DEJANILDO JORGE VELOSO

Ação de fitoterápicos antimicrobianos sobre microrganismos bucais produtores de compostos

sulfurados voláteis: estudo in vitro .

PROGRAMA INTEGRADO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIAUNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIAPROGRAMA INTEGRADO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA

JOÃO PESSOA2006

DEJANILDO JORGE VELOSO

Ação de fitoterápicos antimicrobianos sobre microrganismos bucais produtores de compostos

sulfurados voláteis: estudo in vitro .

Tese apresentada ao ProgramaIntegrado de Pós-Graduação em Odontologia

da Universidade Federal da Paraíbaem cumprimento às exigências

para a obtenção do título de Doutor em Odontologia. Área de concentração:

Estomatologia.

Orientador: Prof. Dr. Fábio Correia Sampaio.Co-orientadora: Profª. Dr.ª Jane Sheila Higino.

JOÃO PESSOA

2

2006DEJANILDO JORGE VELOSO

Ação de fitoterápicos antimicrobianos sobre microrganismos bucais produtores de compostos

sulfurados voláteis: estudo in vitro .

DATA DA DEFESA: 27/07/2006.

_______________________________Prof. Dr. Fábio Correia Sampaio.Orientador.

________________________________Profª. Dra. Célia Maria M. B. de CastroExaminadora.

_________________________________Profª. Dra. Brenda Paula F. D. A. GomesExaminadora.

__________________________________Profª. Dra. Margareth de Fátima F. M. DinizExaminadora.

__________________________________Prof. Dr. Eduardo de Jesus OliveiraExaminador.

3

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Fábio Correia Sampaio, um verdadeiro orientador.

A Profª. Dra. Jane Sheila Higino, da UFPE pela orientação e produção dos

extratos usados neste trabalho.

A Profª. Dra. Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes, da FOP-

UNICAMP, Piracicaba pela orientação e ajuda indispensáveis com os testes

realizados no laboratório em Piracicaba.

Ao Prof. Carlos Henrique Gomes Martins, da Universidade de Franca, SP

pela orientação e amizade.

A Profª. Dra. Maria do Socorro Vieira Pereira,

A Proª. Dra. Nikeila Chacon Oliveira Conde,

A Profª. Dra. Laurylene C. S. Vasconcelos,

A Profª. Fábia Daniele S. C. M e Silvia,

Ao Dr. Frederico Canato Martins, pelo laborioso trabalho e ajuda em

Piracicaba,

A Coordenação e Funcionários do Programa Integrado de Pós-Graduação,

Aos meus Mestres,

Aos meus amigos, um pequeno e estimado grupo de heróis.

A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste

trabalho... Como bem lembrou minha querida Mãe.

4

E porque me faltam as palavras... Obrigado!

“Quando chegarmos ao final da linha, perceberemos que

nossa obsessão egoísta não nos oferece esperança,

e estaremos abertos para nos tornarmos

obcecados por Deus”.

Larry Crabb.

5

RESUMO

A produção de compostos sulfurados voláteis por

microrganismos da cavidade bucal é a principal causa da halitose. O objetivo

deste estudo foi de avaliar in vitro a atividade dos extratos de Caesalpinia

ferrea Mart. (Jucá), Cinnamomun cássia B. (Canela), Malva sylvestris L.

(Malva), Punica granatum L (Romã), Rosmarinus officinalis L. (Alecrim),

Aeolanthus suaveolens (Als.) Spreng. (Macassá), Sysygium aromaticum L

(Cravo) e Tamarindus indica L. (Tamarindo) sobre microrganismos da

cavidade bucal produtores de compostos sulfurados voláteis (CSV) utilizando

diferentes testes de sensibilidade microbiana e um modelo de sedimento

salivar. A atividade dos estratos foi avaliada sobre os microrganismos

Fusobacterium nucleatum, Peptostreptoccocus micros, Porphyromonas

gingivalis e Prevotella intermedia isolados da cavidade bucal. Para o teste de

difusão em agar foram utilizados os extratos puros depositados sobre o meio

de cultura em cilindros de aço (8,0 X 10,0 mm com diâmetro interno de 6,0

mm) e medidas as zonas de inibição. Foi também realizado o teste para

determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) em meio líquido pelo

método da microdiluição com a resazurina como revelador da presença ou

ausência de atividade bacteriana. A quantidade de polifenóis totais dos

extratos foi medida pelo método Azul da Prússia modificado por Graham.

Para o teste com o sedimento salivar foi utilizado o método de Kleimberg e

Codipilly e o sedimento salivar foi exposto aos extratos de jucá e romã

seguindo-se a incubação e realizadas medidas organolépticas e com um

6

monitor de gases (Halimeter®) em intervalos pré-estabelecidos. Ao teste de

difusão os diferentes extratos demonstraram resultados variados com

diferentes zonas de inibição ou ausência destas. O extrato de romã foi o

único extrato que apresentou capacidade inibitória sobre todos os

microrganismos testados. Os valores de CIM demonstraram também uma

variação quanto a ação dos extratos sobre os diversos microrganismos. Os

extratos usados para o teste de sedimento salivar determinaram uma menor

formação de CSV quando comparado ao controle negativo. O uso de

fitoterápicos pode representar uma alternativa para a abordagem

antimicrobiana nos casos de halitose de origem bucal.

7

ABSTRACT

The production of volatile sulfur compounds (VSC) by oral

microorganisms is the main cause for halitosis. This in vitro study evaluated

the antibacterial activity of plant extracts from Caesalpinia ferrea Mart.,

Cinnamomun cassia B. , Malva sylvestris L., Punica granatum L ,

Rosmarinus officinalis L. , Aeolanthus suaveolens (Als.) Spreng. , Sysygium

aromaticum L e Tamarindus indica L. The bacteria tested were Fusobacterium

nucleatum, Peptostreptoccocus micros, Porphyromonas gingivalis e

Prevotella intermedia obtained from clinical trials. The antibacterial activity

was determined by means of agar diffusion and broth microdilution test..

Stainless-steel cylinders (8.0 x 10 mm – inside dia. of 6.0 mm) were placed on

the agar plates and the test extracts were applied inside the cylinders. Zones

of inhibition of bacteria growth around the cylinders were measured and

recorded after incubation time. Resazurin was used as an indicator of

bacteria growth in the microdilution test. In order to test for bactericidal or

bacteriostatical effect from the extract on bacteria, 20 µL from the well

indicating the Minimal Inhibitory Concentration (MIC) and three more wells

were dispensed in agar plates. Results for growing of bacteria were recorded

after appropriated incubation time. Determination of total polyphenols in the

plant extracts was carried out by the Prussian blue method as described by

Graham. The extracts of Punica granatum L. and Caesalpinia ferrea Mart.

showed the highest values for total polyphenols and were chosen for the test

with the suspended salivary system (SSS) method. The salivary sediment

8

were exposed to the extracts and the amount of odor was measured both with

organoleptic test and by a sulfide monitor (Halimeter®) after appropriated

periods. The agar diffusion and the microdilution tests demonstrated different

results with the Punica granatum extract being able to inhibit the growth from

all the bacteria tested by the diffusion method. The results from the test with

the SSS method show that when the extracts were exposed to the extracts

the production of VSC was smaller than the production from the negative

control. The results suggest that some plant extracts may be useful for the

antibacterial approach for the treatment of oral halitosis.

9

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

10

LISTA DE TABELAS

11

LISTA DE ABREVIATURAS

12

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. HALITOSE

2.1.1. CONCEITO DE HALITOSE

2.1.2. AVALIAÇÃO DO HÀLITO

2.1.3. PEVALÊNCIA DA HALITOSE

2.1.4. ETIOLOGIA DA HALITOSE

2.2. ABORDAGEM ANTIMICROBIANA NA HALITOSE

2.3. USO DE PLANTAS MEDICINAIS E FITOTERÁPICOS

2.3.1. USO DE PLANTAS MEDICINAIS E FITOTERÁPICOS NA

ODONTOLOGIA

2.3.2. USO DE PLANTAS MEDICINAIS E FITOTERÁPICOS NO

TRATAMENTO DA HALITOSE

2.4. POLIFENÓIS

3. PROPOSIÇÃO

4. METODOLOGIA

4.1. PREPARAÇÃO DO EXTRATO DAS PLANTAS

4.1.1. EXTRAÇÃO DOS MARCADORES QUÍMICOS

4.1.2. CONCENTRAÇÃO DA SOLUÇÃO EXTRATIVA

4.2. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA

4.2.1. TESTE DA DIFUSÃO EM AGAR

13

4.2.2. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM)

E EM MEIO LÍQUIDO

4.3. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE POLIFENÓIS DOS

EXTRATOS

4.4. DETERMINAÇÃO DA CAPACIDADE INIBITÓRIA DOS EXTRATOS

SOBRE A FORMAÇÃO DE COMPOSTOS SULFURADOS VOLÁTEIS

(CSV) E OUTROS ODORES

4.4.1. PREPARAÇÃO DOS SEDIMENTOS

4.4.2. COLETA DOS DADOS

4.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA

5. RESULTADOS

5.1. ATIVIDADE ANTIMICROBIANA

5.2. CONCENTRAÇÃO DE POLIFENÓIS DOS EXTRATOS

5.3. AÇÃO DOS EXTRATOS DE JUCÁ E ROMÃ NA FORMAÇÃO DE

COMPOSTOS SULFURADOS VOLÁTÉIS E OUTORS ODORES.

6. DISCUSSÃO

7. CONCLUSÕES

REFERÊNCIAS

14

1. INTRODUÇÃO.

Foi na década de 70 que J. Tonzetich usando cromatografia gasosa,

demonstrou que era possível identificar e quantificar os compostos sulfurados

voláteis (CSV) a partir de amostras de ar cavidade bucal, estabelecendo a

importância destas substâncias na formação do mau odor bucal. Como

principais componentes foram identificados: sulfidreto (H2S), metilmercaptana

(CH3SH), e com uma participação menor o dimetilsulfeto [CH3]2S.

Os compostos sulfurados voláteis já haviam sido identificados como

resultantes de processos putrefativos da saliva através de análise por

espectrometria de massa, contudo este método não era sensível o suficiente

para a avaliação do ar no interior da boca. Em seu estudo Tonzetich, 1971

mostrou que a concentração de compostos sulfurados voláteis na boca varia

para o mesmo indivíduo, quando examinado em diferentes horários num

mesmo dia. Os níveis mais altos de concentração destas substâncias

correspondem aos níveis de maior intensidade do mau hálito. Foi verificado

ainda que a aplicação de métodos de higiene bucal reduz significativamente

a quantidade de compostos sulfurados na boca, concluindo-se que a

formação destas substâncias se deve aos processos putrefativos ocorrendo

no interior da cavidade bucal.

Após os achados de Tonzetich os estudos foram desenvolvidos para

detectar os mecanismos de produção dos compostos sulfurados voláteis e a

importância da cavidade bucal como a principal fonte de produção destas

15

substâncias. De acordo com Delanghe et al (1999), num grupo de 260

pacientes atendidos na clínica de odores bucais, foram encontrados

aproximadamente 87% dos casos de halitose com origem bucal, 8%

apresentava mau odor originário da região de ouvido, nariz e garganta, e em

5% dos casos a origem não pode ser determinada. No caso dos pacientes

com halitose de origem bucal, 41% apresentavam saburra lingual, 31%

tinham gengivite, e 28% periodontite.

São diversos os estudos que descrevem que os compostos sulfurados

voláteis (CSV) são produzidos principalmente por bactérias anaeróbias gram-

negativas encontradas não somente em áreas de progressão de gengivite e

periodontite como também na superfície lingual, na assim chamada saburra

lingual. São vários os microrganismos relacionados como produtores de CSV:

Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatun,

Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Peptostreptococcus. Essas

bactérias produzem compostos sulfurados voláteis a partir do metabolismo de

células, incluindo células descamadas da mucosa bucal e células sanguíneas

assim como proteínas da saliva (WALER, 1997; LOESCHE e KAZOR, 2002;

MORITA e WANG, 2001; MILAZZO et al, 2003; SCULLY e ROSEMBERG,

2003).

O uso do fluoreto estanhoso foi utilizado num estudo realizado por

Quirynen et al (2002), mostrando-se eficaz na redução do mau hálito matinal,

assim como na redução de bactérias na saliva e retardando a formação do

biofilme bacteriano bucal.

Realizando revisão sistemática das diversas abordagens no controle

da halitose, Roldán et al (2003) relatam que o controle mecânico do biofilme

16

lingual mostra uma redução transitória nas concentrações dos diversos

componentes do mau odor bucal. A abordagem antimicrobiana conta com

um diverso número de agentes que são utilizados isoladamente ou em

conjunto com a limpeza mecânica da língua. Contudo, o uso prolongado

desses agentes não deve promover o desequilíbrio da microflora bucal ou

contribuir para o surgimento de bactérias resistentes.

Pratten, Barnet e Wilson (2003) verificaram a eficácia da clorexidina e

do acetato de zinco num estudo in vitro, verificando sua capacidade em

reduzir a formação de CSV num modelo com biofilme multiespécie chamado

fermentador de imersão constante (CDFF – constant deph film fermentor).

Com as diversas aplicações foi observada a redução da produção de CSV e

simultaneamente uma alteração no biofilme com redução das bactérias

produtoras de H2S.

Neste contexto, a abordagem antimicrobiana no tratamento da halitose

tem se mostrado como uma opção fundamental. Substâncias como

clorexidina, cloreto de cetilpiridínio, triclosan, peróxido de hidrogênio, dióxido

de cloro, assim como óleos essenciais e cloreto de zinco têm sido estudados

no combate a halitose, com benefícios, mas também restrições. Embora

existam relatos do uso de plantas medicinais no combate da halitose, faltam

ainda evidências confiáveis (SCULLY e ROSEMBERG, 2003).

O uso de fitoterápicos já está incorporado à pratica da Medicina e da

Odontolotogia. Em todo o mundo são desenvolvidas pesquisas que avaliam

o potencial do uso de produtos obtidos de vegetais incluindo o isolamento de

substâncias específicas na busca de novos medicamentos usados na

17

prevenção e tratamento das mais diversas enfermidades (SILANO et al,

2004; SILVA e ANDRADE, 2005; VASCONCELOS et al, 2003).

Nesta pesquisa avaliamos a ação antimicrobiana de extratos

fitoterápicos sobre microrganismos relacionados à produção de CSV na

cavidade bucal através de testes de sensibilidade microbiana por difusão em

agar e microdiluição em caldo. Utilizamos também um modelo de sedimento

salivar que simula as condições do meio bucal e que permite a quantificação

de CSV através do uso de um monitor de gases.

Como justificativa para o desenvolvimento desta pesquisa deve-se

considerar a importância da halitose como uma condição com implicações na

saúde e também trazendo severas restrições sociais. Uma abordagem

fitoterápica pode mostrar-se adequada na busca de agentes antimicrobianos

para uso nos casos em que se deseje a redução dos CSV na cavidade bucal,

preenchendo assim a lacuna hoje existente em termos de pesquisa nesta

área específica.

18

2. REVISÃO DA LITERATURA.

2.1. HALITOSE

2.1.1. CONCEITO DE HALITOSE.

Halitose é o termo genérico usado para descrever um odor

desagradável e repugnante que emana da cavidade bucal. Embora inúmeras

localizações fora da cavidade bucal tenham sido relacionadas à halitose,

sabe-se que em até 90% dos casos a boca é a origem principal do mau odor

(Rosemberg,1997; Delanghe, 1999).

As implicações da halitose na saúde e com interferência nos

aspectos sociais, colocam esta condição numa área de abrangência que

envolve a Odontologia, a Medicina e a Psicologia. Nas culturas mais antigas

pode-se encontrar referências a halitose, a exemplo da cultura Hebraica que

há mais de dois mil anos esclarece no Talmud que um casamento poderia

ser legalmente anulado caso um dos cônjuges apresentasse mau hálito.

