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Bento Gonçalves – RS17 a 21/10/2011
PROPRIEDADES FUNCIONAIS DAS FITOMOLÉCULAS
Marcia Ortiz Mayo MarquesLaboratório de Produtos Naturais
Centro de P&D de Recursos Genéticos VegetaisINSTITUTO AGRONÔMICO (IAC)
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Função Fitomoleculas: Comunicação
Defesa herbívoros
Polinização
Dispersão sementes
Vespa (Braconidae) parasitando pulgão emuma planta de Cyphomandra betacea.
Foto: Montero & Naranjo.
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HENTRICH et al, 2007
VARASSIN et al, 2000
2
1: larvas de lepidópteros (Spodoptera littoralis)
2: larvas de larvas do coleóptero Diabrotica virgifera virgifera
Difosfato de farnesila trans-cariofileno
(*) Terpeno Sintase 23 (TPS23): expressão desta enzima é controlada no nível transcricional e induzida, independentemente, pelos danos causados nas folhas por S. littoralis e nas raízes por D.virgifera
Conclusão: trans-cariofileno pode atrair os inimigos naturais dos herbívoros ( nematóides e vespas parasitas).
*
Kollner et al, The Plant Cell, v. 20, p. 482–494, 2008
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Comunicação: Polinizadores
HENTRICH et al, 2007
Mamíferos:
...Polen, nectar, resinas.
VARASSIN et al, 2000
linalolgeraniol
alcool benzílico
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Classe Composto Planta Polinizador Referência
TerpenosPineno Antúrios
(Anthurium sp)
Orquideas(Oncidium sp)
Passifloras(P. alata)
Abelhas(Meliponinae)
HENTRICH etal, 2007
REIS et al, 2000
Geraniol
Limoneno
LinalolMamangaba(Xylocopa sp)
VARASSIN et al, 2000
Benzenóides
Alcool benzílicoPassifloras(P. mucronata)
Morcego (Glossophaga sp)
VARASSIN et al, 2000
Benzoato de benzila
Orquideas(Gymnadeniasp)
Borboletas(Lepidoptera)
Huber et al,2005
Derivados lipídeos
HeptadecenoAnturiosOrquideas
Abelhas(Eulossa sp)
HENTRICH et al, 2007Huber et al,2005
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Gingerol Shogaolgengibre
Propriedade: antitumoral, antioxidante
Catharantus roseus L.Sulfato de vincristinavincristina
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Espécie: Chamomilla recutita - Família: Annonaceae
Objetivo: Avaliar a atividade do (-) bisabolol, principal
componente do óleo essencial de Chamomilla recutita,
contra o Leishmania infantum.
*agente etiológico da leishmaniose nos países da bacia mediterrânica
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Leishmanioses são causados por protozoários do
gênero Leishmania que afetam o homem e outras espécies de
mamíferos, incluindo os caninos, que são os principais hospedeiros da
doença.
A leishmaniose humana é encontrada em regiões
com um clima quente.
O agente patogênico da leishmaniose na Península Ibérica é
a espécie Leishmania infantum. A maior incidência está no
Mediterrâneo e da zona central da península, principalmente entre
crianças (Castro et al. 2003 ).
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O tratamento farmacológico da doença, apresenta uma vasta gama de
reações adversas, motivando a busca de novos agentes no controle da doença.
Assim, tem havido um crescente interesse na utilização de componentes do óleo
essencial contra a leishmaniose (Rosa et al. 2003)
Teste da pureza do (-)α-bisabolol
(-)α-bisabolol foi fornecido por Sensient
Fragrances S.A. (Granada, Spain).
A purificação foi avaliada por GC-MS (Gas
Chromatograph Hewlett-Packard 5973)
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Padronizou-se a concentração de promastigotas de 1x106
nas culturas de Leishmania infantum em meio RPMI-1640 no inicio
do experimento.
(-)α-bisabolol foi diluído em 1% dimetilsulfóxido (DMSO),
com meio RPMI-1640 nas concentrações de 1,000 mg / mL. Obtendo
a partir desta as concentrações de 1000, 500, 250, 125, 100, 75, 62,5,
50, 37,5, 31,2, 25; 18,75, 15,6, 12,5, 7,8 e 6,25 mg/mL
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Família: Asteraceae
Nome popular: catinga-de-bode, mentrasto, maria-
preta, picão-branco, picão-roxo, erva-de-São João,
erva-de-São-José, erva-de-Santa-Lúcia
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Aflatoxinas são produtos do metabolismo secundário de Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus.
