Tese de doutorado Introdução
Karina J. Malquichagua Salazar
INTRODUÇÃO
“Educação gera conhecimento, conhecimento gera sabedoria, e somente um povo
sábio pode mudar seu destino”
Samuel Lima
Tese de doutorado Introdução
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1. INTRODUÇÃO
1.1. Família Piperaceae
A família Piperaceae, pertencente à ordem Piperales, compreende catorze
gêneros (Calle et al., 1983). É uma das famílias mais primitivas entre as
angiospermas e, junto com Chlorantaceae e Sauraceae, têm sido consideradas
fósseis vegetais vivos (Taylor and Hickey, 1984). Suas espécies podem ser
encontradas em todas as regiões tropicais e subtropicais do planeta, embora a
grande maioria se encontre na parte central e norte da América do Sul (Steyemark,
1984).
As espécies de Piperaceae são predominantemente ervas, arbustos ou
arvoredos, mas também podem ser epífitas ou suculentas, especialmente no caso
de Peperomias.
1.1.1 O gênero Peperomia
Dentre todos os gêneros que compõem essa família, os dois principais, por
ter o maior número de espécies são Peperomia, que alguns autores consideram
família Peperomiaceae, com mais de 1500 e Piper com cerca de 2000 espécies. A
etimologia do nome Peperomia (“peper-omos” – grego: semelhante à Piper) é
baseada na semelhança das flores desse gênero com as de Piper (Wanke et al.,
2007).
A maioria das espécies de Peperomia apresenta folhas providas de tecidos
especializados no armazenamento de água. Esse tecido pode variar em espessura,
determinando maior ou menor suculência à folha. Algumas delas apresentam
elevado grau de suculência, o que muda consideravelmente a morfologia foliar
(Kaul, 1977). A alta capacidade de armazenar água compensa os períodos de seca
Tese de doutorado Introdução
Karina J. Malquichagua Salazar 24
que são muito comuns para espécies de hábito epífito (Helbsing et al., 2000).
Muitas espécies são cultivadas, comercializadas e exportadas como plantas
ornamentais. Como se observa (Figura 1) é grande o potencial de espécies de
Peperomias com essa finalidade.
Peperomia urocarpa
Peperomia nítida Dahl.
Peperomia oreophila
Peperomia arifolia
Peperomia tricolor
Peperomia rotundifolia
Figura 1. Espécies de Peperomias
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1.1.2. Espécies Peperomia
Entre as espécies de Peperomia coletadas pelo LQPN e identificadas pela
Dra. Elsie Franklin Guimarães (Jardim Botânico do Rio de Janeiro) foram
selecionadas quatro espécies de Peperomia para estudo fitoquímico: P. oreophila, P.
urocarpa, P. arifolia e P. nitida. A espécie Peperomia glabella foi selecionada para o
estudo biossintético de um policetídeo. Todas as exsicatas foram depositadas nesse
herbário (Tabela 1).
Dessas espécies, apenas P. oreophila e P. glabella tiveram estudos
fitoquímicos realizados. Para P. oreophila foi descrita a composição de seus óleos
essenciais (Lago et al., 2007) baseada na presença de hidrocarbonetos
sesquiterpênicos: β-elemeno, α-ilangeno, α-guaieno e β-selineno, espatulenol e
sesquiterpenos como 3-ishwarol (1) e 3-ishwarona (2) (Tabela 2, página 6). Estudos
químicos de espécimes de P. glabella revelaram a presença de uma acetofenona
(3), a 2-hidróxi-4,6-dimetoxiacetofenona (Soares et al., 2006), além de uma
secolignana (4) (Monache & Compagnone et al., 1996) (Tabela 2, página 6).
Para o estudo de genes PKSs foram selecionadas as espécies de
Peperomias descritas na tabela 1, exceto P. oreophila. Dessas apresentam estudos
fitoquímicos P. serpens e P. galioides. Estudos químicos de P. serpens revelaram a
presença de dois cromenos, um deles contendo o ácido orselínico e o segundo a
forma descarboxilada (12-13, página 14) (Kitamura et al., 2006.). P. galioides
acumula três quinonas (9-11), um terpeno (8), um ácido orselínico prenilado e seus
derivados descarboxilados (5-7, páginas 7 e 8) (Mahiou et al., 1995; Mahiou et al.,
1996; Villegas et al., 2001).
Tese de doutorado Introdução
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Tabela 1. Dados de coleta e depósito das espécies de Peperomias estudadas
Peperomia Local de coleta Data Voucher
P. oreophila Hesch Serra da Piedade,
MG 12/junho/ 2004 K-418
P. urocarpa (Miq) Fisch. & C.A. Mey.
Bairro do Corcovado Ubatuba, SP
19/março/ 2005 K-552
P. arifolia Miq. Brotas, SP 11/abril/ 2004 K-395
P. nitida Dahlst Igatú, Andaraí, BA 13/fevereiro/ 2006 K-698
P. glabella (sw.) A. Dietr.
Lençóis, Guiné, BA 8/agosto/ 2004 K-414
P. incana
(Haw) A. Dietr. Jardim do LQPN
28/janeiro/ 2008
K-343
P. rubricaulis
(Nees) A. Dietr.
Gruta do Tatu,
Intervales, SP 16/outubro/2004 K-455
P. caperata Yunck.
Adquirida no
comércio local, SP 26/abril/2007 K-888
P. serpens (Sw.) Loudon
Trilha do Corcovado, Ubatuba, SP
17/novembro/2007 K-921
P. galioides H.B.K. Pedra Branca, Poços
de Caldas MG 2/junho/2005 K-582
Tese de doutorado Introdução
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1.2. Metabólitos secundários de espécies de Peperomia
A revisão bibliográfica sobre estudos químicos realizados com espécies de
Peperomia aponta para 18 espécies (Tabela 2). É um conjunto reduzido de
espécies quando se considera um número estimado em torno de 2000 espécies, e
em relação às espécies de Piper, que apresenta centenas de estudos químicos.
Tabela 2. Metabólitos secundários isolados de espécies de Peperomia
Substância Planta (parte estudada) Atividade Referência
O OH
1 2
P. oreophila - Lago et al.,
2007
OHO
O OH
O
O O
P. obtusifolia
(parte aérea)
-
Tanaka et al.,
1998.
OH O
Me
OMeMeO
3
P. glabella - Soares et al.,
2006
O
O
O
O
O O
4
P. glabella
(planta inteira)
- Monache and
Compagnone
et al., 1996
Tese de doutorado Introdução
Karina J. Malquichagua Salazar 28
O
ROH
R= H, COOH
O
OH
R
R=H, COOH
P. amplexicaulis
(planta inteira)
- Burke et al.,
2003.
OH
OH
5
P. galioides
(planta inteira)
P. obtusifolia
(parte aérea)
Atividade
antiparasitária
Mahiou et al. ,
1995.
Tanaka
et al. , 1997.
OH
OH
R
6 R=COOH7 R=H
P. galioides
(planta inteira)
Atividade
antiparasitária
Mahiou et al.,
1995.
R3
R2
R
R1
O O
O O
1 R=R1=R2=R3=OCH2O2 R=R1=OCH2O, R2=R3=OMe3 R=R1=R2=R3=OMe
P. japonica
(planta inteira)
- Chen et al.,
1989.
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OH
8
P. galioides
(planta inteira)
Atividade
cicatrizante
Villegas et al.,
2001.
OOH
O
O
O n
n=10
1' 12'
5''6''
O n
OOH
n=12
1'
19'
P. vulcanica
-
Mbah et al.,
2002.
O
O
OH 9
O
O
OH10
O
O
O
11
P. galioides
(planta inteira)
Atividade
antiparasitária Mahiou et al.,
1996.
CH3O
CH3O
OCH
OCHCH3O
OCH
3
3
3
P. pellucida
(parte aérea) -
Bayma et al.,
2000.
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O
R
R'
R= H e R'=OHR=OH e R'=H
P. blanda
(partes aéreas)
-
Velozo et al.,
2006.
O
O
R1R2
R3
OMe
OMe
MeO
H
O
OMe
OMe
MeO
H
OO OAc
MeO
OH
O
OAcOH
OO
OH
OMe
OMeMeO
R1 R2 R3 1 OH OH OCH3
2 OCH2O OH
P. heyneana
Anti HIV
Zhang et al.,
2007.
H
CH2OAc
H
OH
O
O
OO
OO
OMe
Me
O
H
O
O
OO
OO
O
Me
Me
P. dindygulensis
(parte aérea) -
Govindachari
et al., 1998.
Tese de doutorado Introdução
Karina J. Malquichagua Salazar 31
O
O
O
O
H
H
R1
R2
R3
R4
O
O
O
O
H
OH
OMe
OMe
OH
O
O
O
O
H
OMe
H
OMe
OH
O
O
O
OO
OH H
MeO
OMe
MeO
OO
CH2OAcO
O
OMe
MeO
CH2OAc
OO
CH2OHO
O
OMe
MeO
CH2OH
R1 R2 R3 R4 1 OCH3 OCH2O OCH3
2 OCH3 OCH3 OCH3 OCH3
3 OCH3 OCH3 OH H 4 OCH3 OCH3 OH OCH3
5 H OCH3 OH OCH3
6 OCH3 OCH2O H 7 H OCH2O OCH3
8 OCH3 OH OH OCH3
MeO MeO
P. duclouxii
Atividade contra
células VA-13 e
HepG2
Li et al., 2006.
O
OO
OR1
R2
OMe
OMe
H HO
OO
O
OMe
H H
OH
MeO
O
O
O
HOH2C
OO
MeO
MeO
O
O
OH
CH2OAc
CH2OAc
OMeMeO
OMe
R1 R2 1 OCH2O 2 OCH3 OH 3 OH OH
P. duclouxii
Atividade contra
células
cancerígenas
VA-13 e HepG2
Li et al., 2007.
Tese de doutorado Introdução
Karina J. Malquichagua Salazar 32
O
O
R5
R4
R3
CH2OR2
CH2OR1
OMe
O
O
H
R2
R3
R4
R1
O
OH
R1 R2 R3 R4 R5 6 Ac Ac OCH3 OCH3 OCH3
7 Ac H OCH2O OCH3
8 Ac Ac OCH3 OH OCH3
9 H H OCH2O H
R1 R2 R3 R4 1 OCH3 OCH2O OCH3
2 OCH3 OCH3 OCH3 OCH3
3 OCH3 OCH3 OH H 4 OCH3 OCH3 OH H 5 H OCH3 OH OCH3
P. duclouxii -
Li et al., 2003.
O
OOR1
R2
R4OH2C CH2OR3
OMeMeO
O
OO
HOH2C CH2OAc
OMeMeO
OO
OHO
O
R1 R2 R3 R4 1 OCH2O Ac H 2 OCH2O H Ac 4 OCH3 OH Ac Ac 5 OCH3 OCH3 Ac H
P. dindygulensis
Antiinflamatória
Wu et al.,
2005.
