Transcript
Page 1: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA

COMUNIDADES DE LEVEDURAS ASSOCIADAS A ABELHAS SEM FERRÃO

NA REGIÃO DE MATA SECA EM MINAS GERAIS

JULIANA DE FREITAS TEIXEIRA

BELO HORIZONTE

2019

Page 2: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

JULIANA DE FREITAS TEIXEIRA

COMUNIDADES DE LEVEDURAS ASSOCIADAS A ABELHAS SEM FERRÃO

NA REGIÃO DE MATA SECA EM MINAS GERAIS

BELO HORIZONTE

2019

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Microbiologia do

Instituto de Ciências Biológicas da

Universidade Federal de Minas Gerais,

como requisito parcial para obtenção do

Título de Mestre em Microbiologia.

Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Rosa

Page 3: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor, através do

Programa de Geração Automática da Biblioteca Universitária da UFMG

Teixeira, Juliana de Freitas

COMUNIDADE DE LEVEDURAS ASSOCIADAS A ABELHAS SEM

FERRÃO NA REGIÃO DE MATA SECA EM MINAS GERAIS

[manuscrito] / Juliana de Freitas Teixeira. - 2019.

66 f. : il.

Orientador: Carlos Augusto Rosa.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Minas

Gerais, Instituto de Ciências Biológicas.

1.Leveduras. 2.Mata seca. 3.Abelhas nativas sem ferrão.

4.Biodiversidade. I.Rosa, Carlos Augusto . II.Universidade Federal

de Minas Gerais. Instituto de Ciências Biológicas. III.Título.

Page 4: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,
Page 5: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

i

Dedico este trabalho a minha família,

que está sempre ao meu lado me

apoiando.

Page 6: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

ii

“Certa vez alguém disse que emoções são como cavalos selvagens. Elas são

indomáveis, e os sentimentos são como corredeiras de água que você não

controla e não sabe para onde irão levá-lo. Mas, em algum momento, você terá

que lidar com isso. Precisará aprender a enfrentar a vulnerabilidade e a incerteza

que os sentimentos trazem. Ao mesmo tempo em que os sentimentos podem

levá-lo a visitar os calabouços do inconsciente e ativar pavores, desesperos e

angústias que não se podem traduzir em palavras, eles também podem conduzi-lo

a experiências maravilhosas e fazê-lo chorar de alegria e gratidão."

Sri Prem Baba

Page 7: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

iii

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por todo seu amor.

Aos meus pais Elaine e Milton e aos meus irmãos Job e Jon, pelo amor, cuidado e apoio

incondicional. À minha avó Geralda de Jesus por todas as orações. À minha tia Kênia

Raydan. À minha prima Alexsana.

À todos os amigos por cada abraço, ajuda e palavra de incentivo, em especial Michele,

Beatriz, Ludmylla, Taísa, Flávia, Gabriela, Glauciane, Diego, Patrícia, Larissa e Túlio.

Ao Prof. Carlos Augusto Rosa pela oportunidade, ensinamentos e suporte.

À minhas amigas e todos os colegas do Laboratório de Taxonomia, Biodiversidade e

Biotecnologia de Fungos. Especialmente à Thelma pelo carinho, amizade, contribuição

e toda atenção durante este processo. À Ana Raquel por toda a ajuda e contribuição

neste trabalho. Agradeço a Elisa, Mayara, Rafaela, Katharina, Flávia, Ana Luíza,

Mariana Anzai, Raquel, Thais e Thamar. Agradeço também a Paula Calaça, sempre

atenciosa e a disposição para me ajudar.

À FAPEMIG pelo apoio a pesquisa.

Ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia e ao Instituto de Ciências

Biológicas.

À Universidade Federal de Minas Gerais pela acolhida.

Page 8: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

iv

RESUMO

O ecótono mata seca, região de transição entre cerrado e caatinga, abriga grande

biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão

intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras, principalmente dos gêneros

Starmerella e Zygosaccharomyces. No presente trabalho, as comunidades de leveduras

associadas a duas espécies de abelhas nativas sem ferrão, Tetragonisca angustula (jataí)

e Scaptotrigona cfr. bipunctata (tubuna), e a espécie com ferrão Apis mellifera foram

estudadas em área de mata seca. Três coletas foram realizadas em área de preservação

de mata seca (Janaúba, Minas Gerais), durante a estação chuvosa, no início da estação

seca durante o período de floração das arvores da região, e no auge na estação seca.

Amostras de mel imaturo, mel maduro, pólen e indivíduos adultos foram coletados em

três ninhos de cada espécie de abelha. Durante o período de floração, amostras de flores

de Myracrodruon urundeuva (Aroeira) foram coletadas por serem a principal fonte de

néctar e pólen para as abelhas na região. As amostras foram processadas e semeadas em

ágar extrato de malte – extrato de levedura (YM). Oitenta e seis isolados de leveduras

foram obtidos das amostras coletadas dos ninhos de T. angustula, 184 isolados a partir

das amostras de Scaptotrigona, 78 isolados das amostras de A. mellifera e 33 isolados a

partir das amostras de flores de Aroeira, totalizando 381 isolados de leveduras.

Cinquenta e três espécies de leveduras foram obtidas, incluindo novas espécies. A

espécie associada com mais frequência à T. angustula foi Starmerella etchellsii;

Candida parapsilosis foi a mais frequente associada à A. mellifera. A possível nova

espécie Zygosaccharomyces sp.1, próxima à Z. mellis, foi a espécie mais frequente

associada à S. cfr. bipunctata. As leveduras do gênero Starmerella foram isoladas em

número elevado, distribuídas entre os substratos e entre as três espécies de abelhas,

indicando endemismo. As comunidades de leveduras estudadas apresentam alto número

de espécies exclusivas, indicando segregação nos locais de forrageio. A identificação

das espécies de leveduras associadas a estes insetos contribui para elucidação do

microbioma das abelhas nativas sem ferrão e sua biodiversidade.

Palavras chave: abelha nativa, abelha sem ferrão, levedura, biodiversidade, microbiota,

mata seca.

Page 9: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

v

ABSTRACT

The dry forest ecotone, a transition region between cerrado and caatinga, shelters a great

biodiversity native stingless bee species. These bees are closely related to several

species of yeast, mainly species of the genera Starmerella and Zygosaccharomyces. In

the present study, the yeast communities associated with two species of native stingless

bees, Tetragonisca angustula (jataí) and Scaptotrigona cfr. bipunctata (tubuna), and the

specie Apis mellifera were studied in a dry forest area. Three collections were carried

out in a dry forest preservation area (Janaúba, Minas Gerais), during the rainy season, at

the beginning of the dry season during the flowering period, and at the peak of the dry

season. Samples of immature honey, mature honey, pollen and adult individuals were

collected in three nests of each species of bee. During the flowering period, samples of

flowers of Myracrodruon urundeuva (Aroeira) were collected for being the main source

of nectar and pollen for bees in the region. The samples were processed and plated on

agar malt extract – yeast extract (YM). Eighty-six yeast isolates were obtained from the

samples collected from nests of T. angustula, 184 isolates from the samples of

Scaptotrigona, 78 isolates from the samples of A. mellifera and 33 isolates from the

flower samples of Aroeira, totaling 381 yeast isolates. Fifty-three yeast species were

obtained, including new species. The most frequent species associated with T. angustula

was Starmerella etchellsii; Candida parapsilosis was the most frequent associated with

A. mellifera. The possible new species Zygosaccharomyces sp.1, next to Z. mellis, was

the most frequent species associated with S. cfr. bipunctata. The yeasts of the genus

Starmerella were isolated in high numbers, distributed among the substrates and among

the three species of bees, indicating endemism. The studied yeast communities present a

high number of exclusive species, indicating segregation in the forage sites. The

identification of yeast species associated with these insects contribute to the elucidation

of the microbioma of native stingless bees and its biodiversity.

Keywords: native bee, stingless bee, yeast, biodiversity, microbiota, dry forest.

Page 10: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

vi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Ninho da abelha nativa sem ferrão Scaptotrigona cfr. bipunctata (tubuna), espécie

de abelha eussocial (fonte: Autora) .......................................................................................... 19

Figura 2: Mapa de localização do Município de Janaúba, norte do estado de Minas Gerais,

Brasil. Construído utilizando software QGIS 3.4.2, dados espaciais obtidos no portal de

mapas do IBGE (https://portaldemapas.ibge.gov.br) ............................................................... 28

Figura 3: As espécies de abelhas Tetragonisca angustula (A, jataí), Scaptotrigona cfr.

bipunctata (B, tubuna) e Apis mellifera (C) (fonte: A, http://www.ib.usp.br/beesp/; B, Paula

de Souza São Thiago Calaça; C, Prof. Dr. Clemens Schlindwein) .......................................... 29

Figura 4: Coleta de amostras de flores de Myracrodruon urundeuva (Aroeira) (fonte: Prof. Dr.

Clemens Schlindwein) .............................................................................................................. 30

Figura 5: Coleta de mel com o auxílio de micropipetador (fonte: Paula de Souza São Thiago

Calaça) ...................................................................................................................................... 31

Figura 6: Coleta de pólen utilizando alça estéril (fonte: Paula de Souza São Thiago Calaça) . 31

Figura 7: Indivíduos adultos das espécies Tetragonisca angustula (A), Scaptotrigona cfr.

bipunctata (B) e Apis mellifera (C) em placas de ágar YM (fonte: Autora) ............................ 32

Figura 8: Placa inoculada em campo (A), placa com colônias de levedura isoladas (B), placa

com colônia de levedura purificada (C) (fonte: Autora) .......................................................... 33

Figura 9: Número de isolados de leveduras em relação à cada espécie de abelha estudada (A.

mellifera; S. bipunctata; T. angustula) obtidos nas diferentes datas de coletas (PC, primeira

coleta - 01/04/16; SC, segunda coleta - 09/06/16; TC, terceira coleta - 07/10/16). Os valores

foram expressos como média ± desvio padrão. * p < 0,05 quando comparado o grupo SC com

o grupo TC. Análise de variância de Friedman seguida de pós-teste de Bonferroni................ 39

Figura 10: Diagrama de Venn com o número de espécies de leveduras exclusivas e

compartilhadas entre abelhas adultas (Apis mellifera, T. angustula e S. cfr. bipunctata) e

substratos associados (mel e própolis) ..................................................................................... 40

Figura 11: Dendrograma de similaridade das leveduras vetorizadas por diferentes espécies de

abelhas. Agrupamento realizado pela similaridade Jaccard ..................................................... 42

Page 11: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

vii

Figura 12: Curvas de acumulação de espécies das comunidades de leveduras associadas a

abelhas e substratos relacionados ............................................................................................. 44

Figura 13: Esporos sexuais de Zygosaccharomyces sp.1. A seta indica o esporo dentro da asca

em forma de haltere .................................................................................................................. 53

Figura 14: Árvore filogenética mostrando o posicionamento da espécie Zygosaccharomyces

sp. 1, construída pelo método de ―neighbor-joining‖, baseada em sequências dos domínios

D1/D2 do gene do RNAr. Foi utilizado um bootstrap de 1000 interações e a porcentagem é

mostrada próxima aos ramos. A distância evolutiva foi calculada pelo método de ―Kimura 2

parâmetros―. A barra de escala mostra a proporção de divergência na sequência. Análise

realizada no programa MEGA 7 ............................................................................................... 54

Page 12: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

viii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Número de leveduras isoladas de acordo com a espécie e substrato ........................ 39

Tabela 2: Índices de diversidade e riqueza das comunidades de leveduras associadas às

abelhas Scaptotrigona cfr. bipunctata, Tetragonisca angustula e Apis mellifera. ................... 41

Tabela 3: Índices de diversidade β das comunidades de leveduras associadas às abelhas

S. cfr. bipunctata, Tetragona angustula e Apis mellifera. ........................................................ 42

Tabela 4: Frequência de espécies de leveduras associadas à Tetragonisca angustula ............. 46

Tabela 5: Frequência de espécies de leveduras associadas à Scaptotrigona cfr.

bipunctata. ................................................................................................................................ 49

Tabela 6: Frequência de espécies de leveduras associadas à Apis mellifera ............................ 51

Tabela 7: Possíveis novas espécies de leveduras ..................................................................... 55

Page 13: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

ix

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

DMSO – Dimetilsulfóxido

DNA – Ácido desoxirribonucleico

dNTP – Desoxirribonucleotídeos fosfatados

EDTA – Ácido etilenodiamino tetra-acético

g – Grama

GYMP – Caldo glicose, extrato de levedura, malte e peptona

h – Hora

kb – Kilobase

M – Massa molar

mL – Mililitro

mm – Milímetro

mM – Milimolar

min – Minuto

MRS – Ágar de Man, Rogosa e Sharpe

NaCl – Cloreto de sódio

ng – Nanograma

nm – Nanômetro

PCR – Reação em cadeia da polimerase

pH – Potencial hidrogeniônico

pmol – Picomol

rpm – Rotações por minuto

rRNA – RNA ribossomal

SDS – Dodecil sulfato de sódio

TBE – Tampão tris-hidroximetilaminometano, ácido bórico e EDTA

Tris-EDTA – Tampão tris-hidroximetilaminometano e EDTA

Tris-HCl – Tampão tris-hidroximetilaminometano hidrocloreto

U – Unidade

UV – Ultravioleta

V – Volt

X – Multiplicação

Page 14: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

x

YM – Ágar extrato de levedura e malte

µg – Micrograma

µL – Microlitro

oC – Grau Celsius

> – Maior

+ – Somatória

% – Porcentagem

Page 15: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

xi

SUMÁRIO

RESUMO ........................................................................................................................ iv

ABSTRACT ..................................................................................................................... v

LISTA DE FIGURAS .................................................................................................... vi

LISTA DE TABELAS ................................................................................................. viii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS .................................................................. ix

1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 13

2 JUSTIFICATIVA ....................................................................................................... 15

3 OBJETIVOS .............................................................................................................. 16

3.1 Objetivo geral ........................................................................................................... 16

3.2 Objetivos específicos ................................................................................................ 16

4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................. 17

4.1 Bioma Mata Seca ...................................................................................................... 17

4.2 Abelhas Nativas ........................................................................................................ 18

4.3 Ecologia de leveduras ............................................................................................... 22

4.4 A relação entre abelhas, seus produtos e as leveduras ............................................. 24

5 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 28

5.1 Coleta das amostras .................................................................................................. 28

5.2 Preservação e identificação morfológica .................................................................. 32

5.3 Extração de DNA...................................................................................................... 33

5.4 Agrupamento por PCR fingerprinting com iniciador GTG5 .................................... 34

5.5 PCR utilizando iniciadores ITS1 e NL4 ................................................................... 35

5.6 Purificação e reação de sequenciamento .................................................................. 35

5.7 Análise das sequências ............................................................................................. 36

5.8 Análise estatística dos dados e determinação dos índices de diversidade ................ 37

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................. 38

6.1 Isolamento, preservação e agrupamento morfológico .............................................. 38

6.2 Identificação das leveduras ....................................................................................... 45

6.3 Espécies novas de leveduras ..................................................................................... 52

Page 16: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

xii

7 CONCLUSÃO ............................................................................................................. 57

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 58

Page 17: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

13

1 INTRODUÇÃO

A mata seca é uma área transicional de ampla biodiversidade, sendo considerada

um dos ecossistemas brasileiros menos estudados. A mata seca é fortemente ameaçada

pelas atividades humanas como, por exemplo, o desmatamento visando à agricultura e

pecuária extensiva, fragmentando e reduzindo a vegetação nativa causando o

desequilíbrio ecológico da região. Considerada um ecótono, a mata seca é uma região

de transição ambiental entre os biomas cerrado e caatinga, ocorrendo principalmente no

nordeste do Brasil e região do norte do estado de Minas Gerais, abrangendo 1,3% do

território nacional.

