efeito de dose sub-letal de microcistina-lr nos...
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Universidade Federal do Rio de Janeiro
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
Laboratório de Físico-Química Biológica Aída Hassón-Voloch
Efeito de Dose Sub-Letal de Microcistina-LR nos
Transportadores Renais de Sódio e na Estrutura do Tecido
Renal de Ratos Wistar
Aluna: Dayana de Souza Freire
Bolsista CNPq (PIBIC) desde 2010
Ciências Biológicas - Modalidade Médica / 9º Período
Orientadora: Jennifer Lowe
Projeto de Pesquisa - Efeito de microcistinas, conhecidas toxinas de cianobactérias, na
fisiologia renal: efeitos moleculares no transporte ativo de sódio.
IBCCF UFRJ
Considerações Iniciais
Comecei a estagiar no laboratório de Físico-Química Biológica Aída Hassón-Voloch
no segundo semestre do ano de 2008, enquanto cursava o segundo período de Ciências
Biológicas-Modalidade Médica na Universidade Federal do Rio de Janeiro. Desde então,
participo ativamente das atividades proporcionadas pelo mesmo, tais como journal de
dados e seminários, onde também apresento artigos relacionados ao que faço. Além
disso, participei das Jornadas apresentando painel na XXXI Jornada Giulio Massarani de
Iniciação Científica, Artística e Cultural da UFRJ, com o título “Efeito de Microcistina sobre
pressão arterial e transporte ativo de Sódio nos túbulos proximais renais de ratos Wistar”,
em 2009, na XXXII Jornada Giulio Massarani de Iniciação Científica, Artística e Cultural da
UFRJ, com título: “Única Dose Sub-letal de Microcistina altera o tecido renal de ratos
Wistar”, em 2010, na XXVI Reunião Anual da Federação de Sociedades de Biologia
Experimental (FeSBE), em agosto de 2011, na XXXIII Jornada Giulio Massarani de
Iniciação Científica, Artística e Cultural da UFRJ, com título: “Efeito de Dose Sub-Letal de
Microcistina-LR na Reabsorção de Sódio e Alteração Estrutural do Tecido Renal de Ratos
Wistar”, em outubro de 2011 e no III Encontro Anual do Instituto Nacional de Ciência e
Tecnologia de Biologia Estrutural e Bioimagem (INBEB), em novembro de 2011.
Recentemente, o artigo de título: “Single sublethal dose of microcystin-LR is
responsible for different alterations in biochemical, histological and physiological renal
parameters.”, cujo faço parte do grupo de autores, foi publicado na Revista Toxicon.
Introdução
A incidência e prevalência de doenças renais crônicas constituem um relevante
problema de saúde pública, tanto nos países desenvolvidos quanto nos países em
desenvolvimento (Costa-Leite et al., 2002; Steer & Nigam, 2004). No Brasil, mais de 5
milhões são portadores de insuficiência renal crônica (Costa-Leite et al., 2002),
calculando-se que 150.000 precisam de tratamento de reposição da função renal, embora
pouco mais de 70.000 tenham acesso a ela.
A Insuficiência Renal Aguda (IRA) afeta mais de 7% dos pacientes hospitalizados,
com taxas de mortalidade de até 70%, dependendo da população em estudo (Nash et
al., 2002). E apesar da disponibilidade de novas estratégias de tratamento – em geral
também agressivas – a taxa de mortalidade em conseqüência de IRA não diminuiu nos
últimos anos no mundo todo (Singri et al., 2003) e nada indica que a situação seja
diferente no Brasil, onde são precárias em muitos casos as condições hospitalares que
afetam pacientes críticos internados em unidades de terapia intensiva. É neste cenário
onde convergem fatores de natureza hemodinâmica, imunológica e tóxica que agravam,
por exemplo, os quadros de necrose tubular aguda (NTA).
