efeito da administração parenteral de glutamina sobre a ......inflamatória sistêmica...

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RICARDO ALEXANDRE GARIB Efeito da administração parenteral de glutamina sobre a modulação da resposta inflamatória sistêmica, morbidade e mortalidade de ratos submetidos à pancreatite aguda Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências Programa de Ciências em Gastroenterologia Orientador: Prof. Dr. Dan Linetzky Waitzberg SÃO PAULO 2015

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RICARDO ALEXANDRE GARIB

Efeito da administração parenteral de glutamina sobre a modulação da resposta inflamatória sistêmica, morbidade e mortalidade de ratos submetidos à

pancreatite aguda

Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências Programa de Ciências em Gastroenterologia Orientador: Prof. Dr. Dan Linetzky Waitzberg

SÃO PAULO

2015

Page 2: Efeito da administração parenteral de glutamina sobre a ......inflamatória sistêmica 6.Pancreatite necrosante aguda 7.Ratos 8.Mortalidade USP/FM/DBD-356/15 Trabalho realizado no

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Preparada pela Biblioteca da

Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

reprodução autorizada pelo autor

Garib, Ricardo Alexandre

Efeito da administração parenteral de glutamina sobre a modulação da resposta

inflamatória sistêmica, morbidade e mortalidade de ratos submetidos à pancreatite

aguda / Ricardo Alexandre Garib. -- São Paulo, 2015.

Dissertação(mestrado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.

Programa de Ciências em Gastroenterologia.

Orientador: Dan Linetzky Waitzberg.

Descritores: 1.Glutamina/administração e dosagem 2.Soluções de nutrição

parenteral 3.Citocinas 4.Proteínas de choque térmico 5.Síndrome de resposta

inflamatória sistêmica 6.Pancreatite necrosante aguda 7.Ratos 8.Mortalidade

USP/FM/DBD-356/15

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Trabalho realizado no Laboratório de Nutrição e Cirurgia Metabólica do

Aparelho Digestivo – Laboratório de Investigação Médica – LIM 35, da

Disciplina de Cirurgia do Aparelho Digestivo, do Departamento de

Gastroenterologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo em

parceria com o LIM 37 – Laboratório de Investigação Médica da Disciplina de

Transplante e Cirurgia do Fígado, Laboratório de Emergências Clínicas LIM 51

e o Departamento de Anatomia Patológica da Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo.

Auxílio Pesquisa: Fapesp nº 2011/02071-7

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Ao Raul Garib Junior e à Cirene Rodrigues Garib, meus

pais, que me ensinaram pelo exemplo de esforço e trabalho a vencer as

dificuldades e sempre me deram a base ética que balizaram minha conquistas.

A minha esposa Lia e a meus filhos Maria e Francisco,

meus eternos amores sem os quais a vida não faria o menor sentido, pela

enorme paciência e pelo estímulo para seguir em frente nesta árdua missão

que é a Medicina

A meu irmão Henrique, amigo incondicional que sempre

me incentivou.

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AGRADECIMENTO ESPECIAL

Ao meu orientador e amigo Prof. Dr. Dan Linetzky Waitzberg, por

compartilhar seu conhecimento, me estimular e incentivar a atuar em pesquisa,

pelos ensinamentos que levarei para toda a vida. Agradeço pela grande

oportunidade de fazer parte de sua equipe e tê-lo como orientador.

Ao meu amigo Dr. Pedro Luiz Bertevello, por me incentivar sempre, e pela

valiosa contribuição em minha formação profissional.

A minha amiga e colega de laboratório Nutricionista Priscila Casarim

Garla, por compartilhar comigo os bons e maus momentos durante a realização

deste trabalho, pelos ensinamentos, e pela irrestrita cooperação e pelo apoio

nos momentos mais difíceis.

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AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Marcel Cerqueira Cesar Machado, Professor Emérito do

Departamento de Gastroenterologia da Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo FMUSP, pelas importantes orientações para o

desenvolvimento desta pesquisa.

Ao Prof. Dr. Ivan Ceconello, Professor Titular da Disciplina de Cirurgia do

Aparelho Digestivo, pela oportunidade de me matricular no curso de Pós-

Graduação e por garantir as condições para elaboração desta pesquisa.

Ao Prof. Dr. Luiz Augusto Carneiro D’Albuquerque, Professor Titular da

Disciplina de Transplantes de Órgãos do Aparelho Digestivo da FMUSP, e

Professor Responsável pelo LIM 37 - Laboratório de Investigação Médica -

Transplante de Fígado FMUSP, pelo apoio e por garantir as condições para

elaboração e desenvolvimento desta pesquisa.

Ao Prof. Dr. Eleazar Chaib Professor Associado do Departamento de

Gastroenterologia da FMUSP e Diretor do Laboratório de Transplante e

Cirurgia do Fígado (LIM-37) da Faculdade de Medicina da Universidade de São

Paulo, pelo apoio e por garantir as condições para elaboração e

desenvolvimento desta pesquisa.

À bióloga chefe do Grupo METANUTRI, Dra. Raquel Suzana Torrinhas,

pela enorme contribuição durante todo este projeto, e pelo modo amigo e

generoso com o qual se empenhou para me ajudar.

À Prof. Dra. Ângela Logullo Waitzberg, pelo apoio e pelas sugestões

durante a elaboração deste trabalho.

Aos Professores Dr. José Jukemura, Dr. Fabio Campos e Dr. Francisco

Garcia Soriano, componentes de minha banca de qualificação e que muito

contribuíram na finalização deste trabalho.

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Aos pesquisadores do Grupo METANUTRI – Graziela, Letícia, Mika,

Priscila Sala, Natalia, Rita, Dani, Lívia, Alweid, Felipe, Natasha, Karina, Camila

Samira, Cris Verotti, Christiane, Giliane e Mariane, agradeço pela amizade,

pelas sugestões, pela convivência diária, pela troca de experiências e pelo

conhecimento científico.

Às estagiárias Thaís Garcia e Raquel Santana, obrigado pela ajuda no

início deste trabalho

Às funcionárias do Laboratório Metanutri, Elaine Muniz, Patrícia Macedo

e, em especial, ao Francisco, por todo respeito a mim dedicado e pela

colaboração dada para o andamento deste trabalho.

Ao técnico de laboratório José Edson Pereira da Costa, sempre presente

nos momentos difíceis, meu sincero agradecimento pelos ensinamentos e pela

ajuda prestada.

Às funcionárias do Laboratório LIM 37, Ana Maria Coelho, Nilza Molan e

Sandra Sampietre, por me iniciarem na técnica experimental e pelas análises

realizadas. Aos auxiliares do LIM 37, Dona Maria Aparecida e Genivaldo da

Silva “Zú”, por estarem sempre dispostos a ajudar.

À Dra. Rosely Antunes Patzina e ao Técnico de Laboratório Célio Nasário

da Divisão de Anatomia Patológica do Hospital das Clínicas da FMUSP, pelo

valioso auxílio dado para a realização das análises histológicas.

Ao Prof. Dr. Heraldo Possolo de Souza, pela colaboração no

planejamento e na execução desta pesquisa

À pesquisadora Dra Ana Iochabel Soares Moretti, pela colaboração na

metodologia e na análise de HSP.

Ao estatístico João Ítalo Dias França, por sua dedicação na análise

estatística, a qual foi fundamental para este trabalho.

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Ao Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência

de Animais de Laboratório – CEMIB de Campinas, pelo fornecimento de ratos

isogênicos, indispensáveis para o desenvolvimento deste projeto de estudo.

Aos motoristas e funcionários do Departamento de Transporte da

FMUSP, que sempre estiveram disponíveis para executar com

responsabilidade o transporte de ratos do CEMIB – Unicamp.

Às funcionárias da Secretaria de Pós-Graduação, em especial, à Vilma de

Jesus Libério, por toda atenção e pela paciência no atendimento prestado aos

alunos pós-graduandos.

À Fresenius-Kabi do Brasil, pelo fornecimento das soluções parenterais

que possibilitaram a realização deste trabalho.

À empresa Baxter, por, gentilmente, ceder em comodato bombas de

infusão peristáltica e equipos de infusão para a execução dos experimentos

desta pesquisa.

À empresa Farmoterápica, em especial, à farmacêutica Dra. Carmem

Maldonado, pelo fornecimento de bolsas parenterais manipuladas para rato.

À Diretoria dos LIMs – Direxlim da FMUSP, em especial, à Chefe de

seção Joana Maziero Bernardo, pela importante ajuda com o suprimento de

materiais

À Fundação de Amparo a Pesquisa – FAPESP, pela concessão de

auxílio para o desenvolvimento desta pesquisa.

Aos residentes de Cirurgia do Aparelho Digestivo do Hospital

Beneficência Portuguesa de São Paulo.

À minha avó Yolanda e a meus tios Norberto, Roberto, José Sergio,

Raulita, Milton e Terezinha, por me ajudarem durante toda a formação médica.

E, por fim, a todos que contribuíram de alguma forma para a realização e

conclusão deste Mestrado.

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NORMALIZAÇÃO ADOTADA

Esta dissertação está de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento desta publicação: Referências: adaptado de International Committee of Medical Journals Editors (Vancouver). Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Divisão de Biblioteca e Documentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias. Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria F. Crestana, Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso, Valéria Vilhena. 3a ed. São Paulo: Divisão de Biblioteca e Documentação; 2011. Abreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals Indexed in Index Medicus.

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SUMÁRIO

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

LISTA DE SÍMBOLOS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

RESUMO

ABSTRACT

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................ 3

1.1 Imuno-fármaco-nutrientes: nutrientes com atividade no estado inflamatório e imune ........................................................................................ 3

1.1.1 Glutamina .................................................................................................. 4

1.2 Pancreatite aguda ...................................................................................... 6

1.3 Influências da glutamina na pancreatite aguda ....................................... 8

2 RACIONAL E JUSTIFICATIVA DO ESTUDO .............................................. 13

3 OBJETIVOS .................................................................................................. 17

3.1 Objetivo geral ........................................................................................... 17

3.2 Objetivos específicos............................................................................... 17

4 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................ 21

4.1 Local de execução ................................................................................... 21

4.2 Aspectos éticos ........................................................................................ 21

4.3 Delineamento experimental ..................................................................... 22

4.4 Procedimentos gerais .............................................................................. 25

4.4.1 Animais de experimentação .................................................................... 25

4.4.2 Período de adaptação ............................................................................. 25

4.4.3 Cateterização do Sistema Venoso Central (CVC) ................................... 25

4.4.4 Infusão parenteral ................................................................................... 27

4.4.5 Pancreatite aguda experimental .............................................................. 29

4.5 Procedimentos específicos fase 1 .......................................................... 32

4.5.1 TNF-α no líquido ascítico ........................................................................ 32

4.5.2 Análises histológicas ............................................................................... 32

4.5.3 Proteínas de choque térmico (HSP) 70 e 90 ........................................... 33

4.5.4 Amilase sanguínea .................................................................................. 34

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4.5.5 Citocinas séricas ..................................................................................... 34

4.6 Procedimentos específicos da Fase 2 .................................................... 34

4.7 Análise estatística .................................................................................... 35

5 RESULTADOS .............................................................................................. 39

5.1 Fase 1 – Estudo do impacto da infusão parenteral prévia de glutamina 2 ,12 e 24 horas após indução de PA .......................................... 39

5.1.1 Tempo de 2 horas ................................................................................... 39

5.1.1.1 HSP 90 hepática após 2 horas de indução de PA ................................ 39

5.1.1.2 HSP 90 pulmonar após 2 horas de indução de PA .............................. 39

5.1.1.3 HSP 70 hepática após 2 horas de indução de PA ................................ 40

5.1.1.4 HSP 70 pulmonar após 2 horas de indução de PA .............................. 41

5.1.1.5 TNF- α no líquido ascítico após 2 horas de indução de PA .................. 41

5.1.1.6 Citocinas séricas após 2 horas de indução de PA ............................... 41

5.1.1.7 Amilase sérica após 2 horas de indução de PA ................................... 42

5.1.1.8 Histologia do pâncreas após 2 horas de indução de PA ...................... 43

5.1.2 Tempo de 12 horas ................................................................................. 45

5.1.2.1 HSP 90 no fígado após 12 horas de indução de PA ............................ 45

5.1.2.2 HSP 90 no pulmão após 12 horas de indução de PA .......................... 46

5.1.2.3 HSP 70 no fígado após 12 horas de indução de PA ............................ 47

5.1.2.4 HSP 70 no pulmão após 12 horas de indução de PA .......................... 47

5.1.2.5 Citocinas séricas após 12 horas de indução de PA ............................. 48

5.1.2.6 Histologia do pâncreas após 12 horas de indução de PA .................... 50

5.1.3 Tempo de 24 horas ................................................................................. 51

5.1.3.1 Citocinas séricas após 24 horas de indução de PA ............................. 51

5.1.3.2 HSP 70 no pulmão após 24 horas de indução de PA .......................... 53

5.1.3.3 HSP 90 no fígado após 24 horas de indução de PA ........................... 54

5.2 Analise cinética de citocinas ................................................................... 54

5.2.1 Comparação da cinética de citocinas nos diferentes tempos ................. 55

5.2.1.1 Grupo Salina ........................................................................................ 55

5.2.1.2 Grupo SHAM ........................................................................................ 56

5.2.1.3 Grupo Glutamina .................................................................................. 58

5.3 Fase 2 – Estudo da mortalidade de 7 dias de animais que receberam infusão de glutamina ou solução salina e animais que não receberam infusão parenteral prévia à indução de PA ............................... 62

5.3.1 Mortalidade .............................................................................................. 62

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5.3.2 Análise da sobrevida ............................................................................... 63

5.4 Perda de peso ........................................................................................... 64

6 DISCUSSÃO ................................................................................................. 69

6.1 Do método ................................................................................................. 69

6.1.1 Dos animais ............................................................................................. 69

6.1.2 Do delineamento experimental ................................................................ 69

6.1.3 Da Infusão parenteral .............................................................................. 70

6.1.3.1 Glutamina parenteral ............................................................................ 70

6.1.3.2 Solução salina parenteral ..................................................................... 74

6.2 Do modelo de pancreatite experimental ................................................. 75

6.3 Das variáveis clínicas e laboratoriais ..................................................... 77

6.3.1 Peso ........................................................................................................ 77

6.3.2 Amilase .................................................................................................... 77

6.4 Das variáveis inflamatórias ..................................................................... 78

6.5 Das variáveis histológicas ....................................................................... 81

6.6 Da mortalidade e sobrevida ..................................................................... 82

7 CONCLUSÕES ............................................................................................. 87

8 ANEXOS ....................................................................................................... 91

8.1 ANEXO A - Descritivos da variável peso antes e após a infusão parenteral das soluções propostas .............................................................. 91

9 REFERÊNCIAS ............................................................................................. 95

10 APÊNDICES

APÊNDICE A - Apresentação nacional e internacional do estudo

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LISTA DE SIGLAS ABREVIATURAS

AIN 93 American Institute of Nutrition – 1993

ANOVA Análise de Variância

CAPPesq Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa

CAPPesq Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa

CEMIB Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica

COBEA Colégio Brasileiro de Experimentação Animal

CVC Cateterização do Sistema Venoso Central

ELISA Método de Imunoensaio

ESPEN European Society for Clinical Nutrition and Metabolism

et al. e outros colaboradores

FAPESP Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo

FMUSP Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

GLN Glutamina

GSH-PX Glutationa Peroxidase

HSP Proteína de Choque Térmico

IQCODE Questionário do Informante sobre o Declínio Cognitivo

LIM Laboratório de Investigação Médica

max Máximo

METANUTRI Metabologia e Nutrição em Cirurgia

min Mínimo

ns Não significativo

PA Pancreatite Aguda

PPO Pancreatite Pós-Operatória

SF Solução Salina

SIRS Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica

TNF Fator de Necrose Tumoral

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TNF-α Fator de Necrose Tumoral – α

UNICAMP Universidade Estadual de Campinas

USP Universidade de São Paulo

UTI Unidade de Terapia Intensiva

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LISTA DE SÍMBOLOS

% Porcentagem

< Menor que

> Maior que

≤ Menor ou igual a

cm Centímetro

CO2 Gás Carbônico

dp Desvio Padrão

g Gramas

H2O2 Peróxido de Hidrogênio

Kcal Quilocalorias

Kg Quilogramas

m Média

M Molar

med Mediana

mg miligramas

mL mililitros

mm milímetros

nm nanômetros

ºC graus Celsius

pH Potencial Hidrogeniônico

rpm Rotações por Minuto

v Volume

α Alfa

β Beta

μg Microlitro

μm Micrômetros

ω Ômega

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Composição da solução parenteral de glutamina ................... 29