Diversas espécies de abelhas sem ferrão são encontradas no ecossistema de Mata

Seca, mas ainda com poucos estudos ecológicos sobre estes insetos. As abelhas nativas

sem ferrão fazem parte da ordem Hymenoptera, da família Apidae e da tribo Meliponini

e estão distribuídas pelo mundo basicamente em regiões tropicais. Estes insetos são

altamente adaptáveis a desafios ecológicos e desempenham grande importância como

polinizadoras, sendo consequentemente essenciais para produção de alimentos em

escala global. Os meliponíneos representam o maior grupo existente de abelhas

altamente eusociais, com mais de 500 espécies descritas, sendo que além dos

meliponíneos, apenas a tribo dos apíneos apresenta abelhas eusociais. Apesar da ampla

distribuição e do grande número de espécies das abelhas sem ferrão, a biologia destes

insetos é consideravelmente pouco estudada se comparada à das abelhas europeias

africanizadas (Apis mellifera) pertencentes à tribo Apini. Além disso, as abelhas se

encontram em crescente declínio, ameaçadas especialmente pela perda de habitat e a

redução de biodiversidade nos ambientes ainda ocupados por elas, em decorrência de

sua dependência de flora nativa como recurso alimentar apícola.

Em vista disto, outro aspecto de grande relevância surge através da associação

íntima das abelhas nativas sem ferrão às leveduras, microrganismos ubíquos e

fermentadores. Durante o forrageamento, as abelhas estocam em seus ninhos uma ampla

variedade de alimentos como néctar e pólen. Estes substratos podem ser fontes de

microrganismos que irão colonizar os alimentos produzidos por estes insetos no interior

das colmeias. Leveduras já foram encontradas em provisões de pólen e mel, e no trato

intestinal de larvas de abelhas adultas. As leveduras podem produzir enzimas que

auxiliam na transformação e enriquecimento nutricional do pólen. Estes substratos

Page 18: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

14

servem como alimento para aquisição de nutrientes essenciais durante o processo de

desenvolvimento larval de abelhas sem ferrão.

Ainda há muitos aspectos a serem explorados sobre a relação entre abelhas sem

ferrão e leveduras, incluindo maiores estudos a respeito da biodiversidade e biologia

desses microrganismos. As abelhas nativas sem ferrão auxiliam na sustentação de outras

formas de vida que são essenciais através da polinização, e fornecem produtos de valor

comercial como o mel e o própolis. As interações entre abelhas e leveduras influenciam

intrinsecamente e ativamente a saúde, comportamento, distribuição e reprodução destes

insetos. Portanto, o conhecimento da associação destes microrganismos e abelhas sem

ferrão no bioma de mata seca poderá fornecer novas informações sobre a ecologia desta

interação, e a ocorrência de espécies de leveduras ainda desconhecidas pela ciência.

Page 19: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

15

2 JUSTIFICATIVA

Muito pouco é conhecido ainda sobre a associação entre leveduras e abelhas sem

ferrão. As leveduras provavelmente desempenham papel importante na maturação do

pólen e do mel no interior das colmeias. Isto ocorre pela produção de enzimas que

hidrolisam compostos complexos presentes nestes substratos, além de compostos

voláteis que influenciam no desenvolvimento de larvas e pupas. Portanto, o

conhecimento de espécies de leveduras associadas a estes insetos pode gerar novos

dados sobre a ecologia desta associação. Também, estes insetos são fontes de novas

espécies de leveduras, principalmente dos gêneros Starmerella e Zygosaccharomyces.

Estas espécies podem ter relevância em biotecnologia, como na produção de

biosurfactantes e outros polímeros microbianos. Todos estes aspectos levam

consequentemente à valorização e busca pela preservação do bioma mata seca e da

amplitude de espécies nele encontradas, dentre elas, as abordadas neste estudo,

Myracrodruon urundeuva (aroeira), as abelhas nativas sem ferrão Tetragonisca

angustula e Scaptotrigona cfr. bipunctata, e as leveduras associadas a este bioma.

Page 20: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

16

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Descrever as comunidades de leveduras associadas a duas abelhas sem ferrão, a

Apis mellifera e a flores de Myracrodruon urundeuva (Aroeira) em uma região de mata

seca no norte do estado de Minas Gerais.

3.2 Objetivos específicos

• Isolar colônias de leveduras presentes em mel imaturo, mel maduro, pólen,

flores (Myracrodruon urundeuva) e associadas ao corpo de abelhas adultas dos

ninhos das espécies Apis mellifera, Tetragonisca angustula e Scaptotrigona cfr.

bipunctata.

• Identificar por métodos moleculares as espécies isoladas de leveduras.

• Descrever novas espécies de leveduras.

• Comparar as comunidades de leveduras isoladas dos diferentes

substratos de acordo com a estação do ano.

Page 21: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

17

4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

4.1 Bioma Mata Seca

A mata seca representa 42% da cobertura florestal global, e é considerada como

área de floresta tropical transicional. No Brasil, a mata seca se encontra entre regiões de

cerrado e caatinga, com temperaturas anuais acima de 17º C, com média >25º C,

precipitação anual em torno de 1.800 mm, e um período de 3 a 6 meses com menos de

100 mm por mês (MURPHY & LUGO, 1986; CAETANO et al., 2008; PORTILLO-

QUINTERO & SÁNCHEZ-AZOFEIFA, 2010; FERNANDEZ & DIAZ, 2016). A mata

seca é uma região que enfrenta vários meses de aridez e períodos de distribuição de

chuva com sazonalidade bem demarcada (MILES et al., 2006), possui vegetação

predominantemente decídua e durante a seca pode ocorrer perda de até 50% da

cobertura arbórea (MURPHY & LUGO, 1986; ARRUDA et al., 2011).

A região norte do estado de Minas Gerais, que faz parte do polígono das secas,

apresenta áreas de mata seca nos pontos transicionais entre cerrado e caatinga

(ARRUDA et al., 2011). A fisionomia deste ecossistema apresenta árvores emergentes

atingindo 30 m de altura, sendo que em afloramentos rochosos podem ser encontradas

árvores com dossel superior de 6 m a 15 m. Dentre as espécies que compõem o estrato

arbóreo estão Myracrodruon urundeuva (aroeira-do-sertão), Anadenanthera colubrina

(angico-vermelho), Astronium fraxinifolium (gonçalo-alves), Dilodendron bipinnatum

(mulher-pobre, mamoninha), Sterculia striata (chichá), Amburana cearensis

(amburana), Schinopsis brasiliensis (pau-preto), Cavanillesia arborea (imbaré),

Commiphora leptophloeos (amburaninha), Goniorrhachis marginata (itapicuru), entre

outras. Também podem ser observadas cactáceas e bromeliáceas terrestres (OLIVEIRA-

FILHO, 2006).

O clima e o solo fértil favoreceram a ocupação populacional em áreas de mata

seca, levando ao desmatamento e acelerada degradação devido a cultivos intensivos

como cana de açúcar e soja, e pela conversão em pasto para pecuária (BLACKIE et al.,

2014; FERNANDEZ & DIAZ, 2016). Outro aspecto relevante é o valor econômico do

corte de madeira, geralmente explorado pela população local, podendo resultar em

significativo impacto ambiental se o recurso não for acessado de maneira sustentável

(MURPHY & LUGO, 1986; MCLAREN et al., 2005).

No âmbito das regiões florestais que se encontram em situação de

vulnerabilidade, a mata seca foi identificada como um dos biomas mais ameaçados no

Page 22: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

18

mundo, apesar de sua riqueza de espécies (PORTILLO-QUINTERO & SÁNCHEZ-

AZOFEIFA, 2010; GILLESPIE et al., 2012; FERNANDEZ & DIAZ, 2016). O

desequilíbrio ecológico e a perda de biodiversidade causam impactos econômicos e

sociais. As espécies endêmicas, por exemplo, são responsáveis pela polinização de

plantações que são fontes de abastecimento alimentar, e de coberturas florestais que

garantem a captação e renovação de recursos hídricos além do armazenamento de

carbono (HOEKSTRA et al., 2005).

Mundialmente a área total de floresta tropical de mata seca remanescente é

estimada em 1.048.700 km2, sendo que 97% desta área encontra-se ameaçada e 54,2%

está localizada na América do Sul (MILES et al., 2006). Algumas das principais

ameaças que levam ao risco de perda florestal são a extinção de espécies, a disfunção

ecológica e o decréscimo de biodiversidade, estas ameaças comprometem a conservação

de um ecossistema e dentre seus causadores estão o aumento da densidade populacional

humana, as mudanças climáticas, queimadas, a fragmentação de habitat e degradação, a

invasão de espécies não nativas, e a conversão de terras para atividade agropecuária

(HOEKSTRA et al., 2005; MILES et al., 2006; GILLESPIE et al., 2012; RODRIGUES

et al., 2015; NOTARO et al., 2018).

Os ecossistemas sustentam diversas interações ecológicas e proporcionam

pressões evolucionárias que mantém a biodiversidade, permitem a evolução de novas

espécies e geram características utilitárias que beneficiam os seres humanos

(HOEKSTRA et al., 2005). A mata seca apresenta grande biodiversidade e a maioria

das ameaças a este ecossistema resulta da atividade humana, são necessárias decisões

que colocam estas áreas como alvo de alta prioridade de conservação e pesquisa.

Portanto iniciativas de proteção e manejo de fragmentos florestais deste tipo de

ecossistema são imprescindíveis (MILES et al., 2006; ARRUDA et al., 2011;

FERNANDEZ & DIAZ, 2016; PRIETO-TORRES et al., 2016).

4.2 Abelhas Nativas

As abelhas sem ferrão (Hymenoptera: Apidae: Meliponini) compreendem o

maior grupo de abelhas eussociais do planeta, incluindo mais de 500 espécies descritas,

distribuídas pelas regiões Neotropicais (América tropical, África, sudeste da Ásia e

Austrália) (HRNCIR, JARAU & BARTH, 2016). O território brasileiro abriga diversos

Page 23: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

19

gêneros e espécies de abelhas nativas sem ferrão, sendo, 244 espécies válidas e 89 ainda

não descritas, pertencentes a 29 gêneros diferentes. Estes insetos não somente exercem

grande importância socioeconômica em relação à população humana, como também

interferem diretamente na estruturação ecológica dos ecossistemas em que estão

inseridos (PEDRO, 2014).

As abelhas eussociais se estabelecem em ninhos (figura 1) que apresentam alta

complexidade em sua estrutura e funcionamento, possuindo adultos de duas gerações,

trabalho cooperativo, divisões de classes e manutenção de células de alimento e criação

(HRNCIR, JARAU & BARTH, 2016). Os indivíduos adultos fazem a maior parte ou

todo o forrageamento para obtenção de alimento, enquanto a rainha acasala e faz a

oviposição. A rainha normalmente apresenta maior tamanho corporal que as abelhas

operárias, e sua diferenciação na fase larval se da pela quantidade muito maior de

alimento disponibilizada para a rainha (MICHENER, 2007; LUNA-LUCENA,

RABICO & SIMOES, 2019). As abelhas operárias forrageadoras são generalistas, ou

seja, visitam uma grande diversidade floral coletando néctar e pólen (RAMALHO,

1990).

Figura 1: Ninho da abelha nativa sem ferrão Scaptotrigona cfr. bipunctata (tubuna), espécie de

abelha eussocial (fonte: Autora).

Page 24: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

20

As colônias de abelhas sem ferrão são perenes e resistem a longos períodos de

adversidades pelo consumo de alimento estocado nos ninhos (potes contendo mel e

pólen) (MICHENER, 1969; WILLE, 1983). A nidificação ocorre normalmente em

buracos pré-existentes como, cavidades subterrâneas e arbóreas, associada a outros

insetos como formigas, cupins e vespas, e ainda pode haver ninhos expostos

(SAKAGAMI & ZUCCHI, 1967; HRNCIR, JARAU & BARTH, 2016). A entrada dos

ninhos é construída utilizando cera e resina, geralmente no formato de um tubo

estendido permitindo a passagem de apenas um indivíduo por vez, tanto para entrada

quanto saída, o que confere mais segurança para os ninhos (WILLE, 1983; ROUBIK,

2006).

As abelhas sem ferrão são importantes propagadoras da polinização de diversas

plantas cultivadas, devido a influencia positiva direta no rendimento e na qualidade das

plantações. Estas estão sendo cada vez mais utilizadas por serviços de polinização

comercial, além disso, forrageiam efetivamente em ambientes fechados o que mostra

seu potencial para polinização em estufas. Alguns exemplos de cultivo são morango,

abacate, pepino, cupuaçu e tomate (SLAA et al., 2006).

O mel dos meliponíneos possui atividade antioxidante e alta quantidade de

compostos fenólicos, apresenta bastante variabilidade em sua composição física e

química dependendo da espécie da abelha, da florada predominante, das condições

climáticas e da origem geográfica (BILUCA et al., 2016; RAO et al., 2016). Apesar

dessa variação, o mel normalmente contém açúcares como frutose e glicose, que

compreendem até 95% de sua composição, ácidos orgânicos, ácidos fenólicos (ex.

cafeico, elágico, ferúlico e p-cumárico), flavonóides (ex. apigenina, crisina, galanina,

quercetina, pinocembrina), antioxidantes (ex. ácido ascórbico, superóxido dismutase,

catalase, glutationa reduzida), proteínas, aminoácidos, enzimas, vitaminas (ex. ácido

fólico, riboflavina, biotina, cianocobalamina) e minerais. Cada componente possui

funções nutricionais e medicinais (PATRICIA et al., 2015; RAO et al., 2016).

O mel produzido pelas abelhas sem ferrão é diferenciado em relação ao

produzido por apíneos, em aspectos fisicoquímicos como cor, sabor e viscosidade,

fluido e adocicado com um toque de acidez, sendo mais valorizado economicamente,

porém necessita de maiores estudos para caracterização e definição de padrões de

qualidade (BILUCA et al., 2016; RAO et al., 2016; ÁVILA et al., 2018; COSTA et al.,

Page 25: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

21

2018). Este mel também apresenta propriedades biológicas anti-inflamatória,

antimicrobiana, antiviral e anticancerígena (OTHMAN, 2012; RAO et al., 2016);

diminui o risco de acidente cardiovascular (AL-WAILI, 2004); reduz o stress oxidativo

do cérebro; e aumenta as concentrações de acetilcolina e fator neurotrófico (OTHMAN

et al., 2015). Ainda auxilia na cicatrização de feridas através do aumento da viabilidade

celular e proliferação de fibroblastos dérmicos (NORDIN et al., 2018). Estudos indicam

que o mel produzido pela abelha sem ferrão Tetragonisca angustula possui atividade

antimicrobiana contra bactérias patogênicas como Staphylococcus aureus (MIORIN et

al., 2003), Bacilus cereus, Pseudomonas aeruginosa, e contra leveduras como Candida

albicans e Saccharomyces cerevisiae (DEMERA & ANGERT, 2004; TORRES et al.,

2018), além de ótima capacidade antioxidante (RAO et al., 2016). A produção de mel

por abelhas sem ferrão ainda é pouco explorada, sua valorização pode estimular o

crescimento socioeconômico de comunidades rurais e ao mesmo tempo ser uma via para

atividades educacionais de conservação, criando a possibilidade da implantação de

fontes de renda sustentável e manutenção de abelhas para polinização de plantas

(MUSTAFA, YAACOB & SULAIMAN, 2018).

