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RICARDO ALEXANDRE GARIB
Efeito da administração parenteral de glutamina sobre a modulação da resposta inflamatória sistêmica, morbidade e mortalidade de ratos submetidos à
pancreatite aguda
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências Programa de Ciências em Gastroenterologia Orientador: Prof. Dr. Dan Linetzky Waitzberg
SÃO PAULO
2015
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Preparada pela Biblioteca da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
reprodução autorizada pelo autor
Garib, Ricardo Alexandre
Efeito da administração parenteral de glutamina sobre a modulação da resposta
inflamatória sistêmica, morbidade e mortalidade de ratos submetidos à pancreatite
aguda / Ricardo Alexandre Garib. -- São Paulo, 2015.
Dissertação(mestrado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
Programa de Ciências em Gastroenterologia.
Orientador: Dan Linetzky Waitzberg.
Descritores: 1.Glutamina/administração e dosagem 2.Soluções de nutrição
parenteral 3.Citocinas 4.Proteínas de choque térmico 5.Síndrome de resposta
inflamatória sistêmica 6.Pancreatite necrosante aguda 7.Ratos 8.Mortalidade
USP/FM/DBD-356/15
Trabalho realizado no Laboratório de Nutrição e Cirurgia Metabólica do
Aparelho Digestivo – Laboratório de Investigação Médica – LIM 35, da
Disciplina de Cirurgia do Aparelho Digestivo, do Departamento de
Gastroenterologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo em
parceria com o LIM 37 – Laboratório de Investigação Médica da Disciplina de
Transplante e Cirurgia do Fígado, Laboratório de Emergências Clínicas LIM 51
e o Departamento de Anatomia Patológica da Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo.
Auxílio Pesquisa: Fapesp nº 2011/02071-7
Ao Raul Garib Junior e à Cirene Rodrigues Garib, meus
pais, que me ensinaram pelo exemplo de esforço e trabalho a vencer as
dificuldades e sempre me deram a base ética que balizaram minha conquistas.
A minha esposa Lia e a meus filhos Maria e Francisco,
meus eternos amores sem os quais a vida não faria o menor sentido, pela
enorme paciência e pelo estímulo para seguir em frente nesta árdua missão
que é a Medicina
A meu irmão Henrique, amigo incondicional que sempre
me incentivou.
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Ao meu orientador e amigo Prof. Dr. Dan Linetzky Waitzberg, por
compartilhar seu conhecimento, me estimular e incentivar a atuar em pesquisa,
pelos ensinamentos que levarei para toda a vida. Agradeço pela grande
oportunidade de fazer parte de sua equipe e tê-lo como orientador.
Ao meu amigo Dr. Pedro Luiz Bertevello, por me incentivar sempre, e pela
valiosa contribuição em minha formação profissional.
A minha amiga e colega de laboratório Nutricionista Priscila Casarim
Garla, por compartilhar comigo os bons e maus momentos durante a realização
deste trabalho, pelos ensinamentos, e pela irrestrita cooperação e pelo apoio
nos momentos mais difíceis.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Marcel Cerqueira Cesar Machado, Professor Emérito do
Departamento de Gastroenterologia da Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo FMUSP, pelas importantes orientações para o
desenvolvimento desta pesquisa.
Ao Prof. Dr. Ivan Ceconello, Professor Titular da Disciplina de Cirurgia do
Aparelho Digestivo, pela oportunidade de me matricular no curso de Pós-
Graduação e por garantir as condições para elaboração desta pesquisa.
Ao Prof. Dr. Luiz Augusto Carneiro D’Albuquerque, Professor Titular da
Disciplina de Transplantes de Órgãos do Aparelho Digestivo da FMUSP, e
Professor Responsável pelo LIM 37 - Laboratório de Investigação Médica -
Transplante de Fígado FMUSP, pelo apoio e por garantir as condições para
elaboração e desenvolvimento desta pesquisa.
Ao Prof. Dr. Eleazar Chaib Professor Associado do Departamento de
Gastroenterologia da FMUSP e Diretor do Laboratório de Transplante e
Cirurgia do Fígado (LIM-37) da Faculdade de Medicina da Universidade de São
Paulo, pelo apoio e por garantir as condições para elaboração e
desenvolvimento desta pesquisa.
À bióloga chefe do Grupo METANUTRI, Dra. Raquel Suzana Torrinhas,
pela enorme contribuição durante todo este projeto, e pelo modo amigo e
generoso com o qual se empenhou para me ajudar.
À Prof. Dra. Ângela Logullo Waitzberg, pelo apoio e pelas sugestões
durante a elaboração deste trabalho.
Aos Professores Dr. José Jukemura, Dr. Fabio Campos e Dr. Francisco
Garcia Soriano, componentes de minha banca de qualificação e que muito
contribuíram na finalização deste trabalho.
Aos pesquisadores do Grupo METANUTRI – Graziela, Letícia, Mika,
Priscila Sala, Natalia, Rita, Dani, Lívia, Alweid, Felipe, Natasha, Karina, Camila
Samira, Cris Verotti, Christiane, Giliane e Mariane, agradeço pela amizade,
pelas sugestões, pela convivência diária, pela troca de experiências e pelo
conhecimento científico.
Às estagiárias Thaís Garcia e Raquel Santana, obrigado pela ajuda no
início deste trabalho
Às funcionárias do Laboratório Metanutri, Elaine Muniz, Patrícia Macedo
e, em especial, ao Francisco, por todo respeito a mim dedicado e pela
colaboração dada para o andamento deste trabalho.
Ao técnico de laboratório José Edson Pereira da Costa, sempre presente
nos momentos difíceis, meu sincero agradecimento pelos ensinamentos e pela
ajuda prestada.
Às funcionárias do Laboratório LIM 37, Ana Maria Coelho, Nilza Molan e
Sandra Sampietre, por me iniciarem na técnica experimental e pelas análises
realizadas. Aos auxiliares do LIM 37, Dona Maria Aparecida e Genivaldo da
Silva “Zú”, por estarem sempre dispostos a ajudar.
À Dra. Rosely Antunes Patzina e ao Técnico de Laboratório Célio Nasário
da Divisão de Anatomia Patológica do Hospital das Clínicas da FMUSP, pelo
valioso auxílio dado para a realização das análises histológicas.
Ao Prof. Dr. Heraldo Possolo de Souza, pela colaboração no
planejamento e na execução desta pesquisa
À pesquisadora Dra Ana Iochabel Soares Moretti, pela colaboração na
metodologia e na análise de HSP.
Ao estatístico João Ítalo Dias França, por sua dedicação na análise
estatística, a qual foi fundamental para este trabalho.
Ao Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência
de Animais de Laboratório – CEMIB de Campinas, pelo fornecimento de ratos
isogênicos, indispensáveis para o desenvolvimento deste projeto de estudo.
Aos motoristas e funcionários do Departamento de Transporte da
FMUSP, que sempre estiveram disponíveis para executar com
responsabilidade o transporte de ratos do CEMIB – Unicamp.
Às funcionárias da Secretaria de Pós-Graduação, em especial, à Vilma de
Jesus Libério, por toda atenção e pela paciência no atendimento prestado aos
alunos pós-graduandos.
À Fresenius-Kabi do Brasil, pelo fornecimento das soluções parenterais
que possibilitaram a realização deste trabalho.
À empresa Baxter, por, gentilmente, ceder em comodato bombas de
infusão peristáltica e equipos de infusão para a execução dos experimentos
desta pesquisa.
À empresa Farmoterápica, em especial, à farmacêutica Dra. Carmem
Maldonado, pelo fornecimento de bolsas parenterais manipuladas para rato.
À Diretoria dos LIMs – Direxlim da FMUSP, em especial, à Chefe de
seção Joana Maziero Bernardo, pela importante ajuda com o suprimento de
materiais
À Fundação de Amparo a Pesquisa – FAPESP, pela concessão de
auxílio para o desenvolvimento desta pesquisa.
Aos residentes de Cirurgia do Aparelho Digestivo do Hospital
Beneficência Portuguesa de São Paulo.
À minha avó Yolanda e a meus tios Norberto, Roberto, José Sergio,
Raulita, Milton e Terezinha, por me ajudarem durante toda a formação médica.
E, por fim, a todos que contribuíram de alguma forma para a realização e
conclusão deste Mestrado.
NORMALIZAÇÃO ADOTADA
Esta dissertação está de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento desta publicação: Referências: adaptado de International Committee of Medical Journals Editors (Vancouver). Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Divisão de Biblioteca e Documentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias. Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria F. Crestana, Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso, Valéria Vilhena. 3a ed. São Paulo: Divisão de Biblioteca e Documentação; 2011. Abreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals Indexed in Index Medicus.
SUMÁRIO
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
LISTA DE SÍMBOLOS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................ 3
1.1 Imuno-fármaco-nutrientes: nutrientes com atividade no estado inflamatório e imune ........................................................................................ 3
1.1.1 Glutamina .................................................................................................. 4
1.2 Pancreatite aguda ...................................................................................... 6
1.3 Influências da glutamina na pancreatite aguda ....................................... 8
2 RACIONAL E JUSTIFICATIVA DO ESTUDO .............................................. 13
3 OBJETIVOS .................................................................................................. 17
3.1 Objetivo geral ........................................................................................... 17
3.2 Objetivos específicos............................................................................... 17
4 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................ 21
4.1 Local de execução ................................................................................... 21
4.2 Aspectos éticos ........................................................................................ 21
4.3 Delineamento experimental ..................................................................... 22
4.4 Procedimentos gerais .............................................................................. 25
4.4.1 Animais de experimentação .................................................................... 25
4.4.2 Período de adaptação ............................................................................. 25
4.4.3 Cateterização do Sistema Venoso Central (CVC) ................................... 25
4.4.4 Infusão parenteral ................................................................................... 27
4.4.5 Pancreatite aguda experimental .............................................................. 29
4.5 Procedimentos específicos fase 1 .......................................................... 32
4.5.1 TNF-α no líquido ascítico ........................................................................ 32
4.5.2 Análises histológicas ............................................................................... 32
4.5.3 Proteínas de choque térmico (HSP) 70 e 90 ........................................... 33
4.5.4 Amilase sanguínea .................................................................................. 34
4.5.5 Citocinas séricas ..................................................................................... 34
4.6 Procedimentos específicos da Fase 2 .................................................... 34
4.7 Análise estatística .................................................................................... 35
5 RESULTADOS .............................................................................................. 39
5.1 Fase 1 – Estudo do impacto da infusão parenteral prévia de glutamina 2 ,12 e 24 horas após indução de PA .......................................... 39
5.1.1 Tempo de 2 horas ................................................................................... 39
5.1.1.1 HSP 90 hepática após 2 horas de indução de PA ................................ 39
5.1.1.2 HSP 90 pulmonar após 2 horas de indução de PA .............................. 39
5.1.1.3 HSP 70 hepática após 2 horas de indução de PA ................................ 40
5.1.1.4 HSP 70 pulmonar após 2 horas de indução de PA .............................. 41
5.1.1.5 TNF- α no líquido ascítico após 2 horas de indução de PA .................. 41
5.1.1.6 Citocinas séricas após 2 horas de indução de PA ............................... 41
5.1.1.7 Amilase sérica após 2 horas de indução de PA ................................... 42
5.1.1.8 Histologia do pâncreas após 2 horas de indução de PA ...................... 43
5.1.2 Tempo de 12 horas ................................................................................. 45
5.1.2.1 HSP 90 no fígado após 12 horas de indução de PA ............................ 45
5.1.2.2 HSP 90 no pulmão após 12 horas de indução de PA .......................... 46
5.1.2.3 HSP 70 no fígado após 12 horas de indução de PA ............................ 47
5.1.2.4 HSP 70 no pulmão após 12 horas de indução de PA .......................... 47
5.1.2.5 Citocinas séricas após 12 horas de indução de PA ............................. 48
5.1.2.6 Histologia do pâncreas após 12 horas de indução de PA .................... 50
5.1.3 Tempo de 24 horas ................................................................................. 51
5.1.3.1 Citocinas séricas após 24 horas de indução de PA ............................. 51
5.1.3.2 HSP 70 no pulmão após 24 horas de indução de PA .......................... 53
5.1.3.3 HSP 90 no fígado após 24 horas de indução de PA ........................... 54
5.2 Analise cinética de citocinas ................................................................... 54
5.2.1 Comparação da cinética de citocinas nos diferentes tempos ................. 55
5.2.1.1 Grupo Salina ........................................................................................ 55
5.2.1.2 Grupo SHAM ........................................................................................ 56
5.2.1.3 Grupo Glutamina .................................................................................. 58
5.3 Fase 2 – Estudo da mortalidade de 7 dias de animais que receberam infusão de glutamina ou solução salina e animais que não receberam infusão parenteral prévia à indução de PA ............................... 62
5.3.1 Mortalidade .............................................................................................. 62
5.3.2 Análise da sobrevida ............................................................................... 63
5.4 Perda de peso ........................................................................................... 64
6 DISCUSSÃO ................................................................................................. 69
6.1 Do método ................................................................................................. 69
6.1.1 Dos animais ............................................................................................. 69
6.1.2 Do delineamento experimental ................................................................ 69
6.1.3 Da Infusão parenteral .............................................................................. 70
6.1.3.1 Glutamina parenteral ............................................................................ 70
6.1.3.2 Solução salina parenteral ..................................................................... 74
6.2 Do modelo de pancreatite experimental ................................................. 75
6.3 Das variáveis clínicas e laboratoriais ..................................................... 77
6.3.1 Peso ........................................................................................................ 77
6.3.2 Amilase .................................................................................................... 77
6.4 Das variáveis inflamatórias ..................................................................... 78
6.5 Das variáveis histológicas ....................................................................... 81
6.6 Da mortalidade e sobrevida ..................................................................... 82
7 CONCLUSÕES ............................................................................................. 87
8 ANEXOS ....................................................................................................... 91
8.1 ANEXO A - Descritivos da variável peso antes e após a infusão parenteral das soluções propostas .............................................................. 91
9 REFERÊNCIAS ............................................................................................. 95
10 APÊNDICES
APÊNDICE A - Apresentação nacional e internacional do estudo
LISTA DE SIGLAS ABREVIATURAS
AIN 93 American Institute of Nutrition – 1993
ANOVA Análise de Variância
CAPPesq Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa
CAPPesq Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa
CEMIB Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica
COBEA Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
CVC Cateterização do Sistema Venoso Central
ELISA Método de Imunoensaio
ESPEN European Society for Clinical Nutrition and Metabolism
et al. e outros colaboradores
FAPESP Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
FMUSP Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
GLN Glutamina
GSH-PX Glutationa Peroxidase
HSP Proteína de Choque Térmico
IQCODE Questionário do Informante sobre o Declínio Cognitivo
LIM Laboratório de Investigação Médica
max Máximo
METANUTRI Metabologia e Nutrição em Cirurgia
min Mínimo
ns Não significativo
PA Pancreatite Aguda
PPO Pancreatite Pós-Operatória
SF Solução Salina
SIRS Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica
TNF Fator de Necrose Tumoral
TNF-α Fator de Necrose Tumoral – α
UNICAMP Universidade Estadual de Campinas
USP Universidade de São Paulo
UTI Unidade de Terapia Intensiva
LISTA DE SÍMBOLOS
% Porcentagem
< Menor que
> Maior que
≤ Menor ou igual a
cm Centímetro
CO2 Gás Carbônico
dp Desvio Padrão
g Gramas
H2O2 Peróxido de Hidrogênio
Kcal Quilocalorias
Kg Quilogramas
m Média
M Molar
med Mediana
mg miligramas
mL mililitros
mm milímetros
nm nanômetros
ºC graus Celsius
pH Potencial Hidrogeniônico
rpm Rotações por Minuto
v Volume
α Alfa
β Beta
μg Microlitro
μm Micrômetros
ω Ômega
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Composição da solução parenteral de glutamina ................... 29
Tabela 2 Concentração sérica (pg/mL) de citocinas 2 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções ............................ 42
Tabela 3 Variáveis analisadas na histolologia de 2 horas ..................... 44
Tabela 4 Concentração sérica (pg/mL) de citocinas 12 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis ........................ 49
Tabela 5 Variáveis analisadas na histolologia de 12 horas ................... 50
Tabela 6 Concentração sérica (pg/mL) de citocinas 24 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis ........................ 52
Tabela 7 Concentração sérica (pg/mL) de citocinas nos tempos analisados após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis que receberam infusão parenteral de solução salina .... 55
Tabela 8 Comparação cinética da variável IL 10 no grupo Salina ......... 56
Tabela 9 Comparação cinética da variável IFn y no grupo Salina ......... 56
Tabela 10 Concentração sérica (pg/mL) de citocinas nos tempos analisados após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis que não receberam infusão parenteral ......................... 57
Tabela 11 Comparação cinética da variável IL-2 no grupo Sham ........... 57
Tabela 12 Comparação cinética da variável IL-10 no grupo Sham.......... 58
Tabela 13 Comparação cinética da variável IFn y no grupo Sham .......... 58
Tabela 14 Concentração sérica (pg/mL) de citocinas nos tempos analisados após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis que não receberam infusão parenteral de Glutamina ................................................................................ 59
Tabela 15 Comparação cinética da variável IL-10 no grupo Glutamina ................................................................................ 59
Tabela 16 Comparação cinética da variável IFn y no grupo Glutamina ................................................................................ 60
Tabela 17 Contingência entre as variáveis qualitativas com o grupos..... 63
Tabela 18 Numero de eventos de morte nos diferentes grupos ate o 7º dia ....................................................................................... 63
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Fases da cateterização do sistema venoso central ................ 27
Figura 2 Bomba para infusão parenteral e animal com dispositivo de infusão na região dorsal após cateterização venosa ......... 29
Figura 3 Aspecto do arco duodenal e do pâncreas antes da indução da pancreatite. ........................................................... 31
Figura 4 Aspecto do arco duodenal e do pâncreas após a indução da pancreatite. ........................................................................ 31
Figura 5 Expressão (unidades arbitrárias - U.A) de HSP 90 no pulmão 2 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções. ................................................................................. 40
Figura 6 Expressão (unidades arbitrárias - U.A) de HSP 70 no fígado 2 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções. ................................................................................. 40
Figura 7 Expressão (unidades arbitrárias – U.A.) de HSP 70 no pulmão 2 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções. ................................................................................. 41
Figura 8 Concentrações de amilase sérica (U/dL) 2 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções. ........................... 43
Figura 9 Histologia do pâncreas representada pelo escore total 2 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções. ................................................................................. 45
Figura 10 Expressão (unidades arbitrárias - U.A.) de HSP 90 no fígado 12 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções. ................................................................................. 46
Figura 11 Expressão (unidades arbitrárias - U.A.) de HSP 90 no pulmão 12 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções. ................................................................................. 46
Figura 12 Expressão (unidades arbitrárias - U.A.) de HSP 70 no fígado 12 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções. ................................................................................. 47
Figura 13 Expressão (unidades arbitrárias - U.A) de HSP 70 no pulmão 12 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções. ................................................................................. 48
Figura 14 Histologia do pâncreas representada pelo escore total 12 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções. ................................................................................. 51
Figura 15 Expressão (unidades arbitrárias - U.A) de HSP 70 no pulmão 24 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções. ................................................................................. 53
Figura 16 Expressão (unidades arbitrárias - U.A.) de HSP 90 no fígado 24 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções. ................................................................................. 54
Figura 17 Concentração sérica (pg/mL) de IL-2 nos grupos estudados em diferentes tempos após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis .......................................... 60
Figura 18 Concentração sérica (pg/mL) de IL-10 nos grupos estudados em diferentes tempos após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis .......................................... 61
Figura 19 Concentração sérica (pg/mL) de IFNy nos grupos estudados em diferentes tempos após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis .......................................... 61
Figura 20 Concentração sérica (pg/mL) de TNF nos grupos estudados em diferentes tempos após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis .......................................... 61
Figura 21 Visão geral do comportamento das concentrações séricas (pg/mL) de IFNy, IL-2, IL-10, e TNF nos grupos estudados em diferentes tempos após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis ............................................................. 62
Figura 22 Curva de sobrevida dos animais nos diferentes grupos até o 7 dia ..................................................................................... 64
Figura 23 Perda de peso (g) de ratos Lewis prévio à infusão parenteral de diferentes soluções ........................................... 65
Figura 24 Perda de peso (g) de ratos Lewis após a infusão parenteral de diferentes soluções ........................................... 65
Figura 25 Delta peso (g) de ratos Lewis após a infusão parenteral de diferentes soluções e prévio à indução de PA ........................ 65
RESUMO
Garib R. Efeito da administração parenteral de glutamina sobre a modulação da resposta inflamatória sistêmica, morbidade e mortalidade de ratos submetidos à pancreatite aguda [Dissertação]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2015.