Tabela 2 Concentração sérica (pg/mL) de citocinas 2 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções ............................ 42

Tabela 3 Variáveis analisadas na histolologia de 2 horas ..................... 44

Tabela 4 Concentração sérica (pg/mL) de citocinas 12 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis ........................ 49

Tabela 5 Variáveis analisadas na histolologia de 12 horas ................... 50

Tabela 6 Concentração sérica (pg/mL) de citocinas 24 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis ........................ 52

Tabela 7 Concentração sérica (pg/mL) de citocinas nos tempos analisados após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis que receberam infusão parenteral de solução salina .... 55

Tabela 8 Comparação cinética da variável IL 10 no grupo Salina ......... 56

Tabela 9 Comparação cinética da variável IFn y no grupo Salina ......... 56

Tabela 10 Concentração sérica (pg/mL) de citocinas nos tempos analisados após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis que não receberam infusão parenteral ......................... 57

Tabela 11 Comparação cinética da variável IL-2 no grupo Sham ........... 57

Tabela 12 Comparação cinética da variável IL-10 no grupo Sham.......... 58

Tabela 13 Comparação cinética da variável IFn y no grupo Sham .......... 58

Tabela 14 Concentração sérica (pg/mL) de citocinas nos tempos analisados após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis que não receberam infusão parenteral de Glutamina ................................................................................ 59

Tabela 15 Comparação cinética da variável IL-10 no grupo Glutamina ................................................................................ 59

Tabela 16 Comparação cinética da variável IFn y no grupo Glutamina ................................................................................ 60

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Tabela 17 Contingência entre as variáveis qualitativas com o grupos..... 63

Tabela 18 Numero de eventos de morte nos diferentes grupos ate o 7º dia ....................................................................................... 63

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Fases da cateterização do sistema venoso central ................ 27

Figura 2 Bomba para infusão parenteral e animal com dispositivo de infusão na região dorsal após cateterização venosa ......... 29

Figura 3 Aspecto do arco duodenal e do pâncreas antes da indução da pancreatite. ........................................................... 31

Figura 4 Aspecto do arco duodenal e do pâncreas após a indução da pancreatite. ........................................................................ 31

Figura 5 Expressão (unidades arbitrárias - U.A) de HSP 90 no pulmão 2 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções. ................................................................................. 40

Figura 6 Expressão (unidades arbitrárias - U.A) de HSP 70 no fígado 2 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções. ................................................................................. 40

Figura 7 Expressão (unidades arbitrárias – U.A.) de HSP 70 no pulmão 2 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções. ................................................................................. 41

Figura 8 Concentrações de amilase sérica (U/dL) 2 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções. ........................... 43

Figura 9 Histologia do pâncreas representada pelo escore total 2 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções. ................................................................................. 45

Figura 10 Expressão (unidades arbitrárias - U.A.) de HSP 90 no fígado 12 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções. ................................................................................. 46

Figura 11 Expressão (unidades arbitrárias - U.A.) de HSP 90 no pulmão 12 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções. ................................................................................. 46

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Figura 12 Expressão (unidades arbitrárias - U.A.) de HSP 70 no fígado 12 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções. ................................................................................. 47

Figura 13 Expressão (unidades arbitrárias - U.A) de HSP 70 no pulmão 12 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções. ................................................................................. 48

Figura 14 Histologia do pâncreas representada pelo escore total 12 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções. ................................................................................. 51

Figura 15 Expressão (unidades arbitrárias - U.A) de HSP 70 no pulmão 24 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções. ................................................................................. 53

Figura 16 Expressão (unidades arbitrárias - U.A.) de HSP 90 no fígado 24 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções. ................................................................................. 54

Figura 17 Concentração sérica (pg/mL) de IL-2 nos grupos estudados em diferentes tempos após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis .......................................... 60

Figura 18 Concentração sérica (pg/mL) de IL-10 nos grupos estudados em diferentes tempos após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis .......................................... 61

Figura 19 Concentração sérica (pg/mL) de IFNy nos grupos estudados em diferentes tempos após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis .......................................... 61

Figura 20 Concentração sérica (pg/mL) de TNF nos grupos estudados em diferentes tempos após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis .......................................... 61

Figura 21 Visão geral do comportamento das concentrações séricas (pg/mL) de IFNy, IL-2, IL-10, e TNF nos grupos estudados em diferentes tempos após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis ............................................................. 62

Figura 22 Curva de sobrevida dos animais nos diferentes grupos até o 7 dia ..................................................................................... 64

Figura 23 Perda de peso (g) de ratos Lewis prévio à infusão parenteral de diferentes soluções ........................................... 65

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Figura 24 Perda de peso (g) de ratos Lewis após a infusão parenteral de diferentes soluções ........................................... 65

Figura 25 Delta peso (g) de ratos Lewis após a infusão parenteral de diferentes soluções e prévio à indução de PA ........................ 65

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RESUMO

Garib R. Efeito da administração parenteral de glutamina sobre a modulação da resposta inflamatória sistêmica, morbidade e mortalidade de ratos submetidos à pancreatite aguda [Dissertação]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2015.

INTRODUÇÃO: Relatos conflitantes têm dificultado para se estabelecer o potencial benefício da glutamina (GLN) no tratamento de condições inflamatórias agudas. Nós avaliamos o efeito da infusão parenteral de GLN, prévia à pancreatite aguda (PA) experimental, nos mediadores inflamatórios, morbidade e mortalidade. MÉTODOS: Ratos Lewis (n = 131) receberam glutamina parenteral (grupo GG), solução salina (grupo SS ou controle), ou permaneceram sem infusão parenteral (grupo Sham) por 48h. Após este período, foi induzida PA por meio da injecção retrógrada de taurocolato de sódio no ducto pancreático. Sangue, amostras de pulmão, fígado, pâncreas e líquido ascítico foram colhidos a partir de 2, 12 e 24 horas após PA para avaliação das variáveis propostas (citocinas, hsp, histologia, amilase). Sessenta animais permaneceram vivos após PA para a análise da mortalidade em sete dias. RESULTADOS: A análise entre grupos não mostrou diferenças significativas nos níveis de citocinas (p> 0,05). Análise cinética dentro de cada grupo ao longo do tempo mostrou maior INF-γ no grupo Sham e SS às 2h do que em 12h e 24h, maior IL-2 e inferior IL-10 no Sham, às 24h do que em 2h e 12h, e menor IL-10 no SS e GG em 24 h do que no tempo de 2h (p ≤0.05). O grupo GG exibiu maior expressão de HSP 90 no pulmão e no fígado do que no grupo Sham nos tempos de 2h e 12h, respectivamente; e maior expressão no fígado de HSP90 e HSP70 no grupo SS no tempo 12 horas (p <0,01). O grupo Sham apresentou maior expressão de HSP 70 no pulmão e HSP 90 no fígado do que os outros grupos no tempo de 24h. Não ocorreram alterações na taxa de mortalidade. CONCLUSÕES: Em modelo de PA experimental induzida por taurocolato de sódio, o pré-tratamento com GLN parenteral melhorou o perfil dos mediadores inflamatórios, sem afetar a mortalidade. Descritores: Glutamina/administração e dosagem; Soluções de nutrição parenteral; Citocinas; Proteínas de choque térmico; Síndrome de resposta inflamatória sistêmica; Pancreatite necrosante aguda; Ratos; Mortalidade.

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ABSTRACT

Soares AT. Effect of previous parenteral glutamine infusion on inflammatory mediators, morbidity and mortality of rats submitted to acute pancreatitis [Dissertation]. São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, 2015. INTRODUCTION: Conflicting reports have hindered establish the potential glutamine (GLN) benefit in treating acute inflammatory conditions. We evaluated the effect of parenteral GLN infusion before experimental acute pancreatitis (AP), as systemic inflammation-reproducing model, on inflammatory mediators and mortality. METHODS: Lewis rats (n=131) received parenteral glutamine (GG group), saline (SS or Control group), or remained without parenteral infusion ( Sham group) for 48h. Thereafter, AP was induced by retrograde injection of sodium taurocholate into pancreatic duct. Blood, lung, liver and pancreas samples were collected from 2, 12 and 24h post-AP to assess serum cytokines levels, tissue HSP expression, histology and amylase. Sixty animals remained alive post-PA for seven-day mortality analysis. RESULTS: Punctual between-groups analysis did not show differences in

cytokine levels (p >0.05). Intragroup analysis over time showed higher INF- in Sham and SS at 2h than at 12h and 24h, higher IL-2 and lower IL-10 in Sham at 24h than at 2h and 12h, and lower IL-10 in SS and GG at 24h than at 2h timepoint (p ≤0.05). GG group exhibited higher lung and liver HSP90 than Sham at 2h and 12h timepoints, respectively; and higher liver HSP90 and HSP70 than SS at 12h timepoint (p <0.01). Sham group presented higher lung HSP70 and liver HSP90 than the others at 24h timepoint (p <0.02). No changes occurred on mortality rate. CONCLUSIONS: In sodium taurocholate-induced PA model, pretreatment with parenteral GLN improved inflammatory mediator’s profile, without affecting mortality. Descriptors: Glutamine/administration and dosage; Parenteral nutrition solutions; cytokines; Heat shock proteins; Systemic inflammatory response syndrome; Acute necrotizing pancreatitis; mice; Mortality.

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1 INTRODUÇÃO

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1 INTRODUÇÃO

1.1 Imuno-fármaco-nutrientes: nutrientes com atividade no estado inflamatório e imune

Imunonutrição, como pode ser chamada a prática do uso de imuno-

fármaco-nutrientes, pode contribuir para o tratamento de doentes críticos e

cirúrgicos por melhorar a resposta metabólica, inflamatória e imunológica pós-

trauma. A associação entre perfil nutricional e imunidade assume importante

relevância nesta população de doentes de tal forma que, atualmente, o

emprego de nutracêuticos que visem à restauração e/ou manutenção da

resposta imunológica é cada vez mais frequente na prática clínica. Seus

principais benefícios incluem redução da incidência de infecções hospitalares,

do tempo de internação hospitalar e, em alguns estudos, do custo do

tratamento.1,2

No entanto, a imunonutrição é um universo que ainda carece ser mais bem

explorado, pois permanece sem respostas importantes. É possível que muitos

dos imunonutrientes testados individualmente tenham efeitos terapêuticos

(positivos ou negativos) em determinado grupo de pacientes, mas, quando

ministrados por outra via, a outra população clínica ou em doses diversas

apresentem efeitos diferentes2. Nesse sentido, estudos que considerem a

heterogeneidade de estados clínicos, bem como o uso de distintas vias de

administração e doses de nutrientes isolados ou em associação devem ser

desenvolvidos.

Devido a diferentes propriedades imunomoduladoras, a glutamina desperta

grande interesse na prática clínica e é objeto de diversos estudos que tentam

elucidar seus efeitos terapêuticos.3,4 Recentes publicações conduzidas por

Heyland e colaboradores projetaram, novamente, a glutamina a uma posição de

destaque e suscitou inúmeras discussões a respeito deste imunonutriente.5,6 A

partir destes resultados, dúvidas quanto a sua melhor forma de administração,

dosagem e seus reais benefícios na prática clínica, principalmente em doentes

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críticos, ganharam consistência e tornaram obrigatórios estudos que exploram

sua atividade no sistema imune.

1.1.1 Glutamina

Glutamina (GLN) é a amina livre mais abundante nos seres humanos e

considerada "condicionalmente essencial" durante os estados catabólicos

resultantes de uma condição de trauma, estresse cirúrgico ou sepsis.7

Devido à forte instabilidade, baixa solubilidade em meio aquoso e perfil de

absorção imprevisível, a glutamina é pouco utilizada em sua forma livre como

L- glutamina.8 Na prática clínica, a suplementação parenteral de glutamina é

realizada sob a forma de dipeptídeo sintético (L-alanil L-glutamina), para

garantir adequadas características físico-químicas durante a administração

endovenosa. A infusão parenteral de L-alanil-L-glutamina em pacientes críticos

e cirúrgicos leva ao aumento da concentração sanguínea desse dipeptídeo

(meia-vida de 0,26 horas), mas não altera as concentrações sanguíneas de

alanina ou glutamina; enquanto a sua administração enteral não é associada

com níveis circulantes detectáveis desses peptídeos em pacientes

cirúrgicos.9,10 Além disso, estudo publicado recentemente mostrou que a

infusão parenteral de L-alanil-L-glutamina em pacientes críticos não altera a

produção endógena tecidual de glutamina.11

Admite-se que a infusão de glutamina parenteral, em paciente sob

estresse grave, proporcione benefícios na proteção dos tecidos intestinal,

pulmonar e renal, e desempenhe atividade anti-inflamatória, imunológica,

metabólica e antioxidante12. A glutamina é importante combustível para

linfócitos, macrófagos, neutrófilos e células β - pancreáticas. Sua taxa de

captação é maior em células de rápida proliferação, como enterócitos e

linfócitos. Além disso, a glutamina é precursora de peptídeos e proteínas,

aminoaçúcares, purinas, pirimidinas, nucleotídeos, ácidos nucleicos e da

glutationa peroxidase (GSH-PX), enzima antioxidante que protege o organismo

contra danos consequentes do estresse oxidativo13.

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Para a sobrevivência celular em condições de estresse, como no estresse

oxidativo, além da atuação de antioxidante, as células expressam proteínas

conhecidas como heat shock protein (proteína de choque térmico – HSP)

classificadas com base em seu peso molecular, como HSP 90, HSP 70, 60 e

40. O desequilíbrio na expressão de HSP pode ocorrer em estresse grave,

câncer e inflamação sistêmica.14 Isto sugere que o nível de expressão de HSP

pode determinar o destino das células em resposta à condição de estresse.15

Em nível celular, a expressão de HSP 70 protege contra agentes

citotóxicos e, em animais reduz disfunção tecidual e mortalidade. Em estado

crítico como sepse politrauma e síndrome da angústia respiratória (SARA),

onde a concentração de glutamina encontra-se diminuída (menor que

0,2mmol/L), a expressão de HSP 70 é deficiente (menor que 47%) em

granulócitos, monócitos e linfócitos. Mesmo que por curto período de tempo a

deficiência de glutamina no organismo é capaz de reduzir a expressão de HSP

70 na célula13. Wischmeyer e seus colaboradores investigaram a relação entre

HSP e glutamina em sepse experimental. Camundongos foram divididos em

dois grupos, um com expressão normal de HSP 70 e outro com deficiência

deste gene. Os resultados obtidos mostraram que administração de glutamina

melhorou a sobrevida somente do grupo com expressão normal. Assim,

confirma-se a hipótese de que a expressão de HSP 70 é necessária para o

efeito benéfico da glutamina no estresse e admite-se que a glutamina pode ser

utilizada para induzir resposta protetora e prevenir danos teciduais na vigência

de estresse orgânico.16-19

Metanálise indicou que nutrição parenteral suplementada com dipeptídeo

de glutamina melhorou o balanço nitrogenado, preservou função de órgãos

vitais, reduziu riscos de infecções, favoreceu a proliferação de células do

sistema imunológico e citocinas antiinflamatórias e, principalmente, reduziu a

mortalidade pós-operatória em cirurgias de grande porte sem causar qualquer

efeito colateral.20,21

O racional e as evidências para a utilização da glutamina em pacientes

críticos foram, recentemente, revistas após as publicações de Heyland e

colaboradores, que indicaram possível aumento da mortalidade em pacientes

com disfunção de órgãos que foram suplementados com este

imunonutriente.5,6

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Embora os dados apresentados sejam passiveis de críticas pertinentes

quanto a possível viés, a conclusão destes estudos reforçam a necessidade de

novos protocolos, experimentais ou não, sobre a utilização deste

imunonutriente e representa uma nova oportunidade para aprofundarmos o

conhecimento sobre os diversos mecanismos de ação da glutamina.