Tese de doutorado Introdução
Karina J. Malquichagua Salazar 33
O
OR1O
OR3
OR4
HMeO
MeO
Me
R1 R2 R3 R4 1 CH2 CH3 H 2 CH3 CH3 CH3 H 3 CH3 CH3 H CH3
9 CH2 CH2 10 CH2 CH3 CH3
11 CH3 CH3 CH3 CH3
R2O
O
O
OR1
OR2
HMeO
MeO
OO
R3OH2C
R1 R2 R3 4 CH2 H 5 CH3 CH3 H 6 CH3 H Ac
O
O
OR1
OR2
HMeO
MeO
OO
O
HMeO
MeO
OO
OO
OH
R1 R2 7 CH3 H 12 CH2
P. dindygulensis
Antitumoral Wu et al.,
2006.
O
OH
P. clusiifolia
-
Seeram et al.,
1998.
Tese de doutorado Introdução
Karina J. Malquichagua Salazar 34
O
OOH
OH
O
O
O
OOH
O
OH O
OH
OOH
OH
P. sui
Atividade contra
células
cancerígenas
HONE-1 e
NUGC-3
Cheng et al.,
2003.
O
O O
O
O
OMe
OMe OMe
O
O
O
OMe
OMe
P. tetraphylla - Li et al., 2007.
O
OO
OH
H
O
O
O
OH
H
O O
O
OR
H
P. proctorii - Seeram et al.,
2000.
Tese de doutorado Introdução
Karina J. Malquichagua Salazar 35
O
OR1R2
H
OO
R3
OMe
MeO
OMe
O
OAcR3O
R1
R2OH
OMe
MeO
MeO
OOMe
MeO
OMe
MeO
OMe
OMe
R1 R2 R3
3 OCH2O H 4 OCH3 OH Ac
R1 R2 R3
1 CH2 OCH3
2 H CH3 OH
P. pellucida
Atividade contra
células
cancerígenas
HL-60 e MCF-7
Xu et al.,
2006.
O
OH
OH
O
n
O
O
O
O
O
O OH
12
1 n=82 n=10 3 n=12
P. ducloxii
Atividade contra
células
cancerígenas
VA-13 e HepG2
Li et al., 2007.
O
OH
O
OHO
OH
12 13
P. serpens Fungicida Kitamura et
al., 2006.
Tese de doutorado Introdução
Karina J. Malquichagua Salazar 36
O
RO
OMe
MeO
O
O
OMe
O
OMe
MeO
MeO OH
OMe
OMe
O
OMe
O
O O
O
OMe
O
OMe
MeO
OH
MeO O
O
OMe
1 R=H2 R=Me
P. blanda Tripanocida Felippe et al.,
2008.
O
O
OMe
O
Meo
OOH
O
Meo
O OMe
O
O
R1O
R2O
OR3
O
O
MeO
RO
1 R=H2 R=Me
3 R1=R2=R3=H4 R1=R3=H, R2=Me5 R1=Me,R2=H,R3=Ac
P. villipetiola Fungicida Salazar et al.,
2005.
O
OOH
XyIO
OMeGlu
O
OOH
OH
GluOMe
Glu
P. blanda Antioxidante Veloso et al.,
2009.
Tese de doutorado Introdução
Karina J. Malquichagua Salazar 37
1.3. Aspectos gerais da biossíntese
A biossíntese dos produtos naturais é, dentre as áreas modernas da química,
uma das mais recentes e representa nos conceitos e na metodologia a intersecção
da química com a biologia molecular (Lobo e Lourenço, 2007).
Depois da elucidação estrutural do metabólito secundário, geralmente é
possível propor a biogênese para a formação do mesmo, a partir de blocos
construtores, tais como: acetato, mevalonato, chiquimato ou aminoácidos (Mann,
1994).
Ao propor-se um precursor, há sempre necessidade de verificar se ele está de
fato no percurso químico que conduz ao composto em estudo. A confirmação da rota
proposta pode ser feita por dois caminhos. Um deles é através da incubação de
precursores marcados ou não em extratos enzimáticos (in vitro). Nesta técnica, as
enzimas que atuam na formação do metabólito de interesse são extraídas do
organismo em estudo e incubadas com os possíveis precursores. O outro caminho é
a incorporação de precursores isotopicamente marcados, ou não, em organismos
intactos, tais como plântulas, órgãos, vegetais e cultura de células (in vivo). Neste
procedimento, a enzima responsável pela síntese do metabólito de interesse utiliza
todo o maquinário celular para produzí-lo. Sendo assim, não é necessário fornecer
condições especiais para que a enzima expresse sua atividade. É necessário
apenas que o organismo em estudo seja mantido vivo (Bacher et al., 1999).
No primeiro caso, assim que os tecidos são rompidos, as proteínas são
liberadas de sua estrutura organizada, utilizando-se tampões de extração, os quais
geralmente estão oxigenados, e as enzimas proteolíticas que estavam mantidas em
Tese de doutorado Introdução
Karina J. Malquichagua Salazar 38
compartimentos dentro da célula, também são liberadas. Assim as enzimas são
expostas a três tipos de circunstancias que podem resultar em perda de atividade:
• Desnaturação. A desnaturação pode ser minimizada evitando pH e temperaturas
extremas, desnaturantes como solventes orgânicos, sais (“chaotropics”), e outros
solutos que podem quebrar ligações de hidrogênio e interações hidrofóbicas.
• Inativação do sítio catalítico. Os sítios ativos de uma enzima contem resíduos de
aminoácidos, que são reativos e susceptíveis à modificação, e são responsáveis
pela habilidade catalítica da enzima. Normalmente a atmosfera no interior da célula
4é redutora e a presença de outras moléculas que contém sulfidrilas protege esses
grupos. Mas, quando expostas a uma alta tensão de oxigênio, podem ocorrer
formação de ligações de dissulfetos (-S-S-), oxidações e reações com metais
iônicos. Nestes casos duas medidas de proteção podem ser tomadas: (i) a adição de
EDTA para a remoção de traços de íons metálicos, através da complexação; e (ii) a
adição de um reagente contendo sulfidrilas como o β-mercaptoetanol ou
ditiotreitol/ditieritritol. Outro fator que leva à inativação é a perda de cofatores
durante o processo de solubilização das proteínas, que pode ser reposta (no caso
de ser conhecida) no tampão ou antes da reação enzimática. E, no caso de soluções
diluídas de enzimas a atividade é perdida rapidamente, sendo assim a presença de
ovo albumina (BSA) é necessária. No entanto, seu modo de ação é controverso,
possivelmente interagindo com a enzima diminuindo a dissociação ou agindo como
uma chaperona minimizando o desdobramento da enzima. A seroalbúmina é
também utilizada para minimizar a perda de proteína por absorção nas paredes do
recipiente, especialmente se este for de vidro (Scope, 1994).
Tese de doutorado Introdução
Karina J. Malquichagua Salazar 39
• Degradação proteolítica. As células contem fatores que podem resultar na sua
própria degradação, incluindo as enzimas hidrolíticas de digestão, tais como as
nucleases, hidrolases de polissacarídeo, fosfatases e proteases. Nas células de
mamíferos, essas enzimas encontram-se acumuladas em lisossomas, as quais
agem sobre os polipetídeos indesejados e outros polímeros quando sua degradação
é demandada por circunstâncias fisiológicas. Em plantas, as enzimas digestivas
estão estocadas nos espaços vacuolares e sua ação no citoplasma pode estar sob o
controle de uma variedade de inibidores específicos. No entanto, o delicado
equilíbrio envolvido na organização espacial e funcional de sistemas enzimáticos
sempre é perturbado no processo de obtenção de um extrato enzimático, em função
da mistura das enzimas hidrolíticas com todos os constituintes celulares.
Conseqüentemente deve-se aceitar o fato que enzimas digestivas estarão
sempre presentes e, em função disso, medidas devem ser tomadas para a
manutenção da atividade desejada. Inibidores proteolíticos são compostos químicos
ou biológicos que inibem especificamente enzimas proteolíticas, porém a eficácia
desses é sempre variável (Scope, 1994).
1.4. Policetídeos
Os produtos naturais policetídicos constituem-se um dos maiores e mais
diversificado grupo de metabólitos secundários. Esses metabólitos são produzidos
por cerca de mil diferentes organismos desde procarióticos até eucarióticos.
Antibióticos e micotoxinas produzidos por fungos e actinomicetos, estilbenos e
flavonóides produzidos por plantas são exemplos de substâncias policetídicas. Os
policetídeos têm um papel importante na medicina, devido as suas atividades
Tese de doutorado Introdução
Karina J. Malquichagua Salazar 40
antimicrobianas, antiparasitárias, antineoplásica e imunossupressivas
(Flores-Sanchez and Verpoorte, 2009; Austin and Noel, 2003)
1.4.1. Policetídeos sintases (PKSs)
Policetídeos sintases (PKSs) constituem-se num grupo de enzimas que
catalisam a condensação de ésteres-CoA, tais como acetil-CoA, com extensores de
ésteres de CoA, tais como malonil-CoA (Flores-Sanchez and Verpoorte, 2009). As
PKSs são classificados segundo a sua configuração arquitetônica, como PKS I, II e
III.
O tipo I, presentes em bactérias ou fungos, refere-se a um sistema de um ou
mais proteínas multifuncionais que contém um diferente sítio ativo por cada reação
catalisada pela enzima na montagem e modificação da cadeia de carbonos do
policetídeo. São organizadas em módulos, contendo pelo menos uma aciltransferase
(AT), proteína carregadora de grupos acila (ACP) e atividade β-ceto acil sintase (β-
KS) (Figura 2, página 41).
O tipo II é um sistema de enzimas individuais que carregam um único
conjunto de atividades que agem interativamente. Um conjunto mínimo consiste de
duas unidades cetosintases e uma ACP, que serve como âncora para a cadeia
carbônica. As subunidades adicionais como cetoredutases, ciclases ou aromatases
definem o padrão de ciclização do policetídeo intermediário, seguindo-se de
modificações adicionais como oxidações, reduções ou glicosilações (Figura 3,
página 41). O único grupo conhecido de organismos que utilizam esse sistema são
os actinomicetos Gram positivos do solo e marinhos.
O tipo III está presente em bactérias (Figura 4, página 41), plantas e fungos, e
Tese de doutorado Introdução
Karina J. Malquichagua Salazar 41
são enzimas essencialmente condensadas com ausência de ACP e agem
diretamente com substratos acil-CoA (Flores-Sanchez and Verpoorte, 2009).
Figura 2: Sistema modular do sistema enzimático de PKS I
Figura 3: Sistema enzimático de PKS II
Figura 4: Sistema enzimático de PKS III
Todos as PKSs, de maneira semelhante aos seus ancestrais ácidos graxos
Tese de doutorado Introdução
Karina J. Malquichagua Salazar 42
sintase (FAS), possuem a atividade ß-ceto sintase (KS) que catalisa a incorporação
seqüencial de uma unidade contendo dois átomos de carbonos numa cadeia
policetídica crescente. No entanto, os sistemas FAS realizam reações adicionais de
redução e desidratação sobre as cadeias policetometilênicas resultantes para
produzir um acido graxo alifático predominantemente saturado.
Entretanto, o sistema PKS omite ou modifica alguma dessas últimas reações,
preservando a reatividade química com variações de polaridade, junto com cadeias
lineares policetometilênicas crescentes.
