Maria Teresa S.Craveiro Martins de AlmeidaDepartamento de Biologia
Preparação de Amostras Biológicaspara análise por MEV
Centro de Biologia Molecular e Ambiental Centre of Molecular and Environmental Biology
WORKSHOP - Caracterização Avançada de MateriaisPreparação de amostras para análise por MEV - 12 de Julho, 2011
• 1. Utilidade em Biologia
• 2. Aplicações - tipos de material
• 3. Um exemplo concreto
• 4. Fases de preparação para MEV
• 5. Secagem pelo ponto crítico do CO2
• 6. Alguns resultados
WORKSHOP - Preparação de amostras biológicas para análise por MEV
Sumário
• Estudo da superfície externa(análise mais pormenorizada da topografia; demonstação de situações ou fenómenos fisiológicos)
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1. Utilidade em Biologia
Caracterização(não apenas para fins taxonómicos)
• Organismos (unicelulares; pluricelulares)
• Células isoladas (ex. macrófagos)
• Estruturas de organismos
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2. Aplicações em Biologia
WORKSHOP - Preparação de amostras biológicas para análise por MEV
Importante:
- Conhecimento da amostra (tipo, natureza, dimensão)
- Definição dos objectivos da observação/análise
- Conhecimento dos métodos de preparação disponíveis e da sua adequação ao material em estudo
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50 µm
• Algumas estruturas de organismos, secas (desidratadas) ou queratinizadas, não necessitam de tratamento prévio particular
Porção de olho composto de díptero Extremidade da pata de um insecto
Cabelo liso Cabelo frisado - encaracola
www.ppws.vt.edu/~sforza/ nema/wire_rkn1.jpg
Estiletewww.invasive.org/ images/192x128/1356037.jpg
WORKSHOP - Preparação de amostras biológicas para análise por MEV
Estiletes extraídos manualmente de nemátodes, sob o microscópio invertido,: Meloidogyne spp. e Trichodorus spp.
WORKSHOP - Preparação de amostras biológicas para análise por MEV
Estrutura superficial da levedura Saccharomyces cerevisiae
Levedura patogénica - Candida albicans
Alguns exemplos de aplicação da MEV na observação de materiaisbiológicos
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Biofilme de Candida albicans - estirpe BPW17
Ferreira, C., Silva, S., Ferreira-Oliveira, F., Pinho, E., Henriques M. & Lucas, C. 2010. Candida albicans virulence and drug-resistance requires the O-acyltransferase Gup1p. BMC Microbiol. 10: 238.
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Wt
gup1!
20 µm
Ferreira, C., Silva, S., Ferreira-Oliveira, F., Pinho, E., Henriques M. & Lucas, C. 2010. Candida albicans virulence and drug-resistance requires the O-acyltransferase Gup1p. BMC Microbiol. 10: 238.
Diferenciação do crescimento da levedura Candida albicans - estirpe selvagem e mutante
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Fig. 3. Wall morphology of the Scgup1 mutant. Scanning electron micrographs showing the morphology of the cell surface of the W303-1a (columns 1 and 2) and the gup1 mutant (columns 3 and 4). Cells were grown to exponential phase in YPD at 30°C and 37°C, YPD supplemented with 1M NaCl, and YPD subsequently treated with lyticase for 30min or with Zymolyase for 5 min at 37°C. Bar = 2 mm.
Ferreira, C., Silva, S, van Voorst F., Aguiar, C., Kielland-Brandt, M.C., Brandt, A. & Lucas, C, 2006. Absence of Gup1p in Saccharomyces cerevisiae results in defective cell wall composition, assembly, stability and morphology. FEMS Yeast Res. 6: 1027–1038.
• Caracterização de nemátodes
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3. Outra aplicação particular
Nemátodes
http://soils.usda.gov/education/facts/hands.jpg
Espécies conhecidas (descritas): ± 30 000
100 000 - 1 milhão de espécies
milhares de nemátodes
Os animais mais abundantes do planeta
Estimativa: (De Ley & Blaxter, 2002; Blumenthal & Davis, 2004)
Nemátodes Fitoparasitas (parasitas das plantas)
Nemátodes
- Responsáveis por 13% das perdas agrícolas e florestais,
ao nível mundial (US$ 100 mil milhões, anualmente)
- Grupo de animais muito numeroso e abundante
- Distribuição mundial: ampla - Diversidade de habitats: marinho, água doce e terrestre
naturlink.sapo.pt/ ResourcesUser/Agricultura%2...