A domesticação das abelhas pelo ser humano enraizou-se de maneira cultural e

econômica em nossa sociedade, levando à criação destes insetos também conhecida

como apicultura ou meliponicultura para os meliponíneos, a criação de abelhas sem

ferrão data de períodos remotos em nossa história (QUEZADA-EUÁN et al., 2018). Na

América tropical há registros de uma relação desenvolvida durante milênios entre

comunidades indígenas e abelhas. O mel das abelhas sem ferrão era tradicionalmente

utilizado em trocas de valor econômico. Na medicina e em cerimônias, nas sociedades

Maias pré-colombianas constituíam inclusive parte importante da mitologia. Porém com

o processo de colonização europeu no século XVI, tribos indígenas foram extintas e

grandes áreas florestais desmatadas para ocupação e agricultura. Este último fato afetou

profundamente os processos de nidificação, forrageamento e reprodução de diversas

espécies de abelhas (HRNCIR, JARAU & BARTH, 2016; QUEZADA-EUÁN et al.,

2018).

Desde a antiguidade as abelhas fornecem alimento e outros produtos para o

homem, e é de grande importância reavivar e manter a herança cultural milenar dessa

relação com as abelhas sem ferrão, e com isso auxiliar na valorização do uso sustentável

Page 26: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

22

de seus produtos. O reconhecimento de sua função essencial na manutenção e

conservação de ecossistemas é fundamental (QUEZADA-EUÁN et al., 2018).

4.3 Ecologia de leveduras

As leveduras são fungos ubíquos e geralmente unicelulares, que se reproduzem

predominantemente de forma assexuada por brotamento ou fissão binária, podem

apresentar formas sexuadas, porém, não desenvolvem corpos frutificantes como os

fungos filamentosos. As espécies de leveduras estão distribuídas em dois filos do reino

Fungi, Basidiomycota e Ascomycota (KURTZMAN, FELL & BOEKHOUT, 2011a).

As leveduras são consideradas modelo biológico de estudo laboratorial, células

eucarióticas de fácil e segura manipulação além de rápida reprodução, apresentam curto

tempo entre gerações e genomas de pequeno tamanho, sendo muito interessantes para

manipulação genética e estudos evolucionários (BORNEMAN & PRETORIUS, 2014).

A espécie mais empregada com este propósito é Saccharomyces cerevisiae, utilizada em

experimentos há mais de um século, e em 1996, o primeiro organismo eucariótico a ter

seu genoma completamente sequenciado (GOFFEAU et al., 1996; LITI, 2015). O

histórico de pesquisas sobre leveduras se inicia ao final do século XVIII, em 1789 com

estudos da fermentação alcoólica por Lavoisier (BARNETT, 1998). Este fenômeno é

uma das características metabólicas de maior destaque das leveduras, e já era observado

a 7000 anos a.C. nas regiões da Mesopotâmia e Cáucaso. Nesta época, a humanidade

teve os primeiros contatos com a fermentação espontânea de acordo com registros

arqueológicos, e passou a produzir e preservar uma diversidade de alimentos, dentre

eles pão, queijos, cerveja, vinho e outras bebidas alcoólicas (PRETORIUS, 2000). A

utilização milenar de leveduras na fermentação em ambientes antrópicos levou a

exposição destes microrganismos a diferentes fatores de pressão seletiva resultando em

adaptações genéticas, o que foi chamado de processo de domesticação (SICARD &

LEGRAS, 2011; LITI, 2015).

Entretanto, o interesse no estudo sobre as leveduras em seu ambiente natural,

tanto de espécies selvagens quanto associadas a atividades humanas se inicia

principalmente na década de 1950 (LITI, 2015). As leveduras estão distribuídas em

todos os biomas do mundo e nos ambientes naturais podem assumir diversas funções.

São essencialmente decompositoras, colonizam substratos ricos em nutrientes e são

Page 27: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

23

seguidas por uma variedade de outros microrganismos completando a degradação da

matéria orgânica. Além disso, como parte de um ecossistema, interagem com os

organismos que o compõem em relações de mutualismo, competição, parasitismo e

patogenicidade (STARMER & LACHANCE, 2011). Em situações onde há escassez de

nutrientes as leveduras podem formar esporos, que são estruturas de resistência capazes

de sobreviver mais tempo que as células vegetativas. Em circunstâncias extremas, como

altas ou baixíssimas temperaturas e seca, os esporos persistem até que haja novamente

condições de desenvolvimento favoráveis (LITI, 2015).

Leveduras ascomicéticas como S. cerevisiae podem formar esporos chamados

ascósporos contidos em ascas, enquanto em ambiente rico em nutrientes células

diploides se reproduzem por divisão mitótica. Porém quando há baixa de nutrientes, as

células diploides entram em meiose produzindo esporos haploides com, geralmente,

dois (a e α) tipos reprodutivos diferentes (mating types) (VAUGHAN-MARTINI &

MARTINI, 2011; BOYNTON & GREIG, 2014). Quando as condições favoráveis ao

desenvolvimento retornam, os esporos germinam em células viáveis haploides, que

podem se reproduzir mitoticamente (KNOP, 2006; BOYNTON & GREIG, 2014; LITI,

2015). O cruzamento entre indivíduos não relacionados pode ocorrer entre espécies

próximas de leveduras diferentes, levando à formação de híbridos, como por exemplo,

S. pastorianus, que é um híbrido do cruzamento entre S. cerevisiae e S. eubayanus,

amplamente utilizada na indústria cervejeira para produção de cerveja larger (LIBKIND

et al., 2011).

A diversidade dos habitats naturais de leveduras e sua ubiquidade é

consequência da capacidade desses microrganismos de assimilar nutrientes, como

carbono e nitrogênio, a partir de uma enorme variedade de fontes, além do fato de

tolerarem uma ampla variação na escala de pH, altas pressões osmóticas e salinidade,

dessecação e altos índices de radiação UV. As leveduras podem se tornar especializadas

em apenas um nicho e apresentar características fisiológicas próprias para aquele

ambiente (STARMER & LACHANCE, 2011).

As interações com os ambientes naturais e entre espécies no mesmo habitat

levam ao desenvolvimento de características adaptativas, convergências fenotípicas e o

estabelecimento de estratégias de sobrevivência (LITI et al., 2009). A temperatura pode

influenciar diretamente na velocidade de crescimento. A disponibilidade de recursos

Page 28: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

24

pode determinar a formação ou não de esporos. Ao longo de um dia ocorrem alterações

de luz, umidade, temperatura, incidência de ventos, a chamada variação circadiana, este

aspecto ambiental permite que duas espécies ou mais se desenvolvam em simpatria; ou

seja, que se desenvolvam no mesmo habitat com, por exemplo, as espécies mais

adaptadas a altas temperaturas ou termotolerantes apresentando melhor atividade nos

períodos mais quentes do dia; as espécies criotolerantes, que se desenvolvem melhor a

temperaturas mais baixas, apresentando um desempenho superior nos períodos mais

frios (SAMPAIO & GONÇALVES, 2008; SALVADÓ et al., 2011).

Em resumo, leveduras como seres ubíquos estão amplamente dispersas, podem

ocorrer nos principais ambientes bióticos e abióticos, como solo, água, na atmosfera, em

plantas, animais e insetos. Em certos momentos alguns destes habitats são apenas

transitórios; ventos podem atuar na dispersão destes microrganismos, tal qual, o

carreamento na superfície de um inseto, ou o decaimento de uma fruta ao solo. Além

disto, a migração humana também contribui para a dispersão destes microrganismos,

como ocorreu no caso das leveduras fermentadoras de bebidas alcoólicas (BARBOSA

et al., 2018). Leveduras que se especializaram no crescimento e reprodução em

determinado habitat podem persistir, por exemplo, produzindo esporos, até surgir a

oportunidade de retornarem ao seu reservatório ideal (STARMER & LACHANCE,

2011).

Com o advento das análises biomoleculares, a ferramenta de genômica

populacional, assim como, o estudo de diferentes biomas ao redor do globo, tem

auxiliado na construção da história natural das linhagens de leveduras, suas adaptações

genotípicas e fenotípicas. Isto tem possibilitado o aperfeiçoamento do conhecimento

biológico a respeito dessas espécies de microrganismos, colaborando para melhor

compreensão dos fatores seletivos aos quais são expostas durante seus ciclos de vida,

suas interações ambientais e seu processo evolucionário (LITI, 2015; BARBOSA et al.,

2018).

4.4 A relação entre abelhas, seus produtos e leveduras

A associação entre abelhas sem ferrão e comunidades microbianas vem sendo

mostrada em diversos estudos. Leveduras já foram encontradas no corpo de abelhas

Page 29: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

25

adultas, em larvas, provisões larvais e pupas (ROSA et al., 2003). Microrganismos

podem colonizar diversas partes no corpo de um inseto, que representam habitat

diferentes, alguns exemplos são o exoesqueleto e o lúmen intestinal. A composição e

abundância desta microbiota são determinadas por condições físico-químicas e o

sistema imune do inseto, além das interações entre os microrganismos naquele habitat

(DOUGLAS, 2015). Uma vez que a relação é estabelecida pode haver variados tipos de

interações, desde neutra (0/0), passando por mutualística que é positiva para ambos

(+/+), comensal (+/0), amensal (-/0) e até o parasitismo onde um participante é lesado e

o outro beneficiado (-/+) (STARMER & LACHANCE, 2011; STEFANINI, 2018).

Normalmente a relação é benéfica, onde a levedura oferece nutrientes essenciais ao

inseto e este atua como veículo de dispersão das células fúngicas. Observa-se ainda a

interação entre leveduras e plantas, ricas em compostos orgânicos e umidade,

estabelecendo a tríade inseto-levedura-planta (STARMER & LACHANCE, 2011).

Leveduras foram encontradas no intestino de Apis mellifera com a dominância

de espécies variando de acordo com a posição social do hospedeiro, o intestino de

abelhas operárias apresentou maior dominância do gênero Saccharomyces, enquanto o

de forrageiras e rainhas apresentou maior dominância pelo gênero Zygosaccharomyces

(YUN et al., 2018). O gênero Zygosaccharomyces também foi encontrado em relação de

simbiose mutualística com larvas da espécie de abelha sem ferrão Scaptotrigona depilis.

As larvas desta abelha necessitam consumir a levedura para seu desenvolvimento, em

ordem de ingerir precursores esteroidais essenciais para o processo de formação de

pupas. Estes esteróis não são produzidos pelas abelhas, e sim pelas leveduras

(PALUDO et al., 2018).

A levedura Starmerella meliponinorum foi isolada de abelhas adultas das

espécies nativas sem ferrão Tetragonisca angustula e Melipona quadrifasciata,

Starmerella etchellsii foi encontrada associada somente à T. angustula. As espécies de

leveduras Starmerella apicola, Debaryomyces hansenii e Zygosaccharomyces sp. foram

encontradas em associação à abelhas adultas de M. quadrifasciata (ROSA et al., 2003).

Além disso, S. meliponinorum foi identificada em amostras de pão de abelha, uma

mistura de mel e polén que serve de alimento para as abelhas operárias, e também no

mel, no pólen, em ―pellets‖ de refugo e própolis da abelha T. angustula (ROSA et al.,

2003; TEIXEIRA et al., 2003; STEFANINI, 2018). Leveduras ascomicéticas foram

similarmente obtidas de amostras de himenópteros da tribo Bombini, do gênero Bombus

Page 30: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

26

sp., mais conhecidas como abelhas mamangava, onde foram identificadas leveduras dos

clados Metschnikowia e Starmerella, e dos gêneros Debaryomyces e

Zygosaccharomyces nos potes de mel, no trato digestivo das abelhas, na superfície do

corpo das operárias, e no néctar das flores de Helleborus foetidus visitadas pelas abelhas

(BRYSCH-HERZBERG, 2004). As visitas florais por estas abelhas influenciam

diretamente a frequência e abundância de leveduras no néctar (HERRERA et al., 2009).

O comportamento de visitação de flores pelas abelhas depende de diferentes aspectos

como a composição do néctar, que apresenta altas concentrações de açúcares. O néctar é

a fonte primária de carboidratos para as abelhas, possui aminoácidos e compostos

voláteis, responsáveis por atrair insetos polinizadores. Quanto mais atrativas as

características da composição do néctar, maior a probabilidade de visitação e de células

de leveduras serem inoculadas após a abertura da corola da flor (GILLIAM, 1979;

BRYSCH-HERZBERG, 2004; GONZÁLEZ-TEUBER & HEIL, 2009; HEIL, 2011).

O pólen coletado pelas abelhas sem ferrão é acumulado nas corbículas, parte da

tíbia posterior da abelha que serve como um ―cesto‖, e armazenado posteriormente no

ninho em potes de cerúmen, formando um agregado constituído por diversos pólens

florais com composições diferentes, resquícios de néctar e enzimas salivares das

abelhas. Este é um alimento nutritivo, fonte de proteínas, lipídeos, vitaminas e minerais

para estes insetos (GILLIAM, 1979; LINS et al., 2003). No pólen também são

encontradas espécies de leveduras como S. neotropicalis e S. meliponinorum,

respectivamente em ninhos de Melipona quinquefasciata e T. angustula (ROSA et al.,

2003; TEIXEIRA et al., 2003; DANIEL et al., 2013). Estas leveduras podem fermentar

o pólen após estocado (MENEZES et al., 2013).

O mel por sua vez, apresenta propriedades físico-químicas que usualmente

impedem o crescimento de microrganismos, como baixa atividade de água, baixo pH e

alta concentração de açúcares. Acredita-se que as abelhas sejam responsáveis pela

inoculação das leveduras que se encontram presentes no mel. Geralmente, estas são

resistentes às condições de estresse deste substrato (ESTEVINHO et al., 2012;

RÓZAŃSKA & OSEK, 2012). O mel é armazenado pelas abelhas sem ferrão em potes

de cerúmen. Estes potes são preenchidos com o néctar coletado das flores que após o

armazenamento passa por transformações, onde a maior parte da água evapora. As

leveduras e bactérias presentes iniciam um processo de fermentação, e enzimas das

glândulas salivares das abelhas operárias, como amilases e invertases, são secretadas

Page 31: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

27

quebrando as moléculas de sacarose do néctar em glicose e frutose (VENTURIERI et

al., 2007; MENEZES et al., 2013). Espécies dos gêneros Metschnikowia, Starmerella e

Zygosaccharomyces são recorrentemente observados no mel de abelhas sem ferrão

(ROSA et al., 2003; TEIXEIRA et al., 2003; SEIJO, ESCUREDO & FERNÁNDEZ-

GONZÁLEZ, 2011; SAKSINCHAI et al., 2012).

Maiores conhecimentos sobre qual a função das leveduras em sua associação

com as abelhas são necessários. Os microrganismos podem contribuir na nutrição das

abelhas, provendo nutrientes ou quebrando moléculas que o inseto é incapaz de digerir,

preservando alimentos na colônia e protegendo o inseto contra microrganismos

patogênicos, produzindo toxinas contra o patógeno e modulando o sistema imune do

inseto (MENEZES et al., 2013; DOUGLAS, 2015; STEFANINI, 2018). Em benefício

das leveduras, os insetos atuam como vetores de dispersão, influenciando na

biodiversidade das populações de leveduras no meio ambiente (STEFANINI, 2018).

Portanto, o estudo de leveduras associadas a abelhas e flores de um ecossistema de Mata

Seca poderá fornecer novas informações sobre a associação entre estes organismos,

além de possibilitar a descoberta de novas espécies destes fungos novas para a ciência.

Page 32: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

28

5 MATERIAIS E MÉTODOS

5.1 Coleta das amostras

Foram realizadas três coletas na cidade de Janaúba, norte do estado de Minas

Gerais (figura 2), com suporte e colaboração da equipe do Serviço de Recursos Vegetais

e Opoterápicos da Fundação Ezequiel Dias. As coletas foram realizadas em área de

preservação de mata seca em 2016 nas respectivas datas: 01/04, durante a estação

chuvosa; 09/06, no início da estação seca durante o período de floração; e 07/10 no auge

na estação seca.