INTRODUÇÃO: Relatos conflitantes têm dificultado para se estabelecer o potencial benefício da glutamina (GLN) no tratamento de condições inflamatórias agudas. Nós avaliamos o efeito da infusão parenteral de GLN, prévia à pancreatite aguda (PA) experimental, nos mediadores inflamatórios, morbidade e mortalidade. MÉTODOS: Ratos Lewis (n = 131) receberam glutamina parenteral (grupo GG), solução salina (grupo SS ou controle), ou permaneceram sem infusão parenteral (grupo Sham) por 48h. Após este período, foi induzida PA por meio da injecção retrógrada de taurocolato de sódio no ducto pancreático. Sangue, amostras de pulmão, fígado, pâncreas e líquido ascítico foram colhidos a partir de 2, 12 e 24 horas após PA para avaliação das variáveis propostas (citocinas, hsp, histologia, amilase). Sessenta animais permaneceram vivos após PA para a análise da mortalidade em sete dias. RESULTADOS: A análise entre grupos não mostrou diferenças significativas nos níveis de citocinas (p> 0,05). Análise cinética dentro de cada grupo ao longo do tempo mostrou maior INF-γ no grupo Sham e SS às 2h do que em 12h e 24h, maior IL-2 e inferior IL-10 no Sham, às 24h do que em 2h e 12h, e menor IL-10 no SS e GG em 24 h do que no tempo de 2h (p ≤0.05). O grupo GG exibiu maior expressão de HSP 90 no pulmão e no fígado do que no grupo Sham nos tempos de 2h e 12h, respectivamente; e maior expressão no fígado de HSP90 e HSP70 no grupo SS no tempo 12 horas (p <0,01). O grupo Sham apresentou maior expressão de HSP 70 no pulmão e HSP 90 no fígado do que os outros grupos no tempo de 24h. Não ocorreram alterações na taxa de mortalidade. CONCLUSÕES: Em modelo de PA experimental induzida por taurocolato de sódio, o pré-tratamento com GLN parenteral melhorou o perfil dos mediadores inflamatórios, sem afetar a mortalidade. Descritores: Glutamina/administração e dosagem; Soluções de nutrição parenteral; Citocinas; Proteínas de choque térmico; Síndrome de resposta inflamatória sistêmica; Pancreatite necrosante aguda; Ratos; Mortalidade.
ABSTRACT
Soares AT. Effect of previous parenteral glutamine infusion on inflammatory mediators, morbidity and mortality of rats submitted to acute pancreatitis [Dissertation]. São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, 2015. INTRODUCTION: Conflicting reports have hindered establish the potential glutamine (GLN) benefit in treating acute inflammatory conditions. We evaluated the effect of parenteral GLN infusion before experimental acute pancreatitis (AP), as systemic inflammation-reproducing model, on inflammatory mediators and mortality. METHODS: Lewis rats (n=131) received parenteral glutamine (GG group), saline (SS or Control group), or remained without parenteral infusion ( Sham group) for 48h. Thereafter, AP was induced by retrograde injection of sodium taurocholate into pancreatic duct. Blood, lung, liver and pancreas samples were collected from 2, 12 and 24h post-AP to assess serum cytokines levels, tissue HSP expression, histology and amylase. Sixty animals remained alive post-PA for seven-day mortality analysis. RESULTS: Punctual between-groups analysis did not show differences in
cytokine levels (p >0.05). Intragroup analysis over time showed higher INF- in Sham and SS at 2h than at 12h and 24h, higher IL-2 and lower IL-10 in Sham at 24h than at 2h and 12h, and lower IL-10 in SS and GG at 24h than at 2h timepoint (p ≤0.05). GG group exhibited higher lung and liver HSP90 than Sham at 2h and 12h timepoints, respectively; and higher liver HSP90 and HSP70 than SS at 12h timepoint (p <0.01). Sham group presented higher lung HSP70 and liver HSP90 than the others at 24h timepoint (p <0.02). No changes occurred on mortality rate. CONCLUSIONS: In sodium taurocholate-induced PA model, pretreatment with parenteral GLN improved inflammatory mediator’s profile, without affecting mortality. Descriptors: Glutamine/administration and dosage; Parenteral nutrition solutions; cytokines; Heat shock proteins; Systemic inflammatory response syndrome; Acute necrotizing pancreatitis; mice; Mortality.
1 INTRODUÇÃO
3
1 INTRODUÇÃO
1.1 Imuno-fármaco-nutrientes: nutrientes com atividade no estado inflamatório e imune
Imunonutrição, como pode ser chamada a prática do uso de imuno-
fármaco-nutrientes, pode contribuir para o tratamento de doentes críticos e
cirúrgicos por melhorar a resposta metabólica, inflamatória e imunológica pós-
trauma. A associação entre perfil nutricional e imunidade assume importante
relevância nesta população de doentes de tal forma que, atualmente, o
emprego de nutracêuticos que visem à restauração e/ou manutenção da
resposta imunológica é cada vez mais frequente na prática clínica. Seus
principais benefícios incluem redução da incidência de infecções hospitalares,
do tempo de internação hospitalar e, em alguns estudos, do custo do
tratamento.1,2
No entanto, a imunonutrição é um universo que ainda carece ser mais bem
explorado, pois permanece sem respostas importantes. É possível que muitos
dos imunonutrientes testados individualmente tenham efeitos terapêuticos
(positivos ou negativos) em determinado grupo de pacientes, mas, quando
ministrados por outra via, a outra população clínica ou em doses diversas
apresentem efeitos diferentes2. Nesse sentido, estudos que considerem a
heterogeneidade de estados clínicos, bem como o uso de distintas vias de
administração e doses de nutrientes isolados ou em associação devem ser
desenvolvidos.
Devido a diferentes propriedades imunomoduladoras, a glutamina desperta
grande interesse na prática clínica e é objeto de diversos estudos que tentam
elucidar seus efeitos terapêuticos.3,4 Recentes publicações conduzidas por
Heyland e colaboradores projetaram, novamente, a glutamina a uma posição de
destaque e suscitou inúmeras discussões a respeito deste imunonutriente.5,6 A
partir destes resultados, dúvidas quanto a sua melhor forma de administração,
dosagem e seus reais benefícios na prática clínica, principalmente em doentes
4
críticos, ganharam consistência e tornaram obrigatórios estudos que exploram
sua atividade no sistema imune.
1.1.1 Glutamina
Glutamina (GLN) é a amina livre mais abundante nos seres humanos e
considerada "condicionalmente essencial" durante os estados catabólicos
resultantes de uma condição de trauma, estresse cirúrgico ou sepsis.7
Devido à forte instabilidade, baixa solubilidade em meio aquoso e perfil de
absorção imprevisível, a glutamina é pouco utilizada em sua forma livre como
L- glutamina.8 Na prática clínica, a suplementação parenteral de glutamina é
realizada sob a forma de dipeptídeo sintético (L-alanil L-glutamina), para
garantir adequadas características físico-químicas durante a administração
endovenosa. A infusão parenteral de L-alanil-L-glutamina em pacientes críticos
e cirúrgicos leva ao aumento da concentração sanguínea desse dipeptídeo
(meia-vida de 0,26 horas), mas não altera as concentrações sanguíneas de
alanina ou glutamina; enquanto a sua administração enteral não é associada
com níveis circulantes detectáveis desses peptídeos em pacientes
cirúrgicos.9,10 Além disso, estudo publicado recentemente mostrou que a
infusão parenteral de L-alanil-L-glutamina em pacientes críticos não altera a
produção endógena tecidual de glutamina.11
Admite-se que a infusão de glutamina parenteral, em paciente sob
estresse grave, proporcione benefícios na proteção dos tecidos intestinal,
pulmonar e renal, e desempenhe atividade anti-inflamatória, imunológica,
metabólica e antioxidante12. A glutamina é importante combustível para
linfócitos, macrófagos, neutrófilos e células β - pancreáticas. Sua taxa de
captação é maior em células de rápida proliferação, como enterócitos e
linfócitos. Além disso, a glutamina é precursora de peptídeos e proteínas,
aminoaçúcares, purinas, pirimidinas, nucleotídeos, ácidos nucleicos e da
glutationa peroxidase (GSH-PX), enzima antioxidante que protege o organismo
contra danos consequentes do estresse oxidativo13.
5
Para a sobrevivência celular em condições de estresse, como no estresse
oxidativo, além da atuação de antioxidante, as células expressam proteínas
conhecidas como heat shock protein (proteína de choque térmico – HSP)
classificadas com base em seu peso molecular, como HSP 90, HSP 70, 60 e
40. O desequilíbrio na expressão de HSP pode ocorrer em estresse grave,
câncer e inflamação sistêmica.14 Isto sugere que o nível de expressão de HSP
pode determinar o destino das células em resposta à condição de estresse.15
Em nível celular, a expressão de HSP 70 protege contra agentes
citotóxicos e, em animais reduz disfunção tecidual e mortalidade. Em estado
crítico como sepse politrauma e síndrome da angústia respiratória (SARA),
onde a concentração de glutamina encontra-se diminuída (menor que
0,2mmol/L), a expressão de HSP 70 é deficiente (menor que 47%) em
granulócitos, monócitos e linfócitos. Mesmo que por curto período de tempo a
deficiência de glutamina no organismo é capaz de reduzir a expressão de HSP
70 na célula13. Wischmeyer e seus colaboradores investigaram a relação entre
HSP e glutamina em sepse experimental. Camundongos foram divididos em
dois grupos, um com expressão normal de HSP 70 e outro com deficiência
deste gene. Os resultados obtidos mostraram que administração de glutamina
melhorou a sobrevida somente do grupo com expressão normal. Assim,
confirma-se a hipótese de que a expressão de HSP 70 é necessária para o
efeito benéfico da glutamina no estresse e admite-se que a glutamina pode ser
utilizada para induzir resposta protetora e prevenir danos teciduais na vigência
de estresse orgânico.16-19
Metanálise indicou que nutrição parenteral suplementada com dipeptídeo
de glutamina melhorou o balanço nitrogenado, preservou função de órgãos
vitais, reduziu riscos de infecções, favoreceu a proliferação de células do
sistema imunológico e citocinas antiinflamatórias e, principalmente, reduziu a
mortalidade pós-operatória em cirurgias de grande porte sem causar qualquer
efeito colateral.20,21
O racional e as evidências para a utilização da glutamina em pacientes
críticos foram, recentemente, revistas após as publicações de Heyland e
colaboradores, que indicaram possível aumento da mortalidade em pacientes
com disfunção de órgãos que foram suplementados com este
imunonutriente.5,6
6
Embora os dados apresentados sejam passiveis de críticas pertinentes
quanto a possível viés, a conclusão destes estudos reforçam a necessidade de
novos protocolos, experimentais ou não, sobre a utilização deste
imunonutriente e representa uma nova oportunidade para aprofundarmos o
conhecimento sobre os diversos mecanismos de ação da glutamina.
1.2 Pancreatite aguda
A pancreatite aguda (PA) é uma inflamação aguda do pâncreas em
resposta a agressões de origem multifatorial, como organismos vivos,
processos metabólicos, tóxicos e alterações obstrutivas.22
Em sua apresentação clínica, a PA pode evoluir desde quadro leve
caracterizado por edema pancreático até quadros graves com extensa necrose,
disfunção múltipla de órgãos e morte. A evolução e o quadro clínico estão
diretamente relacionados com a extensão da lesão pancreática e a intensidade
da resposta inflamatória.23,24 A pancreatite aguda leve ocorre em 80 a 90% dos
casos e apresenta mortalidade inferior a 1%. Cerca de 10 a 15% dos casos
evoluem de forma grave com mortalidade que pode atingir até 20% e, neste
grupo de doente, a melhor modulação da resposta imune e inflamatória torna-
se de extrema importância para minimizar desfechos clínicos desfavoráveis.24
A resposta inflamatória na PA se caracteriza por um processo sistêmico
com liberação de mediadores inflamatórios, como fator de necrose tumoral – α
(TNF-α), interleucinas (IL) 1, 6 e 8, dentre outros. Esses mediadores
inflamatórios, na apresentação grave da doença, estão associados à
ocorrência de insuficiência respiratória, instabilidade hemodinâmica, alteração
da permeabilidade vascular e insuficiência renal. Em conjunto, esses
fenômenos compõem a síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS) e,
como resultado final, podem resultar em insuficiência de múltiplos órgãos.25
A lesão tecidual na PA se inicia na célula acinar pela ativação de
moléculas de sinalização inflamatória presentes no núcleo e, posteriormente,
pela liberação de mediadores inflamatórios. Sabe-se que a lesão da célula
7
acinar é responsável pelo recrutamento de neutrófilos e macrófagos
circulantes, e pela ativação da cascata inflamatória.25,26
Imediatamente após o início da lesão do tecido pancreático, inicia-se a
resposta inflamatória sistêmica, com aumento de mediadores pró-inflamatórios,
como IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-α e PGE2, que é seguida pela liberação de
mediadores anti-inflamatórios, como IL-10 e IL-11, com a finalidade de
contrarregular o processo inflamatório. No entanto, o prevalente desequilíbrio
entre a produção de citocinas pró em relação a anti-inflamatórias é frequente
em pancreatite. Tal fato estabelece o grau da resposta sistêmica.25,26 A relação
direta entre mediadores inflamatórios e gravidade da doença, já evidenciada
em estudos prévios, nos permite concluir que a dosagem de níveis séricos de
mediadores inflamatórios pode ser utilizada como fator prognóstico na PA.26,27
Em um segundo momento, na fase inicial de intensa resposta
inflamatória, há a ocorrência de quebra de mecanismos da barreira intestinal
com aumento da permeabilidade da mucosa e translocação bacteriana.28,29
O manejo nutricional representa uma das medidas mais importantes na
PA. Em sua apresentação grave, a doença representa significativo risco
metabólico, inflamatório e infeccioso, o que exige uma terapia nutricional
adequada e precoce. Na vigência de PA, aumentam sobremaneira as
demandas nutricionais, pois a doença desencadeia uma exacerbada resposta
inflamatória local e sistêmica que resultam em hipermetabolismo e
hipercatabolismo acentuados.
A adequada conduta nutricional visa, principalmente, ao repouso
glandular, evitando-se, assim, o estímulo secretório de enzimas digestivas
pancreáticas, que pode perpetuar o estímulo inflamatório e também tem por
objetivo evitar o mecanismo de quebra da barreira intestinal. Medidas como
jejum, alimentação por sonda enteral, localizada, principalmente, na porção
jejunal do TGI, ou terapia nutricional parenteral são, frequentemente,
adotadas30. Associado a essas medidas, o uso de imunonutrientes com
potencial anti-inflamatório tem sido considerado com intuito de minimizar a
inflamação da PA, incluindo o uso de glutamina. Sabe-se, também, que este
imunonutriente, por ser combustível principal para células de mucosa intestinal
(enterócitos, colonócitos) e otimizar as funções imunológicas de células de
8
defesa presentes na mucosa intestinal (linfócitos, macrófagos), apresenta-se
como um potencial instrumento de controle da lesão e evolução na pancreatite
aguda.
1.3 Influências da glutamina na pancreatite aguda
Estudos, experimentais e clínicos, vêm demonstrando benefícios no uso
de imunonutrientes na PA, principalmente com fins terapêuticos.31-35
Sociedades internacionais especializadas em nutrologia defendem
posições divergentes em seus consensos quanto à utilização da glutamina em
pancreatite aguda e pacientes críticos. A Sociedade Europeia (European
Society for Clinical Nutrition and Metabolism - ESPEN) recomenda que, na
hipótese de utilização de nutrição parenteral, deve-se considerar a
suplementação com glutamina devido aos benefícios deste imunonutriente.36 A
posição da sociedade canadense foi revista recentemente e preconiza que, em
pacientes críticos, é fortemente recomendado não utilizar a glutamina
parenteral.37
A suplementação parenteral de glutamina em pancreatite aguda
experimental diminuiu a atrofia intestinal e melhorou a função exócrina da
célula acinar pancreática, comparada à NP padrão sem glutamina. Observou-
se, ainda, aumento significativo dos níveis de albumina e linfócitos, redução do
tempo de nutrição parenteral e internação hospitalar em pacientes
suplementados com dipeptídeo de alanil-glutamina38.
Glutamina parece proteger células e tecidos, atenuar inflamação e
preservar a função metabólica de pacientes em estresse grave. Dose única de
glutamina (0,75g/kg) pode atenuar a ativação do NF-kB, impedir degradação da
proteína inibidora (IkB) e reduzir a intensidade da resposta inflamatória. Esta
resposta está correlacionada com aumento na expressão HSPs na célula.39
Dados recentes indicam que a expressão da proteína de choque térmico
HSP 70 é vital para sobrevida e, na presença de trauma, apresenta uma
redução significativa na sua expressão. Em pacientes críticos, a deficiência de
glutamina diminui a expressão de HSP, contribuindo para aumento da
9
intensidade da resposta inflamatória. Em estudo duplo-cego randomizado, de
pacientes cirúrgicos graves tratados com nutrição parenteral suplementada
com L-alanil-glutamina (0,5g/kg/dia), observou-se aumento da expressão sérica
de HSP 70, diminuição de complicações pós-operatórias e redução do tempo
de permanência na UTI.39
2 RACIONAL E JUSTIFICATIVA DO ESTUDO
13
2 RACIONAL E JUSTIFICATIVA DO ESTUDO
A modulação favorável da resposta inflamatória sistêmica após estresse
traumático pode contribuir para prevenir ou atenuar complicações clínico-
cirúrgicas. Nesse sentido, a terapia nutricional com nutrientes capazes de
modular funções imunológicas torna-se de grande interesse. A Glutamina tem
importante papel neste grupo de nutrientes e seu uso, principalmente quando
administrado pela via parenteral, está associado com a estabilidade ou melhora
de funções imunológicas e modulação favorável de marcadores inflamatórios
na pancreatite aguda (PA). Embora este seja o resultado de inúmeras
pesquisas sobre o tema, recentemente, diversas publicações a respeito
trouxeram å tona a importância de maiores esclarecimentos e evidências
cientificas suficientes que justifiquem a utilização deste aminoácido,
principalmente em doentes críticos.
