![Page 1: Isolamento Viral em Cultivo Celular - Secretaria da Saúde · A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. ` Rapidez](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021904/5ba35b7909d3f2af168b4d4d/html5/thumbnails/1.jpg)
Isolamento Viral em Cultivo Celular
Adriana Candido Rodrigues
![Page 2: Isolamento Viral em Cultivo Celular - Secretaria da Saúde · A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. ` Rapidez](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021904/5ba35b7909d3f2af168b4d4d/html5/thumbnails/2.jpg)
Sistemas Celulares
Célula viva para replicação
Vírus: Parasitas intracelulares obrigatórios
Animais de Laboratório
Ovos Embrionados
Cultura de Células
![Page 3: Isolamento Viral em Cultivo Celular - Secretaria da Saúde · A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. ` Rapidez](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021904/5ba35b7909d3f2af168b4d4d/html5/thumbnails/3.jpg)
Importância
Animais
Vantagens:
Simples
Confiável
Sensível
Desvantagens:
Tempo
Espaço
Custo
Cultura Celular
Vantagens:
Espaço
Custo
Ética
Desvantagem:
Menor sensibilidade
![Page 4: Isolamento Viral em Cultivo Celular - Secretaria da Saúde · A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. ` Rapidez](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021904/5ba35b7909d3f2af168b4d4d/html5/thumbnails/4.jpg)
A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório.
Rapidez no Diagnóstico
Viável economicamente.
É um método sensível, tendo a capacidade de detectar pequenas concentrações do vírus.
![Page 5: Isolamento Viral em Cultivo Celular - Secretaria da Saúde · A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. ` Rapidez](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021904/5ba35b7909d3f2af168b4d4d/html5/thumbnails/5.jpg)
Utilidade da cultura celular
Diagnóstico e IsolamentoProdução de vacinasBiologia molecular do vírus, mecanismo de infecção e patogeniaIsolar grande numero de vírusProdução de antígenos viraisRealizar testes de neutralizaçãoDeterminação de concentrações virais
![Page 6: Isolamento Viral em Cultivo Celular - Secretaria da Saúde · A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. ` Rapidez](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021904/5ba35b7909d3f2af168b4d4d/html5/thumbnails/6.jpg)
N2A Neuroblastoma MurinoOrigem: American Type Culture Collection, Rockville Md. (ATCC)
BHK-21 Rim de Camundongo Recém NascidoOrigem: American Type Culture Collection, Rockville Md. (ATCC)
Fonte :Instituto Pasteur
![Page 7: Isolamento Viral em Cultivo Celular - Secretaria da Saúde · A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. ` Rapidez](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021904/5ba35b7909d3f2af168b4d4d/html5/thumbnails/7.jpg)
Vantagens da Célula
• Universalidade• Sensibilidade• Custo• Espaço Físico• Caráter Ético• Simplicidade
Desvantagens da Célula
• Contaminação• Toxidade
![Page 8: Isolamento Viral em Cultivo Celular - Secretaria da Saúde · A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. ` Rapidez](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021904/5ba35b7909d3f2af168b4d4d/html5/thumbnails/8.jpg)
1913
Levaditi - primeira descrição.
1956
Vieuchange et al. Relatou a
sensibilidade de culturas celulares
primárias de células de rim de camundongo à
infecção pelo vírus da raiva .
Dois anos mais tarde, Kissling descreveu a
passagem seriada de vírus de campo
e de cultivo em células primarias
de rim de hamster
![Page 9: Isolamento Viral em Cultivo Celular - Secretaria da Saúde · A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. ` Rapidez](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021904/5ba35b7909d3f2af168b4d4d/html5/thumbnails/9.jpg)
Por volta de 1963, Kissling e
Reesedemonstraram o
potencial da utilização do
crescimento viral desta maneira
para preparação de uma vacina.
1975
Larghi et al. - BHK-21 desenvolveram o primeiro
isolamento do vírus rábico de rua em células BHK-21 (baby hamster
kidney) tendo em vista o seu uso na rotina
diagnóstica (CAMPBELL; CHARLTON,
1988).Segundo este experimento: cultura celular apresentou >
sensibilidade.