Nemátode-da-madeira do pinheiro - Bursaphelenchus xilophilus
Alguns exemplos de prejuízos causados em culturas, devidos a nemátodes fitoparasitas
Danos provocados por Trichodorus primitivus num campo cultivado com beterraba sacarina, à esquerda (A. Steele)
(Fotografia: Society of Nematologists)
Efeitos nas plantas/culturas: danos/ prejuízos
- directos - nas raízes (durante o processo de alimentação)
- indirectos - transmissão de tobravírus (geralmente muito mais prejudiciais)
- ectoparasitas
- vectores de vírus
NemátodesTrichodoridae
100 nm vírus
Controlo
Identificação correctadas espécies(Caracterização)
Caracterização morfológica das espéciesM.O.M.E.V.
Almeida, M.T.M. de, Santos, M.S.N. de A, Abrantes, I.M. de O. & Decraemer, W. (2005). Paratrichodorus divergens sp. n., a new potential virus vector of tobacco rattle virus and additional observations on P. hispanus Roca & Arias, 1986 from Portugal (Nematoda: Trichodoridae). Nematology. 7 (3): 343-361.
Almeida, M.T.M., 1993
Maximum Likelihood treeshowing relationships amongTrichodorus and Paratrichodorusspecies inferred from rDNA 18S
region.
99
100P. minor - Pt
P. minor - Gr
T. primitivus - Sct
T. primitivus - Pt
T. lusitanicus - Pt
T. emarginatus - Pt
T. spatulatus - Pt
T. beirensis - Pt
P. teres - Gr
P. allius - USA
P. pachydermus - Sct
Paratrichodorus sp. A - Pt
P. hispanus - Pt
P. divergens - Pt
0.1
77
77
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89
83
89
Clusters
P. anemones - Engl
Prismatolaimus intermedius
I – AP. minor
I – BT. primitivus
I – CT. beirensisT. lusitanicusT. emarginatusT. spatulatus
II – A
P. porosusP. alliusP. teres
II – B
P. anemonesP. divergensP. hispanusP. pachydermusParatrichodorus sp. A
P. porosus - Pt
99
100P. minor - Pt
P. minor - Gr
T. primitivus - Sct
T. primitivus - Pt
T. lusitanicus - Pt
T. emarginatus - Pt
T. spatulatus - Pt
T. beirensis - Pt
P. teres - Gr
P. allius - USA
P. pachydermus - Sct
Paratrichodorus sp. A - Pt
P. hispanus - Pt
P. divergens - Pt
0.1
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77
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100P. minor - Pt
P. minor - Gr
T. primitivus - Sct
T. primitivus - Pt
T. lusitanicus - Pt
T. emarginatus - Pt
T. spatulatus - Pt
T. beirensis - Pt
P. teres - Gr
P. allius - USA
P. pachydermus - Sct
Paratrichodorus sp. A - Pt
P. hispanus - Pt
P. divergens - Pt
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77
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Clusters
P. anemones - Engl
Prismatolaimus intermedius
I – AP. minor
I – BT. primitivus
I – CT. beirensisT. lusitanicusT. emarginatusT. spatulatus
II – A
P. porosusP. alliusP. teres
II – B
P. anemonesP. divergensP. hispanusP. pachydermusParatrichodorus sp. A
P. porosus - Pt
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100P. minor - Pt
P. minor - Gr
T. primitivus - Sct
T. primitivus - Pt
T. lusitanicus - Pt
T. emarginatus - Pt
T. spatulatus - Pt
T. beirensis - Pt
P. teres - Gr
P. allius - USA
P. pachydermus - Sct
Paratrichodorus sp. A - Pt
P. hispanus - Pt
P. divergens - Pt
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Clusters
P. anemones - Engl
Prismatolaimus intermedius
I – AP. minor
I – BT. primitivus
I – CT. beirensisT. lusitanicusT. emarginatusT. spatulatus
II – A
P. porosusP. alliusP. teres
II – B
P. anemonesP. divergensP. hispanusP. pachydermusParatrichodorus sp. A
P. porosus - Pt
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100P. minor - Pt
P. minor - Gr
T. primitivus - Sct
T. primitivus - Pt
T. lusitanicus - Pt
T. emarginatus - Pt
T. spatulatus - Pt
T. beirensis - Pt
P. teres - Gr
P. allius - USA
P. pachydermus - Sct
Paratrichodorus sp. A - Pt
P. hispanus - Pt
P. divergens - Pt
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77
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100P. minor - Pt
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T. lusitanicus - Pt
T. emarginatus - Pt
T. spatulatus - Pt
T. beirensis - Pt
P. teres - Gr
P. allius - USA
P. pachydermus - Sct
Paratrichodorus sp. A - Pt
P. hispanus - Pt
P. divergens - Pt
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P. anemones - Engl
Prismatolaimus intermedius
I – AP. minor
I – BT. primitivus
I – CT. beirensisT. lusitanicusT. emarginatusT. spatulatus
II – A
P. porosusP. alliusP. teres
II – B
