cofatores 9

FIGURA 2 - Formação de hidroximet.furfural ~LfMF) e furfural a partir da

desidratação de hexoses e pentases respectivamente 18

FIGURA 3 - Mecanismo de acidificação do citoplasma pela forma não

dissociada do ácido acético e transporte de prótons através da membrana

pela enzima H+ -A TPase 20

FIGURA 4 - Concentrações de xilose durante cultivo de C. guilliermondíí em

meio sintético simulando a constituição de hidrolisado hemicelulósico de

bagaço de cana, com diferentes concentrações de ácido acético

(A- 5 g/L; 8- 6 g/L; C - 8 g/L; D - 10 g/L) 31

FIGURA 5 - Concentrações de ácido acético durante cultivo de C. guil/iermondii

em meio sintético simulando a constituição de hidrolisado hemicelulósico de

bagaço de cana, com diferentes concentrações de ácido acético

(A - 5 g/L; B - 6 g/L; C - 8 g/L; D - 1 O g/L) 34

FIGURA 6 - Proposta de metabolismo de acetato pela formação de

Acetil-CoA 36

FIGURA 7 - Concentrações de xilitol durante durante cultivo de C. guilliermondii

em meio sintético simulando a constituição de hidrolisado hemicelulósico de

bagaço de cana, com diferentes concentrações de ácido acético

(A - 5 g/L; B - 6 g/L; C - 8 g/L; D - 1 O g/L) 38

FIGURA 8 - Concentrações de xilose durante cultivo de C. guillíermondii em

meio formulado a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana,

com diferentes concentrações de ácido acético (A - 3 g/L; B - 4 g/L;

C - 6 g/L; D - 8 g/L) 43

FIGURA 9 - Concentrações de ácido acético durante cultivo de C. guil/iermondii

em meio formulado a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de

cana, com diferentes concentrações de ácido acético (A - 3 g/L;

B - 4 g/L; C - 6 g/L; D - 8 g/L) .46

X

FIGURA 1 O - Concentrações de xilitol durante as fermentações em meio com

hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, com diferentes

concentrações de ácido acético (A - 3 g/L; B - 4 g/L; C - 6 g/L;

D- 8 g/L) 48

FICURA 11 - Atividade específica de xilose redutase por concentração de

acetato de sódio no meio de reação 51

FIGURA 12 - Atividade específica de xilitol desidrogenase por concentração de

acetato de sódio no meio de reação 52

xi

1. INTRODUÇÃO

Xilitol é um poliol com propriedades adoçante e anticariogênica, que

pode ser utilizado em substituição à sacarose por pessoas diabéticas, obesas

ou com anerr= hemolítica. Além diste o xilitol possui diversas aplicações

clínicas, como prevenção de otite média aguda, proteção contra osteoporose e

prevenção de infecção pulmonar. Este já é empregado em vários países,

inclusive no Brasil, como insumo de produtos como pastilhas, creme dental e

gomas de mascar, porém o seu uso é limitado pelo seu elevado custo.

O xilitol é comercialmente produzido a partir da catálise química da

xilose, obtida de resíduos lignocelulósicos ricos em xilana. Este processo

possui a desvantagem de requerer várias etapas de purificação para a

obtenção de uma solução inicial de xilose de elevada pureza, visto que a

presença de impurezas, como resíduos de lignina, interfere na etapa de

redução catalítica. É ainda necessário purificar o produto para remoção de

resíduos tóxicos do catalisador e de subprodutos gerados.

Pesquisas vêm sendo desenvolvidas para se estabelecer um processo

biotecnológico alternativo à produção convencional de xilitol. Pesquisadores do

Grupo de Processos Fermentativos do Departamento de Biotecnologia

(DEBIQ) da Faculdade de Engenharia Química de Lorena (FAENQUIL), vem

há anos trabalhando para obtenção de xilitol a partir de microrganismos

fermentadores da xilose obtida por hidrólise ácida de materiais lignocelulósicos.

Estes materiais constituem recursos renováveis, e são representados pelos

resíduos agroindustriais, como bagaço de cana de açúcar, palha de arroz e

palha de trigo. Neste sentido, espera-se que, além da redução do custo de

produção do xilitol, o processo microbiológico possa contribuir para a

diminuição do impacto ambiental causado por estes resíduos.

Os trabalhos buscam estabelecer condições ideais para este

bioprocesso, como a hidrólise da fração hemicelulósica da biomassa, o

tratamento do hidrolisado, a suplementação nutricional e as condições ótimas

de fermentação para a levedura Candida gui/Jiermondii FTI 20037, uma das

espécies selecionadas mais promissoras para esta bioconversão. Tem sido

também avaliados aspectos quanto à via metabólica envolvida na conversão de

xilose em xilitol, a partir do estudo do comportamento das enzimas

2

intracelulares xilose redutase e xilitol desidrogenase responsáveis pelos passos

iniciais desta via metabólica.

As pesquisas têm evidenciado que apesar do tratamento prévio dos

hidrolisados para a redução da concentração de compostos tóxicos oriundos da

hidrólise .;c;Ja como o ácido acético, este ai, ida permanece no meio em

concentrações consideradas inibitórias à conversão de xilose em xilitol. Dados

obtidos de fermentação em meio sintético revelaram que na presença deste

ácido em concentrações superiores a 3,0 g/L, ocorreu redução na

produtividade do xilitol, enquanto 1,0 g/L deste favoreceu sua formação. No

entanto, na concentração presente nos hidrolisados concentrados e tratados

(- 4 g/L) o seu efeito tóxico é potencializado pela presença de outros

compostos tóxicos à célula como furfural, hidroximetilfurfural e fenóis.

A fim de contribuir para o estabelecimento de uma biotecnologia de

produção de xilitol a partir de bagaço de cana de açúcar, este trabalho teve

como principal objetivo estudar o efeito do ácido acético nas atividades das

enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase de C. guillierrnondii cultivada

tanto em meio sintético contendo xilose como principal fonte de carbono,

quanto em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana de açúcar.

3

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 XILITOL

2.1.1 PROPRIEDADES E APLICAÇÕES

O xilitol é um poliol edulcorante com fórmula empírica CsH120s, que

ocorre na natureza em diversos vegetais, líquens e algas, aparecendo também

como um intermediário no metabolismo de carboidratos em animais (PEPPER

& OLINGER, 1988; WINKELHAUSEN et ai., 1996).

O poder adoçante do xilitol é comparável ao da sacarose e superior ao

de outros polióis como manitol e sorbitol. Possui um terço a menos de calorias

que a sacarose, ou seja 2,4 calorias por grama (BAR, 1991). Devido à doçura e

ao baixo valor calórico, o xilitol vem sendo utilizado como adoçante desde os

anos 60, o que, além de outras características que serão apresentadas a

seguir, proporciona aumento no seu valor econômico.

O xilitol tem a propriedade cariostática por não ser metabolizado por

microrganismos da microbiota bucal, principalmente Streptococcus mutans, o

que impossibilita a proliferação de bactérias e conseqüentemente impede

produção de ácidos que atacam o esmalte dos dentes. Além disto, também

pode ser classificado como anticariogênico, por promover a estimulação da

produção de saliva que possui capacidade tamponante, que juntamente com o

aumento na concentração de íons cálcio e fosfato, induz a remineralização,

revertendo lesões de cáries recém formadas (BIRKHED, 1994; MAKINEN et

ai., 1998). Estudos demonstraram que o consumo diário de chicletes contendo

xilitol por crianças de 1 O anos reduziu em 53,5% a incidência de cáries

(ALANEN et ai., 2000). Os efeitos cariostático e anticariogênico impulsionam o

uso de xilitol em cremes dentais, pastilhas, gomas de mascar e outros produtos

para controle e prevenção às cáries.

O xilitol é apropriado para o uso em produtos alimentícios processados

em temperaturas elevadas, quando reações de Maillard não são desejadas.

Estas reações podem ocorrer quando proteínas são aquecidas na presença de

açúcares redutores, resultando na glicosilação do aminoácido terminal ou de

resíduos de lisina. O xilitol, devido à ausência de grupos aldeídicos ou

4

cetônicos em sua molécula. não participa destas reações de escurecimento,

sendo esta mais uma característica que o torna potencialmente aplicável na

indústria alimentícia (MANZ et ai., 1973; BAR 1991).

Outra vantagem do xilitol é não ser fermentado por muitos

microrganismos, permitindo d.,;:,,m seu uso em xaropes e refrescos sem a

necessidade de pasteurização e da adição de conservantes, quando o produto

é estocado por 4 ou 5 meses em frascos fechados (MANZ et ai., 1973).

A sensação de vaporização nas cavidades oral e nasal é outra

característica importante do xilitol. Esta sensação é proporcionada pelo valor

negativo do calor de dissolução e é explorada em produtos farmacêuticos

(vitaminas e expectorantes), confeitos (pastilhas e balas), sendo este

usualmente combinado a manitol, sorbitol ou ácido cítrico, nestes produtos

(PARAJÓ et ai., 1998a).

Em alguns países europeus o xilitol já vem sendo utilizado como

adoçante, tendo a vantagem de não apresentar sensação desagradável após o

uso (EMODI, 1978). No Brasil sua utilização se limita à composição de

produtos como creme dental, gomas de mascar e pastilhas.

Clinicamente, o xilitol é indicado para obesos por ser menos calórico e

diminuir o nível de ácidos graxos livres no sangue (MANZ et ai., 1973). Pode

ser empregado no tratamento de desordens metabólicas, como em casos de

anemia hemolítica que ocorre em indivíduos com deficiência na enzima glicose-

6-fosfato desidrogenase (van EYS et ai., 1974). É também indicado para

consumo por diabéticos em substituição a outros. açúcares, uma vez que seu

metabolismo não ocorre por vias insulino-dependentes (PEPPER & OLINGER,

1988).

A utilização de xilitol também em nutrição parenteral vem sendo

amplamente aceita no Japão e em alguns países da Europa. Estudos

mostraram que a administração hipocalórica de xilitol juntamente com

aminoácidos preserva as proteínas do paciente mais eficientemente que a

infusão apenas de aminoácidos ou em combinação com glicose (WAITZBERG,

1995).

Novas descobertas tem sido feitas quanto às aplicações do xilitol,

principalmente em uso clínico. Foi demonstrado que o xilitol pode ser utilizado

para a prevenção de otite média aguda, por inibir o crescimento e a adesão de

5

espécies de Pneumococcus e a adesão de Haemophilus influenzae em células

da nasofaringe. O xilitol foi testado na forma de xarope, de goma de mascar e

de pastilha; diminuindo em 40% a ocorrência de otite em crianças (UHARI et

ai., 1998). Outra aplicação do xilitol é a proteção contra osteoporose, uma vez

que ratos submetidos a ova: iéctemia, em uma dieta suplementada com 10% de

xilitol, apresentaram maior densidade óssea, além de manter a constituição

mineral dos ossos. Estes resultados protegem contra a perda das propriedades .

biomecânicas dos ossos, causada pela osteopenia (redução da calcificação ou

da densidade óssea) devido à falta de estrógenos, situação similar a que

acontece na menopausa em mulheres (MA TIILA et ai., 1998). Além disto, o

xilitol em aerossol pode também prevenir infecções pulmonares, inclusive em

pacientes com fibrose cística. Ele reduz a concentração salina do líquido que

cobre as células do revestimento interno dos pulmões, aumentando a atividade

antibiótica corpórea natural contra as bactérias (ZABNER et ai., 2000).

2.1.2 TOLERÂNCIA E TOXICIDADE

Em organismos superiores o metabolismo do xilitol ocorre principalmente

no fígado, onde pode ser transformado em glicose a uma taxa entre 20 e 80%,

dependendo da necessidade. Sua absorção é lenta e portanto também pode

ser metabolizado indiretamente pela biata intestinal. Além disto é bem tolerado

pelo corpo humano em uma dieta contendo acima de 200g por dia (ALAIS &

LINDEN, 1991), e em alguns casos pode apresentar efeito laxativo devido ao

desbalanço osmótico causado no intestino grosso.

Quanto à segurança do consumo e utilização por humanos, o xilitol já é

aceito pela European Economic Community - EEC desde 1984, enquanto a

U.S. Food and Drug Administration - FDA o classifica como "geralmente

reconhecido como seguro" ( General/y Recognise as Safe - GRAS) desde 1986

e "seguro para os dentes" (Safe for Teeth) desde 1994. A Joint Expert Comittee

on Food Additives (JECFA), uma divisão prestigiada da Word Health

Organization confirmou os estudos de toxicidade de xilitol e o classificou como

aceitável para consumo diário (Acceptable Daily lntake - ADI). Atualmente, o

xilitol já é utilizado em produtos alimentícios, farmacêuticos ou de saúde oral

em mais de 35 países (CCC - Calorie Control Council, 2001 ). No Brasil, o xilitol

6

foi aprovado como produto dietético pelo Ministério da Saúde em 1980

(AGUIAR et ai., 1999).

2.2 OBTENÇÃO DE XILITOL

O xilitol pode ser recuperado de fontes naturais como vegetais, fungos e

líquens por extração sólido-líquido, porém como ele está presente em pequena

proporção - menos de 900mg/1 OOg, este processo se torna inviável

economicamente (PARAJÓ et ai., 1998a). Sua obtenção convencional ocorre

por via química, porém a via microbiológica vem se destacando nos últimos

anos.