1.2 Pancreatite aguda

A pancreatite aguda (PA) é uma inflamação aguda do pâncreas em

resposta a agressões de origem multifatorial, como organismos vivos,

processos metabólicos, tóxicos e alterações obstrutivas.22

Em sua apresentação clínica, a PA pode evoluir desde quadro leve

caracterizado por edema pancreático até quadros graves com extensa necrose,

disfunção múltipla de órgãos e morte. A evolução e o quadro clínico estão

diretamente relacionados com a extensão da lesão pancreática e a intensidade

da resposta inflamatória.23,24 A pancreatite aguda leve ocorre em 80 a 90% dos

casos e apresenta mortalidade inferior a 1%. Cerca de 10 a 15% dos casos

evoluem de forma grave com mortalidade que pode atingir até 20% e, neste

grupo de doente, a melhor modulação da resposta imune e inflamatória torna-

se de extrema importância para minimizar desfechos clínicos desfavoráveis.24

A resposta inflamatória na PA se caracteriza por um processo sistêmico

com liberação de mediadores inflamatórios, como fator de necrose tumoral – α

(TNF-α), interleucinas (IL) 1, 6 e 8, dentre outros. Esses mediadores

inflamatórios, na apresentação grave da doença, estão associados à

ocorrência de insuficiência respiratória, instabilidade hemodinâmica, alteração

da permeabilidade vascular e insuficiência renal. Em conjunto, esses

fenômenos compõem a síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS) e,

como resultado final, podem resultar em insuficiência de múltiplos órgãos.25

A lesão tecidual na PA se inicia na célula acinar pela ativação de

moléculas de sinalização inflamatória presentes no núcleo e, posteriormente,

pela liberação de mediadores inflamatórios. Sabe-se que a lesão da célula

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acinar é responsável pelo recrutamento de neutrófilos e macrófagos

circulantes, e pela ativação da cascata inflamatória.25,26

Imediatamente após o início da lesão do tecido pancreático, inicia-se a

resposta inflamatória sistêmica, com aumento de mediadores pró-inflamatórios,

como IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-α e PGE2, que é seguida pela liberação de

mediadores anti-inflamatórios, como IL-10 e IL-11, com a finalidade de

contrarregular o processo inflamatório. No entanto, o prevalente desequilíbrio

entre a produção de citocinas pró em relação a anti-inflamatórias é frequente

em pancreatite. Tal fato estabelece o grau da resposta sistêmica.25,26 A relação

direta entre mediadores inflamatórios e gravidade da doença, já evidenciada

em estudos prévios, nos permite concluir que a dosagem de níveis séricos de

mediadores inflamatórios pode ser utilizada como fator prognóstico na PA.26,27

Em um segundo momento, na fase inicial de intensa resposta

inflamatória, há a ocorrência de quebra de mecanismos da barreira intestinal

com aumento da permeabilidade da mucosa e translocação bacteriana.28,29

O manejo nutricional representa uma das medidas mais importantes na

PA. Em sua apresentação grave, a doença representa significativo risco

metabólico, inflamatório e infeccioso, o que exige uma terapia nutricional

adequada e precoce. Na vigência de PA, aumentam sobremaneira as

demandas nutricionais, pois a doença desencadeia uma exacerbada resposta

inflamatória local e sistêmica que resultam em hipermetabolismo e

hipercatabolismo acentuados.

A adequada conduta nutricional visa, principalmente, ao repouso

glandular, evitando-se, assim, o estímulo secretório de enzimas digestivas

pancreáticas, que pode perpetuar o estímulo inflamatório e também tem por

objetivo evitar o mecanismo de quebra da barreira intestinal. Medidas como

jejum, alimentação por sonda enteral, localizada, principalmente, na porção

jejunal do TGI, ou terapia nutricional parenteral são, frequentemente,

adotadas30. Associado a essas medidas, o uso de imunonutrientes com

potencial anti-inflamatório tem sido considerado com intuito de minimizar a

inflamação da PA, incluindo o uso de glutamina. Sabe-se, também, que este

imunonutriente, por ser combustível principal para células de mucosa intestinal

(enterócitos, colonócitos) e otimizar as funções imunológicas de células de

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defesa presentes na mucosa intestinal (linfócitos, macrófagos), apresenta-se

como um potencial instrumento de controle da lesão e evolução na pancreatite

aguda.

1.3 Influências da glutamina na pancreatite aguda

Estudos, experimentais e clínicos, vêm demonstrando benefícios no uso

de imunonutrientes na PA, principalmente com fins terapêuticos.31-35

Sociedades internacionais especializadas em nutrologia defendem

posições divergentes em seus consensos quanto à utilização da glutamina em

pancreatite aguda e pacientes críticos. A Sociedade Europeia (European

Society for Clinical Nutrition and Metabolism - ESPEN) recomenda que, na

hipótese de utilização de nutrição parenteral, deve-se considerar a

suplementação com glutamina devido aos benefícios deste imunonutriente.36 A

posição da sociedade canadense foi revista recentemente e preconiza que, em

pacientes críticos, é fortemente recomendado não utilizar a glutamina

parenteral.37

A suplementação parenteral de glutamina em pancreatite aguda

experimental diminuiu a atrofia intestinal e melhorou a função exócrina da

célula acinar pancreática, comparada à NP padrão sem glutamina. Observou-

se, ainda, aumento significativo dos níveis de albumina e linfócitos, redução do

tempo de nutrição parenteral e internação hospitalar em pacientes

suplementados com dipeptídeo de alanil-glutamina38.

Glutamina parece proteger células e tecidos, atenuar inflamação e

preservar a função metabólica de pacientes em estresse grave. Dose única de

glutamina (0,75g/kg) pode atenuar a ativação do NF-kB, impedir degradação da

proteína inibidora (IkB) e reduzir a intensidade da resposta inflamatória. Esta

resposta está correlacionada com aumento na expressão HSPs na célula.39

Dados recentes indicam que a expressão da proteína de choque térmico

HSP 70 é vital para sobrevida e, na presença de trauma, apresenta uma

redução significativa na sua expressão. Em pacientes críticos, a deficiência de

glutamina diminui a expressão de HSP, contribuindo para aumento da

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intensidade da resposta inflamatória. Em estudo duplo-cego randomizado, de

pacientes cirúrgicos graves tratados com nutrição parenteral suplementada

com L-alanil-glutamina (0,5g/kg/dia), observou-se aumento da expressão sérica

de HSP 70, diminuição de complicações pós-operatórias e redução do tempo

de permanência na UTI.39

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2 RACIONAL E JUSTIFICATIVA DO ESTUDO

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2 RACIONAL E JUSTIFICATIVA DO ESTUDO

A modulação favorável da resposta inflamatória sistêmica após estresse

traumático pode contribuir para prevenir ou atenuar complicações clínico-

cirúrgicas. Nesse sentido, a terapia nutricional com nutrientes capazes de

modular funções imunológicas torna-se de grande interesse. A Glutamina tem

importante papel neste grupo de nutrientes e seu uso, principalmente quando

administrado pela via parenteral, está associado com a estabilidade ou melhora

de funções imunológicas e modulação favorável de marcadores inflamatórios

na pancreatite aguda (PA). Embora este seja o resultado de inúmeras

pesquisas sobre o tema, recentemente, diversas publicações a respeito

trouxeram å tona a importância de maiores esclarecimentos e evidências

cientificas suficientes que justifiquem a utilização deste aminoácido,

principalmente em doentes críticos.

A PA experimental se destaca por ser de técnica factível, com

metodologia amplamente explorada em diversos estudos por nossa equipe de

pesquisadores. Neste estudo, serviu como modelo indutor de grave estresse

inflamatório local e sistêmico.40,41

Na literatura e em nossa experiência prática, doentes submetidos a

grandes traumas, complexas cirurgias do aparelho digestivo e longos períodos

de isquemia pancreática por ocasião de cirurgias cardiovasculares e by-pass

cardiopulmonar podem desenvolver pancreatite aguda em até 10% dos

casos.42-45 A pancreatite pós-operatória (PPO) é resultado indesejável dos

avanços da cirurgia moderna e sua gravidade é de fácil entendimento, pois, ao

trauma cirúrgico já ocorrido, vem somar-se o trauma metabólico adicional, com

suas graves consequências. Não há como estabelecer a frequência exata da

PPO, pois, muitas vezes, seu diagnóstico passa despercebido no pós-

operatório complicado ou é reconhecido apenas por meio da autópsia.

Procedimentos que envolvem a manipulação e infusão de contraste no

ducto pancreático e biliar comum, como colangiopancreatografia retrógrada

(ERCP), também podem ocasionar pancreatite com incidência que varia de 5 a

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40% dos pacientes.46-48 Uma vez instalada, a pancreatite aguda pode contribuir

para o aumento de taxas de morbidade e mortalidade, e sua gravidade tem

relação com o grau da lesão pancreática e intensidade da resposta inflamatória

sistêmica.

A hipótese do presente estudo considera que o uso parenteral de solução

de glutamina anterior ao evento gerador de estresse pode repercutir na

resposta inflamatória e modificar a mortalidade da PA.

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3 OBJETIVOS

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3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Avaliar a repercussão do uso parenteral prévio de glutamina sobre a

modulação da resposta inflamatória sistêmica e mortalidade em modelo

inflamatório representado pela pancreatite aguda em ratos.

3.2 Objetivos específicos

1. Avaliar o efeito da infusão parenteral prévia de glutamina em

parâmetros inflamatórios e imunológicos associados à indução de

resposta inflamatória local e sistêmica por meio da pancreatite aguda

experimental, em três diferentes tempos: 2, 12 e 24 horas;

2. Avaliar o efeito da infusão parenteral prévia de glutamina na

mortalidade de animais submetidos à pancreatite aguda experimental.

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4 MATERIAIS E MÉTODOS

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4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Local de execução

O estudo experimental foi realizado pelo Laboratório de Nutrição e

Cirurgia Metabólica do Aparelho Digestivo – LIM – 35 da Disciplina de Cirurgia

do Aparelho Digestivo do Departamento de Gastroenterologia da Faculdade de

Medicina da Universidade de São Paulo – FMUSP – em parceria com o

Laboratório de Investigação Médica 37 – LIM 37 – da Disciplina de Transplante

e Cirurgia do Fígado, Laboratório de Emergências Clínicas – LIM 51,

Departamento de Anatomia Patológica da FMUSP e Laboratório de

Bromatologia da Faculdade de Saúde Pública da Universidade de São Paulo.

O protocolo experimental foi desenvolvido no Laboratório de Nutrição e Cirurgia

Metabólica do Aparelho Digestivo (LIM 35) da Disciplina de Cirurgia do

Aparelho Digestivo do Departamento de Gastroenterologia da Faculdade de

Medicina da Universidade de São Paulo – FMUSP – em parceria com o

Laboratório de Investigação Médica 37 (LIM 37) da Disciplina de Transplante e

Cirurgia do Fígado, Laboratório de Emergências Clínicas (LIM 51) e

Departamento de Anatomia Patológica da FMUSP. O estudo contou com o

apoio financeiro de auxílio pesquisa da Fundação de Amparo à Pesquisa do

Estado de São Paulo – FAPESP, Processo nº 2011/02071-7; fornecimento de

frascos de solução parenteral L-alanil glutamina (Dipeptiven® 20%), pela

Fresenius-Kabi; doação por comodato de 10 bombas de infusão volumétrica

pela Baxter Hospitalar; e confecção de bolsas parenterais específicas para o

estudo pela Farmácia de Manipulação Farmoterápica.

4.2 Aspectos éticos

O presente estudo e todos os procedimentos envolvidos em seu protocolo

foram aprovados pela Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa

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da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (CAPPesq -

Protocolo nº 0266/09).

4.3 Delineamento experimental

O presente estudo foi conduzido em duas fases distintas:

Fase 1: Repercussão do uso parenteral prévio de glutamina sobre

biomarcadores da resposta inflamatória sistêmica em modelo de PA:

Após adaptação, animais de experimentação foram submetidos à

cateterização venosa central, infusão parenteral de solução salina 0,9% ou de

glutamina, indução de PA por infusão de ácido taurocólico a 3% no ducto

biliopancretaico e sacrifício por punção cardíaca em períodos crescentes de

tempo (2, 12 e 24 horas após indução de PA), com coleta de amostras de

sangue e tecidos.

Grupos experimentais da Fase 1

Delineamento na Fase 1:

As etapas desta fase foram executadas em dois diferentes intervalos de

duas e doze horas após a indução de pancreatite aguda.

Grupo Sham: submetido à CVC, sem infusão parenteral por 48 horas e

indução de PA.

Grupo Salina (SS) ou controle: submetido à CVC, com infusão parenteral de

solução salina 0,9% por 48 horas e indução de PA.

Grupo Glutamina (GG): submetido à CVC, com infusão parenteral de L-alanil

glutamina por 48 horas e indução de PA.

infusão parenteral de óleo de peixe e indução de PA.

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Tempo de 2 horas:

n=10 animais/grupo;

Cateterização sistema venoso central;

Infusão parenteral de solução salina por 24 horas em todos os grupos;

Infusão parenteral de solução proposta (salina e glutamina) por 48

horas exceto no grupo Sham;

Indução de pancreatite aguda por ácido taurocólico 3% após

laparotomia e cateterização do ducto biliopancreático;

Sacrifício e coleta de material após 2 horas da indução de pancreatite.

Tempo de 12 horas:

n=7 animais/grupo;

Cateterização sistema venoso central;

Infusão parenteral de solução salina por 24 horas em todos os grupos;

Infusão parenteral de solução proposta (salina e glutamina) por 48

horas, exceto no grupo Sham;

Indução de pancreatite aguda por ácido taurocólico 3% após

laparotomia e cateterização do ducto biliopancreático;

Sacrifício e coleta de material após 12 horas da indução de pancreatite.

Tempo de 24 horas:

n= 7 animais/grupo;

Cateterização sistema venoso central;

Infusão parenteral de solução salina por 24 horas em todos os grupos;

Infusão parenteral de solução proposta (salina e glutamina) por 48

horas exceto no grupo Sham;

Indução de pancreatite aguda por ácido taurocólico 3% após

laparotomia e cateterização do ducto biliopancreático;

Sacrifício e coleta de material após 24 horas da indução de pancreatite.

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Fase 2 - Repercussão da infusão parenteral prévia de glutamina na

sobrevida de ratos submetidos à PA:

Após adaptação, animais de experimentação foram submetidos à

cateterização venosa central, infusão parenteral de solução salina 0,9% ou de

glutamina, indução de PA por infusão de ácido taurocólico a 3% no ducto

biliopancretaico e observação por até 7 dias. No sétimo dia, os animais que

sobreviveram foram sacrificados por punção cardíaca.

Grupos experimentais da Fase 2

Delineamento na Fase 2:

n= 20 animais/grupo;

Cateterização sistema venoso central;

Infusão parenteral de solução salina por 24 horas em todos os

grupos;

Infusão parenteral de solução proposta (salina e glutamina) por 48

horas exceto no grupo Sham;

Indução de pancreatite aguda por ácido taurocólico 3% após

laparotomia e cateterização do ducto biliopancreático;

Observação da taxa de mortalidade a cada período de 8 horas em

animais que não foram sacrificados após indução de pancreatite

aguda por até 7 dias.

Grupo Sham: submetido à CVC, sem infusão parenteral por 48 horas e indução

de PA.

Grupo Salina (SS) ou controle: submetido à CVC, com infusão parenteral de

solução salina 0,9% por 48 horas e indução de PA.

Grupo Glutamina (GG): submetido à CVC, com infusão parenteral de L-alanil

glutamina por 48 horas e indução de PA.

infusão parenteral de Glutamina por 48 horas e indução de PA.

infusão parenteral de óleo de peixe e indução de PAz.

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25

4.4 Procedimentos gerais

4.4.1 Animais de experimentação

Foram estudados ratos isogênicos da linhagem Lewis (n=131), machos, com

peso médio de 300 gramas provenientes do Biotério do Centro Multidisciplinar

para Investigação Biológica (CEMIB) da Universidade Estadual de Campinas

(UNICAMP). As normas de proteção e cuidados aos animais de

experimentação foram seguidas no início do projeto de pesquisa segundo

Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), de acordo com

Resolução nº 032/2006, seguido de normas do Comitê de Ética em Pesquisa

da FMUSP (CEP).

4.4.2 Período de adaptação

Cinco dias anteriores à cateterização venosa central; os animais foram

mantidos em gaiolas individuais, em temperatura controlada (20 e 25°C) com

livre acesso à água e ração padrão (Nuvilab CR1, Nuvital Nutrientes S.A,

Paraná, Brasil) no LIM 35, para adaptação ao ambiente de pesquisa.

