Mutações
INSTABILIDADE DO GENOMA HUMANO REPARO DO DNA
Genética Humana Profa. Dra. Ana Elizabete Silva
SOBREVIVÊNCIA E REPRODUÇÃO ESTABILIDADEGENÉTICA
REPLICAÇÃO PRECISA DO DNA
REPARO DO DNA
Aberrações cromossômicas: mudança no genoma
Mutações no DNA: doenças genéticas (câncer)
Falhas
MUTAÇÃO: qualquer mudança na sequência de nucleotídeos ou
arranjo do DNA
Células germinativas: Mutação herdável
Células somáticas: Mutação somática
•Mutações genômicas: numéricas (aneuploidias)
•Mutações cromossômicas: estruturais
•Mutações gênicas: mutação de ponto
OVOCITOGÊNESE: ovócitos formados até 5o mês: número de divisões celulares do zigoto até oócito fertilizado constante: 24-31 divisões → erro de não-disjunção com aumento da idade (aneuploidias)
ESPERMATOGÊNESE: 30-31 divisões celulares até puberdade + 5 div. p/espermatogênese (23 ciclos/ano): centenas de divisões celulares dependendo da idade: 30+5[23x(25-13)]= 310 divisões
•divisões celulares contínuas → risco maior de erros de replicação do DNA → 1/10 espermatozóide → mutação deletéria nova
Exemplos: Neurofibromatose
Acondroplasia
Hemofilia B
(avô materno: fonte da mutação nova)
MUTAÇÕES – LINHAGEM GERMINATIVA
BASE MOLECULAR DAS BASE MOLECULAR DAS MUTAÇÕES GÊNICASMUTAÇÕES GÊNICAS
Mutações Mutações espontâneasespontâneas
Mutações Mutações induzidasinduzidas
Agente Agente mutagênmutagên
icoico
naturnaturaisais
MUTAÇÃO ESPONTÂNEA
ausência de um tratamento com mutágeno: fonte de variação genética
Frequência baixa: uma célula em 105 a 108
Mecanismos:erros na replicação do DNA lesões espontâneas: depurinação, desaminação
e danos oxidativos (radicais superóxido-O2;
peróxido de hidrogênio- H2O2; radicais hidroxila-OH)
elementos genéticos de transposição
•PERDA DE BASES:
Depurinação: 5.000 bases púricas (A e G)/dia/célula
Desaminação: 100 bases C >U/dia/célula
•REPLICAÇÃO: DNA pol: 1 base errada na cadeia filha/10 milhões pb
•REVISÃO DE PROVA “PROOFREADING”: corrige 99,9% dos erros de replicação
•TAXA DE MUTAÇÃO (erros de replicação): muito baixa 10-10 por pb/divisão
•GENOMA DIPLÓIDE HUMANO: ~ 6x109 pb do DNA → menos 1 mutação de pb/divisão
LESÕES ESPONTÂNEAS: ERROS DE REPLICAÇÃO DO DNA
PREVENÇÃO DE ERROS
Alguns sistemas enzimáticos neutralizam compostos potencialmente danosos, antes que reajam com o DNA
Exemplos: desintoxicação de radicais superóxido produzidos durante os danos oxidativos
a- Enzima superóxido dismutase catalisa a conversão dos radicais superóxido peróxido de hidrogênio
b- Enzima catalase converte peróxido de hidrogênio em água
MUTAÇÕES INDUZIDAS
Agentes químicos:
•Análogos de bases: 5-BrdU
•Alcilantes: EMS
•Intercalantes: acridina orange
Agentes físicos:
•Radiação UV
•Radiação ionizante: raios X, gama
Agentes biológicos:
•Vírus mutação insercional
RADIAÇÃO ULTRAVIOLETA
Absorção da luz UV
Estado excitado de uma
base púrica ou pirimídica
Ligação covalente entre
duas pirimidinas adjacentes
Anel ciclobutano: dímeros de timina (TT)
mais estável dímeros menos estáveis: CT,
CC, TU e UU