Outras referências podem ser encontradas nas culturas Grega e Romana.

Contudo, a halitose só foi cientificamente estudada no século XX,

demonstrando-se que a halitose poderia ser fisiológica ou patológica e que a

fonte do mau odor poderia estar localizada na boca, nasofaringe, ou outras

partes do corpo (SANZ , ROLDÁN e HERRERA 2001).

Diversas terminologias são empregadas para descrever a

presença de odores desagradáveis que emanem do ar expirado. Assim,

19

halitose, fetor ex ore, fetor oris, mau odor oral ou mau hálito podem ser

termos encontrados descrevendo as alterações do hálito (TOUYZ, 1993).

Uma primeira tentativa de classificação da halitose, associando as

diferentes categorias com a necessidade de tratamento foi publicada em

Japonês por Miazaki et al em 1999 sob o título: Tentativa de classificação da

halitose e suas indicações de tratamento (Tentative classification of halitosis

and its treatment needs. Niigata Dent J, 1999; 32:7-11. Japonese).

Posteriormente, Yaegaki e Coil (2000) difundiram os conceitos de Miazaki et

al ao descrever um protocolo para exame, classificação e tratamento da

halitose, que segundo os autores, deve ser utilizado para que se evite o

inadequado tratamento dos portadores de pseudo-halitose ou halitofobia.

Ao se receber para tratamento um paciente com queixa de halitose é

de fundamental importância fazer-se a distinção entre a halitose verdadeira e

a pseudo-halitose. A halitose verdadeira descreve a situação na qual o mau

odor é um problema real que pode ser facilmente diagnosticado usando-se

testes organolépticos ou meios físico-químicos. O termo pseudo-halitose é

usado quando o mau odor não existe de fato, mas o paciente insiste que seja

portador de tal alteração. Se após o adequado tratamento para halitose

verdadeira ou pseudo-halitose o paciente ainda insistir que possui alteração

do hálito, esta condição será classificada como halitofobia. A halitose

verdadeira, por sua vez, apresenta a subclassificação em halitose fisiológica

e halitose patológica, podendo ser esta última de origem bucal ou extra-bucal

(YAEGAKI e COIL, 2000; MURATA et al, 2002).

20

2.1. 2. AVALIAÇÃO DO HÀLITO.

A halitose pode ser mensurada por métodos organolépticos e

instrumentais. Os métodos instrumentais incluem a cromatografia gasosa,

monitores sulfídricos e nariz biônico ou eletrônico.

A investigação quanto a presença de halitose geralmente começa com

a queixa de um paciente que se diz portador do problema ou que tenha sido

informado por outro indivíduo (LOESCHE e KAZOR, 2002). A partir deste

momento a investigação quanto a presença de alteração do hálito se dará por

uma medida organoléptica ou com a utilização de um monitor de gases.

O desenvolvimento das técnicas de análise dos odores da cavidade

bucal apresenta duas fases distintas. Uma primeira fase onde os

instrumentos são utilizados para facilitar a avaliação organoléptica, e uma

fase onde os odores passam a ser mensurados através de testes físico-

químicos.

Brening, Sulser e Fosdick (1939) desenvolveram um aparelho

chamado de crioscópio, que permitiu a avaliação dos odores do hálito de três

fontes primárias (boca, pulmões e cavidade nasal) de forma isolada. O

crioscópio foi utilizado em conjunto com um outro aparelho desenvolvido em

1934 por Fair e Wells, o osmoscópio, inicialmente utilizado para a verificação

da qualidade da água através da olfação.

Sulser, brening e Fosdick (1939) utilizaram o crioscópio e o

osmoscópio e avaliaram algumas condições que afetam a concentração dos

21

odores no hálito. Os autores concluíram que algumas variáveis devem ser

consideradas na produção dos odores bucais: presença de piorréia1

gengivite, cáries , tempo decorrido desde a última refeição, sexo e idade.

Para o diagnóstico e estudo da halitose encontram-se referências a

diferentes escala de odores. Assim, escalas com variações de 0 a 5, 0 a 4 e

0 a 9 podem ser encontradas, onde os números mais elevados

correspondem a uma maior intensidade do odor percebido pelo examinador

(PITTS et al, 1981; IWAKURA et al, 1994). Uma escala comumente utilizada

é aquela descrita por Allisson e Katz (1919) com variação de 0 a 5, criada

para o controle de qualidade da água e posteriormente utilizada para a

avaliação organoléptica do hálito por Rosemberg et al (1991a).

O uso de cromatografia gasosa na avaliação do ar da cavidade bucal

foi introduzido por Tonzetich (1971) ao realizar um estudo onde o ar da

cavidade bucal de 15 indivíduos foi avaliado quanto a concentração de

compostos sulfurados voláteis. Amostras de saliva dos mesmos indivíduos

foram incubadas e avaliadas pelo mesmo método. Um cromatógrafo gasoso

equipado com uma coluna de teflon. As amostras de ar da cavidade bucal

foram colhidas através de seringa e imediatamente injetadas na coluna do

cromatógrafo.

Em 1975 Solis-Gafar et al realizaram um estudo clínico onde a

cromatografia gasosa foi utilizada para analisar a eficácia de um colutório

contendo agente antibacteriano (quaternário de amônia ). Uma modificação

quanto a técnica descrita no parágrafo anterior foi introduzida. Um sistema de

válvulas foi conectado a tubos de teflon de forma que uma extremidade do

1 Naquele período da evolução da Periodontia, utilizava-se o termo piorréia para a descrição da Doença Periodontal.

22

tubo era introduzida na cavidade bucal do indivíduo e a outra extremidade era

conectada a entrada do cromatógrafo. O estudo mostrou a redução de

compostos sulfurados voláteis (CSV) com o uso do antimicrobiano. Os

autores concluíram também que o uso da cromatografia gasosa estava

indicada para a avaliação da eficácia de colutórios quanto a redução de CSV

na cavidade bucal.

Com a evolução dos estudos na área de detecção dos odores do

hálito foram desenvolvidos monitores que pudessem ser utilizados no

consultório odontológico. Em 1991a, Rosemberg et al utilizaram um monitor

de gases (compostos sulfurados) até então usado para o controle ambiental

na indústria. O estudo incluiu 75 voluntários que tiveram os odores bucais

avaliados através do monitor de gases e organolepticamente por 5

examinadores. Para o teste organoléptico foi utilizada uma escala de 0 a 5.

Foi observada uma significante correlação entre os dois métodos utilizados.

Rosemberg et al (1991b) avaliaram a reprodutibilidade e a

sensibilidade de um monitor portátil de compostos sulfurados envolvendo 42

sujeitos durante 12 semanas. Além das medidas realizadas com o monitor

de gases, foram realizados testes organolépticos, índice de placa dentária,

índice de sangramento gengival e medição de bolsa periodontal. Solução de

clorexidina 0,2% foi utilizada e a mudança no odor bucal de cada indivíduo foi

avaliada, encontrando-se uma redução de 47% na concentração de

compostos sulfurados. Os testes estatísticos aplicados mostraram maior

reprodutibilidade e sensibilidade nos resultados obtidos com o monitor

quando comparado ao teste organoléptico, mostrando a utilidade deste

monitor em testes clínicos.

23

Furne et al (2002) compararam as medidas na concentração de

compostos sulfurados voláteis obtidas utilizando um monitor portátil

(Halimeter®) e cromatografia gasosa. Embora algumas diferenças tenham

sido encontradas, as leituras com o monitor mostram uma correlação positiva

com aquelas obtidas na avaliação por cromatografia gasosa.

Em 2004, Tanaka et al utilizaram pela primeira vez um nariz eletrônico

(FF-1 Odor discrimination analyzer) na avaliação da halitose. Os resultados

foram comparados com os achados dos testes organolépticos e

cromatografia gasosa mostrando similaridade entre os métodos de avaliação

da halitose.

Outros monitores portáteis para a análise de compostos sulfurados

voláteis foram desenvolvidos nos últimos anos a exemplo do OralChroma™

- Ability,Japan (AIZAVA et al, 2005) e Breathtron™ - New Cosmos Eletric

Company, Osaka, Japan (SOPAPORNAMORN et al, 2006).

2.1. 3. PEVALÊNCIA DA HALITOSE.

Segundo Loesche e Kazor (2002) poucos estudos documentaram a

prevalência da halitose a partir de uma amostra que representasse uma

determinada população. Em um estudo na Suécia com uma amostra

aleatória de 1.681 indivíduos, somente 2,4 % foram classificados como

portadores de halitose. A presença de halitose foi definida como a presença

de odor emanado da cavidade bucal do paciente e que surtia um efeito no

examinador a ponto de tornar o exame martirizante. Em um estudo

24

desenvolvido na França, 4.815 indivíduos de 15 anos de idade responderam

a um questionário e 22% relataram ser portadores halitose. Os autores

concluíram que esta prevalência está provavelmente superestimada

considerando-se a questionável confiabilidade da auto-percepção da halitose.

Em uma amostra com 2.672 indivíduos no Japão, com idade entre

18 e 64 anos, 28% da amostra apresentou halitose. Neste estudo, os

indivíduos com halitose foram definidos como aqueles apresentando valores

≥75 ppb para compostos sulfurados voláteis medido com o Halimeter®

(MIYAZAKY et al, 1997).

Mais recentemente, Liu et al (2006) avaliaram a correlação entre os

níveis de mau odor bucal e condições de saúde bucal em 2000 indivíduos na

China, com igual número de indivíduos das zonas urbanas e rurais. A

amostra foi dividida de forma que continha o mesmo número de indivíduos do

gênero masculino e feminino, entre 15 e 64 anos de idade. Ao teste

organoléptico, 27,5% dos indivíduos apresentaram halitose. Na medida com

um monitor de gases (Halimeter®) 20,3% apresentaram medidas acima de

110 ppb e 35,4 % apresentaram medidas acima de 75 ppb. Não foram

verificadas diferenças significantes nos valores médios medidos com o

Halimeter® para as diferentes faixas etárias ou para os grupos da zona

urbana ou rural.

2.1. 4. ETIOLOGIA DA HALITOSE.

25

Os primeiros estudos que avaliaram odores associados às alterações

do hálito buscaram relacionar a produção destes odores com os processos

putrefativos da saliva.

Em 1943 Law, Berg e Fosdick verificaram que as proteínas salivares

de indivíduos com doença periodontal sofriam putrefação e hidrólise mais

rapidamente do que proteínas oriundas da saliva de indivíduos sadios.

Berg e Fosdick (1946) desenvolveram o primeiro estudo onde a saliva

foi utilizada como um meio para o crescimento de microrganismos bucais em

culturas isoladas. Os autores observaram que a introdução de uma maior

quantidade do microrganismo testado resultava em um aumento do processo

putrefativo. Observaram também que uma microbiota mista produzia

putrefação mais rapidamente do que quando da presença de espécies

isoladas. Os resultados quanto a produção de odores não mostraram

diferença quando a saliva foi incubada em condições de aerobiose ou

anaerobiose.

Berg, Burril e Fosdick (1947) observaram que a saliva de indivíduos

sadios possuía a capacidade de gerar odores desagradáveis após 1 hora de

incubação. Ao final de 3 horas de incubação estes odores tornavam-se

intensos ao ponto impedir uma medição acurada. A saliva de indivíduos com

doença periodontal apresentava uma maior velocidade de putrefação.

Posteriormente, estudos de Ballantyne et al (1951), Clegg e Rae

(1956) e Rae e Clegg (1956) demonstraram as alterações na produção de

amônia por microrganismos bucais quando ocorrem alterações no pH da

saliva. Shiota e Kunkel Jr. (1958) mostraram que estas mudanças no pH

26

também são responsáveis pelo maior ou menor crescimento de determinadas

espécies de microrganismos.

O trabalho de McNamara et al (1972) demonstrou que a geração de

mau odor na cavidade bucal ocorre devido a presença de microrganismos.

Quando a saliva livre de microrganismos foi incubada isoladamente ou

adicionada a caldo para cultura, nenhum odor foi produzido. Este trabalho

também mostrou que nem todos os microrganismos tem a mesma

capacidade de produzir estes odores, sendo os gram-negativos os principais

responsáveis. O pH foi também avaliado e amostras com pH 6,5 inibiram a

formação de odor enquanto amostras com pH 7,2 mostraram presença de

mau odor. A presença de glicose inibiu a formação de mau odor bucal e

manteve o equilíbrio na quantidade de microrganismos gram-positivos e

gram-negativos.

A capacidade de bactérias da bolsa periodontal em produzir

compostos sulfurados voláteis (CSV) foi avaliada por Persson, Claesson e

Carlsson (1989). Bactérias foram colhidas de bolsas periodontais de 9

pacientes e cultivadas em soro humano. A medida de CSV foi realizada

através de cromatografia gasosa e a quantidade de compostos sulfurados

presente no soro após a incubação foi determinada com espectrometria por

emissão de plasma. Os resultados mostraram que as bactérias colhidas das

bolsas periodontais tinham uma alta capacidade de produzir CSV quando

cultivadas no soro humano, sendo o sulfidreto a principal composto sulfurado

formado. Quantidades significantes de metilmercapitana e dimetilsulfeto

foram também encontradas.

27

Persson et al (1990) verificaram a capacidade de diferentes espécies

bacterianas em produzir compostos sulfurados voláteis. A capacidade de

formação de CSV foi medida por cromatografia gasosa a partir de bactérias

isoladas de bolsas periodontais e amostras padronizadas (ATCC). Um total

de 163 amostras representando 75 espécies, além de 7 bactérias até então

não classificadas, mostraram significativa capacidade de produzir CSV

quando cultivadas no soro humano ou a partir da adição de L-cisteína ou L-

metionina em solução salina. Segundo os autores, os resultados

encontrados ampliaram a lista de bactérias bucais capazes de produzir CSV.

Kleinberg e Kodipilly (1997) estudaram as bases biológicas para a

formação da halitose. Utilizando diversos microrganismos da cavidade bucal

encontrados na placa bacteriana e introduzindo diversos aminoácidos ao

meio de cultura, os autores identificaram os microrganismos responsáveis

pela produção do mau hálito usando teste organoléptico. Verificaram ainda

que as bactérias anaeróbias gram-negativas são as principais responsáveis

pela produção dos odores.

Em 1999 Kleinberg e Codipilly utilizaram um modelo de sedimento

salivar (Suspended Salivary Sediment - SSS) e avaliaram alguns parâmetros

relacionados a formação do mau odor bucal. Demonstraram a funcionalidade

do SSS para testar a eficácia de substâncias usadas em colutórios quanto a

sua atividade antibacteriana e inibitória sobre a formação de compostos

sulfurados voláteis e outras substâncias.

Kato et al (2005) utilizaram a reação da cadeia de polimerase em

tempo real para a análise quantitativa de microrganismos bucais produtores

de compostos sulfurados voláteis (CSV). Vinte e dois pacientes forneceram

28

amostras da saliva, biofilme lingual e da placa subgengival. Estes pacientes

foram avaliados quanto a produção de compostos sulfurados voláteis por

cromatografia gasosa a partir de amostras de ar da cavidade bucal Os

testes de PCR foram realizados para a análise de Porphyromonas gingivalis,

Fusobacterium nucleatum, Treponema denticola e Bacteroides forsythus. De

acordo com os autores, esta metodologia pode ser usada para a análise

quantitativa de bactérias bucais produtoras de CSV.

Algumas das bactérias diretamente relacionadas com as alterações do

hálito estão também estão associadas às alterações periodontais e

endodônticas (GOODSON, 1994; GOMES et al, 2005; SAKAMOTO et al,

2006; SEOL et al, 2006).