4.4.3 Cateterização do Sistema Venoso Central (CVC)

Inicialmente; animais foram pesados em balança digital (Marte

Balanças®) com auxílio de recipiente apropriado para este fim. Após obtenção

do peso, procedemos ao cálculo das doses dos anestésicos utilizados. Foram

administrados o cloridrato de cetamina na dose de 80 mg/Kg (Ketamin-S(+)®

Cristália, Brasil) e o cloridrato de xilazina na dose de 8,0 mg/Kg (Rompun 2%®

- Bayer, Brasil), conforme indicação do fabricante (General Reference Book for

Sedation and Anaesthesia, Bayer – 2004). A indução anestésica foi realizada

com a aplicação da dose estabelecida na região intraperitonial do animal. Sob

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efeito anestésico, o animal foi tricotomizado, com auxílio de lâmina de bisturi

número 11 no local determinado de cada procedimento cirúrgico. A assepsia

do local foi realizada com álcool iodado a 2%. Conforme técnica padronizada

por Lima-Gonçalves e colaboradores; o animal é mantido em decúbito dorsal

horizontal e sobre a região supraclavicular direita, previamente protegida por

campo estéril, é realizada incisão transversa de; aproximadamente; 1,0 cm por

planos até localização da veia.49 Posicionamos o animal em decúbito ventral e;

com auxílio de agulha Intracath (Biotecno Produtos Plásticos e Médicos Ltda.,

São Paulo), tunelizamos o tecido subcutâneo em direção à região dorsal, com

exteriorização a 1,0 cm da região retroauricular. Pelo interior do Intracath,

passamos o cateter de silicone (Ciencor® Brasil), de; aproximadamente; 1,0

mm de diâmetro e 70,0 mm de comprimento, o qual é tracionado pelo túnel em

direção à incisão inicial. Fixamos na região dorsal do animal a peça

intermediária representada por agulha anatomicamente adequada para ratos e

soldada à pequena peça metálica que possui duas asas laterais do tipo

“borboleta”. Estas laterais contêm dois orifícios paralelos em cada extremidade

para fixação ao dorso do animal por meio de dois pontos separados com fio

mononylon 3-0 (Shalon® suturas, Brasil). Em seguida, o animal é colocado em

decúbito dorsal e realiza-se a dissecção e reparo da veia jugular direita com fio

de algodão 4-0, estéril, pré-cortado, não absorvível e não agulhado (Polycot® -

Ethicon, New Jersey, EUA). A porção proximal da veia é ligada com o mesmo

fio de reparo e a porção distal é cateterizada por meio da introdução de tubo de

silicone posicionado peri-incisão pela tunelização anterior e contendo solução

fisiológica heparinizada (Figura 1). A incisão da pele é suturada de forma

contínua com fio mononylon 3-0 e desinfetada com álcool iodado 2%.

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27

Figura 1 – Fases da cateterização do sistema venoso central

4.4.4 Infusão parenteral

Finalizada a cateterização venosa central (CVC), os animais foram

distribuídos em gaiola metabólica individual, conectando-se a “borboleta” ao

intermediário de infusão, que gira em torno de seu eixo, permitindo livre

movimentação do animal, denominado swivel. Ao swivel, foi conectado um

cateter de polietilieno, de aproximadamente 120 mm, ligado a equipo de

infusão graduado (Equipo para bomba Colleague® - Baxter Hospitalar Ltda.),

contendo soro fisiológico 0,9%.

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No pós-operatório imediato da CVC, todos os animais receberam infusão

(0,3 mL/h) de solução salina 0,9% durante 24 horas, permanecendo em jejum

oral e água ad libitum. Após este período, os animais foram aleatoriamente

divididos em diferentes grupos: 1. Grupo Salina ou controle (SS) que

permaneceu sob infusão de solução salina 0,9% por mais 48 horas; 2. grupo

Glutamina, que passou a receber infusão de glutamina por 48 horas; 3. Grupo

SHAM, que teve seu cateter ocluído e não recebeu infusão intravenosa. Todos

os grupos de animais permaneceram com livre acesso à dieta oral padrão e

água ad libitum.

As soluções infundidas foram encaminhadas em bolsas individuais de

infusão, previamente preparadas pela empresa Farmacêutica de Manipulação

Farmoterápica (São Paulo, Brasil). Padronizou-se o volume total de infusão

diária de 6 mL de solução por animal na velocidade de 0,3 ml/hora. Para isso,

as bolsas de infusão do grupo glutamina foram preparadas pela adição de

1,0g/Kg de L-alanil glutamina (±1,25mL; Dipeptiven® 20%, composição na

Tabela 4) acrescidos de solução salina 0,9% em quantidade suficiente para

atingir-se o volume final total de 6 mL.

A troca das bolsas parenterais foram efetuadas a cada período de 24

horas para garantia de adequada estabilidade físico-química e microbiológica

da solução na bolsa parenteral previamente formulada pela empresa

Farmacêutica de Manipulação – Famoterápica – São Paulo, Brasil.

O acompanhamento dos animais foi realizado diariamente ao longo de

todo experimento. As observações, como infusão endovenosa e eventuais

alterações do estado geral do animal, foram registradas em fichas

individualizadas. Animais com a retirada ou perda do swível e do equipo foram

considerados não adequados para o estudo e foram excluídos.

Após o término da infusão parenteral proposta ou período de 48 horas

(caso do grupo SHAM), os animais foram, imediatamente, submetidos à PA,

conforme método descrito a seguir.

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Esquema ilustrativo da infusão de bolsas parenterais de grupos salina e

tratamento com glutamina em bomba de infusão contínua:

Figura 2 – Bomba para infusão parenteral e animal com dispositivo de infusão na região dorsal após cateterização venosa

Tabela 1 - Composição da solução parenteral de glutamina

Composição Dipeptiven® 20g

N(2)-L-alanil-L-glutamina

Alanina 8,20g

L-glutamina 13,46g

Água para injeção q.s.p. 100ml

Valores fornecidos pelo fabricante (Fresenius-Kabi® Bad - Homburg, Alemanha)

4.4.5 Pancreatite aguda experimental

A pancreatite aguda foi induzida por meio de injeção retrógrada de

solução de taurocolato de sódio a 3% (Taurocholic acid, sodium salt, Sigma-

Chemical Company™, St. Louis, U.S.A) no ducto biliopancreático, na dose de

0,5 ml/animal com tempo médio de infusão de 60 segundos. Previamente a

Grupo Salina ou controle - Solução Salina (SS)

0,9% - 6ml/dia

Grupos Glutamina - Dipeptiven® - 1,25 ml/dia +

4,75 ml de SS = 6ml/dia

BIC: Velocidade de 0,3ml/h

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esse procedimento, foi realizada anestesia dos animais com administração

intraperitoneal de cloridrato de cetamina 80 mg/Kg (Ketamin-S(+)® Cristália,

Brasil) e cloridrato de xilazina- 8,0 mg/Kg (Rompun 2% ® - Bayer, Brasil),

conforme indicação do fabricante (General Reference Book for Sedation and

Anaesthesia, Bayer – 2004), tricotomia abdominal, antissepsia com polivinil-

pirrolidona-iodo e colocação de campos estéreis.

Procedeu-se a laparotomia por incisão mediana infraxifoídia de,

aproximadamente, 2,0 cm com exteriorização do arco duodenal e pâncreas,

identificação e oclusão do ducto biliar ao nível do hilo hepático com pinça tipo

bulldog, punção da porção contramesentérica do duodeno com agulha 25 x 7 e

cateterização do ducto biliopancreático com cateter de polietileno.

Posteriormente, induziu-se PA foi por meio da injeção retrógrada de solução de

taurocolato de sódio a 3% (Taurocholic acid, sodium salt, Sigma-Chemical

Company™, St. Louis, U.S.A) no ducto biliopancreático, na dose de

0,5mL/animal, com tempo médio de infusão de 60 segundos. Finalmente,

procedeu-se ao fechamento da punção duodenal com ponto em x de fio de

prolene 6-0, e fechamento por planos da parede abdominal, com nylon 3-0

(Figuras 3 e 4).41,42 Após indução de PA, os animais retornaram às gaiolas

metabólicas individuais para acompanhamento e posterior sacrifício nos

determinados intervalos.

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Figura 3 – Aspecto do arco duodenal e do pâncreas antes da indução da pancreatite. Observa-se o ducto biliopancreático cateterizado e o arco duodenal reparado.

Figura 4 - Aspecto do arco duodenal e do pâncreas após a indução da pancreatite. Presença de hiperemia e edema do tecido peripancreático. O ducto biliopancreático cateterizado e ocluído junto ao hilo hepático e o arco duodenal reparado.

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4.5 Procedimentos específicos fase 1

Após a indução de pancreatite aguda experimental, todos os animais

foram em intervalos crescentes de 2, 12 e 24 horas induzidos à eutanásia e

coleta de sangue por punção cardíaca, sob anestesia intraperitonial com 80

mg/Kg de cloridrato de cetamina (Ketamin-S(+)® Cristália, Brasil) e 8,0 mg/Kg

de cloridrato de xilazina- (Rompun 2% ® - Bayer, Brasil). Seguida à eutanásia,

procedeu-se a nova abertura da cavidade abdominal para coleta de líquido

ascítico, amostras de fígado e pâncreas, e abertura da cavidade torácica para

coleta de tecido pulmonar. As amostras sanguíneas foram utilizadas para

dosagem dos níveis séricos de citocinas e de amilase; as amostras de líquido

ascítico foram utilizadas para dosagem de TNF-α; e as amostras teciduais

foram utilizadas para avaliações histológicas (pâncreas), de proteínas de

choque térmico (HSP – fígado e pulmão) e de peroxidação lipídica (fígado).

4.5.1 TNF-α no líquido ascítico

A quantidade de TNF-α em líquido ascítico de animais com PA foi

determinada pelo método de imunoensaio (ELISA), por meio da utilização do kit

RT TNF ALPHA ELISA KIT (Life Tecnologies), conforme recomendações do

fabricante.

4.5.2 Análises histológicas

Fragmentos do tecido pancreático foram retirados e fixados em aldeído

fórmico a 10%. Após coleta, foram encaminhados ao Laboratório de Anatomia

Patológica do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo, onde foram incluídos em parafina, cortados em

espessura de 5 µm, corados com a técnica de hematoxilina-eosina e

observados por microscopia ótica.

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A avaliação do tecido pancreático foi realizada com a utilização da

classificação do processo inflamatório pancreático proposto por Schmidt e

colaboradores50, analisando variáveis: edema, necrose acinar, hemorragia,

necrose gordurosa, inflamação e infiltrado perivascular. A graduação do

processo inflamatório foi realizada com a atribuição de pontos para cada uma

das variáveis descritas, e, posteriormente, analisada e comparada entre os

diferentes grupos estudados.

A análise histológica foi realizada no Departamento de Anatomia

Patológica da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo por

patologista especializado em histologia pancreática, sendo que essa não

possuía conhecimento dos grupos estudados.

4.5.3 Proteínas de choque térmico (HSP) 70 e 90

Aproximadamente, 100 mg de tecido pulmonar e 50 mg do tecido

hepático foram pulverizados em nitrogênio líquido. O material foi

homogeneizado em tampão de lise RIPA (100 mM de Tris-HCl pH 7.5, 1% de

desoxicolato de sódio, 1% de NP40, 150 mM de NaCl, 0.1% SDS) acrescido de

inibidores de proteases (1 mg/mL pepstatina A, 100 mM PMSF). Em seguida,

as amostras foram centrifugadas a 14000g por 10 minutos a 4oC. O

sobrenadante foi coletado, e a concentração de proteínas foi quantificada pelo

método de Bradford (Bio-Rad).

As amostras de proteínas foram acrescidas de tampão de amostra (2%

SDS, 60 mM Tris pH 6.8, 5% de mercaptoetanol, e 0,01% de azul de

bromofenol) e submetidas à eletroforese em um sistema SDS-PAGE, gel 10%

de poliacrilamida (1.5 M Tris-HCl, 10% SDS, 30% bis-acrilamida, 10% de

persulfato de amônia e TEMED). Após a eletroforese, as proteínas foram

transferidas para membrana de nitrocelulose (Bio-Rad) em aparelho semi-dry

transfer (Bio-Rad).

As membranas foram incubadas em solução de bloqueio 5% de leite

desnatado em tampão TBST (50 mM de tampão Tris, pH 8,0, 100 mM NaCl,

1% Tween 20) por 1 hora à temperatura ambiente. Em seguida, foram lavadas

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em TBST e incubadas com o anticorpo primário contra as proteínas de

interesse (Santa Cruz, Biotecnology) overnight a 4ºC. Posteriormente, as

membranas foram incubadas em solução contendo anticorpo secundário

conjugado à peroxidase (1:1000) (Santa Cruz, Biotecnology) e expostas ao

sistema de detecção Super Signal (Pierce). A expressão da proteína foi

comparada por densitometria de gel, utilizando-se o programa de domínio

público “Image J”, criado por Wayne Rasband do National Institutes of Mental

Health, NIH, USA, e previamente utilizado para a determinação de HSP 70 e

HSP 90.51

4.5.4 Amilase sanguínea

Amilase sanguínea foi quantificada por método enzimático colorimétrico,

com emprego do kit MAK009 (Sigma-Aldreich®), conforme recomendações do

fabricante.

4.5.5 Citocinas séricas

Os níveis séricos de IL-1, IL-2, IL-4, IL-10, INF-γ e TNF-α foram

determinados em 500 µL de soro por imunoensaio com microesferas do tipo

multiplex, com uso de kit disponível comercialmente para ratos (Recytmag-

65K-07, Genesis Ltda.) em analisador Luminex (Luminex®, MiraiBio, Alameda,

CA), de acordo com as instruções do fabricante.

4.6 Procedimentos específicos da Fase 2

Após indução de PA, os 20 ratos de cada grupo permaneceram em

observação pelo período máximo de até 7 dias com livre acesso à dieta oral

padrão e água ad libitum. Os animais foram observados individualmente em

intervalos de 8 horas para registro de óbitos. Aqueles animais que

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sobreviveram até o 7º dia pós-PA foram sacrificados por aprofundamento de

anestésico, com injeção intraperitonial com 80 mg/Kg de cloridrato de cetamina

(Ketamin-S(+)® Cristália, Brasil) e 8,0mg/Kg de cloridrato de xilazina- (Rompun

2% ® - Bayer, Brasil).

4.7 Análise estatística

Para a análise estatística dos dados, adotou-se limite de confiança de 5%

para todos os testes realizados. Dados de biomarcadores inflamatórios e

histológicos, foram comparados entre os grupos utilizando-se análise de

variância (ANOVA), em conformidade com a normalidade e teste Kruskal-

Wallis. Diferenças entre os grupos foram avaliadas pelo t de Student com

correção de Bonferroni. A mortalidade dos animais foi avaliada por Teste Exato

de Fisher e a Sobrevida pelo Gráfico de Kaplan Meier. As análises estatísticas

foram realizadas com SPSS 18,0 para Windows (SPSS, Chicago, IL, EUA).

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5 RESULTADOS

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5 RESULTADOS

5.1 Fase 1 – Estudo do impacto da infusão parenteral prévia de glutamina 2 ,12 e 24 horas após indução de PA

5.1.1 Tempo de 2 horas

Fizeram parte da análise desta fase 30 animais, utilizados para avaliação

dos biomarcadores heat shock protein (HSP) 70 e 90 no fígado e no pulmão,

TNF-alfa no líquido ascítico, citocinas séricas, amilase sérica e da histologia do

pâncreas.

5.1.1.1 HSP 90 hepática após 2 horas de indução de PA

Não foram expressos níveis detectáveis de HSP 90 no fígado nos

diferentes grupos estudados.

5.1.1.2 HSP 90 pulmonar após 2 horas de indução de PA

Encontrou-se aumento significativo da expressão da HSP 90 no pulmão

no grupo glutamina, comparado com o grupo SHAM (ANOVA, p = 0,0071) e no

grupo salina, comparado ao grupo SHAM (ANOVA, p= 0,0168). Os dados da

expressão da HSP 90 no pulmão encontram-se na Figura 5.

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Figura 5 - Expressão (unidades arbitrárias - U.A) de HSP 90 no pulmão 2 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções.

5.1.1.3 HSP 70 hepática após 2 horas de indução de PA

Não foram encontradas diferenças entre os grupos na quantificação de

HSP 70 no fígado (ANOVA, p = 0,1749) - Figura 6.

