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Isolamento e caracterização fenotípica de bactérias fixadoras de nitrogênio em simbiose com Macroptiliumlathyroides(L.) Urb. em
Roraima (1).
Joselma Pedrosa da Silva(2); Vicente Gianlupi(3); Krisle da Silva(4).
(1) Trabalho executado com recursos de Embrapa Projeto Coleções D & M: 01.09.01.003.02.07.
(2) Aluna de graduação em Ciências Biológicas; Faculdade Cathedral; Boa Vista-RR; [email protected];
(3) Engº Agrônomo, Pesquisador, EMBRAPA - Roraima, Br.174 Km 8, Distrito Industrial, Boa Vista, RR;
(4)Pesquisadora, Microbiologia do Solo; Embrapa Roraima,Rodovia BR-174, Km 8, Distrito Industrial, CEP 69301-970,
Boa Vista-RR; [email protected].
RESUMO:Devido às características de
adaptabilidade a diferentes ambientes e ao curto
ciclo reprodutivo com facilidade de produção de
sementes, o feijão-dos-arrozais
(Macroptiliumlathyroides), constitui uma planta de
interesse agronômico. Está planta foi recentemente
encontrada em áreas agrícolas em Roraima e tem
potencial como forrageira, pois esta leguminosa
estabelece simbiose com bactérias fixadora de
nitrogênio. Portanto, o objetivo deste estudo foi
isolar e avaliar a diversidade de bactérias fixadoras
de nitrogênio em simbiose com
Macroptiliumlatiroides(L.) Urb. As bactérias foram
isoladas de nódulos das raízes de plantas coletadas
emuma propriedade agrícola no município de
Bonfim-RR. Cem nódulos de três plantas foram
escolhidos ao acaso, e isoladas em meio YMA com
vermelho congo. Após isolamento as bactérias
foram caracterizadas quanto à morfo-fisiologia das
colônias em meio de cultivo YMA contendo azul de
bromotimol. Dos 100 nódulos escolhidos, foi
possível isolar 129 bactérias. A maioria das
bactérias apresentou crescimento muito rápido e
acidificação do meio de cultura. O resultado do
dendrograma revelou uma elevada diversidade,
sendo formados 53 grupos com 70% de
similaridade. As 129 bactérias isoladas de
M.lathyroidesapresentaram elevada diversidade
morfo-fisiológica, sendopromissoras para a fixação
biológica de nitrogênio.
Termos de indexação:Fixação biológica de nitrogênio; Feijão-dos-arrozais;Amazônia
INTRODUÇÃO
O gênero Macroptiliumengloba aproximadamente 20 espécies, sendo um dos mais conhecidos na subtribo Phaseolinae (Delgado-Salinas & Lewis, 2008). Dentre as espécies com uso econômico, se destacam Macroptiliumatropurpureum e M. lathyroidesque são
utilizadas como plantas forrageiras (Monkset al., 2006; Guerra et al., 2007; Vasconcelos et al., 2011). M. lathyroidesé conhecido por diferentesnomes: figo-de-pombo (Vasconcelos etal.,2011), feijão-dos-arrozais (Ferreira et al., 2004) ou feijão-de-rôla (Basile et al., 2007). O feijão-dos-arrozais, particularmente, apresenta características apropriadas para solos úmidos, podendo alcançar altos rendimentos de forragem de qualidade. Pouco exigente em fertilidade,vegeta em locais mal drenados e com pH baixo, além de ser adaptada a precipitações pluviais anuais de 630 a 1800 mm (Monks et al., 2006; Vasconcelos et al., 2011).
Na safra de 2012/ 2013 em áreas agrícolas de Roraima, foi detectada a presença desta leguminosa.Esta planta é uma alternativa para a melhoria da qualidade das pastagens nas terras baixas do Rio Grande do Sul (Reis, 1988), e também pode ser uma alternativa paras as áreas em Roraima desde que manejado corretamente.
Apesar de estabelecer simbiose com bactérias fixadoras de nitrogênio, pouco se conhece sobre a diversidade destas bactérias. Assim, neste trabalho objetivou-se isolar e caracterizar fenotipicamente bactérias coletadas de nódulos de Macroptiliumlathyroides(L.) Urb.em Roraima.
MATERIAL E MÉTODOS
Origem das bactérias
A coleta foi realizada em uma área de lavoura de soja em propriedade particular no Município de Bonfim, Roraima, que representa uma área de cerrado (N 03
o14’56.3”W 060º16’28.9”).
As raízes foram retiradas no campo com
auxíliocom auxílio de pá reta. Estas foram
acondicionadas em sacos e levadas ao laboratório
de Microbiologia do Solo da Embrapa Roraima,
onde foram lavadas, os nódulos retirados e
armazenados em frascos contendo sílica gel. A
parte aérea de plantas contendo flores foi coletada
para confecção de exsicatas que foramdepositadas
no Herbário do Museu Integrado de Roraima, onde
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foram identificadas botanicamente como
Macroptiliumlathyroides (L.) Urb. Foram coletadas
amostras de três plantas.
