UNIVERSIDADE ANHANGUERA DE SÃO PAULO
DIRETORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU E
PESQUISA
MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA E INOVAÇÃO EM SAÚDE
DIRCEU APARECIDO GONÇALVES DE SOUZA
SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO DE COMPLEXOS METÁLICOS
CONTENDO ÁCIDO-3-CARBOXICUMARINA. AVALIAÇÃO DA
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE E ANTIMICROBIANA
SÃO PAULO
2017
SÃO PAULO
2017
DIRCEU APARECIDO GONÇALVES DE SOUZA
MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA E INOVAÇÃO EM SAÚDE
SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO DE COMPLEXOS METÁLICOS
CONTENDO ÁCIDO-3-CARBOXICUMARINA. AVALIAÇÃO DA
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE E ANTIMICROBIANA
DIRCEU APARECIDO GONÇALVES DE SOUZA
Trabalho final de Curso apresentado, como exigência parcial à Banca Examinadora da Universidade Anhanguera de São Paulo, para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia e Inovação em Saúde.
Orientador: Profª Drª. Regina Mara Silva Pereira.
S713s Souza, Dirceu Aparecido Gonçalves de
Síntese, caracterização de complexos metálicos contendo ácido-3-carboxicumarina: Avaliação da atividade antioxidante e antimicrobiana. / Dirceu Aparecido Gonçalves de Souza. – São Paulo, 2017.
66 f.: il.; 30 cm Dissertação (Mestrado Profissional em Biotecnologia e Inovação
em saúde) – Coordenadoria de Pós-graduação - Universidade Anhanguera de São Paulo, 2017.
Orientadora: Profa. Dra. Regina Mara Silva Pereira
1. Cumarina. 2. Complexos. 3. Atividade antioxidante. 4. Ação antimicrobiana. I. Título II. Universidade Anhanguera de São Paulo.
CDD 661
SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO DE COMPLEXOS METÁLICOS
CONTENDO ÁCIDO-3-CARBOXICUMARINA. AVALIAÇÃO DA
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE E ANTIMICROBIANA
Dissertação apresentada à Banca Examinadora dentro do programa de Mestrado em Biotecnologia e Inovação em Saúde, da Universidade Anhanguera de São Paulo, para obtenção do título de Mestre.
BANCA EXAMINADORA
São Paulo, 22 de março de 2017
Dedico esta Dissertação com muito amor a minha família que sempre me fez
acreditar na realização dos meus sonhos e trabalhou muito para que eu pudesse
realizá-los, aos meus pais Antônio José de Souza e Matilde Aparecida
Gonçalves de Souza, aos meus irmãos, companheiros na vida e nos sonhos,
que sempre me apoiaram nas horas mais difíceis, compartilhando alegrias.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a DEUS pela oportunidade que me concedeu por alcançar esta grande vitória. Agradeço com muita gratidão a minha orientadora professora Drª Regina Mara Silva Pereira, pela sua dedicação, paciência, carinho e amizade. Aplicarei todo o aprendizado que obtive no mestrado em Biotecnologia e Inovação em Saúde na minha vida profissional. Você soube despertar em mim grande admiração, se tornando inspiração para mim. Agradeço aos meus maravilhosos professores que sempre me ensinaram com muito carinho. Meus agradecimentos à Adélia Segin Vale Velosa, companheira nas análises qυе fizeram parte dа minha formação. Meus sinceros agradecimentos à Profª. Drª. Alejandra Hortencia Miranda González pelas contribuições dadas nas análises de espectroscopia de infravermelho e termogravimétrica, pelos seus ensinamentos e por estar sempre disposta a ajudar. À Profª. Drª Susana Nogueira Diniz pela sua alegria e simplicidade. Agradeço à Patrícia Benvenuti Mendes que teve participação muito importante nos experimentos microbiológicos. Agradeço aos alunos de iniciação científica que contribuíram para a realização dos experimentos. São eles: Célia Regina Martinez Fortunato, Eduardo Pittner e Erik Ribeiro Pereira. Agradeço à Milleidy Azevedo Pires e Ana Maria da Conceição, pela preciosa ajuda em momentos em que precisei. À Cinthia Cristina de Paulo Tavares, pelos momentos de estudos, almoços e por sua amizade. A todos os alunos do curso de mestrado e doutorado, pelos bons momentos que passamos juntos nas aulas. Ao Programa CAPES pelo apoio financeiro e a Universidade Anhanguera de São Paulo. A todas as pessoas que contribuíram diretamente ou indiretamente, no desenvolvimento deste projeto. Agradeço à Banca Examinadora no exame de qualificação formada pela Profª. Drª. Alejandra Hortencia Miranda González e Profª. Drª Maria Cristina Marcucci Ribeiro, e pelas contribuições dadas a este trabalho.
“ Mas disse o homem: Eis que o temor do Senhor é a sabedoria, e apartar – se do mal é a inteligência ”. Jó 28:28 ”.