A produção de xilitol em larga escala ocorre pelo processo químico, que

consiste na redução de xilose, derivada principalmente de hidrolisados de

materiais lignocelulósicos ricos em xilana. O processo convencional inclui

4 etapas básicas: hidrólise ácida do material vegetal, purificação do hidrolisado

até a obtenção de xilose pura, hidrogenação catalítica da xilose em xilitol e

finalmente cristalização do xilitol. Este processo foi patenteado em 1977 por

MELAJA & HAMALAINEN.

O rendimento do processo químico, bem como a qualidade do xilitol são

dependentes da pureza da solução inicial de xilose, uma vez que a presença

de impurezas interfere na redução catalítica. São necessárias operações de

troca-iônica, descoloração e fracionamento cromatográfico para obtenção de

uma solução de xilose de elevada pureza. Além disto, após a remoção do

catalisador por filtração e troca-iônica, a solução de xilitol é concentrada,

fracionada por cromatografia com o emprego de resinas catiônicas e é

cristalizada para obtenção do produto puro (AGUIAR et ai., 1999). Estas

diversas etapas de purificação para remoção de resíduos resultam no aumento

de tempo de processamento e encarecimento do produto (PARAJÓ et ai.,

1998a).

O xilitol também pode ser obtido microbiologicamente a partir da

fermentação de hidrolisados ricos em xilose obtido de materiais

lignocelulósicos, sem a necessidade de purificação prévia da xilose (ONISHI &

SUZUKI, 1971; SILVA et ai., 1996; FELIPE et ai., 1997b; PARAJÓ et ai.,

1998a, b e c). Vários microrganismos já foram identificados como

7

fermentadores de xilose em xilitol. Dentre os fungos filamentosos pode-se citar

espécies dos gêneros Penicil/ium, Aspergi/Jus, Rhizoous, Glicocladium.

Byssoch/amys, Myrothecium, Neurospora, Rhodotorula, Torulopsis (CHIANG &

KNIGHT, 1960); Mucor e Fusarium (PARAJO et ai., 1998a), além de

Peaomyces a/bertensis identificado por DAH({A (1991 ). Poucas bactérias,

como Corynebacterium sp., Enterobacter liquefaciens e Mycobacterium

smegmatis formam xilitol, geralmente as bactérias convertem xilose

diretamente em xilulose sem os passos de oxirredução (WINKELHAUSEN &

KUZMANOVA, 1998).

Quanto às leveduras, várias espécies foram identificadas como

produtoras de xilitol, destacando-se as do gênero Candida pela maior eficiência

de conversão (Tabela 1).

TABELA 1 - Leveduras identificadas como produtoras de xilitol a partir de xilose, adaptado de WINKELHAUSEN & KUZMANOVA (1998).

Levedura Xilitol (g/L) Candida boídinii NRRL Y-17213 C. guillíermondií FTl-20037 C. íntermedia RJ-248 e. mogii ATCC 18364 C. parapsilosis ATCC 34078 C. pseudotropicalís IZ-431 e. tropical is e. tropicalis HXP 2 C. tropicalis 1004 C. tropicalis ATCC 7349 e. tropicalis ATCC 20240 e. utilis ATCC 22023 C. utilis C-40 Debaryomyces hansenii C-98 M-21 Hansenula anomala IZ-1420 Kluyveromyces fragilís FTl-20066 K. marxianus IZ-1821 Píchía (Hansenu/a) anomala NRRL Y-366 Pachysolen tannophilus NRRL Y-2460 Saccharomyces SC-13 Saccharomyces SC-37 Schízosaccharomyces pombe 16979

2,9 37,0 5,7

31,0 20,0 4,3 2,1 4,8 17,0 20,0 5,5 1,8 3,0 0,8 6, 1 4,6 6, 1 2,0 2,2 0,7 2,3 0,2

8

2.3 BIOCONVERSÃO DE XILOSE EM XILITOL

2.3.1 ASPECTOS BIOQUÍMICOS

Em microrganismos, o xilitol é um intermediário do metabolismo da

xilose. porém na maioria das bactérias e em algumas leveduras que assimilam

xílose, ela é convertida diretamente a xilulose pela enzima xilose isomerase

(EC 5.3.1.5) sem a formação deste poliol (YOKOYAMA et ai., 1995).

A maioria das leveduras metabolizam xilose pela redução em xilitol

catalisada pela enzima xilose redutase (EC 1.1.1.21) na presença de cofatores

reduzidos NADPH e/ou NADH. O xilitol formado pode ser excretado para o

meio extracelular ou oxidado a xilulose, sendo esta reação catalisada pela

enzima xilitol desidrogenase (EC 1.1.1.9) dependente de cofatores oxidados

NADP+ e/ou NAD+ (JEFFRIES, 1983; SLININGER et ai., 1987). A xilulose é

então fosforilada no carbono 5, pela xilulose quinase e metabolizada pela via

pentase fosfato. A xilulose também pode sofrer isomerização a xilose e reiniciar

a seqüência de reações (DAHIYA, 1991). A Figura 1 apresenta o esquema do

metabolismo inicial de xilose em leveduras.

As enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase podem ter diferentes

especificidades, dependendo da levedura estudada. Em Candida utilis, a

enzima xilose redutase requer como cofator NADPH, enquanto xilitol

desidrogenase depende de NAD+ (BRUINENBERG et ai., 1984). Já em

C. guilliermondii FTI 20037 observa-se que a enzima xilose redutase é NADPH

dependente e xilitol desidrogenase é NAD+ ou NADP+ dependente (SILVA et

ai., 1996). Nas leveduras Pichia stipitis, Candida shehatae e Pachysolen

tannophilus a enzima xilose redutase utiliza tanto NADPH como NADH, e a

xilitol desidrogenase NADP+ ou NAD+ (HAHN-HAGERDAL et ai., 1994).

VERDUYN et ai. (1985a e b) demonstraram que P. stipitis possui somente uma

xilose redutase, enquanto P. tannophilus possui duas formas de xilose

redutase, com diferentes especificidades por cofatores. YOKOYAMA et ai.

(1995) sugerem que microrganismos que apresentam a enzima xilose redutase

dependente de NADH são melhores produtores de etanol e ao contrário,

aqueles que apresentam xilose redutase dependente de NADPH, acumulam

xilitol ao invés de produzir etanol. Em C. intermedia foram isoladas duas formas

9

de xilose redutase, uma com especificidade apenas por NADPH e outra que

pode usar NADH ou NADPH como cofator, porém a razão do cofator disponível

no citossol deve determinar qual das duas formas será utilizada para conversão

de xilose em xilitol (MAYR et ai., 2000).

L D·Xll .. OSE _J Red::: e :p~2:) ViáPentÔ$e(FÔ~fâtô

Xilose lsomerase

FIGURA 1 - Esquema do metabolismo de xilose e regeneração de cofatores, adaptado de BARBOSA et ai. (1988) e DAHIYA (1991).

--~"= te ::.:x:: º ~d~'~pj- l_º x_.L_U_L_O_S_E~J

Xilulose lCATP Quinase ADP

j XILULOSE·SP I L..___ -~

LEE (1998) comparando as seqüências de aminoácidos de xilose

redutase de diferentes leveduras observou que os resíduos (Asp43, Tyr48,

Lys77, His110, Lys262) que participam diretamente da catálise ou da ligação

do cofator são conservados em todas elas.

Segundo BRUINENBERG et ai. (1984), a produção de xilitol por

leveduras está intimamente relacionada com a regeneração de cofatores

reduzidos. Pela via pentase fosfato, 1 mol de glicose-6-fosfato é

completamente oxidado a H20 e C02, gerando 12 moles de NADPH a partir de

NADP+. A fim de manter o balanço de cofatores, o NADPH produzido é usado

para reduzir xilose em xilitol, sendo assim o xilitol é catabolizado para produzir

glicose-6-fosfato e regenerar NADP+ suficiente para manter o ciclo

(BARBOSA et ai., 1988).

íl \J Via Pentase Fosfato

10

SILVA et ai. (1996) explicam que em C. guilliermondii FTI 20037, o

acúmulo de xilitol em relação a xilulose ocorre devido às constantes cinéticas

das enzimas, uma vez que o KM da xilose redutase (O, 18 M) é 4 vezes menor

do que o da xilitol desidrogenase (0,75 M), enquanto a Vrnax para xilose

redutase (243 ü/,nl) é maior do que a Vmax da xilitol desidroqenase (168 U/ml).

GIRIO et ai. (1996) sugerem que os valores de KM da enzima xilitol

desidrogenase para o substrato e o cofator podem mostrar qual levedura

acumularia maior concentração de xilitol. Comparada ao de outras leveduras, a

xilitol desidrogenase de D. hansenii apresenta KM na mesma ordem de

magnitude para xilitol e de 2 a 5 vezes maior para NAD+. Assim sendo,

diminuindo a concentração do cofator, a oxidação de xilítol cessaria, havendo

acúmulo deste intermediário no meio.

2.3.2 FATORES QUE INFLUENCIAM O METABOLISMO

A eficiência de conversão de xilose em xilitol, assim como a

produtividade, dependem do microrganismo e das condições empregadas na

fermentação. A produção de xilitol está relacionada principalmente às

atividades das enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase e, por

conseguinte, a indução ou repressão destas enzimas influencia diretamente o

processo.

• Efeito da Presença de Outros Glicídeos

A composição de hidrolisados hemicelulósicos utilizados como meio de

cultura para a produção biotecnológica de xilitol varia de acordo com o tipo de

material lignocelulósico utilizado, porém estão sempre presentes nos

hidrolisados outros açúcares além da xilose, normalmente glicose, arabinose,

galactose e manose, em menores concentrações. WALTHER et ai. (2001),

utilizando Candida tropicalis, observaram que glicose (20 g/L) em meio

contendo 60 g/L de xilose reprimiu fortemente (41 %) a formação de xilitol,

enquanto manose (20 g/L), e galactose (20 g/L) causaram moderada inibição

na produção de xilitol (11 % e 22% respectivamente). Além disto, xilose,

11

manose e galactose foram simultaneamente consumidas após o esgotamento

de glicose, enquanto não se verificou consumo de arabinose.

A presença de hexases, como a glicose, no meio de fermentação é um

dos fatores que regula a produção de xilitol por leveduras. Em fermentações

com C. shehatae e P. stipitis, en, meio de cultura contendo xilose e glicose, foi

verificado o consumo preferencial de glicose em relação a xilose, havendo um

período lag para o consumo desta pentase, necessário para a síntese de

enzimas do metabolismo de xilose (KILIAN & van UDEN, 1988). Contudo, este

período pode ser reduzido com o crescimento do inóculo em meio contendo

xilose como fonte de carbono (SILVA et ai., 1998).

Em C. tropicalis, no entanto, foi observado que quando o meio é

suplementado com glicose, a produção de xilitol é melhorada, inclusive com

menor consumo de xilose. Este efeito, à primeira vista contraditório, foi

explicado pelo uso de glicose como fonte de carbono preferencial pela

levedura, iniciando seu crescimento no meio de cultura mais rapidamente do

que na presença de xilose (YAHASHI et ai., 1996) Além disto a glicose permite

a regeneração de NADPH, cofator da enzima xilose redutase, pela via pentase

fosfato (PARAJÓ et ai., 1998b). ROSA et ai. (1998) constataram o

favorecimento da formação de xilitol por C. · guilliermondii, em meio sintético

contendo 30 g/L de xilose e 5,0 g/L glicose. TAVARES et ai. (2000) também

observaram com D. hansenii ,que a adição de 1,0% de glicose em meio

contendo 60 g/L xilose, a produtividade de xilitol aumentou 30%. O mesmo

efeito não foi observado com a adição de galactose.

Segundo LUCAS & van UDEN (1986), o transporte de moléculas para o

interior da célula interfere na eficiência e na produtividade do xilitol. Estes

autores estudaram o transporte de monômeros de hemicelulose em

C. shehatae e constataram que tanto a glicose como a xilose são transportadas

por sistema de difusão facilitada e também por simporte de prótons. Quando a

levedura cresce sob condições de supressão de fontes de carbono ela produz

um sistema de difusão facilitada que reconhece glicose, D-manose e D-xilose e

não reconhece D-galactose e L-arabinose. Os açúcares glicose e xilose são

mutuamente inibidores competitivos, indicando que as duas atividades nos

sistemas de afinidade correspondem a dois simportes distintos com KS e

Vmax próprios (KS ± 2 mM, Vmax ± 2,3 mmoles/g.h para glicose e

12

KS ± 125 mM, Vmax ± 22,5 mmoles/g.h para xilose). Para P. stipitis, também

foi observado dois simportes distintos para o transporte de glicose e xilose,

porém com comportamento de inibição não competitiva entre eles (KILIAN &

van UDEN, 1988). LEE et ai. (1996) venncaram que em C. guiffiermondii, D-xilose e

L-arabinose são os melhores glicídeos indutores, enquanto glicose é um

repressor catabólico das enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase.

KERN et ai. (1997) também observaram, para xilose redutase de C. tenuis, o

mesmo comportamento de indução por D-xilose e L-arabinose, além de

D-lixose e D-arabinose. Então, pela análise das moléculas indutoras, foi

sugerido que o efeito pode estar relacionado com a posição equatorial dos

grupos hidroxila nos carbonos da posição 3 e 4.

• Concentração Inicial e Idade do lnóculo

CAO et ai. (1994) observaram, em uma linhagem de Candida sp., que

quando a concentração do inóculo foi aumentada de 3,8 a 26 g/L, houve um

aumento de 80% na produção de xilitol em meio com 260 g/L de xilose. Em

hidrolisado de bagaço de cana de açúcar e com C. guilliermondii FTI 20037, a

bioconversão de xilose em xilitol foi favorecida utilizando inóculo de O, 1 a 3,0

g/L, sendo seu aumento limitado pela concentração de substrato e aeração do

meio (FELIPE et ai., 1997a).