A PA experimental se destaca por ser de técnica factível, com
metodologia amplamente explorada em diversos estudos por nossa equipe de
pesquisadores. Neste estudo, serviu como modelo indutor de grave estresse
inflamatório local e sistêmico.40,41
Na literatura e em nossa experiência prática, doentes submetidos a
grandes traumas, complexas cirurgias do aparelho digestivo e longos períodos
de isquemia pancreática por ocasião de cirurgias cardiovasculares e by-pass
cardiopulmonar podem desenvolver pancreatite aguda em até 10% dos
casos.42-45 A pancreatite pós-operatória (PPO) é resultado indesejável dos
avanços da cirurgia moderna e sua gravidade é de fácil entendimento, pois, ao
trauma cirúrgico já ocorrido, vem somar-se o trauma metabólico adicional, com
suas graves consequências. Não há como estabelecer a frequência exata da
PPO, pois, muitas vezes, seu diagnóstico passa despercebido no pós-
operatório complicado ou é reconhecido apenas por meio da autópsia.
Procedimentos que envolvem a manipulação e infusão de contraste no
ducto pancreático e biliar comum, como colangiopancreatografia retrógrada
(ERCP), também podem ocasionar pancreatite com incidência que varia de 5 a
14
40% dos pacientes.46-48 Uma vez instalada, a pancreatite aguda pode contribuir
para o aumento de taxas de morbidade e mortalidade, e sua gravidade tem
relação com o grau da lesão pancreática e intensidade da resposta inflamatória
sistêmica.
A hipótese do presente estudo considera que o uso parenteral de solução
de glutamina anterior ao evento gerador de estresse pode repercutir na
resposta inflamatória e modificar a mortalidade da PA.
3 OBJETIVOS
17
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Avaliar a repercussão do uso parenteral prévio de glutamina sobre a
modulação da resposta inflamatória sistêmica e mortalidade em modelo
inflamatório representado pela pancreatite aguda em ratos.
3.2 Objetivos específicos
1. Avaliar o efeito da infusão parenteral prévia de glutamina em
parâmetros inflamatórios e imunológicos associados à indução de
resposta inflamatória local e sistêmica por meio da pancreatite aguda
experimental, em três diferentes tempos: 2, 12 e 24 horas;
2. Avaliar o efeito da infusão parenteral prévia de glutamina na
mortalidade de animais submetidos à pancreatite aguda experimental.
4 MATERIAIS E MÉTODOS
21
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Local de execução
O estudo experimental foi realizado pelo Laboratório de Nutrição e
Cirurgia Metabólica do Aparelho Digestivo – LIM – 35 da Disciplina de Cirurgia
do Aparelho Digestivo do Departamento de Gastroenterologia da Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo – FMUSP – em parceria com o
Laboratório de Investigação Médica 37 – LIM 37 – da Disciplina de Transplante
e Cirurgia do Fígado, Laboratório de Emergências Clínicas – LIM 51,
Departamento de Anatomia Patológica da FMUSP e Laboratório de
Bromatologia da Faculdade de Saúde Pública da Universidade de São Paulo.
O protocolo experimental foi desenvolvido no Laboratório de Nutrição e Cirurgia
Metabólica do Aparelho Digestivo (LIM 35) da Disciplina de Cirurgia do
Aparelho Digestivo do Departamento de Gastroenterologia da Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo – FMUSP – em parceria com o
Laboratório de Investigação Médica 37 (LIM 37) da Disciplina de Transplante e
Cirurgia do Fígado, Laboratório de Emergências Clínicas (LIM 51) e
Departamento de Anatomia Patológica da FMUSP. O estudo contou com o
apoio financeiro de auxílio pesquisa da Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado de São Paulo – FAPESP, Processo nº 2011/02071-7; fornecimento de
frascos de solução parenteral L-alanil glutamina (Dipeptiven® 20%), pela
Fresenius-Kabi; doação por comodato de 10 bombas de infusão volumétrica
pela Baxter Hospitalar; e confecção de bolsas parenterais específicas para o
estudo pela Farmácia de Manipulação Farmoterápica.
4.2 Aspectos éticos
O presente estudo e todos os procedimentos envolvidos em seu protocolo
foram aprovados pela Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa
22
da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (CAPPesq -
Protocolo nº 0266/09).
4.3 Delineamento experimental
O presente estudo foi conduzido em duas fases distintas:
Fase 1: Repercussão do uso parenteral prévio de glutamina sobre
biomarcadores da resposta inflamatória sistêmica em modelo de PA:
Após adaptação, animais de experimentação foram submetidos à
cateterização venosa central, infusão parenteral de solução salina 0,9% ou de
glutamina, indução de PA por infusão de ácido taurocólico a 3% no ducto
biliopancretaico e sacrifício por punção cardíaca em períodos crescentes de
tempo (2, 12 e 24 horas após indução de PA), com coleta de amostras de
sangue e tecidos.
Grupos experimentais da Fase 1
Delineamento na Fase 1:
As etapas desta fase foram executadas em dois diferentes intervalos de
duas e doze horas após a indução de pancreatite aguda.
Grupo Sham: submetido à CVC, sem infusão parenteral por 48 horas e
indução de PA.
Grupo Salina (SS) ou controle: submetido à CVC, com infusão parenteral de
solução salina 0,9% por 48 horas e indução de PA.
Grupo Glutamina (GG): submetido à CVC, com infusão parenteral de L-alanil
glutamina por 48 horas e indução de PA.
infusão parenteral de óleo de peixe e indução de PA.
23
Tempo de 2 horas:
n=10 animais/grupo;
Cateterização sistema venoso central;
Infusão parenteral de solução salina por 24 horas em todos os grupos;
Infusão parenteral de solução proposta (salina e glutamina) por 48
horas exceto no grupo Sham;
Indução de pancreatite aguda por ácido taurocólico 3% após
laparotomia e cateterização do ducto biliopancreático;
Sacrifício e coleta de material após 2 horas da indução de pancreatite.
Tempo de 12 horas:
n=7 animais/grupo;
Cateterização sistema venoso central;
Infusão parenteral de solução salina por 24 horas em todos os grupos;
Infusão parenteral de solução proposta (salina e glutamina) por 48
horas, exceto no grupo Sham;
Indução de pancreatite aguda por ácido taurocólico 3% após
laparotomia e cateterização do ducto biliopancreático;
Sacrifício e coleta de material após 12 horas da indução de pancreatite.
Tempo de 24 horas:
n= 7 animais/grupo;
Cateterização sistema venoso central;
Infusão parenteral de solução salina por 24 horas em todos os grupos;
Infusão parenteral de solução proposta (salina e glutamina) por 48
horas exceto no grupo Sham;
Indução de pancreatite aguda por ácido taurocólico 3% após
laparotomia e cateterização do ducto biliopancreático;
Sacrifício e coleta de material após 24 horas da indução de pancreatite.
24
Fase 2 - Repercussão da infusão parenteral prévia de glutamina na
sobrevida de ratos submetidos à PA:
Após adaptação, animais de experimentação foram submetidos à
cateterização venosa central, infusão parenteral de solução salina 0,9% ou de
glutamina, indução de PA por infusão de ácido taurocólico a 3% no ducto
biliopancretaico e observação por até 7 dias. No sétimo dia, os animais que
sobreviveram foram sacrificados por punção cardíaca.
Grupos experimentais da Fase 2
Delineamento na Fase 2:
n= 20 animais/grupo;
Cateterização sistema venoso central;
Infusão parenteral de solução salina por 24 horas em todos os
grupos;
Infusão parenteral de solução proposta (salina e glutamina) por 48
horas exceto no grupo Sham;
Indução de pancreatite aguda por ácido taurocólico 3% após
laparotomia e cateterização do ducto biliopancreático;
Observação da taxa de mortalidade a cada período de 8 horas em
animais que não foram sacrificados após indução de pancreatite
aguda por até 7 dias.
Grupo Sham: submetido à CVC, sem infusão parenteral por 48 horas e indução
de PA.
Grupo Salina (SS) ou controle: submetido à CVC, com infusão parenteral de
solução salina 0,9% por 48 horas e indução de PA.
Grupo Glutamina (GG): submetido à CVC, com infusão parenteral de L-alanil
glutamina por 48 horas e indução de PA.
infusão parenteral de Glutamina por 48 horas e indução de PA.
infusão parenteral de óleo de peixe e indução de PAz.
25
4.4 Procedimentos gerais
4.4.1 Animais de experimentação
Foram estudados ratos isogênicos da linhagem Lewis (n=131), machos, com
peso médio de 300 gramas provenientes do Biotério do Centro Multidisciplinar
para Investigação Biológica (CEMIB) da Universidade Estadual de Campinas
(UNICAMP). As normas de proteção e cuidados aos animais de
experimentação foram seguidas no início do projeto de pesquisa segundo
Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), de acordo com
Resolução nº 032/2006, seguido de normas do Comitê de Ética em Pesquisa
da FMUSP (CEP).
4.4.2 Período de adaptação
Cinco dias anteriores à cateterização venosa central; os animais foram
mantidos em gaiolas individuais, em temperatura controlada (20 e 25°C) com
livre acesso à água e ração padrão (Nuvilab CR1, Nuvital Nutrientes S.A,
Paraná, Brasil) no LIM 35, para adaptação ao ambiente de pesquisa.
4.4.3 Cateterização do Sistema Venoso Central (CVC)
Inicialmente; animais foram pesados em balança digital (Marte
Balanças®) com auxílio de recipiente apropriado para este fim. Após obtenção
do peso, procedemos ao cálculo das doses dos anestésicos utilizados. Foram
administrados o cloridrato de cetamina na dose de 80 mg/Kg (Ketamin-S(+)®
Cristália, Brasil) e o cloridrato de xilazina na dose de 8,0 mg/Kg (Rompun 2%®
- Bayer, Brasil), conforme indicação do fabricante (General Reference Book for
Sedation and Anaesthesia, Bayer – 2004). A indução anestésica foi realizada
com a aplicação da dose estabelecida na região intraperitonial do animal. Sob
26
efeito anestésico, o animal foi tricotomizado, com auxílio de lâmina de bisturi
número 11 no local determinado de cada procedimento cirúrgico. A assepsia
do local foi realizada com álcool iodado a 2%. Conforme técnica padronizada
por Lima-Gonçalves e colaboradores; o animal é mantido em decúbito dorsal
horizontal e sobre a região supraclavicular direita, previamente protegida por
campo estéril, é realizada incisão transversa de; aproximadamente; 1,0 cm por
planos até localização da veia.49 Posicionamos o animal em decúbito ventral e;
com auxílio de agulha Intracath (Biotecno Produtos Plásticos e Médicos Ltda.,
São Paulo), tunelizamos o tecido subcutâneo em direção à região dorsal, com
exteriorização a 1,0 cm da região retroauricular. Pelo interior do Intracath,
passamos o cateter de silicone (Ciencor® Brasil), de; aproximadamente; 1,0
mm de diâmetro e 70,0 mm de comprimento, o qual é tracionado pelo túnel em
direção à incisão inicial. Fixamos na região dorsal do animal a peça
intermediária representada por agulha anatomicamente adequada para ratos e
soldada à pequena peça metálica que possui duas asas laterais do tipo
“borboleta”. Estas laterais contêm dois orifícios paralelos em cada extremidade
para fixação ao dorso do animal por meio de dois pontos separados com fio
mononylon 3-0 (Shalon® suturas, Brasil). Em seguida, o animal é colocado em
decúbito dorsal e realiza-se a dissecção e reparo da veia jugular direita com fio
de algodão 4-0, estéril, pré-cortado, não absorvível e não agulhado (Polycot® -
Ethicon, New Jersey, EUA). A porção proximal da veia é ligada com o mesmo
fio de reparo e a porção distal é cateterizada por meio da introdução de tubo de
silicone posicionado peri-incisão pela tunelização anterior e contendo solução
fisiológica heparinizada (Figura 1). A incisão da pele é suturada de forma
contínua com fio mononylon 3-0 e desinfetada com álcool iodado 2%.
27
Figura 1 – Fases da cateterização do sistema venoso central
4.4.4 Infusão parenteral
Finalizada a cateterização venosa central (CVC), os animais foram
distribuídos em gaiola metabólica individual, conectando-se a “borboleta” ao
intermediário de infusão, que gira em torno de seu eixo, permitindo livre
movimentação do animal, denominado swivel. Ao swivel, foi conectado um
cateter de polietilieno, de aproximadamente 120 mm, ligado a equipo de
infusão graduado (Equipo para bomba Colleague® - Baxter Hospitalar Ltda.),
contendo soro fisiológico 0,9%.
28
No pós-operatório imediato da CVC, todos os animais receberam infusão
(0,3 mL/h) de solução salina 0,9% durante 24 horas, permanecendo em jejum
oral e água ad libitum. Após este período, os animais foram aleatoriamente
divididos em diferentes grupos: 1. Grupo Salina ou controle (SS) que
permaneceu sob infusão de solução salina 0,9% por mais 48 horas; 2. grupo
Glutamina, que passou a receber infusão de glutamina por 48 horas; 3. Grupo
SHAM, que teve seu cateter ocluído e não recebeu infusão intravenosa. Todos
os grupos de animais permaneceram com livre acesso à dieta oral padrão e
água ad libitum.
As soluções infundidas foram encaminhadas em bolsas individuais de
infusão, previamente preparadas pela empresa Farmacêutica de Manipulação
Farmoterápica (São Paulo, Brasil). Padronizou-se o volume total de infusão
diária de 6 mL de solução por animal na velocidade de 0,3 ml/hora. Para isso,
as bolsas de infusão do grupo glutamina foram preparadas pela adição de
1,0g/Kg de L-alanil glutamina (±1,25mL; Dipeptiven® 20%, composição na
Tabela 4) acrescidos de solução salina 0,9% em quantidade suficiente para
atingir-se o volume final total de 6 mL.
A troca das bolsas parenterais foram efetuadas a cada período de 24
horas para garantia de adequada estabilidade físico-química e microbiológica
da solução na bolsa parenteral previamente formulada pela empresa
Farmacêutica de Manipulação – Famoterápica – São Paulo, Brasil.
O acompanhamento dos animais foi realizado diariamente ao longo de
todo experimento. As observações, como infusão endovenosa e eventuais
alterações do estado geral do animal, foram registradas em fichas
individualizadas. Animais com a retirada ou perda do swível e do equipo foram
considerados não adequados para o estudo e foram excluídos.
Após o término da infusão parenteral proposta ou período de 48 horas
(caso do grupo SHAM), os animais foram, imediatamente, submetidos à PA,
conforme método descrito a seguir.
29
Esquema ilustrativo da infusão de bolsas parenterais de grupos salina e
tratamento com glutamina em bomba de infusão contínua:
Figura 2 – Bomba para infusão parenteral e animal com dispositivo de infusão na região dorsal após cateterização venosa
Tabela 1 - Composição da solução parenteral de glutamina
Composição Dipeptiven® 20g
N(2)-L-alanil-L-glutamina
Alanina 8,20g
L-glutamina 13,46g
Água para injeção q.s.p. 100ml
Valores fornecidos pelo fabricante (Fresenius-Kabi® Bad - Homburg, Alemanha)
4.4.5 Pancreatite aguda experimental
A pancreatite aguda foi induzida por meio de injeção retrógrada de
solução de taurocolato de sódio a 3% (Taurocholic acid, sodium salt, Sigma-
Chemical Company™, St. Louis, U.S.A) no ducto biliopancreático, na dose de
0,5 ml/animal com tempo médio de infusão de 60 segundos. Previamente a
Grupo Salina ou controle - Solução Salina (SS)
0,9% - 6ml/dia
Grupos Glutamina - Dipeptiven® - 1,25 ml/dia +
4,75 ml de SS = 6ml/dia
BIC: Velocidade de 0,3ml/h
30
esse procedimento, foi realizada anestesia dos animais com administração
intraperitoneal de cloridrato de cetamina 80 mg/Kg (Ketamin-S(+)® Cristália,
Brasil) e cloridrato de xilazina- 8,0 mg/Kg (Rompun 2% ® - Bayer, Brasil),
conforme indicação do fabricante (General Reference Book for Sedation and
Anaesthesia, Bayer – 2004), tricotomia abdominal, antissepsia com polivinil-
pirrolidona-iodo e colocação de campos estéreis.
Procedeu-se a laparotomia por incisão mediana infraxifoídia de,
aproximadamente, 2,0 cm com exteriorização do arco duodenal e pâncreas,
identificação e oclusão do ducto biliar ao nível do hilo hepático com pinça tipo
bulldog, punção da porção contramesentérica do duodeno com agulha 25 x 7 e
cateterização do ducto biliopancreático com cateter de polietileno.
Posteriormente, induziu-se PA foi por meio da injeção retrógrada de solução de
taurocolato de sódio a 3% (Taurocholic acid, sodium salt, Sigma-Chemical
Company™, St. Louis, U.S.A) no ducto biliopancreático, na dose de
0,5mL/animal, com tempo médio de infusão de 60 segundos. Finalmente,
procedeu-se ao fechamento da punção duodenal com ponto em x de fio de
prolene 6-0, e fechamento por planos da parede abdominal, com nylon 3-0
(Figuras 3 e 4).41,42 Após indução de PA, os animais retornaram às gaiolas
metabólicas individuais para acompanhamento e posterior sacrifício nos
determinados intervalos.
31
Figura 3 – Aspecto do arco duodenal e do pâncreas antes da indução da pancreatite. Observa-se o ducto biliopancreático cateterizado e o arco duodenal reparado.
Figura 4 - Aspecto do arco duodenal e do pâncreas após a indução da pancreatite. Presença de hiperemia e edema do tecido peripancreático. O ducto biliopancreático cateterizado e ocluído junto ao hilo hepático e o arco duodenal reparado.
32
4.5 Procedimentos específicos fase 1
Após a indução de pancreatite aguda experimental, todos os animais
foram em intervalos crescentes de 2, 12 e 24 horas induzidos à eutanásia e
coleta de sangue por punção cardíaca, sob anestesia intraperitonial com 80
mg/Kg de cloridrato de cetamina (Ketamin-S(+)® Cristália, Brasil) e 8,0 mg/Kg
de cloridrato de xilazina- (Rompun 2% ® - Bayer, Brasil). Seguida à eutanásia,
procedeu-se a nova abertura da cavidade abdominal para coleta de líquido
ascítico, amostras de fígado e pâncreas, e abertura da cavidade torácica para
coleta de tecido pulmonar. As amostras sanguíneas foram utilizadas para
dosagem dos níveis séricos de citocinas e de amilase; as amostras de líquido
ascítico foram utilizadas para dosagem de TNF-α; e as amostras teciduais
foram utilizadas para avaliações histológicas (pâncreas), de proteínas de
choque térmico (HSP – fígado e pulmão) e de peroxidação lipídica (fígado).
4.5.1 TNF-α no líquido ascítico
A quantidade de TNF-α em líquido ascítico de animais com PA foi
determinada pelo método de imunoensaio (ELISA), por meio da utilização do kit
RT TNF ALPHA ELISA KIT (Life Tecnologies), conforme recomendações do
fabricante.
4.5.2 Análises histológicas
Fragmentos do tecido pancreático foram retirados e fixados em aldeído
fórmico a 10%. Após coleta, foram encaminhados ao Laboratório de Anatomia
Patológica do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo, onde foram incluídos em parafina, cortados em
espessura de 5 µm, corados com a técnica de hematoxilina-eosina e
observados por microscopia ótica.
33
A avaliação do tecido pancreático foi realizada com a utilização da
classificação do processo inflamatório pancreático proposto por Schmidt e
colaboradores50, analisando variáveis: edema, necrose acinar, hemorragia,
necrose gordurosa, inflamação e infiltrado perivascular. A graduação do
processo inflamatório foi realizada com a atribuição de pontos para cada uma
das variáveis descritas, e, posteriormente, analisada e comparada entre os
diferentes grupos estudados.
A análise histológica foi realizada no Departamento de Anatomia
Patológica da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo por
patologista especializado em histologia pancreática, sendo que essa não
possuía conhecimento dos grupos estudados.