1. Substituição de Bases: Mutação de Ponto
Mutação de sentido trocado (missense)
Mutação sem sentido (nonsense)
Mutação de processamento de RNA:destroem sítios consenso de corte; cap, poliadenilação, criam sítios crípticos: códons finalizadores e mudança de matriz de leitura (frameshift)
Mutações reguladoras: afetam a ligação de fator de transcrição e controle transcricional
TIPOS DE MUTAÇÕES: DOENÇAS GENÉTICAS HUMANAS
2. Deleções/Inserções:
Adição/deleção: pouco no. bases
Deleções maiores: Distrofina
Inserção L1 ou Alu: hemofilia A (L1); neurofibromatose (Alu)
Deleção/Duplicação (recombinação)
Crossing-over desigual
Expansão trinucleotídeos repetidos
Repetição CAG: D. Huntington
Repetição CGG: S. do X frágil
TIPOS DE MUTAÇÕES: DOENÇAS GENÉTICAS HUMANAS
POLIMORFISMO X MUTAÇÃO
POLIMORFISMO: variações no DNA
•ocorrência de dois ou mais alelos relativamente comuns para um único lócus.•Variação do DNA na qual cada sequência possível está presente em pelo menos 1% da população.•Ocorre comumente e está associado a um fenótipo normal.
Polimorfismo em sequência codificadora (5% DNA): variante protéica → fenótipos distintos
Polimorfismos de proteínas:
•Grupos sanguíneos ABO e RH
•Sistema de alfa1-antitripsina (1-AT): doença pulmonar, vários alelos (frequência de 10-75%)
•Proteínas de destoxificação de xenobióticos: CYP, GST, NAT
•Proteínas de reparo do DNA: XPD, XRCC1, XRCC2, XRCC3
Polimorfismo em sequência não-codificadora (95% DNA): intergênica ou dentro de íntrons →
ESTIMATIVA DE BASES POLIMÓRFICAS: 1:1000 pb
sem consequência para o funcionamento do gene
sem alterar proteínas
POLIMORFISMOS GENÉTICOS
RFLP SNP SSLP
Minissatélite
VNTR
Microssatélite
STR
TIPOS DE POLIMORFISMOS GENÉTICOS
•Utilização como marcador genético: análise de ligação
•Diagnóstico pré-natal de doenças genéticas
•Detecção de portador heterozigoto
•Avaliação de pessoas com risco de predisposição a doenças complexas: câncer, doenças coronarianas e diabete
•Teste de paternidade e aplicações forenses
•Tipagem tissular para transplante de órgão
RFLP: Polimorfismos de Comprimento de Fragmentos de Restrição
•Alelos 1 e 2: diferentes polimorfismos alteram sítios de restrição
Alelo 1: sítio R (cortado pela enzima restrição)
Alelo 2: nucleotídeo X perda R (sem corte)
•Amplificação (PCR):
primers que flanqueiam o sítio de restrição
Digestão do produto de PCR com enzima R
•Eletroforese: gel de agarose
POLIMORFISMO DE COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA SIMPLES (SSLP):
- arranjos de sequências repetidas com variação no comprimento devido diferentes números de unidades repetidas (multi-alélicos).
MINISSATÉLITES (VNTR): Número Variável de Repetições em Tandem
-unidades repetidas de DNA com 10-100 pb (30pb),
MICROSSATÉLITES (STR): Repetições em Tandem Curtas
• unidades repetidas de 2-4 pb
MINISSATÉLITES (VNTR): unidades repetidas de DNA com 10-100 pb (30pb), resultam de inserção em tandem. Encontrados preferencialmente nas regiões teloméricas (geralmente não transcritas) → sítio p/ recombinação homóloga.
