Download - III-3. Fotossíntese
Grupo 1:
Alexandra Salvado 40267, Ana Lamy 40279, Andreia Sousa 40261 e Telmo Paiva 40243
Bioquímica Experimental II, PL2, 2011/2012, Professor: Carlos Farinha
Objectivos
DQB-Licenciatura em Bioquímica 2
• Testar a libertação de dioxigénio pelos cloroplastos isolados usando
oxidantes de Hill;
• Medir o transporte electrónico fotossintético utilizando a autoxidação
de um aceitador terminal de electrões (viologénio de metilo);
• Ensaio espectrofotométrico da reacção de Hill;
• Determinação do conteúdo de clorofila dos cloroplastos.
Resumo
DQB-Licenciatura em Bioquímica 3
Isolamento dos cloroplastos
Ensaios usando oxidantes de Hill e
viologénio de metilo no eléctrodo de
oxigénio
Ensaio espectrofotométrico da
reacção de Hill
Determinação do conteúdo de
clorofila dos cloroplastos
Determinação do Conteúdo de
Clorofila dos Cloroplastos
DQB-Licenciatura em Bioquímica 4
Abs652 nm= 0,760
ε solução de acetona = 34,5 mg-1 mL cm-1
Abs = ε l c 0,760 = 34,5 × 1 × c ⇔
⇔ c = 0,022 mg mL-1
Em 0,2 mL de suspensão:
ci Vi = cf Vf
ci × 0,2 = 0,022 × 25 ⇔ ci = 2,75 mg mL-1
Em 25 mL de
acetona
Massa de Clorofila por Ensaio
5
No ensaio, são colocados:
1 mL de meio de reação
0,1 ou 0,050 mL de suspensão de cloroplastos
0,850 mL de água
cclorofila = 2,75 mg mL-1
Logo, em 0,1 mL de suspensão:
E em 0,050 mL de suspensão:
Concentração de
clorofila na suspensão suspensão
clorofila
clorofila V
m=c
mg 0,275=m⇔0,1
m=2,75 clorofila
clorofila
mg 0,138=m⇔0,050
m=2,75 clorofila
clorofila
Quantidade de oxigénio por quadrícula
DQB-Licenciatura em Bioquímica 6
[O2] (25ºC) = 0,253 µmol/mL
Logo, em 2 mL, a quantidade de oxigénio é:
µmol 0,506 =) n(O
2
) n(O=0,253
Vtotal
) n(O=][O
2
222
Dos 0 aos 100% de oxigénio encontram-
se 50 quadriculas:
50 quadrículas 0,506 µmol
1 quadrícula
50 q
uadrí
cula
s
x
quadrícula/ O de mol 012,1 2x
Adição de
Ditionito de
Sódio
Figura 1. Registo obtido pelo
eléctrodo de oxigénio
Reagentes de Hill
7
Reação de Hill: 222e
2 O2
1 +A H A +OH-
Reagentes de Hill
Aceitadores artificiais de
electrões
DCPIP
Ferricianeto
Figura 2. Estrutura molecular
do DCPIP
Figura 3. Estrutura molecular
do ferricianeto
Oxidantes de Hill
8
DCPIP
10 µL
DCPIP
20 µL
DCPIP 40 µL
DCPIP
40 µL
DCPIP
40 µL
DCPIP
+ 50 µL
DCMU
Sem
Luz
40 µL
DCPIP Figura 4. Registo obtido pelo eléctrodo de oxigénio para o DCPIP.
Oxidantes de Hill
9
Ensaios com DCPIP
Adição de 40µL de DCPIP
1 quadrícula 1012 nmol de O2
11 quadrículas
10 mm 1 minuto
7 mm
y
2O de nmol 1113y
xminutos 7,0=x
)(×Δ
)(=)(
2
clorofilamt
Onsefotossíntev
1-1-mgmin nmol 5782
275,07,0
1113)(
sefotossíntev
11 quad.
7 mm
Figura 5. Medição do declive
do DCPIP.
DCPIP – resultados obtidos
10
Ensaios V(adicionado)
/µL n(O2) /mol
Tempo
/min
v(fotossíntese) /
nmol min-1mg-1
DCPIP
10 303,6 0,5 2208
20 657,8 0,5 4784
40 1113 0,7 5783
50 DCMU + 40
DCPIP 1063 0,5 7728
• A velocidade de fotossíntese aumenta com o volume adicionado de DCPIP
• Ao adicionar DCMU não devia ocorrer formação de O2
Quadro 1. Registo dos resultados para o DCPIP
Oxidantes de Hill
11
Ferricianeto
10 µL
Ferricianeto
20 µL
Ferricianeto
40 µL
Ferricianeto
20 µL
Ferricianeto
40 µL
Ferricianeto +
50 µL DCMU
Figura 6. Registo obtido pelo eléctrodo de oxigénio para o ferricianeto.