Contaminam grande variedade de alimentos,principalmente o amendoim, nozes, sementes de algodão, milho, trigo, sementes oleosas em geral, ração animal, produzindo a aflatoxina em condições ambientais adequadas, como temperatura entre 25-30 Celsius e atividade de água superior a 0,86.
A contaminação de grãos com micotoxinas e fungos toxigênicos, pode ocasionar,além de problemas de saúde, perdas econômicas consideráveis já que lotescontaminados devem ser descartados.
A FAO (Food and Agriculture Organization) estima uma perda mundial de 25%dos grãos produzidos.
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Aflatoxina B1: altamente tóxica
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OBJETIVOS
Avaliar o potencial do óleo essencial de folhas e flores de mentrasto (Ageratum conyzoides) na inibição do crescimento e da produção da aflatoxina B1 (AFB1) em cultura de Aspergillus flavus,
Avaliar a composição química do óleo essencial das folhas e flores de mentrasto;
Fracionar o óleo essencial para obtenção do princípio ativo inibidor do crescimento e da produção de aflatoxina B1;
Avaliar possíveis alterações na ultra-estrutura celular do fungo.
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Óleo essencial das folhas e flores : hidrodestilação
Concentrações de óleo essencial : 30 μg/mL; 20 μg/mL; 10 μg/mL; 5μg/mL; 1 μg/mL; 0,40 μg/mL; 0,20 μg/mL; 0,10 μg/mL; 0,04μg/mL; 0,020μg/mL; 0,01 μg/mL and 0,00 μg/mL (controle).
Microscopia eletrônica: avaliação da atividade dos óleos essenciais nas células do fungo.
Frações foram purificadas por : CCDP
Identificação das substâncias: EM
MATERIAL E MÉTODOS
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Estruturas químicas dos principais componentes do óleo essencial de folhas e flores de Mentrasto.
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Composição química: principais componentes foram o precoceno II (46,35%), precoceno I (42,78%), cumarina (5,01%) e trans-cariofileno(3,02%).
Precoceno II é o composto ativo do óleo essencial.
Atividade: Inibiram significativamente o crescimento do fungo m 58%, 61% 44%, 45%, 63%, 63%, 57%, 49%, 30%, 29% e 20%.
As concentrações (58 a 49%) inibiram a produção da aflatoxina B1 completamente.
Observada alterações ultraestruturais dependente da concentração do óleo essencial de Ageratum conyzoides utilizado. Mais evidentes no sistema das endomembranas, afetando principalmente a mitocôndria.
RESULTADOS
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• Brasil – maior mercado de agrotóxicos no mundo;
•Mercado Pessoal, Perfumaria e Cosméticos * :
3ª posição mundial
Crescimento médio de 10,5% (últimos 15 anos)
US$ 37,4 bilhões
•Aromas: crescimento de cerca de 5% ao ano,
* ABIHPEC; 2011 Euromonitor International
IMPORTÂNCIA ECONÔMICA
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Pesquisas com Plantas Aromáticas e Medicinais (IAC)
Nativas/Cultivadas
Bioprospecção
Óleos Essenciais Extratos Vegetais
• Caracterização Química•Caracterização Olfativa• Avaliação Biológica
• Domesticação • Diversidade Genética
•Genômica e metabolômica
• Melhoramento Genético
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BIOPROSPEÇÃO DE PLANTAS AROMÁTICAS NATIVAS
Objetivo : avanço do conhecimento da flora aromática nativa sob o ponto de vista:
• levantamento taxonômico;
• variabilidade química e genética;
•agregar valor as espécies;
• contribuir para o uso sustentável ;
• conservação das espécies
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Família Gênero Espécie
36 82 157
Número de famílias botânicas, gêneros e espécies do Cerrado e Mata Atlântica avaliadas
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EXPEDIÇÃO DE COLETA
EXTRAÇÃO DOS ÓLEOS ESSENCIAIS E PREPARO DE EXTRATOS
ANÁLISE DA COMPOSIÇÃO QUÍMICA
DIVERSIDADE QUÍMICA E GENÉTICA
DOMESTICAÇÃO
AVALIAÇÃO OLFATIVA E DA ATIVIDADE BIOLÓGICA *
MELHORAMENTO GENÉTICO
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EXTRAÇÃO DE FITOMOLÉCULAS VOLÁTEIS (ÓLEOS ESSENCIAIS)
HIDRODESTILAÇÃO
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DESTILAÇÃO POR ARRASTE A VAPOR
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ROTINA DE ANÁLISE DA COMPOSIÇÃO QUÍMICA DE ÓLEOS ESSENCIAIS
Óleos essenciais
CG - EM CG - DIC
EM IR co-injeção de padrões IR co-injeção de padrões
Isolamento: CCDC; CC; CLAE
IV EM RMN de 1H RMN de 13C
* Substâncias não identificadas
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Atividade bacteriana dos óleos essenciais de