Utilizados como marcadores polimórficos: datiloscopia de DNA (DNA fingerprinting)
http://www.fathom.com/course/21701758/session1.html
http://www.usask.ca/biology/rank/316/genomics/genomics.htm
Formação de unidades repetitivas
http://www.scq.ubc.ca/?p=250
Família com filhos biológicos e adotivos: Teste de Paternidade
Filha D2: o pai é de casamento anterior
Filho S2: adotado
Vítima de abuso sexual:
suspeitos 1 e 2 comparados com DNA do esperma encontrado na vítima
MICROSSATÉLITES (STR):
•unidades repetidas de 2-4 pb:
CACA...CA;
CAACAA...CAA;
AAATAAAT...AAAT.
• Existem 6,5x105 microssatélites no genoma humano.
•Lócus de microssatélite é multi-alélico: cada pessoa deve ser heterozigota em mais de 70%
•Espalhados por todo o genomaUtilizados como marcadores polimórficos: datiloscopia de
DNAhttp://www.usask.ca/biology/rank/316/genomics/genomics.htm
Doença Ligada ao X (recombinação=0)
Diagnóstico de Doença Genética
POLIMORFISMO DE NUCLEOTÍDEO ÚNICO – SNP:
•Mudanças de um único nucleotídeo distribuídas por todo o genoma.
•Aproximadamente 1:1350 pb no genoma
•Cerca de 1.42 milhões de SNPs no genoma
•Polimorfismos com dois alelos
•Aplicações: marcadores de mapeamento genético; antropologia molecular (evolução) e comparação entre diferentes populações (epidemiologia molecular)
•Detecção: Chips de DNA (hibridização de nucleotídeos)
REPARO DO DNAREPARO DO DNA
Reparar danos no DNA surgidos Reparar danos no DNA surgidos espontaneamente ou induzidos por espontaneamente ou induzidos por mutágenosmutágenos
• Reparo de pareamento errôneoReparo de pareamento errôneo
• Reparo diretoReparo direto
• Reparo de excisão de basesReparo de excisão de bases
•Reparo de excisão de nucleotídeosReparo de excisão de nucleotídeos
• Reparo de quebras de fita dupla no Reparo de quebras de fita dupla no DNA DNA
LESÕES RETARDAM PROGRESSÃO DO CICLO CELULAR
Danos DNA
Bloqueio do
ciclo celular
(Checkpoint)
Reparo do DNA
Apoptose
Proteína ATMIdentifica lesão no DNA
Sinal p/ p53 → Ativar Genes Reparo DNA
• reparo pós-replicação: bases incorporadas erroneamente no DNA durante a replicação (DNA pol: 1 base errada na cadeia filha/10 milhões pb)REVISÃO DE PROVA “PROOFREADING”: corrige 99,9% dos erros de replicação
• eliminação de bases mal pareadas e alças de deleção/inserção• atua na cadeia recém-sintetizada
•genes MSH, MLH e PMSDeslizamentos da DNA Deslizamentos da DNA polimerase: regiões de polimerase: regiões de microssatélitemicrossatélite
REPARO DE PAREAMENTO ERRÔNEO REPARO DE PAREAMENTO ERRÔNEO
MISMATCH REPAIR - MMRMISMATCH REPAIR - MMR
Câncer de cólon não-poliposo Câncer de cólon não-poliposo familial: familial: instabilidade de instabilidade de microssatélitesmicrossatélites-70 a 85% de risco70 a 85% de risco- mutações em mutações em MLH1 e MLH2MLH1 e MLH2 são são mais comunsmais comuns
REPARO DE PAREAMENTO ERRÔNEOREPARO DE PAREAMENTO ERRÔNEO
GG
AA
5’ 3’
Cadeia filhaCadeia filha
Cadeia Cadeia parentalparental
Base errada
MSH3
Reconhecimento Reconhecimento do dano e corte do dano e corte na cadeia filhana cadeia filha
GG
AAMSH2MSH2