RESUMO
SOUZA, D. A. G. Síntese, caracterização de complexos metálicos contendo
ácido-3-carboxicumarina. Avaliação da atividade antioxidante e
antimicrobiana. 2017. 66 fls. Dissertação de Mestrado–Programa de Mestrado
em Biotecnologia e Inovação em Saúde, Universidade Anhanguera de São
Paulo, São Paulo, 2017.
As cumarinas apresentam várias propriedades biológicas e farmacológicas
como: anti-inflamatória, antibacteriana, antioxidante, antiparasitária, antiviral,
antifúngica, antitumoral e vasorelaxante. Conforme descrito na literatura a
complexação das cumarinas com metais aumentam as suas propriedades,
biológicas e farmacológicas. Desta forma, neste trabalho foi realizada a síntese
com sais metálicos de Cu(II), Ni(II) e Zn(II), complexadas com ácido-3-
carboxicumarina. Foram obtidos três novos complexos de C3CCu, C3CNi e
C3CZn, respectivamente no processo de síntese, os quais foram caracterizados
por condutividade, ponto de fusão, análise elementar, espectroscopia no
ultravioleta, espectroscopia vibracional no infravermelho e análise
termogravimétrica. Para a avaliação da atividade antioxidante foi utilizado o
método do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazila (DPPH). Os complexos de C3CCu,
C3CNi e C3CZn apresentaram atividade antioxidade (22% de inibição do radical
DPPH), superior a C3C, avaliada nas mesmas concentrações. A atividade
antimicrobiana dos complexos foi testada nas cepas de Klebsiella pneumoniae,
Staphylococcus aureus e Escherichia coli, através do teste de difusão em disco
na concentração de 4,1 mM, nos volumes de 20, 30, 40 e 50 µL. Embora o
composto de partida C3C não tenha atividade antimicrobiana, os complexos
apresentaram atividade contra as três cepas, tendo maior atividade contra a cepa
de Escherichia coli.
Palavras-chave: Cumarina. Complexos. Atividade Antioxidante. Ação
Antimicrobiana.
ABSTRACT
SOUZA, D. A. G. Synthesis, characterization of metal complexes containing
coumarin-3-carboxylic acid. Evaluation of antioxidant and antimicrobial
activity. 2017. 66 pages. Master's thesis - Master's Program in Biotechnology
and health innovation, Anhanguera University of São Paulo, São Paulo, 2017.
Coumarins have several biological and pharmacological properties such as: anti-
inflammatory, antibacterial, antioxidant, antiparasitic, antiviral, antifungal,
antitumor and vasorelaxant. As described in the literature, the complexation of
coumarins with metals increases their biological and pharmacological properties.
In this work, were synthesised complexes with Cu(II), Ni(II) and Zn (II) contained
coumarin-3-carboxy acid as ligant. Three new complexes of C3CCu, C3CNi, and
C3CZn were obtained were characterized by conductivity, melting point,
elemental analysis, ultraviolet spectroscopy, infrared vibration spectroscopy and
thermogravimetric analysis. For the evaluation of antioxidant activity, the 2,2-
diphenyl-1-picrylhydrazyl radical (DPPH) method was used. The complexes of
C3CCu, C3CNi and C3CZn showed 22% of inhibtion of DPPH for all complexes,
higher than C3C that was evaluated at the same concentrations. The
antimicrobial activity of the complexes was tested in strains of Klebsiella
pneumoniae, Staphylococcus aureus and Escherichia coli strains by disc
diffusion test at the concentration of 4.1 mM in the volumes of 20, 30, 40 and 50
μL. Although the C3C starting compound did not exhibit antimicrobial activity, the
complexes showed activity against the three strains, having greater activity
against the Escherichia coli.