Figura 2: Mapa de localização do Município de Janaúba, norte do estado de Minas Gerais,

Brasil. Construído utilizando software QGIS 3.4.2, dados espaciais obtidos no portal de mapas

do IBGE (https://portaldemapas.ibge.gov.br).

Foram analisadas três espécies (figura 3) Tetragonisca angustula (jataí),

Scaptotrigona cfr. bipunctata (tubuna) e Apis mellifera (ninhos em apiário próximo à

área preservada de mata seca). As coletas de cada substrato analisado foram feitas em

triplicata: mel imaturo, mel maduro, pólen, alimento larval. Foi considerado mel

Page 33: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

29

imaturo aquele depositado em potes ainda abertos e, mel maduro aquele depositado em

potes fechados. No total foram coletados dos ninhos 40 indivíduos adultos de T.

angustula, 55 de S. cfr. bipunctata e 35 de A. mellifera. Em relação ao mel imaturo

foram coletadas 4 amostras dos ninhos de T. angustula, 16 amostras de S. cfr.

bipunctata e 21 de A. mellifera. A amostragem de mel maduro foi 15 de T. angustula,

26 de S. cfr. bipunctata e 21 de A. mellifera. Em relação ao pólen foram coletadas 6

amostras dos ninhos de T. angustula, 33 dos ninhos de S. cfr. bipunctata e 18 de A.

mellifera.

Figura 3: As espécies de abelhas Tetragonisca angustula (A, jataí), Scaptotrigona cfr.

bipunctata (B, tubuna) e Apis mellifera (C) (fonte: A, http://www.ib.usp.br/beesp/; B, Paula de

Souza São Thiago Calaça; C, Prof. Dr. Clemens Schlindwein).

No período de floração em junho foram coletadas treze amostras de flores

(figura 4), de quatro indivíduos masculinos e um feminino de Myracrodruon urundeuva

(Aroeira). As flores de Aroeira são o principal recurso alimentar utilizado pelas abelhas

na área.

Page 34: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

30

Figura 4: Coleta de amostras de flores de Myracrodruon urundeuva (Aroeira) (fonte: Prof. Dr.

Clemens Schlindwein).

As amostras de mel imaturo e maduro foram coletadas com o auxílio de

micropipetador (figura 5), e as de pólen foram coletadas diretamente dos potes de

alimento com alça estéril (figura 6). Alíquotas de 0,1 mL de mel e 0,1 g de pólen foram

diluídas em 0,9 mL água peptonada 0,1%. Um mililitro da diluição decimal 10-1

de cada

amostra foi semeado, em duplicata, em placas contendo ágar extrato de levedura e malte

(YM – ágar 2%, peptona 1%, glicose 2%, extrato de malte 0.3%, extrato de levedura

0.3% e cloranfenicol 100 mg%), pelo método pour plate, as colônias foram contadas e

foi calculado o número de unidades formadoras de colônia (UFC).

Page 35: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

31

Figura 5: Coleta de mel com o auxílio de micropipetador (fonte: Paula de Souza São Thiago

Calaça).

Figura 6: Coleta de pólen utilizando alça estéril (fonte: Paula de Souza São Thiago Calaça).

Além disso, foram coletados cinco indivíduos adultos de cada espécie, colocados

para caminhar por até 15 minutos em placas de ágar YM (figura 7), sendo liberados

após esse período. Este procedimento visou o isolamento de leveduras presentes no

corpo das abelhas ou de fezes liberadas por estas. As placas de YM foram incubadas por

até sete dias em estufa a 25º C. As amostras de flores foram inoculadas em meio líquido

contendo 50% de glicose e em caldo YM, cinco flores para cada tubo. Os tubos foram

incubados em shaker a 200 rpm e 25º C por cinco dias até turvação do meio pelo

crescimento das leveduras. A partir dos tubos com crescimento, 100 µL de diluições

decimais apropriadas foram semeadas em placas de ágar YM para o isolamento das

leveduras. Estas placas foram incubadas em estufa a 25º C (KURTZMAN et al., 2011).

Page 36: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

32

Figura 7: Indivíduos adultos das espécies Tetragonisca angustula (A), Scaptotrigona cfr.

bipunctata (B) e Apis mellifera (C) em placas de ágar YM (fonte: Autora).

5.2 Preservação e identificação morfológica

Após o período de incubação, as colônias foram contadas e descritas

morfologicamente de acordo com a cor, tamanho, textura, borda, formato e foram

agrupadas. Cada morfotipo foi contado, isolado (figura 8 B), purificado (figura 8 C) e

posteriormente inoculado em 2 mL de caldo GYMP. Após o crescimento, foi

acrescentado 200 µL de glicerol para criopreservação das leveduras em freezer a -80º C

(KURTZMAN et al., 2011).

Page 37: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

33

Figura 8: Placa inoculada em campo (A), placa com colônias de levedura isoladas (B), placa

com colônia de levedura purificada (C) (fonte: Autora).

5.3 Extração de DNA

Para a extração de DNA, as leveduras foram inoculadas em ágar YM, e

incubadas em estufa a 25º C por 24 h. Após o crescimento, uma alçada de cada colônia

foi adicionada em tubos com 100 µL de tampão de lise (Tris-HCl pH 8, EDTA pH 8,

NaCl e SDS) para rompimento da parede e membrana celular. Os tubos foram agitados

em vortex e incubados em banho seco a 65º C por 30 min. Após este período, 200 µL de

clorofórmio:álcool isoamílico (24:1, solvente orgânico para desnaturar as proteínas e

purificar o DNA) foi adicionado a cada tubo, homogeneizado manualmente, e

centrifugado à 14000 rpm por 15 min. Após,70 µL do sobrenadante de cada amostra foi

transferido para um novo tubo. Em seguida, adicionou-se 70 µL de isopropanol, e os

tubos foram homogeneizados por inversão, e incubados à temperatura ambiente por 15

min para precipitação do DNA. Após, as amostras foram centrifugadas 14000 rpm por

Page 38: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

34

10 min. O sobrenadante foi descartado por inversão e acrescentou-se 200 µL de etanol

gelado em cada microtubo. Estes foram homogeneizados por inversão e centrifugados a

14000 rpm por 10 min. O sobrenadante foi descartado e esse procedimento foi realizado

mais uma vez para remoção de resíduos de sais. As amostras foram incubadas em estufa

à 37º C para secagem ou mantidas em temperatura ambiente overnight. O pellet

formado no fundo do microtubo foi resuspendido em 50 µL de tampão TE (Tris-EDTA

0,1 M, pH 8) para hidratação e as amostras foram incubadas em estufa à 37º C por 1 h.

O DNA total obtido foi dosado utilizando espectrofotômetro NanoDrop ND1000

(NanoDrop Technologies). Ao final, o DNA foi diluído para atingir a concentração de

aproximadamente 200 ng/µL e armazenado a -20º C.

5.4 Agrupamento por PCR fingerprinting com iniciador GTG5

As linhagens de leveduras com características morfológicas similares foram

agrupadas utilizando a técnica de PCR fingerprinting, com o iniciador GTG 5 (5’ -

GTGGTGGTGGTGGTG - 3’), que permite agrupar os isolados de acordo com seus

perfis moleculares. Cada reação realizada continha: 16,8 µL de água deionizada estéril,

2,5 µL de tampão de PCR 5X (Thermo), 1,5 µL de MgCl2 25mM (Thermo), 1,0 µL de

dNTP 10 pmol, 2,0 µL do iniciador GTG5 10 pmol (Invitrogen), 0,2 µL de Taq DNA

polimerase 5U/µL (Sinapse) e 1 µL de DNA, totalizando volume final de 25 µL. Um

tubo denominado branco contendo todos os reagentes exceto DNA foi preparado, e

utilizado como controle de possíveis contaminações do processo de PCR. O ciclo básico

de amplificação utilizado para reação de PCR foi: um ciclo de desnaturação inicial a

94°C por 2 minutos; 40 ciclos de desnaturação a 93°C por 45 segundos, anelamento a

50°C por 1 minuto e extensão a 72°C por 1 minuto; um ciclo de extensão final a 72º C

por 6 minutos. Por fim, os produtos da amplificação foram visualizados por eletroforese

em gel de agarose 1,5%, eluidos por 2 h à 80 V em tampão TBE 0,5X (Tris-base 0,045

M; Ácido bórico 0,045 M; EDTA 0,001 M, pH 8,0). Foram aplicados nos géis 3 µL de

solução Gel Red (Biotium) + Tampão na proporção de 1:1 e 5 µL do produto da reação

de PCR, após a corrida as bandas moleculares foram visualizadas sob luz ultravioleta

(WHILE et al., 1990).

Page 39: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

35

5.5 PCR utilizando iniciadores ITS1 e NL4

Os representantes de cada agrupamento molecular obtido foram submetidos à

PCR utilizando os iniciadores ITS1 e NL4, que amplificam as regiões ITS1/ITS2

(espaçadores transcritos internos) e os domínios D1/D2 da subunidade maior (26S) do

gene do RNA ribossomal (rRNA) (KURTZMAN & ROBNETT, 1998; FELL et al.,

2000; KURTZMAN, FELL & BOEKHOUT, 2011). Cada reação de PCR, totalizando

volume de 50 µL, continha: 32,8 µL de água deionizada estéril, 5,0 µL de tampão de

PCR 5X (Sinapse), 3,0 µL de MgCl2 25mM (Sinapse), 2,0 µL de dNTP 10 pmol, 1,0 µL

do iniciador ITS1 10 pmol (Invitrogen), 1,0 µL do iniciador NL4 10 pmol (Invitrogen),

2,0 µL de betaína, 1,0 µL de DMSO, 0,2 µL de Taq DNA polimerase 5U/µL (Sinapse)

e 2 µL de DNA. Foi preparado também um branco da reação contendo todos os

reagentes exceto DNA. O ciclo básico de amplificação utilizado no termociclador para

reação de PCR foi: um ciclo de desnaturação inicial a 95°C por 2 minutos; 35 ciclos de

desnaturação a 95°C por 15 segundos, anelamento a 54°C por 25 segundos e extensão a

72°C por 20 segundos; um ciclo de extensão final a 72°C por 10 minutos. Os amplicons

foram analisados através de eletroforese em gel de agarose 1%, eluidos por 20 min à

120 V em tampão TBE 0,5X, foi aplicado ao gel de agarose 3 µL de solução Gel Red

(Biotium) + Tampão na proporção de 1:1 e 1 µL do produto da reação de PCR, após a

corrida as bandas moleculares foram visualizadas sob luz ultravioleta (WHILE et al.,

1990).

5.6 Purificação e reação de sequenciamento

Os amplicons obtidos através da reação de PCR utilizando os iniciadores

ITS1/NL4 foram submetidos a um processo de purificação para serem enviados ao

sequenciamento. Foram adicionados a cada produto de PCR, 11,75 µL de EDTA a 125

Mm e 141,0 µL de etanol absoluto. As amostras foram homogeneizadas por inversão, e

mantidas em repouso por 15 min em temperatura ambiente para precipitação do DNA.

Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 14000 rpm por 25 min, retirou-se o

sobrenadante por inversão, adicionou-se 120,0 µL de etanol 70% gelado à parede do

tubo para lavar o sedimento, homogeneizando por inversão. As amostras foram

Page 40: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

36

centrifugadas novamente, por 10 min, o sobrenadante foi descartado por inversão e as

amostras foram mantidas em temperatura ambiente overnight, para total evaporação do

etanol. O DNA foi ressuspendido em 10,0 µL de água ultrapura e incubado em banho

seco a 37º C por 30 min, para hidratação. O DNA purificado obtido, foi dosado

utilizando espectrofotômetro NanoDrop ND1000 (NanoDrop Technologies), diluído

para atingir a concentração final de aproximadamente 10 a 20 ng/µL e armazenado a -

20º C. Para as reações de sequenciamento foi utilizado o kit Big Dye versão 3.1

(Applied Biosystems, EUA), a placa de sequenciamento foi armazenada a 4°C,

protegida da luz, até injeção das amostras no sistema automatizado de sequenciamento

por eletroforese capilar ABI3130, utilizando-se polímero POP7 no Laboratório de

Parasitologia Celular e Molecular do Centro de Pesquisas René Rachou de Belo

Horizonte, Minas Gerais.

5.7 Análise das sequências

As sequências de DNA obtidas foram analisadas utilizando o programa Phred

quality scores, disponibilizado pela EMBRAPA

(http://asparagin.cenargen.embrapa.br/phph/), selecionou-se bases contíguas com

parâmetro de qualidade Phred (score de qualidade ou Q score) maior que 20. Utilizando

o programa BLASTn (Basic Local Alignment Search Tool – NCBI – NIH; disponível

em https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) as sequências de interesse foram

comparadas com as sequências depositadas no banco de dados do GenBank

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), permitindo identificar assim a identidade da

sequência de interesse (KURTZMAN, 2014). As sequências das leveduras obtidas no

presente trabalho foram comparadas com aquelas depositadas no GenBank, utilizando o

programa Blastn. As espécies que apresentaram sequencias da região D1/D2 idênticas

às espécies conhecidas foram consideradas como pertencentes a aquela espécie. As

espécies que apresentaram mais de seis diferenças não contíguas nesta região, em

relação a todas as espécies conhecidas, foram consideradas como possíveis novas

espécies de leveduras (KURTZMAN, 2014).

Page 41: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

37

5.8 Análise estatística dos dados e determinação dos índices de diversidade

A Análise de Variância não paramétrica de dois fatores de Friedman foi aplicada

na análise dos dados, seguida da correção de Bonferroni para comparação por método

pairwise, com o objetivo de comparar os isolados de leveduras obtidos a partir de cada

espécie de abelhas estudada (T. angustula; S. bipunctata; A. mellifera) e as coletas

realizadas. Os gráficos e as análises estatísticas foram gerados usando o software IBM

SPSS Statistics (Versão 24). Os resultados foram apresentados com média ± desvio

padrão, sendo considerado o nível de significância de 5 % (p < 0,05).

Análises comparativas entre as comunidades de leveduras associadas às três

espécies de abelhas e aos substratos relacionados (mel e própolis) foram conduzidas

utilizando o índice de diversidade diferencial β. Este índice reflete o quanto duas

comunidades diferem em função dos conjuntos de espécies que abrigam

(WHITTAKER, 1972, MAGURRAN, 2004). Para o estudo da diversidade β foi

utilizado o índice βH1 [βH1 = (S /∝med) – 1] de Harrison et al. (1992), onde S = total

de espécies encontrado nas duas comunidades e ∝med = média da riqueza das duas

comunidades.

A análise de similaridade foi realizada com base em uma matriz de presença e

ausência das comunidades de leveduras isoladas de cada espécie de abelha, incluindo-se

os substratos associados (mel e própolis). A análise foi realizada por meio de um

dendograma (UPMG) pelo método de ligação por grupos pareados, empregando os

índices de similaridade Jaccard (VALENTIN,1995; RAMETTE, 2007). Foi utilizado o

programa PAST v3.25. O compartilhamento de espécies de leveduras entre as abelhas

foi visualizado em diagramas de Venn, disponível online (http://jvenn.toulouse.inra.fr)

(BARDOU et al., 2014). O esforço amostral foi avaliado utilizando-se curvas de

acumulação (GOTELLI & CHAO, 2013). A árvore filogenética foi construída com base

em sequências alinhadas dos domínios D1/D2 do gene do RNA ribossomal utilizando-

se o programa Mega Molecular Evolutionay Genetics Analysis versão 7 (KUMAR et

al., 2016). A árvore filogenética foi construída utilizando-se o algoritmo de Neighbor-

joining. Uma análise de bootstrap foi realizada com 1000 iterações, utilizando os

softwares incluídos no programa Mega Molecular Evolutionay Genetics Analysis

versão 7 (KUMAR et al., 2016).