Outra causa importante de acometimento renal que pode levar à insuficiência do
órgão são as glomerulopatias, como as glomerulonefrites e as glomerulopatias
secundárias. Dentre estas se destacam, pela severidade e pelo prognóstico sombrio, as
decorrentes do lupus eritematoso sistêmico e do diabetes mellitus, agravados por
quadros também altamente prevalentes na população brasileira como obesidade e a
hipertensão (Sawaya et al., 2003), incluindo com destaque os antecedentes de má-
nutrição durante o desenvolvimento embrionário que “programam” para o aparecimento
de nefropatias na idade adulta (Sichieri et al., 2000a; 2000b).
Em tempos recentes, houve o acréscimo de uma demanda adicional de urgente
tratamento em patologias pulmonares e renais: as decorrentes da intoxicação por toxinas
produzidas por cianobactérias, sendo a mais conhecida, a microcistina. A gravidade das
conseqüências das intoxicações agudas e crônicas por microcistinas em pacientes em
hemodiálise foi reconhecida pela Secretaria de Estado de Saúde do Rio de Janeiro,
através da Resolução SES nº 1736 de 19 de dezembro de 2001 (DO de 20/12/2001). A
contaminação dos recursos hídricos aparece, portanto hoje como mais um dos fatores
importantes para a deterioração da saúde humana, especialmente em regiões com
condições inadequadas de saneamento e suprimento de água, o que é observável tanto
em regiões brasileiras de alta concentração urbana como em áreas rurais, inclusive no
Estado do Rio de Janeiro.
Entretanto, até recentemente, a relação feita entre a degradação de nossos
mananciais e a saúde pública se restringia à verificação de maior incidência de doenças
de veiculação hídrica e a contaminação por substâncias tóxicas como metais pesados e
compostos orgânicos sintéticos, por exemplo, sem avaliar a sua deletéria influência em
portadores de lesões graves de origem pulmonar ou renal. No Brasil, as florações de
cianobactérias vêm aumentando em intensidade e freqüência e, atualmente, é possível
visualizar-se um cenário de dominância desses organismos em muitos ambientes lênticos
brasileiros. Dentre os gêneros mais freqüentemente observados nas florações de
cianobactérias no Brasil, destacam-se Microcystis e Cylindrospermopsis, descritos na
literatura como potencialmente produtores de hepatotoxinas (microcistinas ou
cilindrospermopsinas) ou neurotoxinas (saxitoxinas), sendo as microcistinas o grupo de
cianotoxinas mais estudado. Os efeitos agudos desta toxina no fígado já estão
devidamente descritos na literatura. No entanto, embora animais e seres humanos
estejam mais freqüentemente expostos a doses sub-letais e crônicas desta toxina,
podendo sofrer os efeitos danosos também em outros órgãos, como pulmão e rins, pouco
se sabe sobre o assunto, assim como sobre os processos e tempo necessário para a
detoxicação desta toxina. Por outro lado, os estudos pioneiros de Picanço et al., (2004) e
de Soares et al., (2007) já evidenciaram respostas inflamatórias pronunciadas no pulmão
de animais intoxicados por microcistinas, necessitando-se agora um avanço do
conhecimento sobre a via principal de estímulo à resposta inflamatória que gera a injúria
pulmonar. Tampouco, tem sido avaliada a possível influência de terapias celulares nas
intoxicações com microcistinas em pacientes submetidos à diálise ou portadores de
doenças pulmonares crônicas como a silicose.
Pela primeira vez, em 2001, três estudos mostraram que durante injúria renal
aguda ou crônica, células circulantes podem ser recrutadas do sangue periférico para
regeneração e reparo tissular (Poulsom et al., 2001; Grimm et al., 2001; Ito et al., 2001).