MSH6
AA
GG Excisão de Excisão de fragmento de 100 fragmento de 100
a 1000pb a 1000pb contendo a base contendo a base
incorretaincorreta
Fita reparadaFita reparadaTT
AA
MLH2 PMS2
Síntese de DNA e Síntese de DNA e ligação da fita ligação da fita reparadareparada
AA
DNA pol DNA pol //
DNA ligase
Reconhecimento do dano e corteReconhecimento do dano e corte na cadeia filha na cadeia filha
• reversão ativa da lesão → sem retirar a reversão ativa da lesão → sem retirar a base danificadabase danificada
• OO66-metilguanina -metilguanina → transição G:C para A:T→ transição G:C para A:T (produzida endogenamente ou mutagênicos (produzida endogenamente ou mutagênicos químicos)químicos)
•Enzima MGMT (metil guanina metiltransferase)Enzima MGMT (metil guanina metiltransferase) → → remove o grupo metilremove o grupo metil
• alto custo energético → uma molécula alto custo energético → uma molécula da enzima é inativada para cada lesão da enzima é inativada para cada lesão corrigidacorrigida
REPARO DIRETOREPARO DIRETO
REPARO DIRETOREPARO DIRETO
GG
CC
Agente Agente alquilaalquilantente
GG
CC
CHCH33
O6-Metilguanina
GG
CC
MGMMGMTT
CHCH33
DNA DNA restaurado e restaurado e
enzima enzima inativainativa
GG
CC
CHCH33Reconhecimento Reconhecimento
da base alterada e da base alterada e transferência do transferência do grupo metil para grupo metil para
resíduo de resíduo de cisteína da MGMTcisteína da MGMT
Reparo Reparo DiretoDireto
MGMMGMTT
ETAPAS COMUNS
etapa 1 = incisão (endonuclease) e excisão (exonuclease)
etapa 2 = ressíntese do DNA (DNA polimerases β, δ, ε)
etapa 3 = ligação das extremidades (DNA ligases)
REPAROS DE EXCISÃO
REPARO POR EXCISÃO DE REPARO POR EXCISÃO DE BASES - BERBASES - BER
• reparo de danos causados por agentes endógenos (hidrólises, oxigênio reativo) que modificam a estrutura das bases
• reparo de danos induzidos por radiação ionizante e agentes alcilantes
• rrealizado pelas DNA glicosilases quebram ligações base-açúcar liberando as bases e gerando sítios apurínicos ou apirimidínicos (sítios AP) reparado por endonucleases específica
•cada DNA glicosilase reconhece uma base alterada no DNA e catalisa sua remoção por hidrólise
•Etapas: remoção da base danificada (DNA glicosilase) sítio AP incisão do sítio AP (endonuclease) excisão e remoção gerando lacuna síntese DNA (DNA polimerase) ligação da cadeia (DNA ligase)
REPARO POR EXCISÃO DE REPARO POR EXCISÃO DE BASES - BERBASES - BER
*
Base danificada
DNA DNA glicosilasglicosilas
ee
ReconhecimenReconhecimento e formação to e formação
do sítio APdo sítio AP
APE1
ReconhecimenReconhecimento e incisão 5’ to e incisão 5’
do sítio APdo sítio AP
XRCCXRCC11
DNA DNA polpol
Excisão da Excisão da porção açúcar-porção açúcar-P e síntese de P e síntese de
DNADNA
XRCCXRCC11
DNA DNA ligase ligase
IIIIII
Ligação da Ligação da cadeiacadeia
Short-patch Short-patch
Quebra de cadeia simples
XRCCXRCC11
PARPPARPReconhecimReconhecim
ento da ento da quebraquebra
PNKPNK Incisão 5’Incisão 5’
PCNPCNAA
DNA polDNA pol
FENFEN11 Síntese Síntese
DNA e DNA e excisãoexcisão
