S.Mendo08/09Conceitos/conhecimentos chave a
apreender• Diferentes tipos nutricionais dos microrganismos• Crescimento e manutenção de microrganismos em
laboratório (culturas puras e contagem de bactérias- UFC, tipos de meios de cultura; técnicas de inoculação)
• Curva de crescimento bacteriano e taxa específica de crescimento
• Influência de alguns factores no crescimento microbiano (pH, temperatura, nutrientes, oxigénio)
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� Nutrientes – substâncias utilizadas na biossíntese e produção de energia (necessárias ao crescimento dos microrganismos).
� 95% composição da célula microbiana-�Macronutrientes: C, O, S, H, N, P (constituintes de hidratos de carbono, lípidos proteínas, ác. nucleicos); e outros (Mg2+, Ca2+, Fe2+/3+)
� as células também necessitam de elementos vestigiais-Micronutrientes: Mn, Co, Zn, Mo (em pequenas quantidades- �)
� NUTRIÇÃO MICROBIANA
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FONTE DE CARBONO
faz parte do esqueleto de todos as células
Conceito de Auxotrofia vs Prototrofia
� FONTES DE C, ENERGIA, H e e-
Autotróficos: utilizam o CO2 como única fonte de Carbono
Heterotróficos: utilizam moléculas orgânicas reduzidas como fonte de C (geralmente produzidas por outros organismos)M
icro
gani
smos
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� FONTE DE ENERGIA DE H OU e-
ENERGIA
Fototróficos: luz
Quimiotróficos: Oxidação de compostos orgânicos e
inorgânicos
H ou e-Litotróficos: moléculas inorgânicas reduzidas
Organotróficos: moléculas orgânicas reduzidas
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Tipos nutricionaisdos microrganismos Fontes de E, H/electrões e C
Fotolitotróficos autotróficos
Fotoorganotróficos heterotróficos
Quimiolitotrófico autotrófico
Quimiolitotrófico heterotróficos
Luz; Mol. Inorgânica dadora de H e e- ; CO2
Luz; Mol. orgânica dadora de H e e-; Mol. orgânica como fonte de C (CO2 pode ser usado)
Química (Mol. Inorg.); Mol. Inorg dadora de H e e- ; CO2 como fonte de C
Química (Mol. org.); Mol. Orgânica; Mol. Orgânica como fonte de C
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OUTROS REQUISITOS NUTRICIONAIS
Enxofre:
Cys, MetAlguns hidr. de carbonoBiotina
Fósforo:
ProteínasÁcidos nucleicosfosfolípidos
Azoto:
AminoácidosPurinasPirimidinasLípidos
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compostos orgânicos, componentes essenciais da célula, sintetizados por MO
� aminoácidos
� purinas e pirimidinas
� vitaminas (pequenas mol. orgânicas que fazem parte de cofactoresenzimáticos)
BiotinaNiacinaRiboflavina-B2-Ácido fólico Ex. Lactobacillus: várias mutações acumuladas
� FACTORES DE CRESCIMENTO
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� CRESCIMENTO E MANUTENÇÃO DE MICRORGANISMOS EM LABORATÓRIO
Mei
os d
e cu
ltura
DEFINIDOS OU SINTÉTICOS
COMPLEXOS(peptona, extracto de carne e extracto de levedura)ex: NB e TSB
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� TIPOS DE MEIOS DE CULTURA
• MEIOS DE USO GERAL
• SELECTIVOS
• DIFERENCIAIS
Meios sólidos: 1,5-2% de Agar (agente solidificante)
Meios semi- sólidos: 0,7% de Agar (“soft agar”)
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� ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS
� Em habitas naturais os MO crescem em populações mistas contendo diferentes espécies
� Estudos de MO implica o seu isolamento em culturas puras
� Espalhamento em placa de Petri contendo meio agarizado
� Diluições da cultura mista inoculadas em placa de agar
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“Processo pelo qual todas as células vivas, esporos viáveis, vírus e viróides são destruídos”
� Calor húmido: autoclave, 121ºC, 1atm, 15-20 min.
� Calor seco: estufa seca, 180ºC, 2h; chama.