As enzimas PKSs aproveitam a reatividade desses intermediários
policetídicos, para promover ciclizações intramoleculares (Esquema 1, página 44),
gerando assim, uma diversidade de produtos monocíclicos e policíclicos substituídos
a partir de simples blocos de acetato (Flores-Sanchez and Verpoorte, 2009; Austin &
Noel, 2003).
1.4.2. PKS III
Vários tipos de PKSs III têm sido encontrados em plantas e participam na
biossíntese de metabólitos secundários (Tabela 3, página 22) incluindo chalcona
sintases (CHS), 2-pirona sintases (2-PS), estilbeno sintases (STS), bisbenzil
sintases (BBS), homoeriodictiol/eriodictiol sintases (HEDS ou HvCHS), acridona
sintases (ACS), benzofenona sintases (BPS), florisovalerofenona sintases (VPS),
isobutirofenona sintases (BUS), ácido triacético cumariol sintases (CTAS),
benzolacetona sintases (BAS), C-metilchalcona sintases (PstrCHS2) e estilbeno
carboxilato sintases (STCS). Em função das CHSs e STSs serem as enzimas mais
estudadas, este grupo é freqüentemente denominado de família tipo-CHS/STS. Uma
Tese de doutorado Introdução
Karina J. Malquichagua Salazar 43
análise das seqüências descritas para PKS III de plantas revela uma identidade de
46-95% nas seqüências de amino ácidos. Tais enzimas utilizam uma variedade de
substratos iniciadores, que abrange desde compostos alifáticos (R-CoA) até
aromáticos (Ar-CoA), substratos de tamanho reduzido como acetil-CoA até
volumosos como p-cumaroil-CoA, ou ainda substratos polares como malonil-CoA até
menos polares como isovaleroil-CoA, provendo às plantas uma extraordinária
diversificação funcional (Flores-Sanchez and Verpoorte, 2009)
1.4.3. Reações de ciclização em cadeias policetometilênicas
As PKSs de plantas apresentam como características diferentes números de
reações de condensação (alongação na cadeia do policetídeo), tipos de reações de
ciclização e substratos de partida. Baseados nos mecanismos de ciclização, eles
são classificados como tipo-CHS, tipo-STS e tipo-CTAS (Tabela 3, página 46).
A ciclização intramolecular, do tipo condensação de Claisen, envolvendo
enzimas tipo-CHS ocorre entre os carbonos C6 e C1. Esse mecanismo de formação
de ligação C-C não é apenas utilizado para a biossíntese de policetídeos, mas
também para a de ácidos graxos. Nas enzimas tipo-STS a ciclização ocorre entre os
carbonos C2 e C7 via condensação intramolecular aldol que pode ser seguida de
descarboxilação do carbono C1 na forma de CO2 ou não, resultando no estilbeno
ácido como ocorre em H. macrophylla L. (Eckermann et al., 2003) (Esquema 1,
página 44). Exemplos de metabólitos que podem ser formados por enzimas tipo-
STCS são o ácido olivetóico em Cannabis sativa, ácidos anacárdicos de Ginkgo
biloba e o ácido orselínico glicosilado em Syzygium aromatica (Charles et al., 1998)
(Esquema 2, página 47). No caso das enzimas tipo-CTAS, ocorre a formação de
uma lactona entre os carbonos C5 e C1. Junto com esses diferentes tipos de
Tese de doutorado Introdução
Karina J. Malquichagua Salazar 44
ciclizações mencionadas acima, algumas PKSs de planta só catalisam reações de
condensação, porém sem a etapa de reação de ciclização. BAS, tem sido isolada de
R. palmatun e catalisa uma única condensação de malonil-CoA e p-cumaroil-CoA
para formar p-hidroxibenzalacetona (Tabela 3, página 45).
CoAS
O
R
O
R
CoAS
OOO
R
OO
O SCoA
O
R
OO
O O
SCoA
R
OH
OH
O
R
OH
OH OH
CO2
OH
OO
CoAS
OO
OH
R
O
O
R
OH
OOO
R
OH
OH
O OH
Tipo- STSTipo-CHS
estilbenochalcona
Tetracetideo
12
3 4 56
78
9+
3
Tipo-PKS III
Tipo-CTAS
Lactona
Reação de claisenReação de aldol
Lactonização
estilbeno ácido
Tipo-STCS
C6-C1
C2-C7
C5-C1
Esquema 1. Tipos de ciclizações de enzimas PKS de plantas
Tese de doutorado Introdução
Karina J. Malquichagua Salazar 45
Enzima Substratos (iniciador, extensor, Nº condensações)
Tipo de ciclização,
tipo de anel
Produto (Esq. 2)
Planta (espécie) Referência
Nenhuma reação de
ciclização
benzalacetona sintase (BAS)
p-cumaroil-CoA, malonil-CoA (1x)
feruloil-CoA, malonil-CoA (1x)
-
-
1
2
Rubus idaeus
R. palmatum
Abe et al., 2001.
Abe et al., 2007.
Uma reação de ciclização
benzalacetona sintase (BAS)
N-metilantraniloil-CoA (ou antraniloil-CoA)
malonil-CoA (ou metil-malonil-CoA)(1x) -, heterocílico 3 R. palmatum Abe et al., 2006.
Tipo-CTAS
C-metilchalcona sintase
(PstrCHS2)
2-pirona sintase (2-PS)
ácido p-cumaroiltriacético
sintase (CTAS)
Dicetídeo-CoA, metil-malonil-CoA (1x)
acetil-CoA, malonil-CoA(2x)
p-cumaroil-CoA, malonil-CoA(3x)
Lactonização,
heterocíclico
4
5
6
Pinus strobus
G. Hybrida
H. macrophylla
Var. thunbergii
Schroder et al., 1998.
Eckerman et al.,1998.
Akiyama et al., 1999.
Tipo-CHS
chalcona sintase (CHS)
florisovalerofenona sintase
(VPS)
isobutirofenona sintase (BUS)
benzofenona sintase (BPS)
acridona sintase (ACS)
homoeriodictiol/eriodictiol
p-cumaroil-CoA, malonil-CoA (3x)
Isovaleroil-CoA, malonil-CoA (3x)
Isobutiril-CoA, malonil-CoA (3x)
m-hidroxibenzoil-CoA, malonil-CoA (3x)
benzoil-CoA, malonil-CoA (3x)
N-metilantraniloil-CoA, malonil-CoA (3x)
feruloil-CoA, malonil-CoA (3x)
Claisen, Aromático
7
8
9
10
11
12
13
M. sativa
H. lupulus
H. calycinum
C. erythracea
H. androsaemu
H. serrata
Austin et al., 2003.
Okada et al., 2001.
Klingauf et al., 2005.
Beerhues et al., 1996.
Liu et al., 2003.
Austin et al., 2003.
Austin et al., 2003.
Tese de doutorado Introdução
Karina J. Malquichagua Salazar 46
Tabela 3. Exemplos de PKS III, substratos preferidos e produtos de reação
sintase(HEDS ou HvCHS) cafeoil-CoA, malonil-CoA (3x) 14 H.vulgare Austin et al., 2003.
Tipo-STS
estilbeno sintase(STS)
pinosilvin sintase
bibenzil sintase(BBS)
bifenil sintase(BIS)
carboxilato de estilbeno
sintase (STCS)
p-cumaroil-CoA, malonil-CoA (3x)
cinamoil-CoA, malonil-CoA (3x)
di-hidro-m-cumaroil-CoA, malonil-CoA (3x)
benzoil-CoA, malonil-CoA (3x)
Aldol,
Aromático
15
16
17
18
A. hupogaea
Pinus estrobus
Bletilla striata
S. aucuparia
Austin et al., 2004.
Fliegmann et al., 1992.
Preisig et al., 1995.
Liu et al., 2007.
di-hidro-p-cumaroil-CoA, malonil-CoA (3x)
Aldol sem
descarboxilação
, aromático
19
H. macrophylla
Eckermann et al.,
2003.
Duas ou mais reações de
ciclização, miscelânea.
Cromeno pentacetídeo
sintase (PCS)
hexacetídeo sintase (HKS)
aloesona sintase (ALS)
octacetídeo sintase (OKS)
acetil-CoA, malonil-CoA (4x)
acetil-CoA, malonil-CoA (5x)
acetil-CoA, malonil-CoA (6x)
acetil-CoA, malonil-CoA (7x)
-,
heterocíclico
ou aromático
20
21
22
23, 24
A. arborescens
P. indica
R. palmatum
A. arborescens
Abe et al., 2005.
Jinda et al., 2008.
Abe et al., 2004.
Abe et al., 2005.
Tese de doutorado Introdução
Karina J. Malquichagua Salazar 47
O
CH3
OH
R
NO
R2
OH
R1
O
R1
R2
O
OH
R3
OO
OH
OO
OH
O
OH
O
R1
R2OHOH
OH
O
OHOH
OH
R1
R3
R2
O
OHOH
OH
R
N
O
OH
OH
CH3
R
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OHOH
OH
O
OH
O
O
OH
OH
O
OHOH
OH
O
O
O
OH
OH
O
O
O
O
O
OH
OH
OH
O
OOH
O
OH
OH
O OH
OH
COOHO-Glu
OH
COOH
R
OH
COOH OH
HOOC
OMe
OH
OH
COOH
OH
COOH
OH
(1) R=H(2) R=OCH3 (3)
R=H ou CH3
R=H ou CH3
(4)R1,R2=H, R3=CH3
(5)
(6)
(7) R1=OH, R2=H(13) R1=OH, R2=OCH3
(14) R1, R2=OH
(8) R1=H, R2,R3=CH3
(9) R1=CH3, R2,R3=H
(10) R=OH(11) R=H
(12) (15) R=OH (16) R= H
(17)
(18)
(19)(20)
(21)
(22) (23) (24) ácido olivetoico (C. sativa)ácido orselínico glicosilado (S. aromática)
Ácidos anacardicos (G. biloba)
R:C13H27
C15H31
C17H35
Amorfrutim (A. fruticosa)ácido hidrangeico (H. macrophylla)
ácido lunulárico (liverworts)
Esquema 2. Exemplos de produtos biossintetizados por PKS de plantas
1.4.4 . Mecanismos de reações com PKSs III
O principio básico do mecanismo da reação em PKS III consiste na utilização
de um tioéster de CoA iniciador para executar reações de condensações
seqüenciais com duas unidades de carbono de um extensor descarboxilado,
usualmente malonil-CoA. Um intermediário policetometilênico linear é rearranjado
para ciclizar e, posteriormente, formar um sistema aromático. O sítio ativo desses
PKSs é constituido de um túnel que se liga a CoA, um compartimento que se liga ao
substrato de partida e um compartimento onde ocorre a ciclização, e três resíduos
conservados em todos as PKSs conhecidos: Cys164, His303 e Asn336 (numerado
Tese de doutorado Introdução
Karina J. Malquichagua Salazar 48
na Medicago sativa CHS). Cada sítio ativo está contido no monômero e os
substratos aproximam-se através do longo túnel e se liga a CoA. A Cys164 é o
nucleófilo que inicia a reação e ataca ao grupo carbonílico do tioéster de partida
resultando na transferência do grupo de partida para a cisteina. O resíduo Asn336
orienta o grupo carbonílico do tioéster do malonil-CoA perto da Hi303 e Phe215,
provendo um ambiente no polar para o carboxilato terminal, que facilita a
descarboxilação. A ressonância do íon enolato para a forma ceto permite a
condensação do carbânion do acetil com o intermediário policetídico ligado á
enzima. Os resíduos Phe215 e a Phe265 agem como porteiros. A recaptura da
cadeia CoA-dicetideo-acetil-substrato de partida pela Cys164 e o estágio da
liberação da CoA para adicionais ciclos de elongação (Esquema 3), resulta na
formação do intermediário do policetídeo final. Na etapa final ocorre a ciclização
intramolecular do intermediário policetídico (Staunton et al., 2001, Sanchez and
Verpoorte, 2009; Austin and Noel, 2003).
