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Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.
/
Buzelle, Samyra Lopes
Metabolismo de ácidos graxos e glicerol no tecido adiposo branco de camundongos com resistência à insulina induzida pela hiperlipídica. Ribeirão Preto, 2016.
125 p. il. ; 30 cm
Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP. Área de concentração: Bioquímica.
Orientador: Kettelhut, Isis do Carmo.
1. Tecido adiposo. 2. Ácido graxo. 3. Glicerol-3-fosfato. 4. Dieta hiperlipídica. 5. Metabolismo lipídico.
“Treine a si mesmo a deixar partir
tudo que teme perder” Mestre Yoda
Dedico aos meus pais Edineia e José Buzelle que iluminaram
meus caminhos com afeto e dedicação, que se doaram e
renunciaram aos seus sonhos muitas vezes para que os
filhos pudessem se realizar e que esperaram e compreenderam
as longas ausências. Quando procuro uma forma verbal de
exprimir minha gratidão, não encontro nada à altura. Mas
quero dizer que os amo e que sou grata a Deus por ter
nascido de vocês.
Ao meu irmão Junior José, que é um exemplo de fé, carinho e
perseverança. “Eis que quão bom e quão suave é que os
irmãos vivam em união!” Te amo meu irmão.
Para Anna Carolina H. Billek, “É melhor ter companhia do
que estar sozinho, porque maior é a recompensa do trabalho
de duas pessoas. Se um cair, o amigo pode ajudá-lo a
levantar-se. Mas pobre do homem que cai e não tem quem o
ajude a levantar-se!”. Sem você talvez eu tivesse conseguido,
mas com você o caminho foi muito mais alegre e ameno.
AGRADECIMENTOS
“O que Deus faz por nós, esta além do que podemos ver”. Agradeço a ELE
por toda a sua proteção e por colocar em minha vida seus filhos e meus
irmãos que me auxiliaram nesse caminho.
Profa. Dra. Isis do Carmo Kettelhut, que é um exemplo de força e
bondade. Eu agradeço não só pela impecável orientação, mas também por
sempre ouvir, compreender e aconselhar. O respeito que tem pelas
dificuldades e individualidades de seus alunos é admirável e algo que
levarei para sempre comigo. Obrigada pelo exemplo de amor ao ensino e
à pesquisa.
Profa. Dra. Valéria Ernestânia Chaves, agradeço pela amizade, pelas
valiosas orientações e por ser uma ótima companheira de viagem. Não é
de hoje que você me ajuda e acompanha e eu sou muito grata por ter seu
auxílio em todos os momentos.
Profa. Dra. Maria Emília Soares Martins, agradeço por ter me
presenteado com o modelo experimental utilizado nesse trabalho, você
foi a luz em um momento de indecisão.
Prof. Dr. Luiz Carlos de Carvalho Navegantes, por sua orientação e
pelos conselhos sempre valiosos. Obrigada por nos receber em San
Diego.
Prof. Dr. David Wright, por me receber em seu laboratório com tanto
carinho, respeito e entusiasmo. Obrigada pelo excelente projeto de
pesquisa e pela publicação do trabalho. Rebecca MacPherson, Laelie
Snook, Scott Frendo-Cumbo, Laura Castellani, Willem Pepper e Zachary
Anderson, agradeço por me acolherem e me fazerem tão bem quando eu
estava tão longe de casa.
Prof. Dra. Nair Honda Kawashita, meu eterno amor e admiração por ser
sempre tão solícita e por todo o carinho que sempre demonstrou por
mim. Agradeço por fazer parte da banca, por todos os anticorpos
emprestados, por todos os artigos em colaboração, e por sempre me dar
conselhos tão valiosos para a vida e para a ciência.
Aos membros da banca, Profa. Dra. Thais Martins de Lima, Profa. Dra.
Maria Cristina Foss e Profa. Dra. Lucila Leico Kagohara Elias pela
disponibilidade na correção do manuscrito e por aceitarem fazer parte
da banca.
Prof. Dr. Heraldo Possolo de Souza, (FM-USP) por permitir a realização
de experimentos em seu laboratório, e pelo excelente auxílio técnico
da Dra. Denise Frediani e Dr. Hermes Vieira Barbeiro.
Vani Maria Alves, pelo auxílio nos experimentos de histologia deste
trabalho. Agradeço pela ajuda com sua vasta experiência e dedicação na
realização das análises. Profa. Dra. Maria Célia Jamur e Profa. Dra.
Constance Oliver por disponibilizar o laboratório para a aquisição das
imagens histológicas e Anderson Roberto de Souza pelo apoio técnico.
Prof. Dr. José Antunes Rodrigues por permitir a realização de dosagens
hormonais em seu laboratório, e Dr. André Mecawi pelo auxílio nas
dosagens, e também por ter sido sempre um bom amigo e conselheiro, por
me ouvir, me ajudar e me proporcionar muitos momentos felizes.
Maria Antonieta Rissato Garófalo obrigada por estar comigo em todos os
experimentos, por sempre tornar tudo mais fácil e prático, por todos
os cálculos complicados que você sempre fez parecer fácil. Obrigada
por sempre se preocupar comigo e por cuidar de mim, por seu apoio
maternal e por todos os conselhos e conversas tão enriquecedoras.
Neusa Maria Zanon obrigada pela convivência sempre agradável, por
sempre ajudar em tudo que precisei e pelos momentos alegres dentro e
fora do laboratório. Elza Maria Filippin agradeço por sua presença
essencial em todos o experimentos, pela manipulação das dietas e por
estar sempre disposta a me ajudar. Lilian Zorzenon que com sua calma e
serenidade sempre auxiliou em tudo tornando-se essencial para todos
nós. Victor Galban pela disponibilidade em resolver nossos problemas
técnicos de maneira sempre gentil.
Aos funcionários do Departamento de Bioquímica, Maria Ivone Campos
Fonseca pela extrema competência e profissionalismo em resolver os
problemas da pós-graduação, por todo o auxílio e prontidão com os
processos do sanduíche e da tese, sem você tudo seria tão difícil...
Ronaldo Sordi Campanini por toda a ajuda e por sempre me receber com
alegria. Ao Marrom, que durante todo o tempo que esteve a frente do
nosso biotério sempre foi um exemplo de cordialidade e organização. Ao
Paulinho (in memorian) por sempre ajudar com os animais no biotério.
Aos amigos do LCM, “a amizade desenvolve a felicidade e reduz o
sofrimento, duplicando a alegria e dividindo a nossa dor”.
Aos amigos que seguiram: Priscila Cassola, tenho que te agradecer por
me levar para academia, eu perseverei (rs), pelos almoços no bandeijão
e por ser companheira em nunca deixar comida no prato! “Você é 10”.
Graziella Nascimento, muito obrigada pela ajuda em todos os
experimentos, essa tese não sairia sem você e por todas as conversas.
Nosso time de lipolíticos era pequeno, mas trabalhador! Flavia
Aparecida Graça, sua positividade e sua risada inconfundível sempre
fizeram o laboratório mais feliz. Leandro Manfredi, apesar de ser
“curintia” sempre te admirei por seu dom com a dialética, obrigada
pelos “temáticos”. Danilo Lustrino agradeço por ter sido um bom amigo,
por me apoiar em momentos de dificuldade e por ser sempre generoso.
Silvia de Paula Gomes, eu tenho uma divida de gratidão eterna com
você, que me acolheu antes mesmo de eu ser aluna do laboratório, e
também depois quando eu ainda não tinha onde morar. Agradeço-te também
pelo conselho que foi decisivo para que eu viesse para o LCM, e por
sempre estar lá quando eu precisei, você é uma pessoa rara nesse
mundo.
Franciele Przygodda, tenho tanto a te agradecer... Você foi uma grande
amiga e companheira! Meus experimentos com você não eram só muitos
mais rápidos e organizados, mas também muito mais alegres e
engraçados. Você foi a melhor companheira de viagem, de bandeijão e de
longos desabafos. Frannnnnnn obrigada por sempre me apoiar, ajudar e
compreender.
Juliano Machado, a pessoa mais esforçada que conheci nesse
laboratório, o mestre das vias de sinalização, meu companheiro de
Marcão, meu amigo tão especial. Obrigada por sempre estar lá e por me
dizer o que eu precisava ouvir, por todos os abraços e risadas. Isso
“sugere fortemente” que você é incrível.
Wilian Silveira, não adianta fazer essa pose de malvado-pessimista,
você tem um coração enorme e não sabe falar não. Muito obrigada por
todas as caronas, pizzas, subways, mas principalmente pelos temáticos.
Você é um ótimo vizinho mesmo batendo na janela.
Natalia Lauterbach, a sua sinceridade e personalidade são um exemplo a
ser seguido. Você não é tão brava quanto parece viu? Apesar de
discordarmos se é biscoito ou bolacha, sempre serei agradecida por ter
sua amizade, pelos vídeos engraçados, e pelas nossas músicas cultas e
profundas.
Rafael Rossi Valentin, te agradeço um monte por todos os nossos
“embates” científicos extremamente enriquecedores, você tem uma
inteligência admirável e um senso de humor espetacular! Obrigada por
toda a ajuda com essa tese, pelas piadas horríveis que sempre me
fizeram rir muito, e é claro pelas cervejas espetaculares.
Dawit Gonçalves, papi você é o cara. Agradeço muito por sempre ajudar
e por nunca julgar minhas dúvidas. Sua vontade de inovar e todo o seu
conhecimento são admiráveis, você para mim é um exemplo de cientista e
de professor.
Aos meus colegas de pós-graduação Bruno Gonzaga Teodoro, Eriston
Vieira Gomes, Wellington Ramos Pedersoli, Madla Adami Passos, Gabriela
Solano, Lilian dos Santos Castro pelos momentos de alegria e de
aprendizado nessa jornada.
Wermerson Assunção, meu filhote, agradeço pela ajuda na conexão com a
FM-USP, pela hospedagem garantida na sua casa, por todas as alegrias
que você sempre me deu, mas principalmente por ser esse amigo tão
querido.
A minha irmã Janaina de Olveira Inoui e meus sobrinhos João Guilherme,
Beatriz, Iago e Nana por fazerem minha vida mais feliz e cheia de
amor.
Ao apoio financeiro da CAPES nas bolsas de doutorado e doutorado-
sanduíche, CNPq e FAPESP nos projetos do laboratório.
A todos aqueles que direta ou indiretamente me ajudaram nessa jornada,
meu muito obrigada.
RESUMO
“METABOLISMO DE ÁCIDOS GRAXOS E GLICEROL NO TECIDO
ADIPOSO BRANCO DE CAMUNDONGOS COM RESISTÊNCIA À INSULINA
INDUZIDA PELA DIETA HIPERLIPÍDICA”
Camundongos Swiss, quando submetidos à dieta hiperlipídica (HL), apresentam
considerável ganho ponderal e de depósitos adiposos, tornando-se obesos e resistentes à
insulina. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da dieta HL por 8 semanas no
perfil inflamatório, síntese de triacilglicerol (TAG) com ênfase na vias de geração de
glicerol-3-fosfato (G3P) e lipólise nos tecidos adiposos brancos (TAB) retroperitoneal
(RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. Camundongos Swiss foram alimentados
com as dietas: controle (CT) - dieta purificada (AIN-93G); ou HL - dieta AIN-93G
modificada contendo 35% de lipídeos (4% de óleo de soja e 31% de gordura suína). Os
camundongos alimentados com a dieta HL apresentaram uma maior massa corporal,
acompanhada pelo aumento nos tecidos RETRO e EPI, além de desenvolverem
resistência à insulina constatada no teste de tolerância à glicose (TTG), hiperglicemia e
hiperinsulinemia. O conteúdo protéico da pAKT, avaliado por western blot (WB), e a
adiponectina, dosada em homogenados dos tecidos adiposos, estão reduzidos apenas no
EPI. Houve aumento na expressão gênica de MCP-1 e PAI-1, e foi observada menor
área dos adipócitos no EPI, sem alteração no RETRO dos animais HL. A síntese de
novo de ácidos graxos (AG), avaliada pela incorporação de 3H de 3H2O em AG foi
maior em ambos os TAB, porém a captação de AG das lipoproteínas circulantes
avaliada pela atividade e expressão da lipase lipoproteica (LPL) aumentou no EPI e
reduziu no RETRO. A dieta HL induziu aumento na fosforilação do glicerol, avaliada
pela atividade e conteúdo da GK que aumentaram nos dois TAB, e maior incorporação
de 1-14C-glicerol em TAG no EPI. A captação de glicose in vitro e conteúdo do GLUT-
4, que indicam atividade da via glicolítica foram reduzidos no EPI e RETRO, assim
como a gliceroneogênese avaliada pela incorporação de 1-14C-piruvato em TAG, sem
alterações na atividade e conteúdo da fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK). A
atividade lipolítica basal foi avaliada in vitro pela liberação de glicerol por adipócitos
isolados, e não foi alterada pela ingestão de dieta HL, porém quando estimulada por
noradrenalina a liberação de glicerol foi menor nos animais HL, assim como as
fosforilações da ATGL e HSL e conteúdo do receptor adrenérgico β3. A dieta HL levou
a uma redução no conteúdo de PPARγ e aumento de ATF3 em ambos os tecidos. No
EPI houve aumento de pCREB, pSTAT3 e RGS2 em relação aos controles enquanto no
RETRO a única diferença encontrada foi a menor pSTAT3. Nossos resultados
demonstram que o aumento nos TAB é resultado de maior síntese e captação de AG, e
que o G3P necessário para a esterificação a TAG é proveniente principalmente da
fosforilação direta do glicerol pela GK; além disso, a reduzida lipólise também parece
contribuir para esse quadro. Nos animais HL, o EPI parece ser mais propenso aos
efeitos da dieta do que o RETRO.
ABSTRACT
“FATTY ACID AND GLYCEROL METABOLISM IN WHITE ADIPOSE
TISSUE OF MICE WITH INSULIN RESISTANCE INDUCED BY HIGH FAT
DIET”
Swiss mice when subjected to high fat diet (HFD), shown considerable weight gain and
adipose depots, becoming obese and insulin resistant. The aim of this study was to
evaluate the effect of HFD diet for 8 weeks in the inflammatory profile, triacylglycerol
(TAG) synthesis with emphasis in glycerol-3-phosphate (G3P) generation pathways and
lipolysis in retroperitoneal (RETRO) and epididymal (EPI) white adipose tissue (WAT)
of mice. Swiss mice were fed with diets: control (CT) - purified diet (AIN-93G); or
HFD - purified diet (AIN-93G) plus 35% of fat (4% soybean oil and 31% of lard). Mice
fed a HFD diet had a higher body mass, accompanied by an increase in RETRO and EPI
tissues, in addition to developing insulin resistance, evidenced by glucose tolerance test
(GTT), hyperglycemia and hyperinsulinemia. The protein content of pAKT, accessed by
western blot, and adiponectin, measured in WAT homogenates, are reduced only in EPI.
There was an increase in gene expression of MCP-1 and PAI-1, and was observed
smaller area of adipocytes in EPI, with no change in RETRO of HFD fed animals. De
novo synthesis of fatty acids (FA), evaluated by incorporation of 3H from 3H2O in FA
was higher in both TAB, but the uptake of FA, from blood lipoproteins, evaluated by
the activity and expression of lipoprotein lipase (LPL) was increased in EPI and reduced
in RETRO. HFD induced increase in phosphorylation of glycerol, evaluated by the
activity and content of glycerolkinase (GyK) which increased in both TAB and greater
incorporation of 1-14C-glycerol in the TAG only in EPI. The in vitro glucose uptake and
GLUT-4 content, which indicates the activity of the glycolytic pathway were reduced in
EPI and RETRO, as well as glyceroneogenesis assessed by the incorporation of 1-14C-
pyruvate into TAG without changes in the activity and contents of phosphoenolpyruvate
carboxykinase (PEPCK). The basal lipolytic activity was evaluated in vitro by glycerol
releasing from isolated adipocytes, and was not altered by HFD intake, but when
stimulated by noradrenaline glycerol release was lower in HFD animals as well as the
phosphorylation of ATGL and HSL and β3 adrenergic receptor content. HFD led to a
reduction in the content of PPAR gamma and an increase in ATF3 in both tissues. In
EPI there was an increase in pCREB, pSTAT3 and RGS2 while in RETRO the only
difference was reduced pSTAT3. Our results shown that TAB increase is result of
increased FA synthesis and uptake, and G3P required for esterification TAG comes
mainly from direct phosphorylation of glycerol by GyK; Furthermore, reduced lipolysis
also seems to contribute to this scenario. HFD effects seem to be more prominent in EPI
than in RETRO.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACC – Acetil-CoA Carboxilase
AG – Ácidos Graxos
AGL – Ácido Graxo Livre
AGS – Ácido Graxo Sintase
Akt/PKB –Ak thymoma/Proteína Quinase B
Aqp – Aquagliceroporina
ATF3 - Activating Transcription Factor 3
ATGL – Lipase dos Triacilgliceróis dos Adipócitos
ATP – Adenosina Trifosfato
cAMP - Adenosina 3’,5’monofosfato cíclico
CBP – CREB binding protein
CGI-58 - Comparative Gene Identification 58
ChREBP – Carbohydrate Responsive Element Binding Protein
CONCEA - Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal
CREB - cAMP-responsive Element Binding Protein
CREM - cAMP-responsive Element Modulator
CRTC - cAMP-regulated Transcriptional Co-activators
CT – Dieta Controle
DAG – Diacilglicerol
DM2 – Diabetes Melitus tipo 2
EPI – Tecido Adiposo Branco Epididimal
G3P – Glicerol-3-fosfato
G6PD – Glicose-6-fosfato Desidrogenase
GK – Gliceroquinase
GPCR – Receptor acoplado à proteína G
GPD2 – Gliceraldeído-3-fosfato Desidrogenase
HCHL – Dieta Hiperglicídica e Hiperlipídica
HL – Dieta Hiperlipídica
HP – Dieta Hiperproteica livre de Carboidratos
IFNγ – Interferon γ
IL-6 – Interleucina 6
IR – Receptor de Insulina
IRE - Insulin Response Element
IRS - Insulin Receptor Substrate
JAK – Janus Kinase
LHS – Lipase Hormônio Sensível
LPHC – Dieta Hipoproteica Hiperglicídica
LPL – Lipase Lipoprotéica
MAG – Monoacilglicerol
MCP-1- Monocyte Chemoattractant Protein-1
NADPH - Nicotinamida Adenina Dinucleotideo Fosfato
PAI-1 - Plasminogen Activator Inhibitor-1
PDE – Fosfodiesterase
PDK - Proteína Quinase Dependente de Fosfatidilinositol
PDK4 – Piruvato Desidrogenase Quinase 4
PEPCK – Fosfoenolpiruvato Carboxiquinase
PI3K - Fosfatidilinositol 3-quinase
PKA - Proteína Quinase Dependente de cAMP
PPARγ - Peroxisome Proliferator-activated Receptor γ
PPRE - PPAR response element
RETRO – Tecido Adiposo Branco Retroperitoneal
RGS2 - Regulator of G Protein Signaling 2
RIP140 - Receptor-Interacting Protein 140
RPL32 - Ribosomal protein L32
SNS – Sistema Nervoso Simpático
SREBP – Sterol Regulatory Element Binding Protein
STAT - Signal Transducers and Activators of Transcription
TAB – Tecido Adiposo Branco
TAG – Triacilglicerol
TAM – Tecido Adiposo Marrom
Th – Linfocito T-helper
TNFR – Receptor de TNF-α
TNF-α - Tumor Necrosis Factor α
TTG – Teste de Tolerância à Glicose
TZD – Tiazolinedinediona
Sumário 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 1
1.2 Metabolismo do tecido adiposo branco .................................................................. 2
1.3 Obesidade induzida por dieta hiperlipídica .......................................................... 10
2. OBJETIVOS ............................................................................................................... 17
2.1 Objetivos gerais .................................................................................................... 17
2.2 Objetivos específicos ............................................................................................ 17
3. MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................... 19
3.1 Animais e tratamento ............................................................................................ 19
3.2 Determinação dos níveis séricos de insulina, corticosterona, leptina, adiponectina, triacilglicerol, colesterol, ácidos graxos e glicose ...................................................... 21
3.3 Análise histológica ............................................................................................... 21
3.4 Teste de Tolerância à Glicose (TTG) ................................................................... 22
3.5 Determinação do conteúdo de citocinas no tecido adiposo branco ...................... 22
3.6 Isolamento de adipócitos ...................................................................................... 23
3.7 Síntese in vivo de ácidos graxos de novo .............................................................. 23
3.8 Síntese in vitro de ácidos graxos de novo ............................................................. 25
3.9 Atividade da enzima Lipase Lipoprotéica (LPL) ................................................. 26
3.10 Captação de Glicose in vitro ............................................................................... 28
3.11 Incorporação de 1-14C-piruvato e 1-14C-glicerol em lipídios totais ................... 28
3.12 Extração dos lipídios totais ................................................................................. 29
3.13 Atividade da Fosfoenolpiruvato Carboxiquinase (PEPCK) ............................... 29
3.14 Atividade da Gliceroquinase (GK) ..................................................................... 31
3.15 Lipólise in vitro .................................................................................................. 32
3.16 Western Blot ....................................................................................................... 32
3.17 Real Time (RTqPCR) ......................................................................................... 34
3.18 Análise estatística ............................................................................................... 36
4. RESULTADOS .......................................................................................................... 37
4.1 Caracterização metabólica do modelo experimental ............................................ 37
4.1.1 Massa corporal ............................................................................................... 37
4.1.2 Parâmetros séricos ......................................................................................... 39
4.1.3 Massa do tecido adiposo ................................................................................ 41
4.1.4 Análise histológica do tecido adiposo ........................................................... 42
4.1.5 Avaliação da resistência insulínica ................................................................ 44
4.1.6 Perfil inflamatório ......................................................................................... 47
4.2. Síntese de triacilglicerol: origem dos ácidos graxos e geração do glicerol-3-fosfato ......................................................................................................................... 50
4.2.1 Fontes de ácidos graxos ................................................................................. 50
4.2.2. Vias de síntese de glicerol-3-fosfato ............................................................ 56
4.3. Degradação do TAG: Lipólise ............................................................................. 65
4.4. Vias de sinalização .............................................................................................. 69
5. DISCUSSÃO .............................................................................................................. 72
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 92
1
______________________________________________________________________ Introdução
1. INTRODUÇÃO
A obesidade é reconhecida hoje como um dos mais importantes problemas de
saúde pública no mundo, afetando pessoas de todas as idades. A Organização Mundial
da Saúde estimou que em 2014 cerca de 1,9 bilhões de adultos estavam com sobrepeso,
e destes, 600 milhões eram obesos, correspondendo a 39% da população mundial com
sobrepeso e 13% de obesos (WHO, 2015). Considerada uma epidemia global, a
obesidade está associada ao aumento no risco de incidência de várias doenças que
incluem: diabetes tipo 2 (DM2), dislipidemias, doenças cardiovasculares, hipertensão,
acidente vascular cerebral e diversos tipos de câncer (KOPELMAN, 2000).