DNA DNA ligase Iligase I
Long-patchLong-patch
Ligação Ligação da da
cadeiacadeia1 nucleotídeo
2-13 nucleotídeos
REPARO POR EXCISÃO DE REPARO POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS - NUCLEOTÍDEOS - NERNER
• remoção de adutos no DNA remoção de adutos no DNA distorção da distorção da dupla hélicedupla hélice
• dímeros de pirimidina, HAP, cisplatinadímeros de pirimidina, HAP, cisplatina
• fatores ambientaisfatores ambientais
• principal mecanismo de reparoprincipal mecanismo de reparo
• deficiência: doenças genéticasdeficiência: doenças genéticas
•realizado pelo complexo multienzimático XPA-XPG
• remove 24-32 nucleotídeos
Xeroderma Pigmentoso Xeroderma Pigmentoso
-Mutações em XPA-XPGMutações em XPA-XPG
- 1000 a 4000X o risco de câncer de pele 1000 a 4000X o risco de câncer de pele exposição solar ou irradiação UVexposição solar ou irradiação UV
Reparo por excisão de nucleotídeos (NER)
TFIIH: complexo da RNA pol II com atividade de helicase
ERCC1-XPF: endonuclease que corta a fita em 5’
XPG: endonuclease que corta a fita em 3’
DNA pol, PCNA, RPA e RFC: síntese da fita nova
Ligase
REPARO DE QUEBRAS NO DNA FITA REPARO DE QUEBRAS NO DNA FITA DUPLA DUPLA
• DSB (quebra fita dupla):DSB (quebra fita dupla): lesão espontânea lesão espontânea induzida por radicais de Oinduzida por radicais de O22 livres, replicação livres, replicação do DNA e agentes genotóxicos como a do DNA e agentes genotóxicos como a radiação ionizanteradiação ionizante
• causa de aberrações cromossômicascausa de aberrações cromossômicas
• Reparo homólogo (RH) Reparo homólogo (RH) pareamento com o cromossomo homólogo intacto
• Reparo de ligação das extremidades não- Reparo de ligação das extremidades não- homologa (NHEJ) homologa (NHEJ) religação direta das extremidades quebradas
REPARO HOMÓLOGOREPARO HOMÓLOGO
Radiação ionizante
CromátidCromátides irmãses irmãs
Quebra de Quebra de cadeia cadeia dupladupla
Degradação Degradação 5’-3’5’-3’Rad5Rad522
Rad
50 MRE1
1NBS1
BRCA1BRCA1 Rad54Rad54
Invasão Invasão da cadeiada cadeia
BRCABRCA22 Rad51Rad51
DNA DNA polpol
DNA DNA ligaseligase
Síntese de Síntese de DNA e ligação DNA e ligação das cadeiasdas cadeias
Reparo Reparo DNA com DNA com fidelidadefidelidade
d. Reparo posterior à d. Reparo posterior à duplicaçãoduplicação
por recombinação por recombinação semelhante à conversão semelhante à conversão gênicagênica
Uma das fitas vermelhas apresenta uma quebra
DNA polimerase desloca a fita
ligação dos fragmentos
duplicação posterior do DNA resulta em 3 alelos e 1 alelo
Resultado final: um alelo verde foi convertido em um vermelho
heteroduplex
ProcessamenProcessamento das to das
extremidadeextremidadess
LIGAÇÃO DAS EXTREMIDADES NÃO-LIGAÇÃO DAS EXTREMIDADES NÃO-HOMÓLOGASHOMÓLOGAS
DNA fita duplaDNA fita dupla
Agente Agente danificantedanificante
Quebra de cadeia Quebra de cadeia dupladupla
DNA DNA PKc1PKc1
KU80KU70
KU80KU70
XRCC4XRCC4
DNA ligase DNA ligase IVIV Ligação das Ligação das
extremidadextremidadeses
DNA reparado DNA reparado com baixa com baixa fidelidadefidelidade