Esquema 3. Proposta do carregamento do substrato, descarboxilação do malonil e
extensão do policetídeo em chalcona sintase (CHS)
A. Carregamento
B. Extensão
Descarboxilação
Condensação
Tese de doutorado Introdução
Karina J. Malquichagua Salazar 49
1.5. O-Metiltransferases (OMTs) em plantas
OMTs dependem da S-adenosil-L-metionina (SAM) para metilar pequenas
moléculas em plantas e estão envolvidos na biossíntese de ligninas, flavonóides,
alcalóides, e muitos outros metabólitos secundários fenólicos de plantas.
Freqüentemente essas metilações são essenciais nas funções fisiológicas das
moléculas por alterarem de forma significativa a polaridade de grupos funcionais. As
OMTs de planta podem ser classificadas em três principais grupos (Websites of the
Schröder Group; Noel et al., 2002):
• Tipo 1. É uma superfamília de proteínas de uma grande diversidade de
substratos. Exemplo são as enzimas metilantes de grupos hidroxílicos de
fenilpropanoides, eugenol, chavicol, flavonóides, isoflavonóides, alcalóides,
cumarinas, orcinois, estilbenos, entre outros. Freqüentemente de ésteres de CoA de
fenilpropanoides que são substratos típicos das enzimas do tipo 2 (ver embaixo).
Características comuns das proteínas do tipo 1: elas são homodímeras com
subunidades de 38-43 kDa, não requerem Mg2+ (ou outros cátions divalentes) para
sua atividade, fato que as diferencia do tipo 2 (Ibdah et al., 2003). Entre os vários
exemplos dessas enzimas tem sido cristalizadas, podem ser citadas a chalcona
O-metiltransferase (ChOMT), a isoflavona O-metiltransferase (IOMT) (Zubieta et al.,
2001) e a hidróxi-isoflavona 4’-O-metiltransferase (HI4’OMT) de Medicago truncatula
(Liu et al., 2006) (Tabela 4, página 51). Tais informações contribuiram para o
entendimento da arquitetura, seletividade do substrato e mecanismo catalítico
dessas reações. No entanto, é ainda difícil prever o substrato fisiológico dos novos
membros desta família tendo como base somente os modelos estruturais. Além
disso, várias enzimas possuem grande promiscuidade por substratos in vitro e não
permite concluir acerca da especificidade in vivo aos substratos. Essa família
Tese de doutorado Introdução
Karina J. Malquichagua Salazar 50
também inclui as S-metiltransferases (SMT) e N-metiltransferases (NMT).
• Tipo 2. Essa família possui menos exemplos que a do tipo 1 e menos
diversificado em número de seqüências e genes. Todas essas proteínas parecem
ser específicas à ésteres-CoA de fenilpropanoides e sua principal reação está
associada à biossíntese de ligninas. No entanto, a especificidade não é absoluta e
há exemplos de membros desta família que também são ativos com flavonoides e
fenilpropanoides (Ibdah et al., 2003; Kim et al., 2006) (Tabela 4, página 51). As
proteínas desta família também são homodímeras, mas o tamanho das subunidades
são menores (23-28 kDa) e requerem um cátion divalente como o Mg2+ para mediar
a desprotonação do grupo hidroxílico antes da transferência do grupo metila. Uma
dessas proteínas, a O-metiltransferase do cafeoil Co-A, foi cristalizada e mostrou
alta similaridade ao OMT do catecol de animais que requer Mg2+ (Ferrer et al., 2005;
Vidgren et al., 1994).
• Tipo 3. A maior parte destas enzimas são metiltransferases de grupos
carboxílicos (carboxil metiltransferases). Constituem-se em exemplos as carboxil
metiltransferases do ácido benzóico e do ácido salicílico em Clarkia breweri (Ross et
al., 1999) (Tabela 4, página 30) e do acido jasmônico em Capsicum annum L. (Min
et al., 2005). Cabe ressaltar que esta família também contém outros membros de
OMTs, tais como N-metiltransferases (NMT), enzimas que realizam as metilações na
biossíntese da cafeína (Yonehama et al., 2006). Esta família também é conhecida
como SABATH, a abreviação dos membros mais conhecidos ate 2003, carboxil OMT
do Ácido Salicílico, carboxil OMT do Ácido Benzóico, e N-metiltransferase da
Teobromina (D’aurea et al., 2003). Como esperado, as estruturas 3D das enzimas
Tese de doutorado Introdução
Karina J. Malquichagua Salazar 51
carboxil OMTs e NMT mostram seqüências similares e, de uma forma geral, as
estruturas são praticamente idênticas.
O-MT tipo 1 em
Medicago sativa,
ChOMT=
chalcona O-MT
(Zubieta et al.,
2001)
O-MT tipo 2 em
Mesembryanthe
crystallinum,
PFMOMT=O-MT
de cafeloil-CoA e
flavonóide (Ibdah
et al., 2003)
O-MT tipo 3 em
Clarkia breweri,
(Dudareva et al.,
1998; Ross et al.,
1999)
Tabela 4. Exemplos de OMTs, substratos e produtos de reação
Isoliquiritigenina
Tese de doutorado Introdução
Karina J. Malquichagua Salazar 52
1.6. Biossíntese em Peperomia glabella
Estudos fitoquímicos prévios de P. glabella descreveram a presença da
acetofenona 3, o 2-hidróxi,4,6-dimetoxiacetofenona no esquema 5, como o principal
metabólito secundário em todas as partes da planta (Soares et al., 2006).
A acetofenona foi previamente isolada de Artemisia maritime (Saxena et al.,
2002) e Plagiochila fasciculata e mostraram atividade fungicida contra Trichophyton
mentagrophytes (Lorimer et al., 1994). Derivados de acetofenona têm mostrado
ainda propriedades anti-inflamatórias (Sala et al., 2001; Favier et al.,1998),
citotóxicas (Huang et al., 1999), anti-HIV e antimicrobiana (Cuesta et al., 1999; Fuller
et al., 1999). O 2-hidróxi-4,6-dimetoxiacetofenona pode ser preparado a partir de 1-
hidróxi-3,5-dimetoxibenzeno (Goldoni et al., 2005; Cunningham et al., 1989), 2,4,6-
triidroxiacetofenona (Aponte et al., 2008) e 1,3,5-trihidroxibenzeno (Matieva et al.,
2002).
A biossíntese da acetofenona (3) (Esquema 5, página 54) não é conhecida,
mas a forma monometilada, o 4,6-diidróxi-2-metoxiacetofenona (Esquema 4, página
53) foi estudada através de experimentos de administração de acetato de sódio
[13C2] que foi incorporado em sua estrutura. Essa se constituía como parte de um
policetídeo maior, o knipholona (Esquema 4, página 53), uma fenilantraquinona
isolada de culturas de Knipholia pumila (Asphodelaceae). Nesse estudo observou-se
a incorporação de três unidades de acetato [13C2], mostrando que a porção 4,6-
diidróxi-2-metoxiacetofenona segue a rota policetídica da mesma maneira que o
crisofanol (Bringmann et al., 2007) (Esquema 4, página 53).
Tese de doutorado Introdução
Karina J. Malquichagua Salazar 53
OHO
O
OH
O
OH OH
OMe
OHO
O
OH
O
OH OH
OMe
O
ONa
O O O O
O
O
OO
SR
O
ONa
O
ONa
OMT
*
3
PKS
SEnz
8
PKS
+
knipholona
crisofanol
4,6-diidróxi-2-metoxiacetofenona
acetato de sódio [13C2] +
Esquema 4. Proposta biossintética do 4,6-diidróxi-2-metoxiacetofenona em Knipholia
pumila (Asphodelaceae)
A natureza estrutural da acetofenona (3) (Esquema 5, página 54) e o estudo
de incorporação de o 4,6-diidróxi-2-metoxiacetofenona (Esquema 4) sugeriram que
sua rota biossintética segue a via policetídica e que, posteriormente, seria metilada
nas hidroxilas 4 e 6 (Esquema 5, página 54). Para a primeira etapa é proposta a
atuação da enzima policetídeo sintase (PKS III), executando a condensação de
quatro moléculas de acetato, sendo que o substrato de partida seria uma molécula
de acetil-CoA e como moléculas extensoras, três de malonil-CoA, para formar o
tetracetídeo. Na seqüência, ocorre a ciclização através de condensação de Claisen
intramolecular formando a 2,4,6-triidroxiacetofenona. A condensação de Claisen
indica que a ciclização ocorreria entre os C1 e C6 e, portanto, deveria pertencer as
enzimas tipo-CHS. Na segunda etapa da biossíntese, a 2,4,6-triidroxiacetofenona
Tese de doutorado Introdução
Karina J. Malquichagua Salazar 54
seria metilada nas hidroxilas em C-4 e C-6, pela enzima O-metiltransferase, que
deve pertencer à família do tipo 1 ou tipo 2.
O
SCoA
O
SCoA
COOH
O O O O
O
O
O
OO
OH
HO
OO
OO
O O
OH
O
O
MeO
OH O
OMe
+ 3 X PKS
SEnz
SEnz
SEnz
-
-
2,4,6-triidroxiacetofenona
Claisen
Enolizaçao Expulsão do grupo de saída
OMTSAM
2-hidroxi,4,6-dimetoxiacetofenona
3
Esquema 5. Proposta biossintética do 2-hidróxi-4,6-dimetoxiacetofenona
1.7. Estudo de cetosintases (KSs) de Peperomias que participam da
biossíntese do ácido orselínico
O estudo fitoquímico de Peperomia oreophila, P. urocarpa, P. arifolia Miq. e
P. nitida revelou que todas essas espécies acumulam pelo menos um ácido
orselínico (ou orselinato) prenilado, cuja natureza estrutural sugere que a sua
biossíntese ocorre pela via policetídica e através de condensação aldólica (Esquema
Tese de doutorado Introdução
Karina J. Malquichagua Salazar 55
6, página 56).
A biossíntese do ácido orselínico envolve a formação de uma cadeia poli-β-
cetometilênica formada por acoplamentos de quatro unidades de C2 através de
reações de condensações de Claisen sucessivas. O ácido orselínico tem sido
isolado de fungos como Penicilinium madriti, no qual foi estudada sua biossíntese e
determinada como sendo via policetidica (Gaucher et al., 1968). Pode ser
comumente encontrado em líquens formando dímeros ou trímeros através de
esterificações (Honda, 1999).