Dentre as causas principais da obesidade encontram-se a ingestão de dietas
hiperlipídicas (HL), vida sedentária, fatores genéticos e desordens do sistema endócrino
(SWINBURN et al., 2011). A obesidade é decorrente de um desequilíbrio entre o
consumo e o gasto energético, levando a um aumento no armazenamento de nutrientes
em forma de triacilglicerol (TAG) no tecido adiposo branco (TAB). Os adipócitos são
capazes de sintetizar TAG através da esterificação de ácidos graxos (AG) com o
glicerol-3-fosfato (G3P) e o armazenamento de lipídios ocorre quando a taxa de
esterificação é maior que a da lipólise (BALLARD; HANSON, 1967; NYE et al., 2008)
Além disso o aumento no armazenamento de TAG na expansão da massa
adiposa está intimamente associado com o desenvolvimento de resistência à insulina em
tecidos periféricos como o músculo esquelético e fígado (GALIC; OAKHILL;
STEINBERG, 2010) e o DM2 é a co-morbidade mais prevalente nesta condição (GUH
et al., 2009). A resistência à insulina está entre os primeiros distúrbios relacionados ao
desenvolvimento do DM2 e é fator determinante para a instalação da síndrome
metabólica, desordem definida por obesidade, hipertensão, intolerância à glicose e
2
______________________________________________________________________ Introdução
dislipidemia (WIESER; MOSCHEN; TILG, 2013). A resistência à insulina se deve a
uma condição na qual o excesso de ingestão alimentar desencadeia inflamação,
alterações no metabolismo lipídico e na microbiota intestinal (JOHNSON; OLEFSKY,
2013).
As abordagens nutricionais no combate à obesidade vêm no sentido de prevenir
e tratar, porém esses efeitos não são permanentes, e o crescente interesse na regulação
do metabolismo em modelos de obesidade se torna fundamental para a identificação de
alvos moleculares do armazenamento lipídico e desenvolvimento de estratégias para o
controle da redução de depósitos adiposos.
1.2 Metabolismo do tecido adiposo branco
O aumento na massa adiposa observada na obesidade ocorre em consequência de
hipertrofia e hiperplasia de adipócitos em resposta a uma situação prolongada de
desequilíbrio entre consumo e gasto energético. Este aumento dos depósitos adiposos
requer processos metabólicos que envolvem o ciclo de armazenamento e degradação de
TAG (WATT; STEINBERG, 2008). A formação dos TAG demanda o fornecimento de
AG, o que se dá por meio de três processos: a síntese de novo, a captação de AG pré-
formados provenientes das lipoproteínas circulantes e a reesterificação de AG oriundos
da lipólise e degradação dos TAG armazenados no próprio adipócito. No estado
alimentado, com dieta balanceada, a síntese de AG utiliza predominantemente a glicose
como substrato. A glicose é captada no adipócito através do transportador de glicose
GLUT-4, e é convertida a piruvato, que entra no ciclo do ácido tricarboxílico. O citrato
formado no ciclo é lançado ao citoplasma, onde é convertido em acetil-CoA e
oxaloacetato pela ATP-citrato liase. A acetil-CoA carboxilase-1 (ACC1) converte parte
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______________________________________________________________________ Introdução
A síntese de G3P a partir da glicose é a via classicamente conhecida tanto no
TAB como no tecido adiposo marrom (TAM), sendo a glicose degradada pela via
glicolítica até diidroxiacetona fosfato, seguido de redução a G3P pela glicerol-3-fosfato
desidrogenase (GPD2) (Figura 1). O G3P pode ser sintetizado também a partir de
precursores não glicídicos de 3 carbonos pela gliceroneogênese. As primeiras
observações sobre esta via foram feitas ao final da década de 60 e início da década de
70 (BALLARD; HANSON, 1967; GORIN; TAL-OR; SHAFRIR, 1969; HOPGOOD;
BALLARD, 1973; RESHEF; HANSON; BALLARD, 1970), com a constatação de que
o TAB epididimal (EPI) de ratos era capaz de converter in vitro lactato, piruvato e
aminoácidos glicogênicos em glicerol de TAG. O fato destas observações terem sido
feitas no tecido adiposo de animais jejuados e diabéticos foi interpretado por Reshef et
al., (1970) como um mecanismo de redução na liberação de AG-TAG com a finalidade
de prevenir a formação de corpos cetônicos e, consequentemente a acidose característica
destas duas condições metabólicas. Posteriormente, estudos do nosso laboratório
publicados por Botion et al., (1998) utilizando técnica de dupla marcação (3H2O e
glicose-U-14C) refutaram a hipótese de Reshef, ao constatarem que ratos adaptados à
dieta hiperprotéica livre de carboidratos (HP) e que apresentavam reduzida lipólise,
mostravam aumentada atividade da via gliceroneogênica. O aumento desta via foi
interpretada pelos autores, como um mecanismo compensatório para garantir a geração
de G3P numa situação de baixa disponibilidade de glicose, assegurando assim, a
esterificação dos AG e manutenção dos depósitos de TAG. Outro aspecto importante
destes estudos foi a constatação de que mesmo em animais com dieta balanceada, a
contribuição da gliceroneogênese era maior (56%) do que a contribuição da glicose
(44%) na formação de G3P no TAB, TAM e fígado (BOTION et al., 1998). Estudos
mais aprofundados desta via identificaram a fosfoenolpiruvato carboxiquinase
5
______________________________________________________________________ Introdução
(PEPCK), considerada inicialmente uma enzima exclusivamente gliconeogênica, como
enzima chave também da gliceroneogênese e que catalisa a conversão de oxaloacetato,
um intermediário do ciclo de Krebs, a fosfoenolpiruvato. A relevância da PEPCK no
metabolismo lipídico do TAB foi evidenciada por trabalhos utilizando animais
transgênicos. Camundongos com deleção gênica da PEPCK apresentam redução da
gordura e aumento da mobilização de AG-TAG do TAB (OLSWANG et al., 2002),
enquanto camundongos que superexpressam esta proteína no TAB apresentam alta
atividade gliceroneogênica e acúmulo de gordura nesse tecido (FRANCKHAUSER et
al., 2002).
Achados do nosso laboratório sugerem que a gliceroneogênese é regulada pela
disponibilidade de glicose, parecendo ser inibida pelo aumento da utilização de glicose
e estimulada pela falta dela, assim sendo essa via parece ser estimulada para compensar
a reduzida síntese de G3P a partir desta hexose. Animais alimentados com dieta
hipercalórica e hiperlipídica do tipo cafeteria (HCHL) apresentam níveis plasmáticos
elevados de insulina, com redução da gliceroneogênese e ativação da via glicolítica e da
gliceroquinase nos TAB epididimal e retroperitoneal (CHAVES et al., 2006). Já em
uma situação onde há redução da insulina plasmática e consequentemente da
disponibilidade de glicose, como a administração de dieta HP observa-se aumento na
atividade da via gliceroneogênica (BOTION et al., 1998).
A geração de G3P pela fosforilação do glicerol pela GK, por bastante tempo, foi
considerada desprezível no TAB, tendo em vista a reduzida atividade desta enzima
neste tecido quando comparado ao fígado e TAM. A GK tem o importante papel de
reciclar o glicerol gerado pela hidrólise do TAG no interior do adipócito, e crescentes
evidências apontam que a sua atividade pode ser modulada em diversas condições no
TAB. Estudos do nosso laboratório demonstraram que tanto a atividade quanto a
6
______________________________________________________________________ Introdução
expressão da GK estão sob controle direto do sistema nervoso simpático no TAM. A
exposição ao frio, situação conhecida de aumento da atividade simpática para o TAM,
promove aumento na expressão e atividade da GK. Após a desnervação simpática
cirúrgica desse tecido nos animais expostos ao frio, a atividade da enzima é reduzida e
volta aos valores normais (KAWASHITA et al., 2002). A infusão constante de
noradrenalina por bombas osmóticas por 72 horas foi capaz de aumentar a atividade da
GK em 83% no EPI e 55% no retroperitoneal (RETRO) (VALENTIM, 2012).
Corroborando estes achados, foi demonstrado que a ativação crônica de receptores β3
adrenérgicos pelo agonista CL 316,243 causa aumento da expressão de GK no TAB a
níveis que excedem os observados no TAM (MOTTILLO et al., 2014). Outro conhecido
ativador da GK são as tiazolidineadionas (TZDs), agonistas do PPARγ (Peroxisome
proliferator-activated receptor gamma), que induzem consideravelmente a expressão de
GK em adipócitos isolados em cultura (GUAN et al., 2002). Recentemente também foi
descrita a influência da RIP140 (Receptor-Interacting Protein 140) na expressão da GK
em adipócitos. Em células primárias de animais nocautes para RIP140, a expressão da
GK foi aumentada em 5x, por uma regulação pré-transcricional onde o fator se liga
diretamente à região PPAR response element (PPRE) na região promotora do gene da
GK inibindo sua transcrição (KISKINIS et al., 2014).
Outro fator que possivelmente contribui para o aumento no tamanho do TAB e
que influencia na atividade da GK é a regulação no transporte de glicerol através da
membrana do adipócito. Estudos sugerem que a hipertrofia de adipócitos pode ser, em
parte, consequência da redução da permeabilidade da membrana plasmática ao glicerol,
resultando no aumento de glicerol intracelular. O transporte de glicerol pelas
membranas é realizado pelas aquagliceroporinas (Aqp), que têm sido descritas como um
novo ponto de regulação do acúmulo intracelular de lipídios, já que a modulação da
7
______________________________________________________________________ Introdução
expressão e função das Aqps pode alterar a massa adiposa. No tecido adiposo, a Aqp7 é
a isoforma mais expressa e é reconhecida como principal canal de transporte de glicerol
presente. Os níveis de mRNA da Aqp7 são regulados por fatores nutricionais. Em jejum
esses níveis aumentam e no estado alimentado diminuem no TAB, levando a um
aumento nos níveis plasmáticos de glicerol no jejum e redução no estado alimentado
(KISHIDA et al., 2001). A ausência de Aqp7, estudada em animais nocautes e em
adipócitos 3T3-L1 knockdown, promove aumento do conteúdo intracelular de glicerol,
aumento na atividade da GK e na captação de ácido oléico levando a um maior acúmulo
de TAG (HIBUSE et al., 2005).
Já é conhecido que a insulina regula negativamente a expressão do gene da Aqp7
por meio do IRE (Insulin Response Element) existente em sua região promotora
(KISHIDA et al., 2001). Em camundongos, a deficiência de Aqp7 é associada com
deficiência na ação da insulina, redução na tolerância à glicose e redução na fosforilação
da AKT no TAB e fígado, além de prejuízos na ativação da PI3K (fosfatidilinositol 3-
quinase) pelo IRS-1 (Insulin Receptor Substrate 1) no TAB (HIBUSE et al., 2005).
Além da síntese de TAG, outro processo importante que determina o tamanho da
massa adiposa é a lipólise que é regulada por fatores hormonais, nutricionais e neurais.
A lipólise envolve uma classe de enzimas classificadas como hidrolases, sendo as mais
conhecidas a lipase dos triacilgliceróis dos adipócitos (ATGL), que tem alta
especificidade para TAG, e a lipase hormônio sensível (LHS), que atua principalmente
como hidrolase de diacilglicerol (DAG) no TAB. As lipases de monoacilglicerol
(MAG) finalizam a degradação dos TAG, liberando o último AG e uma molécula de
glicerol (AHMADIAN; DUNCAN; SUL, 2009). Animais que superexpressam ATGL
possuem altas taxas lipolíticas tanto em condições basais quanto estimulada por
diferentes agentes lipolíticos, e quando alimentados com dieta HL estes animais são
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______________________________________________________________________ Introdução
adenosina 3’,5’monofosfato cíclico (cAMP) que leva à ativação da proteína quinase
dependente de cAMP (PKA). A PKA é responsável pela fosforilação da LHS e
perilipina A, a principal proteína estrutural localizada na superfície da gota lipídica. A
perilipina A quando fosforilada facilita o acesso da LHS à gota lipídica e expõe a
superfície da gota para a ação das enzimas que vão promover a hidrólise dos TAG em
AG e glicerol (Figura 2) (ZIMMERMANN et al., 2004). Além disso, a perilipina que
encontra-se ligada ao CGI-58 (Comparative Gene Identification 58) e ao ser fosforilada
estimula a liberação deste que é um potente ativador da ATGL (NIELSEN et al., 2014).
Ao contrário das catecolaminas a insulina inibe a lipólise pela fosforilação e
ativação da fosfodiesterase (PDE) específica do cAMP, a PDE-3, que catalisa a
hidrólise do cAMP em AMP, reduzindo os níveis de cAMP e como conseqüência
impedindo a fosforilação da LHS. A sinalização intracelular da insulina inicia-se pela
ligação do hormônio ao seu receptor específico de membrana, o IR (receptor de
insulina), uma proteína com atividade tirosina quinase intrínseca. Essa ligação leva a
autofosforilação e ativação de IR com consequente fosforilação dos substratos do
receptor de insulina (IRS), permitindo a interação destes com várias proteínas com
domínio SH2, entre elas a subunidade p85 da proteína PI3K. Em seguida, a PI3K
promove a fosforilação do fosfolipídio de membrana fosfatidilinositol 4,5-bifosfato,
convertendo-o em fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato. Este, por sua vez, ancora as
proteínas PDK (proteína quinase dependente de fosfatidilinositol) e Akt/PKB (proteína
quinase B). Após ancoramento na membrana, a PDK promove a fosforilação da Akt em
resíduos de serina e/ou treonina que, uma vez ativada, se desloca para o citosol e passa a
fosforilar diversas proteínas-alvo reguladas pela insulina (DUNCAN et al., 2007).
A lipólise pode também ser influenciada por uma regulação autócrina, induzida
por substâncias produzidas pelas próprias células adiposas ou do estroma vascular,
10
______________________________________________________________________ Introdução
como a IL-6, leptina e o TNF- α (Tumor Necrosis Factor α) (LAFONTAN; LANGIN,
2009). A ativação da lipólise por TNF-α é tempo e dose dependente e quando ocorre no
TAB é através de sua ligação ao receptor de TNF do tipo 1 (TNFR-1) (FERES et al.,
2013). Os efeitos no TNF-α na lipólise são controversos, a injeção de TNF-α por 5 dias
em ratos não teve efeito na atividade lipolítica do TAB (KETTELHUT; GOLDBERG,
1988), já na dieta LPHC onde há aumento plasmático dessa citocina a atividade
lipolítica está reduzida no RETRO e EPI (BUZELLE et al., 2010; SANTOS et al.,
2012). Quando os adipócitos isolados dos TAB de animais LPHC são incubados com
TNF-α a atividade lipolítica é menor do que nos animais controles (FERES et al., 2013)
1.3 Obesidade induzida por dieta hiperlipídica
A obesidade decorre de uma combinação de fatores individuais e sociais,
entretanto é frequentemente atribuída a fatores alimentares, como ingestão de dietas
com alta densidade energética (NIKOLIC et al., 2012). Diferenças individuais e a
vulnerabilidade ao desenvolvimento da obesidade são fenômenos que podem ser
observados em diferentes espécies animais como determinadas linhagens de ratos e
camundongos que podem reagir de maneira diferente a estímulos alimentares, porém, o
ganho de peso, acúmulo de gordura corporal e a inflamação no TAB são achados
comuns (MONTGOMERY et al., 2013).
Camundongos ob/ob, deficientes em leptina, por exemplo, tem sobrepeso e
hiperfagia e desenvolvem severa resistência à insulina, podendo ser utilizados tanto nos
estudos de obesidade quanto de diabetes (LINDSTRÖM, 2007). Já os camundongos da
linhagem C57BL/6J podem ser facilmente induzidos à obesidade utilizando uma dieta
HL (Surwit, et al.1988). Camundongos da linhagem Swiss quando submetidos à dieta
11
______________________________________________________________________ Introdução
HL apresentam considerável ganho ponderal e de depósitos adiposos, aumentando até
30% do seu peso quando comparado aos animais que receberam uma dieta controle.
Após oito semanas de tratamento, esses animais se tornam obesos, hiperinsulinêmicos e
resistentes à insulina, bem como intolerantes à glicose (DE SOUZA et al., 2005;
PITOMBO et al., 2006). Não faltam evidências de que fatores genéticos exercem um
papel importante no desenvolvimento desta patologia, entretanto, mesmo que
predisposto geneticamente, sem um excesso na ingestão calórica, dificilmente um
organismo se torna obeso (NING et al., 2011).
A ingestão de dieta HL está relacionada com maior concentração de TAG no
TAB, indução de estresse metabólico, alterações na lipólise e ativação das vias de
sinalização de algumas adipocinas. Apesar de fatores nutricionais e hormonais como
ácidos graxos, catecolaminas e insulina estarem alterados na obesidade, substâncias
liberadas pelo próprio adipócito têm sido apontadas como causadoras da resistência
insulínica. As adipocinas secretadas pelo TAB, que incluem a adiponectina, resistina,
interleucina 6 (IL-6) e TNF-α parecem ter função primordial na regulação de vias
metabólicas tanto em situações fisiológicas quanto patológicas (HOTAMISLIGIL;
SHARGILL; SPIEGELMAN, 1993; SEWTER et al., 1999; STEPPAN et al., 2001)
Em modelos de ingestão de dieta HL, há aumento no infiltrado de macrófagos
no TAB. Tanto os adipócitos quanto os macrófagos tem papel na patogênese da
obesidade e resistência à insulina. Esses dois tipos celulares tem a mesma origem
embrionária e são capazes de produzir e liberar moléculas semelhantes dependendo das
condições às quais estão expostos. Os adipócitos são especializados em armazenar
lipídios, enquanto que os macrófagos são especializados em resposta inflamatória, mas
na obesidade a função metabólica e a inflamação se sobrepõem, e a expressão gênica
nas duas linhagens se torna semelhante. Dessa maneira, citocinas inflamatórias podem
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______________________________________________________________________ Introdução
frequentemente associada à inflamação no TAB (OSBORN; OLEFSKY, 2012;
YAMAUCHI et al., 2001).
Há diferenças fenotípicas fundamentais nos macrófagos presentes no tecido
adiposo de animais magros e obesos. Na obesidade, há a predominância do tipo M1, que
é produzido pelo contato com linfócitos T-helper 1 (Th1) ou mediadores inflamatórios
como INFγ (Interferon γ). Após a ativação os macrófagos liberam citocinas
inflamatórias, principalmente TNF-α e IL-6. O tipo M2 é produzido pela exposição às
citocinas dos linfócitos Th2 como IL-4 e IL-13, e expressam fatores como IL-10 que
atuam em processos imunossupressores como o reparo tecidual (HILL; REID BOLUS;
HASTY, 2014). Interessantemente, no TAB de animais obesos os macrófagos
frequentemente se localizam em arranjos denominados Crow like structure, e não
difusos como no TAB de animais magros (CINTI, 2005).
Frequentemente, fatores de transcrição que atuam na diferenciação dos
adipócitos possuem papel fundamental na regulação da expressão gênica em modelos de
obesidade. Um dos fatores de transcrição mais bem estudados do TAB é o PPARγ. Esse
fator existe em duas isoformas: PPARγ1 e PPARγ2, formadas por splicing alternativo.
O PPARγ1 é expresso em baixos níveis em vários tecidos, enquanto que o PPARγ2 é
especificamente expresso no TAB, atuando como regulador principal da diferenciação
de adipócitos e metabolismo de glicose (TONTONOZ et al., 1994). Porém, o papel
desse fator de transcrição em modelos de obesidade é controverso. Yamauchi e
colaboradores (2001) verificaram que no TAB a ativação suprafisiológica do PPARγ
pelas TZDs estimulou a adipogênese o acúmulo de TAG, além de aumentar o transporte
de AG do fígado e músculo para o TAB reduzindo o conteúdo de TAG nesses tecidos.
Os autores observaram também que a redução na liberação de AGL e TNF-α, e o
aumento na expressão de adiponectina levou a uma melhora na sensibilidade à insulina.
14
______________________________________________________________________ Introdução
No mesmo estudo o tratamento com TZD em animais com obesidade induzida por dieta
melhorou a hiperglicemia e hiperinsulinemia (YAMAUCHI et al., 2001). Por outro
lado, Miles et al (2003) demonstraram que o PPAR parece não influenciar nos efeitos da
ingestão de dieta HL. Animais PPARγ+/- alimentados com dieta HL não se tornam
obesos nem resistentes à insulina, e não apresentam diferenças na massa adiposa,
tamanho dos adipócitos, níveis circulantes de AGL e leptina quando comparados com
os animais normais (MILES et al., 2003).
Outra família de fatores de transcrição que é influenciada pela obesidade são as
STATs (Signal Transducers and Activators of Transcription), que podem ser
primariamente ativados por hormônios e citocinas, como leptina, prolactina, IL-6 e
IFNγ. Após a ativação do receptor por seus respectivos ligantes se inicia a sinalização
que envolve a fosforilação em tirosina das STATs pelas JAks (Janus Kinase), ocorrendo
sua dimerização e translocação para o núcleo, onde podem modular a transcrição
gênica. Existem sete subtipos de STATs dos quais o 1, 3, 5A, 5B e 6 são expressos no
TAB (DARNELL, 1997; ZHAO; STEPHENS, 2013). A sinalização JAK-STAT no
TAB exerce papel importante na comunicação parácrina entre os adipócitos e
macrófagos, influencia no fenótipo da obesidade e regula a expressão de enzimas
chaves do metabolismo lipídico como a LPL, AGS e PDK 4 (Piruvato desidrogenase
quinase 4) (RICHARD; STEPHENS, 2014)
Além destes, outro fator importante no desenvolvimento da obesidade e
resistência à insulina é a família dos CREBs (cAMP-responsive Element Binding
Proteins) que inclui os fatores de transcrição CREB, ATF (Activating Transcription
Factor) e CREM (cAMP-responsive Element Modulator). Após fosforilação na serina
133 por proteínas quinase como a PKA ou Cálcio Calmodulina o CREB estimula a
transcrição de vários genes pelo recrutamento da histona deacetilase CBP e os
15
______________________________________________________________________ Introdução
coativadores transcricionais CRTC (cAMP-regulated Transcriptional Co-activators)
(CHRIVIA et al., 1993; RAVNSKJAER et al., 2007). Na obesidade induzida por dieta
HL o CREB é ativado no TAB onde reduz a ação local da insulina e contribui para a
resistência à insulina sistêmica. Quando a atividade de CREB é inibida, a sensibilidade
à insulina no TAB é sistemicamente preservada nos animais obesos. Esse
comprometimento na função do adipócito mediada por CREB ocorre por uma maior
expressão de ATF3, um repressor que se liga e inibe a transcrição de adiponectina e
GLUT-4 (QI et al., 2009b). Adicionalmente, o CRTC3 está aumentado na obesidade
induzida por dieta HL, sendo capaz de atenuar a sinalização adrenérgica no TAB.
Animais CRTC3-/- são resistentes à obesidade e esteatose hepática induzida por dieta
HL, e a ativação do CTCR3 está relacionada com a superexpressão do RGS2 (Regulator
of G Protein Signaling 2), um gene alvo de CREB conhecido por sua co-relação com a
síndrome metabólica (SONG et al., 2010)
Apesar de haverem diversos trabalhos na área, o metabolismo na obesidade e as
disfunções associadas ainda não estão totalmente claros. Nesse panorama, estudos que
avaliam o metabolismo in vivo e in vitro são de fundamental importância. Para a
compreensão dos mecanismos envolvidos nas alterações metabólicas decorrentes da
obesidade, a utilização de modelos animais que reproduzam essa condição é primordial.