PFEIRER et ai. (1996) observaram durante fermentações em meio

sintético, que a utilização de inóculos de C. guil/iermondii de 16 a 24 horas

resultou em maior produtividade do xilitol, dados corroborados por FELIPE et

ai. (1997a). Estes autores constataram um aumento de 36% neste parâmetro

com emprego de inóculo de 24 horas em relação ao de 48 horas durante

fermentações em hidrolisado de bagaço de cana.

• Temperatura e pH

A temperatura é um fator importante pois interfere tanto no crescimento

da levedura, como na atividade das enzimas envolvidas na via microbiológica

de obtenção de xilitol. Pesquisas com C. guilliermondii demonstraram que a

13

máxima concentração de xilitol acumulado ocorreu tanto em 30 ºC, como em

35 ºC. Nestas temperaturas a taxa de crescimento foi alta e a xilose foi

consumida rapidamente (BARBOSA et ai., 1988). SOUZA et ai. (1993)

verificaram, durante o cultivo de C. gui/liermondii em hidrolisado hemicelulósico

de palha de arroz, em i:ernperaturas acima de 40 ºC, um decréscimo da

produção de xilitol, enquanto que abaixo de 20 ºC não foi observada formação

deste palio!. Em hidrolisado hemicelulósico de bagaço, o maior rendimento de

xilitol e as atividades máximas para as enzimas xilose redutase e xilitol

desidrogenase de C. guifliennondii foram encontrados com a temperatura de

fermentação igual a 35 ºC (SENE et ai., 2000a).

O pH é outro parâmetro que interfere no crescimento celular e nas

atividades enzimáticas, sendo este efeito dependente do tipo de meio de

cultura. FELIPE et ai. (1997b) constataram que em fermentações de hidrolisado

hemicelulósico de bagaço de cana, a produção de xilitol por C. guilliermondii

foi fortemente inibida em pH abaixo de 4,5, o mesmo não foi observado por

SILVA et ai. (1994) em meio sintético. MORITA et ai. (2000a), também

utilizando hidrolisado de bagaço, encontraram melhores resultados para

consumo de xilose, produtividade e rendimento de xilitol em pH 7,0.

SENE et ai. (2000a) encontraram as máximas atividades de xilose redutase e

xilitol desidrogenase de C. guifliermondii foram em pH 5,5 e 8,5

respectivamente. Em hidrolisado de bagaço de cana, a atividade máxima para

xilose redutase ocorreu quando o pH do meio de cultura foi igual a 6,0,

condição na qual foram também encontrados os máximos valores dos

parâmetros fermentativos da produção de xilitol.

WEBB & LEE (1990) relacionaram o efeito do pH nas atividades

enzimáticas aos resíduos de histidina e cisteína, que podem estar envolvidos

na ligação do cofator à enzima xilose redutase de P. stipitis. A histidina é um

resíduo de aminoácido que é frequentemente encontrado em sítios

enzimáticos, seu anel imidazólico varia entre os estados sem carga e com

carga positiva para catalisar a formação e ruptura de ligações. Estes estados

são influenciados pelo pH do meio e interferem na atividade enzimática.

14

• Disponibilidade de Oxigênio

Para a formação de xilitol, outro fator crítico é a disponibilidade de

oxigênio durante a fermentação. Em condições anaeróbicas a xilose não pode

ser assimilada pelo fato de que o cofator reduzido NADH não pode ser

regenerado através da fosforilação oxidativa (NOLLEAU et ai., 1993), além do

que a atividade de transhidrogenase não foi detectada em leveduras e

aparentemente o balanço não pode ser restabelecido por esta via (HAHN-

HAGERDAL et ai., 1994). VANDESKA et ai. (1996) concluíram que a taxa de

consumo de oxigênio determina quando a xilose é utilizada em processos

respiratórios ou fermentativos.

Segundo GIRIO et ai. (1990), condições de forte aeração favorecem o

aumento de biomassa e prejudicam a produção de xilitol. Na cadeia

transportadora de elétrons, o oxigênio oxida o NADH em NAD+ e a alta

proporção de NAD+ /NADH favorece a oxidação de xilitol em xilulose. A xilulose

seria então degradada através da via da pentase fosfato e pela via glicolítica

para formar piruvato, que é o substrato do ciclo dos ácidos tricarboxílicos,

resultando no aumento de massa celular (FURLAN et ai. 1991). Para favorecer

a bioconversão de xilose em xilitol o meio deve ser mantido sob condições de

baixa aeração, pois ocorre uma elevação da concentração de NADH,

paralisando as etapas posteriores do catabolismo do xilitol e consequente

acúmulo do mesmo (NOLLEAU et ai., 1993; HAHN-HAGERDAL et ai., 1994).

BRUINENBERG et ai. (1984) demonstraram que a taxa de fermentação

anaeróbica de xilose por P. tannophilus e P. stipitis está relacionada à atividade

de xilose redutase NADH dependente, que é a chave para a fermentação

aeróbica em leveduras porque depende da cadeia respiratória para repor o

cofator reduzido. PREEZ et ai. (1989) sugerem que o grau de aeração pode

modular a razão entre xilose redutase NADH dependente e xilose redutase

NADPH dependente em P. tannophi/us. Foi observado para Candida boidinii,

que as atividades de xilose redutase NADH dependente e xilitol desidrogenase

NAD+ dependente foram diminuídas com o aumento da disponibilidade de

oxigênio (VANDESKA et ai., 1995). O mesmo foi observado para

C. guilliermondii, porém esta só possui uma forma da enzima xilose redutase,

que é NADPH dependente (SENE, 2000b).

15

• Concentração Inicial de Xilose

O efeito da concentração inicial de xilose na produção de xilitol foi

estudado em diferentes microrganismos, demonstrando que a produção é

favorecida com o aumento da concentração de xilose inicial (PARAJÓ et ai..

1998b). O aumento na produção é observado até o ponto em que a

concentração de xilose prejudica o crescimento celular. A queda no rendimento

pode estar associada à alta pressão osmótica no meio de cultura ou a inibição

das enzimas pelo substrato (DAHIYA, 1991; DOMINGUEZ et ai., 1997;

PARAJÓ et ai., 1998b).

SILVA et ai. (1996) verificaram que a levedura C. guilliermondii cultivada

em meio sintético apresentou maior produtividade de xilitol com a concentração

de xilose inicial de 70 g/L e maior rendimento com concentração igual a 90 g/L,

porém seus resultados demonstraram que a melhor produção de xilitol e as

maiores atividades de xilose redutase e xilitol desidrogenase ocorrem na faixa

de 70 a 170 g/L de xilose inicial. Segundo ROSA et ai. (1998), os maiores

valores de atividades para xilose redutase e xilitol desidrogenase de

C. guilliermondii cultivada em meio sintético foram obtidos em meio contendo

15 g/L de xilose, entretanto, quando esta concentração foi aumentada até

609/L observou-se uma redução em cerca de 50% nas atividades enzimáticas.

Em pesquisas com C. tropicalis, WAL THER et ai. (2001) observaram

que a xilose na concentração de 156,5 g/L não causou estresse osmótico sob

baixa taxa de aeração (condições semi-aeróbicas), contudo, com o aumento da

aeração a produtividade de xilitol foi prejudicada em 50% quando a

concentração de xilose foi de 120 g/L.

2.4 MATÉRIA-PRIMA

Um dos objetivos do desenvolvimento de tecnologia para produção

biotecnológica de xilitol é apresentar uma alternativa mais barata possível à via

química, forma atualmente empregada para obtenção deste adoçante, a fim de

possibilitar a produção em larga escala com custos mais baixos. Seguindo este

objetivo, busca-se como fonte de xilose, materiais lignocelulósicos por serem

uma fonte abundante e de grande potencial em recursos renováveis.

16

Lignocelulose é o material orgânico mais abundante na biosfera,

compondo cerca de 50% da biomassa no mundo. Sua produção anual tem

sido estimada em 10 a 50x109 toneladas (KUHAD, 1993). A lignocelulose é

composta de 20 a 35% de celulose, 20 a 39% de hemicelulose e 20 a 30% de

, lignina, considerando 0 cceo seco . de diferentes í-i .ateria is. Os componentes

hemicelulósicos das paredes de células vegetais incluem uma variedade de

polissacarídeos lineares ou ramificados compostos de açúcares tais como

D-xilose, D-galactose, D-manose, D-glicose e L-arabinose (FERREIRA FILHO,

1998). J

Em madeiras e em diversos resíduos agroindustriais a porção

hemicelulósica contém alto teor de xilanas, que são polímeros compostos

principalmente por unidades xilanopiranosídicas. Diferentes métodos de

hidrólise são utilizados para romper a ligação entre as unidades monoméricas e

consequente liberação de sacarídeos, entre eles, principalmente a xilose. Entre

os métodos empregados podem ser citados: extração com soluções alcalinas

(TOIT et ai., 1984), "steam explosion" (MARCHAL et ai., 1986), hidrólise

enzimática (TSAO, 1986) e hidrólise ácida (PESSOA JR., 1997).

Entre os diversos resíduos agroindustriais, pesquisas confirmam que a

xilose presente nos hidrolisados hemicelulósicos de palha de arroz

(ROBERTO et ai., 1994), eucalipto (FELIPE et ai., 1996), bagaço de cana de

açúcar (FELIPE et et., 1997a e b) e palha de trigo (CANILHA, 2002) pode ser

convertida em xilitol por C. guilliennondii FTI 20037. Dentre estes materiais, o

bagaço de cana de açúcar tem se destacado pela sua disponibilidade,

principalmente no estado de São Paulo, o que o torna alvo de inúmeras

pesquisas para o seu aproveitamento no processo microbiológico de obtenção

de xilitol.

'-. ,__

2.4.1 BAGAÇO DE CANA DE AÇÚCAR

O bagaço de cana de açúcar é um resíduo gerado pela indústria

sucroalcooleira após o esmagamento da cana de açúcar para extração do suco

contendo sacarose. Este resíduo é normalmente utilizado pelas próprias

indústrias como combustível para as caldeiras, no entanto este pode ser

17

empregado na geração de produtos de alto valor agregado, como no caso do

xilitol. O bagaço de cana de açúcar possui aproximadamente 50% de celulose,

25% de hemicelulose, 20% de lignina e 3% de cinzas. Comparado a outros

resíduos lignoceluló5;c;:;:;, como palha de arroz, casca de a, .oz e palha de trigo,

entre outros, o bagaço de cana é o que apresenta maior proporção de xilose

(23,3%) em relação aos carboidratos totais (LEE, 1997). Além disto pode ser

considerado uma reserva abundante de energia solar pela sua alta

produtividade (cerca de 80 toneladas/hectare) e capacidade de regeneração

anual (PANDEY et ai., 2000). Estas características têm impulsionado pesquisas

em tecnologias de aproveitamento do bagaço de cana, principalmente em

processos biotecnológicos utilizando microrganismos fermentadores de xilose.

2.5 EFEITO TÓXICO DOS HIDROLISADOS HEMICELULÓSICOS

Para que os hidrolisados hemicelulósicos sejam utilizados como meios

de cultivo para obtenção de xilitol, alguns problemas devem ser contornados,

como a presença de compostos tóxicos inerentes ao processo de hidrólise da

biomassa. Diversos destes compostos já foram identificados, tais como

minerais e metais contidos no material lignocelulósico ou resultantes do

processo de corrosão de equipamentos; produtos da hidrólise de hemicelulose

como hidroximetilfurfural,. furfural e ácido acético; produtos derivados da

degradação de lignina como compostos fenólicos, ácidos aromáticos e

aldeídos; e ainda compostos derivados de extrativos (PARAJÓ et ai., 1998c).

Para minimizar os efeitos destes compostos, diversas técnicas já foram

empregadas, como adaptação de células das leveduras, adição de substâncias

redutoras, neutralização e "overliming", evaporação e "steam stripping",

extração por solvente e adsorção por carvão ativo (CONVERTI et ai., 1999).

O Furfural e o hidroximetilfurfural (HMF) são compostos quimicamente

relacionados, ambos possuem um anel furano e um grupo aldeídico e são

, formados a partir da quebra de carboidratos (Figura 2). Foi demonstrado que

tanto o furfural, como o HMF, exercem efeito inibitório no crescimento de

C. guilliermondii; furfural em concentrações maiores que 1,0 g/L, e HMF em

concentrações acima de 1,5 g/L (SANCHES & BATISTA, 1988).

18

o o Hexases

Desidratação

HMF

'( ? o. .. ._//·,r/-..... .. :;'.'·º

o Pentases

o ,..o . ....__ ... li \_( Desidratação

Furfural

FIGURA 2 - Formação de hidroximetilfurfural (HMF) e furfural a partir da desidratação de hexases e pentases, respectivamente (adaptado de TAHERZADEH et ai., 2000).

O consumo de furfural é mais rápido em relação ao HMF. Quando os

dois estão presentes no meio, HMF é convertido lentamente até que todo o

furfural seja metabolizado. Esta característica é importante porque a presença

de HMF é prolongada durante o processo. O metabolismo destes compostos

pode ocorrer pela enzima piruvato descarboxilase, que catalisa a formação do

grupo acilo, como na reação entre piruvato e acetaldeído. Assim HMF e furfural

competem com a reação com acetaldeído, interferindo na via glicolítica e

prejudicando o crescimento do microrganismo. Além disto, foi demonstrado que

a redução de HMF consome NADH, sendo necessária uma adicional formação

deste cofator para manter o balanço na célula (TAHERZADEH et ai., 2000).