Segundo Lee et al (2003) aceita-se a idéia de que a causa principal

da halitose seja devido a presença de compostos sulfurados voláteis. Deve-

se considerar, contudo a presença de outras substâncias compondo o grupo

de substâncias que produzem os odores do hálito como cadaverina e

putrescina, indol, escatol, piridina, entre outros (GOLDBERG et al, 1994;

KLEIMBERG e CODIPILLY, 1997; CODIPILLY, KAUFMAN e KLEIMBERG,

2004).

2. 2. ABORDAGEM ANTIMICROBIANA NA HALITOSE.

A abordagem antimicrobiana no tratamento na redução dos odores

bucais está diretamente relacionada à abordagem antimicrobiana utilizada na

doença periodontal, uma vez que existem bactérias comuns a ambos os

processos.

29

Baker at al (1987) avaliaram o efeito da clorexidina e uma série de

análogos onde o clorofenil foi substituído por cadeias do tipo alquil. A

clorexidina mostrou atividade antimicrobiana sobre baterias gram-negativas

e gram-positivas. Os melhores resultados foram obtidos com o uso dos

agentes hexidecidine, hexhexidine e alexidine que apresentaram um largo

espectro e boa ação sobre patógenos da cavidade bucal.

Uma comparação quanto a substantividade de 9 produtos para higiene

bucal, incluindo 2 dentifrícios, foi avaliada por Elworthy et al (1996). A

substantividade foi definida como a persistência da ação antibacteriana ao

longo de intervalos de 30, 60, 180, 300, e 420 minutos. A ação

antibacteriana foi medida a partir da contagem de unidades formadoras de

colônias obtidas da coleta de saliva estimulada , incubada em anaerobiose

por 72 horas. A clorexidina (0,12%) mostrou o melhor resultado com máxima

eficácia após 3 a 5 horas e mantendo o melhor resultado até o intervalo de

7 horas, quando comparada as demais substâncias testadas.

Herrera et al (2003) realizaram estudo in vitro e in vivo de 4

enxaguantes bucais contendo clorexidina a 0,12%. Teste de contato direto in

vitro mostrou que Lactocacillus casei, Straptococcus mitis e Streptococcus

micros foram sensíveis a associação de clorexidina + cetilpiridínio e

resistentes as associações clorexidina + álcool, clorexidina + fluoreto de

sódio e a clorexidina 0,12% de forma isolada. No estudo in vivo a contagem

bacteriana mostrou uma maior redução para as associações clorexidina +

cetilpiridínio e clorexidina + álcool, independentemente de se tratarem de

bactérias aeróbicas ou anaeróbicas.

30

Sreenivasan (2003) realizou um ensaio clínico para avaliar a eficácia

de um dentifrício contendo triclosan associado a um copolímero ( PVM/MA -

polyvinyl methyl ether/maleic acid ) sobre bactérias bucais produtoras de

sulfidreto. O efeito do dentifrício testado foi comparado a um outro dentifrício

sem triclosan ou copolímero, em um modelo de estudo duplo cego e

cruzado. Para a avaliação do efeito antibacteriano, amostras de saliva foram

coletadas e devidamente processadas para crescimento em trypticase soja

agar (TSA) e um meio específico contendo acetato de chumbo para o

crescimento de bactérias produtoras de sulfidreto. Os resultados mostraram

que o uso do dentifrício contendo triclosan e o copolímero levaram a uma

redução significativa de todas as bactérias, incluindo aquelas produtoras de

sulfidreto, corroborando resultados previamente obtidos com o uso deste

dentifrício na redução do mau odor bucal.

A redução de compostos sulfurados voláteis (CVS) com o uso de um

colutório foi avaliada por Winkel et al (2003). O estudo clínico duplo cego

envolveu 40 voluntários que utilizaram um colutório teste contendo

clorexidina, cetilpiridínio e lactato de zinco e um colutório placebo. Os

parâmetros foram avaliados através de: teste organoléptico ( 0 – 5 ), nível de

CSV, índice de Winkel para saburra lingual e manchamento lingual e

manchamento dentário. O uso do colutório teste levou a uma significante

redução do teste organoléptico de 2,8 para 1. A média de CSV caiu de 292

ppb para 172 ppb no grupo teste enquanto nenhuma redução foi observada

no grupo controle. Em ambos os grupos não foi observada redução

significativa no índice de saburra lingual. O manchamento lingual foi um

31

efeito adverso observado apenas no grupo teste. Concluíram os autores que

o colutório testado foi eficaz no tratamento da halitose.

Uma redução na contagem de microrganismos anaeróbios

subgengivais foi encontrada por Santos et al (2004) ao avaliarem a eficácia

do uso da clorexidina (0,05%) associada ao cloreto de cetilpiridínio (0,05%)

usado por um período de 15 dias. Um ensaio clínico aleatório utilizando

placebo foi realizado com 33 portadores de periodontite crônica previamente

tratados. Observou-se uma redução significativa da microbiota e na

freqüência de detecção de Porphyromonas gingivalis no grupo teste. A

formulação antisséptica testada demonstrou uma atividade inibitória de curto

prazo na formação de biofilme dental.

Um estudo de Carvalho et al (2004) avaliou o impacto de colutórios

sobre o hálito matinal. Usando um modelo duplo cego, aleatório e cruzado, os

autores avaliaram 4 diferentes marcas comerciais de colutórios disponíveis

no Brasil, em um grupo de 12 indivíduos, por um período de 4 dias. Os

produtos continham respectivamente: triclosan (0,03%), gluconato de

clorexidina (0,12%), cloreto de cetilpiridínio e óleos essenciais. Foram

utilizados controle positivo e negativo, e se avaliou: níveis de compostos

sulfurados voláteis (CSV) com Halimeter®, índice de gengivite e índice de

placa dentária. O gluconato de clorexidina (0,12%) foi o produto que se

mostrou mais eficaz na redução de CSV.

Roldán et al (2004) desenvolveram um estudo duplo cego, cruzado

utilizando controle negativo com 10 indivíduos para comparar a eficácia de 5

diferentes colutórios contendo clorexidina, com relação ao seu efeito sobre a

concentração de compostos sulfurados voláteis e contagem de bactérias na

32

saliva (aeróbias e anaeróbias). As formulações continham: clorexidina

0,12% (CHX + NO); clorexidina 0,12% + álcool (CHX + ALC); clorexidina

0,12% + cetilpiridínio 0,05% (CHX + CPC); clorexidina 0,12% + fluoreto de

sódio (CHX + NaF); e clorexidina 0,05%, + cetilpiridínio 0,05% + acetato de

zinco 0,14% (CHX + Zn). As medidas de CVS com Halimeter®, teste

organoléptico, índice de saburra lingual e contagem bacteriana na saliva

foram realizadas antes do uso dos produtos seguindo-se novas avaliações

com 1 e 5 horas após o uso dos mesmos. Com relação aos CSV o melhor

resultado em 1 hora ocorreu com o uso de CHX + NO e CHX + Zn. Após 5

horas os melhores resultados foram obtidos com o uso de CHX + CPC e CHX

+ Zn. Com relação a contagem bacteriana CHX + CPC mostrou o melhor

desempenho tanto sobre bactérias aeróbicas como anaeróbicas. Concluem

os autores que diferenças importantes podem ser observadas com o uso de

diferentes formulações contendo clorexidina.

Sekino et al (2004) avaliaram o uso da clorexidina na formação do

biofilme dental através de um ensaio clínico duplo cego. Além do uso de

colutório com clorexidina (0,2%), os voluntários da pesquisa utilizaram

clorexidina gel (1,0%) para escovação da língua. Exames foram realizados do

1º ao 4º dia. Observou-se que o uso da clorexidina na forma de bochechos

associado ao uso do gel reduziu a formação de novo biofilme bacteriano,

diminuindo o número de microrganismos do biofilme o número de

microrganismos na saliva.

Colutórios contendo baixas concentrações de clorexidina foram

avaliados quanto a ação antimicrobiana sobre bactérias produtoras de

sulfidreto e relacionadas à halitose. Sreenivasan e Gittins (2004) realizaram

33

um ensaio clínico aleatório para comparar a eficácia de colutórios contendo

clorexidina nas concentrações de 0,03% , 0,06% e 0,12% , com relação ao

colutório controle sem clorexidina. Bactérias produtoras de sulfidretos

mostraram significativa redução pós-tratamento para ambas as

concentrações de clorexidina quando comparadas ao controle .

Recentemente, um dentifrício em forma líquida contendo

triclosan/copolímero foi testado in vitro por Sreenivasan et al (2005) quanto a

sua ação antimicrobiana sobre 13 espécies de microrganismos da cavidade

bucal, incluindo Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis e

Prevotella intermedia. Adicionalmente, testes microbiológicos ex vivo

avaliaram sua eficácia a partir de saliva coletada de indivíduos que utilizaram

o dentifrício e compararam seus efeitos com outras duas amostras de

dentifrícios contendo ingredientes típicos (flavorisantes, humectantes,

abrasivos, sufactantes e fluoreto de sódio). Em ambos os testes o uso do

dentifrício contendo triclosan/copolímero resultou em uma significante

redução no número de bactérias cultiváveis quando comparado aos demais

dentifrícios.

Quirynen et al (2005) realizaram um estudo duplo cego, aleatório de

longa duração (6 meses) e avaliaram a eficácia de colutórios contendo

clorexidina 0,05% + cloreto de cetilpiridínio 0,05% em formulações com ou

sem álcool, comparando-as com um placebo (sem álcool). Depois de 1, 3 e 6

meses uma série de parâmetros clínicos e microbiológicos foram avaliados.

Dentre estes parâmetros, foi avaliado o efeito dos colutórios sobre bactérias

anaeróbias, inclusive Fusobacterium nucleatum. Efeitos adversos também

foram avaliados. As formulações com ou sem álcool foram igualmente

34

eficazes na redução das bactérias na placa bacteriana dental e na saliva.

Concluem os autores que as formulações testadas são efetivas enquanto

agentes inibidores do biofilme bucal a longo praso, apresentando reduzidos

efeitos colaterais.

Um colutório contendo benzidamida 0,15% + cetilpiridinio 0,05% foi

testado por Herrera et al (2005) quanto a sua eficácia na prevenção da

recolonização da placa bacteriana num período de 4 dias. Um colutório

contendo cloreto cetilpiridinio e um placebo foram usados para comparação.

Dentre os microrganismos testados estavam incluídos: Fusobacterium

nucleatum, Peptostreptococcus micros, Porphyromonas gingivalis e

Prevotella intermedia. Resultados demonstraram que houve uma ação

inibitória da associação benzidamida 0,15% + cetilpiridinio 0,05% sobre

Fusobacterium nucleatum e Prevotella intermedia, quando comparada ao

placebo.

Lakhssassi et al (2005) estudaram a susceptibilidade antimicrobiana

de 50 patógenos anaeróbicos colhidos de 20 sujeitos adultos e com

diagnóstico de doença periodontal agressiva. Foram isoladas amostras de

Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Tannerella forsythia,

Fusobacterium nucleatum e Peptostreptococcus micros. Foram testados 10

antibióticos utilizando-se as técnicas de microdiluição e difusão em agar

(discos). Os resultados da difusão mostraram que, nas amostras estudadas,

os antibióticos amoxicilina, ampicilina, amoxicilina/clavulanato, doxiciclina, e

clindamicina mostraram-se efetivos. Ciprofloxacina e clindamicina

apresentaram baixa eficácia contra os microrganismos estudados.

35

Um estudo sobre o efeito antimicrobiano de dentifrício contendo

triclosan/copolímero (triclosan 0,3%, gantrez 2%) e de colutório contendo

diferentes concentrações de clorexidina (0,12% e 0,06%) foi desenvolvido por

Yang e Sreenivasan (2005). Foi utilizado um modelo ex vivo onde amostras

bacterianas colhidas a partir da saliva e do dorso da língua foram expostas as

substâncias testes e depois cultivadas em meios apropriados, incluindo meio

de cultura específico para o crescimento de bactérias produtoras de

sulfidreto. A exposição ao dentifrício mostrou efeito antimicrobiano dose

dependente , sobre bactérias anaeróbias e facultativas O efeito dos

colutórios bucais contendo clorexidina sobre bactérias produtoras de

sulfidreto mostrou uma redução de 82% e 69% para as concentrações do

colutório de 0,12% e 0,06%, respectivamente. Contudo, não foi observada

uma significante resposta dose dependente.

2. 3. USO DE PLANTAS MEDICINAIS E FITOTERÁPICOS.

Os produtos naturais obtidos diretamente de vegetais ou

microrganismos são uma importante fonte de compostos que orientam a

indústria farmacêutica na busca de novos medicamentos (HASLAN, 1996).

Populações em todos os continentes têm experimentado o poder de cura das

plantas e utilizado milhares destas plantas desde a pré-história (COWAN,

1999).

Desde a antiguidade a humanidade tem usado as plantas para o

tratamento de doenças. Na verdade, muito antes da descoberta das

bactérias, aceitava-se que certas plantas apresentavam o potencial para

36

curar diversas enfermidades. Alguns dos medicamentos de origem vegetal

chamados atualmente de medicamentos tradicionais são ainda utilizados

(RIOS e RECIO, 2005).

Em diversos continentes cresce o número de estudos que procuram

comprovar o que é divulgado como conhecimento popular sobre a atividade

de determinadas plantas no combate às doenças (STICKEL, PATSENKER e

SCHUPPAN, 2005; FUNARI e FERRO, 2005; MICHELIN et al, 2005;

MELÉNDEZ e CAPRILES, 2006).

De acordo com Lorenzi e Matos (2002) diversas partes das plantas

são empregadas nas chamadas práticas caseiras do uso de plantas

medicinais. São usadas as folhas, cascas, raízes, o látex, frutos e sementes.

As formas de utilização são variadas e podem incluir: chás, inalação,

xaropes, tinturas, entre outras.

Neste contexto, a atividade antimicrobiana de diversas espécies de

plantas tem sido avaliada. Na Guatemala, Cáceres et al (1987) realizaram

uma pesquisa entre vendedores e curandeiros e detectaram o uso de pelo

menos 200 plantas usadas para o tratamento de lesões da pele e mucosas.

Numa seleção de 21 plantas usadas com propósitos medicinais na

África do Sul, Rabe e Staden (1997) verificaram que 12 das espécies

testadas apresentaram atividade antibacteriana sobre bactérias Gram-

positivas.

Na Nigéria, Kudi et al (1999) avaliaram a atividade antimicrobiana de 8

espécies de plantas tradicionalmente utilizadas no tratamento de infecções

tanto em humanos como em animais. A maioria dos extratos apresentou

atividade inibitória sobre bactérias Gram-positivas. Duas espécies

37

(Angeiossus schimperi e Anacardium occidentali) apresentaram atividade

inibitória sobre bactérias Gram-negativas, as quais sejam, Escherichia coli e

Pseudomonas aeruginosa.

No norte da Argentina, Salvat et al (2001) avaliaram a atividade

antimicrobiana de 25 espécies de plantas. Entre outros resultados, a

Vassobia breviflora apresentou atividade bacteriostática sobre

Staphylococcus aureus e Enterococcus faecium.

No estudo de Geyid et al (2005) no qual foram avaliados extratos de

44 plantas usadas no tratamento de doenças infecciosas na Etiópia, verificou-

se que de modo geral, quanto maior o número de substâncias constituintes

apresenta uma determinada espécie de planta, maior a diversidade de

microrganismos sobre os quais esta planta terá atividade inibitória.

Segundos os autores, pode-se explicar este fenômeno por um possível efeito

de sinergismo entre os diversos componentes presentes no extrato.