http://www.sbbq.org.br/revista/mtdidaticos/Env.pdf
Xeroderma Pigmentoso
Síndrome de Cockaine
Tricotiodistrofia
Anemia de Fanconi
Ataxia telangiectasia
Síndrome de Bloom
SÍNDROMES DE INSTABILIDADE CROMOSSÔMICA
defeitos nos mecanismos de reparo e replicação do DNA
freqüência aberrações cromossômicas
incidência câncer
AR
Clínica
manifestações cutâneas (1,5 anos)
anomalias oculares (4 anos)
anomalias neurológicas (6 meses)
Xeroderma (pele seca)
Incidência:1/250.000 (USA); 1/40.000 (Japão)
Células XP: sensíveis a radiação UV indivíduos incapazes reparar dímeros TT: risco ↑ câncer de pele (2000x)
XP: defeito no reparo de excisão de nucleotídeos (NER)
XERODERMA PIGMENTOSO (XP)
grupos de complementação: XPA-XPG diferenças clínicas
defeitos enzimáticos incapacidade de excisar danos induzidos pela luz UV e mutagênicos químicos
diagnóstico exposição a luz solar
tratamento proteção da pele da luz solar
chapéus
óculos que absorvem luz UV
bloqueadores solares
roupas protetoras
acompanhamento periódico por dermatologista
AR
Clínica
anemia
alterações da pigmentação da pele (64%)
baixa estatura (62%)
malformações do rádio (50%)
anomalias oculares (41%), renais (34%),
microcefalia (37%), deficiência mental (25%)
90% anemia aplástica
ANEMIA DE FANCONI (FA)
incidência: 1/22.000 a 1/476.000 indivíduos
8 grupos de complementação: FANCA a FANCG (heterogeneidade genética)
células FA: sensíveis à agentes químicos que causam ligações cruzadas entre as fitas de DNA:
-mitomicina C (MMC), diepoxibutano (DEB), mostarda nitrogenada (NM), cisplatina , ...
freqüência de neoplasias: leucemias e tumores hepáticos
quebras cromossômicas espontâneas, figuras tri, quadri e multiradiais,
figuras radiais endorreduplicação
AR
Clínica
peso ao nascimento
retardo de crescimento pré e pós-natal
(145 cm H; 130 cm M)
telangiectasias e fotossensibilidade (borboleta)
cabeça alongada, microcefalia, inteligência normal
imunodeficiência: infecções (respiratórias e gastrointestinais)
SÍNDROME DE BLOOM (SB)
Incidência: 1/58.000 judeus
asquenazim
figuras quadrirradiais
mutações no gene BLM 15q26.1 DNA helicase ( RecQ) papel na replicação e reparo do DNA
Risco maior de câncer: carcinomas, leucemias e linfomas
AR
Clínica
-ataxia cerebelar (12-14 meses) disfunção neuromotora
-telangiectasia olhos e pele (3 e 5 anos) retardo de crescimento (70%)
incidência neoplasias (linfoma e leucemia linfóide) e imunodeficiências
incidência: 1/40.000
risco câncer de mama heterozigotos AT
ATAXIA TELANGIECTASIA (AT) SÍNDROME DE LOUIS-BAR
células AT sensíveis a radiação ionizante e agentes radiomiméticos (N-acetoxi-N-2-acetil-2-aminofluoreno - 4-NQO)
linfócitos AT rearranjos espontâneos dos cromossomos 7 e 14
4 grupos de complementação: A, C, D e E mutações gene ATM
gene ATM (11q22-23) diversas vias
controle transdução de sinal
checkpoint ciclo celular
resposta celular ao dano no DNA induzido por radiação
gene ATM interage p53 na checagem G1-S e mutações no gene ATM abolem mecanismo de reparo pré-síntese de DNA
defeito mecanismo de reparo do DNA ou defeito na replicação DNA