IMUNODIAGNÓSTICO: Diagnóstico laboratorial
por meio de técnicas imunológicas.
Busca: Anticorpo ou Antígeno no organismo vertebrado
suspeito de estar infectado usando-se ensaios de
Precipitação, Aglutinação, Fixação de complemento,
Neutralização ou Imunoensaios com Acs ou Ags
marcados que utilizam sinalizadores da interação Ag-Ac
com conjugados ligantes, como Imunofluorescência,
Radioimunoensaio, Imunoenzimáticos,
Imunofluorimétricos e Quimioluminiscência
Outros testes: Hipersensibilidade a Antígenos: Reações
intradérmicas e percutâneas (Testes in vivo).
É uma associação biomolecular semelhante à
interação de enzimas com seus substratos ou de
hormônios com seus receptores, com uma distinção
bem evidente o Anticorpo não provoca nenhuma
alteração química irreversível na molécula de Ag,
podendo, portanto, o produto formado (Ag-Ac) se
dissociar nos seus 2 componentes Ag e Ac livres
/solução/suspensão.
Ag + Ac AgAc (Imunecomplexos)
• A interação entre Ag e Ac envolve a ocorrência de
várias forças não covalentes entre o determinante
antigênico (epítopo) da molécula do Ag e o sítio
combinatório (parátopo) da molécula do Ac,
constituído pelas regiões (domínios) variáveis de
cadeia L e de cadeia H (VL / VH) e particularmente
pelas regiões hipervariáveis ou regiões determinantes
de complementaridade (CDRs) de VH e de VL.
A elevada especificidade das interações Ag e Ac
possibilitou:
1) O desenvolvimento de uma grande variedade de ensaios
ou reações sorológicas
2) As reações sorológicas podem detectar / identificar /
mensurar tanto Ags como Acs.
3) As reações sorológicas revestem-se de uma enorme
importância para:
3.1) O diagnóstico laboratorial de enfermidades
infecciosas
3.2) O monitoramento da intensidade de respostas
humorais pós-vacinação e também para detectar / mensurar /
identificar imunoquimicamente moléculas de interesse
biológico ou médico
4) Os ensaios sorológicos podem diferir em parâmetros
como limiar de detecção, sensibilidade, especificidade,
reprodutibilidade e alguns podem ser quantitativos enquanto
outros são qualitativos.
ENSAIOS SOROLÓGICOS
Primários detectam a interação direta entre
antígeno e anticorpo: Ex. Radioimnoensaio,
Imunofluorescência, ELISA
Secundários detectam conseqüências da interação
entre antígeno e anticorpo mudanças no estado
físico do antígeno: Imunodifusão, Aglutinação,
Fixação de Complemento.
Van Oss, 2000; Janeway, 2001
Ac + Ag Ac-Ag K1
K2
K1 = 1010 M-1 alta afinidade
Metodologias que utilizam reagentes não marcados:
•Precipitação
•Aglutinação
•Hemólise (Fixação de Complemento)
Metodologias que utilizam reagentes marcados:
•Radioimunoensaios
•ELISA
•Imunofluorescência
•Western Blotting
•Citometria de Fluxo.
• Conceito de chave e fechadura
• Ligações não-covalentes
– Pontes de Hidrogênio
– Ligações Eletrostáticas
– Forças de Van der Waals
– Ligações Hidrofóbicas
• Reversível
• Ligações Múltiplas
Source: Li, Y., Li, H., Smith-Gill, S. J.,
Mariuzza, R. A., Biochemistry 39, 6296, 2000
http://www.med.sc.edu:85/chime2/lyso-abfr.htm
O complexo Ag-Ac tende
a se manter unidos
Ac
Ag
Alta
Afinidade Ac
Ag
baixa
Afinidade
Afinidade
• Refere-se à força da interação entre um determinante
antigênico e o parátopo de um Ac homólogo.
Os complexo Ag-Ac
tende a se dissociar
Avidez • A força total de ligação entre um Ag com
vários determinantes e Acs multivalentes.
Keq = 104
Afinidade
106
Avidez
1010
Avidez
É a habilidade de um anticorpo reagir por meio do seu sitio combinatório com somente um determinante antigênico
Outros autores definem: É a habilidade de uma população de
moléculas de anticorpos reagirem fortemente com um antígeno e fracamente com outro Ag de estrutura semelhante.
Reatividade Cruzada • É a habilidade de um Ac reagir através de seu
parátopo com mais que um determinante
antigênico.
