Extração Líquido-Líquido

Operação Unitária de transferência de massa

utilizada para separar componentes presentes em

uma solução e/ou suspensão, distribuindo-os

entre fases líquidas parcialmente solúveis ou

insolúveis.

PURIFICAÇÃO DE PRODUTOS BIOTECNOLÓGICOS

Purificação

Clarificação

Rompimento Celular

Separação de Células

Bioprodutos Intracelulares

Bioprodutos Extracelulares

Acabamento

BIOPRODUTO

ELLBio

Sistemas Poliméricos (PEG)

de Duas Fases Aquosas

(SPDFA)

Sistemas Micelares de Duas Fases Aquosas

(SMDFA)

Sistemas Micelares Reversos

(SMR)

ELLBio

EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO DE BIOMOLÉCULAS

Vantagens comuns aos 3 métodos

• Rápidos

• Baixo custo

• Biocompatíveis

- massa

Fase Líquida Inicial

Meio inicial: solução e/ou suspensão

Fase Líquida II(inferior)

Fase Líquida I(superior)

Sistema de duas fases

transferência de massa

Processo de separação de fases

A FI

AFII

K =

FP =Ae(fase ext)

Ae(inicial)

R(%) =AFI

Ainicial

. 100

separação – em função da diferença de solubilidade da biomolécula nas fases

1) Dois polímeros não-iônicos:

PEG x Dextrana

PEG x Polivinil álcool

PPG x Dextrana

Metil Celulose x Hidroxipropil dextrana

2) Polieletrólito x Polímero não-iônico

Sulfato dextrana de sódio x polipropileno-glicol

Carboximetilcelulose de sódio x metil celulose

3) Dois polieletrólitos

Sulfato dextrana de sódio x carboximetildextrana de sódio

Carboximetildextrana de sódio x carboximetilcelulose de sódio

4) Polímero não-iônico x Composto de baixa massa molar

PPG x fosfato de potássio

PEG x fosfato de potássio

metoxipolietileno glicol x fosfato de potássio

PPG x glicose

PEG x glicose

PEG x sulfato de magnésio

PEG x citrato de sódio

PEG x Dextrana

PPG x Dextrana

PEG x fosfato de potássio

PEG x sulfato de magnésio

PEG x citrato de sódio

• Rápida separação de fases

• Baixo custo

• Elevada seletividade na separação baseada na solubilidade

Fase de fundo

Diagrama de fases:

• ordenada: composição da molécula de maior concentração na fase de

TOPO (PEG, por exemplo)

• abscissa: composição da molécula de maior concentração na fase de

FUNDO (Fosfato, por exemplo)

• ambos os componentes do sistema estão presentes nas duas fases

• o diagrama pode ser construído, determinando-se a composição das fases

em equilíbrio de uma série de sistemas

• pontos acima da curva binodal: formação de duas fases

• pontos abaixo da curva binodal: única fase

Formação do SPDFA depende da concentração dos componentes do sistema

PEG (%massa)

T

M

B

Curva de equilíbrio de um sistema PEG/fosfato

Fosfato (%massa)

Composição

inicial

Composição da fase Topo

Composição da fase de Fundo

Linha de amarração ou “tie line”

Curva binodal

C

Ponto crítico

Linha de amarração

sistemas cuja composição inicial encontra-se sobre uma mesma linha de amarração possuem a mesma composição final

• As relação de volumes entre as fases varia com a composição -

de acordo com a razão entre os segmentos TM e BM

• Segmento TM – proporcional ao volume da fase de FUNDO

• Segmento BM – proporcional ao volume da fase de TOPO

• C - Ponto crítico – composições e volumes da fase TOPO e FUNDO são iguais. Sistema instável.