� Filtração: membrana de acetato de celulose c/ 0,22�m de Ø
� Radiação: ionizante, UV
� ESTERILIZAÇÃO
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� Filtração por membranas
� TÉCNICAS DE INOCULAÇÃO
� Riscado em placa - culturas puras
� Sementeira à superfície(100�l de amostra)
� Sementeira por incorporação(análise quantitativa de uma amostra muito contaminada)
dil. décimais
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Expresso em UFC– Unidade Formadora de Colónias
CONSERVAÇÃO DE CULTURAS PURAS
� placa de agar, 4ºC (2-3 semanas)� glicerol, -20ºC (meses)� glicerol, -80ºC (anos)� liofilizados (alguns anos)
� CONTAGEM DE COLÓNIAS BACTERIANAS
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� CRESCIMENTO MICROBIANO
Aumento dos constituintes celulares – pode ser medido pelo aumento do tamanho das células/ nº de células(FISSÃO BINÁRIA E GEMULAÇÃO)
Curva de crescimento: : gráfico do logaritmo do nº de células x tempo de incubação, representa o crescimento de um MO num sistema fechado sem adição de nutrientes.
TEMPO DE DUPLICAÇÃO (td) ou GERAÇÃO (tg): a população duplica durante um determinado intervalo de tempo (fase exponencial).
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Tempo Nºdivisões 2n População (N 0 x2n)0 0 n=0 1
20 1 n=1 240 2 n=2 460 3 n=3 8
EXEMPLO: E. coli (em condições adequadas) – td = 20min.
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CRESCIMENTO MICROBIANO EXPRESSO POR EQUAÇÕES MATEMÁTICAS:
N = N0 x 2n
log N- log N0 + n log2
log N- log N0 = nlog2; n= log N- log N0 / log 2
= log N – log N0 / 0,301 = 3,3 (log N- log N0)
n = t/ td Se a população crescer durante o tempo t(n = nºde gerações)
Nt = 2n N0
lnNt - lnN0 = nln2 = 0,693 t/ tdEquação expressa em log
Equação geral para o crescimento de células(N = nºde células)
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� CRESCIMENTO EXPONENCIAL
A representação gráfica dos logaritmos naturais da densidade populacional em função do tempo traduz-se numa relação linear (utiliza-se papel logarítmico).
Assumindo que, numa cultura microbiana, em condições de crescimento equilibrado, a taxa de aumento da população no tempo t é proporcional à densidade populacional x, então a taxa de específica crescimento (�) é dada por:
�= 1/x . dx/dt
Integrando xt= x0 . e�t ln xt= ln x0 . �t
Corresponde ao declive da recta
1
2 3
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A taxa específica de crescimento (�) relaciona-se com o tempo médio de duplicação (td) para a população, por substituição de xt= 2x0 e t= td na eq. 3:
td= ln2/� = 0.693/ �
. A taxa específica de crescimento é um indicador da resposta do MO às condições e ao meio em que estão a crescer.
Cada MO tem o seu td característico, relacionado com a taxa específica de crescimento � .
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E. coli
EXEMPLO
� Meio rico (LB), a 37ºC (td pequeno e � maior)
� Meio mínimo ou temperaturas superiores/ inferiores conduzem a uma alteração do td e do �
� Existe sempre um valor de � óptimo para cada espécie
LB
MM
�(t)
(Log
nºcé
l)
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CRESCIMENTO DIÁUXICO: em meios complexos, contendo por exemplo dois substratos como fontes de C e energia. (por exemplo glucose e lactose).
t
nºde
cél
glucose
lactose
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� AVALIAÇÃO QUANTITATIVA DO CRESCIMENTO MICROBIANO
Geralmente são avaliados um de dois parâmetros:I. massa celularII. nºde células
I. DETERMINAÇÃO DA MASSA CELULAR� métodos directos pesagem dos MO (peso seco)� métodos indirectos dispersão da luz que atravessa a suspensão
Medida da diminuição da luz transmitida – densidade óptica (DO) (Absorvência)
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II. DETERMINAÇÃO DO NÚMERO DE CÉLULAS(contagem ao microscópio usando câmaras de contagem)
� Nem todas as bactérias que se contam vão dar origem a uma colónia.
� Assume-se que cada colónia é originada a partir de uma única célula, o que nem sempre é verdade. Os resultados são expressos em U.F.C.
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� FACTORES QUE AFECTAM O CRESCIMENTO BACTERIANO
� CONCENTRAÇÃO DE NUTRIENTES� TEMPERATURA� PH� OXIGÉNIO� ACTIVIDADE DA ÁGUA (aw)
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Psicrófilos: abaixo dos 20 ºCMesófilos: entre 20 e 44 ºCTermófilos: entre 45 e 70 ºCHipertermófilos: entre os 70 e 110 ºC
4 GRUPOS:
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� MÉTODOS FÍSICOS E QUÍMICOS DE CONTROLO E DESTRUIÇÃO DE MICRORGANISMOS
� Os MO podem ser necessários ao ser humano e trazer alguns benefícios� Muitos MO são responsáveis por doenças e putrefacção de géneros alimentícios
� Técnicas de assepsia (microbiologia)� Preservação de alimentos
� Prevenção/ tratamento de doenças
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� Esterilização - eliminar todos os MO de um objecto ou habitat
� Desinfecção - inibição, morte ou remoção de MO que podem causar doenças. Geralmente os desinfectantes são de origem química e não implicam necessariamente a remoção de esporos.