Holetz et al (2002) realizaram um estudo e avaliaram a atividade

antimicrobiana de 13 plantas usadas popularmente no Brasil para o

tratamento de doenças infecciosas. Dez dos extratos produzidos a partir das

plantas testadas mostraram variados níveis de atividade antibacteriana. Por

exemplo, o extrato de Piper regnelli (Pariparoba) presentou boa atividade

sobre Staphylococcus aureus e Bacillus subtilis. O extrato de Punica

granatum (Romã) mostrou boa atividade sobre Staphylococcus aureus.

Silva e Andrade (2005) verificaram as diferentes formas de utilização

da vegetação por parte de comunidades da Zona do Litoral e da Mata do

Estado de Pernambuco – Brasil. Dentre as diversas formas de uso verificou-

se que o uso medicinal apresentou o maior número de espécies em todas as

38

comunidades estudadas, correspondendo a quase a metade (169) do total de

plantas indicadas pelos participantes na pesquisa. As ervas foram descritas

como mais frequentemente utilizadas, com pouca utilização das arbóreas e

arbustivas.

De acordo com Maciel et al (2002) o uso das plantas medicinais é o

único recurso de que dispõem algumas comunidades e grupos étnicos. No

Brasil o uso de plantas com finalidade terapêutica ocorre nas regiões mais

pobres do país assim como nas grandes cidades e diversas plantas são

comercializadas em feiras-livres, mercados populares e até encontradas

cultivadas em quintais residenciais.

Dois aspectos importantes devem ser considerados no uso dos

fitoterápicos: a possibilidade de toxicidade e a possibilidade de interação

medicamentosa. Segundo Calixto (2000), no Brasil, a despeito da imensa

diversidade botânica e o largo uso de ervas medicinais, poucos esforços tem

sido feito no sentido de se estabelecer a qualidade, segurança e eficácia

destes produtos. Sabe-se que as plantas em geral contem centenas de

constituintes sendo alguns destes muito tóxicos. Segundo o autor:

“ a idéia de que produtos naturais são seguros e livres de

efeitos colaterais é falsa”.

Existe um senso comum de que produtos obtidos a partir de plantas

são intrinsecamente inofencíveis, uma vez que são naturais. Todavia, seus

efeitos derivam de suas características farmacológicas e dos níveis de

ingredientes ativos. Efeitos tóxicos podem também ser atribuídos a toxicidade

39

de seus constituintes, contaminação por pesticidas, microrganismos ou

metais pesados (CAPASSO et al, 2000).

Sabe-se que fatores intrínsecos e extrínsecos incluindo diferenças de

espécies, variação durante diferentes estações do ano, ambiente, coleta,

cultivo, contaminação, substituição e processamento podem afetar a

qualidade botânica do material utilizado na produção de medicamentos e

consequentemente a sua eficácia e segurança (REICHLING e SALLER,

1998; FONG, 2002).

Muitos medicamentos naturais são utilizados como auto-medicação

por adultos e algumas vezes em doses excessivas ou misturas com até 10

plantas diferentes, as vezes associados a vitaminas e minerais. Pode ocorrer

então efeito tóxico proveniente de uma das plantas utilizadas ou decorrente

da interação entre elas. São ainda desconhecidas as conseqüências da

exposição em longo prazo e não se deve excluir a carcinogenicidade,

mutagenicidade, efeito tóxico sobre o feto ou a criança ( WOOLF, 2003).

Fugh-Berman (2000) alerta para o perigo das interações entre certos

medicamentos alopáticos e fitoterápicos. Pacientes em uso de ciclosporina

ou digoxina devem evitar o uso de Hypericum perforatum L. (Erva de São

João) e misturas de ervas chinesas que podem potencializar o efeito de

corticosteróides.

Sparreboom et al (2004) revisaram a literatura científica publicada

sobre a interação de medicamentos fitoterápicos usados concomitantemente

com medicamentos alopáticos no tratamento do câncer. Verificaram que

Allium sativum, Gingko bliloba, Echinacea purpúrea, Panax ginseng,

40

Hipericum perforatum e Piper methysticum podem atuar na modulação de

enzimas e interferir tanto na absorção por via oral quanto no metabolismo

hepático de medicamentos alopáticos usados em oncologia.

As plantas incluídas neste estudo já foram previamente avaliadas

quanto a sua atividade antimicrobiana ou apontadas como úteis para o

tratamento de diferentes doenças por diferentes populações, através de

estudos de etnofarmacologia. Das espécies aqui estudadas, Caesalpinia

ferrea Mart. (jucá) e Aeolanthus suaveolens (Als.) Spreng. (macassá) foram

encontradas na literatura científica em pesquisas envolvendo sua atividade

antiinflamatória e anticonvulsivante. Contudo, substâncias que apresentam

atividade antimicrobiana são encontradas em sua composição, a exemplo da

presença de taninos e linalol no macassá (CARVALHO et al, 1996; COSTA-

LOTUFO et al, 2004; LIMYATI e JUNIAR,1997; LÓPEZ et al, 2005; MAU,

CHEN e HSIEH, 2001; SANTOYO et al, 2004; SOUZA et al, 2004;

VASCONCELOS et al, 2003).

2. 3. 1. USO DE PLANTAS MEDICINAIS E FITOTERÁPICOS

NA ODONTOLOGIA.

O uso de plantas medicinais na Odontologia segue o padrão para o

uso de plantas medicinais em geral. O conhecimento popular da ação de

determinada planta é disseminado entre a população e o seu uso passa a ser

empregado nas afecções bucais.

Xavier, Ramos e Xavier Filho (1995) realizaram estudo bibliográfico e

entrevista com raizeiros no Estado da Paraíba e descreveram diversas

41

plantas e suas indicações nas afecções bucais, como no combate a aftas,

abscessos, gengivite, ulcerações por próteses mal adaptadas, entre outras.

Um estudo duplo-cego de 9 meses de duração foi conduzido por

Gordon et al (1985) para avaliar a eficácia de um colutório contendo óleos

essenciais (Listerine®) em inibir o desenvolvimento do biofilme dental e da

gengivite. O estudo incluiu 127 sujeitos com idade entre 18 e 54 anos.

Quando comparado ao uso do controle, o uso da substância teste mostrou

uma redução de 12,1%, 18,3% e 18,0% na formação de biofilme dental, nas

avaliações realizadas nos intervalos de 1, 3 e 6 meses, respectivamente.

Redução significativa foi também observada para o índice de gengivite aos

nove meses de uso do produto.

DePaola et al (1989) a inibição da formação do biofilme dental e da

gengivite em um estudo duplo-cego conduzido em 107 indivíduos adultos. O

estudo teve duração de 6 meses e comparou a eficácia do Listerine® ao uso

de um controle com solução hidroalcoólica a 5%. Ao final do estudo não foi

observado manchamento extrínseco dos dentes ou tecidos moles, e a

substância teste levou à redução de 34% nos índices de formação de biofilme

dental e gengivite.

O efeito antimicrobiano sobre microrganismos do biofilme dental do

extrato hidroalcoólico da Punica Granatum Linn. foi avaliado por Pereira

(2002) em uma pesquisa in vitro e também numa avaliação clínica de um

dentifrício contendo este mesmo extrato. Observou-se que o extrato atividade

bactericida sobre Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus

sobrinus, Streptococcus sanguis e Lactobacillus casei. O extrato de Punica

granatum Linn. inibiu a aderência ao vidro de todos os microrganismos

42

testados. O estudo clínico demonstrou a redução na contagem de S. mutans

em 54,8 % dos indivíduos após 30 dias de uso do creme dental contendo o

extrato teste.

Vasconcelos et al (2003) compararam o gel de Punica Granatum Linn.

e o miconazol quanto a sua eficácia no tratamento da candidose bucal

associada a estomatite protética. Resultados clínicos e laboratoriais

apresentaram uma resposta semelhante entre as duas substâncias utilizadas

indicando a possibilidade do uso do gel de Punica Granatum no tratamento

da enfermidade estudada.

A ação da Camelia sinensis (Oolong tea) foi avaliada sobre

Streptococcus mutans. Os resultados demonstraram um efeito inibidor sobre

a enzima glicosiltransferase que permite a síntese de glucanos, responsáveis

pela aderência destes microrganismos à superfície dentária (NAKAHARA et

al, 1993).

Gebara, Zardetto e Mayer (1996) estudaram a ação antimicrobiana in

vitro de produtos naturais sobre Streptococcus mutans e Streptococcus

sobrinus. Foram avaliadas tinturas de cacau, camomila, malva, salva e

tomilho e estabelecidas as concentrações inibitórias mínimas e

concentrações inibitórias mínimas de aderência. Cacau e tomilho

apresentaram tanto ação antibacteriana como inibição da aderência ao vidro

dos microrganismos testados.

Pan et al (2000) utilizaram um método de coloração bacteriana

(LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit, Molecular Probes, Inc., Eugene,

OR – USA) para verificar a eficácia de um colutório contendo óleos

43

essenciais (Listerine®). Dezessete sujeitos participaram do estudo do tipo

aleatório e cruzado. Todos os participantes usaram o colutório e o controle,

observando-se um período de uma semana de intervalo. Trinta minutos após

a realização de bochechos de 30 segundos com a substância teste ou com

uma solução salina como controle, realizou-se a contagem de bactérias

viáveis e não viáveis presentes no biofilme dental. Os resultados foram

comparados com os resultados das coletas de biofilme dental obtidos

previamente a realização do uso das substâncias teste e controle. O uso do

colutório contendo óleos essenciais determinou a destruição de 78,7% das

bactérias enquanto o controle de terminou a destruição de 27,9% das

bactérias.

O óleo essencial de Cymbopogon citratus (capim-santo) foi avaliado

em um estudo in vivo por Santos (2000) e demonstrou eficácia na redução da

colonização de fungos do gênero Candida na mucosa do palato e na base de

dentaduras.

De acordo com Matsumoto, Hamada e Ooshima (2003) polifenóis

presentes no extrato de Camelia sinensis (Oolong tea) apresentaram

atividade inibitória sobre as enzimas glicosiltransferase B e D de

Streptococcus mutans . A velocidade de síntese de glucano foi diminuida

quando da presença de polifenol (OTF6) quando comparada a velocidade de

síntese na ausência desta substância. Isto sugere que o polifenol testado

reduz a síntese do glucano por inibição enzimática e não por competitividade.

O extrato de Camelia sinensis (Oolong tea) foi testado quanto a sua

atividade antibacteriana sobre Streptococcus mutans e Streptococcus

sobrinus. Nenhuma atividade inibitória sobre os microrganismos foi

44

observada no cultivo em caldo (BHI- Brain- Heart Infusion Broth). A atividade

antibacteriana foi observada numa suspensão de solução salina tamponada e

foi mais acentuada para frações monoméricas dos polifenóis. Os resultados

sugerem que a atividade antibacteriana da Camelia sinensis seja

conseqüência do efeito sinérgico de polifenóis monoméricos que se ligam a

proteínas (SASAKI et al, 2004).

Charles et al (2004) compararam o efeito da clorexidina e óleos

essenciais (Listerine®) usados como colutório num ensaio clínico com 6

meses de duração. O Listerine® foi descrito com a seguinte composição:

0,064% de timol, 0,092% de eucaliptol, 0,060% de metilsalicilato e 0,042% de

mentol. Uma solução hidroalcoólica a 5% foi usada como controle negativo.

108 sujeitos foram aleatoriamente distribuídos em 3 grupos. Os resultados

dos índices de sangramento gengival, biofilme dental, cálculo dental e

manchamento dental foram comparados com os índices obtidos no início do

experimento. Após 6 meses ambos os colutórios mostraram resultados

semelhantes quanto ao efeito sobre o biofilme dental e a gengivite. O grupo

que usou a clorexidina mostrou uma maior quantidade de cálculo dental e

manchamento dental quando comparado ao grupo que usou o colutório com

óleos essenciais ou controle negativo.

O efeito inibitório do extrato da casca da semente da Theobroma

cacao (cacau) sobre Streptococcus mutans foi avaliado por Matsumoto et al

(2004). O estudo foi dividido em um experimento in vitro e um ensaio clínico

onde indivíduos utilizaram bochechos com o extrato estudado e forneceram

amostras de saliva para contagem bacteriana. No estudo in vitro o extrato

reduziu de forma significativa a aderência do S. mutans a discos de

45

hidroxiapatita cobertos com saliva, a formação do biofilme dental artificial e a

contagem bacteriana. No estudo in vivo constatou-se a redução da formação

do biofilme dental mensurado pelo índice de placa bacteriana e a redução na

contagem de S. mutans na saliva.

Nostro et al (2004) estudaram a ação do extrato de Helichrysum

italicum sobre Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius e

Streptococcus sanguis. O estudo avaliou ainda: a ação do extrato sobre a

hidrofobicidade do S. mutans, um importante fator relacionado a capacidade

de aderência a estrutura dentária; a aderência ao vidro; e a agregação

celular. O extrato estudado mostrou atividade antimicrobiana sobre os 3

microrganismos testados. Concentrações menores que a concentração

inibitória mínima apresentaram atividade redutora na aderência do S. mutans

a superfície do vidro e na hidrofobicidade e ainda interferência na agregação

bacteriana.

A associação de clorexidina e óleos essenciais foi avaliada quanto a

sua atividade antibacteriana sobre Streptococcus mutans e Lactobacilus

plantarum . Os resultados revelaram que quando a clorexidina foi associada

a óleos essenciais, a quantidade de clorexidina necessária para inibir o

crescimento bacteriano foi reduzida de 4 a 10 vezes (FILOCHE, SOMA e

SISSONS, 2005).

2. 3. 2. USO DE PLANTAS MEDICINAIS E FITOTERÁPICOS NO

TRATAMENTO DA HALITOSE.

46

Descreveremos a seguir alguns estudos que utilizaram a abordagem

antimicrobiana relacionada à redução da halitose com uso de óleos

essenciais e outros fitoterápicos. Também foram incluídos neste tópico

estudos que fazem referência direta a micorganismos reconhecidamente

produtores de compostos sulfurados voláteis.

Em 1949 Morris e Read avaliaram a variação da intensidade do odor

bucal e do odor decorrente da putrefação da saliva quando da ação de um

colutório contendo mentol, timol, eucaliptol, salicilato de metila, ácido

benzóico e ácido bórico. Os resultados mostraram que a diluição da saliva

com 6% do antisséptico impediu a completamente a formação de odores. O

uso do colútório levou a redução dos odores do hálito medidos com

osmoscópio.

Pianotti e Pitts (1978) verificaram a eficácia na redução do número de

bactérias Gran-negativas relacionadas a halitose após o uso de Listerine®

como colutório. Os resultados mostraram a redução estatisticamente

significante dos microrganismos colhidos do sulco gengival de 5 indivíduos

após 15, 60 e 120 minutos da realização de bochecho com o colutório

testado. Contudo, a redução do número de microrganismos após 180

minutos não mostrou diferença estatisticamente significante quando

comparada as medidas realizadas antes do uso do colutório.

Pitts et al (1983) realizaram um estudo aleatório, duplo-cego do tipo

cruzado que incluiu 30 voluntários. A eficácia do Listerine® ( Warner- Lambert

Co, USA) foi comparada a de um colutório placebo (formulação sem a

presença dos óleos essenciais) e um colutório contendo apenas água. Foram

avaliados: a população de microrganismos a partir de amostras da língua e

47

sulco gengival; intensidade do odor bucal a partir de testes organolépticos;

medida de compostos sulfurados voláteis (CSV) com cromatografia gasosa.

O efeito do uso das substancias foi avaliado após 30, 60 e 180 minutos. O

colutório teste foi efetivo em reduzir todos os determinantes do mau odor

bucal analisados. Destacam os autores que o efeito mascarador se mostrou

importante apenas nos primeiros 30 minutos. Os resultados em 60 e 180

minutos foram atribuídos ao efeito antibacteriano do colutório.