O efeito inibitório dos compostos fenólicos é devido à capacidade de se

associarem a membranas biológicas, causando perda de integridade, afetando

assim sua habilidade de servir como barreira seletiva e matriz de enzimas

transmembrânicas. Os compostos fenólicos comumente encontrados em

hidrolisados hemicelulósicos são ácido 4-hidroxibenzóico, vanilina e catecol

(PALMQVIST et ai., 2000).

O efeito de metais foi pesquisado por WATSON et ai. (1984), que

observaram, para P. tannophilus, que o crescimento em meio sintético não foi

alterado na presença de íons como cobre e cromo em baixas concentrações,

inferiores a 0,05 g/L, enquanto na presença de O, 1 g/L de níquel, observou-se

redução rio crescimento.

O efeito dos compostos tóxicos sobre o metabolismo de xilose é

bastante complexo, havendo algumas evidências de que a inibição da

fermentação é causada pelo efeito sinergístico entre eles

19

(LOHMEIER-VOGEL et ai., 1998). Dentre os compostos presentes no

hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana de açúcar considerados como

potencialmente tóxicos à C. guilliermondii, destaca-se o ácido acético,

encontrado em concentrações superiores a 3,0 g/L (RODRIGUES, 1999).

2.5.1 EFEITO DO ÁCIDO ACÉTICO

O ácido acético, proveniente dos grupos acetil das cadeias laterais da

hemicelulose, é considerado o principal inibidor do metabolismo de xilose

(ZYL et ai., 1988; FERRARI et ai. 1992; CONVERTI et ai., 2000). Sua

toxicidade está relacionada com o pH do meio de cultura (NODA et ai., 1982;

FERRARI et ai., 1992), a disponibilidade de oxigênio (ZYL et ai. 1988), a

temperatura (PINTO et ai., 1989), a relação xilose/ácido acético (PREEZ et ai.,

1991 ), a concentração do ácido (FELIPE et el., 1995) e o microrganismo

empregado (FELIPE et ai., 1997b).

O efeito tóxico do ácido acético é aumentado em pH ácido, pois nestas

condições predomina a sua forma não dissociada no meio de cultura (PREEZ,

1991 ). Isto pode explicar a inibição do crescimento de C. guilliermondii em

hidrolisado com pH inferior a 4,5, onde o ácido acético, que possui pKa igual a

4,74 está, em sua maioria, não dissociado (NODA et ai., 1982). Quando este

ácido é transportado para dentro da célula, a molécula se dissocia em íon

acetato mais próton, devido ao pH do citossol ser próximo a neutralidade. Com

o aumento da concentração de prótons, o pH interno diminui. Para a

manutenção homeostática do pH, as células dependem da enzima

transmenbrânica H+ -ATPase que transporta íons H+ para fora das células

consumindo ATP (HOLYOAK et ai., 1996). Como resultado da restauração da

neutralidade, ocorre o desacoplamento da produção de energia e do transporte

de nutrientes, resultando na diminuição do crescimento e do metabolismo do

microrganismo (HERRERO et ai., 1985; lYL et ai. 1988; LOHMEIER-VOGEL

et ai., 1998). HERRERO et ai. (1985) atribuíram o decréscimo no

desenvolvimento celular de C/ostridium thermocellum na presença de ácido

acético ao fato de grande quantidade de ATP ser consumido via H+ -ATPase, a

fim de manter o fluxo de prótons para restaurar o pH intracelular, resultando em

menor energia para a biossíntese. Segundo NARENDRANATH et ai. (2001),

20

estima-se que o consumo de ATP pela atividade de A TPase é de 10-15%

durante o crescimento celular, tendo uma relação estequiométrica de uma

molécula de ATP hidrolisada por próton expulso da célula.

O processo de acidificação do citossol pela entrada de ácido acético

pode também mcdificar o controle da via glic~lítica (P/\MPULHJ\ & LOUREIRO-

DIAS, 1990). A Figura 3 apresenta o mecanismo de acidificação do citoplasma

pela dissociação da molécula de ácido acético e o transporte de prótons para o

meio extracelular via enzima H+ -ATPase.

Meio Extracelular Meia Intracelular

FIGURA 3 - Mecanismo de acidificação do citoplasma pela forma não dissociada do ácido acético e transporte de prótons através da membrana pela enzima H+-ATPase (adaptado de LAWFORD & ROUSSEAU, 1993).

FELIPE et ai. (1995) demonstraram que o efeito inibitório do ácido

acético no metabolismo de xilose por C. guil/iermondii é dependente da

concentração deste no meio de cultura. Em meios com baixa concentração do

ácido, até 1,0 g/L, houve aumento de 20% no rendimento e de 33% na

produtividade de xilitol em relação ao meio ausente de ácido. Foi demonstrado

que esta levedura foi capaz de metabolizar ácido acético em meio sintético e,

segundo os autores, este efeito pode ser devido à entrada deste ácido

diretamente no ciclo dos ácidos tricarboxílicos via acetil-CoA. A assimilação de

ácido acético por C. guilliermondii também é constatada quando a levedura é

cultivada em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, sendo favorecida

com o esgotamento de xilose (FELIPE et ai., 1997a). Melhor crescimento

celular foi observado em condições aeróbicas, com aeração correspondente a

um kLa igual a 35 h-1 e pH inicial igual a 7,0. A capacidade de metabolizar ácido

acético pela levedura, sugere a possibilidade de detoxificação do hidrolisado

utilizando condições ótimas de pH e aeração (MORITA et ai., 2000b).

21

O metabolismo de acetato por leveduras ainda não foi completamente

elucidado. Sabe-se que o acetato pode ser utilizado como fonte de carbono,

sendo convertido em acetil-CoA pela enzima acetato quinase, com consumo de

ATP. SOUSA et ai. (1998) observaram que para Zygosaccharomyces bailii,

nem o ciclo =~ glioxilato, nem a glk,,:meogêr..Jse estão envolvidos no

metabolismo de ácido acético, mas sim o ciclo de Krebs. LEE et ai. (1996)

verificaram que o nível de mRNA e a atividade da enzima acetil-CoA hidrolase

são aumentados em meio contendo acetato, o que indica que a expressão

desta enzima pode estar envolvida na utilização de ácido acético. Acetil-CoA

hidrolase é uma das enzimas que controlam o nível de acetil-CoA e CoASH no

citossol.

22

3. OBJETIVOS

3.1 GERAL

Contribuir para o desenvolvimento de uma tecnologia de obtenção de

xilitol po: via biotecnológica a partir de bagaço de cana de açúce..

3.2 ESPECÍFICOS

• Avaliar a influência da adição de diferentes concentrações de ácido

acético na atividade das enzimas intracelulares xilose redutase (XR) e xilitol

desidrogenase (XDH) de C. guillíerrnondíí cultivada em hidrolisado

hemicelulósico de bagaço de cana de açúcar.

• Avaliar a influência da adição de diferentes concentrações de ácido

acético na atividade das enzimas XR e XDH de C. guí/Jíerrnondií cultivada em

meio sintético, simulando a composição de açúcares do hidrolisado de bagaço.

• Avaliar o efeito da adição de diferentes concentrações de acetato de

sódio nas atividades de XR e XDH.

• Verificar a existência da relação entre a concentração de ácido

acético nas atividades de XR e XDH e o rendimento e produtividade em xilitol.

23

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 MICRORGANISMO E PREPARO DO INÓCULO

Os ensaios foram conduzidos com a levedura Candida gui/liermondii

FTI 20037, selecionada por BARBOSA et ai. (1988) para produção de xilitol.

Foi utilizada uma cultura estoque do DEBIQ/FAENQUIL, mantida em ágar

extrato de malte 5% a 4 ºC.

Para o preparo de inóculo, o cultivo da levedura foi realizado em frascos

Erlenmeyer de 125 ml, contendo 50 mL de meio composto de xilose (30 g/L),

suplementado com sulfato de amônia (2 g/L), cloreto de cálcio dihidratado

(O, 1 g/L), solução de extrato de farelo de arroz (20 g/L), conforme tem sido

empregado nos trabalhos do grupo (FELIPE et ai., 1997a; ALVES et ai., 1998;

RODRIGUES, 1999; SILVA, 2001). O cultivo foi feito em incubadora de

movimento rotatório (New Brunswick, Scientific Co.) com agitação de 200 rpm,

a 30 ºC, por 24 horas.

As células foram recuperadas por centrifugação a 2000xg (Cu-5000 -

Damon/lEC Division) e lavadas com água destilada estéril. Após a segunda

centrifugação as células foram utilizadas para o preparo da suspensão que foi

empregada como inóculo, com concentração igual a 1,0 g/L.

4.2 PREPARO DO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA DE AÇÚCAR

O bagaço de cana foi obtido na Usina Guarani, em Olímpia-SP.

Primeiramente o bagaço teve seu teor de umidade determinado através da

secagem de amostras em estufa a 100 ºC até peso constante. Em seguida foi

hidrolisado na planta de hidrólise ácida da FAENQUIL, em reator de aço inox

AISI 316, com capacidade volumétrica de 250 litros, com aquecimento indireto

por resistência elétrica em camisa de óleo térmico. A hidrólise foi realizada

conforme metodologia estabelecida por PESSOA JR. (1997), empregando as

seguintes condições: temperatura de 121 ºC, por 10 minutos e

100 mg de ácido sulfúrico por grama de matéria seca, para uma relação

sólido-líquido de 1: 1 O. O hidrolisado obtido foi centrifugado para remoção de

24

massa residual de sólidos (celulose e lignina) e armazenado a 4 ºCem câmara

fria.

4.3 CONCENTRAÇÃO E TRATAMENTO

O hidrolisado obtido foi submetido ao processo de concentração, com a

finalidade de aumentar em 3 vezes o teor inicial de xilose e reduzir o teor de

compostos tóxicos voláteis. A concentração foi realizada em um evaporador

rotativo modelo MA 175, com aquecimento por fluído térmico (água destilada)

em banho termostático controlado em aproximadamente 70 ºC.

O tratamento foi feito segundo metodologia estabelecida por ALVES et

ai. (1998), que consistiu em adicionar ao hidrolisado concentrado (pH 2,2),

óxido de cálcio comercial até pH 7,0, seguido de redução de pH até 5,5 com

ácido fosfórico. Ao hidrolisado foi adicionado carvão ativo (2,4% p/v), mantido

sob agitação de 200 rpm, por 1 hora, a 30 ºC. A cada alteração de pH e após o

tratamento com carvão o hidrolisado foi filtrado em papel de filtro, a vácuo em

filtro de porcelana, sendo descartado o precipitado.

Os hidrolisados original, concentrado e tratado foram caracterizados

quanto ao pH, à concentração de açúcares (xilose, glicose e arabinose) e

também quanto à concentração de compostos tóxicos (furfural,

hidroximetilfurfural, ácido acético e compostos fenólicos).

4.4 MEIOS E CONDIÇÕES DE FERMENTAÇÃO

Os experimentos para avaliação do efeito do ácido acético foram

realizados inicialmente em meio de composição semelhante a do hidrolisado

quanto às concentrações de xilose, glicose e arabinose, suplementado com os

mesmos nutrientes utilizados para o cultivo do inóculo, acrescentado de 5, 6, 8

e 1 O g/L de ácido acético. O pH de cada meio foi corrigido para 5,5 com

hidróxido de sódio 1 O M. Como controle foi utilizado meio sem adição de ácido.

Para avaliação do efeito do ácido acético em meio formulado com

hidrolisado, este foi tratado conforme descrito no item 3.3, e suplementado com

os mesmos nutrientes empregados para os meios anteriores. Ao meio de

cultura preparado foi adicionado ácido acético concentrado para as

25

concentrações finais iguais a 5, 6, 8 e 10 g/L, acertando-se o pH para 5,5 com

hidróxido de sódio 1 O M.

O hidrolisado e as soluções de glicose, arabinose e xilose foram

autoclavados a 111 ºC por 15 minutos. As soluções estoque de sulfato de

amónio e cloreto de cálcio di-hidratadato foram preparadas nas concent, ações

de 250 e 50 g/L, respectivamente, e esterilizadas a 121°C por 20 minutos.

A solução de extrato de farelo do arroz foi preparada conforme procedimento

anteriormente estabelecido, uma solução de 250 g/L foi autoclavada a 111 ºC,

por 15 minutos, seguida de centrifugação para remoção de sólidos (FELIPE et

ai., 1997a; ALVES et ai., 1998; RODRIGUES, 1999).

Os ensaios foram conduzidos em frascos Erlenmeyer de 125 ml com

50 ml de meio, em triplicata, a 30 ºC, sob agitação 200 rpm em incubadora de

movimento rotatório (New Brunswick, Scientific Co). Para o acompanhamento

da fermentação, as amostras representadas pelo volume total de cada frasco

Erlenmeyer, foram retiradas em intervalos de 12 horas (12, 24, 36, 48 e 58),

esta última amostra foi analisada neste tempo para evitar o esgotamento da

xilose no meio de cultura, prevenindo o consumo de xilitol.

Após a determinação da concentração celular e avaliação da viabilidade

e pureza da cultura. as células foram separadas por centrifugação a 2000xg

(Cu-5000 - Damon/lEC Division) e lavadas com água destilada estéril. O pH do

sobrenadante foi determinado e este foi congelado para posterior quantificação

da concentração de xilose, glicose, arabinose, ácido acético e xilitol. As células

recuperadas foram ressuspensas em tampão fosfato de potássio O, 1 M, pH 7,2

e congeladas para o rompimento celular.