P. anemonesP. divergensP. hispanusP. pachydermusParatrichodorus sp. A
P. porosus - Pt
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100P. minor - Pt
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T. lusitanicus - Pt
T. emarginatus - Pt
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T. beirensis - Pt
P. teres - Gr
P. allius - USA
P. pachydermus - Sct
Paratrichodorus sp. A - Pt
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P. divergens - Pt
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Prismatolaimus intermedius
I – AP. minor
I – BT. primitivus
I – CT. beirensisT. lusitanicusT. emarginatusT. spatulatus
II – A
P. porosusP. alliusP. teres
II – B
P. anemonesP. divergensP. hispanusP. pachydermusParatrichodorus sp. A
P. porosus - Pt
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100P. minor - Pt
P. minor - Gr
T. primitivus - Sct
T. primitivus - Pt
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T. beirensis - Pt
P. teres - Gr
P. allius - USA
P. pachydermus - Sct
Paratrichodorus sp. A - Pt
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P. teres - Gr
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P. pachydermus - Sct
Paratrichodorus sp. A - Pt
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P. anemones - Engl
Prismatolaimus intermedius
I – AP. minor
I – BT. primitivus
I – CT. beirensisT. lusitanicusT. emarginatusT. spatulatus
II – A
P. porosusP. alliusP. teres
II – B
P. anemonesP. divergensP. hispanusP. pachydermusParatrichodorus sp. A
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T. primitivus - Pt
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P. teres - Gr
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P. pachydermus - Sct
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Prismatolaimus intermedius
I – AP. minor
I – BT. primitivus
I – CT. beirensisT. lusitanicusT. emarginatusT. spatulatus
II – A
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II – B
P. anemonesP. divergensP. hispanusP. pachydermusParatrichodorus sp. A
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Paratrichodorus sp. A - Pt
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Prismatolaimus intermedius
I – AP. minor
I – BT. primitivus
I – CT. beirensisT. lusitanicusT. emarginatusT. spatulatus
II – A
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II – A
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II – B
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I – AP. minor
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II – A
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I – CT. beirensisT. lusitanicusT. emarginatusT. spatulatus
II – A
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Paratrichodorus sp. A - Pt
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0.1
77
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83
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Clusters
P. anemones - Engl
Prismatolaimus intermedius
I – AP. minor
I – BT. primitivus
I – CT. beirensisT. lusitanicusT. emarginatusT. spatulatus
II – A
P. porosusP. alliusP. teres
II – B
P. anemonesP. divergensP. hispanusP. pachydermusParatrichodorus sp. A
P. porosus - Pt
Clusters
II
I
Phylogenetic analysis of trichodorids
Duarte, 2006
Caracterização morfológica e molecular de espécies de nemátodes tricodorídeos
• Colheita do material biológico
• Isolamento do material no Laboratório
WORKSHOP - Preparação de amostras biológicas para análise por MEV WORKSHOP - Preparação de amostras biológicas para análise por MEV WORKSHOP - Preparação de amostras biológicas para análise por MEV
4. Fases da preparação - MEV
• Morte e fixação
• Desidratação
• Secagem
• Montagem
• Revestimento
• Observação/ análise
Preparação para MEV:
O sucesso do resultado final depende de todas as fases (e pormoneres) da preparação da amostra!
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Colheita do material biológico !"#$%&'()"
A colheita de nemátodes fitoparasitas pode ser morosa
Amostras de solo colhido na zona da rizosfera das plantas
Sobreiros - montado no Alentejo (projecto FCT em curso)
O isolamento dos nemátodes fitoparasitas vivos,do grupo taxonómico pretendido, ao microscópio, é um processo moroso; frequentemente a espécie pretendida está representada em números baixos - insuficientes.