Figura 6 - Expressão (unidades arbitrárias - U.A) de HSP 70 no fígado 2 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções.

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5.1.1.4 HSP 70 pulmonar após 2 horas de indução de PA

Não foram encontradas diferenças entre os grupos na quantificação de

HSP 70 no pulmão (ANOVA, p = 0,3719 ) - Figura 7.

Figura 7 - Expressão (unidades arbitrárias – U.A.) de HSP 70 no pulmão 2 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções.

5.1.1.5 TNF- α no líquido ascítico após 2 horas de indução de PA

Não foram encontradas diferenças entre os grupos na quantificação de

TNF- α no líquido ascítico (ANOVA, p > 0,05).

5.1.1.6 Citocinas séricas após 2 horas de indução de PA

Não foram encontradas diferenças entre os grupos na quantificação de

citocinas séricas IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-γ e TNF-α (ANOVA, p > 0,05)

após 2 horas de PA. Os resultados das dosagens de citocinas estão descritos

na Tabela 2.

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Abaixo, temos alguns descritivos das variáveis quantitativas separados

pelos grupos, e o nível descritivo.

Tabela 2 - Concentração sérica (pg/mL) de citocinas 2 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções

Variável Grupo Média Mediana Desvio Padrão

Mínimo Máximo 1º

Quartil 3º

Quartil P-valor

IL-1a

Controle 38,70 14,41 56,71 4,67 171,00 4,67 47,89

0,5526 Glutamina 12,46 4,67 17,97 4,67 59,56 4,67 12,27

Sham 33,28 8,47 51,89 4,67 166,00 4,67 47,89

IL-4

Controle 6,72 3,98 5,10 3,98 16,02 3,98 8,90

0,9701 Glutamina 7,08 3,98 8,93 3,98 30,87 3,98 3,98

Sham 6,16 3,98 5,28 3,98 20,38 3,98 3,98

IL-2

Controle 32,22 25,50 22,67 13,30 86,43 22,32 31,21

0,8326 Glutamina 31,89 23,89 27,23 4,50 97,24 22,31 30,38

Sham 25,39 23,10 11,35 11,90 43,91 17,69 33,71

IL-6

Controle 496,82 200,00 939,53 33,11 2809,00 76,71 289,50

0,6444 Glutamina 444,29 178,00 586,11 33,11 1712,00 33,11 452,00

Sham 1731,03 336,00 2687,18 33,11 7943,00 33,11 3135,00

IL-10

Controle 513,63 400,00 422,09 110,00 1490,00 294,50 560,00

0,2882 Glutamina 716,00 539,00 569,28 144,00 1960,00 298,00 893,00

Sham 339,05 336,50 211,34 81,30 662,00 168,00 482,00

IFNy

Controle 74,01 72,62 52,86 22,15 185,00 30,44 89,41

0,1418 Glutamina 62,51 55,67 38,64 10,40 154,00 55,67 64,15

Sham 96,69 85,25 64,21 47,18 272,00 64,15 93,61

TNFa

Controle 11,10 8,44 11,52 1,82 34,53 1,82 15,97

0,3902 Glutamina 8,83 11,22 6,34 1,82 18,49 1,82 11,22

Sham 6,18 1,82 7,89 1,82 24,96 1,82 8,53

5.1.1.7 Amilase sérica após 2 horas de indução de PA

Não foram encontradas diferenças estatísticas no valor total de amilase

sérica entre os grupos de animais (ANOVA, p = 0,3493). Entretanto, ao

avaliarmos sua variabilidade entre os grupos, notamos que esta foi maior nos

animais SHAM, em comparação aos grupos glutamina e salina, e que animais

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do grupo glutamina apresentaram a menor variabilidade desse marcador, em

comparação com os outros grupos – Figura 8.

Figura 8 - Concentrações de amilase sérica (U/dL) 2 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções.

5.1.1.8 Histologia do pâncreas após 2 horas de indução de PA

Não foram encontradas diferenças da histologia pancreática entre os

grupos referente à análise da somatória das variáveis edema, necrose acinar,

inflamação e infiltrado perivascular, necrose gordurosa e hemorragia (ANOVA,

p = 0,4632) - Figura 9. Abaixo temos que alguns descritivos das variáveis

quantitativas separados pelos grupos, e o nível descritivo na Tabela 3

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Tabela 3 - Variáveis analisadas na histolologia de 2 horas

Variável Grupo Média Mediana Desvio Padrão

Mínimo Máximo 1º

Quartil 3º

Quartil P-

valor

Edema score

controle 1,50 1,50 0,00 1,50 1,50 1,50 1,50

0,0583 Sham 1,65 1,75 0,58 0,50 2,50 1,50 2,00

Glutamina 1,88 2,00 0,23 1,50 2,00 1,75 2,00

Necrose Acinar score

controle 2,43 2,50 1,06 0,50 3,50 2,00 3,25

0,8366 Sham 2,30 2,50 1,32 0,00 4,00 1,50 3,50

Glutamina 2,75 2,75 0,46 2,00 3,50 2,50 3,00

Infiltrado Inflamatório score

controle 0,71 0,50 0,57 0,50 2,00 0,50 0,50

0,9640 Sham 0,80 0,50 0,63 0,00 2,00 0,50 1,50

Glutamina 0,75 0,50 0,46 0,50 1,50 0,50 1,00

Hemorragia score

Controle 0,29 0,00 0,39 0,00 1,00 0,00 0,50

0,7221 Sham 0,25 0,25 0,26 0,00 0,50 0,00 0,50

Glutamina 0,19 0,00 0,37 0,00 1,00 0,00 0,25

Necrose Gordurosa score

Controle 0,21 0,00 0,39 0,00 1,00 0,00 0,25

0,3754 Sham 0,30 0,25 0,35 0,00 1,00 0,00 0,50

Glutamina 0,50 0,50 0,46 0,00 1,00 0,00 1,00

Score

Controle 5,14 5,00 1,18 3,00 7,00 5,00 5,50

0,4632 Sham 5,30 5,75 2,38 1,50 8,00 3,00 7,50

Glutamina 6,06 6,00 0,94 5,00 7,50 5,25 6,75

Observamos que não houve nenhuma diferença estatisticamente

significativa.

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Figura 9 - Histologia do pâncreas representada pelo escore total 2 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções.

5.1.2 Tempo de 12 horas

Fizeram parte da análise desta fase 21 animais, utilizados para avaliação

dos biomarcadores heat shock protein (HSP) 70 e 90 no fígado e no pulmão,

citocinas séricas e da histologia do pâncreas.

5.1.2.1 HSP 90 no fígado após 12 horas de indução de PA

Encontrou-se aumento significativo da expressão da HSP 90 no tecido

hepático de animais do grupo glutamina, quando comparados ao grupo SHAM

(ANOVA, p = 0,001) e ao grupo salina (ANOVA, p= 0,0001). Os dados da

expressão da HSP 90 no fígado encontram-se na Figura 10.

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Figura 10 - Expressão (unidades arbitrárias - U.A.) de HSP 90 no fígado 12 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções.

5.1.2.2 HSP 90 no pulmão após 12 horas de indução de PA

Não foram encontradas diferenças estatísticas na expressão de HSP 90

no pulmão entre os grupos estudados, mas houve uma tendência ao aumento

no grupo glutamina quando comparado aos outros grupos (ANOVA, p =

0,0647). Os dados da expressão da HSP 90 no pulmão encontram-se na

Figura 11.

Figura 11 - Expressão (unidades arbitrárias - U.A.) de HSP 90 no pulmão 12 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções.

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5.1.2.3 HSP 70 no fígado após 12 horas de indução de PA

Encontrou-se aumento significativo da expressão da HSP 70 no tecido

hepático de animais do grupo glutamina, comparado ao grupo salina (ANOVA,

p = 0,0063) e uma tendência ao aumento no grupo glutamina quando

comparado ao grupo SHAM (ANOVA, p = 0,0664). Os dados da expressão da

HSP 70 no fígado encontram-se na Figura 12.

Figura 12 - Expressão (unidades arbitrárias - U.A.) de HSP 70 no fígado 12 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções.

5.1.2.4 HSP 70 no pulmão após 12 horas de indução de PA

Não foram encontradas diferenças estatísticas na expressão de HSP 70

no pulmão entre os grupos estudados, mas houve uma tendência ao aumento

no grupo glutamina quando comparado aos outros grupos (ANOVA, p =

0,0660). Os dados da expressão da HSP 70 no pulmão encontram-se na

Figura 13.

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Figura 13 - Expressão (unidades arbitrárias - U.A) de HSP 70 no pulmão 12 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções.

5.1.2.5 Citocinas séricas após 12 horas de indução de PA

Não foram encontradas diferenças entre os grupos na quantificação de

citocinas séricas IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-γ e TNF-α (ANOVA, p > 0,05)

após 12 horas de PA. Os resultados das dosagens de citocinas estão descritos

na Tabela 3.

Abaixo, temos alguns descritivos das variáveis quantitativas separados

pelos grupos, e o nível descritivo.

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Tabela 4 - Concentração sérica (pg/mL) de citocinas 12 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis

Variável Grupo Média Mediana Desvio Padrão

Mínimo Máximo 1º

Quartil 3º

Quartil P-valor

IL-1a

Controle ou Salina

22,42 15,60 18,05 6,13 60,29 11,40 31,86

0,5737 Glutamina 23,42 13,57 21,97 6,45 63,50 9,48 33,94

Sham 19,76 8,57 23,07 6,13 74,94 6,13 17,86

IL-4

Controle ou Salina

9,16 5,91 8,97 1,35 30,24 4,88 9,23

0,4642 Glutamina 8,99 5,91 7,32 2,17 20,64 3,91 15,38

Sham 11,05 2,17 22,20 1,35 69,72 1,35 6,98

IL-2

Controle ou Salina

46,38 49,40 39,19 3,57 114,00 10,97 72,34

0,8145 Glutamina 51,40 46,75 35,17 11,65 94,91 18,16 90,19

Sham 55,51 37,89 49,37 13,04 158,00 24,44 48,50

IL-6

Controle ou Salina

6099,39 220,00 9506,94 7,50 25288,00 50,13 12704,00

0,9715 Glutamina 6943,39 331,25 15874,90 25,16 39324,00 29,70 1619,00

Sham 2757,04 1789,00 3393,82 7,50 9654,00 113,00 5319,00

IL-10

Controle ou Salina

718,07 142,00 1160,21 36,67 3459,00 99,08 691,00

0,9645 Glutamina 965,41 482,50 1214,17 60,19 3181,00 65,28 1521,00

Sham 519,87 273,00 655,94 65,67 2032,00 96,09 617,00

IFNy

Controle ou Salina

14,61 6,50 16,62 6,50 51,29 6,50 6,50

0,9080 Glutamina 21,59 6,50 36,95 6,50 97,02 6,50 6,50

Sham 24,00 6,50 52,50 6,50 164,00 6,50 6,50

TNFa

Controle ou Salina

4,98 4,84 3,41 1,91 12,84 2,17 5,86

0,8624 Glutamina 4,73 3,91 2,91 1,92 8,44 2,17 8,05

Sham 7,79 4,19 9,19 1,91 30,72 2,43 9,21

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5.1.2.6 Histologia do pâncreas após 12 horas de indução de PA

Não foram encontradas diferenças da histologia pancreática entre os

grupos, referente à análise da somatória das variáveis: edema, necrose acinar,

inflamação e infiltrado perivascular, necrose gordurosa e hemorragia (ANOVA,

p = 0,606) - Figura 14.

Abaixo temos que alguns descritivos das variáveis quantitativas

separados pelos grupos, e o nível descritivo (Tabela 5).

Tabela 5 – Variáveis analisadas na histolologia de 12 horas

Variável Grupo Média Mediana Desvio Padrão

Mínimo Máximo 1º

Quartil 3º

Quartil P-valor

Edema

Score

Salina 1,9 2,0 0,5 1,5 2,5 1,5 2,5

0,0507 SHAM 1,6 1,5 0,5 1,0 3,0 1,5 1,5

Glutamina 2,3 2,5 0,4 1,5 2,5 2,5 2,5

Necrose

Salina 3,1 3,5 1,3 0,5 4,0 3,0 4,0

0,5139 SHAM 3,2 3,0 0,8 1,5 4,0 3,0 3,5

Glutamina 2,4 2,0 1,4 0,5 4,0 2,0 3,5

Inflamação

Salina 0,8 0,5 0,7 0,0 1,5 0,5 1,5

0,9845 SHAM 0,8 0,5 0,6 0,5 2,0 0,5 0,5

Glutamina 0,8 1,0 0,6 0,0 1,5 0,5 1,0

Hemorragia

Salina 0,3 0,0 0,5 0,0 1,5 0,0 0,5

0,8402 SHAM 0,2 0,0 0,4 0,0 1,0 0,0 0,0

Glutamina 0,2 0,0 0,3 0,0 0,5 0,0 0,5

Esteatonecrose

Salina 1,1 1,0 0,7 0,5 2,5 0,5 1,5

0,4146 SHAM 0,9 1,0 0,8 0,0 2,0 0,0 1,5

Glutamina 0,6 0,0 0,9 0,0 2,0 0,0 1,0

Score

Total

Salina 7,3 7,0 2,1 4,0 9,5 6,0 9,0

0,6064 SHAM 6,6 6,0 1,4 4,5 9,0 6,0 7,5

Glutamina 6,3 6,0 2,1 4,5 9,5 4,5 7,0

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Figura 14 - Histologia do pâncreas representada pelo escore total 12 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções.

5.1.3 Tempo de 24 horas

Fizeram parte da análise desta fase 20 animais, utilizados para avaliação

dos biomarcadores heat shock protein (HSP) 70 e 90 no fígado e no pulmão, e

citocinas séricas.

5.1.3.1 Citocinas séricas após 24 horas de indução de PA

Não foram encontradas diferenças entre os grupos na quantificação de

citocinas séricas IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-γ e TNF-α (ANOVA, p > 0,05)

após 24 horas de PA. Os resultados das dosagens de citocinas estão descritos

na Tabela 7.

A seguir, temos alguns descritivos das variáveis quantitativas separados

pelos grupos, e o nível descritivo.

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Tabela 6 – Concentração sérica (pg/mL) de citocinas 24 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis

Variável grupo Média Mediana Desvio Padrão

Mínimo Máximo 1º

Quartil 3º

Quartil P-valor

IL-1a

Salina 41,22 1,84 68,75 1,84 189,00 1,84 46,08

0,5830 Sham 75,82 72,61 72,43 1,84 178,00 1,84 128,00

Glutamina 40,85 12,49 78,00 1,84 216,00 1,84 25,98

IL-4

Salina 15,40 1,30 27,62 1,30 76,46 1,30 13,10

0,3978 Sham 22,55 19,72 21,10 1,30 50,47 1,30 42,82

Glutamina 12,02 1,30 25,34 1,30 69,17 1,30 4,88

IL-2

Salina 74,02 74,03 57,64 7,43 148,00 27,12 117,21

0,2495 Sham 138,45 135,50 78,61 43,37 267,00 83,31 166,00

Glutamina 100,00 70,94 109,02 0,58 258,00 17,49 167,75

IL-6

Salina 592,41 369,00 639,52 75,42 1801,00 184,21 766,50

0,4577 Sham 419,80 464,50 237,85 21,79 676,00 293,00 599,00

Glutamina 1962,68 903,00 3423,10 21,79 9663,00 486,50 1089,00

IL-10

Salina 117,63 65,83 119,10 27,02 295,00 34,62 183,18

0,5535 Sham 47,85 51,42 27,81 0,96 86,12 39,50 57,66

Glutamina 107,99 77,82 106,33 0,96 318,00 54,16 125,41

IFNy

Salina 20,15 4,01 42,71 4,01 117,00 4,01 4,01

0,7764 Sham 23,70 4,01 30,50 4,01 63,08 4,01 63,08

Glutamina 49,58 4,01 120,57 4,01 323,00 4,01 4,01

TNFa

Salina 17,11 13,02 11,75 5,43 36,38 9,19 23,27

0,5788 Sham 23,41 22,27 16,02 0,07 43,34 14,12 38,39

Glutamina 17,88 16,31 21,73 0,07 63,92 3,94 18,50

Observamos que não houve diferença estatisticamente significativa.

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5.1.3.2 HSP 70 no pulmão após 24 horas de indução de PA

Encontrou-se aumento significativo da expressão da HSP 70 no tecido

pulmonar de animais do grupo Sham, comparado ao grupo salina (ANOVA, p =

0,0041) e ao grupo glutamina (ANOVA, p < 0,0001). Os dados da expressão da

HSP 70 no pulmão encontram-se na Figura 15.

