Estudo molecular e funcional do genoma humano Explosão de ferramentas de biologia
molecular, celular e bioquímicas nos últimos anos
As mesmas técnicas podem ser usadas para múltiplos objectivos: Diagnóstico de determinada doença Avaliar prognóstico, optimizar terapêutica,… Investigação – tentar identificar/caracterizar a
etiologia ou a patogénese …
Estudo molecular e funcional do genoma humano Aplicações em todas as áreas da medicina Exemplos: Identificar alterações genéticas germinativas No contexto de uma das milhares de doenças
genéticas/cromossómicas Farmacogenómica – tentar prever respostas a
terapêuticas dependendo do perfil genético de cada indivíduo
Microbiologia Oncologia – alterações somáticas (ou também
germinativas nos casos de síndromes de predisposição para cancro)
…
Identificar Variações de Sequência – Principais técnicas Southern, Western e Northern-blotting PCR, “Nested PCR”, RT-PCR, R-PCR Métodos de rastreio de mutações: SSCP,
DGGE,… Enzimas de restrição / RFLP Sequenciação: 1º, 2º e 3º geração MLPA Micro-array Métodos de estudo de metilação
Principais técnicas de diagnóstico de doenças genéticas constitucionais
“alts dosagem génica” Cariótipo MLPA, FISH Array Comparative
Genomic Hybridization (CGH)
Sequenciação de 1º geração (Sanger)
Arrays de genotipagem Sequenciação de 2º e
3º geração
Anomalias Cromossómicas Variações de sequência
Alterações da metilação
MS-MLPA e outros estudos de metilação
Técnicas quantitativas: Identificar alterações da dosagem génica A nível cromossómico - Citogenética
convencional e molecular: Cariótipo FISH CGH arrayCGH
A nível genético: R-PCR, Q-PCR MLPA arrayCGH
Mutação dinâmica Antecipação Repetição de tripletos CGG (5’-UTR)
Normal: 6 a 44 Intermédio: 45 a 54 Pré-mutação: 55-200 Mutação: mais de ~200 Hagerman, 2004
Inactivação do gene RNAm
(CGG)n
Metilação
?
Síndrome do X-frágil
Sequenciação do DNA
Permite determinar a ordem pela qual as bases constituem um fragmento de DNA
Método de Maxam e Gilbert (químico)
Método de Sanger (enzimático)
Método automático de sequenciação - 1ª geração
Métodos de sequenciação de 2ª geração
(Métodos de sequenciação de 3ª geração)
Sequenciação
Aplicações: - Sequenciação do genoma humano; - Pesquisa de mutações em genes candidatos em DNA de doentes
portadores da doença; - Identificação de mutações em doentes ou eventuais portadores; - Particularmente útil quando não há uma mutação única associada à
doença (heterogeneidade alélica); - Nos casos de heterogeneidade de locus (ex. HNPCC), pode ser
necessário sequenciar vários genes.
É o único método que permite descrever a
sequência nucleotídica completa
Seq. Normal - CGC CGG GTC CTC CAA GCC CTG GAG GGG CTG AAA Seq. Mutada - CGC GGG TCC TCC AAG CCC TGG AGG GGC TGA
Cd 102 Cd 110
= CD102 (-C)
Frameshift codão stop 110
c.304delC; p.(Arg102Glyfs*8)
Caso clinico Jovem 28 anos do sexo masculino com surdez neurosensorial grave-profunda
bilateral notada desde os 2A. Usou proteses desde infancia. Ganho tonal: 20-30dbs com ambas as próteses. Ganho vocal insuficiente com discriminação máxima de 50% aos 80dBs. IC do OE aos 27 anos. TC ouvido interno revelou malformação de Mondini bilateral. Pais não consanguíneos. Pais e outros familiares com alguma diminuição da acuidade auditiva com a idade.
Colocada a hipótese de Síndrome de Pendred
Next generation sequencing (2ª, NGS) Massive paralel sequencing
Tecnologias complexas e revolucionárias com múltiplas aplicações Principal vantagem: permitem obter grandes quantidades de
sequências, de modo rápido e a baixo custo (tendo em consideração a quantidade de dados obtidos)
Sequenciação automática de Sanger: Numa reacção: PCR 1 fragmento 1 sequência obtida
Sequenciação de segunda geração: Numa reacção: amplificação milhares de fragmentos
Milhões de sequências obtidas
Sequenciação de terceira geração Sem necessidade de amplificação leitura de molécula de
DNA única
Next Generation Sequencing (2ª)
Várias estratégias que combinam: 1 – preparação dos templates / libraries (com/sem passo de enriquecimento) 2 – sequenciação e visualização 3 – análise bioinformática dos dados:
a) alinhamento e mapeamento das sequencias obtidas; b) identificação e anotação das variações de sequência encontradas; c) análise e filtragem das variações de sequência
Next Generation Sequencing (2ª) O que sequenciar?