4.5 MÉTODOS ANALÍTICOS

4.5.1 VIABILIDADE E PUREZA DA CULTURA

A viabilidade da cultura foi verificada por análise em microscópio óptico

(Leitz) de lâminas preparadas a fresco, coradas com azul de metileno

(0,01% p/v), dissolvido em citrato de sódio (2% p/v) (ODUMERO et ai., 1992),

enquanto a pureza foi avaliada a partir de lâminas fixadas e coradas com

fucsina.

26

4.5.2 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO CELULAR

A concentração celular foi determinada por espectrometria a 600 nm, no

caso do preparo do inóculo, e por contagem de células em Câmara de

Neubauer (1/400 mm2 x 1/10 mm) para avaliação do crescimento celular nos

diferentes tempos de fermentação.

4.5.3 DETERMINAÇÃO DE PH

O pH das amostras foi determinado em pHmetro modelo 8474

(Micronal).

4.5.4 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCARES E ÁCIDO ACÉTICO

As concentrações de glicose, xilose, arabinose, xilitol e ácido acético

foram determinadas em Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência (Shimadzu -

LC-10 AD), empregando-se as seguintes condições: coluna 810 RAD Aminex

HPX-87H (300 X 7,8 mm); temperatura da coluna 45°C, detector de índice de

refração RID-6\ eluente solução de ácido sulfúrico 0,01 N, fluxo de 0,6 ml/min;

volume da amostra injetada 20 µL.

As amostras, após devidamente diluídas, foram filtradas em filtro

Sep Pak C18 (MILLIPORE). O eluente, antes do uso, foi filtrado a vácuo em

membrana em éster de celulose, 0,45 µm de poro, 47 mm de diâmetro

(MILLIPORE) e simultaneamente foi desgaseificado em banho ultra-som

(THORTON) por 25 minutos.

4.5.5 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE FURFURAL E HIDROXIMETILFURFURAL

As concentrações de furfural e hidroximetilfurfural foram determinadas

em Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência (Shimadzu - LC-1 O AD),

empregando-se as seguintes condições: coluna Hewlett-Packard RP 18

(200 mm); temperatura da coluna 25 ºC, detector de ultravioleta SPD-10A UV-

VIS no comprimento de onda de 276 nm, fluxo de 0,8 mllmin; eluente solução

de acetonitrila/água (1 :8) com 1 % de ácido acético; volume da amostra injetada

20 µL.

27

As amostras foram devidamente diluídas e filtradas em filtros Swennex,

com membrana HA em éster de celulose, 0,45 µm de poro, 0,47 mm de

diâmetro (MILLIPORE). Na composição do eluente, a água bidestilada foi

filtrada a vácuo empregando-se membrana HA em éster de celulose, 0,45µm

de poro, 0,47 mm de diâmetro ,ivilLLIPORE) e os outros componentes, como

ácido acético e acetonitrila, foram nas proporções adequadas, adicionados à água devidamente filtrada. Em seguida o eluente foi desgaseificado em banho

de ultra-som (THORTON) por 15 minutos.

4.5.6 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE FENÓIS

Os compostos fenólicos foram determinados utilizando o método

descrito por KIM & YOO (1996), que consiste na adição de O, 1 ml de

K3Fe(CN)6 8 mM a 1,5 ml de amostra, seguida de adição imediata de O, 1 ml

de uma solução de FeC'3.6H20 O, 1 M em HCI O, 1 M. A absorbância da solução

resultante foi lida após 5 minutos, em uma cubeta de quartzo de 1 cm de

percurso ótico, a 700 nm, em espectrofotômetro computadorizado BECKMAN®

DU 640 8 e comparada com uma curva de calibração feita usando vanilina

como padrão.

4.6 ROMPIMENTO CELULAR

Para o rompimento celular e obtenção das enzimas intracelulares xilose

redutase e xilitol desidrogenase, as células foram descongeladas,

centrifugadas e ressuspensas em tampão fosfato de potássio 0,1 M, pH 7,2 a

uma concentração de 15 a 20 g/L. Foi empregado um volume de 5 ml da

suspensão em um tubo cônico, o qual foi imerso em um banho refrigerado a

-10 ºC para prevenir o aquecimento decorrente das vibrações ultra-sônicas

(Vibra Cell 1 OOW Sonics & Materiais). Ao tubo foi introduzida uma sonda de

13 mm, que emite vibrações a uma frequência de 20 KHz, programada para

vibrações em pulso de 1 s com intervalos de 1 s, durante 35 min. Os restos

celulares foram separados em centrífuga (Jouan NRL 1812) a 6708xg por

1 O min, a 4 ºC, recolhendo-se o sob renadante para determinação das

28

atividades enzimáticas de xilose redutase e xilitol desidrogenase e proteína

solúvel.

4.7 DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNA SOLÚVEL

A concentração de proteína no extrato livre de células foi determinada

conforme método BRADFORD (1976), empregando-se albumina sérica bovina

(BSA) como padrão e reagente de Bradford (Azul-Brilhante de Coomassie

G-250) como cromóforo. As leituras de absorbância foram feitas em

espectrofotômetro a 550 nm.

4.8 MEDIDA DAS ATIVIDADES ENZIMÁTICAS

As atividades enzimáticas foram determinadas em extratos celulares

preparados a partir da suspensão de células, realizadas segundo método

utilizado por SENE (2000b). Os valores de absorbância foram determinados em

espectrofotômetro BECKMAN® OU 640 B.

O meio padrão de reação para xilose redutase foi composto por 200 µL

de extrato celular; 570 µL de água; 150 µL de P-mercaptoetanol O, 1 M; 80 µL

de tampão fosfato de potássio (KH2P04-K2HP04) 1,0 M, pH 7,2; 100 µL de

NADPH 1,2 mM e 200 µL de xilose 0,5 M; correspondendo a um volume total

de 1,3 ml. A atividade foi determinada pela diminuição da absorbância a

340 nm, decorrente da oxidação do NADPH.

Para xilitol desidrogenase, o meio padrão de reação foi constituído de

100 µL de extrato celular; 450 µL de água; 200 µL de p-mercaptoetanol 0,1 M;

150 µL de tampão TRIS 0,5 M, pH 8,6; 150 µL de NAD+ 1,26 mM e 150 µL de

xilitol 0,5 M; correspondendo a um volume total de 1,20 ml. A atividade foi

determinada pelo aumento da absorbância a 340 nm, decorrente da redução do NAD+.

Uma unidade internacional de atividade enzimática (UI) foi definida como

a quantidade de enzima que catalisa a formação de um micromol de NADPH

por minuto, no caso de xilose redutase, ou de NAD+ para xilitol desidrogenase,

à temperatura ambiente, utilizando-se o coeficiente de extinção molar para os

cofatores de 6220 M-1.cm·1 (SENE 2000b).

29

4.9 EFEITO DO ACETATO DE SÓDIO NAS ATIVIDADES ENZIMÁTICAS

Para avaliação na atividade in vitro de xilose redutase e xilitol

desidrogenase em presença de acetato de sódio, foi utilizado o ensaio

enzimático descrito no item anterior, porém adicionando-se uma solução de

acetato até as concentrações finais iguais a 0,25; 0,5; 1,0; 2,0 e 4,0 g/L,

mantendo-se o volume final pela diminuição da quantidade de água. A solução

estoque de acetato de sódio teve seu pH corrigido com hidróxido de sódio 1 M,

para o pH ótimo de atividade enzimática (7,2 para xilose redutase e 8,6 para

xilitol desidrogenase).

4.10 DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS FERMENTATIVOS

• Fator de rendimento de xilitol em relação a xilose consumida (Yp/s)

O fator de rendimento expressa a razão de massa de xilitol produzido

por massa de xilose consumida, em gramas, calculado pela equação:

_ M PJ-Pi Yp1s- --=----

1:lS Sf-Si

Onde:

Pi e P, correspondem às concentrações inicial e final de xilitol (g/L)

Si e St correspondem às concentrações inicial e final de xilose (g/L)

• Produtividade volumétrica de xilitol (Qp)

A produtividade de xilitol expressa a concentração de xilitol produzida

(g/L) pelo tempo (h), calculada pela equação:

Op = M _ Pf-Pi t t

Onde:

Pi e Pt correspondem às concentrações inicial e final de xilitol (g/L)

t: tempo de fermentação (h)

30

• Eficiência de conversão (rl)

Este parâmetro expresso em porcentagem, representa a razão entre o

fator de rendimento obtido experimentalmente e o fator de rendimento teórico

de 0,917 g/g calculado segundo BARBOSA et ai. (1988).

l1 = Yp i s • 100 0,917

• Velocidade de Consumo

Este parâmetro representa a velocidade de consumo de um composto,

calculado pela variação da sua concentração (g/L) dividida pelo tempo (h) de

fermentação.

ÍlC Ci-Cf V= =--

t t

Onde:

Ci e Cf correspondem às concentrações inicial e final do composto

analisado (g/L)

t: tempo de fermentação (h)

31

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 EFEITO DO ÁCIDO ACÉTICO NA FERMENTAÇÃO EM MEIO SINTÉTICO

A avaliação do efeito do ácido na fermentação foi realizada em meio

sintético simulando a composição do hidrolisado quanto às concentrações de

glicídeos (xilose, glicose e arabinose) contendo 5, 6, 8 e 1 O g/L de ácido

acético, concentrações superiores à considerada inibitória (3,0 g/L) para

formação de xilitol, por C. guilliermondii, segundo FELIPE et ai. (1995). A

Tabela li apresenta as características destes meios.

TABELA li - Características dos meios de cultura após a adição de ácido acético.

Meios de Cultura Características

li Ili IV

Ácido Acético (g/L) 5,330 6,204 7,974 10,22 Xilose (g/L) 46,01 47,49 42,28 46,49

Glicose (g/L) 2,474 2,591 2,625 2,635 Arabinose (g/L) 4,878 5,006 5,120 5,347 ~ - Proporção xilose:ácido acético 8,632 7,655 5,302 4,549

pH 5,87 5,26 5,77 5,69

Os meios sintéticos preparados possuíram constituição similar quanto

aos açúcares e pH variando próximo a 5,5, valor ótimo para produção de xilitol

segundo SENE et ai. (1998). As concentrações finais de ácido acético (5,3; 6,2;

8,0 e 10,2 g/L) foram compatíveis com a esperada para avaliação do efeito

deste ácido na fermentação.

5.1.1 EFEITO DO ÁCIDO ACÉTICO NO CONSUMO DE AÇÚCARES

Analisando os gráficos apresentados na Figura 4, observa-se que o

consumo de xilose não foi influenciado pelas concentrações de ácido acético

avaliadas. Em 58 horas o consumo de xilose foi igual a 99, 95, 97 e 95%, para

os meios com 5, 6, 8 e 1 O g/L de ácido acético, respectivamente.

32

Fazendo a regressão linear dos gráficos da Figura 4 obtêm-se as

seguintes funções:

A: y = -0,7536 x + 44,577 (R2= 0,9843)

B: y = -0, 7849 x + 43, 118 (R2= O, 9823)

C: y = -0,7155 x + 41,664 (R2= 0,9957)

D: y = -0,7598 x + 44,362 (R2= 0,9915)

Analisando as equações, nota-se que os valores dos coeficientes

lineares se aproximam da concentração inicial de xilose, enquanto os

coeficientes angulares representam a taxa de consumo deste açúcar e estão

semelhantes, demonstrando que a taxa de consumo de xilose independe das

concentrações de ácido acético no meio de cultura.

50

A B • '<, ~ 30

.9 ., _2 20 R I

10 ·- 12 24 36 48

Tempo (h) 60 12 24 36

Tempo (h) 48 60

-- •

50

e D 40

::; 30 :§)

±-,

Q) .Q 20 R

10 ,o-; ..

24 36 Tem o h

60 12 24 36

Tem o h o 48 48 60

FIGURA 4 - Concentrações de xilose durante cultivo de C. guilliermondii em meio sintético simulando a constituição de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, com diferentes concentrações de ácido acético (A - 5 g/L; B - 6 g/L; C - 8 g/L; D - 1 O g/L).

·-· .,.-i , \ , r (. ,

p; SIL1Ã0(2bo;0) analisou, para e. guilliermondii cultivada em hidrolisado de

bagaço de cana, a inibição do consumo de xilose causada pela exposição das

células ao ácido acético em diferentes tempos e observou que o efeito mais

significativo ocorreu após 12 horas, ou seja, quando este fora adicionado na

fase de máximo crescimento celular. Como neste trabalho, o ácido acético

33

quando adicionado no tempo inicial de fermentação, a inibição do consumo de

xilose pelo aumento do teor de ácido não foi significativa. Isto ocorre

possivelmente devido à capacidade de adaptação da levedura à presença

deste ácido.

Verifica-se pe:c Tabela Ili que o consurr., de arat..nose se iniciou após

24 horas de fermentação. Isto ocorre devido ao esgotamento inicial de glicose

e a diminuição da concentração de xilose em torno de 50%, levando a levedura

a recorrer a outras fontes de carbono para seu metabolismo, ou ainda por estar

diminuindo a concentração de monossacarídeos concorrentes ao transporte de

arabinose. Observa-se que o consumo de arabinose foi igual a 32, 26, 21 e

33% para os meios com 5, 6, 8 e 1 O g/L de ácido acético. respectivamente.

