Cristalização de Proteinas
Glaucius OlivaInstituto de Física de São Carlos - USP
Centro de Biotecnologia Molecular Estrutural - CEPID/FAPESP
Passos na análise de cristais de proteínas por difração de raios-X• Cristalização• Coleta de dados de difração de raios-X• Resolução do problema das fases
Substituição isomórfica múltipla Substituição molecular MAD
• Interpretação dos mapas de densidade eletrônica
• Refinamento da Estrutura
Obtaining adequate protein single crystals is the major bottleneck in the process of elucidating a new structure.
Adequate crystals means:
• highly ordered
• diffraction to high resolution
• suitable size (~0.1mm or less)
Number of protein molecules in a typical protein crystal
Fatos históricos
Friedrich Ludwig Hünefeld
“I have occasionally seen in almost dried blood… rectangular crystalline structures which under the microscope had sharp edges and were bright red.”
(1840 – foi o 1º relator de um cristal proteico) John H. Northrop James B. Sumner Wendell M. Stanley
Cristalização proteica: Nobel em 1946
1a. Est. Crist. Biomolecular (B12; 1957): Nobel em 1964
Max Perutz John KendrewNobel em 1962. Hemoglobina/Mioglobina
122 anos!
Princípios da Cristalização de Proteínas:
1. Proteína pura e homogênea2. Solubilidade proteica e precipitação
• Contatos hidrofóbicos; salting in e salting out3. Supersaturação
• Nucleação4. Crescimento do cristal5. Qualidade cristalina
• padrão de difração e limite de resolução
Obtenção de Proteinas paraCristalização
• Obtenção de proteínas solúveis, puras (“graucristalização”) e na quantidade necessária(tipicamente multiplos de miligramas) é o gargalo inicial mais crítico para um projeto de cristalização de proteinas
• Purificação direta da fonte natural• Expressão heteróloga recombinante
Produção heteróloga de proteínas
‐ O que é?
Por que é importante produzir proteínas heterólogas?Proteína Pura e Homogênea
Fontes mais comuns de heterogeneidade
• Contaminadas por DNA ou proteínas não relacionadas• Oxidação das cisteínas• Modificações pós‐traducionais• Estados de oligomerização• Isoformas• População de moléculas mal enoveladas• Flexibilidade estrutural
Temperatura de expressão
77 kDa
50 kDa
98 kDa
Escolha do organismo
Outras proteínas de fusão Dicas de manipulação de proteínas paracristalização
• Mantenha‐a pura (> 90‐95% em PAGE) e concentrada (> 10 mg/ml)• Seja gentil com sua proteína:
– Evite a formação de espuma– Manter em gelo durante o trabalho com ela e armazená‐la corretamente, evitando ciclos de congelamento / descongelamento
– Filtro– Caracterize a pureza, homogeneidade e estabilidade da proteínapor PAGE, DLS e / ou MS
– Evite a liofilização– Evitar o uso de precipitação com sulfato de amônio como etapafinal de purificação
– Evite misturar proteinas de diferentes preparações
Protein crystal growth from
solution:
nucleation
growth
Mas o que significa cristalização?É um fenômeno de transição de fase!Proteína sai da solução para uma fase cristalina, através da indução de supersaturação (depende da solubilidade da proteína). Como?
• Adição de agente precipitante (batch)• Remoção de água (difusão de vapor)• Troca de solvente (diálise)• Difusão livre por uma interface• Mudança de pH• Combinaçao
Remover água da camada de solvatação Diagrama de Fase para a Solubilidade
Referência: Biomolecular Crystallography – Bernhard Rupp (Capítulo 3)
Parâmetros que afetam solubilidade proteica
• pH• Temperatura• Força iônica• Solventes orgânicos• Polímeros orgânicos
Dependência da solubilidade proteica em relação à alguns parâmetros ‐ pH
Dependência da solubilidade proteica em relação à alguns parâmetros ‐ pH
Dependência da solubilidade proteica em relação à alguns parâmetros ‐ Temperatura
• Temperature manipulates solubility and supersaturation of the sample– normal solubility: in low ionic strength solubility increases with
temperature– retrograde solubility: in high ionic strength solubility decreases with
temperature
• It is convenient to set up trials at different temperatures, e.g. 4°C and room temperature (RT)
• RT must be as controlled as possible.
• Attention to temperature changes during plate viewing!. In temperatures other than RT, minimize condensation.