VOLUMES DAS FASES EM FUNÇÃO DAS

CONCENTRAÇÕES DOS COMPONENTES DO

SISTEMA DE EXTRAÇÃO POR SPDFA

0 5 10 15 20 250

10

20

30

40

50

pH 6,5 pH 7,0 pH 8,0 pH 9,0

PE

G 6

00

(%

p/p

)

Fosfato de Potássio (% p/p)

Curvas binodiais de sistemas com PEG 600 em diversos valores de

pH

0 5 10 15

0

10

20

30

40

50

pH 5,0 pH 6,5 pH 7,0 pH 8,0 pH 9,0

PE

G 6

000 (

% p

/p)

Fosfato de Potássio (% p/p)

Curvas binodiais de sistemas com PEG 6000 em diversos

valores de pH

A variação do pH altera a razão H2PO4-/HPO4

-2

varia a composição o equilíbrio entre as fases

0 5 10 15 20 25

0

10

20

30

40

50

PEG 600 PEG 1500 PEG 4000 PEG 6000

PE

G (

% p

/p)

Fosfato de Potássio (% p/p) pH 8,0

Curvas binodiais de sistemas com massas molares 600, 1500, 4000 e 6000 em pH 8,0

fórmula geral: HO-(CH2CH2)n-CH2CH2OH.

Massas molares:

Abaixo de 1000 Daltons: líquido

Acima de 1000 Daltons: sólido (pó, flocos)

Prática:

Soluções-Estoque 50% m/m

Não se trabalha com

volume devido à alta viscosidade

FATORES QUE INFLUENCIAM NO COEFICIENTE DE PARTIÇÃO (K) DE BIOMOLÉCULAS

Interações HidrofóbicasCargas superficiais / pHDiferença de Potencial Elétrico entre as FasesEfeito de “Salting-Out” da fase salinaDiferenças de ViscosidadeDiferenças de DensidadeInterações BioespecíficasDiagramas de Fases (conc. PEG e sal, p. ex.)Massa molar da biomolécula

Fatores Ambientais

1 Concentração de Polímeros2 Tipo e Concentração de Sal3 Ligantes4 Massa Molar do PEG5 pH6 Temperatura7 Tempo de Mistura e Separação

Fatores Estruturais

1 Resíduos hidrofóbicos

2 Massa molar da Biomolécula

3 Formato da biomolécula

FiCTiC

K =

Coeficiente de Partição

CTi - concentração, ou atividade, do soluto i na fase de topo

CFi - concentração, ou atividade, do soluto i na fase de fundo.

100VC

VC(%)R

inicialinicial

topotopotopo

Rtopo = rendimento na fase de topo (%)

Ctopo = concentração ou atividade da biomolécula na fase de topo (g/L ou U/mL)

Cinicial = concentração ou atividade da biomolécula na amostra antes da extração

(g/L ou U/mL)

totaisproteínas

alvoabiomolécul

K

KS

100).VC

VCVC(BM

inicialinicial

fundofundotopotopo

Extração de retamicina (fase de topo) de meio contendo células de Streptomyces olindensis (fase de fundo) em SPDFA formados por PEG/citrato e PEG/fosfato: (1) PEG 400, (2) PEG 1500 e (3) PEG 6000).

PEG/Sodium Citrate PEG/Potassium Phosphate

Clarificação simultânea à purificação

células na interface células no fundo

• Têm como base a capacidade que as biomoléculas têm de reconhecer e se ligar a outras moléculas, especificamente

• Interações por afinidade: aumentam a partição - K Kaf

• O ligante é ligado covalentemente ao polímero – em geral PEG

formação do complexo polímero-ligante-biomolécula

• O PEG reage facilmente com ligantes, pois contém hidroxilas substituíveis

• O ligante pode ser natural ou sintético

• custo x benefício deve ser favorável

•o ligante deve ser bifuncional – um sítio de ligação para afinidade com a biomolécula e outro sítio para imobilização no polímero

• deve ser estável durante a imobilização

• deve ser estável durante o processo de extração

•não deve conter outros grupos que tenham afinidade por outras partes da biomolécula

• não deve ser tóxico

• disponível

• fácil rompimento da interação polímero/biomolécula.