Baccharis dracunculifolia e Vernonia scorpioides **
(*): José P. de Siqueira-Júnior/ Lab. Genética de Microorganismos – UFPB)
Óleos essenciais: avaliados em linhagens de Staphylococcus aureus
Bombas de efluxo: proteínas integrantes da membrana plasmática bacteriana e que tem sido responsabilizadas por diversos casos de resistência a drogas , as quais são expelidas para fora da célula ;
CIM: método da diluição em meio de cultura solidificado em diferentes concentrações
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Linhagens/Antibiótico OE de B. dracunculifolia OE de V. scorpioides
IS-58 / Tetraciclina 5 ≥20
RN-4220 / Eritromicina 10 ≥20
SA-1199B / Norfloxacina ≥20 ≥20
Tabela 1. CIM (µg/mL) dos óleos essenciais (µL/mL) de B. dracunculifolia e V. scorpioides.
OEBd - óleo essencial de B. dracunculifolia; OEVs - óleo essencial de V. scorpioides
Tabela 2. CIM (µg/mL) do norfloxacina (Nor) na ausência e na presença de concentrações
subinibitórias dos óleos essenciais.
NORNOR + OEBd
(CIM 1/4)
NOR + OEBd
(CIM 1/8)
NOR + OEVs
(CIM 1/4)
NOR + OEVs
(CIM 1/8)
64 4 (16) 16 (4) 8 (8) 64 (0)
*entre parênteses, os fatores de redução da CIM.
Resultado: OE não apresentaram atividade antiestafilococicaOE + NOR : atividade moduladora da resistência, indicando inibição
de bomba de efluxo
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Principais componentes do óleo essencial de Baccharis dracunculifolia
E-nerolidol
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β-pineno
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limoneno
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Principais componentes do óleo essencial de Vernonia scorpioides
E-cariofileno
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germacreno D
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α-E-E-farneseno
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ÓLEO ESSENCIAL DE Lychnophora pinaster MART
M eO OM eO O
cinamato de metila
•Família: Asteraceae
•Nome popular: arnica, arnica mineira
•Ocorrência - restrita a complexos rupestres de MG, BA e GO
•Substância majoritária:
• indústria alimentícia: aromatizante (sintético);
• atração de insetos
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CARACTERIZAÇÃO DA DIVERSIDADE GENÉTICA,
VIA MARCADOR MICROSSATÉLITE, E CONSTITUINTES DO ÓLEO ESSENCIAL DE
Lychnophora pinaster MART
Doutorado : LENITA LIMA HABER/FCA-UNES-Botucatu (2008)Co-orientação: Dra. Maria Imaculda Zucchi – APTA Polo Regional Centro Sul
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• Uso popular:
• folhas e flores : extrato alcoólico e pomada
antiinflamatória, analgésica e cicatrizante ferimentos,
contusões ou hematomas, picadas de insetos
(Pinheiro, 2002; Souza, 2003)
• uso cosmético
sabonete - eliminar asperezas e rachaduras, suavizar
hematomas e contusões
(Almeida et al., 1998)
Lychnophora pinaster
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OBJETIVOS
Avaliar a variabilidade genética de Lychnophora pinaster por
meio de marcador molecular microssatélite;
Avaliar a composição química dos óleos essenciais dos
indivíduos coletados em populações nativas no estado de MG;
Avaliar a composição química dos óleos essenciais cultivados
em Botucatu – SP
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COLETA
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• População
• amostrados 20 indivíduos a;
• material vegetativo para propagação;
• folhas para análises do O.essencial e genética;
• amostras de solo;
• material para a confecção de exsicatas – depositadas no herbário do
IAC;
• dados de localização geográfica;
MATERIAL E MÉTODOS
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CULTIVO L. pinaster
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•Coleta do material nativo: Lavras (Antena , Estrada Real), Carrancas (Estrada
Real)
Colheita do material cultivado: 3 estações do ano ( verão, outono e inverno);
• Secagem: 40 C até peso constante;
• Extração do óleo essencial: hidrodestilação em aparelho Clevenger por 2hs;
•Análise do óleo essencial: CG-EM
•Avaliação dos resultados : análise multivariada (ACP)
Colheita, Extração e análise dos óleos essenciais
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CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR
•Extração do DNA - construção da biblioteca enriquecida com locos microssatélites e estudo
da variabilidade genética e da estrutura populacional;
• Protocolo de extração de DNA baseado no uso de CTAB com modificações.