Keywords: Coumarin. Complexes. Antioxidant activity. Antimicrobial Action.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Estrutura do ácido chiquímico. ......................................................... 16
Figura 2 - Estrutura química da cumarina simples (1- Benzopirano-2-ona). .... 16
Figura 3 - Ciclo biossintético dos metabólitos secundários. ............................. 18
Figura 4 - Rota de biossíntese da cumarina e umbeliferona. ........................... 20
Figura 5 - Estrutura da cisplatina. ..................................................................... 23
Figura 6 - Estrutura proposta da base de Schiff. .............................................. 23
Figura 7 - Estrutura do complexo de ácido-3-carboxicumarina com Gálio. ...... 24
Figura 8 – Esquema reacional da tiosemicarbazida - 8-acetil-7-3-metilcumarina
(a) e estrutura proposta do complexo de tiosemicarbazida e - 8-acetil-7-3-
metilcumarina com metais M= Co(II), Cu(II) e Ni(II) (b). .................................. 25
Figura 9 - Estrutura do complexo 8-formil-7-hidroxi-4-metilcumarina (R= cloro,
bromo, iodo e flúor) com metais (M) de Co(II), Cu(II) e Ni(II). .......................... 26
Figura 10 - Compostos de cumarina com atividade antioxidante: (a) 4-
hidroxicumarina e (b) 4-hidroxi-3-p-nitrofenilcumarina. .................................... 28
Figura 11 - Proposta da estrutura de Naftofuran-2-carbohidrazida com 8-formil-
7-hidroxi-4-metil cumarina e seus metais (M) Cd(II), Co(II), Cu(II), Hg(II), Ni(II)
e Zn(II). ............................................................................................................. 29
Figura 12 - Estrutura do complexo de 4-hidroxi-3-nitrocumarina de prata de 4-
oxi-3-nitrocumarinabisfenantrolina. .................................................................. 31
Figura 13 - Fluxograma da síntese dos complexos .......................................... 35
Figura 14 - Estabilização do radical livre DPPH. .............................................. 38
Figura 15 – Espectroscopia no Ultravioleta dos complexos. ............................ 43
Figura 16 - Estrutura do ácido-3-carboxicumarina. .......................................... 44
Figura 17 - Curva de decomposição térmica do complexo de C3CCu (TG) e
curva de termogravimetria diferencial (DTG).................................................... 46
Figura 18 – Curva de decomposição do complexo de C3CZn (TG) e curva de
termogavimetria diferencial (DTG). .................................................................. 47
Figura 19 - Esquema reacional dos complexos de Cu, Ni e Zn. ....................... 49
Figura 20 - Atividade antioxidante dos compostos em (%). ............................. 50
Figura 21 – Halo de inibição no complexo de C3CNi na cepa de
Staphylococcus aureus .................................................................................... 52
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Heterosídeos cumarínicos mais frequentes nas plantas medicinais.
......................................................................................................................... 17
Tabela 2 - Relação de reagentes utilizado nas análises. ................................. 33
Tabela 3 - Relação de equipamentos utilizados nas análises. ......................... 34
Tabela 4 - Forma de preparação do experimento DPPH. ................................ 39
Tabela 5 - Cor, ponto de fusão, condutividade e rendimento. .......................... 41
Tabela 6 - Solubilidade dos complexos. ........................................................... 42
Tabela 7 - Análise elementar dos complexos. .................................................. 42
Tabela 8 - Dados espectrais no infravermelho dos compostos. ....................... 45
Tabela 9 - Atividade inibitória dos complexos. ................................................. 51
LISTA DE ABREVIATURAS
C3CCu Ácido-3-carboxicumarina cobre
C3CNi Ácido-3-carboxicumarina níquel
C3CZn Ácido-3-carboxicumarina zinco
ºC Graus Celsius
DMF Dimetilformamida
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido Desoxirribonucléico
DPPH Radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazila
DTG Termogravimetria Derivada
FDA Food and Drug Administration
g Gramas
IV Espectroscopia no infravermelho
kg Quilograma
mg Miligrama
M Metais
min Minuto
mL Mililitro
mm Milímitro
nm Nanômetro
mM Milimolar
PF Ponto de fusão
RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
RMN 13C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono
ROS Espécie Reativa de Oxigênio
Sa Samário
TG Termogravimetria
µL Microlitro
UV Espectroscopia no Ultravioleta-visível
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 14
2 REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................ 16
2.1 Cumarina ................................................................................................ 16
2.1.1 Biossíntese das cumarinas .............................................................. 17
2.1.2 Aplicações das cumarinas ................................................................ 21
2.1.3 Propriedades farmacológicas das cumarinas ................................... 21
2.2 Complexos metálicos .............................................................................. 22
2.3 Atividade antioxidante ............................................................................. 27
2.4 Atividade antimicrobiana dos complexos ................................................ 29
2.5 Atividade antitumoral .............................................................................. 30
3 OBJETIVOS .................................................................................................. 32
3.1 Objetivo geral .......................................................................................... 32
3. 2 Objetivos específicos ............................................................................. 32
4 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................. 33
4.1 Material ................................................................................................... 33
4.1.1 Reagentes e equipamentos ............................................................. 33