TABELA Ili - Concentrações de arabinose durante cultivo de C. guilliermondii em meio sintético contendo ácido acético em diferentes concentrações. [Ácido Acético] O g/L 5 g/L 6 g/L 8 g/L 10 g/L

Tempo (h) [Arabinose] g/L o 5,838 4,878 5,006 5,120 5,347 12 4,871 4,587 4,963 4,878 5,096 24 4,913 5,432 5,561 5,497 5,264 36 4,084 4,781 5,175 4,770 5,082 48 3,679 4,301 4,466 4,361 4,503 58 1,826 3,316 3,728 3,547 3,609

Quanto à glicose, esta foi totalmente consumida nas primeiras 12 horas

de cultivo nos quatro meios de cultura com diferentes concentrações de ácido

acético. Já na primeira amostragem, após 12 horas de fermentação, este

açúcar não foi detectado, possivelmente pelo fato de que a glicose, além de ser

a fonte de carbono preferencial, também está presente em baixas

concentrações (-2,6 g/L).

Como neste trabalho, em experimentos realizados anteriormente por

FELIPE et ai. (1995), a levedura C. guilliermondii consumiu glicose

independente da concentração de ácido acético no meio de cultura. ROSA et

ai. (1998) constataram favorecimento na formação de xilitol por

C. guilliermondii, em meio sintético, na presença de glicose até 5,0 g/L. Para

34

Oebaryomyces hansenii, a adição de 10% de glicose em meio contendo 60 g/L

de xilose, resultou em aumento 30% na produtividade de xilitol (TAVARES et

ai., 2000). De acordo com os resultados, foi verificado que a presença de ácido

acético, xilose e arabinose não afetam o consumo de: glicose por

C. guillermondii. Tal comportamento se deve ao fato de que o transporte de

glicose pela membrana celular é independente dos demais açúcares (LUCAS &

van UDEN, 1986) além do que as enzimas utilizadas no metabolismo de glicose

são constitutivas (WALKER, 1999).

5.1.2 CONSUMO DE ÁCIDO ACÉTICO DURANTE A FERMENTAÇÃO

TABELA IV - Ácido acético consumido durante cultivo de C. guilliermondii em meio sintético, contendo diferentes concentrações de ácido acético. [Ácido Acético] 5 g/L 6 g/L 8 g/L 10 g/L

Tempo (h) Ácido Acético Consumido (g/L) 12 1,942 1,566 1,483 1,568 24 2, 101 1,893 1,708 2,538 36 2,498 2,412 2,387 2,861 48 2,884 2,869 2,819 3,241 58 3,080 3, 101 3,040 3,683

O ácido acético foi consumido durante toda a fermentação (Tabela IV),

sendo que nas primeiras 12 horas a velocidade foi maior. como também pode

ser observado na Figura 5. Estes resultados sugerem que este ácido é

metabolizado concomitantemente à glicose, como já observado para

Zygosaccharomyces bailii por SOUSA et ai. (1998).

Observa-se que o consumo do ácido acético é favorecido com o

aumento da concentração deste no meio de cultura, porque houve aumento

das velocidades nas quatro condições estudadas, 0,053; 0,053; 0,052 e

0,064 g/L.h, para os meios com 5, 6, 8 e 1 O g/L de ácido acético,

respectivamente.

10

B

zr ~ ~ 6

i 4

--------- 9 ---------- .... i

i õ - o

:ãi o '" ,. o i:, ·13 ~

--.. - --·--··-·--·-··---·

A

12 24 36 48 60 o 12 24 36 '-3

Tempo (h) Tempo (r., ·- 10 ...

J .. 1 ···- e, ...

-Y---~----- ~ j ::::;- --· E) 1 ~-----------~~- ~ -- ----.; o 5J õ 6

1 ---!'---·--·--.,, ___ o J .!d ~ i 'oi o o "' '--< "' 4 o J o i:, i:, ·13 ·13 ~ 1 ~ 21 e D

e· o o 12 24 36 46 60 o 12 24 36 4S eo

Tempo(h) Tempo n-

FIGURA 5 - Concentrações de ácido acético durante cultivo de C. guilliermondii em meio sintético simulando a constituição de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, com diferentes concentrações de ácido acético (A - 5 g/L; B - 6 g/L; C - 8 g/L; D - 1 O g/L).

Fazendo a regressão linear dos gráficos da Figura 5, utilizando o

intervalo de maior linearidade [12,58], obtêm-se as seguintes funções:

A: y = -0,0264 X + 3, 7687 (R2= 0,9829)

B: y = -0,0349 x + 5,0797 (R2= 0,9920)

C: y = -0,0365 x + 6,9865 (R2= 0,9754)

D: y = -0,0426 x + 8,9583 (R2= 0,9543)

Analisando as equações observa-se que os coeficientes angulares

aumentam com o aumento da concentração de ácido acético no meio de

cultura, demonstrando que a taxa de consumo deste ácido é favorecida com a

sua maior disponibilidade no meio de cultura.

Conforme os dados apresentados na Tabela V, observa-se o aumento

de pH durante a fermentação. Este fenômeno está relacionado ao consumo de

ácido acético pela levedura C. guilliermondii como sugerido por FELIPE et ai.

(1997) e SENE et ai. (1998). Já no meio controle, onde não havia ácido acético,

35

36

o mesmo comportamento não foi observado, ocorrendo diminuição do pH

durante a fermentação.

TABELA V - Valores de pH durante cultivo de C. guil/iermondíi em meio sintético conten~o ácido acético em diferentes concentrações. [Ácido Acético] O g/L 5 g/L 6 g/L 8 g/L 10 g/L

Tempo (h) pH o 4,87 5,87 5,26 5,77 5,69 12 3,34 5,80 5,30 5,72 5,69 24 3,16 6,31 5,41 5,96 5,84 36 2,93 6,99 5,65 6,70 6,27 48 2,68 7,07 5,99 6,99 6,71 58 2,38 7,44 6,72 7,39 7,28

Como já constatado por FELIPE et ai. (1995) durante o cultivo de

C. guilliermondii em meio sintético e por FELIPE et ai. (1997b) e MORITA et ai.

(2000b) em hidrolisado de bagaço de cana, o efeito inibitório do ácido acético

depende do pH de fermentação, sendo potencializado por meios ácidos. No pH

de fermentação o ácido acético que é um ácido fraco (pKa = 4,7), está presente

em maior proporção na forma dissociada, ou seja como acetato (CH3COO-).

De acordo com a equação de Henderson-Hasselbalch, em pH igual a 5,5,

cerca de 86% do ácido acético está na forma de acetato.

FELIPE et ai. (1997a) demonstraram que a levedura C. guilliermondii é

capaz de metabolizar ácido acético em meio sintético. Seu metabolismo deve

ocorrer pela entrada no ciclo de Krebs via acetil-CoA (LEE et ai. 1996;

FELIPE et ai. 1997a; WALKER 1999). SOUSA et ai. (1998) observaram que

para Zygosaccharomyces bailii, nem o ciclo do glioxilato, nem a

gliconeogênese estão envolvidos no metabolismo de ácido acético, mas sim o

ciclo de Krebs. O metabolismo proposto está apresentado na Figura 6, mas

pesquisas são necessárias para sua comprovação.

37

Acetato + CoASH -/\----==---- Acetato Ouinase

Acetil-CoA

ATP AMP+ PPi

Ciclo de Krebs FIGURA 6 - Proposta de metabolismo de acetato pela formação de Acetil-CoA.

5.1.3 FORMAÇÃO DE CÉLULAS NA PRESENÇA DE ÁCIDO ACÉTICO

TABELA VI - Concentrações celulares de C. guilliermondii durante as fermentações em meio sintético contendo ácido acético em diferentes concentrações.

[Ácido Acético] O g/L 5 g/L 6 g/L 8 g/L 10 g/L

Tempo (h) número de células x 107/ml o 12 24 36 48 58

2,36 10,8 11, 1 10,6 14,6 18,3

2,50 6,47 5,33 12,7 11,2 15,0

2,50 4,97 5,03 7,20 7,47 10, 1

3,06 5,57 4,07 10,5 4,67 9,37

3,12 5,00 3,00 7,93 14,6 10,6

Tempo O h: número de células presentes no meio de cultura após a inoculação.

Analisando o crescimento celular, apresentado na Tabela VI, observa-se

rápido aumento no número de células nas primeiras 12 horas seguido de uma

ligeira diminuição em 24 horas. Este efeito deve estar associado à

disponibilidade de glicose nas primeiras horas, promovendo um rápido

aumento de biomassa até sua exaustão, seguido de uma fase de adaptação

para o consumo de outras fontes de carbono. Segundo WALKER (1999),

leveduras cultivadas em batelada, podem ocasionalmente entrar em uma

segunda fase de crescimento. Isto ocorre pela exposição a dois diferentes

substratos que são utilizados seqüencialmente, fenômeno chamado diauxia.

O ácido acético prejudica a formação de biomassa, como pode ser

observado pela Tabela VI. Em fermentações controle ausentes de ácido,

partindo de 2,36 x 107 cels/ml no tempo inicial, o número de células totais

38

após 58 horas foi de 18,3 x 107 cels/ml. Observa-se para as condições com

ácido acético que os valores de células totais são inferiores ao do controle,

tendendo a diminuir com o aumento na concentração de ácido acético. Este

efeito inibitório já foi demonstrado por FELIPE et ai. (1995) e SILVA (2001 ).

TABELA VII - Proporções de células inviáveis durante cultivo de C. guilliermondií em meio sintético contendo ácido acético em diferentes concentrações.

[Ácido Acético] 5 g/L 6 g/L 8 g/L 10 g/L

Tempo (h) Células inviáveis (%)

12 3,09 6,71 4,19 6,67 24 5,00 2,65 1.64 2,22 36 11,0 3,70 12,66 2,52 48 17,8 14,29 17.14 14,61 58 19,8 22,70 21.35 23,27

Tempo O h: número de células inviáveis no meio de cultura após a inoculação.

Analisando a proporção de células inviáveis, apresentada na Tabela VII,

observa-se que com o aumento da concentração de ácido acético o número de

células inviáveis tende a aumentar, demonstrando que além de inibir o

crescimento celular, este ácido acelera a mortalidade das leveduras.

5.1.4 EFEITO DO ÁCIDO ACÉTICO NA FORMAÇÃO DE XILITOL

A formação de xilitol foi independente da concentração de ácido acético,

o que pode ser verificado pela Figura 7. Depois de 58 horas, a concentração de

xilitol no meio foi de 23,50; 20,77; 22,61 e 21,98 g/L para os meios com 5, 6, 8

e 10 g/L de ácido acético, respectivamente. Pode-se notar que entre 12 e

48 horas há uma maior linearidade dos gráficos. Isto ocorre porque nas

primeiras 12 horas a presença de glicose interfere na formação de xilitol e

depois de 48 horas, com o esgotamento de xilose, o xilitol começa a ser

consumido mais rapidamente.

25- z5-_;

-- -·· i

A . B 201 ~] --~-

1 • :::i' 15~ • ::, 9

1 9

~ I :: i • 10- R i 'E.

J 1 1 •

5~ 5~

1 i

-- • --·· o . o 12 24 36 48 60 o 12 24 3ê 48 6C

Tempo (h) Tempo (h) 25..; 251

J --~ 20J e 1 D .Y

J c4 :J - / .. -

2' 2' 3 j • E) j -- g

10J g •

10 ~ 1 ~ J • 1 • 5~ 5

l .. --~ o ' V

12 24 36 48 60 o 12 24 3F. 6C

Tempo (h) Tempo (h)

FIGURA 7 - Concentrações de xilitol durante cultivo de e. guilliermondii em meio sintético simulando a constituição de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, com diferentes concentrações de ácido acético (A - 5 g/L; B - 6 g/L; C - 8 g/L; D - 1 O g/L).

Fazendo a regressão linear dos gráficos da Figura 7, utilizando o

intervalo [12;48] região de maior linearidade, obtêm-se as seguintes equações:

A: y = 0,5499 x - 3,8912 (R2 = 0,9995)

B: y = 0,4301 x - 3,6502 (R2 = 0,9961)

C: y = 0,4870 x - 3,8748 (R2 = 0,9996)

D: y = 0,4499 x - 3,9320 (R2 = 0,9970)

Pelos coeficientes angulares, pode-se notar que houve diminuição dos

seus valores, indicando que a velocidade de formação de xilitol foi prejudicada

pelo aumento da concentração de ácido acético. O mesmo comportamento é

observado analisando-se os parâmetros fermentativos (Tabela VIII).

39

40

TABELA VIII - Produtividade (Op), rendimento (Yp1s) e eficiência de conversão (TJ) de xilitol após 58 horas de cultivo de C. gui/liermondii em meio sintético contendo ácido acético em diferentes concentrações.

O g/L 5 g/L 6 g/L 8 g/L 10 g/L QP (g/L.h) 0,48 0,41 0,36 0,39 0,38 Yp1s üig) 0,78 0,52 0,48 0,51 0,50

T\ (%) 86 56 52 55 55

Os parâmetros fermentativos (produtividade, rendimento e eficiência de

conversão) foram diminuídos com o aumento da concentração de ácido

acético, principalmente comparando aos parâmetros da fermentação controle

(sem ácido acético), conforme Tabela VIII. Estes resultados indicam que o

ácido acético presente no meio de cultura prejudica a formação de xilitol por

C. guilliermondii.

5.1.5 EFEITO DO ÁCIDO ACÉTICO NAS ENZIMAS XILOSE REDUTASE E XILITOL ÜESIDROGENASE

TABELA IX - Atividades específicas de xilose redutase durante cultivo de C. guilliermondii em meio sintético contendo ácido acético em diferentes concentrações.