Exemplos de material purificado por partição de afinidadeSistema Material purificado Ligante

PEG/Dextrana -galactosidase APGP

PEG/palmitato BSA e -lactalbumina Ácidos graxos

PEG/fosfato Proteína A IgG humana

PEG/fosfato Penicilina acilase Trimetilamina

PEG/Dextrana Tripsina Inibidor de tripsina

PEG/Dextrana Lipossomos Avidina

Dext./Hidropropildextrana.

Quimosina pepstatina

PEG/Dextrana Módulos de carbohidrolases Domínios de ligação da celulose

PEG/Dextrana Membranas da glândula lacrimal Aglutinina de trigo

PEG/fosfato Amido Glicoamilase

PEG/Dextrana Aglutinina de germe de trigo Membrana plasmática de fígado de rato

PEG/Dextrana Ácidos graxos de cadeia entre C2 à C18 Albumina do soro humano, ß-lactoglobulina, hemoglobulina, mioglobina

PEG/Dextrana Ácidos graxos saturados de cadeia entre C2 à C18 e insaturados de 18:1, 18:2 e 18:3, grupos acila e Benzoatos

Albumina, lizozima, ribonuclease, α2- macroglobulina

PEG/Dextrana IgG com fluído de ferro magnetizado Proteína A

Sistema de afinidade: fase superior rica em PEG-ligante e a molécula alvo a ser purificada e fase inferior rica em sal (sulfato de sódio) e contaminantes.

Processo de reciclagem do polímero

Proteínas purificadas por partição de metal-afinidade em SDFA

Proteína Metal

Citocromo c de Candida krusei Cobre

Hemoglobina bovina Cobre, Ferro

Eritrócitos Cobre, Zinco

2macroglobulina Cobre, Zinco

Hemoglobina humana Cobre

Fosvitina Ferro

Oxinitrilase Cobre

Desidrogenases alcoólicas, lactato e malato desidrogenase

Cobre, Níquel, Zinco e Cádmio

Linfócitos Cobre, Níquel, Zinco

Lactato desidrogenase Cobre

Células de mamíferos Cobre

Peroxidase de nabo Cobre

Peroxidase de soja Cobre

Proteina de membrana: citocromo bo(3) ubiquinol oxidase c

Cobre

Lactato desidrogenase acoplada a resíduo de polihistidina

Cobre

Biomoléculas nucleotídeo-dependentes purificadas em SDFA com afinidade a corantes.

SistemaBiomolécula Ligante acoplado

ao PEG

PEG/Dextrana

Lactato desidrogenase Corante triazina Cibacron Blue F3G-A

PEG/fosfato

Lactato desidrogenase Eudragit-Cibacron Blue

PEG/Dextrana

Fosfofrutoquinase de levedura

Cibacron Blue F3G-A-PEG

PEG/Dextrana

Isoenzimas de fosfatase alcalina

Procion Yellow H-E3G-PEG

PEG/Dextrana

Fosfoglicerato quinase Cibacron Blue-PEG

PEG/Dextrana

Formato desidrogenase Cibacron Blue-PEG

PEG/fosfato

Xilose redutase Drimaren

)(

)(

ligantesemPEG

ligantePEGaf K

KK

Equipamentos para extração com sistemas de duas fases aquosas

Extratores e colunas de extração líquido-líquido têm basicamente duas funções:

1. Estabelecer o contato entre as duas fases líquidas do sistema para possibilitar a transferência de massa

2. Separar os dois líquidos após a extração

Equipamento por estágios

• Misturador – decantador*• Misturador – decantador em cascata vertical

Equipamentos de contato diferencial

• Coluna de extração por estágios

• Coluna de extração spray*

• Coluna de extração com recheio

• Extrator de discos rotativos perfurados

• Extrator Graesser

Equipamentos centrífugos

Mais importante: extrator Podbielniak

Tambor cilíndrico com placas concêntricas

Fase pesada é alimentada no centro do tambor enquanto a fase leve é alimentada na periferia do extrator

Escoamento contra-corrente