Isolamento e purificação
Para o isolamento, 100 nódulos escolhidos
ao acaso das três plantas, foram mantidos em água
estéril por duas horas para reidratação.
Posteriormente, procedeu-se a desinfestação com
etanol 92,8% por três segundos, hipoclorito de sódio
a 1% por cinco minutos e sucessivas lavagens em
água estéril.Os nódulos desinfestados foram
esmagados com pinça estéril e o líquido intra-
nodular foi estriado utilizando alça de platina em
placas de Petri contendo meio de cultura YMA (Fred
&Waskman, 1928)contendo o indicador vermelho
congo a 0,25%. As placas foram incubadas a 28º C,
com verificações diárias da formação de colônias.
Após aparecimento das colônias, as mesmas foram
repicadas para outra placa de Petri contendo meio
de cultura YMA com indicador, azul de bromotimol
(0,5%) e novamente incubadas para a purificação.
As placas foram monitoradas diariamente visando
verificar o surgimento de colônias isoladas para
posterior caracterização fenotípica através da
morfo-fisologia de colônias.
Caracterização fenotípica
A caracterização fenotípica foi realizada
através da morfo-fisiologia cultural das colônias.
Para isto, as bactérias foram cultivadas em meio de
cultura sólida YMA (Fred &Waskman, 1928),
contendo azul debromotimol e incubadas a 28°C. A
caracterização foi iniciada a partir do aparecimento
das primeiras colônias isoladas. As características
avaliadas foram: crescimento em dias
(aparecimento de colônias isoladas), alteração do
pH do meio (neutro, ácido e alcalino), diâmetro das
colônias (mm), forma (puntiforme,circular ou
irregular), elevação das colônias (plana, convexa,
côncava, elevada e protuberante), borda (inteiraou
irregular), superfície da colônia (lisa ou
rugosa),produção de muco (escassa, pouco,
moderada eabundante), transparência (opaca,
transparente etranslúcida), muco (homogêneo ou
heterogêneo).Devido às plantas se encontrarem em
uma lavoura de soja, além das bactérias isoladas,
foram incluídas na caracterização quatros estirpes
referências para produção de inoculantes de soja,
SEMIA 587 e SEMIA 5019 (Bradyrhizobium elkanii);
SEMIA 5079 (B. japonicum) e SEMIA 5080 (B.
diazoefficiens).
As características foram comparadas e suas
semelhanças foram estimadas pelo coeficiente de
Jaccard. Os isolados foram agrupados pelo método
UPGMA (averagelinkageclustering) e representados
graficamente por um dendrograma (NTSYS-pc,
versão 2.1t).
RESULTADOS E DISCUSSÃO Dos 100 nódulos submetidos ao isolamento,
foram recuperadas 129 bactérias. Isto ocorreu
devido à observação de duas morfologias
bacterianas diferentes durante o processo de
isolamento. O que indica a presença de mais de
uma bactéria dentro dos nódulos.
Quanto à caracterização fenotípica, através da
morfologia das colônias, verificou-se que a 79
bactérias apresentaram crescimento muito rápido 50
rápidos, não apresentando bactérias com
crescimento intermediário e lento. Quanto à
alteração do pH do meio, 52 bactérias apresentaram
reação ácida; 30 neutra e 47 alcalina em meio YMA
acrescido de azul de bromotimol(Figura 1).
Bactérias de crescimento intermediário a lento e
reação neutra a alcalina são características típicas
do gênero Bradyrhizobium(Moreira & Siqueira,
2006).Isto demonstra que entre as 129 bactérias
isoladas, nenhuma apresentou essa característica.
Quando foi gerado o dendrograma das bactérias
isoladas de feijão-dos-arrozais juntamente com as
estirpes referências (SEMIA 597, SEMIA 5019,
SEMIA 5079 e SEMIA 5080), foi possível observar
uma elevada diversidade, sendo formados 53
grupos a 70% de similaridade (Figura 2). Também
foi possível observar que nenhuma bactéria isolada
foi semelhante às estirpes referência, indicando que
apesar das plantas estarem presentes em área
cultivada com soja, as estirpes recomendadas para
produção de inoculantes (SEMIA 587, SEMIA 5019,
SEMIA 5079 e SEMIA 5080) não estabeleceram
simbiose com feijão-dos-arrozais. Os resultados
deste trabalho indicam que apesar de M.
lathyroidester sido introduzido em Roraima, esta
leguminosa foi capaz de estabelecer simbiose com
bactérias nativas com elevada diversidade morfo-
fisiológica, favorecendo o seu crescimento nestes
solos.