O controle da halitose, gengivite e formação do biofilme dental foi

avaliado por um período de 6 semanas por Kozlovsky et al (1996), utilizando

um colutório contendo cloreto de cetilpiridínio e óleo (Assuta®, 2 phase

oil:water mouthrinse, Sherman Soad Industries – Israel) . O Listerine® foi

usado como controle positivo. A redução na formação de compostos

sulfurados voláteis foi medida com um monitor portátil (Model 1170, Interscan

Corp. Ca, USA). Outros parâmetros foram avaliados: teste organoléptico,

índice de biofilme dental, índice de sangramento gengival, nível de

microrganismos na saliva. Houve uma redução da halitose de 80% e 70%

para o TPM e Listerine®, respectivamente. O Listerine® contudo, mostrou-se

mais eficaz quanto a redução do índice de formação do biofilme dental.

Os efeitos antimicrobianos da Arnica montana e da própolis sobre

diversos microrganismos da cavidade bucal, incluindo Porphyromonas

gingivalis, foram avaliados por Koo et al (2000). A atividade antimicrobiana

foi determinada pela difusão em ágar. A própolis mostrou melhor resultado.

O resultado do extrato de Arnica montana sobre a bactéria P. gingivalis foi

discreto, sem uma diferença estatisticamente significante ao resultado do

controle (solução hidroalcoólica de etanol a 80%, v/v ).

48

A eficácia na redução de compostos sulfurados voláteis de 4 colutórios

foi avaliada em um estudo clínico por Rösing, Jonski e RØlla (2002) utilizando

cromatografia gasosa. Um dos colutórios utilizados foi descrito como

contendo produtos derivados de ervar, contudo não especificadas. Os

resultados mostraram que o colutório contendo acetato de zinco (0,1%)

mostrou o melhor resultado. O colutório contendo ervas, juntamente com

colutórios contendo triclosan, flúor e bicarbonato de sódio apresentaram um

baixo nível de redução na formação de compostos sulfurados voláteis sem

diferença estatisticamente significante entre eles.

Borden et al (2002) verificaram a redução do odor bucal através de

teste organoléptico e medida de compostos sulfurados voláteis com um

monitor de gases (Halimeter®) num grupo de 99 sujeitos em um estudo de 4

semanas. Foi realizado um estudo aleatório, duplo-cego e longitudinal onde

foram avaliados 3 diferentes colutórios: óleos essenciais (Listerine® ), cloreto

de cetilpiridínio e outro contendo a associação de dióxido de cloro e zinco.

Um placebo também foi utilizado. Os resultados domonstraram que as 4

substâncias reduziram o mau odor bucal por um período de 4 horas após o

uso, sendo a maior redução produzida pelo uso do cloreto de cetilpitidínio e a

menor pelo placebo. O cloreto de cetilpiridínio mostrou o melhor resultado

também nos períodos de 2 e 4 semanas.

O óleo de Melaleuca alternifolia, uma árvore Australiana, foi testado

in vitro quanto a sua ação sobre bactérias orais por Hammer et al (2003).

161 amostras de bactérias incluindo Fusobacterium ssp. e Prevotella

intermedia foram utilizadas. Foram utilizados os métodos de microdiluição e

macrodiluição em caldo. Dado o grande número de gêneros e espécies

49

utilizados uma grande variação foi encontrada nos resultados. Para as

diferentes espécies de estreptococos a concentração inibitória mínima (CIM)

variou de 0,12% a 2%. Alguns das bactérias de outros gêneros foram

consideradas mais susceptíveis ao óleo estudado, com bactérias do gênero

Prevotella e Veillonella apresentando CIM para concentrações de 0,016%.

O efeito antimicrobiano de um colutório contendo óleos essenciais em

associação com zinco (0,09%) foi testado por Fine et al (2005). Foram

usadas amostras de biofilme dental supragengival e do dorso da língua. As

amostras foram cultivadas de forma que se pode mensurar a redução de

bactérias anaeróbias e também foi utilizado meio de cultura específico para

bactérias produtoras de compostos sulfurados voláteis (CSV). O estudo

contou com 17 sujeitos e foi usado um modelo aleatório, duplo cego e

cruzado. As avaliações foram feitas 12 horas após a realização de um único

bochecho com o colutório, e 12 horas após um período de 14 dias de uso

diário do colutório. As médias de reduções encontradas no número de

bactérias variaram de 56,3% a 95,3% para o biofilme dental e 61,1% a 96,1%

para o biofilme lingual. O uso do colutório teste mostrou um efeito positivo na

redução do número de anaeróbios e bactérias produtoras de CSV.

2. 4. POLIFENÓIS.

Os Polifenóis representam o grupo mais comum de substâncias

encontradas nos vegetais. São descritos como metabólitos secundários sem

uma função específica para o metabolismo intracelular. Nos vegetais, estas

substâncias assumem importante função de proteção seja por sua ação

50

antimicrobiana ou na proteção da integridade da planta ao conferir um sabor

desagradável, e evitando a ingestão da mesma por espécies animais

(BENNICK, 2002).

O grupo de antioxidantes mais abundantes na dieta humana é

constituído pelos polifenóis. Seus efeitos enquanto antioxidantes, absorção

biodisponibilidade, riscos e segurança incluindo a interação com

medicamentos são estudados por diversas áreas incluindo a Nutrição

(KROON et al, 2004; MENNEN et al, 2005; SCALBERT, JOHNSON e

SCALMARSH, 2005). No escopo deste trabalho, destaca-se a ação

antimicrobiana dos polifenóis.

Estima-se que o número de metabólitos secundários nos vegetais

ultrapasse 100.000 e são 3 os principais grupos conhecidos: terpenos, fenóis

e alcalóides. Todavia, a definição destes grupos não é muito rígida uma vez

que, entre outras reações, alguns precursores da biossíntese de fenóis

podem originar alcalóides. Os fenóis possuem pelo menos um grupo hidroxila

ou derivado funcional ligado a um sistema de anel aromático e podem ser

identificados como diversas substâncias: arbutina, hidroquinona, ácido gálico,

ácido cinâmico, cumarina, lignina, flavonas e antocianidinas (CARVALHO,

2004).

Segundo Haslam (1995) tanino é o nome genérico usado para

descrever um grupo de fenóis poliméricos capazes de curtir o couro ou

precipitar gelatina em suspensão, uma propriedade conhecida como

adstringência. Podem ser encontrados com a variação de peso molecular

entre 500 e 3000. Como outros polifenóis, apresentam uma variedade de

propriedades, tais como: ação bactericida, moluscocida, antihelmíntica e

51

capacidade de inibição viral. A ação dos taninos se dá por mecanismos

diversos e inclui: a ligação com íons metálicos, atividade antioxidante, a

capacidade de ligação com outras moléculas incluindo macromoléculas do

tipo proteínas e polissacarídeos.

Os mecanismos de ação dos taninos sobre os microrganismos são

estudados há décadas. Esta ação é estudada a partir de estudos in vitro que

avaliam o crescimento de micelos de fungos filamentosos, contagem de

colônias bacterianas em placas e testes de difusão em disco. Parâmetros

bioquímicos do metabolismo de certos microrganismos são utilizados nestes

estudos a exemplo da degradação da celulose, produção de metano ou

etanol e síntese de glucano, esta última usada na avaliação da ação sobre

Streptococcus mutans ( SCALBERT, 1991).

Cowan (1999) realizou uma extensa revisão sobre as propriedades

antimicrobianas dos constituintes de plantas medicinais.. Os elagitaninos

aparecem como o grupo com o maior número de possíveis mecanismos de

ação: A – ligação com proteínas (ligação com adesinas, inibição enzimática,

inibição do substrato, formação de complexos com a parede celular, ruptura

de membrana, ligação com íons metálicos) e B – Interação com o DNA (ação

antiviral). A seguir podemos ver um quadro que destaca algumas plantas e

a atividade dos polifenóis.

Kahanbabaee e Ree (2001) chamam a atenção para o fato de que

classificação dos taninos em hidrolisáveis e condensados está bem

estabelecida na literatura e é frequentemente utilizada. Todavia, entre os

hidrolisáveis inclui-se os galotaninos e elagitaninos. Segundo os autores,

sabe-se que alguns elagitaninos não são hidrolisáveis e por isso propuseram

52

a classificação dos taninos em 4 grupos : galotaninos, elagitaninos, taninos

complexos e taninos condensados.

NOME CIENTÍFICO NOME POPULAR ATIVIDADE

Rhamnus purshiana Cáscara sagrada Vírus, bactérias fungos

Eucalyptus globulus Eucalipto Bactéria, vírus

Melissa officinalis Limão Vírus

Onobrychis viciifolia Bactérias de ruminantes

Artemísia dracumculus Artemísia Vírus

Thymus vulgaris Tomilho Vírus, bactérias e fungos

Quadro 1. Atividade antimicrobiana de taninos extraídos de algumas plantas.Fonte: Adaptado de Cowan, 1999.

Kahanbabaee e Ree (2001) chamam a atenção para o fato de que

classificação dos taninos em hidrolisáveis e condensados está bem

estabelecida na literatura e é frequentemente utilizada. Todavia, entre os

hidrolisáveis inclui-se os galotaninos e elagitaninos. Segundo os autores,

sabe-se que alguns elagitaninos não são hidrolisáveis e por isso propuseram

a classificação dos taninos em 4 grupos : galotaninos, elagitaninos, taninos

complexos e taninos condensados.

Os taninos podem se ligar a proteínas salivares, em especial histatinas

e proteínas ricas em prolina. Acredita-se ser este um mecanismo de defesa

53

direcionado a reduzir a absorção de taninos, considerando-se a sua potencial

toxicidade sobre humanos e animais (YAN e BENNICK, 1995; LU e

BENNICK, 1998).

Joiner et al (2004) estudaram as características da adsorção de

polifenóis sobre películas de proteínas salivares formadas sobre discos de

hidroxiapatita. Utilizando elipsometria, observou-se que os polifenóis

determinam uma alteração nas características da película protéica e leva a

modificação no mecanismo de interação desta película com novas camadas

de proteínas. Este mecanismo explica a formação de manchas sobre a

superfície dentária quando da presença de polifenóis.

54

3. PROPOSIÇÃO.

É proposição deste trabalho avaliar in vitro a atividade dos extratos de

Caesalpinia ferrea Mart. (Jucá), Cinnamomun cássia B. (Canela), Malva

sylvestris L. (Malva), Punica granatum L (Romã), Rosmarinus officinalis L.

(Alecrim), Aeolanthus suaveolens (Als.) Spreng. (Macassá), Sysygium

aromaticum L (Cravo) e Tamarindus indica L. (Tamarindo) sobre

microrganismos da cavidade bucal produtores de compostos sulfurados

voláteis (CSV) utilizando-se diferentes testes de sensibilidade microbiana.

55

4. MATERIAIS E MÉTODOS.

Trata-se de um estudo experimental realizado em 2 etapas sendo a 1ª

etapa do estudo sobre a atividade antimicrobiana in vitro e a 2ª em um

modelo ex vivo com sedimento salivar.

4.1. PREPARAÇÃO DO EXTRATO DAS PLANTAS.

Extratos de Cinnamomun cassia B (Canela ), Malva sylvestris L

(Malva), Punica granatum L (Romã), Rosmarinus officinalis L (Alecrim),

Aeolanthus suaveolens (Als.)Spreng.L (Macassa , Sysygium aromaticum L

(Cravo) e Tamarindus indica L (Tamarindo) foram preparados no

departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de

Pernambuco em Recife (PE) após a devida identificação botânica no

Laboratório de Toxicologia da mesma instituição.

O Extrato de Caesalpinia ferrea Mart. (Jucá), foi preparado na

Universidade Federal do Amazonas, Manaus, Amazonas. O preparo do

extrato foi realizado utilizando-se a mesma metodologia utilizada para os

demais extratos.

4. 1 .1. EXTRAÇÃO DOS MARCADORES QUÍMICOS.

Após lavagem e secagem em estufa a 33° C por uma semana para

eliminação de umidade e estabilização do conteúdo enzimático o material foi

56

triturado a pó em moinho elétrico seguindo-se a extração dos princípios

ativos.

Foi empregado o método de lixiviação ou percolação em fluxo

contínuo à temperatura ambiente. Neste processo existe a renovação

constante da solução extratora durante um período de 24 horas. Decorrido

este tempo ocorre então a total extração dos marcadores ou princípios ativos.

Para o processo são utilizados 8 litros de solução hidroalcoólica para cada

quilo de matéria prima pulverizada, visando o completo esgotamento da

extração. Recuperou-se aproximadamente 6.600 ml de cada extrato que

após filtração para retirada de impurezas, foram acondicionados em fracos

âmbar e estocados em câmara fria.

Especificamente no caso do Tamarindo (Tamarindus indica L. ) o

processo de extração se deu por maceração fracionada devido ao teor de

açúcar e pectina, evitando-se assim a produção de um extrato

excessivamente turvo. Na primeira maceração a parte da fruta utilizada foi

lavada e cortada em pequenos pedaços, colocada em um balão de fundo

chato e recoberta pela solução extrativa (solução hidroalcoólica a 80%). Após

uma semana realizou-se uma filtração com a obtenção do primeiro filtrado

chamado de extrato A, que foi acondicionado em refrigeração. O material

colhido pelo aparato filtrante foi recolocado em um balão de fundo chato e

recoberto com uma nova solução extrativa, na mesma concentração. Após

uma semana realizou-se filtração para obtenção do extrato B, que foi

acondicionado em refrigeração. Repetiu-se o processo para obtenção do

extrato C, após o qual se deu o completo esgotamento do marco. Na etapa

57

final os extratos A, B e C foram misturados e concentrados em

rotavaporização.

4.1. 2. CONCENTRAÇÃO DA SOLUÇÃO EXTRATIVA.

Após a extração dos marcadores químicos foi realizada a

concentração em nível de extrato fluido 1:1 ( p/v). Este processo foi realizado

em aparelho rota-vapor (Modelo Ika – Werk) a uma temperatura constante de

40°C.

O quadro 2 mostra o detalhamento da parte da planta utilizada,

substância extratora e concentração final do extrato obtido.

PLANTA NOME CIENTÍFICO

PARTE UTILIZADA

SUBSTÂNCIA EXTRATORA

CONCENTRAÇÃO FINAL

ALECRIN Rosmarinus officinalis L.

Folha Etanol 70% 1000 mg/ml

CANELA Cinnamomum cassia Breyn.

Casca Etanol 70% 321 mg/ml

CRAVO Syzygium aromaticum

L.

Pedúnculo floral

Etanol 70% 396 mg/ml

JUCÁ Caesalpinia ferrea Mart

Vargem completa

Metanol 80% 500 mg/ml

MALVA Malva sylvestris L.

Folha Etanol 80% 1000 m g/ml

MACASSÁ Aeolanthus suaveolens

(Als.)Spreng.

Folha, caule e sumidade

florais

Etanol 80% 125 mg/ml

TAMARINDO Tamarindus indica L.

Fruto sem semente

Etanol 70% 411 mg/ml

ROMÃ Punica granatum L.

Casca do fruto

Etanol 80% 540 mg/ml

Quadro 2. Descrição do material fitoterápico utilizado: nome popular, nome científico, parte utilizada, substância extratora e concentração final do extrato obtido.

58

4.2. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA.

Os ensaios antimicrobianos foram realizados no Laboratório de

Anaeróbios, Disciplina de Endodontia da FOP- Unicamp, Piracicaba, SP.

Foi testada a atividade antimicrobiana dos extratos sobre cepas

selvagens previamente cultivadas. Foram utilizadas cepas de: Fusobacterium

nucleatum, Peptostreptococcus micros, Porphyromonas gingivalis e

Prevotella intermedia. Como controle positivo foi utilizado o gluconato de

clorexidina 2% (líquido).