Doyle e Doyle (1990 )
• Quantificação do DNA - gel de agarose,
• Comparação do tamanho e da intensidade das bandas do DNA com bandas de DNA
do fago λ - 10ng/µL.
Marcador molecular: microsatélite
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CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR
• Construção da biblioteca enriquecida com locos SSR,
• Protocolo descrito por Billotte et al. (1999) com modificações;
• primers obtidos - seqüenciados, desenhados (Centro de Citricultura -
Cordeirópolis) e sintetizados (Imprint do Brasil).
• Otimização das condições de amplificação dos primers - série de amplificações com a Taq
polimerase,
• temperatura de reassociação (48º - 54ºC);
• concentração de MgCl2 (0,375 – 1,5µL);
• DNA (2,5 - 5,0µL);
• primers (1,0 - 4,0µL).
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AVALIAÇÃO DOS LOCOS
• Programa Micro-Checker
• freqüência de alelos nulos,
• amplificação preferencial de alelos menores
• possíveis erros de genotipagem devido à presença de bandas
fantasmas (bandas duplicadas);
• Freqüências alélicas e genotípicas Teste exato de Fisher
• aderência às proporções de Equilíbrio de Hardy-Weinberg;
• Desequilíbrio genotípico entre pares de locos desequilíbrio de ligação;
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DIVERSIDADE GENÉTICA
• Freqüências alélicas FSTAT,
• Diversidade genética GDA,
• número médio de alelos (A),
• heterozigozidades esperada (He) e observada (Ho),
• índice de fixação;
• taxa de cruzamento aparente.
ESTRUTURA GENÉTICA
• Variâncias das freqüências alélicas estatísticas F
• índice médio de fixação dentro das populações – f,
• índice de fixação total das populações – F
• divergência genética entre populações – θp
• parâmetro Rst
• fluxo gênico aparente (Nm) entre populações
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RESULTADOS
Populações nativas : substâncias majoritárias
.
M eO OM eO O
cinamato de metila
OH
H
cedr-8(15)-em-9-alfa-ol
H
H
H
H
trans-cariofileno
E E
E
-humuleno
E E
E
E E
E
-humuleno
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Componentes majoritários (%) dos óleos essenciais das populações nativas de Lavras(Antena e Poço Bonito) e de Carrancas (Estrada Real e Estrada Real 1), Minas Gerais.
Populações nativas
Antena x Estrada Real x Poço Bonito
10,24
61,07
81,95
75,55
8,71
12,16
15,7 4,61
3,39
15,89 12,3
6,16
0,79
0,79
25,22
1,9
0 20 40 60 80 100 120
Antena
Estrada Real
Poço Bonito
Estrada Real 1
trans-cinamato de metila trans-cariofileno alfa-humuleno
sesquiterpeno oxigenado 1 sesquiterpeno oxigenado 4 cedr-8(15)-em-9-alfa-ol
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(14,
37%
)
◊ Antena ◊ Poço Bonito◊ Estrada Real◊ Antena ◊ Poço Bonito◊ Estrada Real (57,27%)
B
A
(14,
37%
)
◊ Antena ◊ Poço Bonito◊ Estrada Real◊ Antena ◊ Poço Bonito◊ Estrada Real (57,27%)
(14,
37%
)
◊ Antena ◊ Poço Bonito◊ Estrada Real◊ Antena ◊ Poço Bonito◊ Estrada Real (57,27%)
B
A
Populações nativas
Análise de componentes principais (ACP) para os indivíduosnativos genotipados nas populações de Lychnophora pinaster.