Page 42: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

38

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO

6.1 Isolamento, preservação e agrupamento morfológico

Oitenta e seis isolados de leveduras foram obtidos a partir das amostras

coletadas dos ninhos de T. angustula (jataí), 184 isolados das amostras coletadas dos

ninhos de Scaptotrigona cfr. bipunctata (tubuna), 78 isolados das amostras dos ninhos

de A. melífera e 33 isolados das amostras de flores de Aroeira, M. urundeuva (Tabela

1). Em um dos ninhos de S. cfr. bipunctata observou-se massa de refugo descartada

pelas abelhas, este material foi coletado, plaqueado e a partir dele houve o crescimento

de quatro isolados de levedura (Tabela 1).

Devido a situações adversas durante o período de coleta, os ninhos

apresentaram-se fracos e com pouca ou nenhuma oferta de alimento, sendo possível a

coleta de um número reduzido de amostras. Devido à baixa disponibilidade de alimento

larval e ninhos com poucos discos de cria, estes substratos não foram coletados. De

colmeia de A. mellifera apenas uma amostra foi plaqueada, havendo o crescimento de

dois isolados de levedura (Tabela 1).

Na primeira coleta realizada em primeiro de abril de 2016, durante a estação

chuvosa, foram obtidos 112 isolados de leveduras. Na segunda coleta, realizada em

nove de junho de 2016, no início da estação seca e durante o período de floração foram

obtidos 223 isolados de leveduras. Na terceira coleta, realizada em sete de outubro de

2016, no auge na estação seca foram obtidos apenas 46 isolados de leveduras.

O período de floração é a época do ano onde há maior disponibilidade de

alimento, as abelhas nativas estocam a maior quantidade possível de recursos

alimentares para manter suas colônias perenes, enfrentando posteriormente o auge da

temporada de seca (WILLE, 1983), além disso, quando as temperaturas estão mais altas

a taxa de crescimento das leveduras aumenta e também a diversidade de populações

(BRYSCH-HERZBERG, 2004). Comparando o número de isolados de leveduras

obtidos em cada coleta e de acordo com cada espécie de abelha estudada (Figura 9), foi

possível observar que um número maior de leveduras foi isolado no período da segunda

coleta, sendo significante a diferença na quantidade de isolados obtidos na segunda

coleta (período de floração) em comparação à terceira coleta (auge da estação seca).

Page 43: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

39

Tabela 1: Número de leveduras isoladas de acordo com a espécie e substrato.

Espécies Adulto Mel

imaturo

Mel

maduro

Pólen Alimento

larval

Refugo Flores Total

Tetragonisca

angustula

(n=40)

36

(n=4)

19

(n=15)

30

(n=6)

1

— — — 86

Scaptotrigona

cfr. bipunctata

(n=55)

70

(n=16)

36

(n=26)

37

(n=33)

37

— (n=1)

4

— 184

Apis mellifera (n=35)

50

(n=21)

17

(n=21)

6

(n=18)

3

(n=2)

2

— — 78

Myracrodruon

urundeuva

— — — — — — (n=12)

33

33

Total 156 72 73 41 2 4 33 381

n = número de amostras coletadas dos ninhos.

Figura 9: Número de isolados de leveduras em relação à cada espécie de abelha estudada (A.

mellifera; S. bipunctata; T. angustula) obtidos nas diferentes datas de coletas (PC, primeira

coleta - 01/04/16; SC, segunda coleta - 09/06/16; TC, terceira coleta - 07/10/16). Os valores

foram expressos como média ± desvio padrão. * p < 0,05 quando comparado o grupo SC com o

grupo TC. Análise de variância de Friedman seguida de pós-teste de Bonferroni.

Page 44: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

40

O diagrama de Venn apresentado na Figura 10 representa o compartilhamento de

espécies de leveduras pelas três espécies de abelhas e os substratos associados (mel e

pólen). Aureobasidium pullulans foi a única espécie de levedura encontrada em

associação às três espécies de abelhas. Dezenove espécies de leveduras foram isoladas

exclusivamente de insetos adultos, mel e pólen de T. angustula. A abelha Apis mellifera

apresentou 13 espécies não compartilhadas com quaisquer outras abelhas. Já em

associação exclusiva a S. cfr. bipunctata foram encontradas 15 espécies, incluindo três

espécies novas de Starmerella e duas espécies novas de Zygosaccharomyces.

Figura 10: Diagrama de Venn com o número de espécies de leveduras exclusivas e

compartilhadas entre abelhas adultas (Apis mellifera, T. angustula e S. cfr. bipunctata) e

substratos associados (mel e pólen).

O baixo número de espécies compartilhadas e o grande número de espécies

exclusivas de cada abelha pode indicar uma segregação de locais de forrageio. Ao

compartilhar poucos substratos de visitação é criada uma estratégia alimentar que evita

a competição entre as espécies de abelhas. As espécies R. ruineniae, Rh. mucilaginosa,

Page 45: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

41

S. apicola, S. bombicola e S. etchellsii foram encontradas em associação a duas espécies

de abelhas, S. cfr. bipunctata e T. angustula. Em relação às espécies de Starmerella, em

especial à S. etchelsii, a levedura isolada em maior frequência na comunidade associada

à T. angustula e a terceira mais frequente juntamente com S. apicola associada à S. cfr.

bipunctata. O compartilhamento de leveduras desse gênero pode indicar tanto um

compartilhamento de locais de forrageio como também uma relação espécie específica

de leveduras do gênero Starmerella e estas espécies de abelhas. Scaptotrigona cfr.

bipunctata compartilha com A. mellifera as espécies de leveduras C. parapsilosis, Ha.

siamensis e Pa. laurentii. Já T. angustula e A. mellifera compartilham apenas uma

espécie de fungo leveduriforme, A. melanogenum.

Os índices de diversidade (Dominância e Simpson) e de riqueza (Margalef)

foram analisados para as comunidades de leveduras associadas à três espécies de

abelhas estudadas (Tabela 2).

Tabela 2: Índices de diversidade e riqueza das comunidades de leveduras associadas às

abelhas Scaptotrigona cfr. bipunctata, Tetragonisca angustula e Apis mellifera.

Espécies_S Indivíduos Dominância (D) Simpson (1-D) Margalef

Scaptotrigona

cfr.

bipunctata

24 93

0,1483 0,8517 5,0740

Tetragonisca

angustula

26 43 0,0622 0,9378 6,6470

Apis melifera 18 37 0,0928 0,9072 4,7080

Os índices de Dominância (D) e Simpson (1-D) expressam a diversidade das

comunidades levando em consideração a riqueza e equitabilidade. A comunidade que

apresentou a maior diversidade foi a associada à abelha T. angustula, seguida pela

comunidade associada a A. mellifera. Apesar de a comunidade associada a S. cfr.

bipunctata apresentar um número maior de espécies que a comunidade associada a A.

melifera, em S. cfr. bupunctata houve dominância de Starmerella sp. 1 e

Zygosaccaromyces sp. 1. A riqueza de espécies foi medida utilizando-se o índice de

Margalef e as análises mostram que a comunidade de leveduras associadas a T.

Page 46: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

42

angustula apresentam maior riqueza, seguida pela comunidade associada a S. cfr.

bipunctata e A. mellifera.

Tabela 3: Índices de diversidade β das comunidades de leveduras associadas às abelhas

S. cfr. bipunctata, Tetragona angustula e Apis mellifera.

Scaptotrigona cfr.

bipunctata

Tetragonisca

angustula

Apis

mellifera

Scaptotrigona cfr.

bipunctata

0 0,7600 0,8095

Tetragonisca angustula - 0 0,9091

Apis mellifera - - 0

Foram analisados ainda os índices de diversidade β, que expressam o quão

similar ou diferente são duas comunidades (Tabela 3). Este índice varia de 0, para

comunidades similares, a 1, para comunidades bastante heterogêneas. A similaridade na

composição da comunidade de leveduras entre as abelhas e substratos associados foi

maior entre T. angustula e S. cfr. bipunctata (0,76). Essa mesma dinâmica pode ser

observada na figura 11, que mostra o dendrograma construído a partir da matriz de

similaridade de Jaccard.

Figura 11: Dendrograma de similaridade das leveduras vetorizadas por diferentes espécies de

abelhas. Agrupamento realizado pela similaridade Jaccard.

Page 47: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

43

As curvas de acumulação das espécies de leveduras associadas às abelhas

estudadas não atingiram a estabilidade (i.e. assíntota), indicando que um maior esforço

amostral poderia cobrir a riqueza de espécies esperada.

Page 48: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

44

Figura 12: Curvas de acumulação de espécies das comunidades de leveduras associadas a

abelhas e substratos relacionados.

Page 49: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

45

6.2 Identificação das leveduras

A levedura Starmerella etchellsii foi a espécie associada com mais frequência à

T. angustula e S. cfr. bipunctata. Em T. angustula foi encontrada apenas em associação

ao corpo de abelhas adultas, enquanto em relação à S. cfr. bipunctata foi identificada em

amostras de mel imaturo, mel maduro, pólen e no corpo de abelhas adultas. Além disso,

também foi isolada do pólen de A. mellifera. Esta levedura é osmofílica e tem sido

recuperada a partir de substratos diversificados, tendo sido já anteriormente isolada de

abelhas sem ferrão. Além de S. etchellsii, as espécies associadas com mais frequência a

T. angustula foram A. pullulans, S. apicola, Starmerella sp. 3 e S. meliponinorum. As

espécies do clado Starmerella são leveduras ascomicéticas, frequentemente encontradas

em associação a espécies de abelhas ou substratos visitados por estes insetos (ROSA et

al., 2003). Pelo fato de apresentarem características bioquímicas muito similares, a

identificação das espécies deste gênero pelo método de sequenciamento de regiões do

gene do rRNA é o mais indicado (TEIXEIRA et al., 2003; LACHANCE et al., 2011;

SANTOS et al., 2018).

A levedura S. apicola é uma espécie de ampla distribuição, comumente isolada

de insetos que visitam flores, dentre eles as abelhas, sendo produtora de soforolipídeos,

um biosurfactante anfifílico (ROSA et al., 2003; KURTZMAN et al., 2010;

LACHANCE et al., 2010; SANTOS et al., 2018). No presente trabalho, esta espécie foi

encontrada em amostras de mel maduro, pólen e em associação à abelhas adultas.

Starmerella bombicola foi isolada de amostras de mel imaturo de T. angustula e S. cfr.

bipunctata. Leveduras desta espécie também são frequentemente encontradas

associadas a flores visitadas por abelhas (LACHANCE et al., 2011). A espécie S. lactis-

condensi foi isolada de amostra de pólen coletado por Scaptotrigona cfr. bipunctata, é

uma espécie de levedura considerada nutricionalmente especializada, capaz de crescer

apenas em glicose e lactose como fontes de carbono, além de tolerar substratos com

baixa atividade de água, podendo causar deterioração em alimentos, sendo vetorizada

por insetos (LACHANCE et al., 2011; STRATFORD et al, 2002). Três isolados de S.

meliponinorum foram obtidos a partir de amostras de mel maduro de T. angustula.

Teixeira et al. (2003) descreveram S. meliponinorum a partir de isolados obtidos de

vários substratos associados a espécies de abelhas sem ferrão da tribo Meliponini,

incluindo amostras de mel, própolis, provisões de pólen e abelhas adultas de T.

angustula.

Page 50: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

46

Quatro isolados de S. sorbosivorans foram obtidos a partir de amostras de

alimento larval, mel imaturo e adultos de A. mellifera. Essa espécie de levedura é

frequentemente isolada de vespas e abelhas e dos substratos por esses insetos visitados

(LACHANCE et al., 2001a; LACHANCE et al., 2001b). Outras quatro espécies de

leveduras pertencentes ao clado Starmerella, isoladas nesse trabalho, representam

possíveis espécies novas. Estas novas espécies são filogeneticamente pŕoximas às

espécies Starmerella etcheslsii, S. davenportii, S. lactis-condensie S. bombicola. Outras

espécies mais frequentemente associadas à A. mellifera foram A. pullulans,

Papiliotrema laurentii e S. sorbosivorans (tabela 6).

Tabela 4: Frequência de espécies de leveduras associadas à Tetragonisca angustula.

Espécies

Substratos

Mel imaturo

n=4

Mel maduro

n=15

Pólen

n=6

Adulto

n=40

Total Média

UFC/mL,

ou g

Aureobasidium melanogenum 1 1 10

Aureobasidium pullulans 1 4 5 68

Aureobasidium sp. 1 1 10

Blastobotrys chiropterorum 1 1 10

Candida intermedia 1 1 2,4x102

Citeromyces siamensis 1 1 20

Cystobasidium sp. 1 1 10

Hannaella luteola 1 1 2,4x102

Hannaella zeae 1 1 1,1x102

Kwoniella mangrovensis 1 1 10

Papiliotrema flavescens 1 1 10

Papiliotrema rajasthanensis 1 1 1,2x102

Papiliotrema sp. 1 1 10

Rhodosporidiobolus ruineniae 1 1 10

Rhodotorula mucilaginosa 2 2 2x103

Page 51: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

47

Rhodotorula toruloides 1 1 10

Schizosaccharomyces octosporus 1 1 10

Spencerozyma crocea 1 1 10

Starmerella apicola 2 1 3 20

Starmerella bombicola 1 1 10

Starmerella etchellsii 6 6 27

Starmerella meliponinorum 3 3 2,1x102

Starmerella sp. 3 1 1 2 35

Ustilago sp. 1 1 1 20

Vishniacozyma sp. 1 1 20

Yamadazyma siamensis 1 1 10

Zygosaccharomyces sp. 1 1 1 30

Total 10 13 — 20 42

n = número de amostras coletadas.

A levedura Candida parapsilosis foi a espécie obtida com maior frequência dos

insetos adultos e substratos associados a A. mellifera. Esse microrganismo é encontrado

em uma grande variedade de substratos e localidades, e é considerado um patógeno

oportunista (LACHANCE et al., 2011). Um representante de Cryptococcus gattii foi

isolado de pólen de S. cfr. bipunctata, uma espécie de levedura patogênica que pode

causar doença em indivíduos imunocompetentes (tabela 5). A RDC 12/2001 atribuída

pela ANVISA determina o regulamento técnico sobre padrões microbiológicos para

alimentos, e a Instrução normativa nº 3 de 19 de janeiro de 2001, regulamenta a

qualidade do pólen e outros produtos apícolas, porém ambos os documentos não

estabelecem parâmetros de qualidade comercial em relação a presença ou quantidade de

leveduras no pólen, considerando que o pólen e os outros produtos das abelhas são

utilizados como alimento e suplemento alimentar, é necessária a definição de

parâmetros de segurança microbiológica para os mesmos (BÁRBARA et al., 2018).

Também foram encontradas nesta pesquisa outras leveduras ascomicéticas

pertencentes aos clados Clavispora, Citeromyces, Debariomyces, Meyerozyma,

Schizosaccharomyces, Spencerozyma, Wickerhamiella, Yamadazyma e

Zygosaccharomyces. Debariomyces hansenii e espécies de Zygosaccaromyces já foram

Page 52: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

48

isoladas anteriormente das espécies das abelhas T. angustula e Melipona quadrifasciata

e substratos associados a esses insetos (mel e pópolis) (ROSA et al., 2003).

Debaryomyces hansenii é uma espécie xerotolerante com crescimento ótimo em

elevadas concentrações de NaCl (RASPOR et al., 2006). Pode ser isolada de substratos

diversos, tais como solo, filoplano de algumas plantas, ambiente marinho, produtos

fermentados a base de soja e outros alimentos ricos em sal (SUZUKI et al., 2011).

A possível espécie nova Zygosaccharomyces sp. 1 foi a segunda espécie mais

frequente associada à S. cfr. bipunctata. Foram obtidos 20 isolados de

Zygosaccharomyces sp.1 (tabela 5), a partir de amostras de mel e adultos de S. cfr.

bipunctata, e um isolado a partir de mel maduro de T. angustula (tabela 4).