Algumas espécies de Peperomia acumulam derivados de ácido orselínico, na
forma prenilada, metilada, acetilada, oxidada e, após ciclização com a cadeia
prenilada, produzindo cromenos (Salazar et al., 2005).
Considerando a transferência horizontal de genes entre fungo-planta, tal qual
em P. polybothria, na qual foi demonstrada a presença de Introns I a partir de fungos
(Adams et al., 1998), foi objetivado estudar a presença do gene do PKS que
biossintetiza o ácido orselínico em Peperomias (Seeram et al., 1998, Tanaka et al.,
1997, Mahoiu et al., 1995). Espera-se assim, contribuir para o conhecimento desse
gene de PKS para essas espécies.
Tese de doutorado Introdução
Karina J. Malquichagua Salazar 56
O
SCoA
O
SCoA
COOH
O O O O
OO
O
O
OO
OH
HO
OO
O
O
O
O
O O
O
O OH
OH
O O
O
OH
HO
COOH
O
O
OH
+ 3 X
SEnz
SEnz
SEnz
-
+-
Enolizaçao
Hidrólise
Ácido orselínico
H2O
Floracetofenona
aldol Claisen
Enolizaçao
Expulsão do grupo de saída
SEnz
SEnz
SEnz
A B
Esquema 6. Biossíntese de ácido orselínico e floracetofenona (Dewick, 1984)
Tese de doutorado Objetivos
Karina J. Malquichagua Salazar 57
2. OBJETIVOS
� Descrição dos principais metabólitos secundários de espécies de peperomias,
através do fracionamento cromatográfico dos extratos e determinação estrutural das
substâncias isoladas baseada em análises espectrométricas.
� Investigar a atividade de policetídeo sintase nas folhas de Peperomia glabella
através do desenvolvimento de protocolos para a conversão de precursores, bem
como realizar experimentos para identificar os genes correspondentes.
Tese de doutorado Parte Experimental
Karina J. Malquichagua Salazar 58
EXPERIMENTAL
Dificuldades reais podem ser resolvidas; apenas as imaginárias são insuperáveis. Dificuldades reais podem ser resolvidas; apenas as imaginárias são
"A imaginação é mais importante que o conhecimento."
Albert Einstein
Tese de doutorado Equipamento, materiais e métodos
Karina J. Malquichagua Salazar 59
3. EQUIPAMENTOS, MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Equipamentos
3.1.1. Espectrômetros de Ressonância Magnética Nuclear
� Bruker, modelo AC-200, de 200 MHz.
� VARIAN, modelo DPX-300, de 300 MHz.
� Bruker DRX-500, de 500 MHz.
3.1.2. Cromatografia gasosa – Espectrometria de massas (CG-EM)
� Espectrômetro Shimadzu modelo MS-QP-5050, acoplado a um cromatógrafo
Shimadzu, modelo CG-17A (IQ-USP), com ionização por impacto de elétrons (70
eV), equipado com coluna capilar DB5 de 30 m de comprimento e 0,25 mm de
diâmetro.
3.1.3. Espectrofotômetro no Infravermelho
� Espectrofotômetro Bomen 100, Perkin Elmer, empregando-se pastilha KBr ou
filme.
3.1.4. Espectrofotômetros no Ultravioleta
� A determinação das concentrações das proteínas totais foi realizada num
espectrofotômetro Shimadzu, modelo UV 1650 PC.
3.1.5. Cromatógrafo líquido de alta eficiência
� Em escala analítica foi utilizado o cromatógrafo analítico Shimadzu com
sistema binário de bombas, modelo LC-10AD, detector UV-visível com arranjo de
diodos modelo SPD-10AD e injetor automático Shimadzu SIL-10A, utilizando
coluna analítica de fase reversa, Phenomenex LC-18, 25 cm x 4,6 mm x 5µm.
Tese de doutorado Equipamento, materiais e métodos
Karina J. Malquichagua Salazar 60
3.1.6. Centrífuga
� As centrifugações dos extratos enzimáticos foram realizadas numa centrífuga
refrigerada Hitachi, modelo CR22GII e das partições dos ensaios enzimáticos numa
centrifuga de mesa, modelo 5415D da Eppendorf.
3.1.7. Termociclador
� As reações em cadeia da polimerase foram realizadas no termociclador da
Biorad my cycler TM.
3.1.8. Eletroforese em gel de agarose
� Cubas de eletroforese, Sub-cell® e Mini-Subcell® da Biorad.
3.2. Materiais
3.2.1. Cromatografia em camada delgada analítica ou comparativa
3.2.1.1. Fase estacionária
� Para cromatografia em camada planar comparativa (CPC) utilizou-se, como
fase estacionária sílica gel 60 F 254 com partículas de tamanho 4-45 µm e
espessuras de 0,50 mm, da Merck sob suporte de alumínio.
3.2.1.2. Agentes reveladores
� As revelações foram efetuadas com irradiação de luz na região do UV (254 e
360 nm) ou sulfato cérico seguido de aquecimento.
3.2.2. Cromatografia em camada delgada preparativa
3.2.2.1. Fase estacionária
� Foi utilizada a cromatografia em camada delgada preparativa planar (CPP)
com fase estacionária sílica gel 60 PF 254 com partículas de 4-45 µm e uma
espessura de 1 mm.
3.2.2.2. Agentes reveladores
Tese de doutorado Equipamento, materiais e métodos
Karina J. Malquichagua Salazar 61
� As revelações foram efetuadas com irradiação de luz na região do UV (254 e
360 nm).
3.2.3. Cromatografia em coluna (CC)
3.2.3.1. Fase estacionária
� A fase estacionária empregada para cromatografia em coluna sob vácuo foi
sílica gel 60 com partículas de 63-210 µm da Merck.
3.2.3.2 Solventes
� Para cromatografia, utilizaram-se solventes P.A. da Supren e Synth.
3.2.4. Solventes para RMN
� Solvente deuterado da Acros, CDCl3.
3.2.5. Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
3.2.5.1. Fase estacionária
� Coluna analítica de fase reversa, Phenomenex LC-18, 25 cm x 4,6 mm x 5µm.
3.1.2.5.2. Fase móvel
� Utilizaram-se como eluentes MeOH ou Acetonitrila grau CLAE da Synth e
água MilliQ.
3.2.6. Cromatografia por permeação de gel
� Foram utilizados como fase estacionaria Sephadex LH-20 da Merck e
Sephadex TM G-25 da GE Healthcare.
3.2.7. Eletroforese em gel de agarose
� TopVision™ LE GQ Agarose, da Fermentas
3.2.8. Reagentes da reação em cadeia da polimerase
� MgCl2 (25mM), dntps (25mM), Taq DNA polimerase (500 U), tampão 10X taq
e marcador de massa molecular 100pb da Fermentas.
Tese de doutorado Equipamento, materiais e métodos
Karina J. Malquichagua Salazar 62
� Os iniciadores da BIONEER.
3.2.9. Kits de extração e purificação de ADN
� Kit de extração de ADN genômico de plantas ‘’NucleoSpin® Plant II’’ da
Macherey-Nagal.
� Kits de purificação de ADN de gel de agarose ‘’PureLink™ Quick Gel’’ da
invitrogen e ‘’ GFX PCR DNA and Gel Band’’ da Amersham Biosciences.
3.2.10. Material Botânico
� Os materiais vegetais foram identificados pela Dra. Elsie Franklin Guimarães
(Instituto de Pesquisas Jardim botânico do Rio de Janeiro). As exsicatas dos
materiais vegetais estão depositadas neste herbário.
A classificação botânica das espécies Peperomia de acordo com o Sistema
de classificação de Angiospermas proposto por Cronquist (1981) encontra-se nas
Tabelas 5.
Tabela 5. Classificação morfológica da família Piperaceae, (Cronquist, 1981)
Reino Plantae
Divisão Angiospermae A. Brau & Doill (Magnoliophyta)
Classe Dicotiledonae
Subclasse Magnolidae
Ordem Piperales
Família Piperaceae Agardth
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Karina J. Malquichagua Salazar 63
3.3. Metodologia 3.3.1. Processamento do material vegetal
O material vegetal de cada espécie depois de coletada (Tabela 1, página 26)
foi seco em estufa a 50°C por 48 horas. Ao final do período, o material seco foi
triturado em um moinho de facas para obtenção do material pulverizado.
3.3.2. Obtenção do extrato bruto, análise preliminar, fracionamento e purificação
das substâncias presentes em maior quantidade em espécies de Peperomia.
3.3.2.1. Peperomia oreophila
• Obtenção do extrato bruto - As folhas (38,6 g) foram submetidas a extração com
600 mL de metanol por 12 horas à temperatura ambiente, (essa operação foi
repetida mais três vezes). Na seqüência, a solução obtida foi filtrada e concentrada
em rotaevaporador sob pressão reduzida, obtendo-se assim 4,6 g do extrato bruto
de consistência viscosa.
• Partição líquido-líquido - Uma parte do extrato obtido (600 mg) foi submetida à
partição líquido-líquido com EtOAc e H2O. A fase orgânica foi concentrada em
rotaevaporador sob pressão reduzida, obtendo-se 288 mg.
• Análise preliminar do extrato - A análise preliminar foi baseada em cromatografia
em camada delgada comparativa, utilizando-se como eluente Hex-EtOAc (4:1).
Observaram-se cinco manchas principais sob a lâmpada de UV em 256 nm. A
seguir, para ter um perfil melhor do extrato, foi injetado no CLAE-DAD
(Concentração da amostra, 2mg/mL; vazão, 1,0 mL/min; volume de injeção, 20 µL,
gradiente, tabela 5) obtendo-se um perfil abundante em picos, sendo que o maior
número de picos foram observadas em 301 nm (Figura 5, figura 64).
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Karina J. Malquichagua Salazar 64
Figura 5. Cromatograma obtido por CLAE da fração solúvel em EtOAc do extrato
metanólico das folhas de Peperomia oreophila. Coluna C18, fase móvil H2O/CH3OH
(modo gradiente), vazão: 1mL/min, λ= 301 nm.
Tabela 6. Gradiente utilizada para a análise do extrato das folhas da
Peperomia oreophila por CLAE-DAD
Tempo (minutos) % de MeOH % de H2O
0.1 40 60 5 40 60 35 100 0 40 100 0 45 40 60 50 40 60
• Fracionamento cromatográfico - O extrato foi submetido a uma cromatografia em
coluna utilizando como fase estacionária Sephadex LH-20 (70 gramas), com
gradiente de polaridade, utilizando como eluentes Hexano, DCM e acetona.
Obtiveram-se 28 frações, que após CPC foram reuniram em 9 frações (Tabela 7,
página 67).
M in u t e s
0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5 5 0
mA
U
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
1 0 0 0
1 2 0 0
mA
U
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
1 0 0 0
1 2 0 0
7.7
74
9.6
00
11
.20
0
12
.69
31
3.6
73
14
.50
71
5.6
80
16
.80
4
18
.13
31
8.6
67
20
.16
02
1.0
13
21
.90
7
23
.25
32
4.1
07
25
.60
02
6.5
60
28
.33
5
30
.34
8
31
.96
9
34
.81
4
37
.97
3 39
.22
9
D e te c to r A-3 0 1 n mo r e o fi l a 1o r e o fi l a 1
R e t e n t io n T im e
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• Purificação das substâncias presentes em maior quantidade - A purificação foi
realizada mediante CPP, obtendo-se no total nove compostos (Esquema 7, página
67).