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Porcentagem relativa média (%) dos principais componentes do óleoessencial de folhas de L. pinaster, oriundas de Antena, município deLavras (MG), e cultivadas em Botucatu (SP).
Populações cultivadas
Antena
41,77 57,05 12,46
5,35
1,35
19,06
63,48
2,41
0,71
9,11
3,56
12,26
0,9
0,93
2,07
27,85
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
trans-cinamato de metila
trans-cariofileno
alfa-humuleno
cedr-8(15)-em-9-alfa-ol
Verão Outono Inverno Nativa
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Porcentagem relativa média (%) dos principais componentes do óleo essencial defolhas de L. pinaster, oriundas de Estrada Real, município de Carrancas (MG), ecultivadas em Botucatu (SP).
Populações cultivadas
Estrada Real
40,19
20,14
59,09
28,91
8,16
55,27
18,25
5,00
46,02
5,86
14,37
4,16
0 50 100 150 200 250
trans-cinamato de
metila
trans-cariofileno
alfa-humuleno
Verão Outono Inverno Nativa
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Porcentagem relativa média (%) dos principais componentes do óleo essencialde folhas de L. pinaster, oriundas de Estrada Real 1, município de Carrancas(MG), e cultivadas em Botucatu (SP).
Populações cultivadas
Estrada Real 1
16,82
4,86
43,49
14,50
4,16
59,45
14,41
4,11
59,37 77,01
14,52
4,33
0 50 100 150 200 250 300
trans-cinamato de
metila
trans-cariofileno
alfa-humuleno
Verão Outono Inverno Nativa
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Porcentagem relativa média (%) dos principais componentes do óleo essencial defolhas de L. pinaster, oriundas de Poço Bonito, município de Lavras (MG), ecultivadas em Botucatu (SP).
Populações cultivadas
Poço Bonito
63,07 68,18 72,44 79,74
16,51
5,09
14,44
4,45
13,07
4,07
14,78
4,13
0 50 100 150 200 250 300
trans-cinamato de
metila
trans-cariofileno
alfa-humuleno
Verão Outono Inverno Nativa
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Padrão de divergência genética entre as três populações de L. pinasterdefinido pelo agrupamento UPGMA, a partir das distânciasgenéticas de Nei (1972). Correlação cofenética igual0,96% (1000 reamostragens bootstrap para porcentagemde consistência dos nós).
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA
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Variabilidade genética: as populações podem ser agrupadas em 2 grupos:Poço Bonito (grupo 1) e Antena e Estrada Real 1 e 2 (grupo 2).
As populações apresentaram uma porcentagem de endogamia, compequena taxa de autofecundação e com uma alta taxa de cruzamento,sugerindo um sistema de reprodução misto, com tendência a alogamia.
A maior variabilidade genética ocorre dentro das populações, enquantoque 9,43% de diversidade entre as populações, sendo considerada umadivergência intermediária.
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA
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CONCLUSÃO
Populações nativas: perfil químico dos óleos essenciais divide-se em 2grupos
-Grupo 1: populações Estrada Real, Estrada Real 1 e Poço Bonito, principalconstituinte o trans-cinamato de metila.
-Grupo 2: população Antena, principal substância o cedr-8(15)-en-9-alfa-ol .
A população de Antena cultivada em Botucatu apresentou divergência nacomposição química em relação a região de origem .
Houve influência da época de colheita na proporção relativa doscomponentes mais abundantes no óleo essencial das populações cultivadas.
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AGRADECIMENTOS
Comissão Organizadora do XVI MET
Dra. Vera Quecini – Embrapa Uva e Vinho
Dra Maria Imaculada Zucchi - APTA Polo Regional Centro SulDr. Carlos A. Colombo - IACDra. Lenita Lima Haber –IACDra. Roselaine Facanali – IAC
Maria A. R. Vieira –IAC/FCA-UNESPMônica Tiho Chisaki –IAC/FCA-UNESP