Filogeneticamante a espécie descrita mais próxima a Zygosaccharomyces sp.1 é Z.

mellis, um microrganismo considerado osmotolorante e halotolerante, capaz de manter o

pH intracelular regulado mediante situação de choque hiperosmótico (VINDELØV &

ARNEBORG, 2002). Espécies de Schizosaccharomyces também são resistentes a

substratos com baixa atividade de água, e são geralmente isoladas de ambientes ricos

em açúcar (VAUGHAN-MARTINI et al., 2011b). Nesse trabalho um isolado de

Schizosaccharomyces octosporus foi obtido a partir de mel maduro de T. angustula

(tabela 4).

A espécie Wickerhamiella versatilis é halotolerante e osmotolerante,

sintetizadora de ésteres e glicerol, muito utilizada na fermentação de molho de soja

(HOU et al., 2016; RUAN et al., 2019). Nesse trabalho foi isolada de amostras de mel

imaturo, pólen e de abelhas adultas. Candida intermedia pertence ao clado Clavispora

(DANIEL et al, 2015) e é considerada uma espécie generalista (LACHANCE et al.,

2011).

Também foi isolada neste estudo a levedura Citeromyces siamensis, de mel

maduro produzido por T. angustula, é considerada uma espécie halotolerante e foi

descrita a partir de isolados obtidos na Tailândia (NAGATSUKA, et al., 2002). Além

disso, foi isolada a partir de inseto adulto de T. angustula a espécie. Blastobotrys

chiropterorum, descrita em associação a fígado de morcegos (Mormoops

megalophylla), na Colômbia (GROSE et al. 1968; SMITH et al., 2011). Há também um

relato clínico do isolamento dessa espécie de levedura em água de diálise de um

paciente do Havaí (FURMAN et al., 1983). Recentemente essa espécie foi isolada de

Page 53: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

49

sedimento de manguezal na Tailândia (KUNTHIPHUN et al., 2018). Yamadazyma

siamensis foi descrita em 2013 a partir de um isolado obtido do filoplano de cana de

açúcar na Tailândia (KAEWWICHIAN et al., 2013). Nesse trabalho foi isolada a partir

de inseto adulto de T. angustula (tabela 4).

Tabela 5: Frequência de espécies de leveduras associadas à Scaptotrigona cfr.

bipunctata.

Espécies

Substratos

Mel imaturo

n=16

Mel maduro

n=26

Pólen

n=33

Adulto

n=55

Total Média

UFC/mL,

ou g

Aureobasidium pullulans 1 1 2x103

Candida parapsilosis 1 1 10

Coniochaeta sp. 1 1 20

Cryptococcus gattii 1 1 10

Cyrenella sp. 1 1 10

Cystobasidium calyptogenae 1 1 10

Debaryomyces hansenii 1 1 2 103

Hannaella sinensis 1 1 10

Papiliotrema laurentii 1 2 3 10

Piskurozyma sp. 1 1 10

Rhodosporidiobolus ruineniae 2 1 3 90

Rhodotorula mucilaginosa 1 1 60

Sporidiobolus pararoseus 1 1 20

Starmerella apicola 1 1 9 11 7,3x102

Starmerella bombicola 2 2 4,2x102

Starmerella cf. etchellsii 1 2 2 6 11 8,3x102

Starmerella lactis-condensi 1 1 1,7x102

Starmerella sp. 1 5 3 4 1 13 5,6x102

Starmerella sp. 2 2 2 2x103

Page 54: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

50

Starmerella sp. 4 1 1 4,5x102

Ustilago sp. 2 1 1 10

Wickerhamiella versatilis 4 1 2 7 33

Zygosaccharomyces sp. 1 10 9 1 2 22 3,4x102

Zygosaccharomyces sp. 2 2 1 3 9,9x102

Total 24 22 19 27 92

n = número de amostras coletadas.

Aureobasidium é um gênero de fungo negro, do filo Ascomycota, que apresenta

estágio leveduriforme, sendo A. pullulans a espécie mais conhecida. São

frequentemente isolados de ambientes com baixa atividade de água e considerados

como microrganismos halotolerantes (KOGEJ et al., 2005). Aureobasidium pullulans é

uma espécie generalista, encontrada com frequência em matéria orgânica em

decomposição, na superfície de folhas, solo, água doce e ar (POZO et al., 2011).

Espécies de Aureobasidium foram isoladas de adultos de todas as três abelhas

estudadas. A associação de espécies de Aureobasidium a abelhas pode ser explicada

pelo caráter generalista dessas espécies, que podem estar associadas à superfície das

plantas visitadas por esses insetos. Além disso foram obtidos três isolados de

Aureobasidium a partir de amostras de mel e um isolado de amostra de pólen. A

presença de A. pullulans no mel imaturo pode ser relacionada à capacidade desse

microrganismo de tolerar ambientes com baixa atividade de água.

Algumas espécies de leveduras basidiomicéticas generalistas foram isoladas do

mel e adultos das abelhas estudadas. Espécies de leveduras do gênero Hannaella,

Kwoniella, Papiliotrema,Rhodosporidiobolus, Rhodotorula e Vishniacozyma podem ser

consideras ubíquas e são frequentemente isoladas de substratos vegetais, como filoplano

e flores. Rosa et al. (2003) também isolaram espécies generalistas de leveduras

basidiomicéticas a partir de mel e adultos de T. angustulata, onde foram obtidos

isolados de Cryptococcus albidus-like (= Naganishia albida), Cryptococcus spp. e

Rhodotorula spp. em amostras coletadas em Belo Horizonte e Betim, Minas Gerais.

Para algumas espécies de leveduras basidiomicéticas, apenas um isolado foi

obtido a partir das abelhas estudadas e substratos associados (mel e pólen). Apiotrichum

Page 55: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

51

porosum já foi isolada de solo, exsudato de árvore e guano de morcego (SUGITA,

2011).

Tabela 6: Frequência de espécies de leveduras associadas à Apis mellifera.

Espécies

Substratos

Alimento

larval

n=2

Mel

imaturo

n=21

Mel

maduro

n=21

Pólen

n=18

Adulto

n=35

Total Média

UFC/mL,

ou g

Apiotrichum posorum 1 1 9,4x102

Apiotrichum sp. 1 1 12,5x102

Aureobasidium melanogenum 1 1 30

Aureobasidium pullulans 1 5 6 40

Aureobasidium thailandense 1 1 10

Candida parapsilosis 2 4 6 3,5x102

Coniochaeta rhopalochaeta 1 1 10

Cutaneotrichosporon mucoides 1 1 10

Hannaella siamensis 1 1 10

Meyerozyma guilliermondii 1 1 2x103

Meyerozyma sp. 1 1 2x103

Papiliotrema aurea 1 1 10

Papiliotrema laurentii 4 4 13

Rhynchogastrema tunnelae 1 1 10

Saitozyma flava 1 1 10

Starmerella cf. etchellsii 2 2 15

Starmerella sorbosivorans 2 1 1 4 1,6x102

Total 2 7 2 3 20 34

n = número de amostras coletadas.

Cutaneotrichosporon mucoides é uma espécie com importância médica, capaz

de causar infecção disseminada, e já foi isolada de pacientes com pneumonia e

Page 56: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

52

meningite. Pode causar onicomicose e piedra branca (SUGITA, 2011). Já foi isolada de

amostras de água coletadas na costa do Mar Vermelho em Israel e do Mar Morto

(BUTINAR et al., 2005). Cystobasidium calyptogenae é uma espécie de levedura

isolada inicialmente de um molusco (Calyptogena sp.) em ambiente marinho profundo

do mar da Baía de Sagami, Japão (SAMPAIO, 2011). Em 2008 também foi isolada de

água marinha em Taiwan (TIEN et al., 2008). Rhinchogastrema tunnelae foi descrita a

partir de isolados obtidos de unha e de substrato desconhecido na Finlândia (VALENTE

et al., 2012). Spencerozyma crocea já foi isolada de besouro, árvore e bebida

fermentada (SAMPAIO, 2011). Para todas essas espécies o habitat natural ainda não

está bem estabelecido, uma vez que há poucos trabalhos que relatam o isolamento das

mesmas de substratos naturais ou mesmo um número muito pequeno de isolados da

espécie é conhecido.

Trinta e três isolados foram obtidos a partir das flores de Aroeira, distribuídas

em 4 espécies diferentes. Os isolados das flores de Aroeira foram identificados como

Rhodosporidiobolus ruineniae, Pseudosydowia eucalypti, Kwoniella heveanensis e

Aureobasidium thailandense. A espécie prevalente foi R. ruineniae, levedura

basidiomicética, produtora de óleo antimicrobiano, e geralmente associada com

superfície de folhas (WANG et al., 2016; SITEPU et al., 2017). Esta espécie também foi

encontrada em amostra de mel maduro de T. angustula, e no mel maduro e pólen de S.

cfr. bipunctata. A ocorrência desta espécie associada à flores justifica a presença no mel

das duas abelhas sem ferrão, já que seria coletada juntamente com o néctar de aroeira e

transportada para os ninhos dos insetos.

6.3 Espécies novas de leveduras

Quinze espécies identificadas no presente trabalho apresentaram divergência

considerável na análise da sequência dos domínios D1/D2 do gene do RNA ribossomal

e representam possíveis espécies novas (Tabela 7). Quatro possíveis espécies novas

pertencem ao clado Starmerella. Starmerella sp.1 possui 13 isolados obtidos a partir de

amostras de mel e pólen de Scaptotrigona cfr. bipunctata e também de abelhas adultas.

Essa espécie é filogeneticamente próxima a S. etchellsii, com seis pares de bases

divergentes na comparação de sequências dos domínios D1/D2. Starmerella sp.2 possui

dois isolados obtidos a partir de amostras de pólen de S. cfr. bipunctata, e é

Page 57: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

53

filogeneticamente próxima a S. davenpotii, com 16 pares de bases de divergência nos

domínios D1/D2. Starmerella sp. 3 possui três linhagens obtidas a partir de amostras de

mel da abelha T. angustula. Essa espécie é filogeneticamente relacionada a S. lactis-

condensi, e a divergência em relação à sequência da linhagem tipo é de seis pares de

bases. Starmerella sp. 4 possui apenas 1 isolado obtido a partir de amostra de pólen

coletado em colmeia de S. cfr. bipunctata, e é filogeneticamente próxima a S.

bombicola, com divergência de 4 pares de bases em relação à linhagem tipo.

Duas possíveis novas espécies pertencentes ao clado Zygosaccharomyces foram

obtidas a partir de abelhas adultas e substratos associados a Scaptotrigona cfr.

bipunctata. Zygosaccharomyces sp. 1 possui 20 isolados obtidos a partir de mel, pólen e

abelhas adultas. Essa espécie é filogeneticamente próxima a Z. rouxii (Figura 14), e

apresenta 16 pares de bases divergentes em reação à linhagem tipo (CBS:732) na

comparação das sequências dos domínios D1/D2 do gene do RNA ribossomal.

Zygosaccharomyces sp. 2 é filogeneticamente próxima a Z. siamensis e possui 3

isolados obtidos a partir de amostras de abelha adulta e mel maduro. Ensaios de

esporulação foram realizados e foi possível observar a formação de esporos sexuais pela

espécie Zygosaccharomyces sp. 1. (Figura 13). Os esporos observados estão contidos

em uma asca permanente, com 2-4 esporos, que apresentam morfologia esferoidal a

elipsoidal. Ascas em forma de haltere, típicas do gênero Zygosaccharomyces também

foram observadas. A ascosporulação foi observada em meio YM após sete dias de

incubação a 25ºC.

Figura 13: Esporos sexuais de Zygosaccharomyces sp.1. Esporo dentro da asca em forma de

haltere.

Page 58: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

54

Figura 14: Árvore filogenética mostrando o posicionamento da espécie Zygosaccharomyces sp.

1, construída pelo método de ―neighbor-joining‖, baseada em sequências dos domínios D1/D2

do gene do RNAr. Foi utilizado um bootstrap de 1000 interações e a porcentagem é mostrada

próxima aos ramos. A distância evolutiva foi calculada pelo método de ―Kimura 2 parâmetros―.

A barra de escala mostra a proporção de divergência na sequência. Análise realizada no

programa MEGA 7.

Apiotrichum sp.1 foi isolada a partir de abelha adulta e mel imaturo de A.

mellifera e é filogeneticamente próxima a A. posorum, com 27 bases divergentes na

comparação de sequências dos domínios D1/D2. As outras possíveis espécies novas

obtidas possuem apenas um isolado obtido e a designação de possível espécie nova foi

baseada na divergência apresentada na comparação de sequencias do domínio D1/D2 do

gene do RNA ribossomal. Cyrenella sp. foi isolada de adulto de T. angustula e

apresenta 12 pares de bases divergentes em relação a C. elegans. Cystobasidium sp. foi

isolado a partir de adulto de S. cfr. bipunctata, com quatro pares de bases diferentes em

relação a C. benthicum.

Page 59: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

55

Tabela 7: Possíveis novas espécies de leveduras.

Gênero Espécie aproximada/ % identidade/

Acesso GenBank

Substrato de

isolamento Quantidade

Apiotrichum sp. A. porosum (90%) / (MG707703.1) mel imaturo 1

Cyrenella sp. Cy. elegans (97%) / (KJ708454.1) abelha 1

Cystobasidium sp. Cys. benthicum (99%) /

(KY107427.1)

abelha 1

Meyerozyma sp. M. guilliermondii (98%) /

(MG707678.1)

mel maduro 1

Papiliotrema sp. P. rajasthanensis (98%) /

(KY108743.1) abelha 1

Piskurozyma sp. P. taiwanensis (98%) /

(KY107271.1) abelha 1

Starmerella sp. 1 S. cf. etchellsii (98% - 99%) /

(AY257049.1) abelha, pólen, mel

imaturo, mel maduro 13

Starmerella sp. 2 S. davenportii (95% - 96%) /

(EF452219.1) pólen 2

Starmerella sp. 3 S. cf. lactis-condensi (96% - 99%)

/ (AY257059.1) mel imaturo, mel

maduro 2

Starmerella sp. 4 S. bombicola (99%) /

(HQ111045.1) pólen 1

Ustilago sp. 1 U. calamagrostidis (99%) /

(AY740119.1) mel imaturo 1

Ustilago sp. 2 U. sporoboli-indici (99%) /

(MF716450.1) mel maduro 1

Vishniacozyma sp. V. victoriae (92%) /

(MG735809.1)

mel imaturo 1

Zygosaccharomyces sp.1 Z. mellis (97%) / (KY110273.1) abelha, mel imaturo,

mel maduro, pólen 23

Zygosaccharomyces sp.2 Z. siamensis (99%) /

(KY110251.1)

abelha, mel maduro 3

Total 53

Meyerozyma sp. foi isolada de mel maduro de A. melifera e apresenta seis pares

de bases divergentes em relação a M. gulliermondii. Papiliotrema sp. foi obtida a partir

de adulto de A. mellifera e apresenta quatro pares de base divergentes em relação a P.

rajasthanensis. Piskurozyma sp. foi isolada de adulto de S. cfr. bipunctata e apresenta

uma divergência de oito pares de bases em relação a P. taiwanensis. Ustilago sp. 1 foi

isolada de mel imaturo de T. angustula e apresenta 14 pares de bases divergentes em

Page 60: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

56

relação a U. calamagrostidis. Já Ustilago sp. 2 foi obtida a partir de mel maduro de S.

cfr. bipunctata e apresenta 32 pares de bases divergentes em relação a U. sporoboli-

indici. Vishiniacozyma sp. foi isolada de mel imaturo de T. angustula e apresenta 30

pares de bases divergentes em relação à sequência de V. victoriae. Futuramente serão

realizadas novas análises de sequenciamento utilizando os primers ITS1/ITS4 para

confirmação das novas espécies e posterior descrição.