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Esquema 7. Fracionamento do extrato bruto e purificação das substâncias presentes em maior quantidade em P. oreophila
d
f
c b
Extrato metanólico das folhas da Peperomia oreophila (600 mg)
1. Partição líquido-líquido do extrato bruto (AcOEt:H2O)
2. Coluna cromatográfica da fase orgânica (288 mg),
Sephadex LH-20 Hex:DCM:Acetona (incremento
a e g
a -CCP (Sílica) Hex / AcOEt (4:1) b -CCP (Sílica) Hex / AcOEt (4:1) c -CCP (Sílica) Hex / AcOEt (4:1) d -CCP (Sílica) Hex / AcOEt (4:1) h- CCP (Sílica) Hex / AcOEt (4:1)
h F1-F4
(56,6 mg) 1
(38,00mg) 2
(12,0 mg)
F5 (32,0 mg)
1 (20,0 mg)
2 (9,0 mg)
F6-F7 (14,2 mg)
1 (3,8 mg)
2 (2,0 mg)
5/6 (8,0 mg)
F8-F12 (23,0 mg)
3 (8,8 mg)
4 (8,6 mg)
7 (5,4 mg)
F13 8
(9,6 mg)
F21-F22 9
(6,8 mg)
F23-F26 (71,6 mg)
9 (23,6 mg)
F14-F20 8 + 9
(45,4 mg)
F27-F28 Impureza polar
(18,2 mg)
i
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Tabela 7. Massas das frações obtidas, eluentes utilizados e frações reunidas do
fracionamento em coluna do extrato de folhas de P. oreophila
N° Fração Massas (mg) Eluentes (V:V) Grupo
1 11,24 DCM:Hex (4:1) a
2 13,20 DCM:Hex (4:1) a
3 21,40 DCM:Hex (4:1) a
4 10,60 DCM:Hex (4:1) a
5 32,00 DCM:Acetona (3:2) b
6 8,80 DCM:Acetona (3:2) c
7 5,40 DCM:Acetona (3:2) c
8 7,20 DCM:Acetona (3:2) d
9 4,40 DCM:Acetona (3:2) d
10 3,20 DCM:Acetona (3:2) d
11 3,40 DCM:Acetona (3:2) d
12 4,20 DCM:Acetona (3:2) d
13 9,60 DCM:Acetona (1:4) e
14 7,00 DCM:Acetona (1:4) f
15 4,40 DCM:Acetona (1:4) f
16 8,60 DCM:Acetona (1:4) f
17 9,40 DCM:Acetona (1:4) f
18 6,60 DCM:Acetona (1:4) f
19 4,20 DCM:Acetona (1:4) f
20 5,20 DCM:Acetona (1:4) f
21 2,60 DCM:Acetona (1:4) g
22 4,20 DCM:Acetona (1:4) g
23 9,40 DCM:Acetona (1:4) h
24 13,20 DCM:Acetona (1:4) h
25 32,00 DCM:Acetona (1:4) h
26 17,00 DCM:Acetona (1:4) h
27 2,20 DCM:Acetona (1:4) i
28 16,00 MeOH i
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3.3.2.2. Peperomia urocarpa
• Obtenção do extrato bruto - Folhas secas e moídas (9,88 g) foram submetidas á
extração com 300 mL de DCM:MeOH (2:1) e Turrax® (3000 rpm) a temperatura
ambiente por 1 minuto (essa operação foi repetida mais três vezes). Na seqüência,
as soluções obtidas foram filtradas, reunidas e concentradas em rotaevaporador sob
pressão reduzida, obtendo-se assim 1,11 g do extrato bruto das folhas.
• Partição líquido-líquido - O extrato obtido foi submetido à partição líquido-líquido
com EtOAc e H2O. A fase orgânica foi concentrada em rotaevaporador sob pressão
reduzida obtendo-se 0,81 g.
• Análise preliminar do extrato - A análise preliminar foi baseada em cromatografia
em camada delgada comparativa, utilizando-se como eluentes uma mistura de Hex-
EtOAc (8,5:1,5). Observaram-se duas manchas principais sob a lâmpada de UV em
256 nm. Para obter-se um perfil melhor do extrato, este foi analisado no CLAE-DAD
(Concentração aproximada da amostra, 2mg/mL; vazão, 1,0 mL/min; volume de
injeção, 20 µL), em gradiente (Tabela 5, página 62), obtendo-se um cromatograma
que mostrou dois picos principais em 267 nm.
• Fracionamento cromatográfico - O novo extrato foi submetido a uma
cromatografia em coluna utilizando Sephadex LH-20 e como eluentes, misturas de
Hex:DCM:Acetona, com gradiente de polaridade, obtendo-se 25 frações (Tabela 8 e
esquema 8).
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Figura 6. Cromatograma obtido por CLAE da fração solúvel em EtOAc do extrato
DCM:MeOH das folhas de Peperomia urocarpa. Coluna C18, fase móvil
H2O/CH3OH (modo gradiente), vazão: 1mL/min, λ=287 nm.
Minutes
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
mA
U
0
20
40
60
mA
U
0
20
40
60
16
.18
3
18
.56
0
26
.60
92
8.6
54
29
.40
22
9.8
67
30
.29
33
2.0
35
33
.49
33
4.4
04
35
.82
13
6.6
93
37
.91
33
8.7
77
39
.89
34
1.6
07
42
.68
44
4.5
47
46
.11
4
48
.79
0
Detector A-267 nmurocarpa2urocarpa2
Retention Time
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1. Coluna cromatográfica da fase solúvel em AcOEt , Sephadex LH-20/ Hex:DCM e DCM:Acetona (incremento gradual de polaridade)
F25
12+mistura polar
(15,0 mg)
Fração solúvel em AcOEt (810 mg) do extrato DCM:MeOH (2:1)
de folhas de Peperomia urocarpa
F22-24
12 (217,8 mg)
F20-21
11 + 12 (74,1 mg)
F19
11 (32,9 mg)
Esquema 8. Fracionamento do extrato bruto das substâncias presentes em maior quantidade em Peperomia urocarpa
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Tabela 8. Massas das frações obtidas e eluentes utllizados no fracionamento em
coluna do extrato de folhas de P. urocarpa.
N° Fração Massas (mg) Eluentes (V:V)
1 12,70 DCM:Hex (4:1)
2 28,60 DCM:Hex (4:1)
3 22,60 DCM:Hex (4:1)
4 19,10 DCM:Hex (4:1)
5 20,50 DCM:Acetona (3:2)
6 24,80 DCM:Acetona (3:2)
7 20,0 DCM:Acetona (3:2)
8 15,20 DCM:Acetona (3:2)
9 11,60 DCM:Acetona (3:2)
10 21,10 DCM:Acetona (3:2)
11 26,80 DCM:Acetona (3:2)
12 16,50 DCM:Acetona (3:2)
13 19,20 DCM:Acetona (1:4)
14 17,9 DCM:Acetona (1:4)
15 22,50 DCM:Acetona (1:4)
16 20,80 DCM:Acetona (1:4)
17 23,10 DCM:Acetona (1:4)
18 21,70 DCM:Acetona (1:4)
19 32,90 DCM:Acetona (1:4)
20 38,40 DCM:Acetona (1:4)
21 35,70 DCM:Acetona (1:4)
22 44,90 DCM:Acetona (1:4)
23 42,70 DCM:Acetona (1:4)
24 130,20 DCM:Acetona (1:4)
25 15,00 MeOH
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3.3.2.3. Peperomia arifolia
• Obtenção do extrato bruto - As folhas secas e moidas (620 mg) foram submetidas
a extração a temperatura ambiente por 12 horas, com 100 ml de DCM:MeOH (2:1)
(essa operação foi repetida mais uma vez).
• Na sequência, a solução obtida foi filtrada e concentrada em rotaevaporador sob
pressão reduzida, obtendo-se assim 97,50 mg de extrato bruto que apresentou uma
cor verde intensa.
• Análise preliminar - Foi baseada em cromatografia em camada delgada
comparativa, utilizando-se como eluentes uma mistura de Hex-EtOAc (4:1).
Observou-se na placa uma mancha principal, sob a lâmpada de UV em 254 nm e a
seguir foi analisado no CLAE-DAD, utilizando-se o método da tabela 6, página 64
(concentração da amostra, 2mg/mL; vazão 1,0 mL/min; volume de injeção, 20 µL). O
cromatograma obtido mostrou a presença de um pico majoritário e intenso, sendo
que as majores absorções foram observados em torno de 220 e 280 nm (Figura 7,
página 73). Devido a presença de uma substancia majoritária no extrato, foi obtido
um espectro de RMN de 1H que mostrou sinais similares ao apresentado pela
substância 8 isolada de P. oreophila.
• Fracionamento cromatográfico - O extrato obtido foi submetido a uma coluna
cromatográfica utilizando sephadex LH-20 (40 gr) e, como eluentes, misturas de
Hex:DCM:Acetona, com gradiente de polaridade. Obtiveram-se 20 frações que após
fazer CPC se reuniram a três frações, F1-F3. Foram obtidos os espectros de RMN
de 1H das três frações, sendo que somente na F3 (29 mg) constatou-se a presença
de sinais de uma substancia contendo um anel aromático.
Tese de doutorado Equipamento, materiais e métodos
Karina J. Malquichagua Salazar 73
Minutes
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
mA
U
0
100
200
300
mA
U
0
100
200
300
2.3
13
2.7
61
20
.55
7
22
.40
0
24
.53
3
Detector A-263 nmarifolia1arifolia1
Retention Time
Figura 7. Cromatograma obtido por CLAE do extrato DCM:MeOH das folhas da
Peperomia arifolia .Coluna C18, fase móvil H2O/CH3OH (modo gradiente), vazão:
1mL/min, λ=263 nm.
• Purificação - A fração 3 (29 mg) foi novamente submetida à cromatografia em
coluna utilizando Sephadex LH-20 (30 g) e misturas de Hex:DCM:Acetona com
gradiente de polaridade. Obtiveram-se 10 frações, que foram submetidas a
cromatografia em CPC e reunidas às frações puras, obtendo-se a substância 10
(16,0 mg).
3.3.2.4. Peperomia nítida
• Obtenção do extrato bruto - As folhas, caules e raízes de Peperomia nítida foram
secas e moídas juntas foram submetidas a extrações sucessivas (18 g) com 250 mL
de DCM:MeOH (2:1) e Ultra Turrax ® (9500 rpm) por 3 minutos a temperatura
ambiente (3x). Na sequência, as soluções foram filtradas, reunidas e concentradas
em rotaevaporador sob pressão reduzida, obtendo-se assim 1,5 g de extrato bruto.
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• Análise preliminar - A placa de CPC do extrato mostrou três manchas principais e
três fracas em 254 nm. O cromatograma (CLAE-DAD) do extrato foi obtido
utilizando-se o método da tabela 5 (Concentração da amostra, 2mg/mL; fluxo, 1,0
mL/min; volume de injeção, 20 µL) (Figura 8, página 76). O espectro de RMN de 1H
do extrato sugeriu a presença majoritária de um cromeno com duas metoxilas.