• É a habilidade de uma população de moléculas
de Acs reagirem com mais de um Ag
Anti-A
Ac
Ag A
Anti-A
Ac
Ag B
Epítopo
compartilhado
Anti-A
Ac
Ag C
Epítopo similar
Reações cruzadas
Fatores que Afetam as Reações Ag/Ac
• Afinidade
• Avidez
• Relação [Ag]:[Ac]
• Forma física do Ag
(solúvel ou particulado)
Excesso de Ac Excesso de Ag
Equivalência – formação de rede
Todos os testes baseados nas reações Ag/Ac dependerão da formação de rede ou eles terão de utilizar outras vias para detectar pequenos complexos imunes
Todos testes baseados nas reações Ag/Ac podem ser usados para detectar o Ag ou Ac
SINAL
Resultado da integração de impulsos elementares oriundos da reação do anticorpo com o seu epítopo
É de natureza variável segundo a técnica utilizada.
SINAL X RUÍDO
RUÍDO
Qualquer reatividade inespecífica
resultante de outras causas, que
não a reação antígeno-anticorpo, e
que pode interferir na capacidade
discriminativa do teste sorológico.
SINAL X RUÍDO
Menor número de impulsos
elementares necessários para o
desenvolvimento de um sinal
discriminatório, correspondendo a um
resultado positivo
LIMIAR DE DETECÇÃO
DE UM TESTE
SOROLÓGICO
Fatores que afetam a medição de reações antígeno-anticorpo
1. Afinidade
Quanto maior a afinidade do Ac pelo Ag, mais estável será a interação. Nesse
caso, a facilidade com que se pode detectar a interação é maior
2. Avidez
Reações entre antígenos multivalentes e anticorpos multivalentes são mais
estáveis e portanto mais fáceis de detectar
3. Razão entre antígeno e anticorpo
A razão entre o antígeno e o anticorpo influencia a detecção dos complexos
antígeno-anticorpo porque o tamanho dos complexos está relacionado com a
concentração do antígeno e do anticorpo
4. Forma física do antígeno
A forma física do antígeno influencia em como se detecta a reação AgAc. Se o
Ag é particulado, geralmente se observa a aglutinação do Ag pelo Ac. Se o Ag
é solúvel, geralmente se pesquisa a precipitação de um antígeno após a
produção de grandes complexos AgAc insolúveis.
LIMIAR DE DETECÇÃO OU
SENSIBILIDADE ANALÍTICA
DE ALGUMAS REAÇÕES
SOROLÓGICAS
LIMIAR DE DETECÇÃO OU
SENSIBILIDADE ANALÍTICA
DE ALGUMAS REAÇÕES
SOROLÓGICAS
TESTES DE LIGAÇÃO
PRIMÁRIA
• RIE 0,00005 g/ml
• ELISA 0,0005 g/ml
TESTES DE LIGAÇÃO
SECUNDÁRIA
• HEMAGLUT. PASSIVA 0,01 g /ml
• RFC 0,05 g/ml
• AGLUT. BACTÉRIAS 10,05 g /ml
• PRECIPITAÇÃO GEL 30,00 g/ml
3) Testes de Aglutinação: – simples, baratos, um pouco
mais sensíveis!
Existem Vários Tipos:
a) Hemaglutinação dos Eritrócitos
b) Aglutinação Bacteriana
c) Aglutinação Passiva
d) Inibição da Aglutinação (Inib. Hemaglutinação – HI)
Aglutinação/Hemaglutinação
• Definição - testes que têm como seu ponto final a
aglutinação de um antígeno de natureza particulado
(células procarióticas ou eucarióticas)
– Acs: Aglutinina/hemaglutinina, principalmente do
isótipo IgM* e IgG
+
• Teste de aglutinação qualitativa
– Podem ser pesquisados Ag ou Ac (*Via de regra é o
Ag, Ex; tipagem de grupos sanguíneos)
• Aplicações
– Tipagem de sangue
– Infecções Bacterianas
• Considerações Práticas
– Fácil
– Semi-quantitativo
1/2
1/4
1/8
1/1
6
1/3
2
1/6
4
1/1
28
1/2
56
1/5
12
Teste de aglutinação quantitativa
◦ Título: recíproca da > diluição com resultado +
◦ Efeito Prozona 1
/2
1/4
1/8
1/1
6
1/3
2
1/6
4
1/1
28
1/2
56
1/5
12
1/1
02
4
Po
s.
Neg
.
Título
64
8
512
<2
32
128
32
4
Paciente
1
2
3
4
5
6
7
8
FIGURE 6-7
Demonstration of humaglutination using Ab against sheep
red blood cells (SRBCs): a constant # of SRBCs plus serial two-fold
dilutions of anti-SRBC serum
4. Agglutination Reactions
+ + + (control)
-visible clumping by interaction between Ab & a particulate antigen suchas RBC,
latex beads.
-depend on the crosslinking of polyvalent antigens, similar to precipitation rxns
(lgM is a good agglutinin)
-provide a way to type bacteria with a panel of typing antisera.
-routinely performed to type RBCs for blood transfusion.