4.2.1. TESTE DA DIFUSÃO EM AGAR.

Foi utilizado o método de difusão em meio sólido. 100 µL de meio

FAB (Fastidious Anaerobe Broth - LAB M - Lancashire – UK) contendo

inóculo correspondente ao padrão 1 da escala de McFarland ajustado por

espectrofotômetro (Mod. 432, FEMTO, Brasil- comprimento de onda de 800

nm) foram semeados em placas contendo FAA (Fastidious Anaerobe Agar -

LAB M - Lancashire – UK) enriquecido com sangue de carneiro ( Newprov,

Brasil). A escolha do padrão 1 de McFarland para o inoculo está de acordo

com as características de crescimento das bactérias estudadas. Cilindros

de aço (8,0 X 10,0 mm - com diâmetro interno de 6,0 mm ) foram

colocados sobre os meios FAA previamente semeados. Utilizados nas

59

concentrações mostradas no quadro 2, 50 µL dos extratos testados e o

antimicrobiano (gluconato de clorexidia 2%) foram colocados no interior dos

cilindros. As placas foram então incubadas em câmara de anaerobiose (Don

Whitley Scientific, Bradford, UK ) numa atmosfera contendo 5-10% H2, 10 %

de CO2 e 80-85% de N2 por 72 horas.

Zonas de inibição foram medidas após o período de incubação. Foi

considerada como zona de inibição a menor distância (mm) medida da

margem externa do cilindro até o ponto inicial do crescimento microbiano.

Foram feitas triplicatas para cada substância testada sobre os diferentes

microrganismos.

Após o período de incubação e leitura das zonas de inibição foram

retirados os cilindros e feitas coletas de material sobre o meio sólido que

esteve em contato direto com a substância testada. Este material foi

semeado em placas com FAA e incubado nas mesmas condições

anteriormente descritas. Após o período de incubação foi feita a leitura para

verificar a inibição por contato direto, representada pela ausência de

crescimento bacteriano.

4.2.2. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA

(CIM) E EM MEIO LÍQUIDO.

A concentração inibitória mínima (CIM) foi estabelecida em meio

líquido usando-se o método da microdiluição. Diluições das substâncias

testadas foram preparadas de forma que para os extratos foram utilizadas

concentrações entre 50 e 400 µg/mL, com um total de 20 diferentes

60

concentrações. Para a clorexidina foram utilizadas concentrações entre

0,0115 e 5,9 µg/mL, com um total de 10 diferentes concentrações. Os

inóculos foram preparados e ajustados por espectrofotômetro (800 nm)

correspondendo ao padrão 1 da escala de McFarland.

Foram dispensados na microplaca controles contendo: apenas o meio

líquido (FAB); o meio líquido (FAB) mais o extrato; e o meio líquido (FAB)

mais o inoculo.

Após incubação em câmara de anaerobiose por 72 horas foi realizada

a leitura utilizando-se coloração com resazurina (Sigma, USA) na

concentração de 0,02%. Foram adicionados 30µL da solução de resazurina

em cada poço da microplaca contendo o inóculo e a substância testada,

como também nos poços contendo os controles. Foi interpretada como CIM a

menor concentração correspondente ao poço teste que manteve a coloração

azul da resazurina. A alteração da coloração para a cor rosa –violácea ou

rosa indicou a redução da resazurina implicando na presença de

crescimento bacteriano. A leitura foi realizada após 20 minutos da aplicação

do corante.

As diferentes concentrações foram distribuídas nas microplacas em

duplicata de forma que após a leitura da CIM, uma alíquota de 20µL foi

retirada e semeada em placas com meio FAA. A alíquota foi retirada do poço

correspondente a leitura da CIM, e mais três poços consecutivos com

concentração maior dos extratos. Após a incubação foi feita a leitura quanto

à presença ou não do crescimento bacteriano.

61

Esquema 1. Esquema ilustrativo dos procedimentos para a CIM por microdiluição.

Cultura em placa Meio líquido

Extrato Clorexidina

Preparo da placa.

62

Grau 1 deMcFarlandESPECTROFOTÔMETRO

De acordo com a concentração do extrato é preparada a solução mãe (SM) para ser colocada na microplaca. Também é preparada a clorexidina.

FAB

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

Preparada a SM esta é distribuída de forma que se obtenha as diferentes concentrações que variaram de 400µg/mL até 50µg/mL, ocupando os poços A 1 a 12 e B 1 a 8. Linhas C e D representam a duplicata. Na linha F é colocada a clorexidina. Nos mesmos poços são acrescentados o inóculo e o meio FAB. Controles colocados na linha H.

PLACAS SÃO INCUBADAS EM ANAEROBIOSE

Resazurina 0,02%

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

Leitura da placa após 20min da aplicação da resazurina. Último poço azul (esquerda para direita) representa CIM. Poço com cor rosa-violáceo ou rosa indica atividade bacteriana com redução do corante. Linha H controles. Linhas C e D usada para repique em meio sólido.

4.3. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE POLIFENÓIS DOS

EXTRATOS.

A quantificação de polifenóis totais dos extratos foi realizada pelo

método Azul da Prússia segundo modificação proposta por Graham (1992).

Uma Solução Blank foi preparada com 3 mL de água deionizada

adicionando-se 100 µL do mesmo solvente utilizado para o preparo do

extrato. Após agitação se acrescentou 1 mL da Solução de Ferrocianido de

Potássio (Solução 2) e 1 mL de Cloreto Férrico (Solução 1). Após 15 minutos

se acrescentou 5mL da solução estabilizadora (30 mL de água destilada, 10

mL de H3PO4 e 10mL de goma arábica a 1%). Subseqüente a preparação da

Solução Blank, preparou-se uma Solução Padrão com 3 mL de ádua

deionizada adicionando-se 100µL de solução de ácido gálico a 0,01M

seguindo-se os demais procedimentos para a preparação da solução Blank.

Em seguida, as amostras foram preparadas, utilizando-se 3 mL de água

deionizada acrescidos de 100µL do extrato teste em diluição apropriada,

seguindo com a seqüência de adição dos reagentes usados na preparação

das soluções Blank e Padão.

Após a preparação as soluções Blank, padrão e amostras foram

levadas para leitura em Espectrofotômetro (Beckman – DU640, USA) em luz

visível, em comprimento de onda de 700nm.

63

4.4. DETERMINAÇÃO DA CAPACIDADE INIBITÓRIA DOS

EXTRATOS SOBRE A FORMAÇÃO DE COMPOSTOS SULFURADOS

VOLÁTEIS (CSV) E OUTROS ODORES.

A concentração de CSV foi medida em tubos contendo cultura total de

saliva incubada após a exposição aos dois extratos que apresentaram a

maior concentração de polifenóis. Cada extrato foi usado separadamente.

Cultura total de saliva não exposta a nenhum dos extratos foi utilizada como

controle. O gluconato de clorexidina a 0,12% (Periogard ®) foi usado como

controle positivo. A concentração de 0,12% é a concentração usual presente

nos enxaguantes bucais. O estudo foi desenvolvido com amostras em

duplicata.

4.4.1. PREPARAÇÃO DOS SEDIMENTOS.

O método descrito por Kleinberg e Codipilly (1999) foi utilizado

para a preparação do sistema de sedimento salivar: saliva total foi coletada

de dois indivíduos que se mantiveram sem realização de higiene bucal por 24

horas e com período de jejum de 12 horas antecedendo a coleta. A saliva foi

coletada em tubos de ensaio tipo Falcon (15 mL), pelo método estimulado,

utilizando-se hiperbolóide.

Após coleta, as amostras de saliva foram centrifugadas em 3500 rpm

(centrífuga QUIMIS) por 15 minutos. O sobrenadante foi removido e estocado

em freezer a 4 C. Um volume de 41,75 µl de sedimento foi colocado em 10

tubos Falcon. O sedimento presente em cada tubo foi lavado com um volume

64

de 1 mL de água de deionizada por 3 vezes por 30 segundos. Cada ciclo de

lavagem foi realizado acrescentando-se 1ml de água deionizada ao

sedimento presente em cada tubo, que foi agitado e após 30 segundos foi

feita a centrifugação por 1 minuto. O excesso de água foi retirado,

permanecendo o sedimento em cada tubo.

Foram testadas 3 diferentes concentrações dos extratos,

correspondendo a diluições 1:1, 1:2, e 1:4. As amostras-teste foram exposta

(por 30 segundos) a 1 mL do extrato seguindo-se centrifugação por mais 1

minuto. Após exposição foi realizada outra sessão de lavagem por mais 30

segundos. Os tubos contendo o controle positivo foi exposto a 1ml da

solução de clorexidina a 0,12% e os tubos contendo o controle foram

expostos a água deionizada, por 1 minuto. Em seguida, para simular o

cllearence pela saliva, todas as amostras de sedimento foram centrifugadas,

lavadas com 1ml de água deionizada e mais uma vez centrifugadas,

retirando-se a água de forma que cada tubo permaneceu com o sedimento.

Em cada um dos tubos Falcon contendo o sedimento, foi preparado o

SSS sendo formado por 250 µl de sedimento salivar a 16,7% (v/v) , 250µl de

sobrenadante a 33,3% (v/v) e 250 ul de L-cisteína (6 mM). As amostras

controle e teste foram incubadas por 24 horas a 37 C. As leituras

organolépticas e por Halimeter® foram realizadas nos seguintes momentos:

após 1 , 2, 4 e 24 horas de incubação.

65

Fotografia 1. Saliva distribuída em tubos antes da centrifugação.

Fotografia 2. Saliva distribuída em tubos após a centrifugação. Detalhe a esquerda.

66

4.4.2. COLETA DOS DADOS

Foi realizado teste organoléptico para verificação de mau odor,

utilizando-se uma escala de 0 a 4, com o método da verificação ao bastão de

vidro esterilizados , onde 0 representa a ausência de odor e 4 o odor mais

intenso. Imediatamente após a abertura de cada tubo, um bastão de vidro

com 0,5 cm de diâmetro e 30 cm de comprimento foi introduzido no tubo

Falcon contendo a cultura salivar tendo sua extremidade mergulhada no sis

tema de sedimento e realizando-se movimentos circulares de forma a fazer a

agitação do conteúdo do tubo. Em seguida o bastão foi posicionado

horizontalmente a 10 cm das narinas do examinador, sendo estabelecido o

valor correspondente da escala de acordo com a intensidade do odor.

Para a medição da concentração dos CSV foi utilizado o aparelho

Halimeter (Interscan Corporation), um monitor de CSV. Para tal foi adaptada

uma tampa para o tubo Falcon, contendo duas perfurações. Em uma das

perfurações foi instalado o canudo que foi acoplado ao Halimeter®, que no

momento da medida foi ajustado de forma que a extremidade fosse

posicionada a uma distância de 5 mm da superfície do sedimento salivar. Na

outra perfuração foi acoplado um segmento de canudo plástico com o mesmo

diâmetro do que foi acoplado ao Halimeter®, de forma a permitir a entrada de

ar, compensando o volume de ar retirado pelo aparelho. Essas medidas

foram realizadas imediatamente após a medida organoléptica do conteúdo de

cada tubo.

67

Medidas de pH foram realizadas com eletrodo (Orion, USA) acoplado a

um potenciômetro 710A (Orion, USA). Calibrações foram realizadas com

padrões de pH 4 e 7 e slope de 95%. As leituras foram realizadas após a

última leitura de CSV.

Fotografia 3. Tubos Falcon. A esquerda tubo para incubação. Adireita tubo com tampa e canudosacoplados para medida com Hali-meter®. Detalhe acima.

68

Fografia 4. Halimeter® ( Interscan Co. USA).

4.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA.

Os dados obtidos nas diferentes etapas deste estudo foram tabulados em programa Excel (versão x) e SPSS (versão 11.0). Nestes programas foram calculados médias, desvios padrão e valores em percentual quando apropriado. Os resultados são apresentados em tabelas simples e quadros.

69

5. RESULTADOS.

5.1. ATIVIDADE ANTIMICROBIANA.

A tabela 1 mostra o resultado do teste de difusão em agar dos

diferentes extratos testados. Na mesma tabela pode-se verificar a presença

ou ausência de crescimento bacteriano do material retirado da área de

contato direto com a substância testada.

Tabela 1. Média da zona de inibição (mm) e ação por contato direto de extratos hidroalcoólicos e clorexidina sobre microrganismos da cavidade bucal.

MICRORGANISMO

EXTRATO / DROGA

Peptostreptococcus micros

Fusobacterium nucleatum

Porphyromonas gingivalis

Prevotellaintermedia

ALECRIM 1,6 ( - ) * ( - ) 3 ( - ) * ( - )CANELA * ( - ) * ( - ) * ( + ) * ( - )CRAVO 3 ( - ) * ( + ) * ( + ) * ( - )

MACASSÁ * ( - ) * ( + ) * ( - ) * ( - )MALVA * ( + ) * ( + ) * ( + ) * ( + )

JUCÁ 6,3 ( - ) * ( + ) * ( + ) * ( - )ROMÃ 10,3 ( - ) 5 ( + ) 3 ( - ) 3,6 ( - )

TAMARINDO 2,6 ( - ) 2 ( + ) * ( - ) * ( - )

70

CLOREX. LIQ. 2%

9,3 ( - ) 8,6 ( - ) 8 ( - ) 9,6 ( -)

* Sem inibição. (-) Ausência de crescimento bacteriano após inoculação em meio sólido, de material retirado da área de contato direto do extrato/droga com microrganismo. (+) Presença de crescimento bacteriano após inoculação em meio sólido, de material retirado da área de contato direto do extrato/droga com microrganismo.

A maior média de inibição observada entre os extratos foi a da romã

sobre o Peptostreptococcus micros. A romã foi o único extrato que produziu

zona de inibição sobre todos os microrganismos testados, inclusive com

média superior a da clorexidina para o Peptostreptococcus micros. O extrato

de jucá mostrou um halo de inibição significativa sobre o Peptostreptococcus

micros, contudo, este extrato não mostrou zona de inibição sobre os demais

microrganismos testados Os extratos de canela, macassá e malva não

produziram zona de inibição sobre nenhum dos microrganismos testados. O

extrato de cravo produziu zona de inibição apenas sobre o

Peptostreptococcus micros. O alecrim por sua vez, mostrou zona de inibição

sobre Peptostrptococcus micros e Porphyromonas gingivalis. A clorexidina

mostrou zona de inibição sobre todos os microrganismos testados.

71

1

2

3

4

Fotografia 5. MIC por difusão em agar de extratos fitoterápicos sobre Fusobacterium nucleatum. 1: Malva ; 2: Jucá; 3: Macassá; 4: Tamarindo; Central: Romã.

Na tabela 1 vemos ainda que o Peptostreptococcus micros colhido da

zona de contato direto com os extratos de alecrim, canela, cravo, macassá,

jucá , romã e tamarindo, não apresentou crescimento quando semeado em

meio sólido (FAA). O extrato de malva ,por sua vez , não impediu o

crescimento desta bactéria quando retirada da área de contato direto e

semeada em meio sólido. A bactéria Fusobacterium nucleatum não

apresentou crescimento quando retirada da área de contato direto com os

extratos de alecrim e canela. Todavia, mostrou crescimento quando

semeada a partir das áreas de contato direto com os extratos de cravo,

macassá, malva, jucá, romã e tamarindo.

Na fotografia 2 podemos observar a formação de halos de inibição no

teste de difusão em agar. Pode ser visto o resultado dos extratos de malva,

jucá macassá tamarindo e romã numa placa com crescimento do

Fusobacterium nucleatum.

Os resultados do teste de CIM por microdiluição podem ser vistos na

tabela 2 mostrada a seguir. Cada valor expresso em µg/mL mostra a

concentração inibitória mínima dos diversos extratos sobre os

microrganismos utilizados, identificado pela coloração com a resazurina. Os

resultados da clorexidina também podem ser vizsualizados.