• Fracionamento cromatográfico - O extrato foi dividido em três porções que foram
submetidas à cromatografia em coluna utilizando Sephadex LH-20 (60 gr), como
eluentes foram utilizadas misturas de Hex:DCM:Acetona com gradiente de
polaridade. Cada uma das colunas forneceu oito frações, e apõs CPC foram
reunidas ás frações equivalentes das demais porções (Tabela 9).
• Purificação das substâncias presentes em maior quantidade: A purificação foi
realizada mediante uma segunda coluna cromatográfica com Sephadex LH-20 das
frações 2-3 (517 mg) , obtendo-se essa vez 6 frações (FF1-FF6) e na seqüência com
CPP das frações FF3-4 (Esquema 9, página 75) obtendo-se no total três
substâncias (13-15).
Tabela 9. Massas das frações obtidas e eluentes utilizados no fracionamento em
coluna do extrato de P. nitida.
N° Fração Massas reunidas (mg) Eluentes (V:V) Frações reunidas
1 231,6 DCM:Hex (3:2) a
2 313,8 DCM:Hex (3:2) b
3 203,2 DCM:Hex (4:1) b
4 164,5 DCM:Hex (4:1) c
5 193,4 DCM:Acetona (3:1) c
6 194,8 DCM:Acetona (3:1) d
7 78,4 DCM:Acetona (3:2) d
8 53,5 DCM:Acetona (3:2) d
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a. Coluna cromatográfica de Sephadex LH-20/ Hex:DCM e DCM:Acetona (incremento gradual de polaridade)
Extrato (1,5 g) DCM:MeOH (2:1) de Peperomia
nitida
F4-5
15 (357,9mg)
F2-3 (517,0mg)
13+14 (10 mg)
15 (12 mg)
B. Coluna cromatográfica de Sephadex LH-20 / eluentes Hex:DCM (incremento gradual de polaridade)
B
FF3-4 (30mg)
FF5-6 15 (268mg)
b c
C. CPP/Hex:EtOAC (8:2)
Esquema 9. Fracionamento do extrato bruto e purificação das substâncias
presentes em maior quantidade em Peperomia nitida
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Figura 8. Cromatograma obtido por CLAE do extrato DCM:MeOH das folhas da
Peperomia nítida. Coluna C18, fase móvil H2O/CH3OH (modo gradiente), vazão:
1mL/min, λ=326 nm.
3.3.3. Avaliação da atividade da enzima policetídeo sintase (PKS) de folhas de
Peperomia glabella
3.3.3.1. Obtenção de diversos extratos enzimáticos das folhas
Os estudos de conversão de substratos foram baseados no uso de enzimas
PKS solubilizadas (Paniego et al., 1999 , Raharjo et al., 2004) e, para tal, foram
utilizadas apenas folhas, devido à difícil propagação da espécie. O estudo iniciou-se
com a obtenção do extrato enzimático cuja fração sobrenadante apresenta maior
atividade de policetídeo sintase frente ao acetil-CoA e ao malonil-CoA. Para tal
finalidade foram obtidos vários extratos enzimáticos partindo de 1 g de folhas,
utilizando-se tampão A (fosfato de potássio pH=7,5 (0,1 M) e β-mercaptoetanol 2,5
mM) ou tampão B (tampão fosfato de potássio pH=7,5 (0,1 M) e β-mercaptoetanol
Minutes
0 10 20 30 40 50
mA
U
0
250
500
750
1000
1250
1500
mA
U
0
250
500
750
1000
1250
1500
14
.30
9
18
.09
7
30
.02
6
32
.25
6 35
.61
8
39
.34
1
41
.47
2
44
.92
8
D etecto r A-326 n mn itid a1n itid a1
Retention Time
Tese de doutorado Equipamento, materiais e métodos
Karina J. Malquichagua Salazar 77
2,5 mM e 7 % Dowex 1), com e sem PVPP ou dessalinização. Todas as operações
foram realizadas a 4°C, segundo o esquema 10.
Esquema 10. Obtenção de extratos enzimáticos das folhas de P. glabella
3.3.3.2. Reação enzimática com cada um dos extratos
Na seqüência, os ensaios enzimáticos e os brancos (controles) foram
realizados em duplicata ou triplicata, em tubos de centrifuga de 1,5 mL por um
período de 30 minutos, a 30°C. As quantidades dos reagentes utilizados esta
descrito na tabela 10.
Tabela 10. Concentrações e volumes dos reagentes utilizados nos ensaios enzimáticos
Reagente Concentração no
ensaio Quantidade
(volume) Extrato protéico 300 ul=1,9 µg
Tampão de reação: Fosfato de
potássio pH=7,5, β-mercaptoetanol
e seroalbúmina
0,1 M, 2,5 mM e 2,8% 182 µL
Acetil-CoA 0,2 mM (100nmoles) 4,5 µL
Malonil-CoA 0,6 mM (300nmoles) 13,5 µL
Centrifugação, 4ºC, 20’, 14000 RPM
Dessalinização
Folhas frescas de P. glabella
Suspensão Suspensão
N2
i. Trituração com PVPP ii. Extração com tampão A
i. Trituração sem PVPP ii. Extração com tampão A ou B
Sobrenadante PVPP-A Sobrenadante A ou B
Extrato PVPP-D Extrato PVPP-SD Extrato A-SD ou B-SD
Extrato A-D ou B-D
Dessalinização Sem dessalinização
Precipitado Precipitado
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3.3.3.3. Análises dos produtos de reação através de CLAE
Depois de finalizadas as reações, o meio reacional foi submetido à extração
com EtOAc (3x300 uL) e as fases orgânicas foram reunidas e concentradas.
Posteriormente, os extratos foram ressuspendidos em MeOH e analisados por
CLAE-DAD, Coluna C18, fase móvil H2O/CH3OH (modo gradiente), vazão: 1mL/min,
λ288 nm, e utilizando o método descrito na Tabela 6, página 64.
3.3.4. Otimização das condições da reação enzimática de PKSs (tempo,
temperatura, pH e saturação dos reagentes)
3.3.4.1. Reação enzimática
Na seqüência, foi selecionada a metodologia (Esquema 10, tabela 10) que
forneceu o extrato com atividade enzimática PKSs e OMT, na qual foram realizadas
as determinações do ótimo enzimático. Para otimizar o pH do tampão de extração,
foram realizadas reações enzimáticas com os tampões fosfato de potássio (pH= 6,0
a 8,0) e Tris-HCl (pH=8,0 a 9,0) de 0,5 em 0,5 na faixa de pH = 6 até pH 9. Foram
estudados tempos pré-determinados (10-60 min) para determinar o tempo ótimo e
diferentes temperaturas (20-60°C) para determinar a temperatura ótima (Tabela 10,
página 55). Para determinar a concentração dos reagentes na qual ocorre a
saturação das enzimas foram estudadas varias concentrações de acetil-
CoA:malonil-CoA numa proporção de 1 para 3 de acordo com a proposta na qual se
requer um mol de acetil-CoA e três de malonil-CoA (0,02 mM - 0,06 mM; 0,10 mM -
0,30 mM; 0,2 mM - 0,6 mM; 0,4 mM - 1,2 mM; 0,8mM - 2,4mM). Neste estudo os
dados do extrato protéico e tampão são mostrados na tabela 10.
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3.3.4.2. Dosagem protéica dos sobrenadantes dos extratos
A dosagem protéica dos sobrenadantes dos extratos enzimáticos foi realizada
utilizando-se o método de Bradford (Bradford, 1976), o qual envolve a formação de
um complexo de cor azul, entre as proteínas e o azul de Comassie G-250, com um
máximo de absorção em 595 nm e que é medido por espectrofotometria. Para isso,
foi construída uma curva analítica utilizando diferentes concentrações de
seroalbúmina (1µg/mL a 20µg/mL), cuja equação permitiu determinar a quantidade
de proteínas totais presentes nos sobrenadantes. Em todos os experimentos de
otimização foi utilizado 1,9 µg de proteínas totais (Esquema 10, página 77).
0 5 10 15 200,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
Abs
orbâ
ncia
seroalbumina (µg/mL)
A=(0,0099+0,0037) + (0,0353+0,0004)CR2=0,9996
Esquema 11. Curva analítica de determinação de seroalbúmina
3.3.4.3. Análises dos produtos de reação através de CLAE
Depois de finalizadas as reações, os extratos foram submetidos à partição
com EtOAc (3x300 µL), as fases orgânicas reunidas e concentradas. Os produtos
foram resuspendidos em MeOH e injetados no CLAE, utilizando-se o método
descrito na Tabela 11 (página 80).
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Tabela 11. Gradiente utilizada para a análise dos produtos da reação enzimática
3.3.5. Estudo da variação circadiana da atividade de PKSs
Finalizando a determinação das condições ótimas de reação, foi determinado
também o horário de maior expressão das enzimas PKS e OMT envolvidas na
biossíntese do 2-hidróxi-4,6-dimetoxiacetofenona, para isso foram coletadas folhas
de P. glabella a cada 3 horas durante 27 horas e em duplicata nos horários de maior
expressão. Para os experimentos de otimização também foi utilizado 1,9 µg de
proteínas totais.
3.3.5.1. Reação enzimática
A reação foi realizada sob as condições otimizadas de pH, tempo,
temperatura e saturação dos substratos. As concentrações e volumes dos reagentes
utilizados nos ensaios enzimáticos encontram-se na tabela 10.
3.3.5.2. Análises dos produtos de reação através de CLAE
Depois de finalizadas as reações, elas foram submetidas à partição com
EtOAc (3x300 µL), as fases orgânicas reunidas e concentradas. Os produtos foram
resuspendidos em MeOH e injetadas no CLAE, utilizando o método descrito na
Tempo (minutos) % de MeOH % de H2O 0.1 70 30 2 70 30 10 100 0 13 100 0 17 70 30 20 70 30
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Karina J. Malquichagua Salazar 81
Tabela 11.
3.3.5.3. Quantificação do 2-hidróxi-4,6-dimetoxiacetofenona nas folhas de
Peperomia glabella
Foram coletadas amostras de folhas, com o objetivo de quantificar a
acetofenona presente, nos horários de maior expressão das enzimas, e assim
corroborar os dados obtidos na determinação do horário de coleta ótimo. Para isso,
a cada três horas foram coletadas as folhas, congeladas em N2 liquido e liofilizadas,
moídas na presença de SiO2 e submetidas à extrações sucessivas com EtOAc. As
fases foram reunidas e concentradas, ressuspendidas em MeOH e injetadas no
CLAE, utilizando o método descrito na tabela 11, página 80.
Para quantificar a acetofenona foi construída uma curva de calibração
utilizando diferentes concentrações (3µg/mL a 36 µg/mL), cuja equação permitiu
determinar a quantidade de acetofenona presente nas amostras (Esquema 12).
0 5 10 15 20 25 30 35 400
400000
800000
1200000
1600000
2000000
Are
a
Acetofenona (µg/mL)
Area = (41373+41950) + (50785+2066)CR2=0,99341
Esquema 12. Curva analítica de determinação da acetofenona
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3.3.6. Estudo de genes PKSs
3.3.6.1. Pesquisa bibliográfica
Foi realizada uma busca na literatura e no NCBI para identificar seqüências
de genes que produzem as PKSs que biossintetizam o ácido orselínico e análogos
mais complexos contendo o ácido orselínico (Tabela 12, esquema 13).