4.5.3 Proteínas de choque térmico (HSP) 70 e 90
Aproximadamente, 100 mg de tecido pulmonar e 50 mg do tecido
hepático foram pulverizados em nitrogênio líquido. O material foi
homogeneizado em tampão de lise RIPA (100 mM de Tris-HCl pH 7.5, 1% de
desoxicolato de sódio, 1% de NP40, 150 mM de NaCl, 0.1% SDS) acrescido de
inibidores de proteases (1 mg/mL pepstatina A, 100 mM PMSF). Em seguida,
as amostras foram centrifugadas a 14000g por 10 minutos a 4oC. O
sobrenadante foi coletado, e a concentração de proteínas foi quantificada pelo
método de Bradford (Bio-Rad).
As amostras de proteínas foram acrescidas de tampão de amostra (2%
SDS, 60 mM Tris pH 6.8, 5% de mercaptoetanol, e 0,01% de azul de
bromofenol) e submetidas à eletroforese em um sistema SDS-PAGE, gel 10%
de poliacrilamida (1.5 M Tris-HCl, 10% SDS, 30% bis-acrilamida, 10% de
persulfato de amônia e TEMED). Após a eletroforese, as proteínas foram
transferidas para membrana de nitrocelulose (Bio-Rad) em aparelho semi-dry
transfer (Bio-Rad).
As membranas foram incubadas em solução de bloqueio 5% de leite
desnatado em tampão TBST (50 mM de tampão Tris, pH 8,0, 100 mM NaCl,
1% Tween 20) por 1 hora à temperatura ambiente. Em seguida, foram lavadas
34
em TBST e incubadas com o anticorpo primário contra as proteínas de
interesse (Santa Cruz, Biotecnology) overnight a 4ºC. Posteriormente, as
membranas foram incubadas em solução contendo anticorpo secundário
conjugado à peroxidase (1:1000) (Santa Cruz, Biotecnology) e expostas ao
sistema de detecção Super Signal (Pierce). A expressão da proteína foi
comparada por densitometria de gel, utilizando-se o programa de domínio
público “Image J”, criado por Wayne Rasband do National Institutes of Mental
Health, NIH, USA, e previamente utilizado para a determinação de HSP 70 e
HSP 90.51
4.5.4 Amilase sanguínea
Amilase sanguínea foi quantificada por método enzimático colorimétrico,
com emprego do kit MAK009 (Sigma-Aldreich®), conforme recomendações do
fabricante.
4.5.5 Citocinas séricas
Os níveis séricos de IL-1, IL-2, IL-4, IL-10, INF-γ e TNF-α foram
determinados em 500 µL de soro por imunoensaio com microesferas do tipo
multiplex, com uso de kit disponível comercialmente para ratos (Recytmag-
65K-07, Genesis Ltda.) em analisador Luminex (Luminex®, MiraiBio, Alameda,
CA), de acordo com as instruções do fabricante.
4.6 Procedimentos específicos da Fase 2
Após indução de PA, os 20 ratos de cada grupo permaneceram em
observação pelo período máximo de até 7 dias com livre acesso à dieta oral
padrão e água ad libitum. Os animais foram observados individualmente em
intervalos de 8 horas para registro de óbitos. Aqueles animais que
35
sobreviveram até o 7º dia pós-PA foram sacrificados por aprofundamento de
anestésico, com injeção intraperitonial com 80 mg/Kg de cloridrato de cetamina
(Ketamin-S(+)® Cristália, Brasil) e 8,0mg/Kg de cloridrato de xilazina- (Rompun
2% ® - Bayer, Brasil).
4.7 Análise estatística
Para a análise estatística dos dados, adotou-se limite de confiança de 5%
para todos os testes realizados. Dados de biomarcadores inflamatórios e
histológicos, foram comparados entre os grupos utilizando-se análise de
variância (ANOVA), em conformidade com a normalidade e teste Kruskal-
Wallis. Diferenças entre os grupos foram avaliadas pelo t de Student com
correção de Bonferroni. A mortalidade dos animais foi avaliada por Teste Exato
de Fisher e a Sobrevida pelo Gráfico de Kaplan Meier. As análises estatísticas
foram realizadas com SPSS 18,0 para Windows (SPSS, Chicago, IL, EUA).
5 RESULTADOS
39
5 RESULTADOS
5.1 Fase 1 – Estudo do impacto da infusão parenteral prévia de glutamina 2 ,12 e 24 horas após indução de PA
5.1.1 Tempo de 2 horas
Fizeram parte da análise desta fase 30 animais, utilizados para avaliação
dos biomarcadores heat shock protein (HSP) 70 e 90 no fígado e no pulmão,
TNF-alfa no líquido ascítico, citocinas séricas, amilase sérica e da histologia do
pâncreas.
5.1.1.1 HSP 90 hepática após 2 horas de indução de PA
Não foram expressos níveis detectáveis de HSP 90 no fígado nos
diferentes grupos estudados.
5.1.1.2 HSP 90 pulmonar após 2 horas de indução de PA
Encontrou-se aumento significativo da expressão da HSP 90 no pulmão
no grupo glutamina, comparado com o grupo SHAM (ANOVA, p = 0,0071) e no
grupo salina, comparado ao grupo SHAM (ANOVA, p= 0,0168). Os dados da
expressão da HSP 90 no pulmão encontram-se na Figura 5.
40
Figura 5 - Expressão (unidades arbitrárias - U.A) de HSP 90 no pulmão 2 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções.
5.1.1.3 HSP 70 hepática após 2 horas de indução de PA
Não foram encontradas diferenças entre os grupos na quantificação de
HSP 70 no fígado (ANOVA, p = 0,1749) - Figura 6.
Figura 6 - Expressão (unidades arbitrárias - U.A) de HSP 70 no fígado 2 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções.
41
5.1.1.4 HSP 70 pulmonar após 2 horas de indução de PA
Não foram encontradas diferenças entre os grupos na quantificação de
HSP 70 no pulmão (ANOVA, p = 0,3719 ) - Figura 7.
Figura 7 - Expressão (unidades arbitrárias – U.A.) de HSP 70 no pulmão 2 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções.
5.1.1.5 TNF- α no líquido ascítico após 2 horas de indução de PA
Não foram encontradas diferenças entre os grupos na quantificação de
TNF- α no líquido ascítico (ANOVA, p > 0,05).
5.1.1.6 Citocinas séricas após 2 horas de indução de PA
Não foram encontradas diferenças entre os grupos na quantificação de
citocinas séricas IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-γ e TNF-α (ANOVA, p > 0,05)
após 2 horas de PA. Os resultados das dosagens de citocinas estão descritos
na Tabela 2.
42
Abaixo, temos alguns descritivos das variáveis quantitativas separados
pelos grupos, e o nível descritivo.
Tabela 2 - Concentração sérica (pg/mL) de citocinas 2 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções
Variável Grupo Média Mediana Desvio Padrão
Mínimo Máximo 1º
Quartil 3º
Quartil P-valor
IL-1a
Controle 38,70 14,41 56,71 4,67 171,00 4,67 47,89
0,5526 Glutamina 12,46 4,67 17,97 4,67 59,56 4,67 12,27
Sham 33,28 8,47 51,89 4,67 166,00 4,67 47,89
IL-4
Controle 6,72 3,98 5,10 3,98 16,02 3,98 8,90
0,9701 Glutamina 7,08 3,98 8,93 3,98 30,87 3,98 3,98
Sham 6,16 3,98 5,28 3,98 20,38 3,98 3,98
IL-2
Controle 32,22 25,50 22,67 13,30 86,43 22,32 31,21
0,8326 Glutamina 31,89 23,89 27,23 4,50 97,24 22,31 30,38
Sham 25,39 23,10 11,35 11,90 43,91 17,69 33,71
IL-6
Controle 496,82 200,00 939,53 33,11 2809,00 76,71 289,50
0,6444 Glutamina 444,29 178,00 586,11 33,11 1712,00 33,11 452,00
Sham 1731,03 336,00 2687,18 33,11 7943,00 33,11 3135,00
IL-10
Controle 513,63 400,00 422,09 110,00 1490,00 294,50 560,00
0,2882 Glutamina 716,00 539,00 569,28 144,00 1960,00 298,00 893,00
Sham 339,05 336,50 211,34 81,30 662,00 168,00 482,00
IFNy
Controle 74,01 72,62 52,86 22,15 185,00 30,44 89,41
0,1418 Glutamina 62,51 55,67 38,64 10,40 154,00 55,67 64,15
Sham 96,69 85,25 64,21 47,18 272,00 64,15 93,61
TNFa
Controle 11,10 8,44 11,52 1,82 34,53 1,82 15,97
0,3902 Glutamina 8,83 11,22 6,34 1,82 18,49 1,82 11,22
Sham 6,18 1,82 7,89 1,82 24,96 1,82 8,53
5.1.1.7 Amilase sérica após 2 horas de indução de PA
Não foram encontradas diferenças estatísticas no valor total de amilase
sérica entre os grupos de animais (ANOVA, p = 0,3493). Entretanto, ao
avaliarmos sua variabilidade entre os grupos, notamos que esta foi maior nos
animais SHAM, em comparação aos grupos glutamina e salina, e que animais
43
do grupo glutamina apresentaram a menor variabilidade desse marcador, em
comparação com os outros grupos – Figura 8.
Figura 8 - Concentrações de amilase sérica (U/dL) 2 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções.
5.1.1.8 Histologia do pâncreas após 2 horas de indução de PA
Não foram encontradas diferenças da histologia pancreática entre os
grupos referente à análise da somatória das variáveis edema, necrose acinar,
inflamação e infiltrado perivascular, necrose gordurosa e hemorragia (ANOVA,
p = 0,4632) - Figura 9. Abaixo temos que alguns descritivos das variáveis
quantitativas separados pelos grupos, e o nível descritivo na Tabela 3
44
Tabela 3 - Variáveis analisadas na histolologia de 2 horas
Variável Grupo Média Mediana Desvio Padrão
Mínimo Máximo 1º
Quartil 3º
Quartil P-
valor
Edema score
controle 1,50 1,50 0,00 1,50 1,50 1,50 1,50
0,0583 Sham 1,65 1,75 0,58 0,50 2,50 1,50 2,00
Glutamina 1,88 2,00 0,23 1,50 2,00 1,75 2,00
Necrose Acinar score
controle 2,43 2,50 1,06 0,50 3,50 2,00 3,25
0,8366 Sham 2,30 2,50 1,32 0,00 4,00 1,50 3,50
Glutamina 2,75 2,75 0,46 2,00 3,50 2,50 3,00
Infiltrado Inflamatório score
controle 0,71 0,50 0,57 0,50 2,00 0,50 0,50
0,9640 Sham 0,80 0,50 0,63 0,00 2,00 0,50 1,50
Glutamina 0,75 0,50 0,46 0,50 1,50 0,50 1,00
Hemorragia score
Controle 0,29 0,00 0,39 0,00 1,00 0,00 0,50
0,7221 Sham 0,25 0,25 0,26 0,00 0,50 0,00 0,50
Glutamina 0,19 0,00 0,37 0,00 1,00 0,00 0,25
Necrose Gordurosa score
Controle 0,21 0,00 0,39 0,00 1,00 0,00 0,25
0,3754 Sham 0,30 0,25 0,35 0,00 1,00 0,00 0,50
Glutamina 0,50 0,50 0,46 0,00 1,00 0,00 1,00
Score
Controle 5,14 5,00 1,18 3,00 7,00 5,00 5,50
0,4632 Sham 5,30 5,75 2,38 1,50 8,00 3,00 7,50
Glutamina 6,06 6,00 0,94 5,00 7,50 5,25 6,75
Observamos que não houve nenhuma diferença estatisticamente
significativa.
45
Figura 9 - Histologia do pâncreas representada pelo escore total 2 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções.
5.1.2 Tempo de 12 horas
Fizeram parte da análise desta fase 21 animais, utilizados para avaliação
dos biomarcadores heat shock protein (HSP) 70 e 90 no fígado e no pulmão,
citocinas séricas e da histologia do pâncreas.
5.1.2.1 HSP 90 no fígado após 12 horas de indução de PA
Encontrou-se aumento significativo da expressão da HSP 90 no tecido
hepático de animais do grupo glutamina, quando comparados ao grupo SHAM
(ANOVA, p = 0,001) e ao grupo salina (ANOVA, p= 0,0001). Os dados da
expressão da HSP 90 no fígado encontram-se na Figura 10.
46
Figura 10 - Expressão (unidades arbitrárias - U.A.) de HSP 90 no fígado 12 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções.
5.1.2.2 HSP 90 no pulmão após 12 horas de indução de PA
Não foram encontradas diferenças estatísticas na expressão de HSP 90
no pulmão entre os grupos estudados, mas houve uma tendência ao aumento
no grupo glutamina quando comparado aos outros grupos (ANOVA, p =
0,0647). Os dados da expressão da HSP 90 no pulmão encontram-se na
Figura 11.
Figura 11 - Expressão (unidades arbitrárias - U.A.) de HSP 90 no pulmão 12 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções.
47
5.1.2.3 HSP 70 no fígado após 12 horas de indução de PA
Encontrou-se aumento significativo da expressão da HSP 70 no tecido
hepático de animais do grupo glutamina, comparado ao grupo salina (ANOVA,
p = 0,0063) e uma tendência ao aumento no grupo glutamina quando
comparado ao grupo SHAM (ANOVA, p = 0,0664). Os dados da expressão da
HSP 70 no fígado encontram-se na Figura 12.
Figura 12 - Expressão (unidades arbitrárias - U.A.) de HSP 70 no fígado 12 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções.
5.1.2.4 HSP 70 no pulmão após 12 horas de indução de PA
Não foram encontradas diferenças estatísticas na expressão de HSP 70
no pulmão entre os grupos estudados, mas houve uma tendência ao aumento
no grupo glutamina quando comparado aos outros grupos (ANOVA, p =
0,0660). Os dados da expressão da HSP 70 no pulmão encontram-se na
Figura 13.
48
Figura 13 - Expressão (unidades arbitrárias - U.A) de HSP 70 no pulmão 12 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções.
5.1.2.5 Citocinas séricas após 12 horas de indução de PA
Não foram encontradas diferenças entre os grupos na quantificação de
citocinas séricas IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-γ e TNF-α (ANOVA, p > 0,05)
após 12 horas de PA. Os resultados das dosagens de citocinas estão descritos
na Tabela 3.
Abaixo, temos alguns descritivos das variáveis quantitativas separados
pelos grupos, e o nível descritivo.
49
Tabela 4 - Concentração sérica (pg/mL) de citocinas 12 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis
Variável Grupo Média Mediana Desvio Padrão
Mínimo Máximo 1º
Quartil 3º
Quartil P-valor
IL-1a
Controle ou Salina
22,42 15,60 18,05 6,13 60,29 11,40 31,86
0,5737 Glutamina 23,42 13,57 21,97 6,45 63,50 9,48 33,94
Sham 19,76 8,57 23,07 6,13 74,94 6,13 17,86
IL-4
Controle ou Salina
9,16 5,91 8,97 1,35 30,24 4,88 9,23
0,4642 Glutamina 8,99 5,91 7,32 2,17 20,64 3,91 15,38
Sham 11,05 2,17 22,20 1,35 69,72 1,35 6,98
IL-2
Controle ou Salina
46,38 49,40 39,19 3,57 114,00 10,97 72,34
0,8145 Glutamina 51,40 46,75 35,17 11,65 94,91 18,16 90,19
Sham 55,51 37,89 49,37 13,04 158,00 24,44 48,50
IL-6
Controle ou Salina
6099,39 220,00 9506,94 7,50 25288,00 50,13 12704,00
0,9715 Glutamina 6943,39 331,25 15874,90 25,16 39324,00 29,70 1619,00
Sham 2757,04 1789,00 3393,82 7,50 9654,00 113,00 5319,00
IL-10
Controle ou Salina
718,07 142,00 1160,21 36,67 3459,00 99,08 691,00
0,9645 Glutamina 965,41 482,50 1214,17 60,19 3181,00 65,28 1521,00
Sham 519,87 273,00 655,94 65,67 2032,00 96,09 617,00
IFNy
Controle ou Salina
14,61 6,50 16,62 6,50 51,29 6,50 6,50
0,9080 Glutamina 21,59 6,50 36,95 6,50 97,02 6,50 6,50
Sham 24,00 6,50 52,50 6,50 164,00 6,50 6,50
TNFa
Controle ou Salina
4,98 4,84 3,41 1,91 12,84 2,17 5,86
0,8624 Glutamina 4,73 3,91 2,91 1,92 8,44 2,17 8,05
Sham 7,79 4,19 9,19 1,91 30,72 2,43 9,21
50
5.1.2.6 Histologia do pâncreas após 12 horas de indução de PA
Não foram encontradas diferenças da histologia pancreática entre os
grupos, referente à análise da somatória das variáveis: edema, necrose acinar,
inflamação e infiltrado perivascular, necrose gordurosa e hemorragia (ANOVA,
p = 0,606) - Figura 14.
Abaixo temos que alguns descritivos das variáveis quantitativas
separados pelos grupos, e o nível descritivo (Tabela 5).
Tabela 5 – Variáveis analisadas na histolologia de 12 horas
Variável Grupo Média Mediana Desvio Padrão
Mínimo Máximo 1º
Quartil 3º
Quartil P-valor
Edema
Score
Salina 1,9 2,0 0,5 1,5 2,5 1,5 2,5
0,0507 SHAM 1,6 1,5 0,5 1,0 3,0 1,5 1,5
Glutamina 2,3 2,5 0,4 1,5 2,5 2,5 2,5
Necrose
Salina 3,1 3,5 1,3 0,5 4,0 3,0 4,0
0,5139 SHAM 3,2 3,0 0,8 1,5 4,0 3,0 3,5
Glutamina 2,4 2,0 1,4 0,5 4,0 2,0 3,5
Inflamação
Salina 0,8 0,5 0,7 0,0 1,5 0,5 1,5
0,9845 SHAM 0,8 0,5 0,6 0,5 2,0 0,5 0,5
Glutamina 0,8 1,0 0,6 0,0 1,5 0,5 1,0
Hemorragia
Salina 0,3 0,0 0,5 0,0 1,5 0,0 0,5
0,8402 SHAM 0,2 0,0 0,4 0,0 1,0 0,0 0,0
Glutamina 0,2 0,0 0,3 0,0 0,5 0,0 0,5
Esteatonecrose
Salina 1,1 1,0 0,7 0,5 2,5 0,5 1,5
0,4146 SHAM 0,9 1,0 0,8 0,0 2,0 0,0 1,5
Glutamina 0,6 0,0 0,9 0,0 2,0 0,0 1,0
Score
Total
Salina 7,3 7,0 2,1 4,0 9,5 6,0 9,0
0,6064 SHAM 6,6 6,0 1,4 4,5 9,0 6,0 7,5
Glutamina 6,3 6,0 2,1 4,5 9,5 4,5 7,0
51
Figura 14 - Histologia do pâncreas representada pelo escore total 12 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções.
5.1.3 Tempo de 24 horas
Fizeram parte da análise desta fase 20 animais, utilizados para avaliação
dos biomarcadores heat shock protein (HSP) 70 e 90 no fígado e no pulmão, e
citocinas séricas.
5.1.3.1 Citocinas séricas após 24 horas de indução de PA
Não foram encontradas diferenças entre os grupos na quantificação de
citocinas séricas IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-γ e TNF-α (ANOVA, p > 0,05)
após 24 horas de PA. Os resultados das dosagens de citocinas estão descritos
na Tabela 7.
A seguir, temos alguns descritivos das variáveis quantitativas separados
pelos grupos, e o nível descritivo.