Oxidantes de Hill
12
Ensaios com Ferricianeto
Adição de 40µL de Ferricianeto
1 quadrícula 1012 nmol de O2
13 quadrículas
10 mm 1 minuto
16 mm
y
2O de nmol 1316y
x
minutos 6,1=x
)(×Δ
)(=)(
2
clorofilamt
Onsefotossíntev
1-1-mgmin nmol 2990
275,06,1
1316)(
sefotossíntev
16 mm
13 quad.
Figura 7. Medição do declive do
ferricianeto.
Ferricianeto – resultados obtidos
13
Ensaios V(adicionado)
/µL n(O2) /nmol Tempo /min
v(fotossíntese) /
nmol min-1mg-1
Ferricianeto
20 404,8 0,6 2450
40 1316 1,6 2990
50 DCMU + 40
ferricianeto 506,0 0,2 9200
• A velocidade de fotossíntese aumenta com o volume adicionado de
ferricianeto;
• Ao adicionar DCMU não devia ocorrer formação de O2
Quadro 2. Registo dos resultados para o ferricianeto
Comparação entre Ferricianeto e DCPIP
14
Ensaios V(adicionado)
/µL
n(O2)
/nmol
Tempo
/min
v(fotossíntese) /
nmol min-1mg-1
DCPIP
10 mM
10 303,6 0,5 2208
20 657,8 0,5 4784
40 1113 0,7 5783
50 DCMU + 40
DCPIP 1063 0,5 7728
Ferricianet
o
10 mM
20 404,8 0,6 2450
40 1316 1,6 2990
50 DCMU + 40
ferricianeto 506,0 0,2 9200
Quadro 3. Comparação dos resultados entre o ferricianeto e o DCPIP
DQB-Licenciatura em Bioquímica 15
Ensaio espectrofotométrico
Reacção de Hill Quadro 4. Valores de absorvência registados
DQB-Licenciatura em Bioquímica 16
Ensaio espectrofotométrico
Figura 8. Gráfico correspondente ao ensaio 1, da absorvência
de DCPIP em função do tempo.
Declive
DQB-Licenciatura em Bioquímica 17
Ensaio espectrofotométrico
Figura 9. Gráfico correspondente ao ensaio 2, da absorvência de
DCPIP em função do tempo.
Declive
DQB-Licenciatura em Bioquímica 18
Ensaio espectrofotométrico
Figura 10. Gráfico correspondente ao ensaio 3, da absorvência de
DCPIP em função do tempo.
Média das absorvências:
Declive
𝑥 =0,0186 + 0,0228 + 0,0364
3
⇔ 𝑥 ≈ 0,0259
DQB-Licenciatura em Bioquímica 19
Ensaio espectrofotométrico
Cálculo da variação da concentração em função do tempo:
Lei de Lambert-Beer
Volume total dos reagentes que se adicionou na cuvette:
𝐴𝑏𝑠 = 𝑐𝜀𝑙 ⇔𝐴𝑏𝑠
𝑡=
𝐷𝐶𝑃𝐼𝑃
𝑡𝜀𝑙 ⇔
𝐷𝐶𝑃𝐼𝑃
𝑡=𝐴𝑏𝑠
𝑡×1
𝜀𝑙⇔
⇔[𝐷𝐶𝑃𝐼𝑃]
𝑡= 0,0259 ×
1
16000×1⇔
[𝐷𝐶𝑃𝐼𝑃]
𝑡≈ 1,62 × 10−6 M s-1
V = 1,5 + 0,020 + 1,4 + 0,050 = 2,97 mL
DQB-Licenciatura em Bioquímica 20
Ensaio espectrofotométrico
Número de moles de DCPIP reduzido por segundo:
Pela estequiometria da reacção de Hill:
𝑐 =𝑛
𝑉⇔
𝐷𝐶𝑃𝐼𝑃
𝑡=𝑛𝐷𝐶𝑃𝐼𝑃
𝑡×1
𝑉 ⇔
𝑛𝐷𝐶𝑃𝐼𝑃𝑡
=𝐷𝐶𝑃𝐼𝑃
𝑡× 𝑉 ⇔
⇔𝑛𝐷𝐶𝑃𝐼𝑃
𝑡= 1,62 × 10−6 × 2,97 × 10−3 ⇔
