ReplicaçãodoDNA

1

•  (revisão)polimerizaçãodoDNA

•  mecanismogeraldereplicação

•  Replicaçãoemprocariotos

•  Replicaçãoemeucariotos

Roteirodaaula

2

Dogmacentral

3Alberts,5thed

Dogmacentral

4Alberts,5thed

EstruturadoDNA

- dupla-hélice- AnE-paralela- Estruturasugereummododecópia:replicação

5

DNA:(deoxi)nucleo<deos

6Alberts,5thed

Dupla-fitadoDNA

7Alberts,5thed

CadeiadoDNA:ligaçõesfosfodiéster

8Alberts,5thed

1-DNAduplafitadevesedesenrolar2–Formaçãodeforquilhasdereplicação(moléculasdesenroladas)3–NovafitaéformadaporpareamentocomafitaanEga(parental)4–Novadupla-fitaéformada,contendoumafitaparental(anEga)eumafitanova(replicaçãosemi-conservaEva)

ReplicaçãodoDNA

9

ProcessodereplicaçãodoDNA

10

bactérias:1000nt/segeucariotos:100nt/seg—estruturadacromaEna?

Alberts,5thed

ArthurKornberg SeveroOchoa

PrêmioNobelFisiologia/Medicina1959

DescobertadosmecanismosdereplicaçãodoDNAeRNA

11

ArthurKornberg

1957:idenMficaçãodeenzimacapazdesinteMzaroDNA–DNApolimeraseI(E.coli)“Exactcopiescanbemadefromit,asfromataperecording,sothatinformaEoncanbeusedagainandelsewhereinEmeandspace”(Kornberg,1960)

T7DNApolymerase

12

• Adiçãodebases:região3’

• AEvidademelhoremDNAsimplesfita,nãodupla-fita• DependedapresençadeumDNAmoldeparareplicar-primer

AMvidadedaDNApolimerase:ensaiosinvitro

13Alberts,5thed

Problema:comoareplicaçãopoderiaproceder?

14

5’

5’

3’

3’

5’

3’

primer

Comoocorreareplicaçãodestafita?

Direçãodaforquilha

Problema:comoareplicaçãopoderiaproceder?

15

5’

5’

3’

3’

5’

3’

primer

Direçãodaforquilha

Afita3’-5’éreplicadadeformadescon<nua

16

Replicaçãoconanua

3’

5’

Replicaçãodesconanua

Fitaleadingefitalagging

17

SíntesedeDNAnafitalagging

Alberts,5thed

ReijiOkazaki–1930-1975

Replicaçãosemi-descon<nua:Okazaki(1968)

19

Experimento:Pulse-chasecom3H-MmidinaCulturadebactériasemcrescimento:

replicação

Adiciona3H-Emidina(segundos)DNAreplicado:radioaEvo

AdicionaTnãoradioaEvo

Coletabactériasemdiferentestempos

PurificaçãodeDNAeseparaçãoporgradiente:fragmentospequenose

grandes

pulse

chase

.

.

.

20

ResultadosdoexperimentoDNApurificadologoapósopulso:fragmentospequenos(lagging-strand-desconanua)efragmentosgrandes(leading-strand-conanua)

Fragmentosgrandes

Fragmentospequenos

5’

5’

3’

3’

5’

3’

primer

Direçãodaforquilha

Afita3’-5’éreplicadadeformadescon<nua

22

Leading-strand

3’

5’

Laggingstrand

Pulseandchase

ResultadosdoexperimentoDNApurificadomuitoapósopulso:somentefragmentosgrandes(leading-strand);osfragmentosmenoresforamligados.

Fragmentosgrandes

23

• ReplicaçãodoDNAésemi-conservaMvaMantémduasfitasparentais,egeraduasfitasnovas

• ReplicaçãodoDNAébi-direcionalMovimentaçãodaforquilha• ReplicaçãodoDNAésemi-descon<nuaFitaleading(5’-3’)efitalagging,osfragmentosdeOkazakidevemserreunidos

ReplicaçãodoDNA

24

Replicaçãoésemi-descon<nua

25Alberts,5thed

ForquilhasdereplicaçãoemcromossomoeucarióMco

26Alberts,5thed

ComplexodeproteínasenvolvidonareplicaçãodoDNA

• DNApolimerases(**aEvidadeexonuclease3’-5’)

• Helicase

• ProteínadeligaçãoaDNAsimplesfita

• primase

• DNAligase

27

DNApolimerase:aMvidadedepolimerização5’-3’

dNTPs

1)3’OHdoúlEmontatacaofosfato5’dodNTP

2)2fosfatosclivados

3)Ligaçãofosfodiéster

4)Íonsfosfatosãoliberados 28

DNApolimerase

29Alberts,5thed

Proofreading:aMvidadeexonuclease3’-5’

30Alberts,5thed

Proofreading:aMvidadeexonuclease3’-5’

31Alberts,5thed

DNAhelicase

32Alberts,5thed

ProteínadeligaçãoaoDNAsimplesfita(SSB)

33Alberts,5thed

Slidingclamp:proteínaquemantémaDNApolimeraseassociadaaoDNA

Estrutura3DproteínaE.coli34Alberts,5thed

35Alberts,5thed

Replicaçãoemprocariotos

E.coli-4,6x106pb:40minutosparareplicação

Alberts,5thed

Replicaçãoemprocariotos

sistemaDammethylase/E.coli:controledeusodasorigensdereplicação

Alberts,5thed

Replicaçãoemprocariotos

Alberts,5thed

Proteínasprocariotosvs.eucariotos

39

McGeoch&Bell,2008–NatRevMolCellBiol 40

Replicaçãoemeucariotos

• faseS• diferentesregiõesdocromossomo:replicaçãoemtempodiferenteduranteafaseS(ex:heterocromaEna)

Alberts,5thed

Eucariotos:múlMplasorigensdereplicação

42Alberts,5thed

Eucariotos:múlMplasorigensdereplicação

•  SíEodeligaçãodocomplexodereconhecimento(ORC)•  SíEoparaproteínaauxiliar(proteínavariável)• RegiãodoDNAfácildedesenrolar

43Alberts,5thed

ReplicaçãodoDNAemeucariotos:ORC

44Alberts,5thed

RemodelamentodacromaMna

45Alberts,5thed

Eucariotos:múlMplasorigensdereplicação

46Alberts,5thed

Telomerase:assegurareplicaçãodaextremidadedocromossomo

Telomerase:complexoproteína-RNA

47Alberts,5thed

Replicaçãodostelômeros

48Alberts,5thed

ElizabethBlackburn CarolGreider JackSzostak

PrêmioNobelFisiologia/Medicina2009

DescobertaqueoscromossomossãoprotegidosportelômerosepelaaMvidadedaenzima

telomerase49

Progeria

Hutchinson-Gilford:somentecélulasdapele,ossosesistemacardiovascularenvelhecemrapidamente–telômerosmaiscurtosnonascimento

50

OCasodaDolly

DNA“velho”?51

Cânceretelomerase

52

Parasabermais

•  MolecularBiologyoftheCell–Albertsetal•  EssenEalCellBiology–Albertsetal•  Genes–Lewin