52
Tabela 6 – Concentração sérica (pg/mL) de citocinas 24 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis
Variável grupo Média Mediana Desvio Padrão
Mínimo Máximo 1º
Quartil 3º
Quartil P-valor
IL-1a
Salina 41,22 1,84 68,75 1,84 189,00 1,84 46,08
0,5830 Sham 75,82 72,61 72,43 1,84 178,00 1,84 128,00
Glutamina 40,85 12,49 78,00 1,84 216,00 1,84 25,98
IL-4
Salina 15,40 1,30 27,62 1,30 76,46 1,30 13,10
0,3978 Sham 22,55 19,72 21,10 1,30 50,47 1,30 42,82
Glutamina 12,02 1,30 25,34 1,30 69,17 1,30 4,88
IL-2
Salina 74,02 74,03 57,64 7,43 148,00 27,12 117,21
0,2495 Sham 138,45 135,50 78,61 43,37 267,00 83,31 166,00
Glutamina 100,00 70,94 109,02 0,58 258,00 17,49 167,75
IL-6
Salina 592,41 369,00 639,52 75,42 1801,00 184,21 766,50
0,4577 Sham 419,80 464,50 237,85 21,79 676,00 293,00 599,00
Glutamina 1962,68 903,00 3423,10 21,79 9663,00 486,50 1089,00
IL-10
Salina 117,63 65,83 119,10 27,02 295,00 34,62 183,18
0,5535 Sham 47,85 51,42 27,81 0,96 86,12 39,50 57,66
Glutamina 107,99 77,82 106,33 0,96 318,00 54,16 125,41
IFNy
Salina 20,15 4,01 42,71 4,01 117,00 4,01 4,01
0,7764 Sham 23,70 4,01 30,50 4,01 63,08 4,01 63,08
Glutamina 49,58 4,01 120,57 4,01 323,00 4,01 4,01
TNFa
Salina 17,11 13,02 11,75 5,43 36,38 9,19 23,27
0,5788 Sham 23,41 22,27 16,02 0,07 43,34 14,12 38,39
Glutamina 17,88 16,31 21,73 0,07 63,92 3,94 18,50
Observamos que não houve diferença estatisticamente significativa.
53
5.1.3.2 HSP 70 no pulmão após 24 horas de indução de PA
Encontrou-se aumento significativo da expressão da HSP 70 no tecido
pulmonar de animais do grupo Sham, comparado ao grupo salina (ANOVA, p =
0,0041) e ao grupo glutamina (ANOVA, p < 0,0001). Os dados da expressão da
HSP 70 no pulmão encontram-se na Figura 15.
Figura 15 - Expressão (unidades arbitrárias - U.A) de HSP 70 no pulmão 24 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções.
54
5.1.3.3 HSP 90 no fígado após 24 horas de indução de PA
Encontrou-se aumento significativo da expressão da HSP 90 no tecido
hepático de animais do grupo Sham, comparado ao grupo salina (ANOVA, p =
0,0003) e ao grupo glutamina (ANOVA, p < 0,0001). Os dados da expressão da
HSP 90 no fígado encontram-se na Figura 16.
Figura 16 - Expressão (unidades arbitrárias - U.A.) de HSP 90 no fígado 24 horas após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis submetidos à infusão parenteral de diferentes soluções.
5.2 Analise cinética de citocinas
Com o intuito de se avaliar o comportamento cinético das citocinas,
realizou-se a análise nos diferentes tempos nos grupos.
55
5.2.1 Comparação da cinética de citocinas nos diferentes tempos
5.2.1.1 Grupo Salina
Abaixo, temos os descritivos das variáveis quantitativas separados pelos
tempos, e o nível descritivo.
Tabela 7 – Concentração sérica (pg/mL) de citocinas nos tempos analisados após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis que receberam infusão parenteral de solução salina
Variável Grupo Média Mediana Desvio Padrão
Mínimo Máximo 1º
Quartil 3º
Quartil P-valor
IL-1a
2 Hrs 38,70 14,41 56,71 4,67 171,00 4,67 47,89
0,5867 12 Hrs 22,42 15,60 18,05 6,13 60,29 11,40 31,86
24 Hrs 41,22 1,84 68,75 1,84 189,00 1,84 46,08
IL-4
2 Hrs 6,72 3,98 5,10 3,98 16,02 3,98 8,90
0,5142 12 Hrs 9,16 5,91 8,97 1,35 30,24 4,88 9,23
24 Hrs 15,40 1,30 27,62 1,30 76,46 1,30 13,10
IL-2
2 Hrs 32,22 25,50 22,67 13,30 86,43 22,32 31,21
0,3925 12 Hrs 46,38 49,40 39,19 3,57 114,00 10,97 72,34
24 Hrs 74,02 74,03 57,64 7,43 148,00 27,12 117,21
IL-6
2 Hrs 496,82 200,00 939,53 33,11 2809,00 76,71 289,50
0,6244 12 Hrs 6099,39 220,00 9506,94 7,50 25288,00 50,13 12704,00
24 Hrs 592,41 369,00 639,52 75,42 1801,00 184,21 766,50
IL-10
2 Hrs 513,63 400,00 422,09 110,00 1490,00 294,50 560,00
0,0245 12 Hrs 718,07 142,00 1160,21 36,67 3459,00 99,08 691,00
24 Hrs 117,63 65,83 119,10 27,02 295,00 34,62 183,18
IFNy
2 Hrs 74,01 72,62 52,86 22,15 185,00 30,44 89,41
0,0016 12 Hrs 14,61 6,50 16,62 6,50 51,29 6,50 6,50
24 Hrs 20,15 4,01 42,71 4,01 117,00 4,01 4,01
TNFa
2 Hrs 11,10 8,44 11,52 1,82 34,53 1,82 15,97
0,0596 12 Hrs 4,98 4,84 3,41 1,91 12,84 2,17 5,86
24 Hrs 17,11 13,02 11,75 5,43 36,38 9,19 23,27
56
Observamos que as variáveis IL-10 (p-valor = 0,0245), e IFNy (p-valor =
0,0016) foram estatisticamente significativas. Abaixo, temos as comparações
múltiplas para cada variável (Tabela 8).
IL-10
Tabela 8 – Comparação cinética da variável IL 10 no grupo Salina
Comparação p-valor
2 Hrs 12 Hrs 0,7136
2 Hrs 24 Hrs 0,0004
12 Hrs 24 Hrs 0,2321
Temos que houve diferença significativa entre o grupo 2 horas e 24
horas (p-valor = 0,0004).
IFNy
Tabela 9 – Comparação cinética da variável IFn y no grupo Salina
Comparação p-valor
2 Hrs 12 Hrs 0,0010
2 Hrs 24 Hrs 0,0500
12 Hrs 24 Hrs 0,0904
Temos que houve diferença significativa entre o grupo 2 horas e 12 horas
(p-valor = 0,0010), e entre as 2 horas e 24 horas (p-valor = 0,0500).
5.2.1.2 Grupo SHAM
A seguir, temos os descritivos das variáveis quantitativas separados pelos
tempos, e o nível descritivo.
57
Tabela 10 – Concentração sérica (pg/mL) de citocinas nos tempos analisados após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis que não receberam infusão parenteral
Variável Grupo Média Mediana Desvio Padrão
Mínimo Máximo 1º
Quartil 3º
Quartil P-valor
IL-1a
2 Hrs 33,28 8,47 51,89 4,67 166,00 4,67 47,89
0,6202 12 Hrs 19,76 8,57 23,07 6,13 74,94 6,13 17,86
24 Hrs 75,82 72,61 72,43 1,84 178,00 1,84 128,00
IL-4
2 Hrs 6,16 3,98 5,28 3,98 20,38 3,98 3,98
0,5555 12 Hrs 11,05 2,17 22,20 1,35 69,72 1,35 6,98
24 Hrs 22,55 19,72 21,10 1,30 50,47 1,30 42,82
IL-2
2 Hrs 25,39 23,10 11,35 11,90 43,91 17,69 33,71
0,0020 12 Hrs 55,51 37,89 49,37 13,04 158,00 24,44 48,50
24 Hrs 138,45 135,50 78,61 43,37 267,00 83,31 166,00
IL-6
2 Hrs 1731,03 336,00 2687,18 33,11 7943,00 33,11 3135,00
0,8484 12 Hrs 2757,04 1789,00 3393,82 7,50 9654,00 113,00 5319,00
24 Hrs 419,80 464,50 237,85 21,79 676,00 293,00 599,00
IL-10
2 Hrs 339,05 336,50 211,34 81,30 662,00 168,00 482,00
0,0027 12 Hrs 519,87 273,00 655,94 65,67 2032,00 96,09 617,00
24 Hrs 47,85 51,42 27,81 0,96 86,12 39,50 57,66
IFNy
2 Hrs 96,69 85,25 64,21 47,18 272,00 64,15 93,61
0,0014 12 Hrs 24,00 6,50 52,50 6,50 164,00 6,50 6,50
24 Hrs 23,70 4,01 30,50 4,01 63,08 4,01 63,08
TNFa
2 Hrs 6,18 1,82 7,89 1,82 24,96 1,82 8,53
0,0506 12 Hrs 7,79 4,19 9,19 1,91 30,72 2,43 9,21
24 Hrs 23,41 22,27 16,02 0,07 43,34 14,12 38,39
Observamos que as variáveis IL-2 (p-valor = 0,0020), IL-10 (p-valor =
0,0027), e IFNy (p-valor = 0,0014) foram estatisticamente significativas. Abaixo,
temos as comparações múltiplas para cada variável.
IL-2
Tabela 11 – Comparação cinética da variável IL-2 no grupo Sham
Comparação p-valor
2 Hrs 12 Hrs 0,1203
2 Hrs 24 Hrs <0,0001
12 Hrs 24 Hrs 0,0047
58
Temos que houve diferença significativa entre o grupo 2 horas e 24 horas
(p-valor = 0,0001), e entre as 12 horas e 24 horas (p-valor = 0,0047).
IL-10
Tabela 12 – Comparação cinética da variável IL-10 no grupo Sham
Comparação p-valor
2 Hrs 12 Hrs 0,9915
2 Hrs 24 Hrs <0,0001
12 Hrs 24 Hrs <0,0001
Temos que houve diferença significativa entre o grupo 2 horas e 24 horas
(p-valor < 0,0001), e entre as 12 horas e 24 horas (p-valor < 0,0001).
IFNy
Tabela 13 – Comparação cinética da variável IFn y no grupo Sham
Comparação p-valor
2 Hrs 12 Hrs 0,0258
2 Hrs 24 Hrs 0,0019
12 Hrs 24 Hrs 0,6231
Temos que houve diferença significativa entre o grupo 2 horas e 12 horas
(p-valor = 0,0258), e entre as 2 horas e 24 horas (p-valor = 0,0019).
5.2.1.3 Grupo Glutamina
A seguir, temos alguns descritivos das variáveis quantitativas separados
pelos grupos (tempos), e o nível descritivo.
59
Tabela 14 – Concentração sérica (pg/mL) de citocinas nos tempos analisados após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis que não receberam infusão parenteral de Glutamina
Variável Grupo Média Mediana Desvio Padrão
Mínimo Máximo 1º
Quartil 3º
Quartil P-valor
IL-1a
2 Hrs 12,46 4,67 17,97 4,67 59,56 4,67 12,27
0,2916 12 Hrs 23,42 13,57 21,97 6,45 63,50 9,48 33,94
24 Hrs 40,85 12,49 78,00 1,84 216,00 1,84 25,98
IL-4
2 Hrs 7,08 3,98 8,93 3,98 30,87 3,98 3,98
0,1645 12 Hrs 8,99 5,91 7,32 2,17 20,64 3,91 15,38
24 Hrs 12,02 1,30 25,34 1,30 69,17 1,30 4,88
IL-2
2 Hrs 31,89 23,89 27,23 4,50 97,24 22,31 30,38
0,5394 12 Hrs 51,40 46,75 35,17 11,65 94,91 18,16 90,19
24 Hrs 100,00 70,94 109,02 0,58 258,00 17,49 167,75
IL-6
2 Hrs 444,29 178,00 586,11 33,11 1712,00 33,11 452,00
0,6114 12 Hrs 6943,39 331,25 15874,90 25,16 39324,00 29,70 1619,00
24 Hrs 1962,68 903,00 3423,10 21,79 9663,00 486,50 1089,00
IL-10
2 Hrs 716,00 539,00 569,28 144,00 1960,00 298,00 893,00
0,0258 12 Hrs 965,41 482,50 1214,17 60,19 3181,00 65,28 1521,00
24 Hrs 107,99 77,82 106,33 0,96 318,00 54,16 125,41
IFNy
2 Hrs 62,51 55,67 38,64 10,40 154,00 55,67 64,15
0,0077 12 Hrs 21,59 6,50 36,95 6,50 97,02 6,50 6,50
24 Hrs 49,58 4,01 120,57 4,01 323,00 4,01 4,01
TNFa
2 Hrs 8,83 11,22 6,34 1,82 18,49 1,82 11,22
0,3330 12 Hrs 4,73 3,91 2,91 1,92 8,44 2,17 8,05
24 Hrs 17,88 16,31 21,73 0,07 63,92 3,94 18,50
Observamos que as variáveis IL-10 (p-valor = 0,0258), e IFNy (p-valor =
0,0077) foram estatisticamente significativas. Abaixo, temos as comparações
múltiplas para cada variável.
IL-10
Tabela 15 – Comparação cinética da variável IL-10 no grupo Glutamina
Comparação p-valor
2 Hrs 12 Hrs 0,9925
2 Hrs 24 Hrs 0,0007
12 Hrs 24 Hrs 0,3849
60
Temos que houve diferença significativa entre o grupo 2 horas e 24 horas
(p-valor = 0,0007).
IFNy
Tabela 16 – Comparação cinética da variável IFn y no grupo Glutamina
Comparação p-valor
2 Hrs 12 Hrs 0,1174
2 Hrs 24 Hrs 0,0990
12 Hrs 24 Hrs 0,0989
Não conseguimos encontrar onde houve a significância. Mas o tempo
diferenciou dos demais com um nível de significância de 10% (o p-valor foi de,
aproximadamente, 0,099 em ambos).
Os gráficos a seguir, representam o perfil cinético das interleucinas que
apresentaram diferença significativa (p ≤ 0,05 ) ou tendência (Figuras 17,18, 19
e 20).
Figura 17 - Concentração sérica (pg/mL) de IL-2 nos grupos estudados em diferentes tempos após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis
61
Figura 18 - Concentração sérica (pg/mL) de IL-10 nos grupos estudados em diferentes tempos após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis
Figura 19 - Concentração sérica (pg/mL) de IFNy nos grupos estudados em diferentes tempos após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis
Figura 20 - Concentração sérica (pg/mL) de TNF nos grupos estudados em diferentes tempos após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis
62
Figura 21 – Visão geral do comportamento das concentrações séricas (pg/mL) de IFNy, IL-2, IL-10, e TNF nos grupos estudados em diferentes tempos após a indução de pancreatite aguda em ratos Lewis
5.3 Fase 2 – Estudo da mortalidade de 7 dias de animais que receberam infusão de glutamina ou solução salina e animais que não receberam infusão parenteral prévia à indução de PA
5.3.1 Mortalidade
Considerando todos os grupos experimentais, observamos que não
houve associação entre o sacrifício no sétimo dia com os grupos (Teste Exato
de Fisher, p= 0,5183) – Tabela 17.
63
Tabela 17 – Contingência entre as variáveis qualitativas com o grupos
Grupo
Sacrifício Total
Sim Não
N % N % N %
Soro 8 27,6% 7 46,7% 15 34,1%
Glutamina 8 27,6% 3 20,0% 11 25,0%
SHAM 13 44,8% 5 33,3% 18 40,9%
Total 29 100,0% 15 100,0% 44 100,0%
Legenda: N - animais que apresentaram evento de morte antes do sétimo dia S – animais que chegaram até o sétimo dia e foram sacrificados
5.3.2 Análise da sobrevida
Observamos que o grupo controle teve uma curva de sobrevida menor
que os demais. O p-valor pelo teste de log rank foi de 0,438. Assim, não
podemos afirmar que há diferença entre as curvas de sobrevida.
Abaixo, temos a tabela com o número total de casos em cada grupo, e o
número de eventos (óbitos).
Tabela 18 – Número de eventos de morte nos diferentes grupos até o 7º dia
Grupo Total Número de
eventos
Controle 15 7
Glutamina 11 3
SHAM 18 5
A seguir, temos a curva de sobrevida (Kapla-Meier).
64
Figura 22 - Curva de sobrevida dos animais nos diferentes grupos até o sétimo dia
5.4 Perda de peso
Apesar de não proposto no plano de pesquisa inicial do presente estudo,
a análise da perda de peso dos animais após a infusão parenteral das soluções
propostas e antes da indução da pancreatite aguda também foi investigada.
Encontramos maior perda de peso no grupo SHAM, quando comparado aos
outros grupos experimentais, porém sem significância estatística (Kruskall-
Wallis, p= 0,9373) – (Anexo A) e Figuras 23, 24 e 25.
65
Figura 23 - Perda de peso (g) de ratos Lewis prévio à infusão parenteral de diferentes soluções
Figura 24 - Perda de peso (g) de ratos Lewis após a infusão parenteral de diferentes soluções
Figura 25 - Delta peso (g) de ratos Lewis após a infusão parenteral de diferentes soluções e prévio à indução de PA
6 DISCUSSÃO
69
6 DISCUSSÃO
6.1 Do método
6.1.1 Dos animais
Estudos experimentais com ratos têm sido amplamente utilizados devido
à facilidade de manuseio, adaptação ao ambiente laboratorial e reprodução de
modelos de pesquisa.52
Ratos da linhagem Lewis são considerados isogênicos e foram
elaborados a partir do cruzamento de animais consanguíneos por gerações
consecutivas, gerando populações estáveis e geneticamente homogêneas.53
A homogeneidade genética possibilita a redução do número de animais
por experimento pela maior uniformidade dos resultados encontrados.54,55 Uma
de suas principais indicações são em modelos inflamatórios experimentais.56
A opção por animais do mesmo sexo foi a escolhida com o intuito de se
evitar possíveis alterações hormonais.
6.1.2 Do delineamento experimental
Acesso venoso: conforme técnica padronizada por Lima-Gonçalves e
colaboradores, realizamos a cateterização da veia jugular externa, amplamente
utilizada em estudos prévios realizados pelo nosso grupo.57-60
A utilização do cateter venoso de silicone acoplado à peça giratória
intermediária (Swivel) desenvolvida artesanalmente pelo Grupo METANUTRI,
em parceria com a Escola Politécnica da USP, viabilizou a livre-movimentação
dos animais e possibilitou a infusão das soluções propostas sem
intercorrências, já que permite a total mobilização do animal dentro das gaiolas
individuais.61
70
Outra característica peculiar deste modelo de cateterização é que esta
permitiu a infusão de soluções com diferentes osmolaridades sem
complicações.
6.1.3 Da Infusão parenteral
6.1.3.1 Glutamina parenteral
A Gln atua como um aminoácido essencial durante o estresse catabólico
e condições críticas. Representa importante fonte de combustível para
linfócitos e enterócitos, substrato para a glutationa e a síntese de proteínas de
choque térmico (HSP).62-64 Estas propriedades biológicas associadas a sua
variedade de formas de atuação podem contribuir para melhorar a função da
barreira intestinal e linfócitos, atenuar a resposta inflamatória e preservar
diversas funções metabólicas.65-67
A administração intravenosa da Gln permite sua rápida disponibilidade
para o uso das células e, possivelmente, pode ser vantajosa em conseguir a
modulação inflamatória e proteção celular em estados inflamatórios.