1977
Smith et al. CER (embrião de
galinha). Um ano depois utiliza
N2A (neuroblastomade camundongo)
![Page 10: Isolamento Viral em Cultivo Celular - Secretaria da Saúde · A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. ` Rapidez](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021904/5ba35b7909d3f2af168b4d4d/html5/thumbnails/10.jpg)
CongelamentoDescongelamentoManutenção
Fonte: Instituto Pasteur
![Page 11: Isolamento Viral em Cultivo Celular - Secretaria da Saúde · A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. ` Rapidez](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021904/5ba35b7909d3f2af168b4d4d/html5/thumbnails/11.jpg)
A manutenção das células é realizada em dois repiques por semana, efetuados
durante sua viabilidade e crescimento.
Fonte: Instituto Pasteur
![Page 12: Isolamento Viral em Cultivo Celular - Secretaria da Saúde · A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. ` Rapidez](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021904/5ba35b7909d3f2af168b4d4d/html5/thumbnails/12.jpg)
Estas células, após crescimento, serão utilizadas na técnica do isolamento viral.
Fonte: Instituto Pasteur
![Page 13: Isolamento Viral em Cultivo Celular - Secretaria da Saúde · A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. ` Rapidez](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021904/5ba35b7909d3f2af168b4d4d/html5/thumbnails/13.jpg)
Fonte: Google
Obtenção do número de células desejável:5 x 105 células/mL
Contagem Celular
![Page 14: Isolamento Viral em Cultivo Celular - Secretaria da Saúde · A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. ` Rapidez](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021904/5ba35b7909d3f2af168b4d4d/html5/thumbnails/14.jpg)
N° de células /mL = n° total de células X 10.000 X fator de diluição n° de quadrantes
N° de células encontrado = Volume FinalN°de células /mL da suspensão original
![Page 15: Isolamento Viral em Cultivo Celular - Secretaria da Saúde · A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. ` Rapidez](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021904/5ba35b7909d3f2af168b4d4d/html5/thumbnails/15.jpg)
Total de células dos 4 quadrantes x 10.000* x 10**4
* Fator de conversão da câmara de Neubauer**Volume total de meio usadas na suspensão de células.
Ex.: 196 x 104 x 10 = 490 x 104 = 49 x 105
4Células/mL
49 x 105 _________________ Volume final5 x 105 _________________ 1 mL
Volume final= 9,8 mL
![Page 16: Isolamento Viral em Cultivo Celular - Secretaria da Saúde · A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. ` Rapidez](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021904/5ba35b7909d3f2af168b4d4d/html5/thumbnails/16.jpg)
![Page 17: Isolamento Viral em Cultivo Celular - Secretaria da Saúde · A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. ` Rapidez](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021904/5ba35b7909d3f2af168b4d4d/html5/thumbnails/17.jpg)
Inóculo:
Uma suspensão a 20% (peso/volume) foi preparada a partir de fragmentos do Sistema
Nervoso Central
Fonte: Instituto Pasteur
![Page 18: Isolamento Viral em Cultivo Celular - Secretaria da Saúde · A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. ` Rapidez](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021904/5ba35b7909d3f2af168b4d4d/html5/thumbnails/18.jpg)
Armazenamento das amostras em freezer
Fonte: Instituto Pasteur
![Page 19: Isolamento Viral em Cultivo Celular - Secretaria da Saúde · A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. ` Rapidez](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021904/5ba35b7909d3f2af168b4d4d/html5/thumbnails/19.jpg)
Após preparar Cabine de Segurança Biológica, homogeneizar a amostra.
Manipular no gelo.
Fonte: Instituto Pasteur
![Page 20: Isolamento Viral em Cultivo Celular - Secretaria da Saúde · A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. ` Rapidez](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021904/5ba35b7909d3f2af168b4d4d/html5/thumbnails/20.jpg)
Meio de cultura: para 10 mL de meio acrescentar 30 μL de antibiótico e 30 μL de
aminoácidos essenciais
Fonte :Instituto Pasteur
![Page 21: Isolamento Viral em Cultivo Celular - Secretaria da Saúde · A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. ` Rapidez](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021904/5ba35b7909d3f2af168b4d4d/html5/thumbnails/21.jpg)
Adicionar 40μL da amostra em cada orifício da placa, em triplicata.