Tabela 12. Organismos que produzem o ácido orselínico
Gene Organismo Estrutura Fonte de informação
AviM Streptomices
viridochromogenes Avilamicina Gaisser et al., 1997
CaLO5 Micromonospora
echinospora Calicheamincina Ahlert et al., 2002
evrJ Micromonospora
carbonacea
Everninomicina Hill, 2001
Um dos dados mais relevantes foi publicado por Gaisser et al,.1997 (Figura
9), que descreve o gene AviM de Streptomyces viridochromogenes que apresenta
3879 pb (1293 amino ácidos) e na qual a região cetosintase ou cetoacilsintase (KS),
que catalisa a adição de uma unidade de acetato (C2) na cadeia do policetídeo a ser
alongada (Austin and Noel, 2003), representa aproximadamente 34% da seqüência
(Shen, 2003).
Figura 9. Seqüência de amino ácidos do AviM do PKS (tipo I) que biossintetíza
o ácido orselínico
Visto que os genes AviM, CaLO5 e evrj são os responsáveis pela síntese do
ácido orselínico nas respectivas bactérias, considerou-se que a região de KS dos
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Karina J. Malquichagua Salazar 83
genes PKS responsáveis pela síntese dessa mesma substância nas peperomias
seriam bastante semelhantes ao seu equivalente KS no genoma dessas bactérias
(Tabela 12, página 82).
Esquema 13. Metabólitos derivados de ácido orselínico produzidos por bactérias
Everninomicina Micromonospora carbonacea
Avilamicina
Streptomyces
viridochromogenes
Calicheamincina
Micromonospora carbonacea
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Continuando com a busca de informação foi sugerido que as PKSs de genes
de fungos, especificamente da região KS que expressam policetídeos que não
apresentam redução (NR), tal qual ocorre com o ácido orselínico, podem ser
isolados utilizando-se o par de iniciadores LC1 e LC2c (Bingle et al., 1999).
3.3.6.2. Desenhos de iniciadores degenerados
3.3.6.2.1. Iniciadores degenerados LC1/LC2c
O desenho desses iniciadores foi baseado nas regiões mais conservadas de
KSs de vários fungos cujos policetídeos produzidos não apresentam redução (NR),
tal como ocorre com o ácido orselínico (Tabela 12, página 82). O tamanho dos
produtos de amplificação deve ser aproximadamente de 700 – 800 pb (Bingle et al.,
1999).
3.3.6.2.2. Iniciadores degenerados AOR1/AOR2
O desenho do segundo par de iniciadores degenerados, realizado em
colaboração com o Prof. Gabriel Padilla do ICB-USP (Tabela 13, página 85), foi
baseado na seqüência KS do gene AviM de Streptomyces viridochromogenes (NCBI
AAK83194.1), junto com seqüências KS homólogas identificadas no program BLAST
(Esquema 13). As seqüências foram alinhadas no programa BioEdit (Hall, 1999) de
acordo com as regiões conservadas, que permitiram propor os iniciadores
AOR1/AOR2. O tamanho dos produtos de amplificação é de aproximadamente de
700 – 800 pb.
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3.3.6.2.3. Iniciadores degenerados AOS1/AOS2
O desenho do terceiro par de iniciadores degenerados denominados
AOS1/AOS2 foi baseado também nas seqüências protéica de KS de AviM da
bactéria Streptomyces viridochromogenes alinhadas desta vez com seqüências de
proteínas de plantas superiores (PKSs), para isso também foram utilizados
programas disponíveis na rede (BLAST, ClustalX e CODEHOP) com a colaboração
do Dr. Ari José Scattone Ferreira (Tabela 13). O tamanho dos produtos de
amplificação esperado seria de aproximadamente de 750 pb.
LC1: 5'-GAYCCIMGITTYTTYAAYATG
LC2c: 5'-GTICCIGTICCRTGCATYTC
AOR1: 5'-GCIGTIGTIGGIATHGGITG
AOR2:5'-GGIGCCATDATICCRTTIGTYCT
AOS1: 5'-GGNCCRAANCCRAANARNAC
AOS2: 5'-GCNACNATHYTNGCNATHGG
Tabela 13. Seqüências de nucleotídeos dos Iniciadores utilizados
3.3.6.3. Extração de ADN genômico de Peperomias
A extração de DNA genômico das folhas de Peperomias foi obtido através do
Kit ‘’NucleoSpin® Plant II’’ ou utilizando-se do protocolo descrito (Ferreira &
Grattapaglia, 1996):
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1. Foi pesado 30-50 mg do tecido seco (folhas cortadas em fragmentos) e
macerado utilizando-se um pistilo e nitrogênio liquido em um tubo eppendorf de 1,5
mL.
2. Foi adicionado então 700 µL de solução tampão de extração* e misturado em
vortex.
3. Os tubos foram incubados em banho-maria à 60-65°C por 30 minutos.
Durante a incubação, os tubos foram agitados a cada 10 minutos para
homogeneizar a suspensão.
4. Os tubos foram retirados do banho-maria e deixados esfriar em capela de
exaustão.
5. As soluções foram extraídas com 600 µL de solvente orgânico CIA
(clorofórmio:álcool isoamílico, 24:1) com agitação durante 5 minutos, invertendo-os
no mínimo 20 vezes ou até obter uma emulsão homogênea.
6. Os tubos foram centrifugados em microcentrífuga a velocidade máxima
(12000-15000 rpm) durante 5 minutos.
7. Os tubos foram cuidadosamente retirados da centrifuga, evitando a
perturbação das fases formadas. A fase superior de cada uma das amostras foi
pipetada (aquosa) para um novo eppendorf.
8. Foram repetidos os passos 5, 6 e 7.
9. Foi adicionado, a cada solução obtida no ítem 7, 500 µL de isopropanol frio
(-20°C). Foi misturado gentilmente para precipitar os ácidos nucléicos e mantidos em
freezer durante uma noite.
10. Os tubos foram centrifugados a 7000 rpm por 5 minutos.
11. Foram descartados os sobrenadantes mantendo-se o precipitado.
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12. A cada eppendorf foi adicionado 1 mL de etanol 70 % e os tubos deixadas em
repouso por 10 minutos.
13. O tubos foram centrifugados a 7000 rpm por 3 minutos.
14. Os sobrenadantes foram descartados sem perder o pellet.
15. Os passos 12,13 e 14 foram repetidos.
16. Foi adicionado 1 mL de etanol absoluto a cada tubo e os precipitados foram
deixados imersos por 3 minutos e, posteriormente, separados os sobrenadantes.
17. Os precipitados foram deixados em secagem ao ar.
18. Os precipitados foram ressupendidos em 50-100 µL de água destilada.
19. Finalmente foi adicionado 2 µL de RNAse em cada tubo e incubados em
banho-maria a 37 °C por, no mínimo, 1h para a digestão do RNA.
*100 mL de Tampão de extração 2X CTAB:
2%CTAB 2g
1,4 M de NaCl 8,19 g
20 mM de EDTA 0,75 g
100 mM tris-Cl PH=8,0 10 mL de solução estoque 1M
1% de PVP 1 g
0,2 % mercaptoetanol 0,2 mL
3.3.6.3.1. Quantificação do ADN por espectrofotometria
Uma alíquota de 1 µL de cada extrato de ADN foi diluído 1:1000 com água
(destilada e autoclavada) e submetida a leitura em λ= 260 nm.
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3.3.6.4. Amplificação das regiões alvo utilizando a reação em cadeia de polimerase
(PCR).
3.3.6.4.1. Amplificação das regiões alvo utilizando a reação em cadeia de
polimerase (PCR) com os iniciadores LC1 e LC2c.
Foram preparados os Mix (mistura de todos os componentes da reação) com
os ADNs das folhas de Peperomia urocarpa, Peperomia glabella e Peperomia
arifolia (Tabela 14).
Reagente Concentração
inicial Concentração ou quantidade
final de reagentes Volume por
amostra (µL)
Tampão, contendo
MgCl2 15 mM 10 X 1 X 2 µL
dntps 10 mM 0,2 mM 0,4 µL
Lc1 20 µM 1 µM 1 µL
Lc2 20 µM 1 µM 1 µL
Taq polimerase
- 1U 0,2 µL
H2O - - 14,4 µL
ADN 100 ng/ µL 100 ng 1 µL
Total - - 20 µL
Tabela 14. Quantidades e Concentração dos componentes da reação em cadeia da
polimerase (PCR) com os iniciadores LC1 e LC2c
Condições no termociclador:
Desnaturação inicial 94 C°, 3 min
Desnaturação 94 C°, 1 min
Anelamento 55 C°, 1 min 34 ciclos
Extensão 72 C°, 3 min
Extensão final 72 C°, 10 min
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3.3.6.4.2. Amplificação das regiões alvo utilizando a PCR com os iniciadores AOR1
e AOR2
Reagente Concentração
inicial
Concentração ou quantidade
final de reagentes
Volume por
amostra (µL)
Tampão 10 X 1 X 2 µL
MgCl2 50 mM 5 mM 2 µL
dntps 20 mM 0,2 mM 0,2 µL
AOR1 20 µM 1 µM 1 µL
AOR2 20 µM 1 µM 1 µL
Taq polimerase
- 1U 0,2 µL
H2O - - 11,6 µL
ADN 500 ng/ µL 1000 ng 2 µL
Total - - 20 µL
Tabela 15. Quantidades e concentração dos componentes da reação em cadeia da
polimerase (PCR) com os iniciadores AOR1 e AOR2
Condições no termociclador:
Desnaturação inicial 94 C°, 3 min
Desnaturação 94 C°, 1 min
Anelamento 56 C°, 1min 40 ciclos
Extensão 72 C°, 1 min
Extensão final 72 C°, 10 min
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Karina J. Malquichagua Salazar 90
3.3.6.4.3. Amplificação das regiões alvo utilizando a reação de cadeia de polimerase
(PCR) com os iniciadores AOS1 e AOS2
Reagente Concentração
inicial
Concentração ou quantidade
final de reagentes
Volume por
amostra (µL)
Tampão 10 x 1 x 2 µL
MgCl2 25 mM 5,5 mM 4,4 µL
dntps 25 mM 0,5 mM 0,4 µL
AOR1 20 µM 1 µM 1 µL
AOR2 20 µM 1 µM 1 µL
Taq polimerase
- 1U 0,2 µL
H2O - - 9,5 µL
ADN 500 ng/ µL 750 ng 1,5 µL
Total - - 20 µL
Tabela 16. Quantidades e concentração dos componentes da reação em cadeia da
polimerase (PCR) com os iniciadores AOS1 e AOS2
Esquema 14. Condições no termociclador do PCR com os iniciadores AOS1 e AOS2
94 °C 94 °C 5 min 1 min
55 °C
94 °C
65 °C
45 s
72 °C 1,5 min
55 °C
72 °C 1,5 min
30 s
∞ min
4 °C x1 x20
72 °C
x30 x1
10 min