Page 61: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

57

7 CONCLUSÃO

As comunidades de leveduras estudadas apresentaram baixo compartilhamento

de espécies e elevado número de espécies exclusivas o que indica que

possivelmente as abelhas possuem segregação de locais de forrageio, que pode

resultar em uma menor competição por alimentos.

O elevado número de espécies de leveduras do gênero Starmerella, aliado ao

grande compartilhamento de espécies desse gênero entre as espécies de abelhas,

indica forte endemismo de espécies de Starmerella a abelhas e substratos a estas

relacionados.

A similaridade apresentada entre as três comunidades de leveduras estudadas

apresentou baixos valores. Além disso, a curva de acumulação de espécies não

apresentou estabilidade para nenhuma das três comunidades. Esses dados

indicam que um maior esforço amostral é necessário para cobrir a riqueza de

leveduras das comunidades estudadas.

O isolamento de 15 possíveis espécies novas no presente trabalho mostra o

potencial dos substratos estudados para o isolamento de espécies ainda não

descritas, além de evidenciar a importância de estudos de biodiversidade de

leveduras associadas a abelhas.

Page 62: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

58

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AL-WAILI, N. S. Natural Honey Lowers Plasma Glucose, C-Reactive Protein,

Homocysteine, and Blood Lipids in Healthy, Diabetic, and Hyperlipidemic Subjects:

Comparison with Dextrose and Sucrose. Journal of Medicinal Food, v. 7, n. 1, p. 100–

107, 2004. Disponível em: <All Papers/A/Al-waili 2004 - Comparison with Dextrose

and Sucrose.pdf>.

ARRUDA, D. M.; BRANDÃO, D. O.; COSTA, F. V.; TOLENTINO, G. S.; BRASIL,

R. D.; D’ÂNGELO NETO, S.; NUNES, Y. R. F. Structural aspects and floristic

similarity among tropical dry forest fragments with different management histories in

northern Minas Gerais, Brazil. Revista Árvore, v. 35, n. 1, p. 131–142, 2011.

Disponível em: <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-

67622011000100016&lng=en&tlng=en>.

ÁVILA, S.; BEUX, M. R.; RIBANI, R. H.; ZAMBIAZI, R. C. Stingless bee honey:

Quality parameters, bioactive compounds, health-promotion properties and modification

detection strategies. Trends in Food Science and Technology, v. 81, n. August, p. 37–

50, 2018.

BÁRBARA, M. F. S.; MACHADO, C. S.; SODRÉ, G. D. S.; SILVA, F. de L.; DE

CARVALHO, C. A. L. Microbiological and physicochemical characterization of the

pollen stored by stingless bees. Braz. J. Food Technol., v. 21, p. 1–9, 2018.

BARBOSA, R.; PONTES, A.; SANTOS, R. O.; MONTANDON, G. G.; PONZZES-

GOMES, C. M. De; MORAIS, P. B.; GONÇALVES, P.; ROSA, C. A.; SAMPAIO, J.

P. Multiple Rounds of Artificial Selection Promote Microbe Secondary Domestication -

The Case of Cachaça Yeasts. Genome Biol. Evol., v. 10, n. 8, p. 1939–1955, 2018.

BARDOU, P.; MARIETTE, J.; ESCUDIÉ, F.; DJEMIEL, C.; KLOPP, C. Jvenn: an

interactive Venn diagram viewer. BMC Bioinformatics, v. 15, n. 293, 2014.

BARNETT, J. A. A history of research on yeasts 1: Work by chemists and biologists

1789–1850. Yeast, v. 14, n. 16, p. 1439–1451, 1998. Disponível em:

<http://doi.wiley.com/10.1002/%28SICI%291097-

0061%28199812%2914%3A16%3C1439%3A%3AAID-YEA339%3E3.0.CO%3B2-

Z>.

BILUCA, F. C.; BRAGHINI, F.; GONZAGA, L. V.; COSTA, A. C. O.; FETT, R.

Physicochemical profiles, minerals and bioactive compounds of stingless bee honey

(Meliponinae). Journal of Food Composition and Analysis, v. 50, p. 61–69, 2016.

Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1016/j.jfca.2016.05.007>.

BLACKIE, R.; BALDAUF, C.; GAUTIER, D.; GUMBO, D.; KASSA, H.;

PARTHASARATHY, N.; PAUMGARTEN, F.; SOLA, P.; WAEBER, S.;

SUNDERLAND, P.; SUNDERLAND, T. Tropical dry forests The state of global

knowledge and recommendations for future research. Cifor, p. 38, 2014. Disponível

em:

<http://www.cifor.org/publications/pdf_files/WPapers/DPBlackie1401.pdf?_ga=1.5102

5004.45351557.1403802494>.

BORNEMAN, A. R.; PRETORIUS, I. S. Genomic insights into the Saccharomyces

Page 63: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

59

sensu stricto complex. Genetics, v. 199, n. 2, p. 281–291, 2015.

BOYNTON, P. J.; GREIG, D. The ecology and evolution of non-domesticated

Saccharomyces species. Yeast, v. 31, p. 449–462, 2014.

BRYSCH-HERZBERG, M. Ecology of yeasts in plant-bumblebee mutualism in Central

Europe. FEMS Microbiology Ecology, v. 50, n. 2, p. 87–100, 2004.

BUTINAR, L.; SANTOS, S.; SPENCER-MARTINS, I.; OREN, A.; GUNDE-

CIMERMAN, N. Yeast diversity in hypersaline habitats. FEMS Microbiology Letters,

v. 244, n. 2, p. 229–234, 2005. Disponível em: <

https://doi.org/10.1016/j.femsle.2005.01.043>.

CAETANO, S.; PRADO, D.; PENNINGTON, R. T.; BECK, S.; OLIVEIRA-FILHO,

A.; SPICHIGER, R.; NACIRI, Y. The history of Seasonally Dry Tropical Forests in

eastern South America: Inferences from the genetic structure of the tree Astronium

urundeuva (Anacardiaceae). Molecular Ecology, v. 17, n. 13, p. 3147–3159, 2008.

COSTA, A. C. V. da; SOUSA, J. M. B.; DA SILVA, M. A. A. P.; GARRUTI, D. dos

S.; MADRUGA, M. S. Sensory and volatile profiles of monofloral honeys produced by

native stingless bees of the brazilian semiarid region. Food Research International, v.

105, n. August 2017, p. 110–120, 2018. Disponível em:

<https://doi.org/10.1016/j.foodres.2017.10.043>.

DANIEL, H.; ROSA, C. A.; SÃO THIAGO-CALAÇA, P. S.; ANTONINI, Y.;

BASTOS, E. M. A. F.; EVRARD, P.; HURET, S.; FIDALGO-JIMÉNEZ, A.;

LACHANCE, M.-A. Starmerella neotropicalis f. a., sp. nov., a yeast species found in

bees and pollen. International Journal of Systematic and Evolutionary

Microbiology, v. 63, p. 3896–3903, 2013.

DEMERA, J. H.; ANGERT, E. R. Comparison of the antimicrobial activity of honey

produced by Tetragonisca angustula (Meliponinae) and Apis mellifera from different

phytogeographic regions of Costa Rica. Apidologie, v. 35, p. 411–417, 2004.

DOUGLAS, A. E. Multiorganismal Insects: Diversity and Function of Resident

Microorganisms. Annu Rev Entomol., v. 60, p. 17–34, 2015.

ESTEVINHO, L. M.; FEÁS, X.; SEIJAS, J. A.; PILAR VÁZQUEZ-TATO, M. Organic

honey from Trás-Os-Montes region (Portugal): Chemical, palynological,

microbiological and bioactive compounds characterization. Food and Chemical

Toxicology, v. 50, n. 2, p. 258–264, 2012. Disponível em:

<http://dx.doi.org/10.1016/j.fct.2011.10.034>.

FELL, J. W.; BOEKHOUT, T.; FONSECA, A.; SCORZETTI, G.; STATZELL-

TALLMAN, A. Biodiversity and systematics of basidiomycetous yeasts as determined

by large-subunit rDNA D1/D2 domain sequence analysis. International Journal of

Systematic and Evolutionary Microbiology, v. 50, n. 3, p. 1351–1371, 2000.

FERNANDEZ, A.; DIAZ, O. R. Plant diversity patterns in neotropical dry forests and

their conservation implications. Science, v. 353, n. 6306, p. 1383–1387, 2016.

FURMAN, R. M.; AHEARN, DONALD G. Candida ciferrii and Candida

chiropterorum isolated from clinical specimens. Journal of clinical microbiology, v.

18, n. 5, p. 1252-1255, 1983.

Page 64: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

60

GILLESPIE, T. W.; LIPKIN, B.; SULLIVAN, L.; BENOWITZ, D. R.; PAU, S.;

KEPPEL, G. The rarest and least protected forests in biodiversity hotspots. Biodiversity

and Conservation, v. 21, n. 14, p. 3597–3611, 2012.

GILLIAM, M. Microbiology of pollen and bee bread: The yeasts. Apidologie, v. 10, n.

1, p. 43–53, 1979.

GOFFEAU, A.; BARRELL, B. G.; BUSSEY, H.; DAVIS, R. W.; DUJON, B.;

FELDMANN, H.; GALIBERT, F.; HOHEISEL, J. D.; JACQ, C.; JOHNSTON, M.;

LOUIS, E. J.; MEWES, H. W.; MURAKAMI, Y.; PHILIPPSEN, P.; TETTELIN, H.;

OLIVER, S. G. Life with 6000 Genes. Science, v. 274, p. 562–567, 1996.

GONZÁLEZ-TEUBER, M.; HEIL, M. Nectar chemistry is tailored for both attraction

of mutualists and protection from exploiters. Plant Signaling and Behavior, v. 4, n. 9,

p. 809–813, 2009.

GOTELLI, N. J.; CHAO, A.; LEVIN, S. Measuring and estimating species richness,

species diversity, and biotic similarity from sampling data. Encyclopedia of

biodiversity, v. 5, p. 195- 211, 2013.

GROSE, ELIZABETH S.; MARINKELLE, C. J. A new species of Candida from

Colombian bats. Mycopathologia, v. 36, n. 3, p. 225-227, 1968.

HARRISON, S., ROSS, S. J. & LAWTON, J. H. Beta diversity on geographic gradients

in Britain. Journal of Animal Ecology, v. 61, p. 151-158, 1992.

HEIL, M. Nectar: Generation, regulation and ecological functions. Trends in Plant

Science, v. 16, n. 4, p. 191–200, 2011. Disponível em:

<http://dx.doi.org/10.1016/j.tplants.2011.01.003>.

HERRERA, C. M.; DE VEGA, C.; CANTO, A.; POZO, M. I. Yeasts in floral nectar: A

quantitative survey. Annals of Botany, v. 103, n. 9, p. 1415–1423, 2009.

HOEKSTRA, J. M.; BOUCHER, T. M.; RICKETTS, T. H.; ROBERTS, C. Confronting

a biome crisis: Global disparities of habitat loss and protection. Ecology Letters, v. 8,

n. 1, p. 23–29, 2005.

HRNCIR, M.; JARAU, S.; BARTH, F. G. Stingless bees (Meliponini): senses and

behavior. Journal of Comparative Physiology A, v. 202, n. 9–10, p. 597–601, 2016.

KAEWWICHIAN, RUNGLUK et al. Yamadazyma siamensis sp. nov., Yamadazyma

phyllophila sp. nov. and Yamadazyma paraphyllophila sp. nov., three novel yeast

species isolated from phylloplane in Thailand and Taiwan. Antonie van Leeuwenhoek,

v. 103, n. 4, p. 777-788, 2013.

KNOP, M. Evolution of the hemiascomycete yeasts : on life styles and the importance

of inbreeding. BioEssays, v. 28, p. 696–708, 2006.

KUMAR, SUDHIR; STECHER, GLEN; TAMURA, KOICHIRO. MEGA7: molecular

evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular biology and

evolution, v. 33, n. 7, p. 1870-1874, 2016.

KUNTHIPHUN, S., CHOKREANSUKCHAI, P., HONDEE, P. et al. World J

Microbiol Biotechnol, v. 34, n. 125, 2018. <https://doi.org/10.1007/s11274-018-2507-

Page 65: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

61

7>.

KURTZMAN, C. P. Use of gene sequence analyses and genome comparisons for yeast

systematics. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, v.

64, n. PART 2, p. 325–332, 2014.

KURTZMAN, C. P.; FELL, J. W.; BOEKHOUT, T. Definition, classification and

nomenclature of the yeasts. In: KURTZMAN, C. P.; FELL, J. W.; BOEKHOUT, T.

(Ed.). The Yeasts. Fifth ed. [s.l.] Elsevier B.V., 2011a. 1p. 3–5.

KURTZMAN, C. P.; FELL, J. W.; BOEKHOUT, T. Gene sequence analyses and other

dna-based methods for yeast species recognition. In: KURTZMAN, C. P.; FELL, J. W.;

BOEKHOUT, T. (Ed.). The Yeasts. Fifth ed. [s.l.] Elsevier B.V., 2011b. 1p. 137–144.

KURTZMAN, C. P.; FELL, J. W.; BOEKHOUT, T.; ROBERT, V. Methods for

Isolation , Phenotypic Characterization and Maintenance of Yeasts. In: KURTZMAN,

C. P.; FELL, J. W.; BOEKHOUT, T. (Ed.). The Yeasts. Fifth ed. [s.l.] Elsevier B.V.,

2011. p. 87–110.

KURTZMAN, C. P.; ROBNETT, C. J. Identification and phylogeny of ascomycetous

yeasts from analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial sequences.

Antonie van Leeuwenhoek, International Journal of General and Molecular

Microbiology, v. 73, n. 4, p. 331–371, 1998.

LACHANCE, MARC-ANDRÉ et al. Candida cleridarum, Candida tilneyi and Candida

powellii, three new yeast species isolated from insects associated with flowers.

International journal of systematic and evolutionary microbiology, v. 51, n. 3, p.

1201-1207, 2001a.

LACHANCE, MARC-ANDRÉ et al. Biogeography of the yeasts of ephemeral flowers

and their insects. FEMS yeast research, v. 1, n. 1, p. 1-8, 2001b.

LIBKIND, D.; TODD, C.; VALÉRIO, E.; GONÇALVES, C.; DOVER, J.;

JOHNSTON, M. Microbe domestication and the identi fi cation of the wild genetic

stock of lager-brewing yeast. PNAS, v. 108, n. 35, p. 14539–14544, 2011.

LINS, A. C. S.; SILVA, T. M. S.; CÂMARA, C. A.; SILVA, E. M. S.; FREITAS, B. M.

Flavonóides isolados do pólen coletado pela abelha Scaptotrigona bipunctata (canudo).

Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 13, n. 2, p. 40–41, 2003.

LITI, G. The fascinating and secret wild life of the budding yeast S. cerevisiae. eLife, v.

4, p. 1–9, 2015.

LITI, G.; CARTER, D. M.; MOSES, A. M.; WARRINGER, J.; PARTS, L.; JAMES, S.

A.; DAVEY, R. P.; ROBERTS, I. N.; BURT, A.; KOUFOPANOU, V.; TSAI, I. J.;

BERGMAN, C. M.; BENSASSON, D.; KELLY, M. J. T. O.; OUDENAARDEN, A.

Van; BARTON, D. B. H.; BAILES, E.; BA, A. N. N.; JONES, M.; QUAIL, M. A.;

GOODHEAD, I.; SIMS, S.; SMITH, F.; BLOMBERG, A.; DURBIN, R.; LOUIS, E. J.

Population genomics of domestic and wild yeasts. Nature, v. 458, n. 7236, p. 337–341,

2009. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1038/nature07743>.