Mesmo sendo a ingestão de dieta HL ser um modelo utilizado para estudos em
diferentes áreas da pesquisa, ainda são poucos os trabalhos que demonstram como
ocorre o acúmulo de TAG no TAB de animais que se alimentam com esse tipo de dieta.
Apesar de ser bastante conhecida a fisiopatologia, o desenvolvimento e as
consequências de DM2, o mesmo não ocorre com a obesidade, que por bastante tempo
foi considerada um problema apenas estético. Recentemente, devido à sua associação
16
______________________________________________________________________ Introdução
com diversas co-morbidades, há um extenso esforço para a compreensão da anatomia,
distribuição e o papel fisiológico e patológico do TAB.
Neste sentido, o nosso laboratório tem investigado durante os últimos 20 anos as
vias geração de G3P e a formação dos TAG no TAB de animais submetidos a diferentes
situações experimentais. Animais diabéticos, submetidos ao jejum ou alimentados com
a dieta HP apresentam redução nos níveis plasmáticos de insulina e redução na massa
do TAB, enquanto que animais alimentados com a diea HCHL apresentam aumento dos
níveis de insulina e aumento do TAB ocorrendo nesses estudos um controle recíproco
entre a captação de glicose e via glicolítica e a via gliceroneogênica. No primeiro grupo,
a redução da captação de glicose era acompanhada do aumento da gliceroneogênese e
no segundo grupo ocorria um aumento da glicólise e reduzida gliceroneogênese para a
formação do G3P, parecendo evidente o envolvimento da insulina no controle recíproco
dessas duas vias para a geração do G3P e formação de TAG no TAB. Entretanto, até
hoje, ainda não haviam sido estudadas as atividades das vias de formação de G3P em
uma situação que houvesse resistência à insulina. Assim sendo escolhemos o modelo de
obesidade induzida pela dieta HL em camundongos para investigarmos a regulação das
vias de síntese de G3P em uma situação em que há aumento no armazenamento de
TAG no TAB e uma estabelecida resistência à insulina. O fornecimento de AG pela
síntese de novo e a atividade da lipase lipoproteica, assim como a atividade lipolítica e o
perfil inflamatório foram também investigados.
17
______________________________________________________________________ Objetivos
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivos gerais
Este trabalho teve como objetivo principal investigar o efeito da ingestão de
dieta hiperlipídica por 8 semanas no metabolismo de ácidos graxos e glicerol nos TAB
RETRO e EPI de camundongos resistentes à insulina
2.2 Objetivos específicos
1. Obter dados ponderais e de massa adiposa em animais submetidos à dieta HL,
modelo experimental utilizado neste trabalho.
Acompanhamento da evolução do peso corporal
Determinar o peso dos TAB e TAM
2. Avaliar o perfil plasmático lipídico e hormonal
Dosagens séricas de AGL, glicerol, TAG e colesterol
Dosagens hormonais de adiponectina, corticosterona, insulina e
leptina
3. Verificar a estrutura histológica dos TAB RETRO e EPI
4. Constatar a instalação da resistência à insulina, confirmando a reprodução do modelo
experimental
Dosagens de glicemia e insulina
Teste de tolerância à glicose
Determinar o conteúdo AKT fosforilada (ser-473)
5. Determinar o perfil inflamatório dos TAB RETRO e EPI
Dosagens de TNF-α, IL-6, IL-10 e adiponectina
18
______________________________________________________________________ Objetivos
Expressão gênica de IL-6, MCP-1 e PAI-1
6. Avaliar a origem dos AG esterificados em TAG nos TAB RETRO e EPI
Determinação da velocidade de síntese de AG total in vivo e in vitro
pela incorporação de 3H de 3H2O
Conteúdo proteico de ácido AGS e ACC
Determinação da expressão gênica e atividade da LPL
8. Avaliar as vias de geração de G3P
Determinação do índice de captação de 2-desoxi-1-[14C]-D-glicose in
vitro e conteúdo proteico do GLUT-4 para avaliar a via glicolítica
Determinação da velocidade de incorporação de 1-[14C]-piruvato em
TAG, atividade e conteúdo proteico da PEPCK para avaliar a via da
gliceroneogênese
Determinação da velocidade de incorporação de glicerol-U-[14C] em
TAG, atividade e conteúdo da GK para avaliar a geração de G3P pela
fosforilação direta do glicerol, além do conteúdo da GPD2 e Aqp 7.
9. Avaliar a atividade lipolítica
Determinar a lipólise basal e estimulada por noradrenalina in vitro
Determinar os níveis de fosforilação da ATGL e LHS e o conteúdo
dos receptores β3 e α2 adrenérgicos no TAB
10. Investigar fatores de transcrição envolvidos no metabolismo lipídico
Conteúdo proteico de PPARγ e ATF3
Conteúdo de CREB e STAT3 fosforiladas
Expressão gênica da RGS2
19
______________________________________________________________________ Materiais e métodos
3. MATERIAIS E MÉTODOS
Os experimentos foram desenvolvidos no Laboratório de Endocrinologia e
Controle do Metabolismo do Departamento de Bioquímica e Imunologia da Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP-USP). Todos os procedimentos experimentais
foram conduzidos de acordo com os Princípios Éticos em Experimentação Animal
adotado pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA)
com base nos princípios de boas práticas de laboratório e procedimentos científicos, e
com a aprovação do Comitê de Ética em Experimentação Animal da FMRP-USP,
protocolo nº 047/2013.
3.1 Animais e tratamento
Foram utilizados camundongos machos (Mus musculus) da linhagem Swiss,
provenientes do Biotério da Prefeitura do Campus Administrativo da USP de Ribeirão
Preto (PCARP). Os camundongos com peso inicial entre 15-20g e quatro semanas de
vida foram mantidos em microisoladores em rack ventilado com ciclo claro/escuro de
12 horas, à temperatura de 24 ± 2ºC e umidade de ± 55%, sendo acondicionados dois ou
três camundongos por caixa no biotério Setorial do Departamento de Bioquímica e
Imunologia da FMRP-USP. Antes do início dos experimentos, os animais passaram por
uma ambientação de quatro dias recebendo água e ração padrão para roedores Labina
(Purina) ad libitum.
Após o período de ambientação, os animais iniciaram o período experimental
recebendo as respectivas dietas que seguiram as recomendações do Instituto Americano
20
______________________________________________________________________ Materiais e métodos
de Nutrição (AIN-93G) para roedores (REEVES; NIELSEN; FAHEY, 1993). O grupo
controle (CT) recebeu dieta controle normolipídica de acordo com o AIN-93G durante
oito semanas. O grupo hiperlipídica (HL) recebeu também durante 8 semanas uma dieta
purificada AIN-93G modificada contendo 35% de lipídios, sendo 4% de origem vegetal
(óleo de soja) e 31% de origem animal (gordura suína Sadia) caracterizando uma dieta
hiperlipídica (Tabela I). A quantidade total de calorias da dieta HL foi de 24,5 kJ/g e da
dieta controle foi de 15,8 kJ/g (CINTRA et al., 2008). A dieta e a água foram oferecidas
ad libitum. Ambas as ditas foram homogeneizadas manualmente e armazenadas em
forma de pó a 5º C em recipientes de polipropileno
Tabela 1 – Composição das dietas Controle (CT) e hiperlipídica (HL) (g/100g).
Ingredientes Dieta CT
g/100g
Dieta HL
g/100g
Amido 39,8 11,8
Dextrina 13,2 13,2
Sacarose 10,0 10,0
Caseína 20,0 20,0
Óleo de Soja 7,0 4,0
Banha de porco - 31,0
Celulose microfina(fibra) 5,0 5,0
Mistura de Minerais (AIN – 93G)* 3,5 3,5
Mistura de Vitaminas (AIN – 93G)* 1,0 1,0
L – cistina 0,30 0,30
Bitartarato de Colina 0,25 0,25
* Composição detalhada por (REEVES; NIELSEN; FAHEY, 1993).
Todos os experimentos foram realizados com animais alimentados e iniciados
em torno de 8:00 horas. Os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical e os
TAB e TAM coletados e pesados após laparotomia mediana. Os tecidos foram
utilizados frescos ou congelados em nitrogênio líquido e armazenamento a -80ºC para
21
______________________________________________________________________ Materiais e métodos
uso posterior. A coleta de sangue foi realizada por punção cardíaca com os animais
anestesiados com isoflurano (BioChimico).
3.2 Determinação dos níveis séricos de insulina, corticosterona, leptina,
adiponectina, triacilglicerol, colesterol, ácidos graxos e glicose
Para as dosagens séricas, o sangue dos camundongos alimentados foi coletado
em tubos eppendorf de 1,5 ml e centrifugado a 1.300g por 10 minutos para a obtenção
do soro. A dosagem dos ácidos graxos livres foi feita pelo método colorimétrico
enzimático utilizando kit comercial (NEFA Randox), assim como triacilglicerol
(Labtest), colesterol (Doles) e glicerol (Bioclin-Quibasa). As dosagens de adiponectina
(R&D Systems Inc.), leptina e insulina (Millipore) foram realizadas por ELISA. A
corticosterona foi dosada por radioimunoensaio. A glicemia foi determinada no sangue
total utilizando glicosímetro (Accu-Chek Performa; Roche).
3.3 Análise histológica
Fragmentos dos TAB retroperitoneal e epididimal foram retirados para
histologia e imediatamente colocados em um frasco contendo formalina tamponada a
10%. Posteriormente, os fragmentos foram processados com álcool em concentrações
crescentes (70%, 80%, 95% e 100%), xilol e parafina. Posteriormente foram incluídos
em blocos de parafina, de onde foram seccionados em cortes de 5,0 μm e fixados em
lâminas de microscopia. A coloração utilizada para visualização estrutural foi realizada
com os corantes de Eosina e Hematoxilina. As imagens de campo claro foram
22
______________________________________________________________________ Materiais e métodos
capturadas em um aumento de 40x com o microscópio Olympus BX50F4 acoplado a
um sistema de detecção. A mensuração do tamanho dos adipócitos foi feita com auxílio
do software MATLAB (R2011b, MathWorks) conforme descrito por (OSMAN et al.,
2013).
3.4 Teste de Tolerância a Glicose (TTG)
Camundongos jejuados por 8 horas receberam 2 g/kg de peso corporal de glicose
por via intraperitoneal (i.p.). A concentração de glicose foi determinada nos tempos de
0, 10, 20, 30, 45, 50, 90 e 120 minutos, possibilitando o traçado da curva de decaimento
da glicemia. A glicemia foi determinada no sangue coletado da veia caudal utilizando
um medidor de glicose (Accu-Chek Performa; Roche).
3.5 Determinação do conteúdo de citocinas no tecido adiposo branco
Para a determinação do conteúdo de IL-6, IL-10, TNF-α e adiponectina por
ELISA os TAB retroperitoneal e epididimal foram homogeneizados no TissueLyser II
(Quiagen) em tampão Tris 20 mM acrescido de NaCl 135 mM, 1% de NP40 e 10% de
glicerol, na proporção de 2:1. O homogenado foi centrifugado a 10.000 g por 30
minutos a 4ºC e o sobrenadante foi separado para a realização do ensaio. As proteínas
foram dosadas pelo método BCA – Bicinchoninic Acid, Pierce, USA (SMITH et al.,
1985). Essas dosagens foram realizadas no Laboratório de Emergências Médicas 51 do
Prof. Heraldo Possolo de Souza no Departamento de Clínica Médica da FMUSP de São
Paulo utilizando kits comerciais (R&D Systems Inc.).
23
______________________________________________________________________ Materiais e métodos
3.6 Isolamento de adipócitos
A técnica do isolamento de adipócitos foi baseada no método de Rodbell, 1964.
Um pool de 5g dos TAB retroperitoneal e epididimal foi pesado e mantido em tampão
Krebs-Henseleit (137 mM de NaCl, 4,2 mM NaHCO3, 0,4 mM de MgSO4.7 H2O, 0,5
mM de MgCl2. 6H2O, 0,4 mM de KH2PO4; 5,4 mM de KCl), acrescido de 3% de
albumina bovina livre de ácidos graxos, 27 mM de HEPES e 0,55 mM de glicose, pH
7,4. Após a fragmentação dos tecidos com auxílio de tesoura, o meio foi aspirado com
uma seringa sem agulha. Os fragmentos de tecido foram transferidos para um frasco
plástico contendo tampão na proporção de 1 g de tecido: 1,5 ml de tampão contendo
0,55 mM de glicose e 1,0 mg de colagenase tipo I (Worthington 128 U/mg). Os frascos
foram incubados em banho maria a 37ºC sob agitação constante por 30 minutos. Os
adipócitos isolados foram filtrados em meia de “nylon” e em seguida lavados três vezes
com o tampão Krebs-Henseleit sem glicose para a remoção da colagenase e estromas
vasculares. As células foram separadas do tampão por flotação. Para a contagem dos
adipócitos utilizamos um frasco para cada TAB com a mesma quantidade de tampão e
de células que foi mantido fora do banho durante o período de incubação e contado ao
final em câmara de Neubauer em microscópio óptico (Bioval).
3.7 Síntese in vivo de ácidos graxos de novo
A síntese de AG de novo de todas as possíveis fontes foi avaliada in vivo pela
incorporação de trítio (3H) da água tritiada (3H2O) em ácidos graxos. A metodologia se
baseia na premissa de que a 3H2O se distribui pelo organismo juntamente com a água
corporal e mantém sua atividade específica constante por longos períodos de tempo,
24
______________________________________________________________________ Materiais e métodos
tanto no plasma quanto nos tecidos. Durante a síntese de ácidos graxos, o 3H é
incorporado em ligações estáveis C-H, por meio da troca de 3H com os H dos
nucleotídeos de piridina reduzidos (NADPH), que são utilizados nas reações de redução
(WINDMUELLER; SPAETH, 1966).
Para a determinação da síntese de ácidos graxos in vivo, foi administrado 1 mCi
de água tritiada (Amersham) por animal por via intraperitoneal. Uma hora após a
injeção os animais foram anestesiados com isoflurano (BioChimico). O sangue foi
coletado por punção cardíaca em tubos heparinizados e centrifugado a 1.000 g por 15
minutos a 4ºC para a obtenção do plasma. Os TAB foram retirados, pesados e
homogeneizados em mistura clorofórmio: metanol (2:1) para a extração dos lipídios,
transferidos para provetas de vidro e o volume foi completado para 10 ml com a mesma
mistura (FOLCH; LEES; SLOANE STANLEY, 1957). Após a extração, o material foi
filtrado em lã de vidro, e ao filtrado foi adicionada água deionizada na proporção 1:5. A
fase superior foi descartada, e a fase clorofórmica inferior foi lavada três vezes com
mistura de fase superior composta de clorofórmio, metanol e mistura de sais (0,528 g de
CaCl2.H20; 0,732 g de MgCl2.6H2O; 5,8 g de NaCl em 940 ml de H2O) nas proporções
21,1: 337: 330. Para o isolamento dos AG, foi retirada uma alíquota de 4 ml, de onde foi
evaporado todo o clorofórmio em banho maria a 50ºC. Após a adição de 20 ml de KOH
etanólico (1 ml de KOH 14,5 M + 20 ml de álcool etílico), os tubos foram tampados e
levados ao banho maria a 80ºC por duas horas para a saponificação dos lipídios. Após
esse período, os tubos foram mantidos destampados no banho a 50ºC para a evaporação
do álcool etílico. O material saponificado foi então lavado três vezes com 8 ml de éter
de petróleo para a remoção dos lipídios não saponificáveis. Posteriormente a amostra foi
acidificada com ácido perclórico a 6%. Os AG foram extraídos com éter de petróleo e
transferidos para frascos de cintilação, de onde o éter foi evaporado. Após a evaporação,
25
______________________________________________________________________ Materiais e métodos
foram adicionados 10 ml de coquetel de cintilação. Para a determinação da atividade
específica do trítio no plasma, o mesmo foi diluído 20 vezes em água deionizada e uma
alíquota de 10 µl da diluição foi transferida para frasco de cintilação com 10 ml de
coquetel de cintilação. A radioatividade no plasma e a incorporada na fração dos AG
teciduais foram medidas em contador de cintilação Tri Carb 2100 TR.
A velocidade da síntese de ácidos graxos de novo foi calculada pela seguinte
fórmula:
μ / hora incorporadoemAG
H á á ⁄∙ 1013,3
∙1
2 1
O cálculo se baseia nos trabalhos de Windmueller & Spaeth, (1966). A atividade
específica da água tritiada (DPM de 3H ml de H2O) é obtida a partir da radioatividade
plasmática, considerando que cada mL de plasma contém 0,94 ml de água. O fator 109
13,3 corrige a discriminação isotópica e converte átomo-grama de hidrogênio em nmol
de AG com 16 átomos de carbono sintetizados. O cálculo pressupõe que metade de
todos os átomos de hidrogênio são provenientes da água. Esta técnica estima a síntese
de ácidos graxos a partir de todas as unidades de dois carbonos, independente do tipo de
substrato utilizado.
3.8 Síntese in vitro de ácidos graxos de novo
Para a avaliação da síntese de AG de novo in vitro foram utilizados adipócitos
isolados conforme descrito no item 3.6. Foram incubados 400 µl da suspensão de
adipócitos em 1000 µl de tampão Krebs-Henseleit-Hepes pH 7,4 com 5 mM de glicose
e 3% de albumina, acrescido de 1,5 mCi de 3H2O por 1 hora. Ao término da incubação a
26
______________________________________________________________________ Materiais e métodos
reação foi interrompida acrescentando-se 1 ml de clorofórmio:metanol (2:1) para a
extração dos TAG e posterior saponificação conforme descrito no item 3.8. O cálculo da
velocidade de incorporação de 3H2O em AG-TAG e GLI-TAG foi feito conforme o item
3.8 considerando a atividade específica da 3H2O no tampão de incubação, a qual foi
calculada dividindo-se o DPM de 3H/ml de H2O do tampão pelo átomo-grama do
hidrogênio da H2O.
3.9 Atividade da Lipase Lipoprotéica (LPL)
A determinação da atividade da lipase lipoprotéica (LPL) foi baseada no método
de Nilsson-Ehle & Schotz, (1976), fundamentada na reação:
TAG (glicerol tri[1-14C]oleato) LPL glicerol + 3(14C-oleato)
Os TAB epididimal e retroperitoneal foram homogeneizados em sacarose 250
mM, EDTA 1 mM e heparina 20 U/ml (pH 7,4) na proporção de 100 mg de tecido:1 ml
de tampão. O homogenado foi centrifugado a 12.000 g por 15 minutos a 4°C e o
sobrenadante, abaixo da camada gordurosa, foi utilizado para determinação da atividade
da LPL (HIETANEN; GREENWOOD, 1977).
O substrato, contendo 78 µmol de trioleína, 4 mg de lisolecitina em clorofórmio
e 12,5 µCi de glicerol tri[1-14C]oleato em tolueno (Amersham, Sunnyvale, CA, USA)
foi preparado no dia anterior ao ensaio. Os solventes orgânicos foram evaporados sob
corrente de nitrogênio à temperatura ambiente. Após a adição de 5 ml de glicerol a
mistura foi homogeneizada vigorosamente em vórtex.
27
______________________________________________________________________ Materiais e métodos
Para o ensaio, a mistura de reação foi preparada contendo duas partes de
substrato, duas partes de tampão para LPL (Tris 0,2 M, pH 8,8, albumina bovina livre
de ácidos graxos 6% e NaCl 0,15 M) e uma parte de soro de rato jejuado por 36 horas.
O soro é fonte de apolipoproteina C-II, um co-fator requerido para a ativação da enzima.
Além dos ensaios contendo a amostra, foram realizados ensaios sem a adição da
amostra (Branco) e tubos contendo além da amostra, NaCl 5M, um inibidor da LPL
(Inibido). Em todos os tubos foram adicionados 100 µl da mistura de reação. No tubo
branco foram acrescentados 150 µl de água destilada, no tubo inibido 50 µl de NaCl 5
M e no desconhecido 50 µl de água destilada. Após agitação em vórtex e pré-incubação
a 37ºC por 15 minutos sob agitação, foram acrescentados 100 μl da amostra nos tubos
inibidos e nos tubos experimentais. A incubação foi mantida por 60 minutos a 37ºC sob
agitação (80 ciclos por min) em banho maria. A reação foi interrompida com a adição
de 3,25 ml da mistura de extração de VAUGHAN [(BELFRAGE; VAUGHAN, 1969)
(clorofórmio-heptano-metanol 1,25:1,1:1,41)] seguido de agitação em vórtex. Em
seguida, foi adicionado 1 ml de tampão carbonato-borato 0,1 M (carbonato de potássio
0,05 M e ácido bórico 0,05 M) pH 10,5 e o tubo de reação foi novamente agitado em
vórtex seguido de centrifugação a 1.000 g por 15 min. Alíquotas de 0,8 ml da fase
aquosa superior foram transferidas para frascos de cintilação contendo 9 ml de líquido
de cintilação (SX20-5, Fisher Scientific) para contagem da radioatividade em contador
de cintilação Tri Carb 2100 TR (Packard). Para o cálculo da atividade da enzima, o
DPM da amostra foi subtraído pelo DPM do inibido. A atividade enzimática da LPL foi
expressa em nmol de ácido oléico liberado por minuto por miligrama de proteína. A
dosagem de proteína foi realizada pelo método BCA – Bicinchoninic Acid, Pierce, USA
(SMITH et al., 1985).
28
______________________________________________________________________ Materiais e métodos
3.10 Captação de Glicose in vitro
Os adipócitos (200 µl por frasco) isolados foram incubados em 800 µl de tampão
Krebs-Henseleit-Hepes pH 7,4, contendo 3% de albumina e acrescido de 2-desoxi-1-
[14C]-glicose (0,5 µCi) e glicose 1mM (FOLEY et al., 1980). Após incubação de 3
minutos a 37º C sob agitação constante, a captação da hexose foi interrompida
retirando-se uma alíquota de 200 µl e transferindo-se para tubo de microcentrífuga
contendo o óleo dinonilftalato (0,98 g/l). Como o óleo apresenta densidade
intermediária entre as células e o meio de incubação, obteve-se após uma rápida
centrifugação (30 segundos), uma solução trifásica: na parte inferior do tubo se
encontrava o meio de incubação contendo a 2-desoxi-1-[14C]-glicose não captada pelos
adipócitos, na fase intermediária o óleo e na fase superior os adipócitos. O tubo foi
cortado no meio da fase oleosa e os adipócitos foram dissolvidos em líquido de
cintilação SX20-5 (Fisher Scientific) para contagem da radioatividade em cintilador
Packard Tri-Carb 2100 TR. Os adipócitos foram contados conforme descrito no item
3.6 e o cálculo foi corrigido para 106 células.
3.11 Incorporação de 1-14C-piruvato e 1-14C-glicerol em lipídios totais
Os adipócitos (200 µl por frasco) isolados foram incubados em 800 µl de tampão
Krebs-Henseleit-Hepes pH 7,4 sem glicose e contendo 3% de albumina, acrescido de 1-
[14C]-piruvato (1 mM, 0.5 μCi) ou 1-[14C]-glicerol (1 mM, 1 μCi). Após incubação por
1 hora a 37ºC sob agitação constante, a incorporação dos radioisótopos em lipídios
totais foi interrompida por choque térmico (~ 2ºC) em gelo. As células foram lavadas
com salina para retirar o restante de radioativo não utilizado e posteriormente
29
______________________________________________________________________ Materiais e métodos
adicionou-se clorofórmio:metanol (2:1). A extração dos lipídios totais foi realizada
conforme detalhado no item 3.12.