Todo o genoma (WGS – Whole Genome sequencing)
Determinado(s) alvo(s) seleccionados – uso de métodos de captura / enriquecimento Exoma (WES – whole exome sequencing)
sequenciação da região codificante de “todos” os genes conhecidos
Mendelioma ou “Exoma clinico” ou “Disease exome” sequenciação da região codificante de “todos” os genes
associados a doenças mendelianas conhecidas
Painel de genes associados a determinado grupo de doenças
etc
Sequencing the genome
2001, Human Genome Project : 13 years, $2.7 billion (Sanger sequencing)
2008: 5 months, $1.5 million (NGS) 2011: few days, < $10 000
2013: $1000?
J Med Genet 2011;48:580-589. doi:10.1136/jmedgenet-2011-100223
Sequencing genome vs exome
Human genome ~3,000 Mb Exome ~30 Mb
Vast amounts of genotype and phenotype data
are now being generated Challenge: Interpreting all these new data and
translating the findings to practical healthcare
J Med Genet 2011;48:580-589. doi:10.1136/jmedgenet-2011-100223
Variants “Genetic filter”
Mutations segregating with the disease in the family?
AD families – possibility of incomplete penetrance, variable expression or just mistake in phenotyping…
Additional mutations in other families/affected individuals with the same phenotype?
Not present in variant databases? Heterozygous vs homozygous or compound heterozygous state
Which treshold to use?
Not present in ethnic matched controls?
Variants “Functional filter” Missense/nonsense/frameshift/splice site
Evolutionary converved residue?
Precicted to be damaging? In silico analysis: Polyphen, SIFT
Predicted to affect splicing? In silico analysis
Location in the protein? 3D structure modelling?
Nonsense-mediated decay?
“Good” candidate gene?
Expressed in target tissues?
Mouse KO? Other models already developed?
WES – limites / desafios
Interpretação patogenicidade – variantes de significado incerto
Achados secundários ou incidentais Falsos positivos Cobertura – regiões não sequenciadas Idade pediátrica vs idade adulta?
Estudo de painéis de genes > mais fácil vs exoma seguido analise tipo painel?
Paineis NGS
Sequenciação da região codificante de um numero menor de genes Kits comerciais – mais baratos mas nem sempre os melhores Desenhados por cada laboratório – mais caros mas
potencialmente mais eficazes
Tamanho do alvo - nr de genes / exões/ pares de bases Nr pequeno-médio
Melhor cobertura Mais fácil interpretação Resultados mais fiáveis Menos achados secundários/incidentais
Osteogénese Imperfeita AD, genes COL1A1 e COL1A2
Fenótipo Manifestação Esclera Prognóstico Ossos tubulares Heredit.
I Nascimento ou mais tarde Azul Bom
Direitos; ligeiro abaulamento,
correcção espontânea AD
II-A In utero Azul Morte precoce Curtos, espessos. AD
II-B Forma neonatal de III
II-C In utero Azul Morte precoce Finos, retorcidos AR
III In utero ou mais tarde
Branca (azul ao
nascimento)
Quadro grave, por vezes morte
precoce
Espessos ao nascimento,
adelgaçamento e deformidade progressivos
AD
IV Nascimento ou mais tarde
Branca (azul ao
nascimento)
Geralmente bom; baixa estatura
Direitos: abaulamento pode aumentar AD
V Nascimento ou mais tarde Branca Geralmente bom;
baixa estatura
Calos hiperplásicos, membrana intra-óssea
calcificada AD
Classificação clínica de osteogénese imperfeita (modificado por Sillence 1979 e 1984, adaptado de Spranger et al, Bone Dysplasias, 2ª edição, 2002)
Exemplo de Mutações em proteínas multiméricas
Gene COL1A1
Gene COL1A2
proteínas normais, com 2 cadeias 1 e 1 cadeia 2
2n 1
n 2
Cromossoma 17 Cromossoma 7
COL1A1 COL1A2
1/2 moléculas normais
n 1 n 2
Todos os peptideos
sintetizados são normais
Ausência de proteina
Mutação nonsense ou fs (com NMD) ou delecção de todo
o gene em heterozigotia Situação normal
Exemplo de Mutações em proteínas multiméricas
Gene COL1A1
Gene COL1A2
proteínas normais, com 2 cadeias 1 e 1 cadeia 2
2n 1
n 2
Apenas 1/4 de proteínas funcionais, com as 3
cadeias normais 3/4 de proteínas não funcionais
Mutação
missense Cromossoma 17 Cromossoma 7
Gene COL1A1
Gene COL1A2
Apenas 1/4 de proteínas funcionais, com as 3
cadeias normais 3/4 de proteínas não funcionais
Mutação
missense
Mutações missense afectando glicinas da tripla hélice → mutações antimórficas, efeito dominante
negativo → fenótipos graves de OI
COL1A1
COL1A2
1/2 moléculas normais
n 1 n 2
Só se sintetizam
peptídeos normais
Ausência de proteina
Mutação nonsense ou fs (com NMD) ou delecção de todo
o gene
Mutações nonsense ou fs ou deleção de todo o gene
→ mutações amórficas, efeito de haploinsuficiência → fenótipos leves de OI (tipo 1)
Fetus of D.M. First pregnancy of healthy non-consanguineous
parents
• Height – mother 1,60m; father =1,88m
• Family history – not relevant
• Increased nucal translucency -> CVS -> 46,XY
• US – growth restriction, small limbs, fractures?