4.2 Métodos .................................................................................................. 34
4.2.1 Síntese dos complexos .................................................................... 34
4.2.2 Caracterização dos complexos ........................................................ 36
4.2.2.1 Ponto de fusão ........................................................................... 36
4.2.2.2 Condutividade ............................................................................ 36
4.2.2.3 Teste de Solubilidade dos complexos ....................................... 36
4.2.2.4 Espectroscopia vibracional no Infravermelho ............................ 36
4.2.2.5 Espectrofotometria de Ultravioleta ............................................. 37
4.2.2.6 Análise termogravimétrica ......................................................... 37
4.3 Avaliação da atividade biológica ............................................................. 38
4.3.1 Atividade antioxidante ...................................................................... 38
4.3.1.1 Preparação da solução de DPPH .............................................. 38
4.3.1.1.1 Análise dos complexos ....................................................... 38
4.3.2 Atividade microbiológica ................................................................... 39
4.3.2.1 Análise de difusão em disco ...................................................... 39
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES .................................................................. 41
5.1 Cor, ponto de fusão, condutividade, rendimento e solubilidade .............. 41
5.2 Análise elementar ................................................................................... 42
5.3 Espectroscopia no ultravioleta visível ..................................................... 43
5. 4 Espectroscopia no infravermelho ........................................................... 44
5. 5 Análise termogravimétrica ..................................................................... 45
5. 6 Estrutura proposta para os complexos de C3CCu, C3CNi e C3CZn. .... 48
5. 7 Ensaios biológicos com os complexos................................................... 50
5.7.1 Atividade antioxidante ...................................................................... 50
5.7.2 Atividade antimicrobiana .................................................................. 51
6 CONCLUSÃO ............................................................................................... 54
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 55
APÊNDICES .................................................................................................... 62
Apêndice 1 – Espectro vibracional no Infravermelho do C3C. ......................... 63
Apêndice 2 – Espectro vibracional no Infravermelho do complexo de C3CCu. 64
Apêndice 3 – Espectro vibracional no Infravermelho do complexo de C3CNi. . 65
Apêndice 4 – Espectro vibracional no Infravermelho do complexo de C3CZn. 66
14 1 INTRODUÇÃO
As cumarinas são compostos que desempenham um papel fundamental
nos produtos naturais atuando como metabólitos secundários nas plantas
(ELHUSSEINY; AAZAM; AL-AMRI, 2014). São encontradas em diferentes
concentrações, sendo distribuídas nos frutos, raízes, caules e folhas. Também
podem ser encontradas em bactérias e fungos (PATIL et al., 2015).
Na natureza, foram encontradas mais de 3400 cumarinas que estão
distribuídas em 160 famílias (BOOTH et al., 2004). Estas constituem uma classe
de metabólitos secundários derivados do metabolismo da fenilalanina via ácido
chiquímico (CZELUSNIAK et al., 2012).
As cumarinas destacam-se devido ao seu potencial biológico, o qual é
atribuído aos grupos funcionais presentes em sua estrutura (LV et al., 2015;
MESQUITA et al., 2013). O dicumarol foi o primeiro medicamento isolado com
ação anticoagulante via oral derivado da warfarina (3-fenilacetiletil, 4-
hidroxicumarina) (MUELLER, 2004).
A afraxetina (7,8-di-hidroxi-6-metoxi cromen-2-ona) e dafnetina (7,8-di-
hidroxicumarina) foram avaliadas quanto a sua atividade anti-inflamatória, que
atuam como sequestrador de radicais superóxidos (oriundos de neutrófilos
fagocíticos ativados), os quais estão envolvidos em vários processos
inflamatórios (PAYÁ et al., 1994). Pesquisas revelaram que a 6-nitro-7-
hidroxicumarina apresenta atividade antitumoral com alto potencial na seleção e
inibição das células de neoplasia renal (A-498) (FINN; CREAVEN; EGAN, 2004).
Na literatura são encontrados exemplos que comprovam o aumento da
atividade das cumarinas quando complexadas a íons metálicos como cobre,
prata e zinco, que apresentaram atividades antifúngica e antioxidante (RAJ;
MRUTHYUNJAYASWAMY, 2014), antiparasitária (ALCANTARA et al., 2015),
antineoplásica (THATI et al., 2009), antimicrobiana (ELHUSSEINY; AAZAM; AL-
AMRI, 2014) como é o caso de naphthofuran-2-carbo-hidrazida e 8-formil-7-
hidroxi-4-metil-cumarina com metais de Co(II), Cd(II), Hg(II), Ni(II) e Zn(II).
Através da técnica de eletroforese observou-se que os novos complexos
interagem com o DNA (ácido desoxirribonucleico), comprovando a ação inibidora
de micro-organismos patogênicos (HALLI et al. 2012). Resultados como estes,
15 motivam a busca de mais compostos a base de cumarina com metais. A
coordenação de metais de transição com compostos orgânicos é utilizada como
forma de obtenção de substâncias mais ativas.
O complexo de [3-cloro-N-(7-hidroxi-4-metil-2-oxo-2H-cromen-8-il)
metilenobenzotiofeno-2-carbo-hidrazida] complexadas com diferentes metais de
Co(II), Cu(II), Ni(II) e Zn(II) mostrou atividade antiproliferativo de células
cancerígenas. No processo de complexação a carga positiva do íon metálico é
partilhada com átomos heterodoadores (azoto e oxigênio) presentes no ligante,
o que provoca o deslocamento de elétrons sobre o sistema quelante aumentando
o caráter lipofílico. O quelante favorece a atividade na camada lipóide das
membranas dos micro-organismos que são inibidos (MEYER et al., 1982) nos
fungos (Candida albicans, Fusarium oxysporum e Aspergillus niger) e bactérias
(Salmonella entérica serovar Typhi, Bacillus subtilis e Escherichia coli) (RAJ;
MRUTHYUNJAYASWAMY, 2014).