𝑛𝐷𝐶𝑃𝐼𝑃
𝑡≈ 4,81 nmol s-1
⇔n=4,81×10-91×12⇔n≈2,40×10-9 mol ⇔ 2,40×10-9 mol s-1
DCPIP O2
1 mol — ½ ⇔
4,81 × 10-9 mol — 𝑛
𝑛 =4,81×10−9
1×
1
2⇔ 𝑛 ≈ 2,40 × 10−9 mol
⇔ 2,40 × 10−9 mol s-1
DQB-Licenciatura em Bioquímica 21
Ensaio espectrofotométrico
Cálculo da massa de clorofila:
𝐶𝑙𝑜𝑟𝑜𝑓𝑖𝑙𝑎 =𝑚𝑐𝑙𝑜𝑟𝑜𝑓𝑖𝑙𝑎
𝑉⇔ 𝑚𝑐𝑙𝑜𝑟𝑜𝑓𝑖𝑙𝑎 = 𝐶𝑙𝑜𝑟𝑜𝑓𝑖𝑙𝑎 × 𝑉 ⇔
⇔ 𝑚𝑐𝑙𝑜𝑟𝑜𝑓𝑖𝑙𝑎 = 2,75 × 2,0 × 10−2 ⇔ 𝑚𝑐𝑙𝑜𝑟𝑜𝑓𝑖𝑙𝑎 ≈ 0,055 mg
V = 20 µL = 2,0 × 10-2 mL
[Clorofila] = 2,75 mg mL-1
Velocidade fotossintética:
𝑣 ≈1,44×10−7
0,055≈ 2,62 µmol min-1 mg-1
DQB-Licenciatura em Bioquímica 22
Comparação entre valores
Eléctrodo de oxigénio: v = > 5,78 µmol min-1 mg-1
Espectrofotometria: v = 2,62 µmol min-1 mg-1
VDCPIP/ μL v / µµol min-1 mg-1
10 2,21
20 4,78
40 5,78
Quadro 6. Volumes de DCPIP e respectivas velocidades – eléctrodo de oxigénio
Mesma ordem de grandeza
Valores em concordância
Viologénio de metilo (VM2+
)
DQB-Licenciatura em Bioquímica 23
• Aceitador terminal de electrões;
• Aceita electrões do PS I, ficando reduzido e obtém-se formação de O2 com a
estequiometria normal da reacção de Hill.
• No entanto, o O2 é consumido por outras duas reacções:
Autoxidação do viologénio de metilo:
𝟐𝑶𝟐 + 𝟐𝑽𝑴+ → 𝟐𝑽𝑴𝟐+ + 𝟐𝑶𝟐.−
Dismutação do radical superóxido:
𝟐𝑶𝟐.− + 𝟐𝑯+ → 𝑯𝟐𝑶𝟐 +𝑶𝟐
𝑯𝟐𝑶+ 𝟐𝑽𝑴𝟐+ → 𝟐𝑽𝑴𝟐+ + 𝟏 𝟐 𝑶𝟐 + 𝟐𝑯+
Viologénio de metilo (VM2+
)
DQB-Licenciatura em Bioquímica 24
• Através da soma das 3 reacções anteriores obtém-se a estequiometria de
consumo de O2
Foi o que se registou no eléctrodo de oxigénio
𝑯𝟐𝑶+ 𝟏 𝟐 𝑶𝟐 → 𝑯𝟐𝑶𝟐
0,5 mol de O2 são consumidos por par de electrões transferidos
VM
Viologénio de metilo (VM2+
)
DQB-Licenciatura em Bioquímica 25
• Cálculo das velocidades fotossintéticas
Foram feitos ensaios com diferentes quantidades de viologénio
de metilo até se registar uma estabilização no consumo de O2
De seguida, adicionou-se azeto de sódio
Inibe o catalase, evitando a
síntese de O2 através da
degradação do H2O2
Azeto de sódio
Viologénio de metilo (VM2+
)
DQB-Licenciatura em Bioquímica 26
• 1º Ensaio
[O2]
/ m
ol
Vpapel / min
25 μL
VM
50 μL
NaN3
7 quadrículas
10 mm
100𝜇𝐿 𝑐𝑙𝑜𝑟𝑜𝑝𝑙𝑎𝑠𝑡𝑜𝑠 = 0,1 𝑚𝐿
𝑐𝑙𝑜𝑟𝑜𝑓𝑖𝑙𝑎 = 2,75 𝑚𝑔 𝑚𝐿
𝑚 𝑐𝑙𝑜𝑟𝑜𝑓𝑖𝑙𝑎 = 2,75 × 0,1 = 0,275 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑐𝑙𝑜𝑟𝑜𝑓𝑖𝑙𝑎
7 𝑞𝑢𝑎𝑑𝑟í𝑐𝑢𝑙𝑎𝑠 = 7 × 1,012 × 10−8 = 70,84 𝑛𝑚𝑜𝑙 𝑂2 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑖𝑑𝑜
Figura 11. Ensaio 1 do Viologénio de Metilo.