No mesmo ano, um estudo também mostrou que células derivadas da medula óssea
podiam ser progenitoras de epitélio alveolar (Kotton et al., 2003). Estas observações
constituíram a primeira prova de que as células sangüíneas participam de um “cross-talk”
com células renais e pulmonares residentes e, o mais importante, que entre aquelas se
encontra uma população de células tronco capazes de colonizar rins ou pulmões, gerando
células maduras de diferentes linhagens ou, como parece ser hoje o mais provável,
(Caplan & Dennis, 2006) favorecendo a regeneração ou promovendo a diferenciação
através de uma ação parácrina ainda não desvendada. Ou seja, todo o repertório celular
necessário para a reorganização estrutural e para a execução das diferentes funções dos
tecidos renal e pulmonar.
Objetivos
Compreender os mecanismos moleculares, principalmente na atividade ATPásica
em células epiteliais tubulares de rim de ratos Wistar submetidos à dose sub-letal de
microcistina-LR (50 µg/Kg).
Métodos
Uma dose sub-letal de microcistina-LR (MCYST-LR) 50µg/kg do peso corpóreo do
animal foi administrada, via intraperitoneal, em ratos Wistar machos adultos. Após 24
horas, os animais foram sacrificados e os rins retirados.
O rim esquerdo foi processado para histologia. Após ter sido retirado, o rim foi
cortado em duas metades e deixadas em solução de paraformaldeído tamponado por
cerca de um mês. A fim de emblocar em parafina, as amostras passaram por uma bateria
- álcool 70%, álcool 95%, álcool absoluto I, álcool absoluto II, xilol I, xilol II, parafina I
(58-62ºC) e parafina II (58-62ºC), onde permaneceram 40 minutos em cada -, visando à
desidratação. Em seguida, cortes a 7µm (para PS) e 4µm (para PAS e HE) foram obtidos
no micrótomo para posteriormente serem corados com Picrosirius (PS), PAS e
Hematoxilina-Eosina. Assim, as lâminas foram analisadas e fotografadas no microscópio
para uma análise estatística.
Já o rim direito teve o córtex dissecado, homogeneizado e centrifugado por 10
minutos a 2500 rpm a 4ºC para a retirada de debris celulares. A proteína foi dosada
segundo o método descrito por Lowry et al (1951). A atividade da Na+-ATPase e da
Na+/K+-ATPase foram medidas pelo método colorimétrico, utilizando o fato de que a
ATPase hidrolisa o ATP em ADP e Pi, descrito por Taussky e Shorr (1953). As proteínas
cinases A e C foram medidas através da quantificação de 32P incorporado à histona
(Cabral, 2007). A análise da expressão da Na+/K+-ATPase, da PKA e da PKC foram feitas
através de SDS-PAGE, gel 15%, 10% e 10%, respectivamente, seguido de western
blotting, utilizando anticorpos específicos para as referidas enzimas. Para a obtenção do
controle de carregamento foi utilizado anticorpo específico para beta-actina. A atividade
da Na+-ATPase com diferentes concentrações de Calfostina, inibidor de PKC, foi dosada
pelo método colorimétrico – o mesmo princípio do da Na+/K+-ATPase. Para a realização
desta curva foi utilizado homogenato de córtex renal de rato controle e tratado com
MCYST-LR em concentrações crescentes de calfostina: 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M e 10-6 M.
Resultados
Através da análise histológica e quantificação utilizando o programa Image Pro
Plus 4.0, foi possível observar um aumento, de aproximadamente, 116% do espaço
intersticial renal e 39% do colágeno renal nos ratos tratados com microcistina-LR, quando
comparados com animais controle. Utilizando a coloração de Hematoxilina-Eosina foi
observada um aumento na fibrose de rins no grupo experimental, indicando possíveis
danos renais.
Figura 1: Prancha histológica. A,C, E e G - Controle; B,D, F e H - Microcistina-LR. A,B.