Todos os extratos estudados mostraram valores de CIM presentes nas

concentrações utilizadas, sobre no mínimo dois dos microrganismos

72

estudados. Contudo, nenhum dos extratos apresentou CIM sobre todos os

quatro microrganismos testados.

O extrato da romã foi o único extrato a não apresentar valor da CIM

sobre o Peptostreptococcus micros. Contudo, foi o único extrato a apresentar

valor de CIM (160µg/mL) sobre a Prevotella intermedia para as

concentrações estudadas.

Do ponto de vista da sensibilidade dos microrganismos frente aos

extratos testados, o Peptostreptococcus micros foi o microrganismo a

apresentar o maior número de valores de CIM na concentração abaixo de

50 µg/mL para os diversos estratos utilizados. Por outro lado, a Prevotella

intermedia apresentou o maior número de valores > 400 µg/mL para a CIM

frente aos extratos estudados.

Tabela 2. Valores da Concentração Inibitória Mínima * por microdiluição de extratos hidroalcoólicos sobre microganismos da cavidade bucal.

MICRORGANISMO

EXTRATO / DROGA

Peptostreptococcus micros

Fusobacterium nucleatum

Porphyromonas gingivalis

Prevotella intermedia

ALECRIM ≤ 50 > 400 190 > 400

CANELA ≤ 50 > 400 190 > 400

CRAVO ≤ 50 ≥ 400 ≥ 400 > 400

MACASSÁ ≤ 50 > 400 ≤ 50 > 400

MALVA ≥ 400 > 400 ≤ 50 > 400

JUCÁ ≤ 50 ≥ 400 120 > 400

ROMÃ > 400 ≥ 400 170 160

TAMARINDO 190 > 400 250 > 400

CLOREX LIQ. 2%

0,1844 0,3688 0,3688 0,1844

* Valores da CIM expressos em µg/mL.

73

Fotografia 6 . Detalhe de microplaca. MIC do Tamarindo sobre P. Gingivalis.

74

Tabela 3. Crescimento de microrganismos em meio sólido após a determinação da Concentração Inibitória Mínima por microdiluição.

MICRORGANISMO

Extrato/Droga Peptostreptococcus micros

CIM

Fusobacterium nucleatum

CIM

Porphyromonas gingivalis

CIM

Prevotella intermedia

CIMAlecrim 80 60 70 ≤ 50 >400 100 90 80 70 >400

- - - - - - - -Canela 80 70 60 ≤ 50 >400 300 250 200 190 >400

+ + + + - - - -Cravo 80 70 60 ≤ 50 > 400 ≥400 >400

+ + + + -Macassá 80 70 60 ≤ 50 >400 80 70 60 ≤50 >400

- - - - - - - -Malva ≥400 >400 80 70 60 ≤50 >400

- - - - -Jucá 80 70 60 ≤ 50 ≥400 150 140 130 120 >400

+ + + + - - - - +Romã >400 ≥400 200 190 180 170 190 180 170 160

+ + + + + + + + +Tamarindo 300 250 200 190 >400 400 350 300 250 >400

+ + + + + + + +Clorexidina 1,475 0,7375 0,3688 0,1844 2,95 1,475 0,7375 0,3688 2,95 1,475 0,7375 0,3688 1,475 0,7375 0,3688 0,1844

- - - - - - - - - - - - - - - - CIM ( Concentração inibitória mínima- µg/mL); ( + ) Crescimento bacteriano; ( - ) Ausência de crescimento bacteriano.

A tabela 3 apresentada na página anterior, mostra o resultado da

presença ou ausência de crescimento bacteriano sob a ação dos diversos

extratos, das alíquotas retiradas dos poços correspondentes aos valores da

CIM e de mais três poços consecutivos representando concentrações mais

elevadas.

O Peptostreptococcus micros apresentou crescimento em meio sólido

após exposição aos extratos de canela, cravo, jucá e tamarindo para os valores

da CIM e concentrações mais elevadas. Quando exposto aos extratos de

alecrim e malva, este microrganismo não apresentou crescimento em meio

sólido para as concentrações da CIM. Especificamente no caso do extrato de

alecrim tambémm não houve crescimento bacteriano para concentrações acima

da CIM.

Podemos observar que quanto ao Fusobacterium nucleatum não houve

crescimento bacteriano após o repique em meio sólido quando da exposição ao

extrato de jucá. O repique realizado quando este microrganismo foi exposto ao

estrato da romã apresentou crescimento. Para os demais extratos a CIM

apresentou valor >400 µg/mL e portanto não foi realizado o repique em meio

sólido.

O microrganismo Porphyromonas gingivalis não apresentou crescimento

em meio sólido para os valores da CIM ou concentrações mais elevadas

quando exposto aos extratos de alecrim, canela, cravo, macassá ou malva.

Contudo, apresentou crescimento para a CIM e valores mais elevados, quando

exposto aos extratos de romã e tamarindo. Quanto à exposição ao extrato de

jucá, este microrganismo apresentou crescimento quando repicado após a

exposição ao valor da CIM, contudo, não mostrou crescimento para

concentrações mais elevadas do extrato.

O microrganismo Prevotella intermedia foi semeado em meio sólido

somente após a exposição ao extrato de romã mostrando crescimento para o

valor da CIM e valores mais elevados. Quando exposto aos demais extratos

apresentou valores da CIM >400 µg/mL , não sendo realizado o repique em

meio sólido.

Para todos os microrganismos estudados não foi observado crescimento

bacteriano quando da exposição à clorexidina, tanto para a CIM quanto para as

concentrações mais elevadas.

5.2. CONCENTRAÇÃO DE POLIFENÓIS DOS EXTRATOS.

Fotografia 7. Foto ilustrativa de soluções preparadas para a quantificação de polifenóis. Da esquerda para a direita: Blank, Padrão, Extrato de Malva, Extrato de Romã.

77

Tabela 4. Concentração de polifenóis de extratos hidroalcoólicos obtidas por

espectofotometria.

Planta Diluição Médiada

Leitura

Ácidido

gálico

ug/mL

Mg de fenóisem quivalentede ácido gálico

por mL deextrato

Concentraçãoda solução de

trabalho(mg/mL)

Polifenóis

do extrato

(%)

Padrão Etanol 80%

1,175 190,00

Jucá 01:32 2,5954 568,73 36,39 500 7,3

Romã 01:64 1,8382 329,73 21,10 540 3,9

Canela 01:08 1,6223 290,92 04,65 321 1,5

Malva 01:04 0,3773 67,65 0,54 1000 0,1

Macassa EP 0,5911 143,07 0,14 125 0,1

Padrão Etanol70%

1,175

Alecrin 01:04 1,3932 225,28 1,80 1000 1,3

Tamarindo 01:04 0,4404 71,21 0,56 411 0,1Comprimento de onda de 700 nm. Método azul da Prússia (GRAHAM, 1992).

A tabela 4 mostra a concentração de polifenóis dos extratos utilizados

neste trabalho. O extrato de jucá apresentou a maior concentração seguindo

do estrato de romã.

5.3. AÇÃO DOS EXTRATOS DE JUCÁ E ROMÃ NA FORMAÇÃO DE

COMPOSTOS SULFURADOS VOLÁTÉIS E OUTORS ODORES.

As tabelas apresentadas a seguir mostram os resultados da ação dos

extratos de jucá e romã na formação de CVS e outros odores utilizando-se o

sintema de sedimento salivar, tomando-se as medidas organolépticas e com o

Halimeter®. São apresentadas também as tabelas com o resultado das

78

medidas de pH realizadas ao final do período de incubação e leituras de

concentração dos odores presentes no sistema de sedimento salivar.

Tabela 5. Efeito do extrato de Jucá na formação de compostos sulfurados voláteis e outros odores utilizando-se o sistema de sedimento salivar.

D1ORG HAL

D2ORG HAL

D3ORG HAL

CONT. POSITIVOORG HAL

CONTROLEORG HAL

1h 0 30 0 30 0 33 0 48 1 9002h 0 37 0 34 0 37 0 50 2 9114h 0 38 0 39 0 46 0 50 3 1250 24h 0 27 0 40 0 70 0 33 4 1500 ORG : Teste organoléptico; HAL: Leitura com Halimeter®

Tabela 6. Leitura de pH do sistema de sedimento salivar sob ação do extrato de Jucá após 24 h de incubação.

AMOSTRAS pH D1 – A 6.003

D1 - B 6.005

D2 - A 4.621

D2 - B 4.791

D3 – A 3.047

D3 – B 4.420

CONT. POSIT. - A 7.321

CONT. POSIT. – B 6.800

CONTROLE – A 6.197

CONTROLE - B 6.029

Tabela 7. Efeito do extrato de Romã na formação de compostos sulfurados voláteis e outros odores utilizando-se o sistema de sedimento salivar.

D1ORG HAL

D2ORG HAL

D3ORG HAL

CONT. POSITIVOORG HAL

CONTROLEORG HAL

1h 0 30 1 1200 1 1200 0 40 1 1500

2h 0 30 2 800 2 1000 0 42 2 1320

4h 0 43 1 950 1 1000 0 50 3 1400

24h 0 35 2 560 3 1400 0 33 4 1500

ORG : Teste organoléptico; HAL: Leitura com Halimeter®

79

Tabela 8 .Leitura de pH do sistema de sedimento salivar sob ação do extrato de Romã após 24 h de incubação.

AMOSTRAS pHD1 – A 5.713

D1 - B 7.100

D2 - A 6.320

D2 - B 6.787

D3 – A 5.638

D3 – B 5.249

CONT. POSIT. - A 6.605

CONT. POSIT. – B 5.640

CONTROLE – A 5.906

CONTROLE - B 5.974

80

6. DISCUSSÃO.

A descoberta da participação bacteriana na formação dos odores bucais

trouxe uma grande contribuição ao estudo da halitose. Os primeiros passos

foram dados com o estabelecimento da cavidade bucal como fonte primária dos

odores do hálito na maioria das situações clínicas encontradas.

Primeiro com os estudos de cultura de saliva total e depois de culturas

com microrganismos isolados, diversas bactérias foram identificadas como

produtoras de substâncias de odor desagradável e como tal, responsáveis pela

formação do mau hálito (LAW, BERG e FOSDICK , 1943; BERG e FOSDICK,

1946; CLEGG e RAE, 1956; PERSSON, CLAESSON e CARLSSON , 1989;

KLEINBERG e CODIPILLY, 1999; KATO et al , 2005).

Neste estudo se utilizou bactérias reconhecidamente relacionadas à

formação de compostos sulfurados voláteis (CSV): Fusobacterium nucleatum,

Peptostreptococcus micros, Porphyromonas gingivalis e Prevotella intermedia.

Sabe-se que existe uma maior contribuição das bactérias Gram-negativas

(LOESCHE e KAZOR, 2000; MORITA e WANG, 2001). Embora a bactéria

Peptostreptococcus micros seja Gram-positiva, sua capacidade de produzir

CSV a partir de aminoácidos (L-glutadiona e L-cisteína) foi comprovada por

Carlsson, Larsen e Edlund (1993). Esta constatação demonstrou que várias

espécies bacterianas da cavidade bucal participam na formação de CSV e

apontou para a importância de se pesquisar a ação de antimicrobianos tanto

sobre bactérias Gram-negativas quanto Gram-positivas.

Vale ressaltar que o número total de espécies envolvidas na produção de

CSV ou outras substâncias que participam na formação da halitose é ainda

desconhecido. O trabalho de pesquisa de Persson et al (1990) demonstrou a

81

existência de bactérias bucais até então não classificadas que apresentaram a

capacidade de produzir CSV.

Uma comparação direta entre os resultados encontrados neste estudo

com os resultados de outras pesquisas não poderá ser realizado uma vez que

não conseguimos resgatar na literatura publicada e indexada, estudos que

utilizaram os mesmos extratos fitoterápicos sobre as bactérias aqui estudadas.

Ainda que estudos com as mesmas espécies vegetais e bactérias sejam

citados, devemos considerar que extratos de plantas medicinais apresentam

uma variação na quantidade de seus constituintes. Esta variação pode estar

relacionada com os tipos de métodos de extração e substâncias utilizadas

(RABE e STADEN, 1997; NOSTRO et al, 2000) com a parte da planta utilizada,

variações sazonais durante o crescimento e coleta e ainda provocados pelo

solo e ambiente (REICHLING e SALLER, 1998; ARRIGONI-BLANK et al, 2002).

Especificamente no nordeste do Brasil, Monteiro et al (2006) detectaram

variações na concentração de taninos durante as estações chuvosas e secas

em amostras de aroeira do sertão (Myracroduon urundueva) e angico

(Anadenathera colubrina).

Na Tabela 1 observa-se as variações ao teste de dIfusão quanto a

atividade dos extratos sobre as bactérias utilizadas neste estudo. Quando da

utilização de discos impregnados com agentes antimicrobianos, sabe-se que ao

contato do disco com o meio de cultura, a água é absorvida pelo disco e ocorre

a difusão do agente antimicrobiano. À medida que aumenta a distância a partir

da borda do disco, diminui a concentração do agente antimicrobiano (WINN et

al, 2006). Este conceito é extrapolado para o uso de extratos fitoterápicos

aplicados diretamente sobre o meio sólido. Todavia, não devemos excluir a

82

possibilidade de interações físico-químicas entre o meio de cultura e o extrato

que possam, por exemplo, reduzir a capacidade de difusão dos constituintes do

extrato. Alterações do pH tanto do extrato como do meio podem também

ocorrer. A influencia do pH do meio sobre a atividade antimicrobiana é um fator

considerado relevante nos testes de susceptibilidade antimicrobiana (NCCLS,

2003).

Os resultados na tabela 1 demonstram que a ausência de formação de

halo de inibição não exclui a possibilidade de atividade antimicrobiana. Isto se

considerarmos a ação por contato direto do extrato avaliada pelo cultivo de

material retirado da área sobre o meio de cultura onde foi depositado o extrato.

Por exemplo, não houve crescimento da Prevotella intermedia quando do

cultivo de amostras retiradas da área de contato dos extratos de alecrim,

canela, cravo e macassá, mesmo não havendo a formação de zona de inibição

ao teste de difusão. Por outro lado, mesmo com uma zona média de inibição

de 5 mm produzida pela romã, houve crescimento de Fusobacterium nucleatum

quando o material da área onde foi depositado o extrato sobre o meio de cultura

foi cultivado. Pode-se inferir que estas variações se devam a diferenças de

atividade bactericida ou bacteriostática dos diferentes extratos; ou diferenças

quanto a possíveis interações entre o extrato e o meio de cultura, como

anteriormente mencionadas.

Para os testes de sensibilidade antimicrobiana com substâncias

alopáticas são estabelecidos os padrões de concentração que devem ser

internacionalmente utilizados pelos laboratórios de análises clínicas (CLSI,

2005). Em nosso estudo uma faixa de concentração foi arbitrada para a

realização do teste de microdiluição em caldo.

83

O teste da microdiluição em caldo tem como vantagem a necessidade de

pequenas quantidades de reagentes podendo-se avaliar a atividade de vários

agentes sobre diversos microrganismos. A desvantagem está no tempo

envolvido quando não se utiliza métodos automatizados (WNN et al, 2006). Os

resultados da microdiluição encontrados neste estudo mostram a dinâmica da

interação entre o agente antimicrobiano e as bactérias testadas. Podemos ver,

por exemplo, que o extrato de canela não produziu zona de inibição sobre o

Peptostreptococcus micros ao teste de difusão em agar. Contudo ao teste de

microdiluição este extrato apresentou concentração inibitória mínima com valor

abaixo de 50 µg/ml para esta mesma bactéria. Novamente, devemos considerar

a possibilidade de que o teste em meio líquido permita uma interação entre os

constituintes do extrato e as bactérias que seja diferente daquela que ocorre no

teste em meio sólido.