Por ser muito instável em sua apresentação original, é, frequentemente,
utilizada sob a forma de dipeptídeo L alanil-glutamina. Deste modo, a Gln
possui boa estabilidade e uma meia-vida de minutos, o que confere adequado
perfil de segurança a sua administração.
Na presente pesquisa, a infusão de Gln na forma de dipeptídeo ocorreu
na dose de 1 g/kg/dia na velocidade de 0,3 ml/hora pelo período de 48 horas
previamente à indução de PA não se detectando nenhum sinal de
deteriorização clínica dos animais. Estudo clínico mostrou que a intervenção
farmacológica com Gln na dose entre 0,35 a 0,5 g/kg/dia pode ser uma
intervenção salva-vidas em grupos bem definidos de pacientes críticos.68
Em Metanálise publicada por Zheng e colaboradores, a nutrição
parenteral suplementada com dipeptídeo de Gln melhorou o balanço
nitrogenado, preservou função de órgãos vitais, reduziu riscos de infecções,
favoreceu a proliferação de células do sistema imunológico e citocinas anti-
71
inflamatórias, e, principalmente, reduziu a mortalidade pós-operatória em
cirurgias de grande porte sem causar qualquer efeito colateral.69
Devido ao seu rápido metabolismo, o rato tem excelente tolerância à
administração endovenosa de Gln. O fornecimento endovenoso diário de altas
doses de glutamina na forma de dipeptídeo evidenciou que estes animais não
apresentam reações clínicas expressivas ou fatais.70
É fato, também, que a Gln, devido a suas características de atuação por
diversas vias e mecanismos na cascata inflamatória, vem sendo utilizada nos
estudos como forma de atenuar a inflamação na doença já instalada ou seja
como uma aliada no tratamento, e quanto mais precoce a sua suplementação
melhor os resultados em termos de complicações clínicas, infecciosas e na
mortalidade.71
Wischmeyer, em recente publicação envolvendo mais de 2000 pacientes,
concluiu que a suplementação parenteral de Gln, quando associado ao suporte
nutricional, está associada à significante redução na mortalidade hospitalar e
tempo de internação.3 De forma distinta, Chen e colaboradores concluíram que
a suplementação de Gln não trouxe benefícios na mortalidade e no tempo de
internação hospitalar em pacientes críticos, exceção feita à população de
pacientes cirúrgicos. No entanto, houve redução na taxa de infecção hospitalar.
Os dados sugerem que os efeitos da suplementação de Gln estão diretamente
relacionados à população-alvo da terapia, vias de administração e doses.4
Corroborando ainda mais com a conflitante literatura sobre o uso da Gln,
recentes ensaios clínicos randomizados de grande escala não encontraram
efeitos benéficos da suplementação de glutamina em pacientes com doença
crítica e deixou em aberto diversos questionamentos sobre o tema.
Em estudo realizado com 1223 pacientes críticos que receberam Gln em
altas doses com o intuito de fármaco nutrição, independente da nutrição
artificial, publicado por Heyland e colaboradores, conclui que houve aumento
da mortalidade.6 Seguindo a mesma linha de conclusão, o estudo Metaplus trial
mostrou que dieta enteral enriquecida com Gln levou ao aumento da
mortalidade após 6 meses no grupo suplementado.72
72
Com o intuito de analisar as potenciais heterogeneidades entre os
diferentes grupos de pacientes estudados até o momento e as diferentes vias
para a administração de Gln, Tao e colaboradores conduziram uma revisão de
53 estudos. Encontrou-se evidência moderada de que a suplementação de Gln
reduziu a taxa de infecção e de dias de ventilação mecânica, e evidências de
baixa qualidade no que diz respeito ao tempo de internação hospitalar em
pacientes criticamente doentes ou cirúrgicos. Quanto à mortalidade e ao tempo
de internação em UTI, a suplementação com Gln parece ter pouco ou nenhum
efeito.73
Possível explicação para a enorme heterogeneidade e não uniformidade
sobre os resultados foi discutido em revisão que analisou publicações dos
últimos vinte anos e concluiu que estudos até 2003 mostram efeitos benéficos
enquanto os mais recentes falharam em demonstrar efeitos positivos com a
suplementação de Gln.74
Diversos estudos tentaram explorar os efeitos benéficos atribuídos a Gln
parenteral na condição de PA.
Primeiramente, foram elaboradas estratégias de suplementação
associadas à prescrição de nutrição artificial. Fuentes-Orosco concluiu, em
estudo conduzido com pacientes portadores de PA grave, que a
suplementação de Gln associado à nutrição parenteral foi capaz de reduzir
complicações infecciosas e melhorar o perfil inflamatório sem alteração na
duração de permanência hospitalar, bem como, na taxa de mortalidade.75
De modo concordante com estes dados, Jafari e colaboradores
conduziram metanálise que mostrou menor taxa de complicações infecciosas
com a suplementação parenteral de GLN, mas, agora, acrescida de melhora na
taxa de mortalidade e no tempo de internação.76
Tendo como base as evidências e perspectivas positivas, diversos
autores seguiram sugerindo que a suplementação com Gln deveria ser
estimulada devido aos aparentes benefícios conferidos à população de doentes
com PA e condições críticas, e que novos estudos com delineamentos bem
detalhados e perfil de custo da suplementação deveriam ser
desenvolvidos.77-79
73
Assim posto, após resultados conflitantes apresentados, principalmente,
na população de doentes críticos, metanálise conduzida por Yong e
colaboradores concluiu que, na pancreatite aguda severa, a suplementação
endovenosa de Gln representa a melhor escolha quando comparada a outros
modelos de nutrição convencionais sem aumento nos custos hospitalares, fato
também observado por Ochenga e colaboradores.80,81
Seguindo pela mesma linha de raciocínio científico, no que se refere à
melhor via de suplementação, Metanálise com, aproximadamente, 505 doentes
concluiu que a Gln suplementada pela via parenteral apresenta vantagens
superiores a outras vias, e que pacientes que recebem nutrição enteral não são
beneficiados com a suplementação parenteral de Gln.82
Como vimos ao longo desta discussão, ainda que numerosos estudos
publicados sugiram vantagens com a suplementação de Gln na PA, recente
revisão sistemática sobre a utilização de antioxidantes nesta condição concluiu
que, embora haja um possível benefício, a utilização de Gln deve ser mais bem
observada em grandes estudos randomizados e bem conduzidos.83
Alguns aspectos da presente pesquisa a tornam pioneira na literatura
sobre o assunto. Como observamos, a utilização da Gln está quase sempre
associada a algum esquema de prescrição nutricional seja ela enteral ou
parenteral.
Nosso protocolo considerou infundir, pela via parenteral, Gln previamente
à PA, como um agente imunomodulator independente da terapia nutricional.
Esta abordagem representa uma vertente contemporânea em usar imuno-
fármaco-nutrientes como uma ferramenta terapêutica. Publicação de
Fernandez-Bustamante mostrou que o breve tratamento com Gln enteral
prévio à inoculação de lps e IL 1 foi capaz de melhorar o perfil de resposta em
macrófagos e capilares alveolares de ratos.84
Não obstante a utilização prévia ao insulto ser característica peculiar de
poucas pesquisas, estudos recentes vêm desenvolvendo a hipótese da
imunomodulação, na tentativa de favorecer o curso clínico da PA baseados nas
evidências previamente descritas.85-87
74
Pesquisa experimental recentemente publicada explorou os efeitos da Gln
isolada no tratamento da pancreatite induzida em ratos e concluiu que sua
utilização foi capaz de melhorar as funções cardiovascular, hepática, pulmonar
e renal, assim como a microcirculação pancreática, e diminuir os níveis de
interleucinas pró-inflamatórias, principalmente IL 6, e a mortalidade.88
Embora evidências em pesquisa experimental demonstrarem benefícios
em diversos parâmetros com a fármaco-modulação, existem, até o momento,
terapias farmacológicas promissoras com alvo em vários aspectos da
patogênese da PA que não podem ser plenamente aplicadas na prática clínica.
A dificuldade em se saber o momento exato de intervenção associada à
intensidade da resposta inflamatória faz com que várias tentativas de
imunomodulação isoladamente fracassem.
A PA representa complexa cascata de resposta inflamatória, e, diante
deste conhecimento, a estratégia multimodal com diferentes agentes
farmacológicos ou um fármaco-modulador capaz de agir em diferentes vias
pode proporcionar maiores benefícios.89
Nesta pesquisa, a eleição da Gln parenteral isolada prévia ao insulto
inflamatório representa uma nova hipótese de abordagem em condições de
estresse, com o intuito de modular favoravelmente a inflamação, diante das
várias formas de atuação deste nutriente.
6.1.3.2 Solução salina parenteral
Sabidamente, a PA, devido à intensa resposta inflamatória local e
sistêmica, cursa com alterações precoces na microcirculação pancreática e no
sequestro líquido, com impacto negativo na patogênese e gravidade da
doença. Associado a isto, desordens circulatórias na parede intestinal facilitam
a translocação bacteriana e perpetuam o mecanismo de inflamação associado
à infecção, levando à falência múltipla de órgãos.90,91
Dentre as medidas não específicas utilizadas com o intuito de se evitar
maiores repercussões clínicas da doença, a agressiva reposição volêmica é
fundamental para a prevenção de complicações sistêmicas e visa estabilizar a
75
permeabilidade capilar, modular a reação inflamatória, e sustentar a função da
barreira intestinal.92-95
Optamos pela utilização da solução salina composta por fluidos
cristaloides adicionada com eletrólitos como controle devido a ser a mais
utilizada na ressuscitação volêmica da PA. Objetivou-se preparar o pâncreas
para o insulto de inflamação por meio da melhora da perfusão microcirculatória
e da oxigenação.
6.2 Do modelo de pancreatite experimental
O desenvolvimento de técnicas e modelos experimentais de PA que
buscam se assemelhar à situação humana são largamente utilizados em
pesquisa. A indução de repercussão inflamatória local e sistêmica são uma
ferramenta essencial para aumentar a compreensão dos complexos
mecanismos envolvidos na etiologia, na patogênese e na elaboração de
estratégias terapêuticas para esta doença, principalmente para teste com
novas terapias de regulação do sistema imunológico.96
De modo geral, o modelo ideal de PA deve ter diversos atributos, dentre
os quais, ser facilmente reproduzido, ter a capacidade de controlar a gravidade
da doença e baixo custo. Tendo em vista as restrições metodológicas dos
modelos de PA estabelecidos para a investigação terapêutica, muitas tentativas
têm sido feitas para desenvolver, modificar ou combinar modelos disponíveis.
Embora nenhum dos modelos existentes seja completamente satisfatório e
totalmente comparável com todo o espectro da PA humana, estes não devem
ser descartados por completo. Muito do conhecimento atual sobre a doença
tem origem a partir dos modelos experimentais. Estes podem ser divididos em
variedades invasivas e não invasivas de acordo com o método de indução da
PA. Modelos não invasivos são representados pela administração de ceruleína,
álcool, dietas específicas, arginina, manipulações genéticas e imunológicas. Os
modelos invasivos envolvem a manipulação cirúrgica do animal e consistem de
alterações e oclusões anatômicas, alterações perfusionais e vasculares, e a
injeção de sais biliares no ducto pancreático.97
76
Sabe-se, porém, que, apesar de certos modelos serem mais adequados
que outros para responder perguntas específicas, um dos fatores mais
relevantes em termos práticos é a padronização técnica.
Neste sentido, após extenso treinamento prático e teórico, optou-se pelo
método invasivo de infusão sob pressão constante de ácido taurocólico a 3%
através do ducto biliar comum. Em ratos, esta técnica é relatada como um
modelo representativo da fisiopatologia da doença, com resposta inflamatória
sistêmica grave e como ferramenta bem definida para avaliar a falência múltipla
de órgãos, refletindo os mesmos acontecimentos observados na prática
clínica.97-100
A técnica foi desenvolvida durante toda a pesquisa por um único
pesquisador e reproduzindo, em todas as etapas, a metodologia previamente
publicada pelo grupo.101-103
Com este modelo, no período de 2 a 24h após infusão, ocorre a PA aguda
com uma taxa de mortalidade aproximada de até 25% em 72 horas.97
O conhecimento das características deste modelo de PA determinaram o
início da observação dos mediadores inflamatórios e sacrifício a partir de 2
horas após a indução de PA corroborando com os dados publicados por
Schneider e colaboradores.104 Neste modelo, sabe-se, também que, após 24
horas de PA, há importante injúria da barreira intestinal com sobreposição de
mecanismos infecciosos sobre os inflamatórios, o que nos fez limitar o período
de análise neste tempo.105
Certamente, a transposição de achados experimentais para a
interpretação de eventos inflamatórios que ocorrem em doenças humanas
requer cautela e senso crítico, mas podem ser aproveitados no propósito de se
estudar os mecanismos indutores e perpetuadores da inflamação, assim como
fatores imunorreguladores e mediadores do processo, e estabelecer sugestões
e caminhos que possam trazer benefícios ao tratamento.
77
6.3 Das variáveis clínicas e laboratoriais
6.3.1 Peso
Todos os animais estudados foram submetidos à análise da perda de
peso antes e após a infusão parenteral das soluções propostas. Com isto,
objetivamos diminuir o viés nutricional imediatamente anterior à indução de PA.
Todos os grupos estudados apresentaram perda de peso no intervalo de
infusão parenteral. É possível que a perda de peso observada tenha sido em
decorrência do estresse cirúrgico e da presença do cateter venoso central.
6.3.2 Amilase
A Amilase sérica após 2 horas de indução de PA foi avaliada para
comprovarmos a eficácia do modelo experimental de indução de PA.
Todos os animais estudados apresentam aumento importante dos níveis
de amilase no período.
A análise em períodos superiores (12 e 24h) pode ser influenciada pela
extensão da necrose pancreática e seus valores podem não ser fidedignos
para se estabelecer a extensão inflamatória e, até mesmo, a gravidade da
doença.106
De modo não consensual, a literatura considera que o nível de amilase
pode representar parâmetro de gravidade em modelo experimental com
animais, entretanto, na doença humana, tal observação não se faz
verdadeira.107,108
Embora não foram encontradas diferenças estatísticas na análise da
amilase sérica, ao avaliarmos sua variabilidade entre os grupos, notamos que
esta foi maior nos animais SHAM, em comparação aos grupos Gln e Controle,
e que animais do grupo Gln apresentaram a menor variabilidade desse
marcador, em comparação com os outros grupos. De modo empírico, podemos
inferir que a infusão tanto de glutamina quanto de solução salina parece
modular e organizar favoravelmente a liberação de amilase neste modelo.
78
6.4 Das variáveis inflamatórias
Investigações prévias demonstram que o desenvolvimento da PA exibe
uma estreita relação com o desequilíbrio do sistema imunológico. A significativa
liberação dos mediadores pró-inflamatórias (IL-1, IL-6 e TNF-α) na fase inicial
da doença é reportada como prejudicial ao prognóstico e desfecho
clínico.24,109-111
Devido a complexos mecanismos envolvidos na liberação e curso da
inflamacão mediada por citocinas, modelos animais vem sendo testados na
tentativa de se determinar a cinética destes biomarcadores.112
Em estudo experimental no modelo de PA induzida por taurocolato de
sódio Meyer e colaboradores evidenciaram o aumento precoce de citocinas
pró-inflamatórias e anti-inflamatórias apos 2 h.113
No presente estudo a infusão parenteral de Gln previa a indução de PA
não evidenciou alterações significativas nos níveis séricos das citocinas
estudadas quando comparadas entre os grupos.
Dados publicados em estudo conduzido por Yu e colaboradores
evidenciaram que o perfil de expressão das citocinas segue um cronograma
temporal definido em ratos submetidos a PA. Ao analisarem o perfil cinético
das citocinas (IL-1, TNF-α e IL-6) concluiram que houve um rapido aumento
apos 3 hs de inducao de PA, com pico aproximado por volta de 6 h e declinio
no periodo de 12 a 24 h.114
Com base neste conhecimento realizamos a analise do perfil cinetico das
citocinas estudadas nos diferente grupos. Evidenciamos uma tendência ao
aumento nos níveis de TNF-α observada apenas em animais do grupo SS e
Sham sendo que neste grupo foi observado um aumento progressivo ao longo
do período estudado. Embora de forma não significativa os dados sugerem que
a não infusão parenteral neste modelo de PA pode perpetuar o aumento de
TNF-α pelo provável mecanismo de isquemia pancreática, fato este que talvez
se comprovaria com a continuidade da analise por tempo mais prolongado,
contrario aos reportados no estudo mencionado acima no qual ha declínio
desta citocina no período de 12 a 24 h. No intrínseco mecanismo envolvido no
curso da PA o persistente aumento do TNF-α pode aumentar a permeabilidade
79
intestinal e facilitar a translocação bacteriana criando um ambiente propício
para a infecção pancreática em uma fase mais tardia da doença.115,116
Ao se observar o perfi cinético das citocinas analisadas concluímos que
houve alterações significativas nos níveis de IFN-y, IL-2 e IL-10. Ao contrario
do ocorrido nos grupos SS e Sham não houve queda significativa nos níveis de
IFN-y no grupo Gln. Somado a isto, nos animais do grupo Sham observou-se
um aumento de IL-2 e declínio de IL-10 no tempo de 24 horas, observação feita
também nos animais dos grupos SS e Gln, mas nestes estas alterações
parecem ser de forma mais gradual ao longo do tempo.
Embora IFN-γ e IL-2 possam deflagrar ou ativar o processo inflamatório,
estas citocinas também apresentam vantagens na PA através da participacao
na depuração de agentes patogênicos, com intuito de se evitar infecções nas
fases tardias da doença conforme publicado por Curley e colaboradoes.117
Novas evidências sobre o contraditório papel do IFN-y no processo
inflamatório foi discutido por Zhang, deixando claro que existem propriedades
inesperadas e pouco exploradas desta citocina na regulação inflamatória e
imunológica.118
Em relação a IL-10, ao exercer potente efeito contra-regulador, esta
citocina tem sido relatada como sendo benéfica no modelo de PA induzida por
taurocolato de sódio.119
No entanto, os dados não foram confirmados no contexto clínico.
Estratégia de tratamento precoce no prazo de até 36 h do início dos sintomas
com IL-10 em PA não mostrou diferenças significativas quando comparado ao
placebo, no que diz respeito ao tempo de internação, aspecto tomográfico,
complicações locais e falência de órgãos.120
Resultados conflitantes também foram reportados em estudos duplo-
cegos e randomizados a respeito da utilização de IL-10, com o intuito de se
evitar a PA induzida pela CPRE.121,122,123
Em tese a explicação para estes resultados parece estar relacionada à
prolongada liberação desta citocina e o mecanismo contra regulador da
síndrome da resposta compensatória anti-inflamatória (CARS).124 O progressivo
aumento de IL-10 pode intensificar o seu efeito anti-inflamatório, perpetuar o
mecanismo da CARS e favorecer a paralisia imune, o que torna o hospedeiro
80
suscetível a infecções secundárias. Em uma impressão inicial, na presente
pesquisa o comportamento da IL-10 no grupo GLN parece seguir a evolução
mais favorável, com aumento precoce e queda gradativa ao longo de 24 h após
a indução de PA.
Diante ao exposto possíveis efeitos benefícos e nocivos associados a
estas citocinas no nosso modelo de inflamação parece residir no seu momento
de liberação em relação `as diferentes fases inflamatórias durante a
progressão da da PA.