Lâminas coradas com Hematoxilina-Eosina (HE), cortes a 4 um. C,D. Lâminas coradas
com PAS (Ácido Periódico-Schiff), cortes a 4 um; nota-se aumento do espaço intersticial
cortical renal conforme indicado pelas setas. E,F. Lâminas coradas com PS (Picrosirius),
cortes a 7 um; observa-se aumento do colágeno cortical renal identificado pela cor
avermelhada. G,H. Lâminas coradas com PS (Picrosirius), cortes a 7 um; observa-se
aumento do colágeno medular renal identificado pela cor avermelhada.
HE
PAS
PS
F
E F
C
D
A B
H G H
PS
Figura 2: A. MCYST-LR aumentou significativamente o percentual de espaço intersticial
na fração de membrana de córtex renal, enquanto que na medula não se observou
diferença significativa. Teste T Student não pareado foi utilizado para análise da diferença
estatística, p<0,05. B. MCYST-LR aumentou significativamente o percentual de colágeno
na fração de membrana tanto cortical como medular do rim. Teste T Student não
pareado foi utilizado para análise da diferença estatística, p<0,05.
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
Córtex Medula
Controle
Microcistina-LR
esp
aço
in
ters
ticia
l/áre
a t
ota
l (%
)
0
2
4
6
8
Córtex Medula
Controle
Microcistina-LR
co
lág
en
o/t
ecid
o t
ota
l (%
)
A
B
A análise molecular em diferentes preparações de membrana (n=2) demonstrou
que a atividade da enzima Na+-ATPase e da Na+/K+-ATPase sofreram uma redução no
grupo tratado com a toxina quando comparado com o controle, enquanto que a
expressão (com n=1) da enzima Na+/K+-ATPase não foi alterada pela microcistina-LR.
Controle Microcistina-LR0
20
40
60
80
n=12
Ati
vid
ad
e d
a N
a+A
TP
as
e
nm
ol
Pi
x m
g-1
x m
in-1
A
Controle Microcistina-LR0
50
100
150
200n = 15
Ati
vid
ad
e d
a N
a+/K
+A
TP
ase
nm
ol
Pi
x m
g-1
x m
in-1
B
Figura 3: A. MCYST-LR inibiu a atividade da Na+ ATPase em 2 preparações de fração de
membrana de córtex de rim de rato, com 12 experimentos. Teste T Student não pareado
foi utilizado para análise da diferença estatística, p<0,05; B. MCYST-LR inibiu a atividade
da Na+/K+ ATPase em 2 preparações de fração de membrana de córtex de rim de rato,
com 15 experimentos. Teste T Student não pareado foi utilizado para análise da diferença
estatística, p<0,05; C. A MCYST-LR não alterou a expressão da Na+/K+ ATPase em 1
preparação de fração de membrana de córtex de rim de rato. SDS-PAGE 15%.
Western Blotting - Na+/K+ ATPase
1° - 1:1500
2° - 1:7500
Controle Microcistina-LR
Western Blotting - beta-actina
1° - 1:5000
2° - 1:20000
Controle Microcistina-LR
C
Controle Microcistina-LR
50ug 100ug 50ug 100ug
Quando analisamos a atividade específica da proteína cinase A (PKA), com n=1 no
grupo tratado com microcistina-LR há uma redução na sua atividade cinásica, porém não
é estatisticamente significativa. Já a sua expressão (com n=1) não foi alterada pela
toxina.
Figura 4: A. MCYST-LR não teve efeito significativo sobre a atividade da proteína cinase
A (PKA) em uma preparação de fração de membrana de córtex de rim de rato, com 3
experimentos. Teste T Student pareado foi utilizado para análise da diferença estatística,
p<0,05. B. MCYST-LR não alterou a expressão da PKA na fração de membrana de córtex
de rim de rato. SDS-PAGE 10%.