3.12 Extração dos lipídios totais
A extração dos lipídios totais das células foi realizada segundo o método de
Folch, Lees, & Sloane Stanley, 1957. Após incubação as células foram transferidas para
provetas e foi adicionado clorofórmio:metanol (2:1), as amostras foram então mantidas
em repouso overnight a 4°C. Após este período, a fase superior foi aspirada, deixando
um pequeno filme que foi lavado 3 vezes com a mistura de fase superior (clorofórmio,
metanol e mistura salina na proporção 21,1:337:330). A mistura salina continha CaCl2
0,04%; MgCl2 0,034% e NaCl 0,58%. Para determinação da incorporação dos
substratos marcados com 14C em lipídios totais, uma alíquota do extrato clorofórmico
foi evaporada e o resíduo dissolvido em líquido de cintilação SX20-5 (FISHER
SCIENTIFIC) para posterior contagem da radioatividade em contador de cintilação Tri
Carb 2100 TR.
3.13 Atividade da Fosfoenolpiruvato Carboxiquinase (PEPCK)
Para a medida da atividade da PEPCK, 0,5 g dos TAB foram homogeneizados
em 1 ml de tampão, contendo 0,2 M de sacarose, 20 mM de trietanolamina, 5 mM de 2-
β-mercaptoetanol, 1mM de EDTA, com pH 7,5. O homogenado foi centrifugado a
10.000 g à 4º C durante 15 minutos. A camada lipídica superior foi descartada e o
sobrenadante novamente centrifugado a 100.000 g (4º C) durante 30 minutos para
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______________________________________________________________________ Materiais e métodos
3.14 Atividade da Gliceroquinase (GK)
O método utilizado para a medida da atividade da enzima gliceroquinase, se
baseia na fosforilação de glicerol-14C a glicerol fosfato-14C, determinado conforme o
trabalho de Newsholme, Robinson, & Taylor, (1967).
Para a preparação do homogenado foram utilizados 500 mg de TAB em 1 ml de
tampão contendo KCl 1% e EDTA 1 mM, seguido de centrifugação de 4.000 g por 10
minutos a 4ºC. O infranadante obtido da centrifugação e os tubos contendo 100 µl da
mistura de reação foram pré-incubados a 37º C durante 5 minutos. O meio de reação
continha TRIS 100 mM pH 7,5, ATP 6 mM, MgCl2 4 mM, EDTA 1 mM, NaF 25 mM,
2-β-mercaptoetanol 20 mM, glicerol-U-14C, 10 μCi/mL, glicerol 1 mM, fosfocreatina 10
mM, creatina quinase 26,4 U/ml e albumina 1%. Após a pré-incubação, foram
adicionados 20 µl de amostra nos tubos de reação e 100 µl de etanol 98% e 20 µl de
amostra nos tubos “branco”, que foram mantidos em banho maria a 37ºC por 30
minutos. Após o tempo de incubação, o ensaio foi interrompido pela adição de etanol
98% em todos os tubos (menos o branco), que em seguida foram centrifugados a 2.000
g durante 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante obtido da centrifugação foi utilizado para a
separação do glicerol-14C do glicerol fosfato-14C por cromatografia de papel ascendente
utilizando como solventes: etanol, amônia e água nas proporções 80:4:16
respectivamente, aplicando-se 20 µl do sobrenadante da mistura de reação em papel de
cromatografia Whatman nº 1. Neste sistema, o glicerol não fosforilado move-se à frente
com o solvente e o glicerol fosfato move-se até 5 cm do ponto de aplicação da amostra
quando o solvente se encontra a 30 cm da origem. Ao final da corrida e após a
evaporação do solvente, o papel foi cortado em tiras de 5 cm a partir do ponto de
aplicação da amostra, e as tiras colocadas em frascos contendo líquido de cintilação. A
32
______________________________________________________________________ Materiais e métodos
contagem de radioatividade se deu em contador de cintilação Tri Carb 2100 TR. O
resultado foi expresso em nmol.mg de proteína-1.min-1, sendo a dosagem de proteína
realizada pelo método de LOWRY et al., (1951).
3.15 Lipólise in vitro
Para determinar a lipólise basal e a resposta lipolítica à noradrenalina, alíquotas
de 200 µl da suspensão de adipócitos isolados foram incubados com 800 µl de tampão
Krebs-Henseleit suplementado com 3% de albumina bovina livre de ácidos graxos, 27
mM de HEPES e 5 mM de glicose, pH 7,4, por 60 minutos na presença de 10-6 M de
noradrenalina (Sigma). Para a determinação da lipólise basal, foram incubados frascos
sem noradrenalina, contendo apenas o tampão.
A reação foi interrompida pela imersão dos frascos em gelo, e o meio de
incubação foi aspirado com auxílio de seringas. Após a flotação dos adipócitos
remanescentes, o meio de incubação ausente de adipócitos foi utilizado para
determinação da concentração de glicerol. A taxa lipolítica foi estimada pela liberação
de glicerol no meio de incubação expressa em µmol.106 células-1.h-1. A concentração de
glicerol foi determinada enzimaticamente, com kit comercial (Bioclin-Quibasa).
3.16 Western Blot
Para a determinação do conteúdo de proteínas por western blot os tecidos foram
homogeneizados em tampão RIPA 50 mM de Tris-HCl (pH 7,4) contendo 150 mM de
NaCl; 1 mM de EDTA; 1% de Triton X-100; 0,1% de SDS; 5 µg/ml de aprotinina;
33
______________________________________________________________________ Materiais e métodos
1mM de PMSF; 10 mM de ortovanadato de sódio; 100 mM de NaF; 10 mM de
pirofosfofato de sódio na proporção de 2:1. O homogenado foi centrifugado a 17.000 g
por 20 minutos à 4ºC, para a remoção dos debris celulares e o sobrenadante foi separado
para a realização da eletroforese e dosagem de proteínas pelo método de Lowry
(LOWRY et al., 1951). Aos homogenados foi adicionado tampão da amostra (20% de
glicerol, 125 mM de Tris-HCl, 4% de SDS, 100mM de ditiotreitol, 0,02% de azul de
bromofenol, pH 6,8) na proporção 1:4. Antes da realização da eletroforese, as amostras
foram fervidas a 100ºC por 5 minutos para a desnaturação das proteínas.
Após a corrida eletroforética, o gel foi preparado para a transferência (BioRad
Trans-Blot SD Cell, EUA) de acordo com o método descrito por Towbin, Staehelin, &
Gordon, (1979). Inicialmente, o gel e a membrana de nitrocelulose foram colocados na
solução de transferência contendo 48 mM de Tris, 39 mM de glicina, SDS 10% e 0,2 M
de metanol. Após a montagem do sistema de transferência, as proteínas presentes no gel
de poliacrilamida foram transferidas para a membrana de nitrocelulose, sendo o
processo de transferência realizado durante 30 minutos sob a voltagem fixa de 20 volts,
à temperatura ambiente. Após o término da transferência, a membrana foi submetida a
immunoblot, sendo incubada por 1 hora, sob agitação, à temperatura ambiente em
solução de leite desnatado em pó 10%, diluído em solução TBS-T contendo 0,02 M de
Tris-HCl, 0,16 M de NaCl e 0,1% Tween 20. Após o bloqueio, a membrana foi
incubada overnight a 4ºC com anticorpos primários Os anticorpos primários foram
diluídos em solução de TBS-T contendo 2,5% de albumina bovina e 0,01% de azida
sódica. As membranas foram lavadas com solução de TBS-T, e posteriormente
incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente, com o anticorpo secundário. Após a
lavagem das membranas para remoção do excesso de anticorpo, a membrana foi
revelada em fotodocumentador (BioRad) utilizando kit de quimiluminescência
34
______________________________________________________________________ Materiais e métodos
amplificada (ECL, Amersham). As bandas reveladas foram fotografadas e quantificadas
por densitometria utilizando o software Image Lab (BioRad). Após a quantificação
densitométrica das proteínas, o valor obtido na análise foi dividido pela densitometria
das proteínas constitutivas ß-actina ou α-tubulina.
Os anticorpos primários utilizados foram acetil-CoA carboxilase (ACC,
#3676), ácido graxo sintase (#3189), AKT (#9272), fosfo-AKTSer473 (#9271),
ATGL (#2138), CREB (#9197), fosfo-CREBSer133 (#9198), GLUT-4 (#2213), HSL
(#4107), fosfo-HSLSer660 (#4126), PPARγ (#2340), STAT3 alpha (#8768), fosfo-
STAT3Tyr705 (#9138) da Cell Signaling; α-tubulina (SC-32293), β-actina (SC-81178),
β3-AR (SC-50436), aquaporina 7 (SC-28625), GPD2 (SC-161682), PEPCK (SC-
32879) e TNF-R1 (SC-1070) da Santa Cruz Biotechnology; gliceroquinase (ab126599)
e fosfo ATGLSer406.(ab135093) da Abcam e ATF3 (HPA001562) e α-2A-AR
(SAB4500548) da Sigma Aldrich.
Os anticorpos secundários utilizados foram: IgG goat anti-mouse da KPL, IgG
anti-rabbit (#7074) da Cell Signaling e IgG anti-goat (A-5420) da Sigma, todos
conjugados à peroxidase.
3.17 Real Time (RTqPCR)
O RNA das amostras dos diferentes tecidos foi extraído pelo método do TrizolTM
(Invitrogen, EUA) e quantificado por densidade óptica em espectrofotômetro (260 nm).
Após tratamento de 1µg de RNA total com DNase, foi adicionado o primer de oligo
(dT) (20 pmol; Invitrogen, EUA) em volume total de 11µl, sendo as misturas preparadas
em água DEPC (água milli-Q tratada com dietil-pirocarbonato 0,01% e autoclavada).
35
______________________________________________________________________ Materiais e métodos
Após o aquecimento a 70ºC por 5 minutos e posterior resfriamento a 4oC, seguiu-se a
adição da enzima transcriptase reversa e demais reagentes (tampão de reação, dNTP,
água, MgCl2 e 1µl de ImProm-IITM Reverse T recombinante) e assim, a submissão ao
ciclo 25ºC - 42ºC e interrompida por aquecimento a 70ºC por 15 minutos. Os cDNAs
foram posteriormente submetidos ao PCR em tempo real utilizando-se Platinum®
SYBR® Green qPCR Supermix UDG (Invitrogen) com sequencias de primers
específicos descritas na Tabela II. Os resultados foram adquiridos em sistema de
detecção Perkin-Elmer ABI Prism 7500 com os seguintes parâmetros: 50oC (2 minutos),
95oC (2 minutos), 40 ciclos de 95oC (15 segundos), 57oC (30 segundos), 60oC (30
segundos), seguido pelo ciclo de dissociação para verificação de um produto através de
análise pela curva melting. Para a análise do RNAm, o nível relativo de expressão do
gene de interesse foi calculado em referência à expressão de RPL32 (ribosomal protein
L32), que representam o controle interno endógeno (housekeeper gene), utilizando-se o
método de 2−ΔΔCT (LIVAK; SCHMITTGEN, 2001).
Tabela II - Sequências dos primers utilizados para as reações de PCR em tempo real. Gene Forward Reverse
PAI-1 CCTCTTCATGGGCCAAGT GGTAAGGAGGAGTTGCCTTC
MCP-1 CTGGATCGGAACCAAATGAG AAGGCATCACAGTCCGAGTC
L32 TCTGGTGAAGCCCAAGATCG CTCTGGGTTTCCGCCAGTT
IL-6 AGTTGCCTTCTTGGGACTGA CCTCCGACTTGTGAAGTGGT
LPL GACGTGTCTAACTGCACATTCA CCCGTTACCGTCCATCCAT
RGS-2 AGAAAATGAAGCGGACACTCTT TTGCCAGTTTTGGGCTTC
36
______________________________________________________________________ Materiais e métodos
3.18 Análise estatística
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM). A
análise estatística utilizou o teste “t de Student”. A área sob a curva para o cálculo do
TTG foi calculado utilizando o método trapezoide (GraphPad Prism 5). Para a análise
da frequência de tamanho dos adipócitos e da atividade lipolítica foi utilizada a análise
de variância em duas vias (ANOVA two way) e o teste de Bonferroni para determinar a
diferença entre as faixas de tamanho. Adotou-se nível de significância de 5% em todos
os testes. Para a análise dos resultados utilizou-se o programa SigmaPlot for Windows
versão 11.0 (Systat Software INC.).
37
______________________________________________________________________ Resultados
4. RESULTADOS
Os resultados do presente estudo serão apresentados em quatro subitens, sendo:
1) caracterização metabólica do modelo de obesidade induzida por dieta HL, incluindo
os parâmetros gerais, a resistência à insulina e o perfil inflamatório dos camundongos;
2) síntese de TAG, incluindo a origem dos ácidos graxos e a geração do G3P; 3)
degradação do triacilglicerol (lipólise) e, por fim, 4) as vias de sinalização envolvidas
no fenótipo observado.
4.1 Caracterização metabólica do modelo experimental
4.1.1 Massa corporal
A massa corporal foi avaliada a cada três dias (Figura 4) e teve como finalidade
a padronização do modelo em nosso laboratório e o acompanhamento da instalação do
fenótipo da obesidade. Desde a primeira semana, os camundongos alimentados com a
dieta HL apresentaram maior massa corporal (15%) quando comparados aos
camundongos alimentados com a dieta controle. Até a sexta semana de ingestão, o
ganho de massa corporal foi maior nos camundongos alimentados com a dieta HL, no
entanto, o ganho de massa corporal foi similar entre os grupos na sétima e oitava
semana experimental. Os camundongos alimentados com a dieta HL apresentaram ao
final das 8 semanas experimentais um aumento de 27% na massa corporal quando
comparados aos controles (Figura 5A). O ganho de massa total, calculado pela diferença
entre a massa corporal final e inicial, foi em média 50% maior nos animais alimentados
com a dieta HL quando comparados aos controles (Figura 5B). Ao final das 8 semanas
38
______________________________________________________________________ Resultados
experimentais, a maior massa corporal pode ser facilmente observada nos animais HL,
conforme demonstrado na Figura 6.
-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1015
25
35
45
55
Controle Hiperlipídica
**
**
**
* *
Semanas
Pes
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al (
g)
Figura 4 - Efeito da dieta hiperlipídica no ganho de massa corporal de camundongos alimentados durante 8 semanas. Cada ponto representa a média±EPM (n=30). *P<0,05.
0
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0
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Controle Hiperlipídica
A B
Figura 5 - Efeito da dieta hiperlipídica administrada por 8 semanas na massa corporal final (A) e ganho de massa corporal total (B) em camundongos. As colunas e barras representam a média±EPM (n=30). *P< 0,05.
___
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4.1.2 Par
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39
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40
______________________________________________________________________ Resultados
Tabela 2 – Concentrações séricas de ácidos graxos livres, glicerol, triacilglicerol, colesterol, corticosterona, leptina e adiponectina em camundongos alimentados após 8 semanas com dieta controle ou hiperlipídica.
Controle Hiperlipídica
Ácidos graxos livres (µmol.ml-1) 0,63 ± 0,07 0,74 ± 0,08
Glicerol (µmol.ml-1) 0,13 ± 0,01 0,18 ± 0,01*
Triacilglicerol (mg.ml-1) 1,56 ± 0,12 1,90 ± 0,23
Colesterol (mg.ml-1) 1,02 ± 0,03 0,96 ± 0,05
Corticosterona (µg.ml-1) 0,10 ± 0,01 0,07 ± 0,01*
Leptina (ng.ml-1) 29,67 ± 1,27 29,52 ± 1,86
Adiponectina (µg.ml-1) 2,54 ± 0,15 2,29 ± 0,20
Os valores representam média±EPM (n=10). *P< 0,05.
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Controle Hiperlipídica
A B
DC
Figura 7 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas na concentração sérica de triacilglicerol (A), colesterol (B), ácidos graxos livres (C) e glicerol (D) em camundongos. As barras e colunas representam a média±EPM (n=7). *P< 0,05.
41
______________________________________________________________________ Resultados
0
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Controle Hiperlipídica
A B C
Figura 8 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas na concentração sérica de adiponectina (A), leptina (B) e corticosterona (C) em camundongos. As barras e colunas representam a média±EPM (n=10). *P< 0,05.
4.1.3 Massa do tecido adiposo
A dieta HL, após 8 semanas, induziu um aumento na massa do RETRO (12%),
EPI (38%) e mesentérico (78%), mas promoveu uma redução de 17% na massa do
TAM, quando comparado aos camundongos alimentados com a dieta controle (Tabela
3, Figura 9).
Tabela 3 - Massa dos tecidos adiposos brancos (TAB) retroperitoneal (RETRO), epididimal (EPI) e mesentérico (Mes) e do tecido adiposo marrom (TAM) de camundongos alimentados com dieta controle ou hiperlipídica por 8 semanas.
g de tecido.100g de PC-1 Controle Hiperlipídica
RETRO 1,17 ± 0,03 1,32 ± 0,05*
EPI 3,75 ± 0,10 5,20 ± 0,18*
Mes 1,72 ± 0,07 3,07 ± 0,09*
TAM 0,46 ± 0,03 0,38 ± 0,02*
Os valores representam média±EPM (n=30). *P< 0,05.
42
______________________________________________________________________ Resultados
0
2
4
6
RETRO EPI Mes TAM
*
*
*
*
Pe
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g.1
00
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e P
C-1
)
Figura 9 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas na massa dos tecidos adiposos brancos RETRO (RETRO), epididimal (EPI) e mesentérico (Mes) e marrom (TAM) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=30). *P< 0,05.
4.1.4 Análise histológica do tecido adiposo
A dieta HL não induziu alteração no tamanho dos adipócitos (Figura 10A) do
RETRO ou na frequência de distribuição das células em diferentes intervalos de áreas
(Figuras 10B). No entanto, no EPI é possível observar uma redução de 23% no diâmetro
médio das células nos camundongos alimentados com a dieta HL (Figura 10A). Esta
redução se mostra evidente por uma maior concentração de células na faixa de 240-
1000 µm2 (Figura 10C).
43
______________________________________________________________________ Resultados
0
500
1000
1500
2000
Controle Hiperlipídica
*
RETRO EPI
Áre
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 110
10
20
30
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*
*
EPI
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(%)
Faixas de frequencia de
áreas (M2)1 - <2392 - 240-4993 - 500-9994 - 1000-14995 - 1500-19996 - 2000-24997 - 2500-29998 - 3000-34999 - 3500-399910- 4000-449911- 4500-499912 - >5000
A
B C
Figura 10 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas na área (A) e na frequência de distribuição do diametro dos adipócitos dos TAB retroperitoneal (RETRO, B) e epididimal (EPI, C) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=6). *P< 0,05, teste t de Student, frequências ANOVA two-way com Bonferroni.
Nas imagens capturadas no aumento de 100X foi observado um maior infiltrado
inflamatório nos TAB dos camundongos alimentados com a dieta HL quando
comparado aos controles. Em relação ao RETRO, os camundongos alimentados com a
dieta HL parecem não ter um efeito inflamatório tão pronunciado quanto ao EPI. As
estruturas “crown-like”, apontadas pelas setas, são visualizadas no TAB dos
camundongos alimentados com a dieta HL, contudo a presença dessas estruturas é
menos frequente no TAB RETRO (Figura 11).
___
FiguEpidsemamacr
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__________
ura 11 - Secdidimal de anas. As serófagos. Co
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45
______________________________________________________________________ Resultados
Tabela 4 - Concentração sérica de glicose e insulina em camundongos alimentados após 8 semanas com dieta controle ou hiperlipídica.
Controle Hiperlipídica
Glicemia (mg.dl-1) 177,25 ± 12,16 251,3 ± 17,59*
Insulina (mUI.ml-1) 35,18 ± 5,54 195,76 ± 60,26*
Os valores representam média±EPM (n=8). *P< 0,05.
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)
Controle Hiperlipídica
A B
Figura 12 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas na concentração sérica de glicose (A) e insulina (B) em camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=10). *P< 0,05.
A dieta HL induziu uma notável intolerância à glicose nos camundongos. Após
45, 60, 90 e 120 minutos da sobrecarga de glicose a glicemia foi maior nos
camundongos alimentados com a dieta HL quando comparada aos alimentados com a
dieta controle (Figura 13A). O pico de glicemia é maior após 120 minutos nos animais
que receberam dieta HL, e após este tempo, a glicemia retorna ao valor normal nos
controles, mas não nos animais HL. Observa-se um reduzido clearance de glicose,
representado por um aumento de mais de 55% da área sob a curva dos valores
glicêmicos após sobrecarga dessa hexose nos animais alimentados com a dieta HL
quando comparados aos controles (Figura 13B).
46
______________________________________________________________________ Resultados
0 15 30 45 60 75 90 105 1200
200
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**
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g.dl
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120
min
)
A
B
Figura 13 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas na glicemia nos tempos 0, 10, 20, 30, 45, 60, 90, e 120 min (A) e na área sob a curva (B) do teste de tolerância à glicose em camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=6). *P< 0,05.
Os camundongos alimentados com a dieta HL apresentaram uma redução de
50% na fosforilação de AKT em serina 473 (Ser473) no EPI, mas não apresentaram
alteração nesta sinalização no RETRO quando comparados aos camundongos
alimentados com a dieta controle (Figura 14).
47
______________________________________________________________________ Resultados
0.0
0.5
1.0
1.5
RETRO EPI
*
Controle Hiperlipídica
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CT HL CT HL
RETRO EPI
AKT (62 kDa)
pA
KT
Se
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s)
Figura 14 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas no conteúdo proteico da AKT fosforilada em serina 473 (pAKTSer473) nos tecidos adiposos branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) em camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=6). *P< 0,05.
4.1.6 Perfil inflamatório
A dieta hiperlipídica induziu uma redução de 40% na concentração de
adiponectina apenas no EPI (Figura 15B). Esta dieta não promoveu mudanças na
concentração de TNF-α, IL-6 e IL-10 tanto no RETRO (Figura 15A) quanto no EPI
após 8 semanas de ingestão (Figura 15B).
0
20
40
60
80
100
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RETRO
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EPI
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)
Controle Hiperlipídica
A B
Figura 15 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas na concentração do TNFα, IL-6, IL-10 e adiponectina (Adipo) em homogenados do tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO, A) e epididimal (EPI, B) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=5). *P< 0,05.
48
______________________________________________________________________ Resultados
Assim como não houve alteração nas concentrações de TNF-α nos tecidos
adiposos, também não foi observada alteração no conteúdo proteico do receptor de
membrana de TNF-α nos TAB RETRO e EPI de camundongos alimentados com a dieta
HL quando comparados aos alimentados com a dieta controle (Figura 16).
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Controle Hiperlipídica
RETRO EPI
TNF R (55 kDa)
-Tubulina (55 kDa)
CT HL CT HL
RETRO EPI
Re
cep
tor
de
TN
F-
1/
-tu
bu
lina
(% d
os
con
tro
les)
Figura 16 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas no conteúdo proteico do TNF R1 nos tecidos adiposos retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=6-7). *P< 0,05.