Viologénio de metilo (VM2+
)
DQB-Licenciatura em Bioquímica 27
10 𝑚𝑚 − 1 𝑚𝑖𝑛𝑢𝑡𝑜 10𝑚𝑚 − 𝑥
𝑥 = 1 𝑚𝑖𝑛𝑢𝑡𝑜
Num minuto consome-se 70,84 nmol de O2
𝑣 𝑓𝑜𝑡𝑜𝑠𝑠𝑖𝑛𝑡é𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑉𝑀 =70,84
0,275= 258 𝑛𝑚𝑜𝑙 𝑂2𝑚𝑖𝑛−1𝑚𝑔−1
𝑣 𝑓𝑜𝑡𝑜𝑠𝑠𝑖𝑛𝑡é𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑁𝑎𝑁3 = 293 𝑛𝑚𝑜𝑙 𝑂2𝑚𝑖𝑛−1𝑚𝑔−1
Viologénio de metilo (VM2+
)
DQB-Licenciatura em Bioquímica 28
Aumento do volume
de viologénio de
metilo (aceitador de
electrões)
Aumento do
consumo de
oxigénio
Maior
velocidade
fotossintética
Era o esperado
Quadro 7. Valores de velocidade fotossintética para o viologénio de metilo e do azeto de sódio
Ensaio
Vfotossintética VM
/ nmol O2 min-1 mg-1
Vfotossintética NaN3
/ mol O2 min-1 mg-1
25 μL VM + 50 μL NaN3 258 293
50 μL VM + 50 μL NaN3 373 274
100 μL VM + 50 μL NaN3 291 323
Viologénio de metilo (VM2+
)
DQB-Licenciatura em Bioquímica 29
Azeto de sódio Inibe o catalase
Impede a
formação de
oxigénio
Pela
degradação
do H2O2
Só há consumo de
oxigénio
Aumento do consumo
de oxigénio com a
presença de azeto
Observou-se
para os ensaios
1 e 3
Não se
observou para
o ensaio 2
Mais VM
Menos NaN3
Actividade do PS I
DQB-Licenciatura em Bioquímica 30
VM
DCMU
Asc - DCPIP
[O2]
/ m
ol
Vpapel / min
Figura 12. Ensaio da actividade do PS I.
Actividade do PS I
DQB-Licenciatura em Bioquímica 31
𝑣 𝑓𝑜𝑡𝑜𝑠𝑠𝑖𝑛𝑡é𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑃𝑆 𝐼𝐼 + 𝑃𝑆 𝐼 =59,5
0,1375= 430 𝑛𝑚𝑜𝑙 𝑂2𝑚𝑖𝑛−1𝑚𝑔−1
𝑣 𝑓𝑜𝑡𝑜𝑠𝑠𝑖𝑛𝑡é𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑃𝑆 𝐼 =157
0,1375= 1140 𝑛𝑚𝑜𝑙 𝑂2𝑚𝑖𝑛−1𝑚𝑔−1
Antes
DCMU
Quantidade de
O2 consumida é
inferior
Depois
DCMU
Sem
DCMU Não inibição do
PS II
Síntese
O2
Equilíbrio
entre síntese
e consumo de
O2
Actividade do PS I
DQB-Licenciatura em Bioquímica 32
Síntese de O2
Quando se inibiu o PSII
(com DMCU) apenas se
regista o consumo de O2
e, assim, o declive é mais
acentuado
Figura 12. Transporte electrónico e geração de NADPH e ATP nos cloroplastos. PQ: plastoquinona; PC: plastociana; fd: ferredoxina; DCMU: 3-(3,4-diclorofenilo)-1,1-dimetilureia.
Conclusão
DQB-Licenciatura em Bioquímica 33
• A velocidade fotossintética aumenta com o aumento da concentração do
reagente de Hill;
• Era de esperar que com o aumento do volume de VM houvesse uma maior
velocidade fotossintética, devido ao aumento do consumo de oxigénio, no
entanto isso não se verificou;
• Com o azeto de sódio é esperado que aumentasse o consumo de oxigénio, no
entanto este facto só se observou para os ensaios 1 e 3;
• A velocidade de consumo é mais acentuada quando apenas se fornece o
substrato ao PS I;
• O método do eléctrodo de oxigénio é mais rigoroso que o método
espectrofotométrico.
Referências
DQB-Licenciatura em Bioquímica 34
• Lodish, et al. (2008). Molecular Cell Biology, Sixth Edition. New York: W. H. Freeman
and Company.
• Nelson, D., Cox, M. (2008). Lehninger, Principles of Biochemistry, Fifth Edition. New
York: W. H. Freeman and Company.
• Allen, J., & Holmes, N. (1999). Electron transport and redox titration, in Photosynthesis
energy transduction: a practical approach. Oxford: IRL Press.
• Plummer, D. (1987). An Introduction to Practical Biochemistry . London: McGraw-Hill.