Fonte :Instituto Pasteur
![Page 22: Isolamento Viral em Cultivo Celular - Secretaria da Saúde · A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. ` Rapidez](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021904/5ba35b7909d3f2af168b4d4d/html5/thumbnails/22.jpg)
Adicionar 160 μL de meio de cultura, homogeneizar.
Fonte:Instituto Pasteur
![Page 23: Isolamento Viral em Cultivo Celular - Secretaria da Saúde · A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. ` Rapidez](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021904/5ba35b7909d3f2af168b4d4d/html5/thumbnails/23.jpg)
Adicionar 100 μL de suspensão de células, (contendo 5 x 105 células/mL ).
Fonte: Instituto Pasteur
![Page 24: Isolamento Viral em Cultivo Celular - Secretaria da Saúde · A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. ` Rapidez](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021904/5ba35b7909d3f2af168b4d4d/html5/thumbnails/24.jpg)
Incubar a 37°C em Câmara Úmida de CO2 a 5% de 72 a 96 horas
Fonte :Instituto Pasteur
![Page 25: Isolamento Viral em Cultivo Celular - Secretaria da Saúde · A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. ` Rapidez](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021904/5ba35b7909d3f2af168b4d4d/html5/thumbnails/25.jpg)
Como as células não sofrem efeito citopático, será
preciso evidenciar o vírus através da
Imunofluorescência Direta (IFD).Remover o
sobrenadante com uma bomba de
sucção. Fonte :Instituto Pasteur
![Page 26: Isolamento Viral em Cultivo Celular - Secretaria da Saúde · A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. ` Rapidez](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021904/5ba35b7909d3f2af168b4d4d/html5/thumbnails/26.jpg)
Adicionar 200 μL de Acetona a 80% e incubar por 15 minutos em banho de gelo.
Fonte: Instituto Pasteur
![Page 27: Isolamento Viral em Cultivo Celular - Secretaria da Saúde · A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. ` Rapidez](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021904/5ba35b7909d3f2af168b4d4d/html5/thumbnails/27.jpg)
Após, desprezar Acetona e
secar a placa.
Fonte: Instituto Pasteur
![Page 28: Isolamento Viral em Cultivo Celular - Secretaria da Saúde · A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. ` Rapidez](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021904/5ba35b7909d3f2af168b4d4d/html5/thumbnails/28.jpg)
Acrescentar 40 μL do conjugado antirrábico , previamente titulado, por
orifício, e incubar a 37º C por 60 minutos.
Fonte: Instituto Pasteur
![Page 29: Isolamento Viral em Cultivo Celular - Secretaria da Saúde · A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. ` Rapidez](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021904/5ba35b7909d3f2af168b4d4d/html5/thumbnails/29.jpg)
Enxaguar a placa por imersão, 3
vezes em solução salina tamponada, pH 7,4, e 3 vezes
em água destilada. Secar a placa.
Fonte: Instituto Pasteur
![Page 30: Isolamento Viral em Cultivo Celular - Secretaria da Saúde · A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. ` Rapidez](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021904/5ba35b7909d3f2af168b4d4d/html5/thumbnails/30.jpg)
Adicionar 50μL de glicerina tamponada (pH 8.5) em cada orifício
Fonte: Instituto Pasteur
![Page 31: Isolamento Viral em Cultivo Celular - Secretaria da Saúde · A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. ` Rapidez](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021904/5ba35b7909d3f2af168b4d4d/html5/thumbnails/31.jpg)
Fonte: Instituto Pasteur
A leitura será realizada em cada orifício e, sendo observada pelo
menos uma célula infectada, será
considerada positiva.Orifícios sem células
infectadas serão considerados
negativos.
![Page 32: Isolamento Viral em Cultivo Celular - Secretaria da Saúde · A cultura celular é um método alternativo atendendo aos princípios éticos no uso de animais em laboratório. ` Rapidez](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021904/5ba35b7909d3f2af168b4d4d/html5/thumbnails/32.jpg)
Positivo Negativo