A ingestão de dieta HL também não alterou a expressão gênica de IL-6, MCP-1
e PAI-1 no RETRO (Figura 17A). Contudo no EPI há aumento de quatro vezes no
mRNA da MCP-1 e de 2,5 vezes no do PAI-1 (Figura 17B) nos camundongos HL
quando comparados aos controles, sem alteração na expressão gênica de IL-6.
49
______________________________________________________________________ Resultados
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Il-6 MCP-1 PAI-1
RETROm
RN
A
(% L
32
)
0
1
2
3
4
5
Il-6 MCP-1 PAI-1
*
*
EPI
mR
NA
(%
L3
2)
Controle Hiperlipídica
A B
Figura 17 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas no mRNA da IL-6, MCP-1 e PAI-1 nos tecidos adiposos retroperitoneal (RETRO, A) e epididimal (EPI, B) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=6-7). *P< 0,05.
50
______________________________________________________________________ Resultados
4.2. Síntese de triacilglicerol: origem dos ácidos graxos e geração do
glicerol-3-fosfato
Para avaliar a síntese de TAG no RETRO e EPI dos camundongos alimentados
com a dieta HL, foram avaliadas as vias de síntese de ácidos graxos (síntese de novo e
captação da circulação) (4.2.1) e as de glicerol-3-fosfato (via glicolítica,
gliceroneogênese e fosforilação direta do glicerol) (4.2.2).
4.2.1 Fontes de ácidos graxos
Os ácidos graxos utilizados na síntese da molécula de TAG podem ser
provenientes da síntese de novo, avaliada in vivo pela administração de 3H2O e in vitro
em adipócitos isolados; ou da captação de AG pré-formados provenientes de
lipoproteínas circulantes pela ação da LPL; ou da reciclagem de AG endógenos
provenientes da hidrólise do TAG.
4.2.1.1SíntesedeAGdenovo
A dieta HL induziu um aumento na síntese de ácidos graxos tanto in vivo (52%)
quanto in vitro (254%) no tecido adiposo EPI (Tabela 5 e Figura 18). Contudo, no
RETRO a dieta HL induziu um aumento somente na síntese de ácidos graxos avaliada
in vitro (57%) (Tabela 5 e Figura 18B).
51
______________________________________________________________________ Resultados
Tabela 5 – Velocidade de síntese de ácidos graxos de novo avaliada in vivo e in vitro no tecido adiposo branco (TAB) retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos alimentados com a dieta controle ou hiperlipídica por 8 semanas.
TAB Controle Hiperlipídica
in vivo(µmol.g-1.h-1)
RETRO 5,30 ± 1,13 6,48 ± 0,40
EPI 4,30 ± 0,25 6,53 ± 0,34*
in vitro(nmol.106 cél-1.h-1)
RETRO 3,99 ± 0,19 6,24 ± 0,70*
EPI 1,17 ± 0,13 4,15 ± 0,18*
Os valores representam média±EPM (n=5 ou 6). *P <0,05.
52
______________________________________________________________________ Resultados
0
2
4
6
8
RETRO EPI
Controle Hiperlipídica
*S
ínte
sed
e n
ovo
de
AG
in v
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(µm
ol.g
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cid
o-1
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ra-1
)
0
2
4
6
8
RETRO EPI
*
*
Sín
tese
de
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e A
Gin
vitr
o(n
mo
l.10
6 c
éls
-1.h
ora
-1)
A
B
Figura 18 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas na velocidade de síntese in vivo (A) e in vitro (B) de ácidos graxos de novo no tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=5-6). *P< 0,05.
No RETRO dos camundongos alimentados com a dieta HL houve redução de
aproximadamente 60% no conteúdo da ACC quando comparado aos camundongos
53
______________________________________________________________________ Resultados
controles, já o EPI não apresentou alteração no conteúdo desta enzima (Figura 19A). A
dieta HL não alterou o conteúdo proteico da AGS no RETRO e EPI (Figura 19B).
0.0
0.5
1.0
1.5
RETRO EPI
AGS (281 kDa)
-Tubulina (55 kDa)
CT HL CT HL
RETRO EPI
AG
S/
-tu
bu
lina
(% d
os
con
tro
les)
0.0
0.5
1.0
1.5
*
ACC (265 kDa)
-Tubulina (55 kDa)
CT HL CT HL
RETRO EPI
RETRO EPI
AC
C/
-tu
bu
lina
(% d
os
con
tro
les)
A
B
Controle Hiperlipídica
Figura 19 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas no conteúdo proteico das enzimas acetil-CoA carboxilase (ACC) (A) e ácido graxo sintase (AGS) (B) nos tecidos adiposos branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=5-7). *P< 0,05.
4.2.1.2Lipaselipoproteica
A captação de AG pré-formados provenientes da circulação, avaliada pela
atividade e expressão gênica da LPL foi diferencialmente regulada pela dieta HL nos
tecidos avaliados.
A dieta HL induziu uma redução de 80% na atividade da LPL no RETRO, mas
induziu um aumento de 100% na atividade desta enzima no EPI (Tabela 6, Figura 20A).
A expressão gênica da LPL não foi alterada pela dieta HL no RETRO, mas foi
54
______________________________________________________________________ Resultados
aumentada em 7 vezes no EPI dos camundongos alimentados com a dieta HL quando
comparados aos controles (Figura 20B).
Tabela 6 - Atividade da lípase lipoproteica no tecido adiposo branco (TAB) retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos controles e alimentados com dieta hiperlipídica por 8 semanas.
nmol de ácido oléico. min-1 . mg prot-1 Controle Hiperlipídica
RETRO 6,62 ± 1,48 1,34 ± 0,54*
EPI 4,87 ± 0,74 10,08 ± 1,79*
Os valores apresentam média±EPM (n=8). *P< 0,05.
0
5
10
15
RETRO EPI
*
*
Ativ
ida
de
da
LP
L(n
Mo
l AG
.mg
pro
t-1.m
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)
0
2
4
6
8
10
*
RETRO EPI
mR
NA
LP
L/L
32
(%
do
s co
ntr
ole
s)
A B
Controle Hiperlipídica
Figura 20 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas na atividade (A) e expressão gênica (B) da lipase lipoproteica (LPL) no tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=7-8). *P< 0,05.
55
______________________________________________________________________ Resultados
Tabela 7 – Resumo dos efeitos da dieta HL sobre as fontes de ácido graxo no TAB retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos alimentados com dieta por 8 semanas.
RETRO EPI
Síntese de AG in vivo ≈
Síntese de AG in vitro
Acetil CoA Carboxilase ≈
Ácido Graxo Sintase ≈ ≈
Lipase lipoprotéica (atividade)
Lipase lipoprotéica (mRNA) ≈
Os símbolos representam não alteração (≈), aumento () ou redução () observada nos animais que ingeriram dieta HL em relação aos controles.
56
______________________________________________________________________ Resultados
4.2.2. Vias de síntese de glicerol-3-fosfato
Foram avaliadas as três vias de geração de G3P: via glicolítica; via
gliceroneogênica e fosforilação direta do glicerol no RETRO e EPI de camundongos
controles e alimentados com dieta HL por 8 semanas.
4.2.2.1Avaliaçãodaviaglicolítica
O índice de captação de glicose pelo RETRO e EPI foi avaliado em adipócitos
isolados de camundongos controles e alimentados com a dieta HL após incubação com
2-desoxi-1-[14C]-D-glicose. A dieta HL induziu uma marcante redução (3,5 e 6 vezes)
na captação de glicose em adipócitos do RETRO e EPI respectivamente (Tabela 8,
Figura 21).
Tabela 8 - Índice de captação de 2-desoxi-1-[14C]-D-glicose in vitro no tecido adiposo branco (TAB) retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos controles e alimentados com dieta hiperlipídica.
nmol.106 células-1.min-1 Controle Hiperlipídica
RETRO 2,45 ± 0,48 0,696 ± 0,18*
EPI 2,16 ± 0,06 0,365 ± 0,11*
Os valores apresentam média±EPM (n=5 ou 6) *P < 0,05.
57
______________________________________________________________________ Resultados
0
1
2
3
4
Controle Hiperlipídica
RETRO EPI
**
Ca
pta
ção
de
2-d
eso
xi-1
-[1
4 C]-
D-g
lico
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mo
l.10
6 c
élu
las-1
.min
-1)
Figura 21 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas no índice de captação de 2-desoxi-1-[14C]-D-glicose in vitro em adipócitos isolados dos tecidos adiposos retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=5-6). *P< 0,05.
O conteúdo proteico do transportador de glicose GLUT-4 também foi utilizado
para a avaliação indireta da via glicolítica. A dieta HL induziu uma redução de
aproximadamente 50% do conteúdo proteico de GLUT-4 tanto no RETRO quanto no
EPI quando comparados aos TAB de camundongos alimentados com a dieta controle
(Figura 22).
0.0
0.5
1.0
1.5
Controle Hiperlipídica
*
RETRO EPI
*
Glut-4 (55 kDa)
-Tubulina (55 kDa)
CT HL CT HL
RETRO EPI
Glu
t-4
/-t
ub
ulin
a(%
do
s co
ntr
ole
s)
Figura 22 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas no conteúdo proteico de GLUT-4 nos tecidos adiposos branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=5-6). *P< 0,05.
58
______________________________________________________________________ Resultados
4.2.2.2Avaliaçãodaviagliceroneogênica
A via gliceroneogênica foi avaliada em animais controles e tratados com dieta
HL através da velocidade de incorporação de 1-[14C]-piruvato em lipídios totais e da
atividade e conteúdo da PEPCK, enzima chave desta via.
A velocidade de incorporação de 1-[14C]-piruvato em lipídios totais em células
isoladas dos TAB foi reduzida em 4 vezes no RETRO e 3,5 vezes no EPI de animais
alimentados com dieta HL quando comparados aos animais controles (Tabela 9 e Figura
23).
Tabela 9 - Incorporação de 1-[14C]-piruvato em lipídios totais do tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos controles e alimentados com a dieta hiperlipídica.
nmol.106 células-1.min-1 Controle Hiperlipídica
RETRO 41,55 ± 4,52 14,76 ± 1,40*
EPI 50,91 ± 2,19 4,75 ± 0,39*
Os valores representam média±EPM (n=6). *P < 0,05.
0
20
40
60
RETRO EPI
Controle Hiperlipídica
**
Inco
rpo
raçã
o d
e 1
-[1
4 C]-
piru
vato
(nm
ol.1
06 c
élu
las-1
.min
-1)
Figura 23 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas na incorporação de 1-[14C]-piruvato em lipídios totais em adipócitos isolados do tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=6). *P< 0,05.
59
______________________________________________________________________ Resultados
A atividade e conteúdo da PEPCK, enzima chave da via gliceroneogenica, não
foram alterados no RETRO e EPI de camundongos alimentados com a dieta HL quando
comparados aos camundongos controles (Tabela 10, Figura 24).
Tabela 10 - Atividade da PEPCK no tecido adiposo branco (TAB) retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos controles e alimentados com a dieta hiperlipídica.
nmol de malato. minuto-1 . mg prot-1 Controle Hiperlipídica
RETRO 11,41 ± 1,46 12,50 ± 1,24
EPI 6,56 ± 1,37 8,50 ± 0,96
Os valores representam média±EPM (n=8). *P < 0,05.
0
5
10
15
RETRO EPI
Controle Hiperlipídica
Ativ
ida
de
da
PE
PC
K(n
mo
l de
ma
lato
. m
inu
to-1
.mg
pro
t-1)
0.0
0.5
1.0
1.5
RETRO EPI
PEPCK (62 kDa)
-Tubulina (55 kDa)
CT HL CT HL
RETRO EPI
PE
PC
K/
-tu
bu
lina
(% d
os
con
tro
les)
A
B
Figura 24 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas na atividade (A) e conteúdo proteico (B) da fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK) no tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=5-8). *P< 0,05.
60
______________________________________________________________________ Resultados
4.2.2.3Avaliaçãodafosforilaçãodiretadoglicerol
O processo de fosforilação direta do glicerol foi estimado pela velocidade de
incorporação de gicerol-U-[14C] em lipídos totais em adipócitos isolados e pela
atividade e conteúdo proteico da GK no TAB de animais controles e alimentados com a
dieta HL.
A velocidade de incorporação de glicerol-U-[14C] em lipídios totais nos
adipócitos isolados do RETRO foi reduzida em 44% nos camundongos alimentados
com a dieta HL quando comparados aos controles (Tabela 11 e Figura 25). No entanto,
a ingestão de dieta HL induziu um aumento de 83% na velocidade de incorporação de
glicerol-U-[14C] em lipídios totais nos adipócitos isolados do EPI quando comparados
aos controles.
Tabela 11 - Incorporação de glicerol-U-[14C] em lipídios totais em adipócitos isolados do tecido adiposo branco (TAB) retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos controles e alimentados com dieta hiperlipídica.
nmol.106 células-1.min-1 Controle Hiperlipídica
RETRO 8,81 ± 1,54 4,87 ± 1,46*
EPI 5,26 ± 0,17 9,66 ± 0,81*
Os valores representam média±EPM (n=10 ou 11). *P < 0,05.
61
______________________________________________________________________ Resultados
0
5
10
15
Controle Hiperlipídica
RETRO EPI
*
*
Inco
rpo
raçã
o d
e G
lice
rol-
U-[
14 C
](n
mo
l.10
6 c
élu
las-1
.min
-1)
Figura 25 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas na incorporação de glicerol-U-[14C] em lipídios totais em adipócitos isolados do tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=10-11). *P< 0,05.
A dieta hiperlipídica induziu um aumento na atividade da GK, enzima que
fosforila o glicerol a glicerol-3-fosfato, tanto no RETRO (3,4 vezes) quanto no EPI (2,5
vezes) quando comparado aos camundongos controles (Tabela 12 e Figura 26A). Da
mesma forma, a administração da dieta HL induziu um aumento no conteúdo proteico
da GK tanto no RETRO (40%) quanto no EPI (90%) quando comparados aos
camundongos alimentados com a dieta controle (Figura 26B).
Tabela 12 - Atividade da gliceroquinase no tecido adiposo branco (TAB) retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos controles e alimentados com dieta hiperlipídica.
nmol . minuto-1 . mg prot-1 Controle Hiperlipídica
RETRO 3,73 ± 1,20 12,89 ± 2,13*
EPI 6,60 ± 1,47 16,28 ± 3,38*
Os valores representam média±EPM (n=6). *P < 0,05.
62
______________________________________________________________________ Resultados
0
10
20
30
*
*
RETRO EPI
Controle Hiperlipídica
Ativ
ida
de
da
glic
ero
qu
ina
se(n
mo
l . m
inu
to-1
.mg
pro
t-1)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
RETRO EPI
*
* GK (61 kDa)
-Tubulina (55 kDa)
CT HL CT HL
RETRO EPI
Glic
ero
qu
ina
se/
-tu
bu
lina
(% d
os
con
tro
les)
A
B
Figura 26 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas na atividade (A) e conteúdo proteico (B) da gliceroquinase (GK) no tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI). As barras e colunas representam média±EPM (n=5). *P< 0,05.
A dieta HL não induziu alterações no conteúdo da enzima glicerol-3-fosfato
desidrogenase (GPD2), responsável por catalisar a redução de diidroxiacetona fosfato a
G3P (Figura 27A). Adicionalmente, a dieta hiperlipídica não promoveu alteração no
conteúdo proteico da Aqp7 no EPI, um canal de membrana que promove o transporte de
glicerol pela membrana no TAB, mas induziu uma redução de cerca de 50% neste
parâmetro no RETRO quando comparado aos animais controles (Figura 27B).
63
______________________________________________________________________ Resultados
0.0
0.5
1.0
1.5
RETRO EPI
GPD2 (83 kDa)
-Tubulina (55 kDa)
CT HL CT HL
RETRO EPIG
3P
de
sid
rog
en
ase
2/
-tu
bu
lina
(% d
os
con
tro
les)
A
B
0.0
0.5
1.0
1.5
RETRO EPI
*
Aqp 7 (37 kDa)
-Tubulina (55 kDa)
CT HL CT HL
RETRO EPI
Aq
ua
po
rin
a 7
/-T
ub
ulin
a(%
do
s co
ntr
ole
s)
Controle Hiperlipídica
Figura 27 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas no conteúdo da enzima glicerol-3-fosfato desidrogenase (GPD2) (A) e da aquaporina 7 (Aqp7) (B) no tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=6-12). *P< 0,05.
64
______________________________________________________________________ Resultados
Tabela 13 – Resumo dos efeitos da dieta HL sobre as vias de síntese de G3P no TAB retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos alimentados com dieta por 8 semanas.
Retro Epi
Captação de glicose
GLUT-4
Incorporação de piruvato
PEPCK (atividade e conteúdo) ≈ ≈
Incorporação de glicerol
GK (atividade e conteúdo)
GPD2 ≈ ≈
Aquaporina 7 ≈
Os símbolos representam não alteração (≈), aumento () ou redução () observada nos animais que ingeriram dieta HL em relação aos controles.
65
______________________________________________________________________ Resultados
4.3. Degradação do TAG: Lipólise
Foram realizados ensaios para avaliar a lipólise basal e estimulada pela presença
do agente lipolítico noradrenalina (10-6 M) no meio de incubação. Os resultados
mostram que no estado basal, sem estimulação noradrenérgica, a atividade lipolítica foi
semelhante entre os adipócitos de camundongos controles e HL (Figura 28). Quando
incubadas com noradrenalina, tanto as células isoladas dos animais controles quanto dos
animais HL tiveram aumento da atividade lipolítica (RETRO 5,4 e EPI 6,7 vezes),
porém a lipólise estimulada por noradrenalina foi atenuada nos animais HL em ambos
os tecidos (RETRO 57% e EPI 25%) quando comparadas com os adipócitos dos
animais controle (tabela 9 e figura 15). Na comparação da resposta dos dois TAB
estudados ao estímulo com noradrenalina, é interessante notar que o EPI é 2 vezes mais
responsivo ao agente lipolítico do que o retro nos animais controles, e 4x nos animais
HL (Figura 29).
A dieta HL induziu uma redução de 52% no conteúdo do receptor β3 no RETRO
e de 50% no EPI quando comparados aos animais controles (Figura 30A). Já o conteúdo
dos receptores α2 não foi alterado pela ingestão de dieta HL em nenhum dos tecidos
estudados (Figura 30B).
A dieta HL induziu uma redução de 80% no conteúdo da LHS fosforilada no
EPI e de 77% no RETRO quando comparados aos camundongos controles (Figura
31A). De maneira semelhante, o conteúdo da ATGL fosforilada foi reduzido em 62%
no TAB EPI e em 61% no RETRO de camundongos alimentados com a dieta HL
quando comparados aos controles (Figura 31B).
66
______________________________________________________________________ Resultados
0
1
2
3
*
Basal Nor (10-6 M)
RETRO
*
#
Glic
ero
l (M
ol.1
06 C
els
-1)
0
2
4
6
8
10
Basal Nor (10-6 M)
*
EPI
#*
Glic
ero
l (M
ol.1
06 C
els
-1)
Controle Hiperlipídica
A B
Figura 28 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas na atividade lipolítica basal e estimulada por 10-6 M de noradrenalina (NOR) no tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO, A) e epididimal (EPI, B) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=5). *P< 0,05 vs. basal, #P< 0,05 vs. controle, ANOVA two-way com Bonferroni.
0
2
4
6
8
10
Controle Hiperlipídica
RETRO EPI
*
*
#
#
Glic
ero
l (M
ol.1
06 C
els
-1)
Figura 29 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas na atividade lipolítica estimulada por 10-6 M de noradrenalina no tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=5). *P< 0,05 vs. controle, #P< 0,05 vs. retro, ANOVA two-way com Bonferroni.
67
______________________________________________________________________ Resultados
0.0
0.5
1.0
1.5
RETRO EPI
* *
3-R (44 kDa)
CT HL CT HL
RETRO EPI
-Tubulina (55 kDa)
Controle Hiperlipídica
3-R
/-t
ub
ulin
a(%
do
s co
ntr
ole
s)
0.0
0.5
1.0
1.5
RETRO EPI
2-R (48 kDa)
CT HL CT HL
RETRO EPI
-Tubulina (55 kDa)
2
-R/
-tu
bu
lina
(% d
os
con
tro
les)
A
B
Figura 30 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas no conteúdo dos receptores adrenérgicos β3 (A) e α2 (B) no tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos alimentados. As barras e colunas representam média±EPM (n=7). *P< 0,05.
68
______________________________________________________________________ Resultados
0.0
0.5
1.0
1.5
Controle Hiperlipídica
RETRO EPI
pLHSSer660
CT HL CT HL
RETRO EPI
LHS (81 kDa)
* *
pL
HS
Se
r66
0/L
HS
(% d
os
con
tro
les)
0.0
0.5
1.0
1.5
RETRO EPI
* *
pA
TG
LS
er4
06/A
TG
L(%
do
s co
ntr
ole
s)
pATGLSer406
CT HL CT HL
RETRO EPI
ATGL (55 kDa)
A
B
Figura 31 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas no conteúdo da lipase hormônio sensível fosforilada em serina 660 (pLHSSer660) (A) e lipase de triacilglicerol do adipócito fosforilada em serina 406 (pATGLSer406) (B) no tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=7). *P< 0,05.
69
______________________________________________________________________ Resultados
4.4. Vias de sinalização
Para elucidar os possíveis mecanismos envolvidos na regulação dos processos
metabólicos no TAB de camundongos alimentados com a dieta HL, foram avaliados os
conteúdos do PPARγ, ATF3, pCREB, e pSTAT3, e além da expressão do mRNA do
RGS2.
A dieta HL induziu uma redução de 48% no conteúdo proteico de PPARγ no
RETRO e de 64% no EPI quando comparados a dieta controle (Figura 32).
O conteúdo total de ATF3 teve um acentuado aumento no TAB de camundongos
alimentados com a dieta HL em ambos os tecidos avaliados, o aumento foi de
aproximadamente 5 vezes em ambos os tecidos (Figura 33A). Nestes mesmos animais,
o conteúdo de CREB fosforilado em serina 133 teve um aumento de 60% apenas no
EPI, permanecendo inalterado no RETRO quando comparados aos controles (Figura
33B).
A expressão gênica do RGS2 está aumentada em 70% no EPI de camundongos
alimentados com a dieta HL quando comparados aos controles. No RETRO não houve
alteração na expressão desse gene (Figura 34).
A fosforilação de STAT3 em tirosina 705 foi alterada pela ingestão de dieta HL
de forma diferente nos dois tecidos estudados. Enquanto que no RETRO a forma
fosforilada da STAT3 foi reduzida em aproximadamente 60%, no EPI houve um
aumento de 85% nos animais alimentados com a dieta HL quando comparados aos
alimentados com a dieta controle (Figura 35).
70
______________________________________________________________________ Resultados
0.0
0.5
1.0
1.5
Controle Hiperlipídica
**
PPAR (53,57 kDa)
-Tubulina (55 kDa)
CT HL CT HL
RETRO EPI
RETRO EPI
PP
AR -
tub
ulin
a(%
do
s co
ntr
ole
s)
Figura 32 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas no conteúdo proteico do PPARγ no tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=7). *P< 0,05.