Figura 15 - Expressão (unidades arbitrárias - U.A) de HSP 70 no pulmão 24 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções.

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5.1.3.3 HSP 90 no fígado após 24 horas de indução de PA

Encontrou-se aumento significativo da expressão da HSP 90 no tecido

hepático de animais do grupo Sham, comparado ao grupo salina (ANOVA, p =

0,0003) e ao grupo glutamina (ANOVA, p < 0,0001). Os dados da expressão da

HSP 90 no fígado encontram-se na Figura 16.

Figura 16 - Expressão (unidades arbitrárias - U.A.) de HSP 90 no fígado 24 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções.

5.2 Analise cinética de citocinas

Com o intuito de se avaliar o comportamento cinético das citocinas,

realizou-se a análise nos diferentes tempos nos grupos.

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55

5.2.1 Comparação da cinética de citocinas nos diferentes tempos

5.2.1.1 Grupo Salina

Abaixo, temos os descritivos das variáveis quantitativas separados pelos

tempos, e o nível descritivo.

Tabela 7 – Concentração sérica (pg/mL) de citocinas nos tempos analisados após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis que receberam infusão parenteral de solução salina

Variável Grupo Média Mediana Desvio Padrão

Mínimo Máximo 1º

Quartil 3º

Quartil P-valor

IL-1a

2 Hrs 38,70 14,41 56,71 4,67 171,00 4,67 47,89

0,5867 12 Hrs 22,42 15,60 18,05 6,13 60,29 11,40 31,86

24 Hrs 41,22 1,84 68,75 1,84 189,00 1,84 46,08

IL-4

2 Hrs 6,72 3,98 5,10 3,98 16,02 3,98 8,90

0,5142 12 Hrs 9,16 5,91 8,97 1,35 30,24 4,88 9,23

24 Hrs 15,40 1,30 27,62 1,30 76,46 1,30 13,10

IL-2

2 Hrs 32,22 25,50 22,67 13,30 86,43 22,32 31,21

0,3925 12 Hrs 46,38 49,40 39,19 3,57 114,00 10,97 72,34

24 Hrs 74,02 74,03 57,64 7,43 148,00 27,12 117,21

IL-6

2 Hrs 496,82 200,00 939,53 33,11 2809,00 76,71 289,50

0,6244 12 Hrs 6099,39 220,00 9506,94 7,50 25288,00 50,13 12704,00

24 Hrs 592,41 369,00 639,52 75,42 1801,00 184,21 766,50

IL-10

2 Hrs 513,63 400,00 422,09 110,00 1490,00 294,50 560,00

0,0245 12 Hrs 718,07 142,00 1160,21 36,67 3459,00 99,08 691,00

24 Hrs 117,63 65,83 119,10 27,02 295,00 34,62 183,18

IFNy

2 Hrs 74,01 72,62 52,86 22,15 185,00 30,44 89,41

0,0016 12 Hrs 14,61 6,50 16,62 6,50 51,29 6,50 6,50

24 Hrs 20,15 4,01 42,71 4,01 117,00 4,01 4,01

TNFa

2 Hrs 11,10 8,44 11,52 1,82 34,53 1,82 15,97

0,0596 12 Hrs 4,98 4,84 3,41 1,91 12,84 2,17 5,86

24 Hrs 17,11 13,02 11,75 5,43 36,38 9,19 23,27

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56

Observamos que as variáveis IL-10 (p-valor = 0,0245), e IFNy (p-valor =

0,0016) foram estatisticamente significativas. Abaixo, temos as comparações

múltiplas para cada variável (Tabela 8).

IL-10

Tabela 8 – Comparação cinética da variável IL 10 no grupo Salina

Comparação p-valor

2 Hrs 12 Hrs 0,7136

2 Hrs 24 Hrs 0,0004

12 Hrs 24 Hrs 0,2321

Temos que houve diferença significativa entre o grupo 2 horas e 24

horas (p-valor = 0,0004).

IFNy

Tabela 9 – Comparação cinética da variável IFn y no grupo Salina

Comparação p-valor

2 Hrs 12 Hrs 0,0010

2 Hrs 24 Hrs 0,0500

12 Hrs 24 Hrs 0,0904

Temos que houve diferença significativa entre o grupo 2 horas e 12 horas

(p-valor = 0,0010), e entre as 2 horas e 24 horas (p-valor = 0,0500).

5.2.1.2 Grupo SHAM

A seguir, temos os descritivos das variáveis quantitativas separados pelos

tempos, e o nível descritivo.

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57

Tabela 10 – Concentração sérica (pg/mL) de citocinas nos tempos analisados após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis que não receberam infusão parenteral

Variável Grupo Média Mediana Desvio Padrão

Mínimo Máximo 1º

Quartil 3º

Quartil P-valor

IL-1a

2 Hrs 33,28 8,47 51,89 4,67 166,00 4,67 47,89

0,6202 12 Hrs 19,76 8,57 23,07 6,13 74,94 6,13 17,86

24 Hrs 75,82 72,61 72,43 1,84 178,00 1,84 128,00

IL-4

2 Hrs 6,16 3,98 5,28 3,98 20,38 3,98 3,98

0,5555 12 Hrs 11,05 2,17 22,20 1,35 69,72 1,35 6,98

24 Hrs 22,55 19,72 21,10 1,30 50,47 1,30 42,82

IL-2

2 Hrs 25,39 23,10 11,35 11,90 43,91 17,69 33,71

0,0020 12 Hrs 55,51 37,89 49,37 13,04 158,00 24,44 48,50

24 Hrs 138,45 135,50 78,61 43,37 267,00 83,31 166,00

IL-6

2 Hrs 1731,03 336,00 2687,18 33,11 7943,00 33,11 3135,00

0,8484 12 Hrs 2757,04 1789,00 3393,82 7,50 9654,00 113,00 5319,00

24 Hrs 419,80 464,50 237,85 21,79 676,00 293,00 599,00

IL-10

2 Hrs 339,05 336,50 211,34 81,30 662,00 168,00 482,00

0,0027 12 Hrs 519,87 273,00 655,94 65,67 2032,00 96,09 617,00

24 Hrs 47,85 51,42 27,81 0,96 86,12 39,50 57,66

IFNy

2 Hrs 96,69 85,25 64,21 47,18 272,00 64,15 93,61

0,0014 12 Hrs 24,00 6,50 52,50 6,50 164,00 6,50 6,50

24 Hrs 23,70 4,01 30,50 4,01 63,08 4,01 63,08

TNFa

2 Hrs 6,18 1,82 7,89 1,82 24,96 1,82 8,53

0,0506 12 Hrs 7,79 4,19 9,19 1,91 30,72 2,43 9,21

24 Hrs 23,41 22,27 16,02 0,07 43,34 14,12 38,39

Observamos que as variáveis IL-2 (p-valor = 0,0020), IL-10 (p-valor =

0,0027), e IFNy (p-valor = 0,0014) foram estatisticamente significativas. Abaixo,

temos as comparações múltiplas para cada variável.

IL-2

Tabela 11 – Comparação cinética da variável IL-2 no grupo Sham

Comparação p-valor

2 Hrs 12 Hrs 0,1203

2 Hrs 24 Hrs <0,0001

12 Hrs 24 Hrs 0,0047

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58

Temos que houve diferença significativa entre o grupo 2 horas e 24 horas

(p-valor = 0,0001), e entre as 12 horas e 24 horas (p-valor = 0,0047).

IL-10

Tabela 12 – Comparação cinética da variável IL-10 no grupo Sham

Comparação p-valor

2 Hrs 12 Hrs 0,9915

2 Hrs 24 Hrs <0,0001

12 Hrs 24 Hrs <0,0001

Temos que houve diferença significativa entre o grupo 2 horas e 24 horas

(p-valor < 0,0001), e entre as 12 horas e 24 horas (p-valor < 0,0001).

IFNy

Tabela 13 – Comparação cinética da variável IFn y no grupo Sham

Comparação p-valor

2 Hrs 12 Hrs 0,0258

2 Hrs 24 Hrs 0,0019

12 Hrs 24 Hrs 0,6231

Temos que houve diferença significativa entre o grupo 2 horas e 12 horas

(p-valor = 0,0258), e entre as 2 horas e 24 horas (p-valor = 0,0019).

5.2.1.3 Grupo Glutamina

A seguir, temos alguns descritivos das variáveis quantitativas separados

pelos grupos (tempos), e o nível descritivo.

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59

Tabela 14 – Concentração sérica (pg/mL) de citocinas nos tempos analisados após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis que não receberam infusão parenteral de Glutamina

Variável Grupo Média Mediana Desvio Padrão

Mínimo Máximo 1º

Quartil 3º

Quartil P-valor

IL-1a

2 Hrs 12,46 4,67 17,97 4,67 59,56 4,67 12,27

0,2916 12 Hrs 23,42 13,57 21,97 6,45 63,50 9,48 33,94

24 Hrs 40,85 12,49 78,00 1,84 216,00 1,84 25,98

IL-4

2 Hrs 7,08 3,98 8,93 3,98 30,87 3,98 3,98

0,1645 12 Hrs 8,99 5,91 7,32 2,17 20,64 3,91 15,38

24 Hrs 12,02 1,30 25,34 1,30 69,17 1,30 4,88

IL-2

2 Hrs 31,89 23,89 27,23 4,50 97,24 22,31 30,38

0,5394 12 Hrs 51,40 46,75 35,17 11,65 94,91 18,16 90,19

24 Hrs 100,00 70,94 109,02 0,58 258,00 17,49 167,75

IL-6

2 Hrs 444,29 178,00 586,11 33,11 1712,00 33,11 452,00

0,6114 12 Hrs 6943,39 331,25 15874,90 25,16 39324,00 29,70 1619,00

24 Hrs 1962,68 903,00 3423,10 21,79 9663,00 486,50 1089,00

IL-10

2 Hrs 716,00 539,00 569,28 144,00 1960,00 298,00 893,00

0,0258 12 Hrs 965,41 482,50 1214,17 60,19 3181,00 65,28 1521,00

24 Hrs 107,99 77,82 106,33 0,96 318,00 54,16 125,41

IFNy

2 Hrs 62,51 55,67 38,64 10,40 154,00 55,67 64,15

0,0077 12 Hrs 21,59 6,50 36,95 6,50 97,02 6,50 6,50

24 Hrs 49,58 4,01 120,57 4,01 323,00 4,01 4,01

TNFa

2 Hrs 8,83 11,22 6,34 1,82 18,49 1,82 11,22

0,3330 12 Hrs 4,73 3,91 2,91 1,92 8,44 2,17 8,05

24 Hrs 17,88 16,31 21,73 0,07 63,92 3,94 18,50

Observamos que as variáveis IL-10 (p-valor = 0,0258), e IFNy (p-valor =

0,0077) foram estatisticamente significativas. Abaixo, temos as comparações

múltiplas para cada variável.

IL-10

Tabela 15 – Comparação cinética da variável IL-10 no grupo Glutamina

Comparação p-valor

2 Hrs 12 Hrs 0,9925

2 Hrs 24 Hrs 0,0007

12 Hrs 24 Hrs 0,3849

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60

Temos que houve diferença significativa entre o grupo 2 horas e 24 horas

(p-valor = 0,0007).

IFNy

Tabela 16 – Comparação cinética da variável IFn y no grupo Glutamina

Comparação p-valor

2 Hrs 12 Hrs 0,1174

2 Hrs 24 Hrs 0,0990

12 Hrs 24 Hrs 0,0989

Não conseguimos encontrar onde houve a significância. Mas o tempo

diferenciou dos demais com um nível de significância de 10% (o p-valor foi de,

aproximadamente, 0,099 em ambos).

Os gráficos a seguir, representam o perfil cinético das interleucinas que

apresentaram diferença significativa (p ≤ 0,05 ) ou tendência (Figuras 17,18, 19

e 20).

Figura 17 - Concentração sérica (pg/mL) de IL-2 nos grupos estudados em diferentes tempos após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis

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61

Figura 18 - Concentração sérica (pg/mL) de IL-10 nos grupos estudados em diferentes tempos após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis

Figura 19 - Concentração sérica (pg/mL) de IFNy nos grupos estudados em diferentes tempos após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis

Figura 20 - Concentração sérica (pg/mL) de TNF nos grupos estudados em diferentes tempos após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis

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62

Figura 21 – Visão geral do comportamento das concentrações séricas (pg/mL) de IFNy, IL-2, IL-10, e TNF nos grupos estudados em diferentes tempos após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis

5.3 Fase 2 – Estudo da mortalidade de 7 dias de animais que receberam infusão de glutamina ou solução salina e animais que não receberam infusão parenteral prévia à indução de PA

5.3.1 Mortalidade

Considerando todos os grupos experimentais, observamos que não

houve associação entre o sacrifício no sétimo dia com os grupos (Teste Exato

de Fisher, p= 0,5183) – Tabela 17.

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63

Tabela 17 – Contingência entre as variáveis qualitativas com o grupos

Grupo

Sacrifício Total

Sim Não

N % N % N %

Soro 8 27,6% 7 46,7% 15 34,1%

Glutamina 8 27,6% 3 20,0% 11 25,0%

SHAM 13 44,8% 5 33,3% 18 40,9%

Total 29 100,0% 15 100,0% 44 100,0%

Legenda: N - animais que apresentaram evento de morte antes do sétimo dia S – animais que chegaram até o sétimo dia e foram sacrificados

5.3.2 Análise da sobrevida

Observamos que o grupo controle teve uma curva de sobrevida menor

que os demais. O p-valor pelo teste de log rank foi de 0,438. Assim, não

podemos afirmar que há diferença entre as curvas de sobrevida.

Abaixo, temos a tabela com o número total de casos em cada grupo, e o

número de eventos (óbitos).

Tabela 18 – Número de eventos de morte nos diferentes grupos até o 7º dia

Grupo Total Número de

eventos

Controle 15 7

Glutamina 11 3

SHAM 18 5

A seguir, temos a curva de sobrevida (Kapla-Meier).

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64

Figura 22 - Curva de sobrevida dos animais nos diferentes grupos até o sétimo dia

5.4 Perda de peso

Apesar de não proposto no plano de pesquisa inicial do presente estudo,

a análise da perda de peso dos animais após a infusão parenteral das soluções

propostas e antes da indução da pancreatite aguda também foi investigada.

Encontramos maior perda de peso no grupo SHAM, quando comparado aos

outros grupos experimentais, porém sem significância estatística (Kruskall-

Wallis, p= 0,9373) – (Anexo A) e Figuras 23, 24 e 25.

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65

Figura 23 - Perda de peso (g) de ratos Lewis prévio à infusão parenteral de diferentes soluções

Figura 24 - Perda de peso (g) de ratos Lewis após a infusão parenteral de diferentes soluções

Figura 25 - Delta peso (g) de ratos Lewis após a infusão parenteral de diferentes soluções e prévio à indução de PA

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6 DISCUSSÃO

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69

6 DISCUSSÃO

6.1 Do método

6.1.1 Dos animais

Estudos experimentais com ratos têm sido amplamente utilizados devido

à facilidade de manuseio, adaptação ao ambiente laboratorial e reprodução de

modelos de pesquisa.52

Ratos da linhagem Lewis são considerados isogênicos e foram

elaborados a partir do cruzamento de animais consanguíneos por gerações

consecutivas, gerando populações estáveis e geneticamente homogêneas.53

A homogeneidade genética possibilita a redução do número de animais

por experimento pela maior uniformidade dos resultados encontrados.54,55 Uma

de suas principais indicações são em modelos inflamatórios experimentais.56

A opção por animais do mesmo sexo foi a escolhida com o intuito de se

evitar possíveis alterações hormonais.

6.1.2 Do delineamento experimental

Acesso venoso: conforme técnica padronizada por Lima-Gonçalves e

colaboradores, realizamos a cateterização da veia jugular externa, amplamente

utilizada em estudos prévios realizados pelo nosso grupo.57-60

A utilização do cateter venoso de silicone acoplado à peça giratória

intermediária (Swivel) desenvolvida artesanalmente pelo Grupo METANUTRI,

em parceria com a Escola Politécnica da USP, viabilizou a livre-movimentação

dos animais e possibilitou a infusão das soluções propostas sem

intercorrências, já que permite a total mobilização do animal dentro das gaiolas

individuais.61

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70

Outra característica peculiar deste modelo de cateterização é que esta

permitiu a infusão de soluções com diferentes osmolaridades sem

complicações.