Variables to force supersaturation: Temperature
Dependência da solubilidade proteica em relação à alguns parâmetros ‐ Sais
Forca ionica =
Log(S) = β – Ks(I)
Dependência da solubilidade proteica em relação à alguns parâmetros – Polímeros Orgânicos (PEGs)
Log(S) = β – KscPEG• Não existe pegging in• Competição pelas
moléculas de água
Nucleação e Crescimento
A colisão entre moléculas podem induzir a formação de agregados cristalinos
Distâ
ncia (Å)
supersaturação
Taman
ho m
édio da a
gregação
Nucleação crítica
Metaestável zona de nucleação
Crescimento cooperativo
Separação (centro)
Separação média
Diâmetro molecular médio de 40 Å
A formação de uma massa crítica que permita o crescimento cristalino
Concentração de lisozima (mg/mL)
O processo de cristalização procede em duas fases: Nucleação e Crescimento
Termodinâmica da Cristalização
Métodos de CristalizaçãoDifusão de vapor: gota sentada
[ppt]gota = [ppt]reservatório2
A concentração no reservatório mantem‐se praticamente a mesma
[ppt]gota = [ppt]reservatório
Reservatório
Reservatório
O equilíbrio acontece com a difusão de vapor
O volume da gota diminui, aumentando a concentração de ambos precipitante e proteína
Gota contém: proteína + sol. reservatório + aditivos + ligantes + etc...
Reservatório contém: agente precipitante + solução tamponante + aditivos, etc...
Proteína + sol. reservatório: normalmente 1:1, 2:1 e 1:2
§
§ Exceção para os precipitantes voláteis
Ao final do processo (na gota):a) Aumento na [ppt]b) Aumento na [proteína]
Energia de ativação para vencer a barreira da nucleação
Equilíbrio da solução
Na maioria das vezes é um processo rápido horas dias (3 a 5)
Independente do precipitante, o processo inicia‐se rapidamente e desacelera de acordo com a diferença de concentração de precipitante entre a gota e o reservatório
O equilíbrio é dependente da temperatura
Tempo (horas)
% eq
uilíb
rio
Dados experimentais+ 4˚C∆ 25˚C
Adaptado de Fowlis et al 1988. J. Cryst. Growth 90:117.
O equilíbrio cessa no momento em que a pressão osmótica das duas soluções se igualam
Diagrama de Cristalização para Difusão de Vapor
Diagrama de Cristalização para Difusão de Vapor
Crystallization strategies: how to optimize crystallization trials
•Sparse Matrix (“random”)Biased samplings of crystallization parameters selected
from literature
•Grid ScreensOne or two parameters systematically varied
•Incomplete factorialsall parameters varied simultaneously and randomly
statistically balanced
Exemplo do espaço 3D de Cristalização Matriz Esparsa
• Condições de cristalização são baseadas em um número limitado de soluções e agentes precipitantes (screens), escolhidos de acordo relatos científicos de sucesso na cristalização de macromoléculas
• Muitos diferentes tipos de screens são disponíveis no mercado
• Os screens cobrem uma vasta gama de soluções tamponantes, pH, aditibos e agentes precipitantes
• Nota: screenis do tipo “matrizes esparsas” envolvem uma aleatoriedade intencional no tocante às possíveis combinações de condições que funcionaram anteriormente
JBScreen FamilyJBScreen Classic The JBScreen Classic Kits 1‐10 cover 240 (10 kits x 24 conditions each) of the most prominent conditions for protein crystallization. Their compositions result from mining of literature data of several thousands of crystallized proteins. JBScreen represents the selected statistically most successful buffers that yielded protein crystals suitable for X‐ray diffraction.BScreen Basic Based on the classic sparse matrix crystallization screen published first by Jancarik and Kim in 1991, it contains 96 unique reagent mixtures for screening a wide range of pH and various salts and precipitants. JBScreen Membrane The optimized screen for hydrophobic and membrane proteinsJBScreen Kinase A highly effective crystallization screen based on data analyses of published kinase structuresJBScreen Nuc‐Pro A highly effective sparse matrix screen based upon extensive screening of the PDB, with focus on entries by structural genomic initiatives, the BMCD and other protocols.JBScreen PEG/Salt Efficient screening of PEG 3350 and PEG 5000 MME versus 48 different saltsJBScreen PentaerythritolA systematic crystallization screen based on pentaerythritol polymers as precipitants developed by Ulrike Demmer from the Max‐Planck‐Institute for Biophysics in Frankfurt.JBScreen PACT ++ Systematic screen for pH, anion, cation testing in the presence of polyehtylene glycolJBScreen JCSG ++ Optimized sparse matrix screen developed by the Joint Center for Structural Genomics (JCSG)Pi‐Screens Developed at the MRC Cambridge ‐ Crystallization Screens for soluble and integral membrane proteins based on Pi sampling strategyJBScreen Wizard A highly effective random sparse matrix screen for crystallizing proteins, peptides, nucleic acids and macromolecular complexes
Otimização da Condição de Cristalização
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Sal contra PEG screen
Sal contra PEG screenpH contra PEG screen
pH contra PEG screen