Fixação - essencial para a preservação da integridade das estruturas biológicas sujeitas a desidratação posterior e vácuo
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• TAF (MO) - 48 h (pode ser conveniente)
• Glutaraldeído - a 2% (4-8 ºC, 48 h)
Lavagens: tampão de cacodilato de sódio 0.1 M
(Pode ser necessária a morte prévia, rápida, pelo calor)
• Tetróxido de ósmio a 2% (8-18 h, no escuro)
(malha de 5 μm)
Atenção: pH, tempos, concentrações, temperatura
Glutaraldeído(fixador potente de MEV)
Tetróxido de ósmio
Estabilizador proteico
Estabilizador lipídico e proteico;
(Pós-fixador)
aumenta o contraste
Fixação
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Equipamento para o processo de fixação de nemátodes para a MEV
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10 µm
Levedura Saccaromyces cerevisiae sujeita a fixação com glutaraldeído
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Efeito bem evidente na levedura Saccaromyces cerevisiae, não sujeita a fixação com glutaraldeído
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5 µm 5 µm
Efeito da fixação com glutaraldeído na preparação da bactéria Escherichia coli por MEV: A - não sujeita a fixação; sujeita à acção do fixador
A B
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Desidratação - indispensável para sujeitar o material ao vácuo
• série alcoólica* Vácuo
etanol a: 5, 10, 25, 50, 75, 95, 100 %100 % - 3 passagens
(15 minutos cada passagem)
(*ou com acetona)
• Aparelho - Secador
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5. Secagem pelo ponto crítico
• Agente: CO2*
Secagem
“Balzers”* ou Freon
• Procedimento
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1. Colocação dos espécimes na câmara
2. Arrecimento: 10 ºC
3. Lavagem (s) com CO2 (5-10 ciclos)
4. Aquecimento/ secagem (35-40 ºC)
Alguns materiais poderão oferecer mais dificuldade na questão do suporte para colocação na câmara- ex: células que crescem sobre um substracto
• Procedimento
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5. Evaporação
CO2 — 31º C; 73.8 bar Freon — 40º C; 39.8 bar
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3 µm
10 µm
Nemátodes tricodorídeos (MEV)
Superfície cuticular com numerosos detritos aderentes
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5 µm
Superfície cuticular de nemátode tricodorídeoperfeitamente livre de detritos/ partículas aderentes
Paratrichodorus porosus - fêmea
Acção da secagem pelo ponto crítico do CO2
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Montagem
1 mm
6. Manutenção do material para um excicador até ao revestimento - metalização.
exemplares (nemátodes)
fita-cola dupla, carbonadacabelo - suporte
exemplares (nemátodes)
suportemetálico
Fixação: sobre fita-cola dupla carbonada, numa lamela de vidro circular, ou directamente no suporte metálico
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Revestimento
Revestimento condutor - com ouro (ou ouro e platina)
Å
(Necessário, uma vez que o material biológico não é condutor)
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Análise/ Observação
Análise - observação
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Alguns Resultados
Sampaio, P. & Pais, C., 2008
10 µm
Acção de macrófagos sobre a levedura patogénica, Candida albicans - processo de reconhecimento e fagocitose.
WORKSHOP - Preparação de amostras biológicas para análise por MEV WORKSHOP - Preparação de amostras biológicas para análise por MEV
1 µm
1 µm
5 µm
(Almeida, M.T.M., 1993) (Almeida et al., 2005)Cauda de macho de Paratrichodorus divergens
Fêmea de Paratrichodorus sp.
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Miranda, S. & Almeida, M.T.M., 2011
Fêmea de Trichodorus sp.
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10 µm
Silva, L. & Almeida, M.T.M., 2006
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Pormenores cuticulares de fêmea e de macho deParatrichodorus sp. e Trichodorus sp.
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Miranda, S. & Almeida, M.T.M., 2011
Pormenores cuticulares da cauda de macho de Paratichodorus sp.
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Miranda, S. & Almeida, M.T.M., 2011
10 µm
Pormenores cuticulares da cauda de macho de Paratichodorus sp.
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Miranda, S. & Almeida, M.T.M., 2011
Cutícula de nemátode do género Trichodorus
Importância da análise da estrutura cuticular superficial de géneros de nemátodes da família Trichodoridae
Obrigada pela atenção