6.1.3 Da Infusão parenteral

6.1.3.1 Glutamina parenteral

A Gln atua como um aminoácido essencial durante o estresse catabólico

e condições críticas. Representa importante fonte de combustível para

linfócitos e enterócitos, substrato para a glutationa e a síntese de proteínas de

choque térmico (HSP).62-64 Estas propriedades biológicas associadas a sua

variedade de formas de atuação podem contribuir para melhorar a função da

barreira intestinal e linfócitos, atenuar a resposta inflamatória e preservar

diversas funções metabólicas.65-67

A administração intravenosa da Gln permite sua rápida disponibilidade

para o uso das células e, possivelmente, pode ser vantajosa em conseguir a

modulação inflamatória e proteção celular em estados inflamatórios.

Por ser muito instável em sua apresentação original, é, frequentemente,

utilizada sob a forma de dipeptídeo L alanil-glutamina. Deste modo, a Gln

possui boa estabilidade e uma meia-vida de minutos, o que confere adequado

perfil de segurança a sua administração.

Na presente pesquisa, a infusão de Gln na forma de dipeptídeo ocorreu

na dose de 1 g/kg/dia na velocidade de 0,3 ml/hora pelo período de 48 horas

previamente à indução de PA não se detectando nenhum sinal de

deteriorização clínica dos animais. Estudo clínico mostrou que a intervenção

farmacológica com Gln na dose entre 0,35 a 0,5 g/kg/dia pode ser uma

intervenção salva-vidas em grupos bem definidos de pacientes críticos.68

Em Metanálise publicada por Zheng e colaboradores, a nutrição

parenteral suplementada com dipeptídeo de Gln melhorou o balanço

nitrogenado, preservou função de órgãos vitais, reduziu riscos de infecções,

favoreceu a proliferação de células do sistema imunológico e citocinas anti-

Page 93: Efeito da administração parenteral de glutamina sobre a ......inflamatória sistêmica 6.Pancreatite necrosante aguda 7.Ratos 8.Mortalidade USP/FM/DBD-356/15 Trabalho realizado no

71

inflamatórias, e, principalmente, reduziu a mortalidade pós-operatória em

cirurgias de grande porte sem causar qualquer efeito colateral.69

Devido ao seu rápido metabolismo, o rato tem excelente tolerância à

administração endovenosa de Gln. O fornecimento endovenoso diário de altas

doses de glutamina na forma de dipeptídeo evidenciou que estes animais não

apresentam reações clínicas expressivas ou fatais.70

É fato, também, que a Gln, devido a suas características de atuação por

diversas vias e mecanismos na cascata inflamatória, vem sendo utilizada nos

estudos como forma de atenuar a inflamação na doença já instalada ou seja

como uma aliada no tratamento, e quanto mais precoce a sua suplementação

melhor os resultados em termos de complicações clínicas, infecciosas e na

mortalidade.71

Wischmeyer, em recente publicação envolvendo mais de 2000 pacientes,

concluiu que a suplementação parenteral de Gln, quando associado ao suporte

nutricional, está associada à significante redução na mortalidade hospitalar e

tempo de internação.3 De forma distinta, Chen e colaboradores concluíram que

a suplementação de Gln não trouxe benefícios na mortalidade e no tempo de

internação hospitalar em pacientes críticos, exceção feita à população de

pacientes cirúrgicos. No entanto, houve redução na taxa de infecção hospitalar.

Os dados sugerem que os efeitos da suplementação de Gln estão diretamente

relacionados à população-alvo da terapia, vias de administração e doses.4

Corroborando ainda mais com a conflitante literatura sobre o uso da Gln,

recentes ensaios clínicos randomizados de grande escala não encontraram

efeitos benéficos da suplementação de glutamina em pacientes com doença

crítica e deixou em aberto diversos questionamentos sobre o tema.

Em estudo realizado com 1223 pacientes críticos que receberam Gln em

altas doses com o intuito de fármaco nutrição, independente da nutrição

artificial, publicado por Heyland e colaboradores, conclui que houve aumento

da mortalidade.6 Seguindo a mesma linha de conclusão, o estudo Metaplus trial

mostrou que dieta enteral enriquecida com Gln levou ao aumento da

mortalidade após 6 meses no grupo suplementado.72

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72

Com o intuito de analisar as potenciais heterogeneidades entre os

diferentes grupos de pacientes estudados até o momento e as diferentes vias

para a administração de Gln, Tao e colaboradores conduziram uma revisão de

53 estudos. Encontrou-se evidência moderada de que a suplementação de Gln

reduziu a taxa de infecção e de dias de ventilação mecânica, e evidências de

baixa qualidade no que diz respeito ao tempo de internação hospitalar em

pacientes criticamente doentes ou cirúrgicos. Quanto à mortalidade e ao tempo

de internação em UTI, a suplementação com Gln parece ter pouco ou nenhum

efeito.73

Possível explicação para a enorme heterogeneidade e não uniformidade

sobre os resultados foi discutido em revisão que analisou publicações dos

últimos vinte anos e concluiu que estudos até 2003 mostram efeitos benéficos

enquanto os mais recentes falharam em demonstrar efeitos positivos com a

suplementação de Gln.74

Diversos estudos tentaram explorar os efeitos benéficos atribuídos a Gln

parenteral na condição de PA.

Primeiramente, foram elaboradas estratégias de suplementação

associadas à prescrição de nutrição artificial. Fuentes-Orosco concluiu, em

estudo conduzido com pacientes portadores de PA grave, que a

suplementação de Gln associado à nutrição parenteral foi capaz de reduzir

complicações infecciosas e melhorar o perfil inflamatório sem alteração na

duração de permanência hospitalar, bem como, na taxa de mortalidade.75

De modo concordante com estes dados, Jafari e colaboradores

conduziram metanálise que mostrou menor taxa de complicações infecciosas

com a suplementação parenteral de GLN, mas, agora, acrescida de melhora na

taxa de mortalidade e no tempo de internação.76

Tendo como base as evidências e perspectivas positivas, diversos

autores seguiram sugerindo que a suplementação com Gln deveria ser

estimulada devido aos aparentes benefícios conferidos à população de doentes

com PA e condições críticas, e que novos estudos com delineamentos bem

detalhados e perfil de custo da suplementação deveriam ser

desenvolvidos.77-79

Page 95: Efeito da administração parenteral de glutamina sobre a ......inflamatória sistêmica 6.Pancreatite necrosante aguda 7.Ratos 8.Mortalidade USP/FM/DBD-356/15 Trabalho realizado no

73

Assim posto, após resultados conflitantes apresentados, principalmente,

na população de doentes críticos, metanálise conduzida por Yong e

colaboradores concluiu que, na pancreatite aguda severa, a suplementação

endovenosa de Gln representa a melhor escolha quando comparada a outros

modelos de nutrição convencionais sem aumento nos custos hospitalares, fato

também observado por Ochenga e colaboradores.80,81

Seguindo pela mesma linha de raciocínio científico, no que se refere à

melhor via de suplementação, Metanálise com, aproximadamente, 505 doentes

concluiu que a Gln suplementada pela via parenteral apresenta vantagens

superiores a outras vias, e que pacientes que recebem nutrição enteral não são

beneficiados com a suplementação parenteral de Gln.82

Como vimos ao longo desta discussão, ainda que numerosos estudos

publicados sugiram vantagens com a suplementação de Gln na PA, recente

revisão sistemática sobre a utilização de antioxidantes nesta condição concluiu

que, embora haja um possível benefício, a utilização de Gln deve ser mais bem

observada em grandes estudos randomizados e bem conduzidos.83

Alguns aspectos da presente pesquisa a tornam pioneira na literatura

sobre o assunto. Como observamos, a utilização da Gln está quase sempre

associada a algum esquema de prescrição nutricional seja ela enteral ou

parenteral.

Nosso protocolo considerou infundir, pela via parenteral, Gln previamente

à PA, como um agente imunomodulator independente da terapia nutricional.

Esta abordagem representa uma vertente contemporânea em usar imuno-

fármaco-nutrientes como uma ferramenta terapêutica. Publicação de

Fernandez-Bustamante mostrou que o breve tratamento com Gln enteral

prévio à inoculação de lps e IL 1 foi capaz de melhorar o perfil de resposta em

macrófagos e capilares alveolares de ratos.84

Não obstante a utilização prévia ao insulto ser característica peculiar de

poucas pesquisas, estudos recentes vêm desenvolvendo a hipótese da

imunomodulação, na tentativa de favorecer o curso clínico da PA baseados nas

evidências previamente descritas.85-87

Page 96: Efeito da administração parenteral de glutamina sobre a ......inflamatória sistêmica 6.Pancreatite necrosante aguda 7.Ratos 8.Mortalidade USP/FM/DBD-356/15 Trabalho realizado no

74

Pesquisa experimental recentemente publicada explorou os efeitos da Gln

isolada no tratamento da pancreatite induzida em ratos e concluiu que sua

utilização foi capaz de melhorar as funções cardiovascular, hepática, pulmonar

e renal, assim como a microcirculação pancreática, e diminuir os níveis de

interleucinas pró-inflamatórias, principalmente IL 6, e a mortalidade.88

Embora evidências em pesquisa experimental demonstrarem benefícios

em diversos parâmetros com a fármaco-modulação, existem, até o momento,

terapias farmacológicas promissoras com alvo em vários aspectos da

patogênese da PA que não podem ser plenamente aplicadas na prática clínica.

A dificuldade em se saber o momento exato de intervenção associada à

intensidade da resposta inflamatória faz com que várias tentativas de

imunomodulação isoladamente fracassem.

A PA representa complexa cascata de resposta inflamatória, e, diante

deste conhecimento, a estratégia multimodal com diferentes agentes

farmacológicos ou um fármaco-modulador capaz de agir em diferentes vias

pode proporcionar maiores benefícios.89

Nesta pesquisa, a eleição da Gln parenteral isolada prévia ao insulto

inflamatório representa uma nova hipótese de abordagem em condições de

estresse, com o intuito de modular favoravelmente a inflamação, diante das

várias formas de atuação deste nutriente.

6.1.3.2 Solução salina parenteral

Sabidamente, a PA, devido à intensa resposta inflamatória local e

sistêmica, cursa com alterações precoces na microcirculação pancreática e no

sequestro líquido, com impacto negativo na patogênese e gravidade da

doença. Associado a isto, desordens circulatórias na parede intestinal facilitam

a translocação bacteriana e perpetuam o mecanismo de inflamação associado

à infecção, levando à falência múltipla de órgãos.90,91

Dentre as medidas não específicas utilizadas com o intuito de se evitar

maiores repercussões clínicas da doença, a agressiva reposição volêmica é

fundamental para a prevenção de complicações sistêmicas e visa estabilizar a

Page 97: Efeito da administração parenteral de glutamina sobre a ......inflamatória sistêmica 6.Pancreatite necrosante aguda 7.Ratos 8.Mortalidade USP/FM/DBD-356/15 Trabalho realizado no

75

permeabilidade capilar, modular a reação inflamatória, e sustentar a função da

barreira intestinal.92-95

Optamos pela utilização da solução salina composta por fluidos

cristaloides adicionada com eletrólitos como controle devido a ser a mais

utilizada na ressuscitação volêmica da PA. Objetivou-se preparar o pâncreas

para o insulto de inflamação por meio da melhora da perfusão microcirculatória

e da oxigenação.

6.2 Do modelo de pancreatite experimental

O desenvolvimento de técnicas e modelos experimentais de PA que

buscam se assemelhar à situação humana são largamente utilizados em

pesquisa. A indução de repercussão inflamatória local e sistêmica são uma

ferramenta essencial para aumentar a compreensão dos complexos

mecanismos envolvidos na etiologia, na patogênese e na elaboração de

estratégias terapêuticas para esta doença, principalmente para teste com

novas terapias de regulação do sistema imunológico.96

De modo geral, o modelo ideal de PA deve ter diversos atributos, dentre

os quais, ser facilmente reproduzido, ter a capacidade de controlar a gravidade

da doença e baixo custo. Tendo em vista as restrições metodológicas dos

modelos de PA estabelecidos para a investigação terapêutica, muitas tentativas

têm sido feitas para desenvolver, modificar ou combinar modelos disponíveis.

Embora nenhum dos modelos existentes seja completamente satisfatório e

totalmente comparável com todo o espectro da PA humana, estes não devem

ser descartados por completo. Muito do conhecimento atual sobre a doença

tem origem a partir dos modelos experimentais. Estes podem ser divididos em

variedades invasivas e não invasivas de acordo com o método de indução da

PA. Modelos não invasivos são representados pela administração de ceruleína,

álcool, dietas específicas, arginina, manipulações genéticas e imunológicas. Os

modelos invasivos envolvem a manipulação cirúrgica do animal e consistem de

alterações e oclusões anatômicas, alterações perfusionais e vasculares, e a

injeção de sais biliares no ducto pancreático.97

Page 98: Efeito da administração parenteral de glutamina sobre a ......inflamatória sistêmica 6.Pancreatite necrosante aguda 7.Ratos 8.Mortalidade USP/FM/DBD-356/15 Trabalho realizado no

76

Sabe-se, porém, que, apesar de certos modelos serem mais adequados

que outros para responder perguntas específicas, um dos fatores mais

relevantes em termos práticos é a padronização técnica.

Neste sentido, após extenso treinamento prático e teórico, optou-se pelo

método invasivo de infusão sob pressão constante de ácido taurocólico a 3%

através do ducto biliar comum. Em ratos, esta técnica é relatada como um

modelo representativo da fisiopatologia da doença, com resposta inflamatória

sistêmica grave e como ferramenta bem definida para avaliar a falência múltipla

de órgãos, refletindo os mesmos acontecimentos observados na prática

clínica.97-100

A técnica foi desenvolvida durante toda a pesquisa por um único

pesquisador e reproduzindo, em todas as etapas, a metodologia previamente

publicada pelo grupo.101-103

Com este modelo, no período de 2 a 24h após infusão, ocorre a PA aguda

com uma taxa de mortalidade aproximada de até 25% em 72 horas.97

O conhecimento das características deste modelo de PA determinaram o

início da observação dos mediadores inflamatórios e sacrifício a partir de 2

horas após a indução de PA corroborando com os dados publicados por

Schneider e colaboradores.104 Neste modelo, sabe-se, também que, após 24

horas de PA, há importante injúria da barreira intestinal com sobreposição de

mecanismos infecciosos sobre os inflamatórios, o que nos fez limitar o período

de análise neste tempo.105

Certamente, a transposição de achados experimentais para a

interpretação de eventos inflamatórios que ocorrem em doenças humanas

requer cautela e senso crítico, mas podem ser aproveitados no propósito de se

estudar os mecanismos indutores e perpetuadores da inflamação, assim como

fatores imunorreguladores e mediadores do processo, e estabelecer sugestões

e caminhos que possam trazer benefícios ao tratamento.

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77

6.3 Das variáveis clínicas e laboratoriais

6.3.1 Peso

Todos os animais estudados foram submetidos à análise da perda de

peso antes e após a infusão parenteral das soluções propostas. Com isto,

objetivamos diminuir o viés nutricional imediatamente anterior à indução de PA.

Todos os grupos estudados apresentaram perda de peso no intervalo de

infusão parenteral. É possível que a perda de peso observada tenha sido em

decorrência do estresse cirúrgico e da presença do cateter venoso central.

6.3.2 Amilase

A Amilase sérica após 2 horas de indução de PA foi avaliada para

comprovarmos a eficácia do modelo experimental de indução de PA.

Todos os animais estudados apresentam aumento importante dos níveis

de amilase no período.

A análise em períodos superiores (12 e 24h) pode ser influenciada pela

extensão da necrose pancreática e seus valores podem não ser fidedignos

para se estabelecer a extensão inflamatória e, até mesmo, a gravidade da

doença.106

De modo não consensual, a literatura considera que o nível de amilase

pode representar parâmetro de gravidade em modelo experimental com

animais, entretanto, na doença humana, tal observação não se faz

verdadeira.107,108

Embora não foram encontradas diferenças estatísticas na análise da

amilase sérica, ao avaliarmos sua variabilidade entre os grupos, notamos que

esta foi maior nos animais SHAM, em comparação aos grupos Gln e Controle,

e que animais do grupo Gln apresentaram a menor variabilidade desse

marcador, em comparação com os outros grupos. De modo empírico, podemos

inferir que a infusão tanto de glutamina quanto de solução salina parece

modular e organizar favoravelmente a liberação de amilase neste modelo.