Podemos então considerar que a ausência de efeito antimicrobiano de

determinado extrato ao teste de difusão em agar deve ser interpretado com

cautela uma vez que este mesmo extrato pode apresentar atividade

antimicrobiana ao teste de microdiluição.

Neste estudo utilizamos a resazurina como revelador do crescimento

bacteriano. Este corante apresenta a vantagem de uma fácil interpretação e já

foi utilizado em testes de atividade antimicrobiana com óleos essenciais e

extratos hidroalcoólicos (MANN e MARKHAM, 1998; UMEH, OLUMA e IGOLI,

2005). A utilização da resazurina nos controles quando adicionada ao meio de

cultura e ao meio de cultura contendo o extrato teste nos permite afirmar que a

presença do extrato não interferiu na leitura utilizando-se o corante. As

84

diferentes colorações observadas nos poços após a adição da resazurina de

fato comprovam a presença ou ausência de atividade microbiana.

O resultado do subcultivo de alíquotas retiradas dos valores de CIM

apresentados na tabela 3 mostra a diversidade da atividade dos extratos

testados sobre os diferentes microrganismos. O crescimento de

microrganismos no subcultivo em meio sólido indica uma ação bacteriostática

enquanto a ausência de crescimento indica uma ação bactericida.

A importância do efeito bactericida ou bacteriostático é ainda motivo de

discussão no tratamento das doenças infecciosas de um modo geral. O órgão

atingido, imunidade do hospedeiro, os níveis séricos da substância, entre outros

fatores, podem ser critérios para a escolha do antibiótico (FINBERG et al,

2004). Para o uso de colutórios, a importância da ação bactericida ou

bacteriostática não é conclusiva. Os testes com agentes antimicrobianos são

em sua maioria voltados para o estabelecimento da CIM em microrganismos

em sua forma planctônica. Em nossa opinião, estes testes têm a sua

importância como um passo inicial na avaliação do potencial antimicrobiano de

novas substâncias.

Existe contudo a necessidade de que sejam desenvolvidos modelos

experimentais que se aproximem ao máximo das condições encontradas na

cavidade bucal. Pratten, Barnett e Wilson (1998) comprovaram o já bem

conhecido efeito refratário dos biofilmes bucais aos agentes antimicrobianos. O

uso de clorexidina a 0,2% sobre um modelo de biofilme durante 1 minuto não

apresentou uma significativa redução no números de bactérias. Uma redução

substancial foi alcançada somente quando o biofilme foi exposto a clorexidina

85

por 60 minutos. Isto demonstra a importância da substantividade do agente

antimicrobiano.

A realização do teste com o sistema de sedimento salivar mostrou a

atividade dos extratos de romã e jucá num ambiente que se assemelha aquele

encontrado na cavidade bucal (KLEINBERG e CODIPILLY, 1999).

A consistência dos extratos de romã e jucá mostrou-se imprópria para o

uso no sistema de sedimento salivar e por isso foram utilizadas diluições a 50%

(D1), 25% (D2) e 12,5% (D3).

Com a exposição do sedimento salivar aos extratos de romã e jucá

observou-se uma menor formação de CSV. Neste estudo, os sedimentos foram

expostos aos extratos em diferentes concentrações e em seguida lavados para

simular a remoção dos extratos que ocorreria na cavidade bucal com a

presença da saliva. Em seguida cisteína foi adicionada aumentando a

disponibilidade de substrato para o metabolismo bacteriano. Podemos então

inferir que a menor formação de CSV observada se deu pela ação

antibacteriana dos extratos. Neste contexto, não devemos deixar de considerar

a importância do pH no sistema de sedimento. Um pH ácido leva a inibição na

formação de CSV. Segundo Kleinberg e Codopilly (1999) as concentrações de

CSV caem acentuadamente com valores de pH em torno de 4,0. Os resultados

da leitura de pH na tabela 6 mostra valores próximos de 4,0 para as diluições

D2 e D3 do estrato de jucá, indicando uma possível influência quanto a

formação de CSV e leitura ao teste organoléptico.

Por outro lado os valore de pH do jucá para a diluição D1 é um valor não

leva a redução de formação de CSV podendo-se então atribuir a menor

formação de odores ao efeito inibitório do extrato sobre as bactérias.

86

Os valores de leitura organoléptica obtidos também mostram a

capacidade de inibição da formação de odores no sistema de sedimento

quando da exposição aos extratos de romã e jucá, quando comparado ao

controle. Ao teste organoléptico são percebidos pelo examinador não somente

os odores representados por CSV, mas também outros odores de outras

substâncias que estão presentes nos odores bucais (GOLDBERG et al, 1994;

KLEIMBERG e CODIPILLY, 1999; CODIPILLY, KAUFMAN e KLEIMBERG,

2004).

A redução do pH pode ocorrer como resultado direto da presença dos

extratos ou por alterações decorrentes da ação sobre diferentes bactérias.

Processos fermentativos relacionados à presença de glicoce no sistema de

sedimento salivar permite um aumento no número de bactérias sacarolíticas o

que reduz o pH. A redução dos odores com origem em outras substâncias

(indol, escatol) medidas ao teste organoléptico pode resultar da maior

degradação de cisteína em relação a outros aminoácidos. Um efeito oposto

pode ocorrer quando ocorre menor degradação de cisteína e um aumento da

degradação de outros aminoácidos (KLEINBERG e CODIPPILY, 1999).

Na tabela 7 que mostra o efeito do extrato de romã sobre o sistema de

sedimento salivar. Podemos ver que para a diluição D2 os valores do teste

organoléptico aumentam enquanto os valores de CSV diminuem nas leituras de

1h e 2h. Como já discutido anteriormente, ao teste organoléptico são

percebidos simultaneamente odores de outras substâncias juntamente com os

CSV.

87

Os dados de CSV obtidos com a leitura pelo Halimeter® sobre sedimento

salivar controle (Tabelas 5 e 7) mostram valores elevados e que representam

clinicamente casos extremos de concentração de CSV na cavidade bucal. Do

mesmo modo estes dados também indicam que a inibição proporcionada pela

exposição do sistema de sedimento salivar ao extrato ocorreu em um meio com

condições ideais para a produção de CSV, dada a adição de cisteína ao

sistema. No estudo in vivo de Liu et al (2006) medidas acima de 75 ppb foram

utilizadas na inclusão dos indivíduos no grupo de portadores de halitose.

Um outro fator precisa ser considerado na avaliação organoléptica que

é a possibilidade da presença de um odor mascarador. O estudo in vivo de

Pitts et al (1983) demonstrou a presença de um efeito mascarador que foi

observado até 30 minutos após o uso de um colutório. Em nosso estudo, não

foram percebidos odores mascaradores apresentados pelos extratos quando da

análise organoléptica do teste com sedimento salivar. A quantidade de extrato

utilizada, o tempo de exposição do sedimento ao extrato e a lavagem do

sedimento explicam a ausência da interferência de odores próprios do extrato.

Os testes de sensibilidade antimicrobiana realizados previamente ao

teste com sedimento salivar também colaboram para a interpretação de que a

redução na formação de CSV foi decorrente do efeito antimicrobiano dos

extratos. Ainda que o sedimento salivar seja composto por um número de

espécies bem maior do que o número testado por difusão e microdiluição,

devemos considerar: A – o possível efeito antimicrobiano sobre outras espécies

produtoras de CSV; B – que o efeito antimicrobiano sobre determinada espécie

leva ao desequilíbrio do meio, impedindo o desenvolvimento de espécies

88

bacterianas produtoras de CSV mesmo que estas não sejam sensíveis ao

agente antimicrobiano presente no extrato.

Bradshaw et al (1998) demonstraram a importância da bactéria

Fusobacterium nucleatum na coagregação bacteriana e observaram que a

presença deste microrganismo facilitou a sobrevivência de Porphyromonas

gingivalis e Prevotella nigrescens quando cultivos contendo estes

microrganismos foram expostos ao oxigênio. O oposto também foi observado

de forma que na ausência de Fusobacterium nucleatum o crescimento destes

outros microrganismos foi perturbado.

Sabe-se que Porphyromonas gingivalis e Treponema denticola são

frequentemente encontradas em associação na doença periodontal. Estudo in

vitro demonstrou um efeito sinérgico na formação de biofilme quando estes

dois microrganismos foram cultivados em associação. Por outro lado, quando

Treponema denticola foi incubada com Fusobacterium nucleatum ou Tannerella

forsythia, nenhum aumento na formação do biofilme foi observado quando

comparado ao cultivo destes dois microrganismos na ausência da Treponema

denticola (YAMADA, IKEGAMI e KURAMITSU, 2005). Não somente a presença

de determinada bactéria é importante no fenômeno de coagregação, no caso

do envolvimento de Porphyromonas gingivalis e Fusobacterium nucleatum.

Estudo utilizando medidas automatizadas com espectrofotometria indicou que a

quantidade de bactérias presentes influência de tal forma o fenômeno de

coagregação que este pode não ocorrer se uma proporção ideal entre o número

de bactérias for alterado (METZGER et al 2001).

A utilização o sedimento salivar de Kleinberg e Codopilly (1999) não

inclui testes para verificação da viabilidade das bactérias após a última medida

89

de CSV. Se considerarmos as interações entre as bactérias descritas

anteriormente, o cultivo para verificação do crescimento e identificação das

bactérias viáveis poderia trazer informações adicionais sobre a influência da

presença do agente antimicrobiano presente no sistema.

A quantificação de polifenóis em produtos de origem vegetal é bastante

utilizada dada a importância destes componentes por suas propriedades

antioxidantes e antimicrobianas. Diferentes métodos são utilizados e na sua

maioria fazem uma equivalência com a quantidade de ácido gálico presente na

amostra estudada (GRAHAM, 1992; SELLAPPAN, AKOH e KREWER, 2002;

LEE et al, 2003; KIM et al, 2003; GIAMPERI et al, 2004; ROMANI et al, 2006;

MILLER et al, 2006). O ácido gálico já foi apontado como o responsável pela

ação antimicrobiana em estudo que realizou avaliação de componentes

isolados da planta Rubus ulmifolius (PANIZZI et al 2002).

Fizemos a opção pelo método Azul da Prússia modificado por Grahan

(1992) que apresenta como vantagem a estabilidade da cor após a adição dos

reagentes e utilizamos os resultados na escolha de dois extratos com as

maiores concentrações de polifenóis para a realização dos testes com

sedimento salivar. Dada a literatura revisada e os resultados encontrados neste

estudo, podemos inferir que o efeito antimicrobiano está relacionado à presença

de polifenóis nos extratos estudados. No entanto não podemos descartar a

participação de outros compostos presentes nos extratos como aminoácidos,

proteínas, ácidos graxos esteróides, entre outros (CARVALHO, 2004).

Não foi objetivo deste trabalho a quantificação de componentes isolados

presentes nos extratos. Não estamos alheios a importância da identificação

destas substâncias quando consideramos o potencial encontrado nos extratos

90

utilizados quanto a sua capacidade de inibição de bactérias produtoras de

CSV. Todavia, este aspecto deve ser considerado tendo-se em vista dois

fatores destacados por Chan (2003) quanto ao uso de produtos de origem

vegetal: substâncias isoladas podem ser demasiadamente tóxicas ou podem

não apresentar atividade terapêutica. Este fenômeno é observado tanto

quando do estudo da atividade antimicrobiana como da atividade antioxidante

dos polifenóis (CHATTOPADHYAY et al, 2002; SEERAM et al, 2005; KUET et

al, 2006).

Verificamos que são poucos os estudos com fitoterápicos na

Odontologia. Seymour (2003) realizou revisão bibliográfica quanto as

propriedades e uso dos óleos essenciais quanto ao seu efeito bactericida, uso

na irrigação em casos de gengivite, bochechos em fase pós-cirúrgica,

manutenção de implantes, redução de bacteremia e redução de bactérias pelo

aerosol das turbinas odontológicas. Em todos os estudos revisados, o

Listerine® foi o colutório contendo óleos essenciais utilizado. Outros estudos

tem surgido nas últimas décadas incluindo, por exemplo, Cymbopogon citratus,

Arnica montana Melaleuca alternifolia, Camelia simensis, e Punica granatum,

como visto na revisão da literatura (SANTOS, 2000; KOO et al, 2000;

HAMMER, 2003; VASCONCELOS et al, 2003; MATSUMOTO et al, 2003).

Observamos que na literatura publicada sobre a abordagem

antimicrobiana com produtos fitoterápicos na halitose, o seu uso em estudos in

vivo está restrito aos óleos essenciais e praticamente aos estudos com

Listerine®. Como exceções temos: o estudo de Koslovsky et al (1996) que não

descreve a composição de um colutório com a combinação água/óleo e o

91

estudo de Rösing, Jonski e RØlla (2002) que não especifica as substâncias de

origem vegetal presentes no colutório testado.

Vimos em nosso estudo Nesta pesquisa vimos que existe um potencial

para a utilização de fitoterápicos no combate a microrganismos relacionados a

halitose. A realização de ensaios clínicos são reconhecidamente os melhores

modelos de estudo (LOESCHE e KAZOR, 2000) e inclusive são exigidos pela

American Dental Association (ADA) para os produtos indicados para o

tratamento da halitose para os quais se solicite a aprovação daquele Conselho

(WOZNIAK, 2005).

De forma geral, o uso de popular de produtos vegetais com finalidade

terapêutica tem seu uso legitimado pela prática do consumo baseado nas

informações acumuladas durante os séculos. Ainda que o uso de plantas

medicinais ocorra como uma prática comum em todo o mundo, as pesquisas

nesta área específica são indispensáveis tanto para a descoberta de novos

medicamentos como para avaliação quanto aos riscos e benefícios destes

produtos (CALIXTO 2000; CAPASSO et al, 2000; WOOLF, 2003;

SPARREBOOM et al, 2004).

Um fato interessante pode ser observado no Brasil. Podemos nos

“alimentar” com extratos de plantas medicinais que têm o seu registro no

Ministério da Agricultura, que compramos nas farmácias, estão acondicionados

em frascos com atomizadores ou sprays, e no rótulo têm a observação:

“ melhor não ingerir nada após o uso”.

O crescente interesse pelos medicamentos de origem vegetal não é um

fenômeno social desvinculado de um forte componente de interesse

econômico. Somente nos mercados dos Estados Unidos e Europa foram

92

alcançados valores em torno de cinco e sete bilhões de dólares no ano de

1999, respectivamente. No Brasil contamos com uma legislação específica

quanto ao uso de produtos fitoterápicos que, não obstante, sofre oposição por

parte de algumas companhias farmacêuticas (CALIXTO, 2000).

Utilizamos modelos in vitro como um passo inicial na investigação de

alguns extratos e demonstramos sua atividade antimicrobiana. Vimos ao teste

de difusão, microdiluição e com a utilização do sistema de sedimento salivar

que os extratos testados apresentam potencial utilidade no tratamento da

halitose uma vez que mostram atividade antimicrobiana sobre microrganismos

diretamente responsáveis pela produção de CSV. Como esses microrganismos

estão envolvidos na doença periodontal e endodôntica, estas áreas da

Odontologia podem também ser beneficiadas. Estudos pré-clínicos e clínicos

precisam ser realizados até que se obtenha o tão necessário binômio eficácia e

segurança.

7. CONCLUSÕES.

Extratos fitoterápicos demonstraram atividade inibitória sobre

microrganismos bucais produtores de compostos sulfurados voláteis e portanto

93

apresentam uma potencial utilidade na abordagem antimicrobiana para o

tratamento da halitose de origem bucal.

Os extratos fitoterápicos de jucá (Caesalpinia ferrea) e romã

(Punica granatum) inibiram a formação de compostos sulfurados voláteis em

um modelo de sedimento salivar mostrando potencial utilização na cavidade

bucal para a redução das principais substâncias relacionadas a halitose de

origem bucal.

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