[Ácido Acético] O g/L 5 g/L 6 g/L 8 g/L 1 O g/L

Tempo (h) Atividade de XR (Ul/mg) 12 O, 1675 0,3643 0,2813 0,3691 0,2692 24 O, 1735 0,4103 0,3048 0,2953 0.2301 36 0,2086 0,5219 0,5015 0,4453 0,4688 48 0,2113* 0,9473* 0,8113* 0,6854 0,4083 58 0, 1736 0,7292 0,7995 0,8586* 0,7195*

* atividade máxima encontrada para cada condição.

Analisando os valores de atividade específica para a enzima xilose

redutase durante a fermentação, apresentados na Tabela IX, observa-se que

os valores máximos de atividade diminuíram com o aumento da concentração

de ácido acético. Isto pode ser explicado pela diminuição da proporção

xilose:ácido acético, pois sendo a xilose o principal indutor da enzima, quando

ela está em menor proporção em relação ao total de fontes de carbono,

espera-se que a atividade também seja menor.

41

Observa-se também. na Tabela IX. o aumento da atividade de xilose

redutase durante a fermentação de C. guilliermondii e que os valores máximos

ocorreram em 48 horas quando a concentração foi igual a 5 e 6 g/L e em 58

horas para 8 e 1 O g/L. KERN et ai. (1997), em cultivo de C. tenuis em meio

sintético verificaram o aumento das atividades específicas de xilcse redutaso e

xilitol desidrogenase durante a fase de crescimento exponencial da levedura,

decrescendo devido ao esgotamento de xilose, o substrato responsável pela

indução destas enzimas. O mesmo comportamento para C. guillierrmondii foi

observado por ROSA et ai. (1998) em meio sintético.

TABELA X - Atívidades específicas de xllitol desidrogenase durante cultivo de C. guillíermondii em meio sintético contendo ácido acético em diferentes concentrações. [Ácido Acético] O g/L 5 g/L 6 g/L 8 g/L 10 g/L

Tempo (h) Atividade de XDH (Ul/mg) 12 0,1816 0,2892 0,3985 0,4024 0,2911 24 0,2371 0,4289 0,2765 0,2763 0,2637 36 0,2524 0,7177 0,4284 0,4783 0,4714

-- 48 0,3226* 1,2341* 0,8559* 0,7550* 0,5342 - ~_.,.,

58 0,2534 0,7576 0,5510 0,6645 0,5536* • atividade máxima encontrada para cada condição.

A partir dos valores de atividade específica da enzima xilitol

desidrogenase obtidos durante a fermentação e apresentados na Tabela X,

nota-se que com o aumento da concentração de ácido acético, os valores

máximos de atividade diminuíram, ocorrendo uma redução de até 55% entre as

atividades obtidas para 5 e 1 O g/L deste ácido. Além disto os valores máximos

ocorreram após 48 horas quando a concentração do ácido foi 5, 6 e 8 g/L e

após 58 horas com concentração igual a 1 O gil. Sugere-se que este efeito

possa estar relacionado com a menor proporção de xilose em relação ao total

de fontes de carbono, como foi explicado acima para a enzima xilose redutase.

KERN et ai. (1997), analisando diferentes açúcares, observaram que a xilose é substrato indutor das duas enzimas envolvidas no seu metabolismo. xilose

redutase e xilitol desidrogenase.

Assim como observado para xilose redutase (Tabela IX) as condições

com ácido acético apresentaram maiores atividades de xilitol desidrogenase do

42

que no meio controle, sugerindo que a presença do ácido acético no meio de

cultura pode aumentar o metabolismo de xilose. Este aumento pode estar

associado à regeneração dos ATPs gastos para o transporte de prótons do

meio intracelular para o meio extracelular, a fim de se restabelecer a

neutralidade do pH intraceluls., acidificado pelo ácido acético (Figura 3).

5.2 EFEITO DO ÁCIDO ACÉTICO NA FERMENTAÇÃO EM HIDROLISADO

5.2.1 CARACTERIZAÇÃO DO HIDROLISADO

O hidrolisado hemicelulósico obtido do processo de hidrólise ácida de

bagaço de cana de açúcar foi concentrado a vácuo até 3 vezes e depois

submetido ao tratamento descrito na metodologia. As características do

hidrolisado após cada etapa estão apresentadas na Tabela XI. A constituição

foi semelhante às apresentadas por ALVES et a/.(1998), RODRIGUES (1999),

MORITA et ai. (2000a), SENE (2000b) e SILVA (2001).

TABELA XI - Características dos hidrolisados hemicelulósicos de bagaço de cana de açúcar original, após a concentração e depois do tratamento. Características Original Concentrado Tratado*

........ ·- ·-·-··········--~--- -

Ácido Acético (g/L) 2,54 2,16 4,72 Xilose (g/L) 14,85 45,03 47,17

Glicose (g/L) 0,39 2,41 2,37 Arabinose (g/L) 1,50 4,41 4,78

Furfural (g/L) 0,050 0,038 Nd Hidroximetilfurfural (g/L) 0,004 0,010 Nd

Fenóis Totais (g/L) 1,023 3.032 1,089 pH 1,27 0,67 5,40

nd: não detectado por cromatografia liquida. * tratamento após concentração

A glicose presente em baixas concentrações favorece o processo

fermentativo, uma vez que esta é a fonte de carbono preferencial da levedura

no início do seu crescimento no meio de cultura (YAHASHI et ai., 1996).

Segundo KIM et ai. (1999), o consumo inicial de glicose pela levedura e

43

consequente aumento de massa celular favorece a utilização de xilose para a

produção de xilitol.

O monossacarídeo arabinose, também presente no hidrolisado, pode

aumentar a eficiência de conversão de xilose em xilitol, uma vez que este é

indutor das enzimas xilose redutase e xititol desidrogenase (LEE et ai., í SJG;

KERN et ai., 1997).

Verifica-se também na Tabela XI, além do ácido acético, a presença de

inibidores do metabolismo microbiano, como furfural, hidroximetilfurfural e

fenóis originados durante o processo de hidrólise da biomassa lignocelulósica

(PARAJÓ et ai., 1998c).

O ácido acético e o furfural, por serem compostos voláteis, tiveram suas

concentrações diminuídas após a etapa de concentração a vácuo. O

tratamento foi eficiente para a remoção de furfural e hidroximetilfurfural e

diminuição de compostos fenólicos. A concentração de fenóis foi menor do que

a considerada inibitória para o crescimento de Sacharomyces cerevisiae, ou

seja, menor que 2 g/L (PALMIQVIST et ai., 2000). Mesmo após o tratamento, a

concentração de ácido acético permaneceu acima da considerada como

inibitória (3,0 g/L) ao crescimento e produção de xilitol por C. guil/iermondii

(FELIPE et ai., 1995).

TABELA XII - Características dos meios de cultura preparados com hidrolisado contendo ácido acético em diferentes concentrações. ~~--''--~~~~~~~~~~-

Meios de Cultura Características

li Ili IV

Ácido Acético (g/L) 3,303 4,029 6,122 8,273 Xilose (g/L) 36,99 38,41 38,56 37,46

Glicose (g/L) 1,690 1,734 1,886 1,726 Arabinose (g/L) 4,601 4,689 4,367 4,684

Proporção xilose:ácido acético 11,20 9,533 6,299 4,528 pH 5,19 5,55 5,67 5,64

Para avaliar o efeito de diferentes concentrações de ácido acético na

bioconversão de xilose em xilitol, este foi adicionado ao hidrolisado, já

contendo 4,72 g/L de ácido. a fim de atingir as concentrações iguais a 6, 8 e

1 O g/L. Os meios preparados apresentaram como concentrações finais deste

ácido 3, 4, 6 e 8 g/L. valores abaixo do que o esperado. A Tabela XII apresenta

as características dos meios de cultura preparados.

5.2.2 EFEITO DO ÁCIDO ACÉTICO NO CONSUMO DE AÇÚCARES

Analisando os gráficos apresentados na Figura 8, observa-se que o

consumo de xilose foi semelhante nos quatro meios de cultura com diferentes

concentrações de ácido acético e que em 58 horas o consumo de xilose foi

igual a 95, 97, 96 e 95% para os meios com 3, 4, 6 e 8 g/L de ácido acético,

respectivamente.

·i 50

40 A 40 B .. - ... ::;- 30 - 30

·:,

3 !_ 2 I -..

20 20 ~ !: ~ ~

10 10

•· ··-. 12 ;, 36 46 50 12 24 36 46 60

50 7empo (h)

50 Tempo (h)

40 e 40 D ···1

::;- 30 -:. - 30

3 ~ s ·,._ i

20 1 20 .Q :! :8. ~ 10 10 ..

12 36 46 50 12 24 36 48 60 7e,npo (h) Tempo (h)

FIGURA 8 - Concentrações de xilose durante cultivo de C. guilliermondíi em meio formulado a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, com diferentes concentrações de ácido acético (A - 3 g/L; 8 - 4 g/L; C - 6 g/L; D - 8 g/L).

Fazendo a regressão linear dos gráficos da Figura 8 obtêm-se as

seguintes funções:

A: y = '-0,6386 x + 40,075 (R2 = 0,9778)

8: y = -0,6702 X+ 39,283 (R2 = 0,9944)

C: y = -0,6613 x + 39.291 (R2 = 0,9820)

D: y = -0,6311 x + 39,720 (R2 = 0,9873)

44

45

Analisando as equações, nota-se que os valores dos coeficientes

lineares se aproximam da concentração inicial de xilose, enquanto os

coeficientes angulares representam a taxa de consumo deste açúcar. Como

estes valores são semelhantes, pode-se inferir que a taxa de consumo de

xilose indccende ds concentração de ácido acético no meio de cultura. Esse

comportamento se deve ao fato da levedura poder se adaptar à presença de

ácido acético, inclusive utilizando-o para seu metabolismo. Porém os

coeficientes angulares foram menores do que os obtidos para meio sintético,

sugerindo que em hidrolisado o consumo de xilose ocorre mais lentamente,

possivelmente pela presença de outros compostos inibidores, além do ácido

acético.

TABELA XIII - Concentrações de arabinose durante cultivo de C. guilliermondii em meio formulado a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, contendo ácido acético em diferentes concentrações.

[Ácido Acético] 3 g/L 4 g/L 6 g/L 8 g/L

Tempo (h) [Arabinose] g/L o 4,601 4,689 4,367 4,684 12 3,904 4,795 4,828 4,612 24 3,645 3,497 3,308 3,495 36 3,120 3,486 3,370 3,765 48 2,819 2,488 2,492 2,847 58 2,375 2,165 2, 195 2,417

A partir dos dados apresentados na Tabela XIII, verifica-se que o

consumo de arabinose é iniciado após 12 horas de fermentação para as

condições de 4, 6 e 8 g/L de ácido acético, enquanto para o meio com 3 g/L o

consumo é simultâneo ao dos demais açúcares, como a xilose (Figura 8) e a

glicose (dados não apresentados). Observa-se o consumo de 52. 46, 50 e 52%

para os meios com 3, 4, 6 e 8 g/L de ácido acético, respectivamente,

demonstrando que, como já observado para meio sintético, a concentração de

ácido acético não interfere no consumo de arabinose.

Baixas taxas de assimilação de arabinose foram observadas durante

fermentações em hidrolisado de bagaço de cana (SENE, 2000b), como

também em hidrolisado de eucalipto (FERRARI et ai., 1992) e de palha de arroz

(ROBERTO et ai., 1995). Em meio sintético (Tabela Ili), o consumo, além de

46

ocorrer em menor proporção, só iniciou após 24 horas de fermentação,

demonstrando que em hidrolisado o metabolismo de C. guil/íermondii pode ser

desviado para contornar a toxicidade do ácido acético.

Como observado em meio sintético. a glicose foi totalmente consumida

nas prirceiras 12 horas ce cultivo nos meios de cultura ..... orn diferentes

concentrações de ácido acético. Isto ocorre porque, como já discutido

anteriormente para meio sintético, além de ser a fonte de carbono preferencial

da levedura, este açúcar está presente em baixas concentrações (-1,7 g/L).

Foi observado que ácido acético, xilose, arabinose e os outros demais

constituintes do hidrolisado não interferiram no consumo de glicose.

5.2.3 CONSUMO DE ÁCIDO ACÉTICO DURANTE A FERMENTAÇÃO

TABELA XIV -Ácido acético consumido durante cultivo de C. guilliermondii em meio formulado a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, contendo diferentes concentrações de ácido acético. [Ácido Acético] 3 g/L 4 g/L 6 g/L 8 g/L

Tempo (h) Ácido Acético Consumido (g/L) -.

12 0, 150 0,295 0,991 1, 149 e-. -

24 0,004 0,057 0,213 1,342 36 0,614 0,298 1,061 0,878 48 0,870 0,953 1,575 1,927 58 1,528 1,427 2,011 3,177

Analisando os dados da Tabela XIV, observa-se que em hidrolisado,

assim como em meio sintético, o ácido acético foi consumido em maiores

proporções quando a sua concentração foi aumentada, observando-se o

consumo de cerca de 40% após 58 horas. Foram observadas velocidades de

consumo iguais a 0,026; 0,025; 0,035 e 0,055 g/L.h para os meios com 3, 4, 6 e

8 g/L, respectivamente.

47

10

. -·-----~-· ---~-------... _

A 8 ::::, :§ o ô .\1 :;. o "' o u ºi3 ~

::::, :§ 8 6

~ "' o u

ºi3 j ~

:-'--~-~---,.-~-~-,-~---, 11------ ---__,,....... -----·-·----- ~---------

--..._

1 1 1 12 24 36 48 60 o

Tempo (h)

,e~

e J 1

ôi .. - j ,. o ê-; --------- o .J .. - ..... ___ ~ --""i __ o -·· "' o j u ºi3 ~ 21

! e 12 24 36 48 60

Tempo (h)

24 48 6( 36 12

Tempo (h)

10

D

36 48 6( 12 24

Tempo (h)

FIGURA 9 - Concentrações de ácido acético durante cultivo de C. guilliermondii em meio formulado a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, com diferentes concentrações de ácido acético (A - 3 g/L; B - 4 g/L; C - 6 g/L; D - 8 g/L).