Definição – teste de aglutinação feito com um
antígeno solúvel adsorvido a uma partícula (por
ex. Cels./hemácias ou partículas de látex)
+
Aplicações
– Medida de anticorpos para antígenos solúveis (por ex. Ags sols. do Toxoplasma gondii)
Aglutinação Passiva
• As particulas são revestidas com Ags,
• Partículas mais usadas Eritrócitos, látex, bentonita
ou carvão.
-Aglutinação Bacteriana
-As infecções bacterianas frequentemente induzem a
produção de Acs séricos específicos para Ags de
superfície das Bactérias.
-A presença de tais Acs pode ser detectada pelas
reações de aglutinação bacteriana.
-Os títulos dos Acs séricos de um indivíduo suspeito
é definido como a recíproca da maior diluição do
soro que produz uma reação positiva de aglutinação.
-O título aglutinante de um soro pode ser usado para
o diagnóstico de infecções bacterianas.
Um exemplo de teste de soro-
aglutinação com partículas é o teste
de Látex de aglutinação ou de
aglutinação bacteriana.
Ag Bacteriano Acs Anti-bacterianos
(+) (-)
Testes de Precipitação
- Formação de rede
- Tipo de Ags: Macromoléculas Solúveis
- Principais Acs envolvidos: IgG* e IgM
- Formação de Precipitado dos
Imunocomplexos
- Maior formação de precipitado de
imunecomplexos na zona de equivalência
entre as concentrações de Ag e de Ac
1. Reações de Precipitação:
-Acs e Ags em soluções aquosas formam uma rede/malha =>
Precipitação
A formação da rede requer:
1) Acs polivalentes
2) Ags devem ser bivalentes / polivalentes
Testes de Precipitação: – simples, baratos, mas específicos!
e pouco sensíveis!!!
Não Precipitação Precipitação +
TESTE DE LIGAÇÃO SECUNDÁRIA
•Nem todo anticorpo que reagiu participa da geração de sinal
•Sensibilidade analítica = 30 µg / mL
TESTE DE ELEVADA
ESPECIFICIDADE ANALÍTICA
BAIXÍSSIMA OCORRÊNCIA DE RUÍDO
TESTE DE
EXECUÇÃO SIMPLES
BAIXO CUSTO
FATORES QUE AFETAM A DIFUSÃO
•CONCENTRAÇÃO D=K x C
•TEMPERATURA D=K x T
•PESO MOLECULAR D=K x 1/PM
•FORMATO MOLÉCULA D=Maior moléculas esféricas
•VISCOSIDADE DO MEIO D= K x 1/V
•TAMANHO DO PORO (gel) D=K x DIAM. PORO
3. Precipitation Reactions
FIGURE 6-5
Diagrammatic representation of radial & double immunodiffusion. : precipitation reactions in gels yield visible precipitin lines; no visible precipitate forms in regions of Ab or Ag excess.
in the Ab-containing semisolid medium
The region of equivalence
-> The area is proportional to the conc. of Ag.
anti- A + anti B
NÃO IDENTIDADE DE ANTÍGENOS
ANTÍGENO A ANTÍGENO B
NÃO IDENTIDADE DE ANTÍGENOS
ANTÍGENO A ANTÍGENO B
-Formação de rede
-Tipo de Ags: Macromoléculas Solúveis
-Principais Acs envolvidos: IgG e IgM
-Formação de Precipitado dos
Imunocomplexos
-Maior formação de precipitado de
imunecomplexos na zona de equivalência
entre as concentrações de Ag e de Ac
Fig. 2.12. IDGA – IMUNODIFUSÃO DUPLA EM GEL DE ÁGAR - Ouchterlony gel-
diffusion assay for antigen:antibody binding.
Antigen and antibody are placed in different wells of an agar gel. They diffuse toward each
other and precipitate where they meet at equivalence, forming a visible band. When serum
samples in two wells are tested against the same well of antigen, the relatedness of the
samples can be determined by the shape of the precipitin line formed (not shown).
Método ◦ Ags sâo separados por eletroforese
• Interpretação – Precipitina representam os antígenos individuais
Ag
- +
Ag
Ac
Ag
Ac
– Ac é colocado dentro do agar cortado
Fig. 2.14. Immunoelectrophoresis reveals the presence of several
distinct immunoglobulin isotypes in normal human serum.
Método ◦ Ag e Ac migram em direção ao outro pela eletroforese
◦ Usado somente quando o Ag e o Ac têm cargas opostas
• Qualitativa –Rápida
Ag Ac
- +
Fixação de Complemento
– Ag misturado com soro teste para ser ensaiado pelo Ac
– Quantidade padrão de complemento é adicionado
– Eritrócitos cobertos com Acs é adicionado
– Determinação da quantidade de eritrócitos lisados
Ag
Soro de
paciente
Ag Sem Ag
Ag
• Metodologia