Neste trabalho foram sintetizados e caracterizados complexos de Cu(II),
Ni(II) e Zn(II) contendo ácido-3-caboxicumarina. Também foi avaliada a atividade
antioxidante e antimicrobiana destes novos complexos.
16 2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Cumarina
No ano de 1820 Vogel extraiu a 1,2-benzopirona (cumarina) da
Coumarouna odorata conhecida como fava tonka. A partir de então, as
cumarinas vêm sendo reconhecidas como produtos naturais amplamente
distribuídas nas plantas (MONTAGNER, 2007). As cumarinas derivam do
metabolismo do ácido chiquímico representado na Figura 1. O metabolismo da
fenilalanina atua como metabólitos secundários nas plantas (KOSTOVA;
STEFANOVA, 2012).
Figura 1 - Estrutura do ácido chiquímico. Fonte: SIMÕES et al., 2003.
As cumarinas são substâncias heterociclícas de oxigênio que
desempenham um papel importante nos produtos naturais, contendo um amplo
aspectro de atividades biológicas (ELHUSSEINY; AAZAM; AL-AMRI, 2014). O
primeiro e o mais simples representante das cumarinas é a 1-benzopirano-2-ona
(Figura 2).
Figura 2 - Estrutura química da cumarina simples (1- Benzopirano-2-ona). Fonte: SIMÕES et al., 2003.
Os heterosídeos mais encontrados nas plantas são pertencentes à classe
dos derivados cumarínicos (Tabela 1), sendo distribuídos nas espécies
17 Gramíneas, Umbelíferas, Rutáceas, Leguminosas, Orquidáceas, Labiadas
(COSTA, 2002).
Tabela 1 – Heterosídeos cumarínicos mais frequentes nas plantas medicinais.
Heterosídeos Aglicona (cumarina presente) Ocorrência
Melilotósido Ácido o-cumárico Trevo doce amarelo
Skinina 7-hidroxi-cumarina Anis do Japão
Dafnina 7,8-di-hidroxi-cumarina Azeite spurge
Esculina 6,7-di-hidroxi-cumarina Castanheiro da Índia
Chichoriina 6,7-di-hidroxi-cumarina Chicórea
Escopolina 6-metoxi-7-hidroxi-cumarina Tabaco, Beladona
Fabiatrina 6-metoxi-7-hidroxi-cumarina Fabiana imbricata
Fraxina 6-metoxi-7,8-di-hidroxi-cumarina Planta do foguete Fonte: Adaptado de COSTA, 2002.
Atualmente, mais de 1300 cumarinas já foram identificadas de fontes
naturais em 160 famílias, especialmente de plantas verdes. As propriedades
farmacológicas, bioquímicas e aplicações terapêuticas de cumarinas simples
dependem de seus padrões de substituição (HOULT; PAYÁ, 1996).
2.1.1 Biossíntese das cumarinas
Todos os metabólitos secundários dos vegetais derivam do metabolismo
da glicose, via dois intermediários principais: o ácido chiquímico e o acetato
(Figura 3). O ácido chiquímico que é formado pela recondensação aldólica de
dois metabólitos da glicose: o fosfoenolpiruvato e a eritrose-4-fosfato, produz três
aminoácidos aromáticos: triptofano, fenilalanina e tirosina, que são precursores
da biossíntese de numerosos produtos naturais aromáticos em plantas
superiores, entre eles, os taninos, alcalóides, lignanas, ligninas e cumarinas
(SIMÕES et al., 2003).
A maioria das cumarinas são derivadas biogeneticamente da via do ácido
chiquímico, mas um número significativo delas pode derivar de uma via mista
(ácido chiquímico e acetato) como as 4-fenilcumarinas. As 4-n-propilcumarinas
derivam apenas da via do acetato (KUSTER; ROCHA, 2003).
18
Figura 3 - Ciclo biossintético dos metabólitos secundários. Fonte: SIMÕES et al., 2010.
19
As cumarinas são derivadas do metabolismo da fenilalanina amonialiase
– PAL (Figura 3). Esta enzima é responsável, entre o metabolismo primário e o
secundário, por catalisar a desaminação da L-fenilalanina (metabólito primário)
produzindo o ácido trans-cinâmico (I). O ácido trans-cinâmico é p-hidroxilado
através da ação da enzima cinamato 4´-hidroxilase resultando no ácido p-
cumárico (II) (DOUGLAS, 1996).
Nesta via de síntese, a hidroxilação do ácido cinâmico ou do ácido p-
cumárico pode ocorrer na posição orto da cadeia lateral originando o ácido o-
cumárico (III) e o ácido 2,4-diidroxicumárico (IV) respectivamente (DEWICK,
1997).