• TOP - 22 weeks
Mendelioma ou “Exoma clinico” Painel cujo alvo são “todos” os genes associados a
doenças mendelianas conhecidas Kits comercias desenvolvidos por empresas e passíveis
de ser usados em qualquer laboratório Vantagens
Custo: mais barato que painel ; pouco mais barato que WES
Interpretação mais fácil q exoma, mais dificil q painel
ADPM / défice intelectual (ID)
• 3% da população • > 500 genes conhecidos, estimativa > 1000 • Estratégia diagnóstica:
1. Estudo FMR1 – pesquisa de síndrome do X-Frágil
2. Array CGH 3. “screening metabólico” -> treatable ID 4. Painel NGS vs Mendelioma vs Exoma
Estudos NGS Painel Mendelioma Exoma
Custos Variáveis, podem ser equivalentes por teste, mas muitíssimo mais baratos q Sanger!!
~1000 euros Mais caro por base
~1450 euros Intermédio
~1800 euros Mais barato por base
Profundidade de cobertura alvo ++++ +/++ (variavel) +/++ (variavel)
Interpretação Variantes significado incerto
Mais fácil +
Intermédia ++
Dificil (trio…) +++
Achados Secundários Dilemas éticos
Menor Nr +
Intermédio ++
Maior Nr +++
Nível de formação dos profissionais envolvidos, nível de explicação e tempo de consulta para consentimento, capacidade de entendimento do individuo / casal
Menor Intermédio Elevado
Necessidade de atualização regular do teste
Mais dificil, dependente laboratório
Automática (empresa)
Automática (empresa)
Nível de caracterização fenotípica necessária
Pré-teste ++ Pós –teste ++ Pós –teste +++
Outros Difícil se muitos genes alvo
Fenótipo atípico, não classificável e/ou se mutação causadora localizada em gene não anteriormente associado ao fenótipo em causa
Análise como painel
Questões para o clínico
WES vs Mendelioma vs painel?
WES - Qual exoma mais apropriado? Só no caso index ou em trio
Painel - Qual o mais apropriado?
Qual o laboratório e como o encontrar?
privado/publico
inter/nacional
especialistas naquele grupo de patologias ou não? médicos geneticistas na equipa de interpretação?
Questões para o clínico
Como avaliar as múltiplas variáveis associadas a cada teste:
Qualidade da sequenciação (Certificação?)
Painel: grau de cobertura e profundidade de cobertura dos genes alvo? Complementado por sequenciação de Sanger quando cobertura insuficiente?
WES: que genes/exões não são cobertos e são importantes ter em conta para a patologia em causa?
Nível e confiança na interpretação oferecida?
Questões para o clínico
Qual o consentimento informado apropriado para cada teste e como o obter?
Como lidar com os achados secundários ou “incidentais”?
Quando e como referenciar a consulta de genética?
Se teste “negativo” ou inconclusivo, quando “repetir”?
Como organizar formação adequada nesta área aos múltiplos profissionais?
Sequenciação de nova geração – perspectivas
Inevitável - muito mais barata
Próximos anos: problemas/dilemas exponencialmente acrescidos
Melhoria progressiva da interpretação graças a melhoria de software de interpretação bases de dados da variação normal bases de dados mutações consideradas patogénicas
Aumento da capacidade de detecção
grandes delecções/duplicações rearranjos equilibrados (translocações inversões) padrão de metilação a nível do genoma
Diagnóstico - Perspectivas futuras
“alts dosagem génica” Cariótipo MLPA, FISH Array Comparative
Genomic Hybridization (CGH)
Sequenciação de 1º (Sanger)
Arrays de genotipagem Sequenciação de 2º e
3º geração
Anomalias Cromossómicas Variações de sequência
Alterações da metilação
MS-MLPA e outros estudos de metilação
- Painel de genes - Exoma - Genoma
1 teste único! -Temos de nos preparar - Primasia – debate ético