CONCLUSÕES
As bactérias isoladas de M. lathyroides demonstraram umaelevada diversidade morfo-fisiológica cultural.
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Apesar de terem sido isoladas em lavouras de soja, as bactérias obtidas não se foram similares as bactérias utilizadas em inoculantes de soja.
REFERÊNCIAS
BASILE, A. G. et al. Controle químico de feijão-de-rôla (Macroptiliumlathyroides) com glyphosate. In: SIMPÓSIO INTERNACIONAL SOBRE GLYPHOSATE, 1., 2007, Botucatu. Anais... Botucatu: FCA, UNESP, 2007. 1 CD-ROM.
DELGADO-SALINAS, A.; LEWIS, G. P. A.new species of Macroptilium(Benth.)Urb.(Leguminosae: Papilionoideae: Phaseolinae)from North-Eastern Brazil. Kew Bulletin,v.63, n.1, p.151-154, 2008. FONSECA, J. A. &
MEURER, E. J. Inibição da absorção de magnésio pelo potássio em plântulas de milho em solução nutritiva. Revista Brasileira de Ciência do Solo, 21:47-50, 1997. FERREIRA, O. G. L. et al. Efeito do corte da parte aérea e de épocas de colheita sobre o rendimento e qualidade das sementes de feijão-dos-arrozais. Revista Brasileira deAgrociência, v.10, n.2, p.175-178, 2004.
GUERRA, J.G.M. et al. Desempenho deleguminosas tropicais perenes como plantas de cobertura do solo. Seropédica: EmbrapaAgrobiologia, 2007. 22 p. (EmbrapaAgrobiologia. Boletim de pesquisa e desenvolvimento, 20). MONKS, P.L. et al. Produção e qualidade de sementes de Macroptiliumlathyroides(L.). Rev. Bras. Herb., v.11, n.1, p.11-23, jan./abr. 2012 Urb. sob diferentes espaçamentos e épocas de colheita. Pesquisa Agropecuária Tropical,
v.36, n.2, p.107-112, 2006. VASCONCELOS, W. A. et al. Germinação de sementes e desenvolvimento de plântulas de figo de pombo (Macroptiliumlathyroides). Revista Trópica, v.5, n.1, p.3-11, 2011.
Gráfico 1. Características morfo-fisilógicas culturais das bactérias isoladas de feijão dos arrozais
(Macroptiliumlathyroides) coletadas em lavoura de soja em Roraima. pH; TC (tempo de crescimento); FC (forma da colônia); EC (elevação da colônia); BC (borda da colônia); SC (superfície da colônia); PM (produção de muco); TM (transparência do muco); CM (consistência do muco); AM (aparência do muco); CC (cor da colônia) e EM (elasticidade do muco).
52 47
30
79
50
97
823
86
20 23
2
123
5 6
122
39 45
1730
47 51
24 25
78
5944
20
81
49
0
129
0
20
40
60
80
100
120
140
Ácid
o
Alc
alin
o
Neutr
o
Muito R
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Rápid
o
Circula
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Lobada
Rugosa
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Modera
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Escassa
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Aquosa
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Cre
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Bra
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Hete
rogênio
Sim
Não
pH TC FC EC BC SC PM TM CM CC AM EM
Nú
mero
de Iso
lad
os
Caracteristicas Morfoculturais
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Figura 2 - Dendrograma de similaridade de bactérias isoladas de feijão-dos-arrozais(Macroptiliumlathyroides) coletadas em área de cultivode soja em Roraima.
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
SEMIA5079
S-93 S-19 S-29 S-44 S-15 S-96 S-38 S-45 S-32 S-50B SEMIA5079 SEMIA5080 S-85A S-30 S-25 S-47 S-21 S-10 S-90A S-79 S-74 S-59 S-33A S-65A S-73 S-39A S-89 S-98A S-92A S-2 S-7B S-13 S-17B S-34B S-94A S-24 S-53 S-54 S-52A S-51 S-55 S-16B S-61 S-90B S-12 S-16B S-60 S-95 S-6 S-77B S-37A S-5B S-5A S-78 S-16A S-33B S-22 S-88 S-48 S-72A S-86A S-40 S-100 S-14 S-69 S-50A
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
SEMIA5079
S-34C S-80B S-84 S-76B S-35 S-83B S-87A S-27 S-28 S-11 S-72B S-68 S-18 S-56 S-71 S-76A S-83A S-8B S-98B S-26 S-62B S-87B S-70A S-82 S-1 S-20 S-23B S-41 S-67 S-4 S-57 S-23A S-36A S-58A S-77A S-8A S-94B S-33C S-65B S-49A S-92B S-49B S-66 S-52B S-3B S-42 S-99A S-7A S-90C S-91A S-34A S-75 S-17A S-99B S-85B S-70B S-62A S-43 S-37B S-46 S-31 S-39B S-58B SEMIA5019 SEMIA587