Após a hidroxilação, os ácidos hidroxicinâmicos sofrem isomerização da
forma trans para cis. Na natureza, as isomerizações trans/cis e a lactonização
são mediadas por enzimas. O ácido o-cumárico (V) e o ácido p-cumárico (VI)
dão origem a cumarina e umbeliferona (Figura 4). As etapas seguintes são
dependentes das características gênicas das plantas, podendo estar envolvidas
em duas ou mais rotas específicas na biogênese das cumarinas (DEWICK, 1997;
WATERMAN et. al., 1994).
Em alguns casos, ocorre a glicosilação do ácido p-hidroxicinâmico
impedindo a lactonização e a cumarina surge após injúria tecidual e hidrólise
enzimática. Quando isso ocorre, o ácido cinâmico glicolisado sofre ação de uma
glicosidase, sua molécula de açúcar é retirada e o ácido cinâmico esterifica-se
formando a cumarina. A formação de dihidroxicumarina, trihidroxicumarina e
seus éteres-derivados envolvem a hidroxilação da 7-hidroxicumarina e não a
lactonização dos ácidos cinâmicos correspondentes (BRUNETON, 1995).
20
Figura 4 - Rota de biossíntese da cumarina e umbeliferona. Fonte: Baseado em DOUGLAS, 1996; DEWICK, 1997 e WATERMAN; MOLE, 1994.
21
Os grupos hidroxilas podem ser metilados, glicosilados, ou até mesmo
prenilados. A prenilação do anel benzênico pelo dimetialilpirofosfato nas
posições C-6 da 7-hidroxicumarina produz pirano ou furanocumarinas lineares,
e a prenilação na posição C-8 dá origem aos homólogos angulares (OJALA,
2001; KUSTER; ROCHA, 2003).
A prenilação da 7-hidroxicumarina no anel benzênico nas posições C-6
ou C-8 é o passo inicial na biogênese das furanocumarinas e piranocumarinas.
A ciclização da isoprenilcumarina nas posições C-6 ou C-8 acontece por ataque
nucleofílico do grupo hidroxila em C-7 ao epóxido formado pela oxidação da
ligação dupla do resíduo isopentenila. Dependendo da orientação do ataque
nucleofílico, o produto poderá ser a hidroxi-isopropildi-hidrofuranocumarina ou
será a hidroxidimetildi-hidropiranocumarina (KUSTER; ROCHA, 2003).
2.1.2 Aplicações das cumarinas
As cumarinas possuem ampla aplicação na indústria devido ao seu custo
reduzido, odor agradável e alta estabilidade. São utilizadas como aromatizante
e aditivo em alimentos industrializados (adoçantes, bebidas alcoólicas,
manteiga), tabaco, medicamentos, cosméticos, (enriquecimento de óleos
essenciais), perfumes (como agente fixador, ou para ressaltar a fragrância),
materiais plásticos, borrachas, tintas, produtos de limpeza e spray, para
mascarar odores de solventes orgânicos, detergentes, pasta de dentes, cigarros,
branqueadores ópticos, corantes para lasers e sondas biológicas (KUSTER;
ROCHA, 2003, EGAN et al., 1990 CELEGHINI, 1997).
2.1.3 Propriedades farmacológicas das cumarinas
As cumarinas constituem uma grande classe de lactonas, que contêm na
sua estrutura um anel fundido de benzeno e pirona, podendo exercer diversas
interações dos tipos: não covalentes, hidrofóbicos, interações eletrostáticas,
ligações de hidrogênio, forças de Vander Waals ou na coordenação com metal,
dependendo dos grupos funcionais presentes na molécula (PENG; DAMU;
ZHOU, 2013).
22
Esses grupos funcionais podem interagir com diversas enzimas e
receptores, os quais permitem que estas cumarinas apresentem um amplo
espectro de propriedades biológicas (OTERO et al., 2014) como: anticoagulante
(GOMEZ-OUTES et al., 2012), antioxidante (KOSTOVA et al., 2011),
antidegenerativa (ANAND; SINGH; SINGH, 2012), antimicrobiana (WU et al.,
2009), antitumoral (RIVEIRO et al., 2007), anti-inflamatória (MURAKAMI et al.
2000) entre outras.
As cumarinas são importantes antioxidantes naturais, sabe-se apenas,
que o anel 1,2-pirona exerce pouca influência na atividade antioxidante, sendo,
o grupo orto catecol e seus substituintes os principais responsáveis por esta ação
(ZHANG; WANG, 2004).
Foi observada a atividade antimicrobiana de cumarinas naturais e semi-
sintéticas, dentre elas o ostenol foi o composto que apresentou a melhor
atividade antibacteriana contra cepas Gram-positivas (Staphylococcus aureus e
Bacillus cereus) (SOUZA; DELLE-MONACHE; SMÂNIA, 2005).