� Antiséptico - controlo do crescimento de MO em tecidos vivos, por acção de agentes químicos. Estes compostos inibem temporariamente o crescimento ou matam MO. Adicionalmente, não podem ser tóxicos para o hospedeiro.
ALGUNS TERMOS IMPORTANTES
Germicidas – matam MO patogénicos e não patogénicosBactericidas (fungicidas, viricidas,etc) – se matam MOBacteriostáticos (fungistáticos) – se inibem o crescimento
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� CONDIÇÕES QUE AFECTAM A EFICÁCIA DE UM AGENTE ANTIMICROBIANO
1. Tamanho da população2. Composição da população 3. Concentração do agente antimicrobiano4. Duração da exposição ao agente antimicrobiano5. Condições do local onde ocorre a exposição
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A morte celular obedece a um padrão e, à semelhança do que ocorre com o crescimento celular, pode ser exponencial ou logarítmica.
t (min.)
log
nºcé
ls.
D121
� MORTE CELULAR
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� CALOR HÚMIDOAutoclave – para destruição de células de endósporos bacterianos (atmosfera saturada de vapor e sobre pressão, 1atm)
� degradação de ácidos nucleicos� desnaturação de enzimas e outras proteínas
PasteurizaPasteurizaççãoão
63ºC, 30 min.72ºC, 15 seg. (HTST)
140-150ºC, 1-3 seg. (UHT)
TindalizaTindalizaççãoão
90-100ºC, 30 min.3 dias consecutivosIncubações a 37ºC
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� FILTRAÇÃO:
Membranas com poro de 0,2 �m (de acetato de celulose, policarbonato, nitrato de celulose, etc).
Filtração do ar:
câmara de fluxomáscaras cirúrgicas
salas assépticas
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� RADIAÇÃO
�� UVUV- pode ser letal. Não atravessa superfícies de forma eficaz, pelo que é utilizada para a sua esterilização.
�� IonizanteIonizante (radiação Gama do Cobalto 60)- penetra dentro dos objectos, pelo que é utilizada para esterilização de material descartável de plástico. Também é utilizada para esterilização de antibióticos e hormonas.
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MÉTODOS QUÍMICOS DE CONTROLO DE MO
� COMPOSTOS FENÓLICOS
� poderosos microbicidas� muito tóxicos� alterações na membrana celular dos MO� bactericidas ou bacteriostáticos (depende da concentração)
� ALCOÓIS
� agentes antisépticos e desinfectantes� coagulação de proteínas � solubilização de lípidos � destruição de membranas celulares� bactericidas ou fungicidas
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� COMPOSTOS HALOGENADOS
� gás ou associado a agentes libertadores de cloro� utilizados como desinfectante de águas de consumo e piscinas� destruição da actividade de proteínas celulares (oxidação dos grupos sulfidrilo e reacções de N- e C- clorinação e descarboxilação)
� IODO
� interacção com enzimas essenciais ou proteínas (reacções de grupos -SH, Iodo -NH aa)
� desinfecção de feridas
� preparação do campo operatório (Betadine- iodo epolivinilpirrolidona)
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� METAIS PESADOS
� inactivação de proteínas celulares� tratamento de pequenas feridas e infecções da pele (mercuriocromo)
� DETERGENTES CATIÓNICOS
� compostos de amónio quaternário � activos contra a maioria das bactérias (excepto Mycobacteriumtuberculolosis e endósporos)� disrupção das membranas e desnaturação de proteínas� baixa toxicidade
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� ALDEÍDOS
Formaldeído- tóxico e letal para todos os micróbios e esporos- bactericida, esporocida e virucida
Glutaraldeído- sol. aq. 2% menos irritante que o Formaldeído- desinfecção de material hospitalar- desnaturação de proteínas e ác. nucleicos
� ÓXIDO DE ETILENO
� gás (temp. ambiente)� microbicida e esporicida� agente alquilante, inactiva enzimas e proteínas� esterilização de material de polietileno ou empacotado em papel