0
2
4
6
ATF3 (23 kDa)
CT HL CT HL
RETRO EPI
RETRO EPI
-Tubulina (55 kDa)
Controle Hiperlipídica
* *
AT
F3
/-t
ub
ulin
a(%
do
s co
ntr
ole
s)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
RETRO EPI
* pCREBSer133
CT HL CT HL
RETRO EPI
CREB (43 kDa)
pC
RE
BS
er1
33 /C
RE
B(%
do
s co
ntr
ole
s)
A
B
Figura 33 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas no conteúdo proteico do ATF3 (A) e no conteúdo proteico do CREB fosforilado em serina 133 (pCREBSer133) (B) no tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=6-7). *P< 0,05.
71
______________________________________________________________________ Resultados
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Controle Hiperlipídica
RETRO EPI
*m
RN
A R
GS
2/L
32
(% d
os
con
tro
les)
Figura 34 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas na expressão gênica do RGS2 no tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=5-6). *P< 0,05.
0
50
100
150
200
250
RETRO EPI
*
*
Controle Hiperlipídica
pSTAT3Tyr705
CT HL CT HL
RETRO EPI
STAT3 (62 kDa)
pS
TA
T3
Ty
r70
5 /tS
TA
T3
(% d
os
con
tro
les)
Figura 35 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas no conteúdo proteico de STAT3 fosforilado em tirosina 705 (pSTAT3Tyr705) no tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=6-7). *P< 0,05.
72
______________________________________________________________________ Discussão
5. DISCUSSÃO
No presente trabalho a ingestão de dieta HL por 8 semanas induziu obesidade,
resistência à insulina e intolerância à glicose em camundongos Swiss, favorecendo uma
ampla investigação do controle do metabolismo lipídico no TAB, e essa é a primeira
vez que investigamos os efeitos de uma dieta HL no metabolismo de lipídios no TAB de
camundongos que apresentam resistência insulínica. Nossas observações sugerem
interessantes mecanismos para o acúmulo de TAG no TAB desses animais, e nos
trazem novas perspectivas sobre o desenvolvimento da obesidade. O consumo de dietas
ricas em lipídios conhecidamente induz tais efeitos em roedores, sendo um modelo
bastante utilizado para o estudo da obesidade induzida pela dieta e suas co-morbidades
(CINTRA et al., 2008; DE SOUZA et al., 2005; PITOMBO et al., 2006). Há vários
anos, o nosso grupo vem estudando o efeito de diferentes dietas, tais como hiperproteica
e livre de carboidratos (HP), hiperglicidica e hiperlipídica (HCHL) e hipoproteica
hiperglicídica (LPHC) no funcionamento do TAB e na manutenção dos estoques do
TAG, bem como o balanço entre a lipogênese e a lipólise nestes diferentes modelos
(BOTION et al., 1998; BUZELLE et al., 2010; CHAVES et al., 2006; SCHMID;
KETTELHUT; MIGLIORINI, 1984).
No presente estudo, a oferta da dieta HL aos camundongos induziu um quadro
de resistência à insulina sistêmica, caracterizado por hiperglicemia, hiperinsulinemia e
intolerância à glicose. Além disto, a dieta HL promoveu um maior ganho de massa
corporal, acompanhado de um aumento na massa dos depósitos de TAB e resistência
deste tecido à ação da insulina, avaliada pela captação de glicose. Tais achados
corroboram os de outros autores que utilizaram um modelo semelhante ao nosso, com a
mesma linhagem animal, semelhante composição dietética e o mesmo período
73
______________________________________________________________________ Discussão
experimental de consumo da dieta (CINTRA et al., 2008; DE SOUZA et al., 2005;
PITOMBO et al., 2006).
Nesse estudo demonstramos que o RETRO e EPI estão maiores nos animais que
ingeriram a dieta HL. Apesar de ser um resultado esperado, pouco se sabe sobre como
isso ocorre, já que tamanho do depósito de TAG é resultado da interação de diversos
processos que podem ser influenciados por alterações hormonais, metabólicas e neurais
estabelecido para diferentes situações nutricionais. O armazenamento de AG-TAG no
TAB tem sido apontado como mecanismo protetor contra a lipotoxicidade dos AG para
outros órgãos em modelos de dieta HL, isso porque os AG derivados do TAB,
principalmente na obesidade, podem prejudicar o funcionamento de tecidos periféricos,
resultando em resistência à insulina muscular e esteatose hepática (CAO et al., 2008).
Nesse estudo os animais são acometidos pela esteatose hepática que é visível (Figura 6)
e que foi descrita previamente por CINTRA et al. (2008), porém o tecido muscular,
apesar de ter peso menor, parece não estar resistente à insulina, uma vez que não há
redução na fosforilação de AKT nos músculos soleus e EDL (dados não mostrados),
sugerindo que os efeitos da dieta HL parecem ser menores no tecido muscular. Outro
fato interessante é que em nosso estudo a ingestão da dieta HL por 8 semanas não
causou alterações no perfil lipídico plasmático dos animais: as concentrações de AGL,
TAG e colesterol não foram diferentes, o que pode indicar que o fígado e TAB são
capazes de captar os AG provenientes da dieta na tentativa de evitar a deposição
ectópica. Kwon e colaboradores (2012) estudaram o efeito temporal da dieta HL em
camundongos C57BL/6J e observaram resultados semelhantes aos nossos, não havendo
diferenças nos níveis plasmáticos de TAG e AGL em nenhum tempo até 24 semanas de
dieta.
74
______________________________________________________________________ Discussão
Os ácidos graxos depositados nos TAB, como descrito previamente, podem ser
provenientes ou da captação de AG pré-formados pela atividade da LPL ou da síntese
de novo. No EPI os dois processos estão aumentados, há maior síntese de AG de novo e
também maior atividade da LPL, sinalizando uma maior captação de AG de
lipoproteínas circulantes, enquanto que no RETRO apenas a síntese está aumentada,
enquanto que a atividade desta enzima está reduzida nos animais HL (Figura 36). A
magnitude no ganho de massa nos dois depósitos não é uniforme, no EPI há um ganho
de massa superior ao do RETRO e a atividade da LPL parece ser um ponto importante
nessa diferença entre os dois tecidos. Corroborando nossos achados, em camundongos
C57BL/6J tratados por cinco meses com uma dieta do tipo HL foi observada maior
atividade da LPL nos TAB inguinal e mesentérico associada ao maior peso destes
tecidos e tamanhos dos adipócitos quando comparados aos animais tratados com dieta
controle (Rebuffé-Scrive, et al., 1993). Também em humanos foi demonstrado que a
maior parte dos AG armazenados em TAG no TAB é proveniente da captação da
corrente sanguínea, sendo apenas uma pequena fração sintetizada pelo tecido, mesmo
após a ingestão de uma dieta hiperglicídica (OSMAN et al., 2013). Além disso, o
aumento da expressão de RGS2 somente no EPI nesse estudo parece indicar que esse
fator de transcrição pode estar envolvido também na regulação diferencial da expressão
e atividade de LPL, uma vez que em um estudo com animais nocautes para RGS2 os
autores demonstraram, em adipócitos isolados desses animais, que os níveis basais de
LPL são significantemente menores do que nas células dos animais selvagens, e quando
submetidos a estímulo para diferenciação o mRNA da LPL aumenta nas células
selvagens mas não nas RGS2-/- (NUNN et al., 2011). Assim, a maior atividade da LPL
no EPI pode ser correlacionada com o maior ganho de peso deste tecido (38%) assim
75
______________________________________________________________________ Discussão
como maior expressão de RGS2, enquanto que no RETRO a captação de AG pré-
formado parece não ter sido necessária para o ganho de apenas 12% na massa.
Nesse trabalho, tanto no EPI quanto no RETRO foi observado aumento na
síntese de AG de novo (Figura 36). A síntese de AG de novo é a via que produz AG a
partir de intermediários não lipídicos, e utiliza principalmente a glicose como substrato.
A técnica utilizada nesse estudo avalia a síntese de AG a partir de todas as fontes de
carbono, dessa maneira não podemos afirmar qual o substrato utilizado pelo TAB dos
animais que ingeriram dieta HL. O fluxo de intermediários de carbonos para os AG é
coordenado por uma série de reações enzimáticas: o primeiro passo é a conversão do
citrato a acetil-CoA e oxaloacetato pela ATP citrato liase. O acetil-CoA é então
carboxilado a malonil-CoA pela ACC e a AGS, que é a enzima que regula a velocidade
da via, converte o malonil-CoA a palmitato (AMEER et al., 2014). Nossos resultados
demonstram que não há alteração no conteúdo protéico da AGS em nenhum dos tecidos
e que no RETRO a ACC está até com o conteúdo reduzido. Considerando que ambas as
enzimas são reguladas por fosforilações e também alostericamente, a medida do
conteúdo protéico total não pode ser conclusiva sobre o fluxo da via, diferentemente dos
experimentos com a 3H2O.
Assim como no presente estudo, alguns trabalhos têm demonstrado que mesmo
na resistência insulínica é possível ocorrer um aumento na síntese de AG de novo (LIN
et al., 2005; SAMPATH et al., 2007). Entre os possíveis mecanismos que explicam o
aumento da síntese de novo de AG está a ativação dos dois maiores reguladores das
enzimas da síntese: o SREBP-1c (Sterol Regulatory Element Binding Protein 1c) e o
ChREBP (Carbohydrate Responsive Element Binding Protein). SREBP-1c e ChREBP
regulam a expressão de genes chaves da lipogênese: Acetil-CoA sintetase, ACC, AGS e
ATP citrato liase (DENTIN et al., 2004; SHIMANO et al., 1999). O principal ativador
76
______________________________________________________________________ Discussão
de SREBP-1 é a insulina que regula esse fator tanto a nível transcricional quando pós-
traducional (KERSTEN, 2001). Porém, em ratos Sprague Dawley resistentes à insulina
que receberam dieta HL por 8 semanas a expressão tanto de SREBP-1 quanto de
ChREBP estão aumentadas (SUN et al., 2013). Tem sido observada também maior
ativação de SREBP-1c em situações de resistência insulínica induzida pela a ingestão de
dieta HL. Em camundongos resistentes à insulina tratados por 18 semanas com dieta HL
há aumento na expressão de AGS, enzima málica e ATP citrato liase no fígado
(BIDDINGER et al., 2005). Sugere-se que os próprios ácidos graxos saturados são
capazes de ativar o SREBP-1c e induzir a síntese hepática de novo (LIN et al., 2005;
SAMPATH et al., 2007), porém parece que o SREBP-1c é muito mais ativo no fígado
do que no TAB, e não há estudos que descrevem sua ativação por AG no TAB.
Já o ChREBP é transativado pela própria glicose, que quando convertida a
xilulose-5P no shunt das pentoses, ativa a proteína fosfatase 2A que defosforila e ativa o
ChREBP (IIZUKA; HORIKAWA, 2008). A glicose-6P desidrogenase (G6PD), enzima
limitante do shunt das pentoses regula a produção de NADPH e pentoses, incluindo a
xilulose-5P. A G6PD está aumentada em modelos de obesidade e o próprio aumento de
NAPDH pode elevar a síntese de AG e TAG (WANG et al., 2012; WU et al., 2013). O
aumento no fluxo do shunt das pentoses poderia fornecer tanto NADPH para estimular a
síntese de AG quanto aumentar a atividade do ChREBP pela maior produção de
xilulose-5P e maior expressão de genes de enzimas lipogênicas. A menor captação de
glicose não parece ser limitante para a maior atividade lipogênica. Em ratos que
ingerem dieta balanceada ou HP, substratos não glicídicos são mais importantes para
síntese de novo do que a glicose (BOTION et al., 1998). Herman e colaboradores (2012)
demonstraram que em animais que ingerem dieta normal a expressão do ChREBP no
TAB está correlacionada com a expressão de GLUT-4, indicando que em condições
77
______________________________________________________________________ Discussão
normais o transporte da glicose é necessário para a ativação do ChREBP. Porém, em
animais que ingeriram dieta HL e em humanos obesos essa correlação é perdida
(HERMAN et al., 2012). Foi demonstrado também que em camundongos com deleção
seletiva do GLUT-4 nos adipócitos a massa do TAB é preservada, o que sugere que a
síntese de lipídios no TAB não é dependente exclusivamente do transporte de glicose
estimulado por insulina (ABEL et al., 2001). Adicionalmente, foi demonstrado que a
superexpressão de GLUT-4 no TAB em animais que ingeriram dieta HL leva a uma
menor expressão do ChREBP apesar de terem mais GLUT-4 (HERMAN et al., 2012).
Outra interessante possibilidade é de que o próprio glicerol poderia servir de substrato
para síntese de AG. A contribuição do glicerol para a síntese de AG foi avaliada in vitro
pela incorporação de 14C de [U-14C]glicerol em AG em fatias de fígado de ratos tratados
com a dieta LPHC por 15 dias, e foi observado que no fígado o glicerol, mais do que a
glicose, é um importante substrato para a esterificação e síntese de AG, uma vez que
pela conversão a diidroxiacetona fosfato pode entrar na via glicolítica e ser convertido
acetil-CoA (MENEZES et al., 2013). Uma vez que nossos resultados demonstram que
tanto a sinalização da insulina quanto a captação de glicose estão reduzidas, podemos
sugerir que tanto um aumento na atividade do SREBP-1c induzido pelos próprios AG
saturados da dieta quanto do ChREBP pela maior atividade da G6PD produzindo mais
NADPH e Xilulose-5P poderiam contribuir para maior síntese de AG de novo. Também
devemos considerar que o maior fornecimento de glicerol para o TAB poderia estimular
a síntese de novo, uma vez que tanto o conteúdo e atividade da GK quanto o glicerol
plasmático estão aumentados. A ocorrência desse cross-talk no TAB necessita de mais
investigações.
Além dos AG, é necessário um adequado fornecimento de G3P para a
esterificação a TAG. Como já descrito previamente, o G3P pode ser proveniente da
78
______________________________________________________________________ Discussão
glicólise, gliceroneogênese ou fosforilação direta do glicerol pela GK. Dados prévios do
nosso laboratório tem sugerido uma regulação inversa entre a utilização de glicose e a
gliceroneogênese para a formação de G3P no TAB. A dieta HP, o jejum e o diabetes
induzido por estreptozotocina, situações que reduzem a concentração sérica de insulina,
induzem uma redução na glicólise e um aumento na gliceroneogênese no tecido adiposo
(BOTION et al., 1998; BRITO et al., 2001; FRASSON et al., 2012), enquanto a dieta
HCHL, uma situação que eleva a insulina sérica, há um aumento na glicólise e uma
redução na gliceroneogênese (CHAVES et al., 2006) tanto no RETRO quanto no EPI.
Recentemente, foi demonstrado que o tratamento com dexametasona por 7 dias, uma
situação que provoca resistência à insulina, causa um aumento na gliceroneogênese
acompanhado de redução na captação de glicose no RETRO. No entanto, no EPI dos
mesmos animais não foi observada a reciprocidade entre estas duas vias metabólicas,
uma vez que ambas encontram-se reduzidas (FERREIRA-SODRE, 2015). Da mesma
forma, previamente nós demonstramos que a oferta da dieta LPHC durante 14 dias,
apesar de induzir uma redução na concentração de insulina (aproximadamente 2 vezes),
também promove um aumento na concentração sérica de corticosterona (2 vezes)
culminando na redução da incorporação de glicose marcada em lipídios e redução no
conteúdo de PEPCK no TAB RETRO (APARECIDA DE FRANÇA et al., 2014;
SANTOS et al., 2012). No presente trabalho também foi observada a perda da
reciprocidade entre as vias glicolítica e gliceroneogênica, uma vez que ambas estão
reduzidas, e apesar da corticosterona sérica estar reduzida nos animais HL, observamos
resposta semelhante ao efeito do tratamento com dexametasona no EPI desses animais.
O que observamos em comum entre essas duas situações é que a perda da reciprocidade
é acompanhada pela resistência insulínica no RETRO e EPI dos camundongos HL e no
79
______________________________________________________________________ Discussão
EPI dos ratos que receberam dexametasona. Dessa maneira, parece sugestivo que a
resistência à insulina seja um fator importante na perda da reciprocidade.
Em ambos os tecidos, RETRO e EPI, a resistência insulínica foi demonstrada
pela redução na captação de glicose e no conteúdo de GLUT-4, acompanhado de um
aumento do ATF3. No entanto, apenas no EPI foi observado uma redução do conteúdo
de adiponectina, além da menor fosforilação de AKT, maior fosforilação de CREB e
aumentada expressão do RNAm de RGS-2, fatores que contribuem para uma menor
translocação do GLUT-4 para a membrana plasmática. No RETRO, a redução da
captação de glicose ocorreu independente de alterações na adiponectina, fosforilação de
Akt e CREB e expressão de RGS-2. Tanto ATF3 quanto RGS-2 são alvos de CREB,
que compromete a função do tecido adiposo na obesidade. QI e colaboradores (2009)
demonstraram que a expressão e conteúdo proteico de ATF3 estão aumentados em
aproximadamente 10 vezes em animais tratados com a dieta HL, e que a sinalização do
ATF3 envolve a ativação de CREB, que por sua vez inibe a transcrição gênica de
adiponectina e GLUT-4 (QI et al., 2009a). O RGS-2 também pode regular a
translocação do GLUT-4 por uma via não-canônica da insulina. Em adipócitos 3T3-L1
que receberam uma microinjeção de RGS2 houve redução drástica na translocação de
GLUT-4 induzida por insulina. O receptor da insulina ativado pode fosforilar Gαq em
tirosina, que forma um complexo molecular com a subunidade P110α da PI3K ativando-
a, e aumentando a translocação do GLUT-4 e o transporte de glicose. O RGS2 por sua
vez, hidrolisa a ligação da Gαq com o GTP tornando-a inativa e reduzindo a ativação da
PI3K e a translocação do GLUT-4 (IMAMURA et al., 1999). Diante disso, parece
razoável sugerir que além da redução na sinalização da insulina, a inibição da
translocação do GLUT-4 pelo aumento da expressão de RGS2 e do conteúdo de ATF3
80
______________________________________________________________________ Discussão
também poderia constituir um mecanismo de redução da captação de glicose observada
em nossos animais resistentes à insulina.
Além de funções na ação da insulina, o RGS2 parece estar envolvido no
armazenamento de TAG. Durante o processo de diferenciação de células 3T3-L1 o
RGS-2 é regulado positivamente e quando expresso ectopicamente em pré-adipócitos
NIH-3T3 promove a diferenciação dessas células e a expressão de marcadores
adipogenicos (IMAGAWA; TSUCHIYA; NISHIHARA, 1999). Em camundongos
alimentados com dieta HL por 25 semanas há aumento na expressão de RGS2 tanto no
TAB, quanto no fígado, sugerindo que esta proteína pode regular o armazenamento de
lipídios nestes órgãos (NUNN et al., 2011). No mesmo estudo, os autores demonstraram
que camundongos RGS2-/- são resistentes ao ganho de peso relacionado ao
envelhecimento quando comparados aos selvagens C57BL/6. O peso corporal reduzido
foi acompanhado também de melhor sensibilidade à insulina e menores depósitos
adiposos (NUNN et al., 2011).
Tendo em vista que a síntese de novo e a captação de AG pré-formados estão
aumentadas no EPI, seria razoável supor que uma ativação da gliceroneogênese seria
necessária para fornecer G3P para a esterificação, já que a reduzida sinalização da
insulina e conteúdo de GLUT-4 impossibilitaria o fornecimento de G3P pela via
glicolítica. Ainda, a própria redução na sinalização da insulina favorece a
gliceroneogênese, porém neste estudo o que se observa é uma redução desta via. A
redução tanto na via glicolítica quanto da gliceroneogenica parece inconsistente, tendo
em vista que o tecido parece ser capaz de sustentar a síntese de G3P em ritmo adequado
para a eficiente esterificação dos AG, formação de TAG e seu acúmulo no TAB. Porém,
a maior velocidade de incorporação de 1-[14C]-glicerol em TAG no EPI, e o
considerável aumento na atividade da GK em ambos os tecidos, sugerem que o G3P
81
______________________________________________________________________ Discussão
necessário para a adequada esterificação dos AG é proveniente principalmente da
fosforilação direta do glicerol captado da circulação, e os aumentados níveis
plasmáticos do glicerol nos animais que ingeriram a dieta HL corroboram esta hipótese.
O aumento na atividade da GK é suficiente para garantir o fornecimento de G3P ao
TAB e promover o desenvolvimento da obesidade. Ainda que no RETRO dos
camundongos alimentados com a dieta HL a velocidade de incorporação de 1-[14C]-
glicerol em lipídios esteja reduzida podemos estimar que este fornecimento de G3P,
representando 5 nmol.106 células-1.min-1, é capaz de esterificar todo AG sintetizado de
novo ou préformado, proveniente da circulação ou reciclagem endógena, considerando-
se que cada molécula de glicerol pode esterificar 3 AG. Nossos resultados sugerem que
no RETRO a ingestão da dieta HL por 8 semanas pode ser capaz de aumentar a taxa de
reesterificação de AG em TAG, já que a aumentada atividade da GK e o menor
conteúdo de Aqp7 podem sugerir que o tecido limita a liberação de glicerol e de AG
para a circulação, o que pode indicar uma menor atividade metabólica nesse tecido
(Figura 36).
É clássico o aumento da atividade da GK em animais obesos (KOSCHINSKY;
GRIES; HERBERG, 1971; TREBLE; MAYER, 1963) Stern e colaboradores (1983)
estudaram a atividade da GK em ratos Zucker e camundongos ob/ob obesos, e
demonstraram que a atividade da enzima está aumentada em todos os animais obesos
estudados quando comparados aos seus controles, e correlacionaram esse aumento com
o peso corporal, tamanho do adipócito e dieta ingerida, sendo que os maiores níveis de
atividade desta enzima foram observados nos que ingeriram dieta HL (STERN et al.,
1983). A ativação do PPARγ também tem sido relacionada à maior expressão de GK.
Foi demonstrado que em adipócitos 3T3-L1 tratados com TZDs há um aumento na
expressão e indução na atividade da GK, acompanhada de aumento na incorporação de
82
______________________________________________________________________ Discussão
glicerol em TAG, e os autores postulam que isso leva a uma maior reciclagem do
glicerol proveniente da hidrólise endógena de TAG (GUAN et al., 2002). Em humanos,
foi apontado que o do gene desta enzima é alvo de regulação pelo PGC1-α, não sendo
influenciado por rosiglitazona e ácido retinoico o que demonstra que a regulação da GK
pode se dar de forma independente de PPARγ (MAZZUCOTELLI et al., 2007). Em
nosso modelo experimental, o controle da GK parece não se dar pelo PPARγ, uma vez
que o conteúdo proteico deste está reduzido em ambos os tecidos nos quais a GK está
aumentada.