Algumas cumarinas apresentam atividade citotóxica e imunomoduladora
causando mudanças significativas na regulação da resposta imune, crescimento
e diferenciação celular inibindo o crescimento de vários tipos de células. Estas
propriedades são importantes para o desenvolvimento de novas drogas
antitumorais para o tratamento de neoplasia gástrica (SGC-7901) (ZHANG et al.,
2009), brônquica (NSCLC-N6) (KOFINAS et al., 1998), prostática (DU145 e
LNCAP) (KANG et al., 2009, MIRANDA, 2001), hepatocelular (Hep G2) (YU et
al., 2009), renal (786-O e A-498) e pulmonar (A549) (ROSSELLI et al., 2009),
com uma diminuição de 40% a 50% no número de metástase (MONTAGNER,
2007). Por apresentarem uma grande variedade de propriedades farmacológicas
vem crescendo rapidamente o interesse por esta classe de compostos.
2.2 Complexos metálicos
Um dos principais medicamentos a base de complexos metálicos é a
cisplatina (Figura 5). Apesar de sintetizada em 1844 por Michel Peyrone, só em
1978 foi aprovada pela Food and Drug Administration (FDA) para uso clínico. A
cisplatina, bem como seus derivados, tem sido utilizada no tratamento de
23 neoplasias de cérebro, ovário, bexiga, mama e próstata com taxa de cura de 70-
90% (THATI et al., 2009). Apesar de ser bastante eficaz, a cisplatina e seus
análagos apresentam inúmeros efeitos colaterais, náusea, enjôo,
nefrotoxicidade e genotoxicidade, portanto há um incentivo em buscar novos
compostos mais ativos com menor efeito tóxico.
Figura 5 - Estrutura da cisplatina. Fonte: ZHANG; LIPPARDS, 2003.
Os complexos vêm surgindo como uma forma alternativa para tratamento
de diversas doenças na tentativa de obter compostos menos tóxicos e com
elevado potencial biológico, quando comparados com fármacos padrões
disponíveis no mercado (PATIL et al., 2011, RAJ et al., 2014).
Na formação de um composto metálico a molécula precisa apresentar
sítios doadores de elétrons, já que os metais atuam como ácidos de Lewis,
receptores de elétrons. As bases de Schiff (Figura 6) são um bom exemplo, pois
possuem átomos de N contendo elétrons livres capazes de formar ligação de
coordenação com íons metálicos. A coordenação pode mudar as propriedades
biológicas das moléculas, devido às alterações na densidade eletrônica sobre os
sítios de ação (PATEL et al., 2012).
Figura 6 - Estrutura proposta da base de Schiff. Fonte: PATIL et al., 2011.
As cumarinas contêm sítios de ligação que podem interagir com diversos
metais. Um exemplo é coordenação da ácido-3-carboxicumarina com o gálio que
PtCl
Cl
H3N
H3N
R
R
R
C
24 ocorrem através dos grupos doadores C=O e COO- (Figura 7) (KOSTOVA;
STEFANOVA, 2012.
Ga
Figura 7 - Estrutura do complexo de ácido-3-carboxicumarina com Gálio. Fonte: KOSTOVA; STEFANOVA, 2012.
Considerando a busca por novos complexos, foi realizada a síntese da
tiosemicarbazida com 8-acetil-7-hidroxi-4-metilcumarina com os respectivos
metais de Co(II), Cu(II) e Ni(II) (Figura 8). A coordenação nestes complexos
ocorreu através de S, N e O, que apresentaram elétrons livres disponíveis para
a coordenação. Os complexos obtidos tiveram atividade antifúngica,
antibacteriana, antidiabética e antitumoral superior a 8-acetil-7-hidroxi-4-
metilcumarina (BALASUBRAMANIAN et al., 2006).
25
(a) (b)
Figura 8 – Esquema reacional da tiosemicarbazida - 8-acetil-7-3-metilcumarina (a) e estrutura proposta do complexo de tiosemicarbazida e - 8-acetil-7-3-metilcumarina com metais M= Co(II), Cu(II) e Ni(II) (b). Fonte: PATIL et al., 2011.
HN
R
M
H2O
H2O
CH3
CH3
H3C
HN
M
H2O
R
H2O
CH3
NH3,CS
2,NH
2,NH
2
R
H H
H
HO
R=Cl, NO2
NH2
H
R
CH3
CH3
R
NH2
OH
CH3
Et OH -2-3 -drops
HCl
4-5 horas de
Refluxo
CH3
26
Estudos realizados a partir de 8-formil-7-hidroxi-4-metilcumarina / 3-cloro-
com 2,4-di (R) anilina / o-toluidina (R= cloro, bromo, iodo e flúor) com metais de
Co(II), Cu(II) e Ni(II), mostram um aumento na lipofilicidade da molécula após a
coordenação com os metais, facilitando a permeabilidade através da membrana
lipídica. Esses complexos foram testados em bactérias como Pseudomonas
aureginosa e Proteus mirabilis e fungos (Aspergillus niger e Rhizopus oryzae)
(PRABHAKARA et al., 2016).