Western Blotting - beta-Actina
1° - 1:5000
2° - 1:20000 Controle Microcistina-LR0
1
2
3
4
5
n = 3
Ati
vid
ad
e d
a P
KA
pm
ol
de P
i X
mg
-1 X
min
-1
A
Western Blotting - PKA-alfa
1° - 1:1500
2° - 1:7500
Controle Microcistina-LR
50ug 100ug 50ug 100ug
B
Quando analisamos a atividade específica das proteínas cinase C (PKC), com n=2
no grupo tratado com microcistina não foi observado diferença alguma. O mesmo efeito
pôde ser observado na expressão da PKC-alfa (com n=2).
Figura 5: A. MCYST-LR não teve efeito significativo sobre a atividade da proteína cinase
C (PKC) em 2 preparações de fração de membrana de córtex de rim de rato, com 17
experimentos. Teste T Student pareado foi utilizado para análise da diferença estatística,
p<0,05. B. MCYST-LR não alterou a expressão da PKC na fração de membrana de córtex
de rim de rato. SDS-PAGE 10%.
Controle Microcistina-LR0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
n = 17
Ati
vid
ad
e d
a P
KC
pm
ol
de P
i X
mg
-1 X
min
-1
Western Blotting - PKC-alfa
1° - 1:1000
2° - 1:5000
Controle Controle
Microcistina-LR Microcistina-LR
Western Blotting - beta-Actina
1° - 1:5000
2° - 1:20000
Controle Controle
Microcistina-LR
Microcistina-LR
B
A
Ao analisar a atividade Na+-ATPásica foi possível observar que a calfostina
estimulou a atividade desta enzima apenas na concentração a 10-6 M, entretanto, a
atividade desta enzima, não foi alterada pelas diferentes concentrações de calfostina no
grupo tratado com microcistina-LR.
Figura 6: Curva de atividade da Na+-ATPase com diferentes concentrações de Calfostina.
A. A atividade da Na+-ATPase foi estimulada na concentração de 10-6 M. Para a realização
desta curva foi utilizado homogenato de córtex renal de rato controle (n=1), com 6
experimentos, e concentrações crescentes de calfostina: 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M e 10-6 M.
Teste T Student pareado foi utilizado para análise da diferença estatística, p<0,05. B.
Para a realização desta curva foi utilizado homogenato de córtex renal de rato tratado
com MCYST-LR (n=1), com 5 experimentos, e concentrações crescentes de calfostina:
10-9 M, 10-8 M, 10-7 M e 10-6 M. Teste T Student pareado foi utilizado para análise da
diferença estatística, p<0,05.
Contr
ole M-9
Cal
fost
ina
10M-8
Cal
fost
ina
10M-7
Cal
fost
ina
10M-6
Cal
fost
ina
10
0
5
10
15
20
25
n=6
Ati
vid
ad
e d
a N
a+ A
TP
ase
nm
ol
de P
i x m
g-1
x m
in-1
MCYST-L
R M-9
Cal
fost
ina
10M-8
Cal
fost
ina
10M-7
Cal
fost
ina
10M-6
Cal
fost
ina
10
0
10
20
30
Ati
vid
ad
e d
a N
a+ A
TP
ase
nm
ol
de P
i x m
g-1
x m
in-1A B
Conclusão
Apenas uma dose sub-letal de microcistina já é responsável por alterações
morfológicas e bioquímicas no tecido renal. Outros estudos vêm sendo realizados para
compreender quais os mecanismos moleculares que são alterados pela microcistina. Os
resultados aqui apresentados, nos levam a investigar o comportamento de enzimas
importantes para a função renal e principalmente sua regulação por proteínas cinases.