O impacto da fosforilação do glicerol e da gliceroneogênese na re-esterificação
de AG foi avaliado em explantes de TAB subcutâneo humano de indivíduos magros e
obesos. Para isso avaliou-se a atividade da PEPCK e GK e a incorporação de piruvato e
glicerol marcados em TAG, e os resultados demonstraram que nos magros a PEPCK
contribui 6 vezes mais para a re-esterificação, enquanto que nos obesos a GK foi mais
eficiente (LEROYER et al., 2006). Mottillo e colaboradores (2014), em trabalho que
avaliou o turnover de AG no TAB, demonstraram que o tratamento por 1 dia com o
agonista β3 CL 316,243 aumenta a re-esterificação de AG em TAG, eleva
consideravelmente o mRNA da GK e reduz o da PEPCK, e com isso sugerem que o
papel da GK é importante para a reciclagem de AG, enquanto que a PEPCK parece ser
mais importante no acoplamento da síntese de novo com a síntese de TAG nessa
situação experimental. PEPCK e GK são ambas alvos de PPAR e CREB (MOTTILLO
et al., 2014), porém o que observamos no presente estudo é que com a redução do
conteúdo de PPARγ este parece não influenciar nas atividades de GK e PEPCK. A
atividade da GK por outro lado, parece ser influenciada pela maior atividade de CREB
no EPI, e pela maior disponibilidade de G3P intracelular no RETRO, já que não há
alteração na fosforilação de CREB neste tecido.
83
______________________________________________________________________ Discussão
No presente trabalho, a oferta da dieta HL durante 8 semanas parece representar
o primeiro modelo capaz de induzir uma redução no fluxo da gliceroneogênese,
avaliado pela velocidade de incorporação de 1-14C-piruvato em lipídios, sem alterar o
conteúdo e atividade da PEPCK no RETRO e EPI. Deve-se considerar que a medida in
vitro da atividade enzimática é a atividade máxima em condições ideais o que nem
sempre acompanha o fenômeno in vivo que é dependente de outros fatores. Além disso,
apesar de a PEPCK ser a enzima chave da gliceroneogênese, o piruvato é um metabólito
importante em outras vias. Diversos trabalhos ilustram que o transporte de piruvato
tanto na membrana plasmática quanto na mitocôndria pode ser regulado por diferentes
fatores (PATTERSON et al., 2014; SCHELL; RUTTER, 2013; SHEARMAN;
HALESTRAP, 1984) e a regulação do fluxo do piruvato no TAB ainda necessita de
outros estudos que possam esclarecer estes fatores.
Outro ponto importante na manutenção dos estoques de TAG é a atividade
lipolítica do TAB, uma vez que estes estoques são resultado do balanço entre síntese e
degradação de TAG. Evidencias sugerem que a desregulação da lipólise e do
metabolismo lipídico em adipócitos de animais alimentados com dieta HL é mediado
em parte por defeitos na sinalização adrenérgica no tecido. Ratos alimentados com dieta
HL por 6 semanas possuem reduzida resposta lipolítica (liberação de glicerol) no TAB
quando incubados com 0,5 µM de adrenalina (SUSINI; LAVAU; HERZOG, 1979). O
mesmo acontece quando células do EPI de ratos são estimuladas com adrenalina,
forskolina e dibutiril AMP cíclico (TEPPERMAN; DEWITT; TEPPERMAN, 1986).
Seguindo o mesmo padrão, em camundongos alimentados com dieta HL por 8 semanas
houve redução na fosforilação da LHS e no conteúdo de perilipinas, além de prejuízo na
lipólise estimulada por adrenalina (GAIDHU et al., 2010). Corroborando esses estudos,
nossos resultados demonstraram que tanto em adipócitos isolados tanto do EPI quanto
84
______________________________________________________________________ Discussão
RETRO dos animais que ingeriram dieta HL, quando incubados com noradrenalina (10-
6 M), liberam menos glicerol para o meio de incubação do que os dos animais controles,
indicando menor atividade lipolítica estimulada por noradrenalina. O conteúdo dos
receptores adrenérgicos β3 e os níveis de fosforilação da LHS se encontram reduzidos
em ambos os tecidos. Além disso, a menor fosforilação da ATGL também contribui
para a menor resposta lipolítica. A menor atividade lipolítica no RETRO e EPI, além de
contribuir para o aumento dos TAB, favorece nossa hipótese de que o TAB atua no
sentido de evitar a liberação de AGL para a circulação (Figura 36).
Um aspecto interessante observado nesse trabalho foi a diferença de resposta
entre os depósitos RETRO e EPI. O RETRO parece ser menos afetado pela dieta do que
o EPI, já que este último exibe um fenótipo bastante semelhante ao observado em outros
modelos de obesidade. Estudos têm enfatizado propriedades depósito-específicas do
TAB, que apresenta distribuição heterogênea no organismo. Entre os diversos coxins há
diferenças na captação de ácidos graxos, lipólise, secreção de adipocinas, quantidade de
mitocondrias e expressão de receptores (BJØRNDAL et al., 2011; CAESAR et al.,
2010; LEMONNIER, 1972; LI; YANG; BJÖRNTORP, 1993; PALOU et al., 2009). A
distribuição da gordura corporal parece ser ainda mais importante do que o conteúdo
total de gordura, e as diferenças metabólicas entre os depósitos são provavelmente
resultado da diferente expressão de genes relacionados com a funcionalidade dos
diferentes TABs (CAESAR et al., 2010; PALOU et al., 2009). Genes envolvidos com a
lipogênese (PPARγ2, SREBP1c, ACC1 e GPAT), captação de ácidos graxos (LPL e
CD36), lipólise (LHS e ATGL) e transporte de glicose (GLUT-4) estão aumentados no
RETRO de ratos alimentados com dieta comercial balanceada quando comparados aos
depósitos inguinal e mesentérico (PALOU et al., 2009). Em camundongos obesogênicos
APOE3Leiden foi avaliado o efeito da ingestão de dieta HL por 12 semanas nos tecidos
85
______________________________________________________________________ Discussão
adiposos EPI, subcutâneo e mesentérico. O estudo demonstrou que mais de 3000 genes
são regulados pela dieta, porém apenas 62 são comuns aos três tecidos e cerca de 2400
são regulados em apenas um dos depósitos. Genes relacionados ao metabolismo do
piruvato e síntese de acetil-CoA estão reduzidos no EPI e aumentados no subcutâneo e
mesentérico dos animais que ingeriram dieta HL, demonstrando uma menor atividade
lipogênica no EPI (CAESAR et al., 2010). Para explicar diferenças regionais no
metabolismo dos tecidos EPI, RETRO, inguinal e mesentérico de ratos, LI e
colaboradores (1993) administraram [U-14C]ácido oleico por gavagem e mediram o
acúmulo e o turnover de AG nos diferentes tecidos. Nos TAB inguinal e mesentérico, a
radioatividade reduz rapidamente após 16 horas da ingestão, enquanto que no RETRO e
EPI a redução ocorre somente após 1 mês. A meia-vida do [U-14C]ácido oleico foi
menor nos tecidos inguinal e mesentérico quando comparados aos EPI. Já no RETRO a
meia vida deste AG parece ser prolongada além do tempo de observação de 1 mês,
indicando que o turnover de TAG é menor no retro do que nos outros tecidos. Nossos
resultados ressaltam a importância das diferenças morfológicas e metabólicas entre os
vários depósitos lipídicos, mesmo quando apenas os viscerais são comparados.
Além de adipócitos, o tecido adiposo é constituído por outros tipos celulares,
incluindo células endoteliais, pré-adipócitos, macrófagos e outras células inflamatórias,
sendo que todas elas são capazes de produzir citocinas inflamatórias. A resposta
inflamatória pode ser iniciada nos adipócitos, que são as primeiras células a serem
afetadas no desenvolvimento da obesidade, ou potencialmente em células vizinhas que
podem ser afetadas pelo crescimento do TAB (WELLEN; HOTAMISLIGIL, 2005).
Assim, geralmente a inflamação é caracterizada por aumento local dos níveis de
citocinas juntamente com infiltrado de células do sistema imunes para o tecido. A
inflamação na dieta HL ocorre como uma resposta exagerada do organismo frente a
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______________________________________________________________________ Discussão
uma sobrecarga nutricional em células que armazenam lipídios. A ativação de genes
relacionados ao processo inflamatório é um dos eventos iniciais e permanentes em
resposta à dieta HL. Os TAB mesentérico e EPI de camundongos que ingeriram dieta
HL por 24 semanas tem regulação positiva destes genes entre 2-4 semanas de dieta
(KWON et al., 2012). O mecanismo inflamatório induzido pela obesidade visa o reparo
tecidual e envolve inicialmente a regulação positiva de genes que transcrevem citocinas,
quimiocinas e outros mediadores inflamatórios através da ativação de fatores de
transcrição como o NF-κβ (nuclear factor-kB) e STAT3 (DEBNATH et al., 2015). O
conceito de obesidade como condição inflamatória já está bem estabelecido, porém, a
expressão e conteúdo de marcadores inflamatórios são controversos. Montgomery et al.,
(2013) demonstraram em seu estudo que a expressão de TNF-α, MCP-1 e IL-6 não foi
alterada após 8 semanas de ingestão da dieta HL. DOS SANTOS e colaboradores
(2013) estudaram o efeito de dietas com diferentes composições lipídicas por 8 semanas
no TAB de camundongos Swiss. Os animais que receberam dieta rica em gordura
animal não tiveram diferenças nas concentrações de TNF-α e IL-6 no EPI e RETRO e a
IL-10 foi reduzida apenas no RETRO. TURNER et al., (2013) realizaram um estudo
que avaliou o efeito temporal da dieta na expressão de citocinas, e observaram que com
uma e três semanas de dieta não há aumento de marcadores inflamatórios no TAB,
fígado ou músculo e que no TAB só houve aumento dos marcadores após 16 semanas
de dieta. Nossos resultados demonstraram que as concentrações de TNF-α, IL-6 e IL-10
não foram alteradas nos TAB estudados, e isso pode ser atribuído ao tempo de dieta,
que não foi longo o suficiente para provocar alterações nesses parâmetros.
Diante disso, investigamos a expressão de PAI-1 e MCP-1, e observamos
aumento no mRNA dessas proteínas apenas no EPI. Há uma contribuição direta de PAI-
1 com as complicações da obesidade como a resistência à insulina e trombose, bem
87
______________________________________________________________________ Discussão
como acumulo de TAB visceral (DE TAEYE; SMITH; VAUGHAN, 2005). O PAI-1
tem sido considerado um fator preditor do diabetes tipo II e atua como estimulador da
diferenciação de adipócitos mediada por redução na atividade do PPARγ (CORREIA;
HAYNES, 2006). O PAI-1 é considerado uma proteína de fase aguda, com níveis
aumentados nos estágios iniciais da resposta inflamatória (GABAY; KUSHNER, 1999).
Durante a expansão da massa adiposa há regiões do tecido que entram em hipóxia, o
tecido expande e a vasculatura é insuficiente para manter a normoxia, os adipócitos
secretam então fatores angiogênicos em resposta á hipóxia, que incluem VEGF e PAI-1
(TRAYHURN; WOOD, 2004). O MCP-1 está aumentado no TAB em diversos estudos
com dieta HL (DEBNATH et al., 2015; KWON et al., 2012) e em células tratadas com
AGL (TAKAHASHI et al., 2008). O gene da MCP-1 é expresso tanto em células 3T3-
L1, quanto em adipócitos de camundongos obesos. Em camundongos que
superexpressam MCP-1 nos adipócitos, o infiltrado de macrófagos é maior do que nos
selvagens, e em animais nocautes para MCP-1 que são alimentados com dieta HL o
acúmulo de macrófagos foi inibido; sugerindo que a secreção de MCP-1 pelos
adipócitos ativa diretamente o recrutamento de macrófagos para o TAB (KANDA et al.,
2006). Os nossos achados vão ao encontro desses trabalhos, e demonstram que em
nosso modelo de obesidade o EPI, mas não o RETRO, é sítio de um processo
inflamatório agudo, sinalizado pelo aumento na expressão de PAI-1 e que o infiltrado
observado no corte histológico pode ser desencadeado pela maior expressão de MCP-1.
O infiltrado do TAB ocasionado pela dieta HL é causada por monócitos que
migram para o TAB, e se tornam macrófagos, que uma vez acumulados secretam mais
citocinas levando a uma reação em cadeia. Uma vez que macrófagos ativados estão
presentes no tecido, eles ativam o processo inflamatório (OSBORN; OLEFSKY, 2012).
A ativação da inflamação com acúmulo de macrófagos no tecido, leva à formação
88
______________________________________________________________________ Discussão
estruturas crown-like em torno dos adipócitos, que consiste em macrófagos que
circulam e fagocitam os adipócitos “mortos” para evitar lipotoxicidade (STRISSEL et
al., 2007). Em camundongos C57BL/6 que ingeriram dieta HL por 20 semanas a
apoptose dos adipócitos foi caracterizada como um evento inicial, progressivo e
depósito-dependente relacionado positivamente com a expansão do TAB, mudança de
fenótipo dos macrófagos, inflamação e desenvolvimento da resistência à insulina.
(STRISSEL et al., 2007). O EPI desses animais reestabelece a quantidade de células
mortas com adipócitos pequenos, sugerindo que essa morte celular é um pré-requisito
para a transição de um tecido hipertrófico para hiperplásico na obesidade. (Faust et al.,
1978). Foi demonstrado que não há aumento do tamanho das células adiposas nas
primeiras nove semanas de ingestão de dieta HL nos TAB inguinal, mesentérico e EPI e
os autores demonstraram que a hiperplasia surge apenas na 12ª semana (CAESAR et al.,
2010). Outro fator que parece regular o infiltrado de células imunes no TAB é o CREB.
Em camundongos alimentados com dieta HL que expressam o dominante negativo para
CREB especificamente no TAB (F-ACREB) o infiltrado de células imunes esta
relativamente ausente, bem como houve redução de genes relacionados com as vias
inflamatórias em comparação aos animais selvagens tratados com a mesma dieta (QI et
al., 2009a). Em camundongos que ingeriram dieta HL a severidade na hiperplasia e
hipertrofia são dependentes do TAB estudado (LEMONNIER, 1972). Juntamente com o
aumento de genes inflamatórios, nossos achados histológicos sugerem que no EPI, mas
não no RETRO, o processo inflamatório está ativado e relacionado à apoptose dos
adipócitos, dado a presença de estruturas “crown-like”, a menor área dos adipócitos e
maior frequência de adipócitos pequenos, indicando que o tecido está possivelmente em
processo de hiperplasia, dado o maior peso do TAB e o menor tamanho celular. Além
89
______________________________________________________________________ Discussão
disso, a maior fosforilação de CREB neste tecido parece ser um fator adicional no
aumento do infiltrado e dos genes inflamatórios.
Nosso estudo reforça a idéia de que a obesidade pode induzir alterações em
múltiplos tecidos, porém ressalta a importância de se distinguir uma reação local do
tecido de uma resposta sistêmica. Em nossos animais, o grau de inflamação sistêmica
parece mínimo, uma vez que não observamos alterações nos níveis plasmáticos de
citocinas, porém, quando analisamos o EPI, as características histológicas e a expressão
de citocinas sugerem fortemente que há uma reação inflamatória local.
Em resumo, os resultados apresentados nesse trabalho demonstram que o
aumento nos depósitos de TAG no RETRO e EPI é decorrente de uma combinação de
fatores: aumento da atividade da LPL, aumento da síntese de novo de AG, aumento da
atividade da GK e redução da atividade lipolítica estimulada por noradrenalina. É
interessante notar que em nosso modelo de obesidade com resistência à insulina a
reciprocidade entre as vias glicolítica e gliceroneogênica é perdida na medida em que as
duas vias estão reduzidas em ambos os tecidos estudados. Além disso, esse estudo
demonstrou que a maior atividade da GK é suficiente para fornecer todo o G3P
necessário para a esterificação dos AG provenientes da síntese de novo. Outro aspecto
interessante observado em nosso estudo é que nos dois tecidos estudados o acúmulo de
TAB ocorre de maneira depósito-dependente. O RETRO parecer ser menos suscetível
aos efeitos da dieta HL, já que o aumento neste tecido é menos pronunciado, somado a
isso temos menor atividade da LPL, o que indica que os AG necessários para a síntese
de TAG são provenientes principalmente da síntese de novo e da reciclagem endógena.
Observamos também no RETRO que o G3P necessário para esterificar esses AG é
proveniente da maior atividade da GK sem aumento na velocidade de incorporação de
14C-glicerol em TAG, e apesar de ter menor atividade lipolítica estimulada por
90
______________________________________________________________________ Discussão
noradrenalina, o reduzido conteúdo de Aqp7 sugere que há maior re-esterificação neste
tecido. No EPI é mais evidente o fenótipo da obesidade, com redução no conteúdo de
adiponectina e fosforilação de AKT indicando um evidente prejuízo na ação da insulina
neste tecido. Os AG necessários para a esterificação em TAG no EPI são provenientes
tanto da maior atividade da LPL quanto da síntese de novo, o que demonstra maior
disponibilidade de AG neste tecido. O G3P necessário para esterificar os AG vem da
maior atividade da GK e maior velocidade de incorporação de 14C-glicerol em TAG,
demonstrando que também no EPI a fosforilação direta do glicerol é a via que mais
contribui para a síntese de G3P. O perfil inflamatório no EPI pode ter papel importante
na instalação da obesidade uma vez que o aumento deste tecido é mais pronunciado do
que no RETRO. Nossos dados demonstram que a obesidade induzida por dieta HL
altera de maneira depósito-dependente o funcionamento dos TAB e as vias de formação
de G3P e AG para a síntese e armazenamento de TAG.
___
TAB
TAB
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__________
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91
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92
______________________________________________________________________ Referências bibliográficas
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABEL, E. D. et al. Adipose-selective targeting of the GLUT4 gene impairs insulin
action in muscle and liver. Nature, v. 409, n. 6821, p. 729–33, 8 fev. 2001.
AHMADIAN, M.; DUNCAN, R. E.; SUL, H. S. The skinny on fat: lipolysis and fatty
acid utilization in adipocytes. Trends in endocrinology and metabolism: TEM, v. 20,
n. 9, p. 424–8, nov. 2009.
AMEER, F. et al. De novo lipogenesis in health and disease. Metabolism: clinical and
experimental, v. 63, n. 7, p. 895–902, jul. 2014.
APARECIDA DE FRANÇA, S. et al. Low-protein, high-carbohydrate diet increases
glucose uptake and fatty acid synthesis in brown adipose tissue of rats. Nutrition
(Burbank, Los Angeles County, Calif.), v. 30, n. 4, p. 473–80, abr. 2014.
BALLARD, F. J.; HANSON, R. W. Phosphoenolpyruvate carboxykinase and pyruvate
carboxylase in developing rat liver. The Biochemical journal, v. 104, n. 3, p. 866–71,
set. 1967.
BELFRAGE, P.; VAUGHAN, M. Simple liquid-liquid partition system for isolation of
labeled oleic acid from mixtures with glycerides. Journal of lipid research, v. 10, n. 3,
p. 341–4, maio 1969.
BIDDINGER, S. B. et al. Effects of diet and genetic background on sterol regulatory
element-binding protein-1c, stearoyl-CoA desaturase 1, and the development of the
metabolic syndrome. Diabetes, v. 54, n. 5, p. 1314–23, maio 2005.
BJØRNDAL, B. et al. Different adipose depots: their role in the development of
metabolic syndrome and mitochondrial response to hypolipidemic agents. Journal of
93
______________________________________________________________________ Referências bibliográficas
obesity, v. 2011, p. 490650, jan. 2011.
BODEN, G.; SHULMAN, G. I. Free fatty acids in obesity and type 2 diabetes: defining
their role in the development of insulin resistance and beta-cell dysfunction. European
Journal of Clinical Investigation, v. 32, n. s3, p. 14–23, jun. 2002.
BOTION, L. M. et al. Glucose contribution to in vivo synthesis of glyceride-glycerol
and fatty acids in rats adapted to a high-protein, carbohydrate-free diet. Metabolism:
clinical and experimental, v. 47, n. 10, p. 1217–21, out. 1998.
BRITO, S. R. et al. Glucose uptake and glycolytic flux in adipose tissue from rats
adapted to a high-protein, carbohydrate-free diet. Metabolism: clinical and
experimental, v. 50, n. 10, p. 1208–12, out. 2001.
BUZELLE, S. L. et al. A low-protein, high-carbohydrate diet increases the adipose lipid
content without increasing the glycerol-3-phosphate or fatty acid content in growing
rats. Canadian journal of physiology and pharmacology, v. 88, n. 12, p. 1157–65,
dez. 2010.
CAESAR, R. et al. A combined transcriptomics and lipidomics analysis of
subcutaneous, epididymal and mesenteric adipose tissue reveals marked functional
differences. PloS one, v. 5, n. 7, p. e11525, jan. 2010.
CAO, H. et al. Identification of a lipokine, a lipid hormone linking adipose tissue to
systemic metabolism. Cell, v. 134, n. 6, p. 933–44, 19 set. 2008.
CHAVES, V. E. et al. Glyceroneogenesis Is Reduced and Glucose Uptake Is Increased
in Adipose Tissue from Cafeteria Diet-Fed Rats Independently of Tissue Sympathetic
Innervation. J. Nutr., v. 136, n. 10, p. 2475–2480, 1 out. 2006.
94
______________________________________________________________________ Referências bibliográficas
CHRIVIA, J. C. et al. Phosphorylated CREB binds specifically to the nuclear protein
CBP. Nature, v. 365, n. 6449, p. 855–859, 28 out. 1993.
CINTI, S. Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose
tissue of obese mice and humans. The Journal of Lipid Research, v. 46, n. 11, p.
2347–2355, 8 set. 2005.
CINTRA, D. E. et al. Interleukin-10 is a protective factor against diet-induced insulin
resistance in liver. Journal of hepatology, v. 48, n. 4, p. 628–37, abr. 2008.
CORREIA, M. L. G.; HAYNES, W. G. A role for plasminogen activator inhibitor-1 in
obesity: from pie to PAI? Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology, v. 26,
n. 10, p. 2183–5, out. 2006.
DARNELL, J. E. STATs and gene regulation. Science (New York, N.Y.), v. 277, n.
5332, p. 1630–5, 12 set. 1997.
DE SOUZA, C. T. et al. Short-term inhibition of peroxisome proliferator-activated
receptor-gamma coactivator-1alpha expression reverses diet-induced diabetes mellitus
and hepatic steatosis in mice. Diabetologia, v. 48, n. 9, p. 1860–71, set. 2005.
DE TAEYE, B.; SMITH, L. H.; VAUGHAN, D. E. Plasminogen activator inhibitor-1: a
common denominator in obesity, diabetes and cardiovascular disease. Current opinion
in pharmacology, v. 5, n. 2, p. 149–54, abr. 2005.
DEBNATH, M. et al. Metaflammatory responses during obesity: Pathomechanism and
treatment. Obesity research & clinical practice, 21 nov. 2015.
DENTIN, R. et al. Hepatic glucokinase is required for the synergistic action of ChREBP
and SREBP-1c on glycolytic and lipogenic gene expression. The Journal of biological
95
______________________________________________________________________ Referências bibliográficas
chemistry, v. 279, n. 19, p. 20314–26, 7 maio 2004.
DOS SANTOS, B. et al. Effects of a diet enriched with polyunsaturated, saturated, or
trans fatty acids on cytokine content in the liver, white adipose tissue, and skeletal
muscle of adult mice. Mediators of inflammation, v. 2013, p. 594958, jan. 2013.
DUNCAN, R. E. et al. Regulation of lipolysis in adipocytes. Annual review of
nutrition, v. 27, p. 79–101, jan. 2007.
FAUST, I. M. et al. Diet-induced adipocyte number increase in adult rats: a new model
of obesity. The American journal of physiology, v. 235, n. 3, p. E279–86, out. 1978.