Por exemplo, a imunoterapia com IFN-γ em PA parece ser benéfica
apenas na fase tardia da PA, quando complicações infecciosas e a
imunoparalisia podem ser a causa dominante de sua mortalidade.125 Assim, em
estudos experimentais que testaram o tratamento da PA com INF-γ, enquanto
aumento prejudicial da amilase sérica, do edema pancreático, da expressão de
NF-ĸB e de TNF-α foram observados no início do processo inflamatório,
acentuada melhora da doença e progressão da necrose intrapancreática,
acompanhada pela diminuição da ativação de NF –ĸB, expressão de COX-2, e
TNF-α, também foram relatados.126-128
Observados em conjunto, a dinâmica de liberação de INF-γ, IL-2 e IL-10
observada em animais do grupo GLN parece exercer efeito protetor ao tentar
manter a competência imunológica em fases posteriores de progressão da
PA.
É bem conhecido que uma maior expressão de HSP pode exercer efeito
protetor em estados de inflamação. Sabe-se também que a Gln foi amplamente
estudada como um importante fármaco regulador desta maior expressão.64
Em nosso estudo, enquanto modesta variação sobre os níveis de
citocinas foram notados, acentuado efeito foi observado sobre a expressão de
HSPs, principalmente ao concentramos nossa análise no grupo GLN em
relação aos outros grupos. Nossos resultados corroboram com os de Xue et al.
relatando melhora da transcrição do fator de choque térmico (HSF1), um
regulador mestre para a expressão de HSP, após a infusão parenteral de
GLN.129
81
O aumento da expressão hepática de HSP70 e uma tendência ao
aumento da HSP 70 pulmonar foram observados em animais do grupo GLN
12h após AP.
Publicação de Saluja e colaborador concluiu que a maior expressão de
HSP 70 em modelo experimental de PA associou-se com melhorias na
sobrevivência, lesão tecidual e resposta inflamatória.19 Deste modo a indução
precoce da expressão de HSP70 vem sendo alvo de estudos com fins
terapêuticos . Meng e colaboradores pré induziram a expressão de HSP 70 em
ratos, por meio de lavagem peritoneal com solução salina a 42° graus e em
seguida, realizaram lesão pancreática através da injeção intraperitoneal de
ceruleína. Seis horas após a indução da PA, os autores observaram aumento
da expressão de HSP70 no tecido pancreático, correlacionado com menores
níveis séricos de amilase, IL-6, TNF-α e significativa redução do escore de
gravidade histopatológica do pâncreas.130
No que se refere `a expressão de HSP90 hepática e pulmonar, os animais
do grupo GLN exibiram um aumento significativo no tempo de 2 hs em relação
aos animais dos outros grupos.
Resultado inesperado inicialmente foi a maior expressão de HSP70 no
pulmão e HSP90 no fígado de animais do grupo Sham sem tratamento prévio
pela via parenteral. Explicação pertinente se faria perante o grupo Gln já que
conhecemos uma das principais características da glutamina que é a sua
rápida utilização pelas células. Talvez 24 h após a indução de PA a Gln tenha
sido totalmente metabolizada e não mais consiga auxiliar no aumento da
expressão de HSP. Por fim, embora as HSPs 70 e 90 tenham propriedades
citoprotetoras neste modelo experimental, conforme evidenciado previamente
em estudo de Moretti e colaboradores, os dados devem ser interpretados à luz
de desfechos da doença e com base em maior número de estudos clínicos.51
6.5 Das variáveis histológicas
Com o intuito de correlacionarmos os dados analisados com o desfecho
clínico e e demonstrarmos a eficiência do método realizamos o perfil histológico
82
pancreático de acordo com os critérios de Schmidt50. Apesar da expressiva
atividade inflamatória demonstrada pelo aumento de amilse, alterações
citocínicas, expressão de HSPs e até mesmo aumento do escore histológico
pós-PA não verificamos diferença significativa na histologia pancreática.
Contrário aos achados por nós observados, Alhan e colaboradores concluíram
que a infusão de Gln parenteral foi capaz de melhorar o perfil da necrose
pancreática 24 hs apos a indução de PA em ratos.88
No entanto, fator limitante na interpretação de nossos resultados é a
ausência de análise histológica pancreática no período de 24 horas.
Certamente, neste período, teríamos maior ocorrência de necrose pancreática
que por consequência nos proporcionaria maiores subsídios para confirmar ou
refutar a tese de melhora histológica com a infusão de Gln pura.
6.6 Da mortalidade e sobrevida
No que se refere à mortalidade, as últimas publicações sobre a
suplementação de glutamina na prática clínica são extremamente
controversas. Enquanto alguns autores destacam a influência deletéria sobre
as taxas de mortalidade em pacientes críticos,outros,em contrapartida
divergem plenamente quanto a este potencial incremento nesta variável. 5,6,80,83
Nosso modelo de PA, cursa com mortalidade que varia de 25% com 72 h até
35 % após 7 dias.97,131 Muitas da criticas observadas sobre o aumento da
mortalidade com a suplemenetacao de Gln em estudos clinicos diz respeito a
populacao de doentes e ao momento em que e utilizada. Os dados sugerem
que a suplementacao em um momento em que a disfuncao multipla de orgaos
esta instalada pode agravar o quadro clinico.6
Conforme discutido anteriormente estudo experimental conduzido por
Alhan e colaboradores que explorou os efeitos da Gln isolada no tratamento da
pancreatite induzida em ratos observou significativa redução da mortalidade.88
Em nossa pesquisa não houve diferença significativa na mortalidade de 7
dias apos PA entre os grupos estudados (p = 0,518). Quanto à análise de
sobrevida, observamos que nao houve diferenca estatística entre os grupos
83
apesar de eventos de morte ocorrerem de modo mais tardio no grupo Gln
(intervalo médio = 48 h para Gln vs 24-48 h e 30-36 dias para Sham e SS,
respectivamente; p = 0,79).
Nossos resultados contrariam, a principio de forma não significativa, a
atual vertente de que a infusao de Gln principalmente em doentes criticos
posso aumentar a mortalidade. No entanto cabe ressaltar que o estudo tem
limitações que podem comprometer a tradução de dados para os seres
humanos. Trata – se de estudo experimental no qual a Gln parenteral foi
infundida independente de nutrição parenteral e antes da tensão crítica. Esta
estratégia, embora represente uma tentativa de se antecipar ao futuro estresse
inflamatorio nos impede de saber se o mesmo efeito seria observado caso a
Gln fosse infundida em conjunto com outros nutrientes e se os fatores de
estresse já estavam em andamento.
A principio, nossos dados em conjunto podem sugerir benefícios na
infusão parenteral de Gln prévia a indução de PA aguda experimental. O
aumento na expressão de proteínas de choque HSP 70 e HSP 90 nos tecidos
hepático e pulmonar, embora não demonstre impacto significativo na histologia
pancreática e na taxa de sobrevida e mortalidade, pode representar potencial
vantagem na resolução ou limitação do processo inflamatório local e sistêmico.
É possível que a avaliação cinética de citocinas e a análise
histopatológica com intervalos mais prolongados possa contribuir para melhor
compreensão dos fenômenos envolvidos no mecanismo inflamatório e suas
repercussões no curso da patogênese da PA experimental.
7 CONCLUSÕES
87
7 CONCLUSÕES
Realizado nas condições descritas, o presente estudo permitiu as
seguintes conclusões:
- Gln parenteral prévia à indução de PA não alterou de modo
significativo o perfil de liberação de citocinas e a análise histológica do
pâncreas entre os grupos estudados;
- Gln parenteral parece favorecer a cinética de liberação de INF-γ, IL-2
e IL-10 com possível efeito protetor ao tentar manter a competência
imunologica em fases posteriores de progressão da PA;
- A infusão de Gln prévia a PA mostrou maiores e mais precoces
expressões de HSPs, com possível melhor modulação e resposta ao
processo inflamatório;
- Não houve relação entre a infusão de Gln parenteral com o aumento
de mortalidade ou menor sobrevida.
8 ANEXOS
91
8 ANEXOS
8.1 ANEXO A - Descritivos da variável peso antes e após a infusão parenteral das soluções propostas
Variável Grupo Média Mediana Desvio Padrão
Mínimo Máximo 1º
Quartil 3º
Quartil P-valor
Peso Pré
Soro 291,40 284,00 24,10 264,00 345,00 274,00 302,00
0,3368 Glutamina 278,53 281,00 22,24 242,00 312,00 261,50 296,00
SHAM 289,15 299,00 26,83 238,00 325,00 273,50 310,50
Peso Pós
Soro 288,93 275,00 31,11 250,00 350,00 267,00 308,00
0,3605 Glutamina 273,47 275,00 23,67 234,00 328,00 259,00 286,00
SHAM 283,26 285,00 23,19 243,00 325,00 271,50 298,00
Delta peso
Soro 4,43 2,00 12,55 -13,00 25,00 -6,00 17,00
0,9373 Glutamina 5,07 2,00 24,91 -39,00 42,00 -7,50 24,00
SHAM 5,42 5,00 21,75 -40,00 43,00 -2,50 14,00
9 REFERÊNCIAS
95
9 REFERÊNCIAS
1. Heyland DK, Novak F, Drover JW, Jain M, Su X, Suchner U. Should immunonutrition become routine in critically ill patients? A systematic review of the evidence. JAMA. 2001;286(6):944-53.
2. Waitzberg DL, Lotierzo PHP, Duarte AJS, Schronts E, Cerra. F. Imunonutrição. In: Waitzberg DL. Nutrição oral, enteral e parenteral na prática clínica. 3ª Ed, São Paulo: Atheneu; 2000; 1511-38.
3 Wischmeyer PE, Dhaliwal R, McCall M, Ziegler TR, Heyland DK. Parenteral glutamine supplementation in critical illness: a systematic review. Crit Care. 2014 Apr 18;18(2) ):R76.
4 Chen QH, Yang Y, He HL, Xie JF, Cai SX, Liu AR, Wang HL, Qiu HB. The effect of glutamine therapy on outcomes in critically ill patients: a meta-analysis of randomized controlled trials. Crit Care. 2014;18(1):R8.
5 Heyland DK, Elke G, Cook D, Berger MM, Wischmeyer PE, Albert M, et al; on behalf of the Canadian Critical Care Trials Group. Glutamine and antioxidants in the critically Ill patient: a post hoc analysis of a large-scale randomized trial. JPEN J Parenter Enteral Nutr. 2014;39(4):401-9.
6 Heyland DK, Muscedere J, Wischmeyer PE, Cook D, Jones G, et al; Canadian Critical Care Trials Group. A randomized trial of glutamine and antioxidants in critically ill patients. N Engl J Med. 2013;368(16):1489-97.
7 Dechelotte P, Hasselman M, Cynober L, Allaouchiche B, Coëffier M, Hecketsweiler B, et al. L-Alanyl-L-glutamine dipeptide-supplemented total parental nutrition reduces infectious complications and glucose intolerance in critically ill patients. The French controlled, randomized, double-blind, multicentre study. Crit Care Med. 2006;34(3):598-604.
8 Heyland DK, Dhaliwal R, Drover JW, Gramlich L, Dodek P; Canadian Critical Care Clinical Practice Guidelines Committee. Canadian Critical Care Clinical Practice Guidelines. JPEN J Parenter Enteral Nutr. 2003;27(5):355-73
9 Berg A, Rooyackers O, Norberg A, Wernerman J. Eliminations kinetics of L-alanyl-L-glutamine in ICU patients. Amino Acids. 2005;29(3):221-8.
10 Melis GC, Boelens PG, Van Der Sijp JRM, Popovici T, De Bandt JP, Cynober L, et al. The feeding route (enteral or parenteral) affects the plasma response of the dipetide Ala-Gln and the amino acids glutamine, citrulline and arginine, with the administration of Ala-Gln in preoperative patients. Br J Nutr. 2005;94(1):19-26.
96
11 Mori M, Rooyackers O, Smedberg M, Tjader I, Norberg A, Wernerman J. Endogenous glutamine production in critically ill patients: the effect of exogenous glutamine supplementation. Critical Care. 2014;18(2):R72.
12 Griffiths RD, Allen KD, Andrews FJ, Jones C. Infection, multiple organ failure, and survival in the intensive care unit: influence of glutamine-supplemented parenteral nutrition on acquired infection. Nutrition. 2002;18(7-8):546-52.
13 Newsholme EA, Crabtree B, Ardawi MS. Glutamine metabolism in lymphocytes: its biochemical, physiological and clinical importance. Q J Exp Physiol. 1985;70(4):473-89.
14 Singleton KD, Wischmeyer PE. Glutamine's protection against sepsis and lung injury is dependent on heat shock protein 70 expression. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2007;292(5):R1839-45.
15 Schafer C, Williams JA. Stress kinases and heat shock proteins in the pancreas: possible roles in normal function and disease. J Gastroenterol. 2000;35(1):1-9.
16 Jordan I, Balaguer M, Esteban ME, Cambra FJ, Felipe A, Hernández L, Alsina L, Molero M, Villaronga M, Esteban E. Glutamine effects on heat shock protein 70 and interleukines 6 and 10: Randomized trial of glutamine supplementation versus standard parenteral nutrition in critically ill children. Clin Nutr. 2015 Feb 7.
17 Yang J, Zhang Y, Zhao S, Zhang Z, Tong X, Wei F, Lu Z. Heat shock protein 70 induction by glutamine increases the α‑ synuclein degradation in SHSY5Y neuroblastoma cells. Mol Med Rep. 2015 Jul 2.
18 Singleton KD, Wischmeyer PE. Effects of HSP70 gene knockout on acute respiratory distress syndrome and the inflammatory response following sepsis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2006;290(5):L956-61.
19 Saluja A, Dudeja V. Heat shock proteins in pancreatic diseases. J Gastroenterol Hepatol. 2008;23(Suppl 1):S42-5.
20 Zheng YM, Li F, Zhang MM, Wu XT. Glutamine dipeptide for parenteral nutrition in abdominal surgery: a meta-analysis of randomized controlled trials. World J Gastroenterol. 2006;14;12(46):7537-41.
21 Weitzel LR, Wischmeyer PE. Glutamine in critical illness: the time has come, the time is now. Crit Care Clin Nutr. 2010;26(3):515-25.
22 Bradley EL 3rd. A clinically based classification system for acute pancreatitis. Summary of the International Symposium on Acute Pancreatitis, Atlanta, Ga, September 11 through 13, 1992. Arch Surg. 1993;(5):586-90.
97
23 Brivet FG. Scoring systems and severe acute pancreatitis. Crit Care Med. 2000; 28(8):3124-5.
24 Mayer J, Rau B, Gansauge F, Beger HG. Inflammatory mediators in human acute pancreatitis: clinical and pathophysiological implications. Gut. 2000;47(4):546-52.
25 Rakonczay Z Jr., Hegyi P, Takacs T, McCarroll J, Saluja AK. The role of NF-kappaB activation in the pathogenesis of acute pancreatitis. Gut. 2008; 57(2):259-67.
26 Baldwin AS Jr. The NF-kappa B and I kappa B proteins: new discoveries and insights. Annu Rev Immunol. 1996;14:649-83.
27 Norman J. The role of cytokines in the pathogenesis of acute pancreatitis. Am J Surg. 1998;175(1):76-83.
28 Souza LJ, Sampietre SN, Figueiredo S, Yria Y, Machado MC, Pinotti HW. Translocação bacteriana na pancreatite aguda. Estudo experimental em ratos. Rev Hosp Clin Fac Med S Paulo. 1996;51(4):116-20.
29 Souza LJ, Sampietre SN, Assis RS, Knowles CH, Leite KR, Jancar S, et al. Effect of platelet-activating antagonists (BN-52021, WEB-2170, and BB-882) on bacterial translocation in acute pancreatitis. J Gastrointest Surg. 2001;5(4):364-70.
30 Uhl W, Warshaw A, Imrie C, Bassi C, McKay CJ, Lankisch PG, et al. Guidelines for the surgical management of acute pancreatitis. Pancreatology. 2002;2(6):565-73.
31 Wang X, Li W, Li N, Li J. Omega‐3 fatty acids‐supplemented parenteral nutrition decreases hyperinflammatory response and attenuates systemic disease sequelae in severe acute pancreatitis: a randomized and controlled study. JPEN J Parenter Enteral Nutr. 2008;32(3):236‐41.
32 Foitzik T, Eibl G, Schneider P, Wenger FA, Jacobi CA, Buhr HJ. Omega-3 fatty acid supplementation increases anti-inflammatory cytokines and attenuates systemic disease sequelae in experimental pancreatitis. JPEN J Parenter Enteral Nutr. 2002;26(6):351-6
33 Xiong J, Zhu S, Zhou Y, Wu H, Wang H. Regulation of ω-3 fish oil emulsion on the sirs during the initial stage of severe acute pancreatitis. J Huazhong Univ Sci Technol. 2009;29(1):35-38.
34 Asrani V, Chang WK, Dong Z, Hardy G, Windsor JA, Petrov MS. Glutamine supplementation in acute pancreatitis: a meta-analysis of randomized controlled trials. Pancreatology. 2013;13(5):468-74.
35 Zhong X, Liang CP, Gong S. Intravenous glutamine for severe acute pancreatitis: a meta-analysis. World J Crit Care Med. 2013 Feb 4;2(1):4-8.
98
36 Gianotti L, Meier R, Lobo DN, Bassi C, Dejong CH, Ockenga J, Irtun O, MacFie J; ESPEN Guidelines on Parenteral Nutrition: pancreas. Clin Nutr. 2009;28(4):428-35
37 http://www.criticalcarenutrition.com/docs/CPGs202015/4.1c202015.pdf
38 Morrison AL, Dinges M, Singleton KD, Odoms K, Wong HR, Wischmeyer PE. Glutamine's protection against cellular injury is dependent on heat shock factor-1. Am J Physiol Cell Physiol. 2006;290(6):C1625-32.
39 Ziegler TR, Ogden LG, Singleton KD, Luo M, Fernandez-Estivariz C, Griffith DP, et al. Parenteral glutamine increases serum heat shock protein 70 in critically ill patients. Intensive Care Med. 2005;31(8):1079-86.
40 Banerjee AK, Galloway SW, Kingsnorth AN. Experimental model of acute pancreatitis. Br J Surg. 1994;81:1096-103.
41 Rattner DW. Experimental models of acute pancreatitis and their relevance to human disease. Scand J Gastroenterol. 1996;31(Suppl 219):6-9.
42 Lubianskii VG, Nasonov SV. Acute pancreatitis after resection of stomach for low duodenal ulcer. Khirurgiia (Mosk). 2001(3):8-11.
43 Howard TJ, Moore SA, Saxena R, Matthews DE, Schmidt CM, Wiebke EA. Pancreatic duct strictures are a common cause of recurrent pancreatitis after successful management of pancreatic necrosis. Surgery. 2004;136(4):909-16.
44 Lo SS, Wu CW, Shen KH, Hsieh MC, Lui WY. Higher morbidity and mortality after combined total gastrectomy and pancreaticosplenectomy for gastric cancer. World J Surg. 2002;26(6):678-82.
45 Bailey AA, Bourke MJ, Williams SJ, Walsh PR, Murray MA, Lee EY, et al. A prospective randomized trial of cannulation technique in ERCP: effects on technical success and post-ERCP pancreatitis. Endoscopy. 2008 Apr;40(4):296-301.
46 Freeman ML, DiSario JA, Nelson DB, Fennerty MB, Lee JG, Bjorkman DJ, et al. Risk factors for post-ERCP pancreatitis: a prospective, multicenter study. Gastrointest Endosc. 2001;54(4):425-34.
47 Simmons DT, Petersen BT, Gostout CJ, Levy MJ, Topazian MD, Baron TH. Risk of pancreatitis following endoscopically placed large-bore plastic biliary stents with and without biliary sphincterotomy for management of postoperative bile leaks. Surg Endosc. 2008;22(6):1459-63.