Fazendo a regressão linear dos gráficos da Figura 9, não foram obtidos

coeficientes de correlação (R2) satisfatórios, demonstrando que em hidrolisado

a taxa de consumo de ácido acético varia durante a fermentação.

TABELA XV - Valores de pH durante cultivo de C. guilliermondii em meio formulado a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, contendo ácido acético em diferentes concentrações. [Ácido Acético] 3 g/L 4 g/L 6 g/L 8 g/L

Tempo (h) pH ·--------·--------------------------------- o 5,19 5,55 5,67 5,64

12 5,23 5,50 5,62 5,62 24 5,29 5,56 5,70 5,69 36 5,44 5,76 5,92 5,86 48 5,63 5,96 6,23 6, 11 58 5,71 6,07 6,33 6,31

48

Observa-se pela Tabela XV, que o pH aumenta durante a fermentação.

Como sugerido anteriormente, este fenômeno pode estar relacionado ao

consumo de ácido acético pela levedura C. guilliermondii. Nota-se que o

aumento do pH foi menor do que em meio sintético, isto porque menos ácido

acét.co foi consumido cm hidrolisado.

O consumo de ácido acético por C. guilliermondii cultivada em

hidrolisado hemicelulósico já havia sido observado por FELIPE et ai. (1997b) e

MORITA et ai., (2000b). Isto sugere que esta levedura pode ser utilizada para

detoxificação do hidrolisado otimizando-se as condições de pH e aeração.

5.2.4 FORMAÇÃO DE CÉLULAS NA PRESENÇA DE ÁCIDO ACÉTICO

TABELA XVI - Concentrações celulares de C. guilliermondii durante as fermentações em meio formulado a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, contendo ácido acético em diferentes concentrações. [Ácido Acético] 3 g/L 4 g/L 6 g/L 8 g/L

Tempo (h) o 2,88 12 5,50 24 6,08 36 6,50 48 7,08 58 11,5

número de células x 107/ml 2,42 6,50 6,67 6,83 9,08 13,3

2,04 1,98 7,42 7,17 8,25 7,33 8,33 7,42 8,42 7,50 10,3 11,3

Tempo O h: número de células presentes no meio de cultura após a inoculação

Analisando o crescimento celular (Tabela XVI), observa-se que o

aumento na concentração de ácido acético não prejudica a formação de

biomassa, diferente do encontrado utilizando meio sintético. Quanto à proporção de células inviáveis, apresentada na Tabela XVII, não é observada

influência da concentração de ácido acético na mortalidade das leveduras,

indicando que em hidrolisado, C. guilliermondii tem capacidade de se adaptar e

manter seu crescimento.

49

TABELA XVII - Proporções de células inviáveis durante cultivo de C. guilliermondii em meio formulado a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, contendo ácido acético em diferentes concentrações.

[Ácido Acético] 3 g/L 4 g/L 6 g/L 8 g/L

Tempo (h) Células inviáveis (%) ----· 12 1,52 8,97 14,6 0,00 24 1,37 3,75 0.00 3,41 36 2,56 3,66 2,00 2,25 48 1, 18 1,83 3.96 3,33 58 0,00 11,88 5.69 3,68

5.2.5 EFEITO DO ÁCIDO ACÉTICO NA FORMAÇÃO DE XILITOL

Pela Figura 9 observa-se que a formação de xilitol independe da

concentração de ácido acético no meio de cultura. Após 58 horas a

concentração de xilitol no meio foi de 24,64; 22,57; 24,42 e 20.91 g/L para os

meios com 3, 4, 6 e 8 g/L de ácido acético, respectivamente, valores próximos

aos encontrados para meio sintético (23,50; 20,77; 22,61 e 21,98 g/L).

::::, 15 :s ~ 10 R

25

20

25

20

• .l.

A

•

::] 15 :s ~ E, 10

5

B .......

•

- •

• 12 24

Tempo {h 36 60 12 48 60

25-1

20

....

24 Tempo(h)

e .. D ... ---·-·

_..., ::::, 15 :s

o 12 24 Tempc {h'·

36 48 60

Tempo (h)

FIGURA 1 O - Concentrações de xilitol durante cultivo de C. guilliermondii em meio formulado a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, com diferentes concentrações de ácido acético (A - 3 g/L; B - 4 g/L; C - 6 g/L; D - 8 g/L).

50

Fazendo a regressão linear dos gráficos da Figura 1 O. utilizando o

intervalo [12:48] obtêm-se as seguintes funções:

A: y = -0,4963 x - 3,871 (R2 = 0,9995)

8: y = -0,5065 x - 2,435 (R2 = 0,9885)

C: y = -0,496~ x - 2,867 (R2 = 0,9997)

D: y = -0,4934 x - 3,829 (R2 = 0,9949)

Analisando a variação dos coeficientes angulares das equações obtidas,

pode-se inferir que a formação de xilitol ocorre com a mesma velocidade e é

independente da concentração de ácido acético no meio de cultura

TABELA XVIII - Produtividade (Qp), rendimento (Ypts) e eficiência de conversão (ri) de xilitol após 58 horas de cultivo de C. guilliermondii em meio formulado a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, contendo diferentes concentrações de ácido acético.

3 g/L 4 g/L 6 g/L 8 g/L Qp (g/L.h) 0,42 0,39 0,42 0,36 Ypts (g/g) 0,70 0,60 0,66 0,59

ri (%) 77 66 72 64

Foi observado que a produtividade em xilitol foi similar entre as

condições estudadas, com diminuição no meio com 8 g/L de ácido acético. Os

parâmetros rendimento e eficiência de conversão foram infiuenciados pela

concentração de ácido acético. Desta forma quanto menor a proporção

xilose/ácido acético, menor o rendimento e a eficiência de conversão.

Comparando com os parâmetros em meio sintético a produtividade foi

semelhante, contudo o rendimento e a eficiência foram maiores em hidrolisado

hemicelulósico. Porém todos os parâmetros foram menores do que em

fermentações controle (na ausência de ácido acético), que apresentou

rendimento igual a 0,48 g/L.h, rendimento de 0,78 g/g e eficiência de 86%.

5.2.6 EFEITO DO ÁCIDO ACÉTICO NAS ENZIMAS XILOSE REDUTASE E XILITOL ÜESIDROGENASE

De acordo com os valores de atividade específica para a enzima xilose

redutase apresentados na Tabela XIX, nota-se que a concentração crescente

de ácido acético pouco influenciou nos valores máximos de atividades. A

atividade foi reduzida em 24% em hidrolisado em relação ao meio sintético.

51

TABELA XIX - Atividades específicas de xilose redutase durante cultivo de C. guilliermondii em meio formulado a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, contendo diferentes concentrações de ácido acético. [Ácido Acético] 3 g/L 4 g/L 6 g/L 8 g/L

Tempo (h) Atividade de XR. iüiímg)

12 0,6312 0,3101 0,4914 0,4312 24 0,3622 0,6395 0,6506 0,5850 36 0,7228* 0,3668 0,5921 0,5403 48 0,5309 0,7478* 0,6507* 0,7091* 58 0,4451 0,3081 0,5865 0,6440

• atividade máxima encontrada oara cada condição.

Observa-se também na Tabela XIX, que os valores máximos ocorreram

em 36 horas quando a concentração foi 3 g/L e em 48 horas com concentração

igual a 4, 6 e 8 g/L.

TABELA XX - Atividades específicas de xilitol desidrogenase durante cultivo de C. guilliermondii em meio formulado a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, contendo diferentes concentrações de ácido acético. [Ácido Acético] 3 g/L 4 g/L 6 g/L 8 g/L

Tempo (h) Atividade de XDH (Ul/mg)

12 0,6436 0,3026 0,4206 0,4000 24 0,4310 0,4839 0,5592 0,4888 36 0,8464* 0,5406 0,7436 0,5555 48 0,5865 0,7590* 0,7944 0,7513* 58 0,6634 0,6919 1,0911* 0,6316

• atividade máxima encontrada para cada condição.

A partir dos valores de atividades específicas da enzima xilitol

desidrogenase obtidos durante a fermentação e apresentados na Tabela XX.

nota-se que. assim como para a enzima xilose redutase, a variação de ácido

acético não influenciou nos valores máximos de atividade. No entanto a

atividade foi menor (31%) em hidrolisado em relação ao meio sintético.

Observa-se também o aumento das atividades de xilose redutase e xilitol

desidrogenase (Tabelas XIX e XX) semelhante ao já observado por SENE

(2000b), sendo neste caso os máximos valores de atividade obtidos após

52

36 horas de fermentação. KERN et ai. (1997) também observaram o mesmo

comportamento para C. tenuis em meio sintético.

5.3 EFEITO DO ACETATO DE SÓDIO NA ATIVIDADE DAS ENZIMAS XILOSE REDUTASE E XILITOL DESIDROGENASE

Para avaliar como o ácido acético influencia na atividade das enzimas

envolvidas na bioconversão de xilose em xilitol, ensaios in vitro foram

realizados variando-se a concentração de acetato no meio de reação. Acetato

de sódio foi utilizado no lugar de ácido acético, uma vez que no interior da

célula este ácido está quase que completamente na forma dissociada, devido

ao pH intracelular estar próximo a neutralidade.

o 2

[Acetato] g/L 3 4

0.30

•

•

• 0,15-+--~-~-~-~-~-~-~-~-~-~

FIGURA 11 - Atividade específica de xilose redutase em função da concentração de acetato de sódio no meio de reação.

Pela Figura 11 pode-se observar que a presença de acetato de sódio no

meio de reação aumenta a atividade de xilose redutase, tendo como

concentração ótima 0,5 g/L onde ocorreu um aumento de 58% da atividade

específica em relação à atividade sem acetato no meio. Em concentrações

acima de 1 . O g/L a atividade é maior do que na ausência de acetato, porém

tende a se manter constante. Estes resultados podem demonstrar que o ácido

acético presente no meio de cultura pode aumentar a atividade da enzima

53

xilose redutase, porém mais experimentos são necessários porque este

aumento pode estar relacionado ao aumento da força iônica no meio de

reação. Assim como para xilose redutase, a atividade de xilitol desidrogenase é

aumentada com a presença de acetato de sódi.. no meio de reação, cor. .o

observado na Figura 11. Para concentração de acetato de sódio igual a 1,0 g/L

verifica-se um aumento de 60% na atividade específica de xilitol

desidrogenase. Em concentrações acima de 2,0 g/L a atividade é maior do que

na ausência de acetato, porém tende a se manter constante.

0,40

• 0,35

ro o ~ o Q) .. a...-.. 0,30 (/) Cl

( w E -- Q) - "O :::> ro .__.. "O "> 0,25 ~

• 0,20

o 2 3 4

[Acetato] g/L

FIGURA 12 - Atividade específica de xilitol desidrogenase em função da concentração de acetato de sódio no meio de reação.

Estes resultados demonstram que o ácido acético presente no meio de

cultura pode aumentar tanto a atividade da enzima xilose redutase como de

xilitol desidrogenase, por este motivo não há aumento de produtividade, porque

mesmo que aumente a formação de xilitol, sua conversão em xi!ulose também

é aumentada.

Também foi observado que o ácido acético não inibi a atividade das

enzimas envolvidas no metabolismo de xilose, uma vez que em meio controle,

contendo ácido acético, mas sem xilose, foram observadas atividades iguais a

O, 1054 Ul/mg para xilose redutase e 0,0878 Ul/mg para xilitol desidrogenase.

54

6. CONCLUSÕES

Com base nos resultados obtidos é possível concluir que:

• O fato de que no meio com hicirnlisado, o consumo de é'."'ido

acético e as atividades das enzimas xilose redutase e xilitol

desidrogenase terem sido menores do que em meio sintético, pode

ser explicado pelo efeito inibitório do ácido acético ter sido

potencializado por outros compostos presentes no hidrolisado.

• O favorecimento das atividades específicas de xilose redutase e de

xilitol desidrogenase pelo ácido acético presente no meio de

cultura, pode ser comprovado pelo aumento destas in vitro

verificado na presença de acetato de sódio.

• O favorecimento das atividades de xilose redutase e de xilitol

desidrogenase pelo ácido acético poderia estar relacionado com o

fato de que a produtividade não foi aumentada, possivelmente

porque a maior formação de xilitol coincidiu com sua maior

conversão em xilulose.

• O ácido acético prejudicou a formação de células e de xilitol, tanto

em meio sintético como em hidrolisado, diminuindo o rendimento, a

produtividade e a eficiência de conversão de xilitol.

55

7. RECOMENDAÇÕES

Sugestões para trabalhos futuros:

• Estudar o metabolismo de ácido acético em Candida guilliermondii,

utilizando substrato marcado com carbono radioativo. Inclusive

medindo a atividade da enzima H+ -ATPase, para comprovar se

ocorre desvio de energia para o transporte extracelular de prótons

e a atividade de citrato liase para comprovar que o metabolismo

não ocorre via glioxilato.

• Utilizar técnicas de engenharia metabólica, como repressão por

RNA antisense, superexpressão, e disrupção de genes visando o

melhoramento genético de Candida guil/iermondii a fim de se obter

maior rendimento e produtividade de xilitol.

• Avaliar a regulação e expressão das enzimas intracelulares pelo

estudo dos promotores dos seus genes.

56

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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