FERES, D. D. S. et al. In vitro TNF-α- and noradrenaline-stimulated lipolysis is
impaired in adipocytes from growing rats fed a low-protein, high-carbohydrate diet.
Lipids, v. 48, n. 8, p. 779–86, ago. 2013.
FERREIRA-SODRE, G. N. Papel dos glicocorticóides na regulação das vias de
geração de glicerol-3-fosfato no tecido adiposo branco de ratos. [s.l: s.n.].
FOLCH, J.; LEES, M.; SLOANE STANLEY, G. H. A simple method for the isolation
and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of biological
chemistry, v. 226, n. 1, p. 497–509, maio 1957.
FOLEY, J. E. et al. Insulin binding and hexose transport in rat adipocytes. Relation to
cell size. Diabetologia, v. 19, n. 3, p. 234–41, set. 1980.
FRANCKHAUSER, S. et al. Increased fatty acid re-esterification by PEPCK
overexpression in adipose tissue leads to obesity without insulin resistance. Diabetes, v.
51, n. 3, p. 624–30, mar. 2002.
FRASSON, D. et al. The sympathetic nervous system regulates the three glycerol-3P
96
______________________________________________________________________ Referências bibliográficas
generation pathways in white adipose tissue of fasted, diabetic and high-protein diet-fed
rats. Metabolism: clinical and experimental, v. 61, n. 10, p. 1473–85, out. 2012.
GABAY, C.; KUSHNER, I. Acute-phase proteins and other systemic responses to
inflammation. The New England journal of medicine, v. 340, n. 6, p. 448–54, 11 fev.
1999.
GAIDHU, M. P. et al. Dysregulation of lipolysis and lipid metabolism in visceral and
subcutaneous adipocytes by high-fat diet: role of ATGL, HSL, and AMPK. American
journal of physiology. Cell physiology, v. 298, n. 4, p. C961–71, abr. 2010.
GALIC, S.; OAKHILL, J. S.; STEINBERG, G. R. Adipose tissue as an endocrine
organ. Molecular and cellular endocrinology, v. 316, n. 2, p. 129–39, 25 mar. 2010.
GORIN, E.; TAL-OR, Z.; SHAFRIR, E. Glyceroneogenesis in adipose tissue of fasted,
diabetic and triamcinolone treated rats. European journal of biochemistry / FEBS, v.
8, n. 3, p. 370–5, abr. 1969.
GUAN, H.-P. et al. A futile metabolic cycle activated in adipocytes by antidiabetic
agents. Nature medicine, v. 8, n. 10, p. 1122–8, out. 2002.
GUH, D. P. et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a
systematic review and meta-analysis. BMC public health, v. 9, p. 88, jan. 2009.
HERMAN, M. A. et al. A novel ChREBP isoform in adipose tissue regulates systemic
glucose metabolism. Nature, v. 484, n. 7394, p. 333–8, 19 abr. 2012.
HIBUSE, T. et al. From The Cover: Aquaporin 7 deficiency is associated with
development of obesity through activation of adipose glycerol kinase. Proceedings of
the National Academy of Sciences, v. 102, n. 31, p. 10993–10998, 11 jul. 2005.
97
______________________________________________________________________ Referências bibliográficas
HIETANEN, E.; GREENWOOD, M. R. A comparison of lipoprotein lipase activity and
adipocyte differentiation in growing male rats. Journal of lipid research, v. 18, n. 4, p.
480–90, jul. 1977.
HILL, A. A.; REID BOLUS, W.; HASTY, A. H. A decade of progress in adipose tissue
macrophage biology. Immunological reviews, v. 262, n. 1, p. 134–52, nov. 2014.
HOPGOOD, M. F.; BALLARD, F. J. Synthesis and degradation of
phosphoenolpyruvate carboxylase in rat liver and adipose tissue. Changes during a
starvation-re-feeding cycle. The Biochemical journal, v. 134, n. 2, p. 445–53, jun.
1973.
HOTAMISLIGIL, G. S.; SHARGILL, N. S.; SPIEGELMAN, B. M. Adipose
expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin
resistance. Science (New York, N.Y.), v. 259, n. 5091, p. 87–91, 1 jan. 1993.
IIZUKA, K.; HORIKAWA, Y. ChREBP: a glucose-activated transcription factor
involved in the development of metabolic syndrome. Endocrine journal, v. 55, n. 4, p.
617–24, ago. 2008.
IMAGAWA, M.; TSUCHIYA, T.; NISHIHARA, T. Identification of inducible genes at
the early stage of adipocyte differentiation of 3T3-L1 cells. Biochemical and
biophysical research communications, v. 254, n. 2, p. 299–305, 19 jan. 1999.
IMAMURA, T. et al. G alpha-q/11 protein plays a key role in insulin-induced glucose
transport in 3T3-L1 adipocytes. Molecular and cellular biology, v. 19, n. 10, p. 6765–
74, out. 1999.
JAWORSKI, K. et al. Regulation of triglyceride metabolism. IV. Hormonal regulation
of lipolysis in adipose tissue. American journal of physiology. Gastrointestinal and
98
______________________________________________________________________ Referências bibliográficas
liver physiology, v. 293, n. 1, p. G1–4, jul. 2007.
JOHNSON, A. M. F.; OLEFSKY, J. M. The origins and drivers of insulin resistance.
Cell, v. 152, n. 4, p. 673–84, 14 fev. 2013.
KANDA, H. et al. MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue,
insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity. The Journal of clinical
investigation, v. 116, n. 6, p. 1494–505, jun. 2006.
KAWASHITA, N. H. et al. Glycerokinase activity in brown adipose tissue: a
sympathetic regulation? American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative
and Comparative Physiology, v. 282, n. 4, p. R1185–R1190, 1 abr. 2002.
KERSTEN, S. Mechanisms of nutritional and hormonal regulation of lipogenesis.
EMBO reports, v. 2, n. 4, p. 282–6, abr. 2001.
KETTELHUT, I. C.; GOLDBERG, A. L. Tumor necrosis factor can induce fever in rats
without activating protein breakdown in muscle or lipolysis in adipose tissue. The
Journal of clinical investigation, v. 81, n. 5, p. 1384–9, maio 1988.
KISHIDA, K. et al. Genomic structure and insulin-mediated repression of the aquaporin
adipose (AQPap), adipose-specific glycerol channel. The Journal of biological
chemistry, v. 276, n. 39, p. 36251–60, 28 set. 2001.
KISKINIS, E. et al. RIP140 represses the “brown-in-white” adipocyte program
including a futile cycle of triacylglycerol breakdown and synthesis. Molecular
endocrinology (Baltimore, Md.), v. 28, n. 3, p. 344–56, mar. 2014.
KOPELMAN, P. G. Obesity as a medical problem. Nature, v. 404, n. 6778, p. 635–43,
6 abr. 2000.
99
______________________________________________________________________ Referências bibliográficas
KOSCHINSKY, T.; GRIES, F. A.; HERBERG, L. Regulation of glycerol kinase by
insulin in isolated fat cells and liver of Bar Harbor obese mice. Diabetologia, v. 7, n. 5,
p. 316–22, out. 1971.
KWON, E.-Y. et al. Time-course microarrays reveal early activation of the immune
transcriptome and adipokine dysregulation leads to fibrosis in visceral adipose depots
during diet-induced obesity. BMC genomics, v. 13, p. 450, jan. 2012.
LAFONTAN, M.; LANGIN, D. Lipolysis and lipid mobilization in human adipose
tissue. Progress in lipid research, v. 48, n. 5, p. 275–97, set. 2009.
LEMONNIER, D. Effect of age, sex, and sites on the cellularity of the adipose tissue in
mice and rats rendered obese by a high-fat diet. The Journal of clinical investigation,
v. 51, n. 11, p. 2907–15, nov. 1972.
LEROYER, S. N. et al. Rosiglitazone controls fatty acid cycling in human adipose
tissue by means of glyceroneogenesis and glycerol phosphorylation. The Journal of
biological chemistry, v. 281, n. 19, p. 13141–9, 12 maio 2006.
LI, M.; YANG, S.; BJÖRNTORP, P. Metabolism of different adipose tissues in vivo in
the rat. Obesity research, v. 1, n. 6, p. 459–68, nov. 1993.
LIN, J. et al. Hyperlipidemic effects of dietary saturated fats mediated through PGC-
1beta coactivation of SREBP. Cell, v. 120, n. 2, p. 261–73, 28 jan. 2005.
LINDSTRÖM, P. The physiology of obese-hyperglycemic mice [ob/ob mice].
TheScientificWorldJournal, v. 7, p. 666–85, jan. 2007.
LIVAK, K. J.; SCHMITTGEN, T. D. Analysis of relative gene expression data using
real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods (San Diego,
100
______________________________________________________________________ Referências bibliográficas
Calif.), v. 25, n. 4, p. 402–8, dez. 2001.
LOWRY, O. H. et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent. The Journal
of biological chemistry, v. 193, n. 1, p. 265–75, nov. 1951.
MAZZUCOTELLI, A. et al. The Transcriptional Coactivator Peroxisome Proliferator
Activated Receptor (PPAR) Coactivator-1 and the Nuclear Receptor PPAR Control
the Expression of Glycerol Kinase and Metabolism Genes Independently of
PPAR Activation in Human White Adipocytes. Diabetes, v. 56, n. 10, p. 2467–2475,
23 jul. 2007.
MENEZES, A. L. et al. A low-protein, high-carbohydrate diet increases de novo fatty
acid synthesis from glycerol and glycerokinase content in the liver of growing rats.
Nutrition research (New York, N.Y.), v. 33, n. 6, p. 494–502, jun. 2013.
MILES, P. D. G. et al. Effect of heterozygous PPARgamma deficiency and TZD
treatment on insulin resistance associated with age and high-fat feeding. American
journal of physiology. Endocrinology and metabolism, v. 284, n. 3, p. E618–26, mar.
2003.
MONTGOMERY, M. K. et al. Mouse strain-dependent variation in obesity and glucose
homeostasis in response to high-fat feeding. Diabetologia, v. 56, n. 5, p. 1129–39, maio
2013.
MOTTILLO, E. P. et al. Coupling of lipolysis and de novo lipogenesis in brown , beige
, and white adipose tissues during chronic  3-adrenergic receptor activation. Journal
of lipid research, v. 55, n. 11, p. 2276–86, dez. 2014.
NEWSHOLME, E. A.; ROBINSON, J.; TAYLOR, K. A radiochemical enzymatic
101
______________________________________________________________________ Referências bibliográficas
activity assay for glycerol kinase and hexokinase. Biochimica et Biophysica Acta
(BBA) - Enzymology, v. 132, n. 2, p. 338–346, mar. 1967.
NIELSEN, T. S. et al. Dissecting adipose tissue lipolysis: molecular regulation and
implications for metabolic disease. Journal of molecular endocrinology, v. 52, n. 3, p.
R199–222, 1 jun. 2014.
NIKOLIC, D. et al. Population genetic analyses of susceptibility to increased body
weight. Archives of medical science : AMS, v. 8, n. 6, p. 998–1002, 20 dez. 2012.
NILSSON-EHLE, P.; SCHOTZ, M. C. A stable, radioactive substrate emulsion for
assay of lipoprotein lipase. Journal of lipid research, v. 17, n. 5, p. 536–41, 1 set.
1976.
NING, J. et al. Insulin and insulin signaling play a critical role in fat induction of insulin
resistance in mouse. American journal of physiology. Endocrinology and
metabolism, v. 301, n. 2, p. E391–401, ago. 2011.
NUNN, C. et al. Resistance to age-related, normal body weight gain in RGS2 deficient
mice. Cellular signalling, v. 23, n. 8, p. 1375–86, ago. 2011.
NYE, C. et al. Reassessing triglyceride synthesis in adipose tissue. Trends in
endocrinology and metabolism: TEM, v. 19, n. 10, p. 356–61, dez. 2008.
OLSWANG, Y. et al. A mutation in the peroxisome proliferator-activated receptor
gamma-binding site in the gene for the cytosolic form of phosphoenolpyruvate
carboxykinase reduces adipose tissue size and fat content in mice. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America, v. 99, n. 2, p. 625–
30, 22 jan. 2002.
102
______________________________________________________________________ Referências bibliográficas
OSBORN, O.; OLEFSKY, J. M. The cellular and signaling networks linking the
immune system and metabolism in disease. Nature medicine, v. 18, n. 3, p. 363–74,
mar. 2012.
OSMAN, O. S. et al. A novel automated image analysis method for accurate adipocyte
quantification. Adipocyte, v. 2, n. 3, p. 160–4, 2013.
PALOU, M. et al. Gene expression patterns in visceral and subcutaneous adipose depots
in rats are linked to their morphologic features. Cellular physiology and
biochemistry : international journal of experimental cellular physiology,
biochemistry, and pharmacology, v. 24, n. 5-6, p. 547–56, jan. 2009.
PATTERSON, J. N. et al. Mitochondrial metabolism of pyruvate is essential for
regulating glucose-stimulated insulin secretion. The Journal of biological chemistry,
v. 289, n. 19, p. 13335–46, 9 maio 2014.
PITOMBO, C. et al. Amelioration of diet-induced diabetes mellitus by removal of
visceral fat. The Journal of endocrinology, v. 191, n. 3, p. 699–706, dez. 2006.
PORTER, M. H. et al. Effects of TNF-alpha on glucose metabolism and lipolysis in
adipose tissue and isolated fat-cell preparations. The Journal of laboratory and
clinical medicine, v. 139, n. 3, p. 140–6, mar. 2002.
QI, L. et al. Adipocyte CREB promotes insulin resistance in obesity. Cell metabolism,
v. 9, n. 3, p. 277–86, mar. 2009a.
QI, L. et al. Adipocyte CREB promotes insulin resistance in obesity. Cell metabolism,
v. 9, n. 3, p. 277–86, 3 mar. 2009b.
RAVNSKJAER, K. et al. Cooperative interactions between CBP and TORC2 confer
103
______________________________________________________________________ Referências bibliográficas
selectivity to CREB target gene expression. The EMBO journal, v. 26, n. 12, p. 2880–
9, 20 jun. 2007.
REBUFFÉ-SCRIVE, M. et al. Regional fat distribution and metabolism in a new mouse
model (C57BL/6J) of non-insulin-dependent diabetes mellitus. Metabolism: clinical
and experimental, v. 42, n. 11, p. 1405–9, nov. 1993.
REEVES, P. G.; NIELSEN, F. H.; FAHEY, G. C. AIN-93 purified diets for laboratory
rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on
the reformulation of the AIN-76A rodent diet. The Journal of nutrition, v. 123, n. 11,
p. 1939–51, nov. 1993.
RESHEF, L.; HANSON, R. W.; BALLARD, F. J. A possible physiological role for
glyceroneogenesis in rat adipose tissue. The Journal of biological chemistry, v. 245,
n. 22, p. 5979–84, 25 nov. 1970.
RICHARD, A. J.; STEPHENS, J. M. The role of JAK-STAT signaling in adipose tissue
function. Biochimica et biophysica acta, v. 1842, n. 3, p. 431–9, mar. 2014.
RODBELL, M. METABOLISM OF ISOLATED FAT CELLS. I. EFFECTS OF
HORMONES ON GLUCOSE METABOLISM AND LIPOLYSIS. The Journal of
biological chemistry, v. 239, p. 375–80, fev. 1964.
SAMPATH, H. et al. Stearoyl-CoA desaturase-1 mediates the pro-lipogenic effects of
dietary saturated fat. The Journal of biological chemistry, v. 282, n. 4, p. 2483–93, 26
jan. 2007.
SANTOS, M. P. DOS et al. A low-protein, high-carbohydrate diet increases fatty acid
uptake and reduces norepinephrine-induced lipolysis in rat retroperitoneal white adipose
tissue. Lipids, v. 47, n. 3, p. 279–89, mar. 2012.
104
______________________________________________________________________ Referências bibliográficas
SCHELL, J. C.; RUTTER, J. The long and winding road to the mitochondrial pyruvate
carrier. Cancer & metabolism, v. 1, n. 1, p. 6, jan. 2013.
SCHMID, H.; KETTELHUT, I. C.; MIGLIORINI, R. H. Reduced lipogenesis in rats
fed a high-protein carbohydrate-free diet. Metabolism: clinical and experimental, v.
33, n. 3, p. 219–23, mar. 1984.
SEWTER, C. P. et al. Regulation of tumour necrosis factor-alpha release from human
adipose tissue in vitro. The Journal of endocrinology, v. 163, n. 1, p. 33–8, out. 1999.
SHEARMAN, M. S.; HALESTRAP, A. P. The concentration of the mitochondrial
pyruvate carrier in rat liver and heart mitochondria determined with alpha-cyano-beta-
(1-phenylindol-3-yl)acrylate. The Biochemical journal, v. 223, n. 3, p. 673–6, 1 nov.
1984.
SHIMANO, H. et al. Sterol regulatory element-binding protein-1 as a key transcription
factor for nutritional induction of lipogenic enzyme genes. The Journal of biological
chemistry, v. 274, n. 50, p. 35832–9, 10 dez. 1999.
SMITH, P. K. et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical
biochemistry, v. 150, n. 1, p. 76–85, out. 1985.
SONG, Y. et al. CRTC3 links catecholamine signalling to energy balance. Nature, v.
468, n. 7326, p. 933–9, 16 dez. 2010.
STEPPAN, C. M. et al. The hormone resistin links obesity to diabetes. Nature, v. 409,
n. 6818, p. 307–12, 18 jan. 2001.
STERN, J. S. et al. Glycerol kinase activity in adipose tissue of obese rats and mice:
effects of diet composition. The Journal of nutrition, v. 113, n. 3, p. 714–20, mar.
105
______________________________________________________________________ Referências bibliográficas
1983.
STRISSEL, K. J. et al. Adipocyte death, adipose tissue remodeling, and obesity
complications. Diabetes, v. 56, n. 12, p. 2910–8, dez. 2007.
SUN, H. et al. The effect of LXRα, ChREBP and Elovl6 in liver and white adipose
tissue on medium- and long-chain fatty acid diet-induced insulin resistance. Diabetes
research and clinical practice, v. 102, n. 3, p. 183–92, dez. 2013.
SURWIT, R. S. et al. Diet-induced type II diabetes in C57BL/6J mice. Diabetes, v. 37,
n. 9, p. 1163–7, set. 1988.
SUSINI, C.; LAVAU, M.; HERZOG, J. Adrenaline responsiveness of glucose
metabolism in insulin-resistant adipose tissue of rats fed a high-fat diet. The
Biochemical journal, v. 180, n. 2, p. 431–3, 15 maio 1979.
SWINBURN, B. A. et al. The global obesity pandemic: shaped by global drivers and
local environments. Lancet, v. 378, n. 9793, p. 804–14, 27 ago. 2011.
TAKAHASHI, K. et al. JNK- and IkappaB-dependent pathways regulate MCP-1 but
not adiponectin release from artificially hypertrophied 3T3-L1 adipocytes preloaded
with palmitate in vitro. American journal of physiology. Endocrinology and
metabolism, v. 294, n. 5, p. E898–909, maio 2008.
TEPPERMAN, H. M.; DEWITT, J.; TEPPERMAN, J. Effect of a high fat diet on rat
adipocyte lipolysis: responses to epinephrine, forskolin, methylisobutylxanthine,
dibutyryl cyclic AMP, insulin and nicotinic acid. The Journal of nutrition, v. 116, n.
10, p. 1984–91, out. 1986.
TONTONOZ, P. et al. mPPAR gamma 2: tissue-specific regulator of an adipocyte
106
______________________________________________________________________ Referências bibliográficas
enhancer. Genes & Development, v. 8, n. 10, p. 1224–1234, 15 maio 1994.
TOWBIN, H.; STAEHELIN, T.; GORDON, J. Electrophoretic transfer of proteins from
polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,
v. 76, n. 9, p. 4350–4, set. 1979.
TRAYHURN, P.; WOOD, I. S. Adipokines: inflammation and the pleiotropic role of
white adipose tissue. The British journal of nutrition, v. 92, n. 3, p. 347–55, set. 2004.
TREBLE, D. H.; MAYER, J. GLYCEROLKINASE ACTIVITY IN WHITE ADIPOSE
TISSUE OF OBESE-HYPERGLYCAEMIC MICE. Nature, v. 200, p. 363–4, 26 out.
1963.
TURNER, N. et al. Distinct patterns of tissue-specific lipid accumulation during the
induction of insulin resistance in mice by high-fat feeding. Diabetologia, v. 56, n. 7, p.
1638–48, jul. 2013.
VALENTIM, R. R. O papel das catecolaminas na regulação da gliceroquinase e sua
importância no tecido adiposo branco de ratos. [s.l: s.n.].
VÁZQUEZ-VELA, M. E. F.; TORRES, N.; TOVAR, A. R. White Adipose Tissue as
Endocrine Organ and Its Role in Obesity. Archives of Medical Research, v. 39, n. 8, p.
715–728, nov. 2008.
WANG, F. et al. Activated glucose-6-phosphate dehydrogenase is associated with
insulin resistance by upregulating pentose and pentosidine in diet-induced obesity of
rats. Hormone and metabolic research = Hormon- und Stoffwechselforschung =
Hormones et métabolisme, v. 44, n. 13, p. 938–42, dez. 2012.
107
______________________________________________________________________ Referências bibliográficas
WATT, M. J.; STEINBERG, G. R. Regulation and function of triacylglycerol lipases in
cellular metabolism. The Biochemical journal, v. 414, n. 3, p. 313–25, 15 set. 2008.
WELLEN, K. E.; HOTAMISLIGIL, G. S. Inflammation, stress, and diabetes. The
Journal of clinical investigation, v. 115, n. 5, p. 1111–9, maio 2005.
WHO (WORLD HEALTH ORGANIZATION). WHO | Obesity and overweight. n.
Fact sheet N°311, 2015.
WIESER, V.; MOSCHEN, A. R.; TILG, H. Inflammation, Cytokines and Insulin
Resistance: A Clinical Perspective. Archivum Immunologiae et Therapiae
Experimentalis, v. 61, n. 2, p. 119–125, 10 jan. 2013.
WINDMUELLER, H. G.; SPAETH, A. E. Perfusion in situ with tritium oxide to
measure hepatic lipogenesis and lipid secretion. Normal and orotic acid-fed rats. The
Journal of biological chemistry, v. 241, n. 12, p. 2891–9, 25 jun. 1966.
WU, C. et al. [Roles of glucose-6-phosphate dehydrogenase in obesity induced by high
fat diet]. Wei sheng yan jiu = Journal of hygiene research, v. 42, n. 3, p. 447–50,
maio 2013.
YAMAUCHI, T. et al. The mechanisms by which both heterozygous peroxisome
proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) deficiency and PPARgamma
agonist improve insulin resistance. The Journal of biological chemistry, v. 276, n. 44,
p. 41245–54, 2 nov. 2001.
ZHAO, P.; STEPHENS, J. M. Identification of STAT target genes in adipocytes. JAK-
STAT, v. 2, n. 2, p. e23092, 1 abr. 2013.
ZIMMERMANN, R. et al. Fat mobilization in adipose tissue is promoted by adipose
108
______________________________________________________________________ Referências bibliográficas
triglyceride lipase. Science (New York, N.Y.), v. 306, n. 5700, p. 1383–6, 19 nov.
2004.