48 Disario JA, Freeman ML, Bjorkman DJ, Macmathuna P, Petersen BT, Jaffe PE, et al. Endoscopic balloon dilation compared with sphincterotomy for extraction of bile duct stones. Gastroenterology. 2004;127(5):1291
99
49 Lima-Gonçalves E, Yamagushi N, Waitzberg DL, Mello Filho GB. Nutrição parenteral em ratos: aspectos técnicos. Acta Cir Bras. 1990;5(1):17-22.
50 Schmidt J, Rattner DW, Lewandrowski R, Compton CC, Mandavilli U, Knoefel WT, et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating in acute pancreatitis. Scand J Gastroenterol. 1992;215(1):44-56.
51 Moretti ALS, Sarmento Rios EC, Soriano FG, Possolo de Souza H, Abatepaulo F, et al. Hypertonic saline increases heat shock proteins 70 and 90 and reduces neutrophil infiltration in lung injury. Pancreas. 2009;38(5):507-14.
52 COBEA - Comissão de Ensino do Colégio Brasileiro de Experimentação em Animais. Manual para Técnicos em Bioterismo. 2a edição, São Paulo; 1996.
53 http://www.harlan.com/products_and_services/research_models_and _services/research_models/lewis_inbred_rat.hl
54 Shaw R, Festing MF, Peers I, Furlong L. Use of factorial designs to optimize animal experiments and reduce animal use. ILAR J. 2002;43(4):223-32.
55 Ferreira LM, Hochman B, Barbosa MVJ. Experimental models in research. Acta Cir Bras. 2005;20(S2):28-34.
56 "Research Animal Models". Charles River. Retrieved 5 August 2012.
57 Lima-Gonçalves E, Yamagushi N, Waitzberg DL, Mello Filho GB. Nutrição parenteral em ratos: aspectos técnicos. Acta Cir Bras. 1990;5:17-22.
58 Waitzberg DL, Bellinati-Pires R, Yamaguchi N, Massali-Oku S, Salgado MM, Hypolito IP, et al. Influence of medium- chain triglyceride-based lipid emulsion on rat polymorphonuclear cell functions. Nutrition. 1996;12(2):93-9.
59 Bertevello PL, De Nardi L, Torrinhas RS, Logullo AF, Waitzberg DL. Partial replacement of ω-6 fatty acids with medium-chain triglycerides, but not olive oil, improves colon cytokine response and damage in experimental colitis. JPEN J Parenter Enteral Nutr. 2012;36(4):442-8.
60 Garib R, Garla P, Torrinhas RS, Bertevello PL, Logullo AF, Waitzberg DL. Effects of parenteral fish oil lipid emulsions on colon morphology and cytokine expression after experimental colitis. Nutr Hosp. 2013;28(3):849-56
61 Campos FG, Waitzberg DL, Habr-Gama A, Logullo AF, Noronha IL, Jancar S, et al. Impact of parenteral n-3 fatty acids on experimental acute colitis. Br J Nutr. 2002;87(S1):S83-8.
100
62 Galizia MS, Alves CC, Tamanaha RB, Torrinhas RS, Leite FC, Neto AH, Gama-Rodrigues J, Waitzberg DL. A new swivel model for parenteral and enteral infusion in rats. J Surg Res. 2005;128(1):3-8.
63 Wischmeyer PE. Glutamine: role in critical illness and ongoing clinical trials. Curr Opin Gastroenterol. 2008 Mar;24(2):190-7
64 Wischmeyer PE. Glutamine: the first clinically relevant pharmacological regulator of heat shock protein expression? Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 2006 May;9(3):201-6.
65 Wischmeyer PE. Glutamine: role in gut protection in critical illness. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 2006 Sep;9(5):607-12.
66 Wang X, Wu K, Wang B, Xu X, Xu M, Gong Z. Effects of glutamine on the intestinal failure in rats model of acute necrotizing pancreatitis. Zhonghua Nei Ke Za Zhi. 2001;40(12):815-8.
67 Foitzik T, Kruschewski M, Kroesen AJ, Hotz HG, Eibl G, Buhr HJ. Does glutamine reduce bacterial translocation? A study in two animal models with impaired gut barrier. Int J Colorectal Dis. 1999;14(3):143-9.
68 Kim M, Wischmeyer PE. Glutamine. World Rev Nutr Diet. 2013;105:90-6.
69 Zheng YM, Li F, Zhang MM, Wu XT. Glutamine dipeptide for parenteral nutrition in abdominal surgery: a meta-analysis of randomized controlled trials. World J Gastroenterol. 2006;12(46):7537-41.
70 http://www.medsafe.govt.nz/profs/datasheet/d/Dipeptiveninf.pdf
71 Xue P1, Deng LH, Xia Q, Zhang ZD, Hu WM, Yang XN, Song B, Huang ZW. Impact of alanyl-glutamine dipeptide on severe acute pancreatitis in early stage. World J Gastroenterol. 2008;14(3):474-8.
72 van Zanten AR, Sztark F, Kaisers UX, Zielmann S, Felbinger TW, Sablotzki AR, et al. High-protein enteral nutrition enriched with immune-modulating nutrients vs standard high-protein enteral nutrition and nosocomial infections in the ICU: a randomized clinical trial. JAMA. 2014 Aug 6;312(5):514-24.
73 Tao KM, Li XQ, Yang LQ, Yu WF, Lu ZJ, Sun YM, Wu FX. Glutamine supplementation for critically ill adults. Cochrane Database Syst Rev. 2014 Sep 9;9:CD010050.
74 Fadda V, Maratea D, Trippoli S, Messori A. Temporal trend of short-term mortality in severely ill patients receiving parenteral glutamine supplementation. Clin Nutr. 2013;32(3):492-3.
101
75 Fuentes-Orozco C, Cervantes-Guevara G, Muciño-Hernández I, López-Ortega A, Ambriz-González G, Gutiérrez-de-la-Rosa JL, Gómez-Herrera E, Hermosillo-Sandoval JM, González-Ojeda A. L-alanyl-L-glutamine-supplemented parenteral nutrition decreases infectious morbidity rate in patients with severe acute pancreatitis. JPEN J Parenter Enteral Nutr. 2008;32(4):403-11.
76 Jafari T, Feizi A, Askari G, Fallah AA. Parenteral immunonutrition in patients with acute pancreatitis: a systematic review and meta-analysis. Clin Nutr. 2015;34(1):35-43.
77 Kenneth A. Kudsk, MD. Glutamine: more evidence, more promise. JPEN J Parenter Enteral Nutr. 2008;32(4):492-4.
78 Zhong X, Liang CP, Gong S. Intravenous glutamine for severe acute pancreatitis: a meta-analysis .World J Crit Care Med. 2013;2(1):4-8.
79 Sahin H, Mercanligil SM, Inanç N, Ok E. Effects of glutamine-enriched total parenteral nutrition on acute pancreatitis. Eur J Clin Nutr. 2007;61(12):1429-34.
80 Yong L, Lu QP, Liu SH, Fan H. Efficacy of glutamine-enriched nutrition support for patients with severe acute pancreatitis: a meta-analysis. JPEN J Parenter Enteral Nutr. 2015 Feb 5 [Epub ahead of print].
81 Ockenga J, Borchert K, Rifai K, Manns MP, Bischoff SC. Effect of glutamine-enriched total parenteral nutrition in patients with acute pancreatitis. Clin Nutr. 2002 Oct;21(5):409-16.
82 Asrani V, Chang WK, Dong Z, Hardy G, Windsor JA, Petrov MS. Glutamine supplementation in acute pancreatitis: a meta-analysis of randomized controlled trials. Pancreatology. 2013;13(5):468-74.
83 Jeurnink SM, Nijs MM, Prins HA, Greving JP, Siersema PD. Antioxidants as a treatment for acute pancreatitis: a meta-analysis. Pancreatology. 2015;15(3):203-8.
84 Fernandez-Bustamante A, Agazio A, Wilson P, Elkins N, Domaleski L, He Q, Baer KA, et al. Brief glutamine pretreatment increases alveolar macrophage CD163/heme oxygenase-1/p38-MAPK dephosphorylation pathway and decreases capillary damage but not neutrophil recruitment in IL-1/LPS-insufflated rats. PLoS One. 2015 Jul 6;10(7):e0130764.
85 Goldenberg DE, Gordon SR, Gardner TB. Management of acute pancreatitis. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 2014;8(6):687-94.
86 Easler JJ, Mounzer R, Papachristou GI. Pharmacological therapy for acute pancreatitis: where are we now? where are we going? Minerva Gastroenterol Dietol. 2012;58(4):365-76.
102
87 Kambhampati S, Park W, Habtezion A. Pharmacologic therapy for acute pancreatitis. World J Gastroenterol. 2014;20(45):16868-80.
88 Alhan E, Usta A, Türkyılmaz S, Kural BV, Erçin C. Effects of glutamine alone on the acute necrotizing pancreatitis in rats. J Surg Res. 2015;193(1):161-7.
89 Akinosoglou, Charalambos Gogos. Immune-modulating therapy in acute pancreatitis: Fact or fiction. World J Gastroenterol. 2014;20(41):15200-15.
90 Kinnala PJ, Kuttila KT, Grönroos JM, Havia TV, Nevalainen TJ, Niinikoski JH. Pancreatic tissue perfusion in experimental acute pancreatitis. Eur J Surg. 2001;167(9):689-694.
91 Cuthbertson C.M, Christophi C. Disturbances of the microcirculation in acute pancreatitis. Br J Surg. 2006;93(5):518–30.
92 Zhao G, Zhang JG, Wu HS, Tao J, Qin Q, Deng SC, et al. Effects of different resuscitation fluid on severe acute pancreatitis. World J Gastroenterol. 2013;19(13):2044-52.
93 Klar E, Messmer K, Warshaw AL, Herfarth C. Pancreatic ischaemia in experimental acute pancreatitis: Mechanism, significance and therapy. Br J Surg. 1990;77(11):1205-10.
94 Trikudanathan G, Navaneethan U, Vege SS. Current controversies in fluid resuscitation in acute pancreatitis: a systematic review. Pancreas. 2012;41(6):827-34.
95 Bi Y, Atwal T, Vege SS. Drug therapy for acute pancreatitis. Curr Treat Options Gastroenterol. 2015;13(3):354-68.
96 Bhatia M, Brady M, Shokuhi S, Christmas S, Neoptolemos JP, Slavin J. Inflammatory mediators in acute pancreatitis. J Pathol. 2000;190(2):117-25.
97 Su KH, Cuthbertson C, Christophi C. Review of experimental animal models of acute pancreatitis. HPB (Oxford). 2006;8(4):264-86.
98 Hyun JJ, Lee HS. Experimental models of pancreatitis. Clin Endosc. 2014;47(3):212-6.
99 Kahl S, Mayer JM. Update on experimental acute pancreatitis. Minerva Gastroenterol Dietol. 2012;58(4):355-63.
100 Wan MH, Huang W, Latawiec D, Jiang K, Booth DM, Elliott V, Mukherjee R, Xia Q. Review of experimental animal models of biliary acute pancreatitis and recent advances in basic research. HPB (Oxford). 2012;14(2):73-81.
103
101 Llimona F, de Lima TM, Moretti AI, Theobaldo M, Jukemura J, Velasco IT, et al. PGC-1α expression is increased in leukocytes in experimental acute pancreatitis. Inflammation. 2014;37(4):1231-9.
102 Almeida JL, Sampietre SN, Mendonça Coelho AM, Trindade Molan NA, Machado MC, et al. Statin pretreatment in experimental acute pancreatitis. JOP. 2008;9(4):431-9.
103 Coelho AM, Jukemura J, Sampietre SN, Martins JO, Molan NA, Patzina RA, et al. Mechanisms of the beneficial effect of hypertonic saline solution in acute pancreatitis. Shock. 2010;34(5):502-7.
104 Schneider L, Jabrailova B, Strobel O, Hackert T, Werner J. Inflammatory profiling of early experimental necrotizing pancreatitis. Life Sci. 2015;126:76-80.
105 Liang HY, Chen T, Wang T, Huang Z, Yan HT, Tang LJ. Time course of intestinal barrier function injury in a sodium taurocholate-induced severe acute pancreatitis in rat model. J Dig Dis. 2014;15(7):386-93.
106 Schmidt J, Lewandrowski K, Fernandez del Castillo C, Mandavilli U, Compton CC, et al. Histopathologic correlates of serum amylase activity in acute experimental pancreatitis. Dig Dis Sci. 1992;37(9):1426-33.
107 Dubick MA, Mar G, Mayer AD, Majumdar AP, McMahon MJ, Geokas MC. Digestive enzymes and protease inhibitors in plasma from patients with acute pancreatitis.Pancreas. 1987;2(2):187-94.
108 Yadav D, Agarwal N, Pitchumoni CS. A critical evaluation of laboratory tests in acute pancreatitis. Am J Gastroenterol. 2002;97(6):1309-18.
109 Dambrauskas Z, Giese N, Gulbinas A, Giese T, Berberat PO, Pundzius J, Barauskas G, Friess H. Different profiles of cytokine expression during mild and severe acute pancreatitis. World J Gastroenterol. 2010;16(15):1845-53.
110 Minkov GA, Halacheva KS, Yovtchev YP, Gulubova MV. Pathophysiological mechanisms of acute pancreatitis define inflammatory markers of clinical prognosis. Pancreas. 2015;44(5):713-7.
111 Bentrem DJ, Joehl RJ. Pancreas: healing response in critical illness. Crit Care Med. 2003;31(8 Suppl):S582-9.
112 Fétaud-Lapierre V, Pastor CM, Jorge-Costa M, Hochstrasser DF, Morel DR, Frossard JL, Lescuyer P. Time-course proteomic analysis of taurocholate-induced necrotizing acute pancreatitis. Proteomics. 2013;85:12-27.
104
113 Meyer A, Kubrusly MS, Salemi VM, De Mendonça Coelho AM, Molan NA, Patzina RA, Machado MC, Mady C, D'Albuquerque LA, Jukemura J. Severe acute pancreatitis: a possible role of intramyocardial cytokine production. JOP. 2014 May 27;15(3):237-42.
114 Yu C, Huang L, Li X, Zhu H, Li Z, Yu X. Spatial and temporal differences of HMGB1 expression in the pancreas of rats with acute pancreatitis. Int J Clin Exp Pathol. 2015 Jun 1;8(6):6928-35.
115 Bruewer M, Luegering A, Kucharzik T, Parkos CA, Madara JL, Hopkins AM, Nusrat A. Proinflammatory cytokines disrupt epithelial barrier function by apoptosis-independent mechanisms. J Immunol. 2003;171:6164–6172.
116 Clark EC, Patel SD, Chadwick PR, Warhurst G, Curry A, Carlson GL. Glutamine deprivation facilitates tumour necrosis factor induced bacterial translocation in Caco-2 cells by depletion of enterocyte fuel substrate. Gut. 2003;52:224–230.
117 Curley P, Nestor M, Collins K, Saporoschetz I, Mendez M, Mannick JA, Rodrick ML. Decreased interleukin-2 production in murine acute pancreatitis: potential for immunomodulation. Gastroenterology. 1996;110(2):583-8.
118 Zhang J. Yin and yang interplay of IFN-gamma in inflammation and autoimmune disease. J Clin Invest. 2007;117(4):871-3.
119 Zou WG, Wang DS, Lang MF, Jin DY, Xu DH, Zheng ZC, Wu ZH and Liu XY. Human interleukin 10 gene therapy decreases the severity and mortality of lethal pancreatitis in rats. J Surg Res. 2002; 103: 121-126.
120 Villoria A, Abadía de Barbará C, Molero X, Álvarez A, Antolín M, Guarner L, Malagelada JR. Early treatment with interleukin-10 (IL-10) in severe acute pancreatitis. Pancreatology. 2003;3:457-81.
121 Devière J, Le Moine O, Van Laethem JL, Eisendrath P, Ghilain A, Severs N, Cohard M. Interleukin 10 reduces the incidence of pancreatitis after therapeutic endoscopic retrograde cholangiopancreatography. Gastroenterology. 2001;120:498-505.
122 Dumot JA, Conwell DL, Zuccaro G, Vargo JJ, Shay SS, Easley KA, Ponsky JL. A randomized, double blind study of interleukin 10 for the prevention of ERCP-induced pancreatitis. Am J Gastroenterol. 2001;96:2098-102.
123 Singh P, Lee T, Davidoff S, Bank S. Efficacy of Interleukin 10 (IL10) in the prevention of post-ERCP pancreatitis: a meta-analysis. Gastrointest Endosc. 2002;55:AB150.
124 Bone RC. Sir Isaac Newton, sepsis, SIRS, and CARS. Crit Care Med. 1996;24:1125–8
105
125 Amanvermez R, Özbalci GS. Clinics related to acute pancreatitis wonder whether IFN-γ can attenuate pancreatic injury or not. Bosn J Basic Med Sci. 2013;13:203.
126 Meng H, Gong J, Fang L, Song Z, Wu F, Zhou B, Qian M. Effect of interferon-γ on NF-κB and cytokine IL-18 and IL-27 in acute pancreatitis. Bosn J Basic Med Sci. 2013;13:114-8.
127 Hayashi T, Ishida Y, Kimura A, Iwakura Y, Mukaida N, Kondo T.IFN-γ protects cerulein-induced acute pancreatitis by repressing NF-κB activation. J Immunol. 2007;178:7385-94.
128 Rau BM, Krüger CM, Hasel C, Oliveira V, Rubie C, Beger HG, Schilling MK. Effects of immunosuppressive and immunostimulative treatment on pancreatic injury and mortality in severe acute experimental pancreatitis. Pancreas. 2006;33:174-83
129 Xue H, Slavov D, Wischmeyer PE.Glutamine-mediated dual regulation of heat shock transcription factor-1 activation and expression. J Biol Chem. 2012;287:40400-13
130 Meng K, Liu Q, Dou Y, Huang Q. Prior peritoneal lavage with hot 0.9 % saline induces HSP70 expression and protects against cerulein-inducedacute pancreatitis in rats. Mol Biol Rep. 2013;40(2):1443-9.
131 Matheus AS, Coelho AM, Sampietre S, Patzina R, Jukemura J, Cunha JE, Machado MC. Effect of inhibition of prostaglandin E2 production on pancreatic infection in experimental acute pancreatitis. HPB. 2007;9(5):392-7.
10 APÊNDICES
10 APÊNDICES
APÊNDICE A - apresentação nacional e internacional do estudo
Congresso Americano: Apresentação de dois pôsteres no congresso
da Sociedade Americana de Nutrição Clínica e Metabólica - ASPEN, realizado
em Fênix – Arizona em Fevereiro de 2013.
Poster 1) "Impact of prior use of parenteral omega-3 fatty acids and
glutamine isolated and combined on survival in an experimental model of acute
pancreatitis"
Pôster 2) "Impact of prior use of parenteral omega-3 fatty acids and
glutamine isolated and combined in inflammatory response in an experimental
model of Acute Pancreatitis”
Congresso Brasileiro: Apresentação oral de destaque científico do
trabalho “Efeito da infusão parenteral combinada de ácidos graxos ômega-3 e
glutamina sobre sobrevida e estresse oxidativo em pancreatite aguda, estudo
experimental”.
Congresso Europeu: Apresentação de dois pôsteres no congresso da
Sociedade Europeia de Nutrição Clínica e Metabólica – ESPEN, realizado em
Genebra – Suíça em Setembro de 2014.
Postêr 1) Previous parenteral infusion of alanil-glutamine increases HSP
70 expression in lung and liver of rats submitted to acute pancreatitis
Postêr 2): Unexpected results of prior infusion of parenteral fish oil lipid
emulsion in experimental acute pancreatitis