Serial Analysis of Gene ExpressionSerial Analysis of Gene Expression(SAGE)(SAGE)
Greice Andreotti De Molfetta, PhD
SAGESAGE
Vantagens:
Sistema aberto – todos os transcritos podem ser identificados;
Acuracia na detecção dos transcritos;
Banco de dados digital;
Informação quantitativa e qualitativa;
Desvantagens:
Caracterização de novos transcritos é computacionalmente complicada a partir de sequencias pequenas (tags);
Especificidade da Tag (aumentou para 21 bp);
Existência de transcritos que não contem o sítio da enzima NlaIII;
Sensitividade baixa da detecçao de variantes de splicing alternativo;
TAGSTAGS
TAGS ou ETIQUETAS:
Seqüências pequenas mas exclusivas de um Seqüências pequenas mas exclusivas de um determinado gene.determinado gene.
NÃO SE REPETEM EM OUTROS GENESNÃO SE REPETEM EM OUTROS GENES
AAAAAAAAA
AAAAAAAAA
CATG
CATG
CATG AAAAAAAAA
10 pares de bases10 pares de bases
Banco de dados grande e validadoBanco de dados grande e validado
TAGSTAGS
TAGS de 10 pb - identificam unicamente um TAGS de 10 pb - identificam unicamente um transcrito;transcrito;
TAGS ligados uns aos outros facilitam TAGS ligados uns aos outros facilitam clonagem e seqüenciamento de clonagem e seqüenciamento de todostodos os os transcritos da amostra;transcritos da amostra;
Análise: os tags são separados e identificados Análise: os tags são separados e identificados através de seus sítios de reconhecimento através de seus sítios de reconhecimento CATG;CATG;
Velculescu Velculescu et alet al, 1995, 1995
SAGE e TagsSAGE e Tags
Baseando-se na existência das tags e na sua Baseando-se na existência das tags e na sua identificação:identificação:
Análise em série ( Grande escala):Análise em série ( Grande escala):
Identificação de um número maior de genes Identificação de um número maior de genes
Transcriptoma completo de um organismoTranscriptoma completo de um organismo
Custo e tempo menoresCusto e tempo menores
Quantificação da expressão gênica (contagem Quantificação da expressão gênica (contagem dos tags)dos tags)
DITAGSDITAGS
Localizado entre as sequências “CATG”
Ditags apresentam 20-26 pb entre cada sequencia “CATG”
Descartar os ditags duplicados - incluindo aqueles da fita reversa da PCR
Descartar as sequênicas “linker”
Contabilizar a ocorrencia de cada tag
Como é um resultado de Como é um resultado de SAGE?SAGE?
TAG COUNT TAG COUNT TAG COUNTCCCATCGTCC 1286 CACTACTCAC 245 TTCACTGTGA 150CCTCCAGCTA 715 ACTAACACCC 229 ACGCAGGGAG 142CTAAGACTTC 559 AGCCCTACAA 222 TGCTCCTACC 140GCCCAGGTCA 519 ACTTTTTCAA 217 CAAACCATCC 140CACCTAATTG 469 GCCGGGTGGG 207 CCCCCTGGAT 136CCTGTAATCC 448 GACATCAAGT 198 ATTGGAGTGC 136TTCATACACC 400 ATCGTGGCGG 193 GCAGGGCCTC 128ACATTGGGTG 377 GACCCAAGAT 190 CCGCTGCACT 127GTGAAACCCC 359 GTGAAACCCT 188 GGAAAACAGA 119CCACTGCACT 359 CTGGCCCTCG 186 TCACCGGTCA 118TGATTTCACT 358 GCTTTATTTG 185 GTGCACTGAG 118ACCCTTGGCC 344 CTAGCCTCAC 172 CCTCAGGATA 114ATTTGAGAAG 320 GCGAAACCCT 167 CTCATAAGGA 113GTGACCACGG 294 AAAACATTCT 161 ATCATGGGGA 110
SAGE
1- Obtenção do RNAm (poli-A);
2- Síntese do cDNA com o uso de oligo (dt) biotinilado;
3- Ligação do cDNA (cauda poliA) à partículas magnéticas revestidas com Streptavidina;
4- Clivagem com uma enzima de ancoragem (NlaIII) que reconheça 4 pb (CATG);
5- Ligação de adaptadores (contendo um sítio de reconhecimento para a enzima de etiquetagem, e sítios para os primers A e B) aos cDNAs;
6- Clivagem com a enzima de etiquetagem (TE) (BsmF1), uma enzima do tipo 2 que reconhece o sítio do Adaptador (adjacente ao cDNA) clivando aproximadamente 14 pares de bases adiante, liberando um tag específico para o cDNA;
7- Ligação dos tags para formação de ditags;
8- Amplificação dos ditags por PCR com os primers A e B;
9- Isolamento dos ditags utilizando a enzima de ancoragem para retirada dos adaptadores;
10- Recuperação dos ditags;
11- Formação dos concatâmeros pela ligação dos ditags;
12- Clonagem e seqüenciamento dos concatâmeros, que formam a biblioteca de SAGE.