Considerações Finais e Avaliação do Bolsista
Desde meu primeiro ano como aluna de Iniciação Científica no Laboratório de
Físico-Química Biológica Aída Hassón-Voloch, em 2008, pude aprender diversas técnicas
como Eletroforese, Western Blot e método de Tail Cuff (utilizado para aferir pressão
arterial caudal no rato). Ainda, aprendi como processar amostras para histologia e
posterior utilização dos corantes como Hematoxilina-eosina e Picrosirius para observação
no Microscópio Óptico. Para dosagem de atividades de enzimas foram utilizados os
métodos Colorimétrico e Radioativo. Além disso, a convivência diária no laboratório me
permitiu desenvolver o pensamento crítico na análise dos resultados, através da
discussão com minha orientadora e colegas de trabalho. Dessa forma, julgo de extrema
importância para a minha carreira profissional estes 4 anos no Laboratório de Físico-
Química Biológica.
Perspectivas Futuras
Analisar a ação da microcistina-LR nas atividades da Na+-ATPase, Na+/K+-ATPase,
PKA e PKC em cultura de células, com a linhagem LLC-PK1.
Referências Bibliográficas
Cabral, L. M. P.; Wengert, M.; da Ressurreição, A. A . A.; Feres-Elias, P. H.; Almeida, F.
G.; Vieyra, A .; Caruso Neves, C.; Einicker-Lamas, M. (2007) J. Biol. Chem. 282:
24599-24606.
Caplan, A. I.; Dennis, J. E. (2006) J. Cell. Biochem 98: 1076-1084.
Costa-Leite, I.; Schramm, J. M. A; Gadelha, A.M.J; Valente, J.G. et al. (2002) Ciência e
Saúde 7: 733-741.
Grimm, C. P.; Nickerson, P.; Jeffery, J. et al. (2001) N. Engl. J. Med. 345: 93-97.
Ito, T.; Suzuki, A.; Imai, E.; Okabi, M.; Hori, M. (2001) J. Am. Soc. Nephrol. 12: 2625-
2635.
Kotton, DN; Fine, A. (2003) Cytotherapy 5(2):169-73.
Lowe, J.; Souza-Menezes, J.; Freire, D.S.; Mattos, L.J.; Castiglione, R.C.; Barbosa, C.M.L.;
Santiago, L.; Ferrão, F.M.; Cardoso, L.H.D.; da Silva, R.T.; Vieira-Beiral, H.J.; Vieyra,
A.; Morales, M.M.; Azevedo, S.M.F.O.; Soares, R.M. (2012) Toxicon 59(6):601-9.
Lowry, O. H.; Rosebrough, N. J.; Farr, A. L.; and Randall, R. J. (1951) J. Biol. Chem. 193,
265–275.
Nash, K; Hafeez, A; Hou, S. (2002) Am. J. Kidney Dis. 39: - 930-936.
Picanço, MR; Soares, RM; Cagido, VR; Azevedo, SM; Rocco, PR; Zin, WA; (2004) Braz J
Med Biol Res 37(8):1225-9
Poulsom, R; Forbes, SJ; Hodivala-Dilke, K; Ryan, E; Wyles, S; Navaratnarasah, S; Jeffery,
R; Hunt, T; Alison, M; Cook, T; Pusey, C; Wright, NA (2001) J Pathol 195(2):229-
35
Sawaya, AL; Roberts, S ( 2003) Cad Saude Publica 19 Suppl 1:S21-8
Sichieri, R.; Siqueira, K.S.; Moura, A.S.; (2000a) Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 24:
614-618.
Sichieri, R.; Siqueira, K.S.; Pereira, R.A.; Ascherio, A. (2000b) Public Health Nutr. 3: 77-
82.
Singri, N; Ahya, SN; Levin, ML (2003) Acute renal failure, JAMA. 289(6):747-51
Soares, R.M.; Cagido, V.R.; Ferraro, R.B.; Meyer, J.R.F.; Rocco, P.R.M.; Zin, W.A.;
Azevedo, S.M.F.O. (2007) Toxicon 50: 330-338.
Steer, D. L, Nigam, S. K. (2004). Am. J. Physiol. Renal Physiol. 286: F1-F7.
Taussky, HH; Shorr, E. J Biol Chem. (1953) Jun202(2):675-85.