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78

6.4 Das variáveis inflamatórias

Investigações prévias demonstram que o desenvolvimento da PA exibe

uma estreita relação com o desequilíbrio do sistema imunológico. A significativa

liberação dos mediadores pró-inflamatórias (IL-1, IL-6 e TNF-α) na fase inicial

da doença é reportada como prejudicial ao prognóstico e desfecho

clínico.24,109-111

Devido a complexos mecanismos envolvidos na liberação e curso da

inflamacão mediada por citocinas, modelos animais vem sendo testados na

tentativa de se determinar a cinética destes biomarcadores.112

Em estudo experimental no modelo de PA induzida por taurocolato de

sódio Meyer e colaboradores evidenciaram o aumento precoce de citocinas

pró-inflamatórias e anti-inflamatórias apos 2 h.113

No presente estudo a infusão parenteral de Gln previa a indução de PA

não evidenciou alterações significativas nos níveis séricos das citocinas

estudadas quando comparadas entre os grupos.

Dados publicados em estudo conduzido por Yu e colaboradores

evidenciaram que o perfil de expressão das citocinas segue um cronograma

temporal definido em ratos submetidos a PA. Ao analisarem o perfil cinético

das citocinas (IL-1, TNF-α e IL-6) concluiram que houve um rapido aumento

apos 3 hs de inducao de PA, com pico aproximado por volta de 6 h e declinio

no periodo de 12 a 24 h.114

Com base neste conhecimento realizamos a analise do perfil cinetico das

citocinas estudadas nos diferente grupos. Evidenciamos uma tendência ao

aumento nos níveis de TNF-α observada apenas em animais do grupo SS e

Sham sendo que neste grupo foi observado um aumento progressivo ao longo

do período estudado. Embora de forma não significativa os dados sugerem que

a não infusão parenteral neste modelo de PA pode perpetuar o aumento de

TNF-α pelo provável mecanismo de isquemia pancreática, fato este que talvez

se comprovaria com a continuidade da analise por tempo mais prolongado,

contrario aos reportados no estudo mencionado acima no qual ha declínio

desta citocina no período de 12 a 24 h. No intrínseco mecanismo envolvido no

curso da PA o persistente aumento do TNF-α pode aumentar a permeabilidade

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intestinal e facilitar a translocação bacteriana criando um ambiente propício

para a infecção pancreática em uma fase mais tardia da doença.115,116

Ao se observar o perfi cinético das citocinas analisadas concluímos que

houve alterações significativas nos níveis de IFN-y, IL-2 e IL-10. Ao contrario

do ocorrido nos grupos SS e Sham não houve queda significativa nos níveis de

IFN-y no grupo Gln. Somado a isto, nos animais do grupo Sham observou-se

um aumento de IL-2 e declínio de IL-10 no tempo de 24 horas, observação feita

também nos animais dos grupos SS e Gln, mas nestes estas alterações

parecem ser de forma mais gradual ao longo do tempo.

Embora IFN-γ e IL-2 possam deflagrar ou ativar o processo inflamatório,

estas citocinas também apresentam vantagens na PA através da participacao

na depuração de agentes patogênicos, com intuito de se evitar infecções nas

fases tardias da doença conforme publicado por Curley e colaboradoes.117

Novas evidências sobre o contraditório papel do IFN-y no processo

inflamatório foi discutido por Zhang, deixando claro que existem propriedades

inesperadas e pouco exploradas desta citocina na regulação inflamatória e

imunológica.118

Em relação a IL-10, ao exercer potente efeito contra-regulador, esta

citocina tem sido relatada como sendo benéfica no modelo de PA induzida por

taurocolato de sódio.119

No entanto, os dados não foram confirmados no contexto clínico.

Estratégia de tratamento precoce no prazo de até 36 h do início dos sintomas

com IL-10 em PA não mostrou diferenças significativas quando comparado ao

placebo, no que diz respeito ao tempo de internação, aspecto tomográfico,

complicações locais e falência de órgãos.120

Resultados conflitantes também foram reportados em estudos duplo-

cegos e randomizados a respeito da utilização de IL-10, com o intuito de se

evitar a PA induzida pela CPRE.121,122,123

Em tese a explicação para estes resultados parece estar relacionada à

prolongada liberação desta citocina e o mecanismo contra regulador da

síndrome da resposta compensatória anti-inflamatória (CARS).124 O progressivo

aumento de IL-10 pode intensificar o seu efeito anti-inflamatório, perpetuar o

mecanismo da CARS e favorecer a paralisia imune, o que torna o hospedeiro

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80

suscetível a infecções secundárias. Em uma impressão inicial, na presente

pesquisa o comportamento da IL-10 no grupo GLN parece seguir a evolução

mais favorável, com aumento precoce e queda gradativa ao longo de 24 h após

a indução de PA.

Diante ao exposto possíveis efeitos benefícos e nocivos associados a

estas citocinas no nosso modelo de inflamação parece residir no seu momento

de liberação em relação `as diferentes fases inflamatórias durante a

progressão da da PA.

Por exemplo, a imunoterapia com IFN-γ em PA parece ser benéfica

apenas na fase tardia da PA, quando complicações infecciosas e a

imunoparalisia podem ser a causa dominante de sua mortalidade.125 Assim, em

estudos experimentais que testaram o tratamento da PA com INF-γ, enquanto

aumento prejudicial da amilase sérica, do edema pancreático, da expressão de

NF-ĸB e de TNF-α foram observados no início do processo inflamatório,

acentuada melhora da doença e progressão da necrose intrapancreática,

acompanhada pela diminuição da ativação de NF –ĸB, expressão de COX-2, e

TNF-α, também foram relatados.126-128

Observados em conjunto, a dinâmica de liberação de INF-γ, IL-2 e IL-10

observada em animais do grupo GLN parece exercer efeito protetor ao tentar

manter a competência imunológica em fases posteriores de progressão da

PA.

É bem conhecido que uma maior expressão de HSP pode exercer efeito

protetor em estados de inflamação. Sabe-se também que a Gln foi amplamente

estudada como um importante fármaco regulador desta maior expressão.64

Em nosso estudo, enquanto modesta variação sobre os níveis de

citocinas foram notados, acentuado efeito foi observado sobre a expressão de

HSPs, principalmente ao concentramos nossa análise no grupo GLN em

relação aos outros grupos. Nossos resultados corroboram com os de Xue et al.

relatando melhora da transcrição do fator de choque térmico (HSF1), um

regulador mestre para a expressão de HSP, após a infusão parenteral de

GLN.129

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81

O aumento da expressão hepática de HSP70 e uma tendência ao

aumento da HSP 70 pulmonar foram observados em animais do grupo GLN

12h após AP.

Publicação de Saluja e colaborador concluiu que a maior expressão de

HSP 70 em modelo experimental de PA associou-se com melhorias na

sobrevivência, lesão tecidual e resposta inflamatória.19 Deste modo a indução

precoce da expressão de HSP70 vem sendo alvo de estudos com fins

terapêuticos . Meng e colaboradores pré induziram a expressão de HSP 70 em

ratos, por meio de lavagem peritoneal com solução salina a 42° graus e em

seguida, realizaram lesão pancreática através da injeção intraperitoneal de

ceruleína. Seis horas após a indução da PA, os autores observaram aumento

da expressão de HSP70 no tecido pancreático, correlacionado com menores

níveis séricos de amilase, IL-6, TNF-α e significativa redução do escore de

gravidade histopatológica do pâncreas.130

No que se refere `a expressão de HSP90 hepática e pulmonar, os animais

do grupo GLN exibiram um aumento significativo no tempo de 2 hs em relação

aos animais dos outros grupos.

Resultado inesperado inicialmente foi a maior expressão de HSP70 no

pulmão e HSP90 no fígado de animais do grupo Sham sem tratamento prévio

pela via parenteral. Explicação pertinente se faria perante o grupo Gln já que

conhecemos uma das principais características da glutamina que é a sua

rápida utilização pelas células. Talvez 24 h após a indução de PA a Gln tenha

sido totalmente metabolizada e não mais consiga auxiliar no aumento da

expressão de HSP. Por fim, embora as HSPs 70 e 90 tenham propriedades

citoprotetoras neste modelo experimental, conforme evidenciado previamente

em estudo de Moretti e colaboradores, os dados devem ser interpretados à luz

de desfechos da doença e com base em maior número de estudos clínicos.51

6.5 Das variáveis histológicas

Com o intuito de correlacionarmos os dados analisados com o desfecho

clínico e e demonstrarmos a eficiência do método realizamos o perfil histológico

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pancreático de acordo com os critérios de Schmidt50. Apesar da expressiva

atividade inflamatória demonstrada pelo aumento de amilse, alterações

citocínicas, expressão de HSPs e até mesmo aumento do escore histológico

pós-PA não verificamos diferença significativa na histologia pancreática.

Contrário aos achados por nós observados, Alhan e colaboradores concluíram

que a infusão de Gln parenteral foi capaz de melhorar o perfil da necrose

pancreática 24 hs apos a indução de PA em ratos.88

No entanto, fator limitante na interpretação de nossos resultados é a

ausência de análise histológica pancreática no período de 24 horas.

Certamente, neste período, teríamos maior ocorrência de necrose pancreática

que por consequência nos proporcionaria maiores subsídios para confirmar ou

refutar a tese de melhora histológica com a infusão de Gln pura.

6.6 Da mortalidade e sobrevida

No que se refere à mortalidade, as últimas publicações sobre a

suplementação de glutamina na prática clínica são extremamente

controversas. Enquanto alguns autores destacam a influência deletéria sobre

as taxas de mortalidade em pacientes críticos,outros,em contrapartida

divergem plenamente quanto a este potencial incremento nesta variável. 5,6,80,83

Nosso modelo de PA, cursa com mortalidade que varia de 25% com 72 h até

35 % após 7 dias.97,131 Muitas da criticas observadas sobre o aumento da

mortalidade com a suplemenetacao de Gln em estudos clinicos diz respeito a

populacao de doentes e ao momento em que e utilizada. Os dados sugerem

que a suplementacao em um momento em que a disfuncao multipla de orgaos

esta instalada pode agravar o quadro clinico.6

Conforme discutido anteriormente estudo experimental conduzido por

Alhan e colaboradores que explorou os efeitos da Gln isolada no tratamento da

pancreatite induzida em ratos observou significativa redução da mortalidade.88

Em nossa pesquisa não houve diferença significativa na mortalidade de 7

dias apos PA entre os grupos estudados (p = 0,518). Quanto à análise de

sobrevida, observamos que nao houve diferenca estatística entre os grupos

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apesar de eventos de morte ocorrerem de modo mais tardio no grupo Gln

(intervalo médio = 48 h para Gln vs 24-48 h e 30-36 dias para Sham e SS,

respectivamente; p = 0,79).

Nossos resultados contrariam, a principio de forma não significativa, a

atual vertente de que a infusao de Gln principalmente em doentes criticos

posso aumentar a mortalidade. No entanto cabe ressaltar que o estudo tem

limitações que podem comprometer a tradução de dados para os seres

humanos. Trata – se de estudo experimental no qual a Gln parenteral foi

infundida independente de nutrição parenteral e antes da tensão crítica. Esta

estratégia, embora represente uma tentativa de se antecipar ao futuro estresse

inflamatorio nos impede de saber se o mesmo efeito seria observado caso a

Gln fosse infundida em conjunto com outros nutrientes e se os fatores de

estresse já estavam em andamento.

A principio, nossos dados em conjunto podem sugerir benefícios na

infusão parenteral de Gln prévia a indução de PA aguda experimental. O

aumento na expressão de proteínas de choque HSP 70 e HSP 90 nos tecidos

hepático e pulmonar, embora não demonstre impacto significativo na histologia

pancreática e na taxa de sobrevida e mortalidade, pode representar potencial

vantagem na resolução ou limitação do processo inflamatório local e sistêmico.

É possível que a avaliação cinética de citocinas e a análise

histopatológica com intervalos mais prolongados possa contribuir para melhor

compreensão dos fenômenos envolvidos no mecanismo inflamatório e suas

repercussões no curso da patogênese da PA experimental.

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7 CONCLUSÕES

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7 CONCLUSÕES

Realizado nas condições descritas, o presente estudo permitiu as

seguintes conclusões:

- Gln parenteral prévia à indução de PA não alterou de modo

significativo o perfil de liberação de citocinas e a análise histológica do

pâncreas entre os grupos estudados;

- Gln parenteral parece favorecer a cinética de liberação de INF-γ, IL-2

e IL-10 com possível efeito protetor ao tentar manter a competência

imunologica em fases posteriores de progressão da PA;

- A infusão de Gln prévia a PA mostrou maiores e mais precoces

expressões de HSPs, com possível melhor modulação e resposta ao

processo inflamatório;

- Não houve relação entre a infusão de Gln parenteral com o aumento

de mortalidade ou menor sobrevida.

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8 ANEXOS

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8 ANEXOS

8.1 ANEXO A - Descritivos da variável peso antes e após a infusão parenteral das soluções propostas

Variável Grupo Média Mediana Desvio Padrão

Mínimo Máximo 1º

Quartil 3º

Quartil P-valor

Peso Pré

Soro 291,40 284,00 24,10 264,00 345,00 274,00 302,00

0,3368 Glutamina 278,53 281,00 22,24 242,00 312,00 261,50 296,00

SHAM 289,15 299,00 26,83 238,00 325,00 273,50 310,50

Peso Pós

Soro 288,93 275,00 31,11 250,00 350,00 267,00 308,00

0,3605 Glutamina 273,47 275,00 23,67 234,00 328,00 259,00 286,00

SHAM 283,26 285,00 23,19 243,00 325,00 271,50 298,00

Delta peso

Soro 4,43 2,00 12,55 -13,00 25,00 -6,00 17,00

0,9373 Glutamina 5,07 2,00 24,91 -39,00 42,00 -7,50 24,00

SHAM 5,42 5,00 21,75 -40,00 43,00 -2,50 14,00

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9 REFERÊNCIAS

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10 APÊNDICES

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10 APÊNDICES

APÊNDICE A - apresentação nacional e internacional do estudo

Congresso Americano: Apresentação de dois pôsteres no congresso

da Sociedade Americana de Nutrição Clínica e Metabólica - ASPEN, realizado

em Fênix – Arizona em Fevereiro de 2013.

Page 132: Efeito da administração parenteral de glutamina sobre a ......inflamatória sistêmica 6.Pancreatite necrosante aguda 7.Ratos 8.Mortalidade USP/FM/DBD-356/15 Trabalho realizado no

Poster 1) "Impact of prior use of parenteral omega-3 fatty acids and

glutamine isolated and combined on survival in an experimental model of acute

pancreatitis"

Page 133: Efeito da administração parenteral de glutamina sobre a ......inflamatória sistêmica 6.Pancreatite necrosante aguda 7.Ratos 8.Mortalidade USP/FM/DBD-356/15 Trabalho realizado no

Pôster 2) "Impact of prior use of parenteral omega-3 fatty acids and

glutamine isolated and combined in inflammatory response in an experimental

model of Acute Pancreatitis”

Page 134: Efeito da administração parenteral de glutamina sobre a ......inflamatória sistêmica 6.Pancreatite necrosante aguda 7.Ratos 8.Mortalidade USP/FM/DBD-356/15 Trabalho realizado no

Congresso Brasileiro: Apresentação oral de destaque científico do

trabalho “Efeito da infusão parenteral combinada de ácidos graxos ômega-3 e

glutamina sobre sobrevida e estresse oxidativo em pancreatite aguda, estudo

experimental”.

Page 135: Efeito da administração parenteral de glutamina sobre a ......inflamatória sistêmica 6.Pancreatite necrosante aguda 7.Ratos 8.Mortalidade USP/FM/DBD-356/15 Trabalho realizado no

Congresso Europeu: Apresentação de dois pôsteres no congresso da

Sociedade Europeia de Nutrição Clínica e Metabólica – ESPEN, realizado em

Genebra – Suíça em Setembro de 2014.

Postêr 1) Previous parenteral infusion of alanil-glutamine increases HSP

70 expression in lung and liver of rats submitted to acute pancreatitis

Postêr 2): Unexpected results of prior infusion of parenteral fish oil lipid

emulsion in experimental acute pancreatitis