SAGE
Esquema da abordagem experimental adotada pela técnica de SAGE (figura obtida do protocolo original, disponível em www.sagenet.org).
1 2 3
28 S
18 S
4 S
SAGE
• Extração RNA :
Síntese da dupla fita. A) Representação esquemática da síntese da dupla fita de cDNA; B) RT-PCR: linhas 1 e 2 são amplificações com, GAPD da amostra linhagem granulocítica (1) e amostra da linhagem ertitrocitária (2); linhas 3 e 4 são amplificações com EEF1A1 da amostra linhagem granulocítica (3) e amostra da linhagem eritrocitária.
SAGE
Digestão com a enzima Nla III. Representação esquemática da digestão em seguida da captura da região de interesse. B) PCR usando “primers” específicos para GAPDH (linha 2) e EEF1A1 (linha 4). Após a digestão, um sítio de ligação do primer GAPDH é perdido (linha 3), enquanto os sítios para EEF1A1 continuam intactos (linha 5).
SAGE
Ligação do adaptador nos “pools” A (linhagem granulocítica) e B (linhagem eritróide). A) representação esquemática da ligação. B) PCR usando “primers” específicos de cada adaptador e para o gene EEF1A1. As linhas 1 e 3 correspondem ao produto de PCR com o conjunto de “primers” correto, DTP-1 com o “pool” A e DTP-2 com o “pool” B. As linhas 2 e 4 correspondem ao produto de PCR com o conjunto de “primers” trocados
SAGE
Formação dos “tags”. A) representação esquemática da clivagem com BsmFI. B) Produto da amplificação para verificar a eficiência da digestão. Linhas 1 e 3, e linhas 2 e 4 representam amplificação do “pool” A e B antes e depois da digestão, respectivamente.
SAGE
Ligação e expansão dos “ditags”. A) Representação esquemática. B) Amplificação dos “ditags” nas diluições 1:20 (1), 1:40 (2), 1:80 (3); controle positivo (4), controle negativo sem ligase (5) e branco (6). C) Produtos precipitados da amplificação em grande escala com a diluição 1:120.
SAGE
Digestão e purificação dos “ditags”. A) Representação esquemática da digestão com NlaIII para liberação dos “ditags”. B) Gel de poliacrilamida com os fragmentos resultantes da digestão enzimática. O fragmento de 26 pb foi purificado para a formação dos concatâmeros.
SAGE
Ligação dos “ditags” e formação dos concatâmeros. A) Representação esquemática. B) Gel de poliacrilamida com o perfil de fragmentos de concatâmeros; o marcador é utilizado para orientar no isolamento dos fragmentos a serem clonados.
SAGE
SAGE
Est. Vermelho Normal
Est. Branco
10.633 2.191
9.230
2.0402.224
15.809
4.234
SAGE
total de tags sequenciadas: 60.000
Genes + expressos estímulo branco