LUNA-LUCENA, D.; RABICO, F.; SIMOES, Z. L. Reproductive capacity and castes

in eusocial stingless bees (Hymenoptera: Apidae). Current Opinion in Insect Science,

v. 31, p. 20–28, 2019.

Page 66: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

62

MAGURRAN, A. E. Measuring Biological Diversity. Oxford, Blackwell Science Ltd.,

p.256, 2004.

MCLAREN, K. P.; MCDONALD, M. A.; HALL, J. B.; HEALEY, J. R. Predicting

species response to disturbance from size class distributions of adults and saplings in a

Jamaican tropical dry forest. Plant Ecology, v. 181, n. 1, p. 69–84, 2005.

MENEZES, C.; VOLLET-NETO, A.; CONTRERA, F.; VENTURIERI, G. C.;

IMPERATRIZ-FONSECA, V. L. The Role of Useful Microorganisms to Stingless Bees

and Stingless Beekeeping. In: Pot-Honey: A legacy of stingless bees. 1. ed. New York

2013: Springer Science and Business Media, p. 153–171, 2013.

MICHENER, C. D. Comparative Social Behavior of Bees. Annual Review of

Entomology, v. 14, n. 1, p. 299–342, 1969. Disponível em:

<http://www.annualreviews.org/doi/10.1146/annurev.en.14.010169.001503>.

MICHENER, C. D. The bees of the world. 2nd. ed. [s.l.] The Johns Hopkins

University Press, 2007.

MICHENER, C. D. The Meliponini. In: VIT, P.; PEDRO, S. R. M.; ROUBIK, D. Pot-

honey: a legacy of stinglees bees. Springer, New York, p. 3–17, 2013.

MILES, L.; NEWTON, A. C.; DEFRIES, R. S.; RAVILIOUS, C.; MAY, I.; BLYTH,

S.; KAPOS, V.; GORDON, J. E. A global overview of the conservation status of

tropical dry forests. Journal of Biogeography, v. 33, n. 3, p. 491–505, 2006.

MIORIN, P. L.; LEVY, N. C.; CUSTODIO, A. R.; BRETZ, W. A.; MARCUCCI, M. C.

Antibacterial activity of honey and propolis from Apis mellifera and Tetragonisca

angustula against Staphylococcus aureus. Journal of Applied Microbiology, v. 95, n.

5, p. 913–920, 2003.

MURPHY, P. G.; LUGO, A. E. Ecology of Tropical Dry Forest. Annual Review of

Ecology and Systematics, v. 17, n. 1, p. 67–88, 1986. Disponível em:

<http://www.annualreviews.org/doi/10.1146/annurev.es.17.110186.000435>.

MUSTAFA, M. Z.; YAACOB, N. S.; SULAIMAN, S. A. Reinventing the honey

industry: Opportunities of the stingless bee. Malaysian Journal of Medical Sciences,

v. 25, n. 4, p. 1–5, 2018.

NAGATSUKA, YUKA et al. Citeromyces siamensis sp. nov., a novel halotolerant yeast

isolated in Thailand. International journal of systematic and evolutionary

microbiology, v. 52, n. 6, p. 2315-2319, 2002.

NORDIN, A.; OMAR, N.; SAINIK, N. Q. A. V.; CHOWDHURY, S. R.; OMAR, E.;

BIN SAIM, A.; BT HJ IDRUS, R. Low dose stingless bee honey increases viability of

human dermal fibroblasts that could potentially promote wound healing. Wound

Medicine, v. 23, p. 22–27, 2018.

NOTARO, K. A.; DE MEDEIROS, E. V.; DUDA, G. P.; MOREIRA, K. A.; DE

BARROS, J. A.; DOS SANTOS, U. J.; LIMA, J. R. S.; MORAES, W. S. Enzymatic

activity, microbial biomass, and organic carbon of entisols from brazilian tropical dry

forest and annual and perennial crops. Chilean Journal of Agricultural Research, v.

78, n. 1, p. 68–77, 2018.

Page 67: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

63

OLIVEIRA-FILHO, A. T. de. Definição e delimitação de domínios e subdomínios das

paisagens naturais do estado de Minas Gerais. In: SCOLFORO, J. R.; CARVALHO, L.

M. T. (Ed.). Mapeamento e Inventário da Flora e dos Reflorestamentos de Minas

Gerais. Lavras: UFLA, 2006. p. 21–35.

OTHMAN, N. H. Honey and cancer: Sustainable inverse relationship particularly for

developing nations-a review. Evidence-based Complementary and Alternative

Medicine, v. 2012, p. 1–10, 2012.

OTHMAN, Z.; ZAKARIA, R.; HUSSAIN, N.; HASSAN, A.; SHAFIN, N.; AL-

PALUDO, C. R.; MENEZES, C.; SILVA-JUNIOR, E. A.; VOLLET-NETO, A.;

ANDRADE-DOMINGUEZ, A.; PISHCHANY, G.; KHADEMPOUR, L.; FABIO, S.;

CURRIE, C. R.; KOLTER, R.; CLARDY, J.; PUPO, M. T. Stingless Bee Larvae

Require Fungal Steroid to Pupate. Scientific Reports, v. 8, n. 1122, p. 1–10, 2018.

PATRICIA, V.; OLIVERIO, V.; TRINY, L.; FAVIÁN, M. Meliponini biodiversity and

medicinal uses of pot-honey from El Oro province in Ecuador. Emirates Journal of

Food and Agriculture, v. 27, n. 6, p. 502–506, 2015.

PEDRO, S. R. D. M. The stingless bee fauna in Brazil (Hymenoptera: Apidae).

Sociobiology, v. 61, n. 4, p. 348–354, 2014.

PORTILLO-QUINTERO, C. A.; SÁNCHEZ-AZOFEIFA, G. A. Extent and

conservation of tropical dry forests in the Americas. Biological Conservation, v. 143,

n. 1, p. 144–155, 2010. Disponível em:

<http://dx.doi.org/10.1016/j.biocon.2009.09.020>.

POZO, M. I.; HERRERA, C. M.; BAZAGA, P. Species richness of yeast communities

in floral nectar of southern Spanish plants. Microb Ecol, v.61, p. 82-91, 2011.

PRETORIUS, S. I. Tailoring wine yeast for the new millennium: novel approaches to

the ancient art of winemaking. Yeast, v. 16, n. 8, p. 675–729, 2000. Disponível em:

<http://dx.doi.org/10.1002/1097-0061(20000615)16:8%3C675::AID-

YEA585%3E3.0.CO;2-B>.

PRIETO-TORRES, D. A.; NAVARRO-SIGÜENZA, A. G.; SANTIAGO-ALARCON,

D.; ROJAS-SOTO, O. R. Response of the endangered tropical dry forests to climate

change and the role of Mexican Protected Areas for their conservation. Global Change

Biology, v. 22, n. 1, p. 364–379, 2016.

QUEZADA-EUÁN, J.; NATES-PARRA, G.; MAUÉS, M. M.; IMPERATRIZ-

FONSECA, V. L.; ROUBIK, D. Economic and cultural value of stingless bees

(Hymenoptera: Meliponini) among ethnic groups of tropical Ameica. Sociobiology, v.

65, n. 4, p. 534–557, 2018.

QUINTAL, R. B.; ROUBIK, D. W. Melipona bees in the scientific world: western

cultural views. In: VIT, P.; PEDRO, S. R. M.; ROUBIK, D. Pot-honey: a legacy of

stinglees bees. Springer, New York, p. 247–259, 2013.

RAHBI, B.; AHMAD, A. Potential Role of Honey in Learning and Memory. Medical

Sciences, v. 3, n. 2, p. 3–15, 2015. Disponível em: <http://www.mdpi.com/2076-

3271/3/2/3/>.

Page 68: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

64

RAMALHO, M. Foraging by stingless bees of the genus, scaptotrigona (Apidae,

meliponinae). Journal of Apicultural Research, v. 29, n. 2, p. 61–61, 1990.

RAO, P. V.; KRISHNAN, K. T.; SALLEH, N.; GAN, S. H. Biological and therapeutic

effects of honey produced by honey bees and stingless bees: A comparative review.

Brazilian Journal of Pharmacognosy, v. 26, n. 5, p. 657–664, 2016. Disponível em:

<http://dx.doi.org/10.1016/j.bjp.2016.01.012>.

RASPOR, P. et al. Yeasts isolated from three varieties of grapes cultivated in different

locations of the Dolenjska vine-growing region, Slovenia. International Journal of

Food Microbiology. v. 109, n. 1-2, p. 97-102, 2006.

RODRIGUES, P. M. S.; SILVA, J. O.; EISENLOHR, P. V; SCHAEFER, C. Climate

change effects on the geographic distribution of specialist tree species of the Brazilian

tropical dry forests. Brazilian Journal of Biology, v. 75, n. 3, p. 679–684, 2015.

Disponível em: <https://www.scopus.com/inward/record.uri?eid=2-s2.0-

84943559136&partnerID=40&md5=a8470f31eb6238f60637dcb36210c5b2>.

ROSA, C. A.; LACHANCE, M. A.; SILVA, J. O. C.; TEIXEIRA, A. C. P.; MARINI,

M. M.; ANTONINI, Y.; MARTINS, R. P. Yeast communities associated with stingless

bees. FEMS Yeast Research, v. 4, n. 3, p. 271–275, 2003.

ROUBIK, D. W. Stingless bee nesting biology. Apidologie, v. 37, n. 2, p. 124–143,

2006.

RÓZAŃSKA, H.; OSEK, J. Effect of storage on microbiological quality of honey.

Bulletin of the Veterinary Institute in Pulawy, v. 56, n. 2, p. 161–163, 2012.

SAKAGAMI, SHÔICHI F.; ZUCCHI, R. Behavior studies of the stingless bees , with

special reference to the oviposition process: VI. Trigona (Tetragona) clavipes. Journal

of the Faculty of Science Hokkaido University, v. 16, n. 2, p. 292–313, 1967.

SAKSINCHAI, S.; SUZUKI, M.; CHANTAWANNAKUL, P.; OHKUMA, M.;

LUMYONG, S. A novel ascosporogenous yeast species, Zygosaccharomyces

siamensis, and the sugar tolerant yeasts associated with raw honey collected in

Thailand. Fungal Diversity, v. 52, p. 123–139, 2012.

SALVADÓ, Z.; ARROYO-LÓPEZ, F. N.; GUILLAMO, J. M.; SALAZAR, G.;

QUEROL, A.; BARRIO, E. Temperature Adaptation Markedly Determines Evolution

within the Genus Saccharomyces. Applied and Environmental Microbiology, v. 77,

n. 7, p. 2292–2302, 2011.

SAMPAIO, J. P.; GONÇALVES, P. Natural Populations of Saccharomyces

kudriavzevii in Portugal Are Associated with Oak Bark and Are Sympatric with S .

cerevisiae and S. paradoxus. Applied and Environmental Microbiology, v. 74, n. 7, p.

2144–2152, 2008.

SEIJO, M. C.; ESCUREDO, O.; FERNÁNDEZ-GONZÁLEZ, M. Fungal diversity in

honeys from northwest Spain and their relationship to the ecological origin of the

product. Grana, v. 50, n. 1, p. 55–62, 2011.

SICARD, D.; LEGRAS, J. L. Bread, beer and wine: Yeast domestication in the

Saccharomyces sensu stricto complex. Comptes Rendus - Biologies, v. 334, n. 3, p.

229–236, 2011. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1016/j.crvi.2010.12.016>.

Page 69: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

65

SLAA, E. J.; SÁNCHEZ CHAVES, L. A.; MALAGODI-BRAGA, K. S.; HOFSTEDE,

F. E. Stingless bees in applied pollination : practice and perspectives To cite this

version : Review article Stingless bees in applied pollination : practice and perspectives

OF POLLINATION IN COMMERCIALLY GROWN. Apidologie, v. 37, p. 293–315,

2006.

STARMER, WILLIAM T; LACHANCE, M.-A. Yeast Ecology. In: KURTZMAN, C.

P.; FELL, J. W.; BOEKHOUT, T. (Ed.). The Yeasts. Fifth ed. [s.l.] Elsevier B.V.,

2011. p. 65–83.

STEFANINI, I. Yeast ‐ insect associations : It takes guts. Yeast, v. 35, p. 315–330,

2018.

STRATFORD, M., BOND, C. J., JAMES, S. A., ROBERTS, I. N. & STEELS, H.

Candida davenportii sp. nov., a potential soft-drinks spoilage yeast isolated from a

wasp. Int J Syst Evol Microbiol, v. 52, p. 1369–1375, 2002.

TEIXEIRA, A. C. P.; MARINI, M. M.; NICOLI, J. R.; ANTONINI, Y.; MARTINS, R.

P.; ROSA, C. A.; ROSA, C. A. Starmerella meliponinorum sp . nov ., a novel

ascomycetous yeast species associated with stingless bees. International Journal of

Systematic and Evolutionary Microbiology, v. 53, p. 339–343, 2003.

TIEN, CHIH-JEN; CHANG, CHING-WEN; WANG, PI-HAN. Rhodotorula

calyptogenae, a new record yeast for Taiwan. Fungal Science, v. 23, p. 55-56, 2008.

TORRES, A. R.; SANDJO, L. P.; FRIEDEMANN, M. T.; TOMAZZOLI, M. M.;

MARASCHIN, M.; MELLO, C. F. Chemical characterization, antioxidant and

antimicrobial activity of propolis obtained from Melipona quadrifasciata quadrifasciata

and Tetragonisca angustula stingless bees. Brazilian Journal of Medical and

Biological Research, v. 51, n. 6, p. 1–10, 2018.

VALENTE, PATRICIA et al. Bandoniozyma gen. nov., a genus of fermentative and

non-fermentative tremellaceous yeast species. PLoS One, v. 7, n. 10, p. e46060, 2012.

VALENTIN, J. L. Agrupamento e Ordenação. in: Peres-Neto, P.R., Valentin, J.L.,

Fernandez, F.A.S. (Eds.). O ecologia brasiliensis, v. 2, p. 27-55, 1995.

VAUGHAN-MARTINI, A.; MARTINI, A. Saccharomyces Meyen ex Reess ( 1870 ).

In: KURTZMAN, C. P.; FELL, J. W.; BOEKHOUT, T. The Yeasts. Fifth ed. [s.l.]

Elsevier B.V., p. 733–746, 2011 a.

VAUGHAN-MARTINI, A.; MARTINI, A. Schizosaccharomyces Lindner (1893). In:

KURTZMAN, C. P.; FELL, J. W.; BOEKHOUT, T. The Yeasts. Fifth ed. [s.l.]

Elsevier B.V., p. 779-784, 2011 b.

VENTURIERI, G. C.; OLIVEIRA, P. S.; VASCONCELOS, M. A. .; MATTIETTO, R.

A. Caracterização, colheita, conservação e embalagem de méis de abelhas

indígenas sem ferrão. Belém, Brasil: EMBRAPA, 2007.

WHILE, T. J.; BRUNS, T. D.; LEE, S. B.; TAYLOR, J. W. Amplification and direct

sequencing of fungal ribosomal RNA Genes for phylogenetics. In: PCR Protocols: A

Guide to Methods and Applications. [s.l.] Academic Press, 1990. p. 315–322.

WHITTAKER, R.H. Evolution and measurement of species diversity. Taxon, v. 21, p.

Page 70: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS …...biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras,

66

213-251, 1972.

WILLE, A. Biology of the Stingless Bees. Annual Review of Entomology, v. 28, n. 1,

p. 41–64, 1983. Disponível em:

<http://www.annualreviews.org/doi/10.1146/annurev.en.28.010183.000353>.

YUN, J. H.; JUNG, M. J.; KIM, P. S.; BAE, J. W. Social status shapes the bacterial and

fungal gut communities of the honey bee. Scientific Reports, v. 8, n. 1, p. 1–11, 2018.


Top Related