Figura 9 - Estrutura do complexo 8-formil-7-hidroxi-4-metilcumarina (R= cloro, bromo, iodo e flúor) com metais (M) de Co(II), Cu(II) e Ni(II). Fonte: PRABHAKARA et al., 2016.
Todos os complexos metálicos são caracterizados através de técnica de
espectroscopia no Infravermelho (IV), Ressonância Magnética Nuclear (RMN)
de 1H e 13C (KARATAS et al., 2016), espectroscopia no Ultravioleta Visível (UV-
Vis), Difração de Raios X (MUJAHID et al. 2016), Fluorescência, Calorimetria,
(PRABHAKARA et al., 2015), Termogravimetria, entre outros (PATEL et al.,
2012).
A coordenação de metais de transição em compostos orgânicos é
utilizada como forma de obtenção de compostos mais ativos. Estudos de
cumarinas e seus complexos mostram que a coordenação de íons metálicos
CH3
M
H2O
H2O
CH3
27 promove um aumento significativo no potencial biológico desses novos
compostos (CREAVEN et al., 2005).
2.3 Atividade antioxidante
A oxidação é um processo metabólico presente nas células para a
produção de energia, no entanto, o metabolismo do oxigênio gera radicais livres,
que quando em excesso, provocam danos extensivos nas células. O estresse
oxidativo vem sendo associado ao desenvolvimento de doenças degenerativas.
O sistema antioxidante bloqueia substâncias potencialmente danosas, tais como
as espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (HALLIWELL; GUTTERIDGE,
2007).
Os radicais livres são átomos ou moléculas altamente reativas e que
possuem elétrons ímpares na sua última camada eletrônica. É este não
emparelhamento de elétrons da última camada que confere alta reatividade a
esses átomos ou moléculas (FERREIRA; MATSUBARA, 1997). O excesso
desses radicais causa danos nas macromoléculas biológicas como lipídeos,
proteínas e DNA, gerando alterações e implicando em diversas patologias como:
neoplasias, aterosclerose, doenças neurodegenerativas, diabetes, cirrose e
artrite reumatoide (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007).
Os radicais livres cujo elétron desemparelhado encontra-se centrado nos
átomos de oxigênio ou nitrogênio são denominados ERO (espécies reativas de
oxigênio) e ERN (espécies reativas de nitrogênio). Sendo estes os responsáveis
por inúmeras patogenias, pois nem todas as substâncias denominadas radicais
livres apresentam elétrons desemparelhados em sua última camada. Como é o
caso do peróxido de hidrogênio (H2O2) (BARBOSA, et al., 2010).
Na literatura encontra-se relatos de que a atividade antioxidante das
hidroxicumarinas (Figura 10, a) ocorrendo atráves do grupo hidroxila (PENG;
DAMU; ZHOU, 2013). As cumarinas com grupamentos aminas possuem alta
atividade na remoção de radicais livres. Um exemplo é p-nitrofenilo (Figura 10,
b) que têm grande capacidade de eliminar os radicais livres pelo efeito do
grupamento hidroxilo e amino evitando lesões nas células (PENG; DAMU;
ZHOU, 2013).
28
As cumarinas encontradas na natureza apresentam importantes
antioxidantes naturais, sabe-se que o anel 1,2-pirona exerce pouca influência na
atividade antioxidante, sendo o grupo ortocatecol e seus substituintes os
principais responsáveis por esta ação (ZHANG; WANG, 2004).
Estudos sobre o efeito da cumarina e de três derivados (7-
hidroxicumarina, 7-acetoxicumarina e 7-aliloxicumarina) sobre o metabolismo
oxidativo de neutrófilos de coelhos estimulados, demonstraram que a cumarina
não afeta a produção de radicais superóxidos. Entanto seus derivados
apresentam efeitos inibitórios em dose-dependentes sugerindo que a presença
de radicais substituintes na posição 7 do anel benzopirona é importante para
atividade inibitória da produção de radicais superóxido (KABEYA, 2002).
(a) (b)
4-hidroxicumarina 4-hidroxi-3-p-nitrofenilcumarina
Figura 10 - Compostos de cumarina com atividade antioxidante: (a) 4-hidroxicumarina e (b) 4-hidroxi-3-p-nitrofenilcumarina. Fonte: PENG; DAMU; ZHOU, 2013.
Recentemente, devido às cumarinas possuírem atividades antioxidantes
baixa, foi proposto avaliar a atividade antioxidante com complexos contendo
bases de Schiff. O naftaurano-2-carbohidrazida com 8-formil-7-hidroxi-4-metil-
cumarina, contendo Co(II), Cu(II) e Zn(II) tiveram atividade moderada, quando
comparados com os complexos de Cd(II), Hg(II) e Ni(II).
Os experimentos realizados com os complexos indicam a eliminação dos
radicais livres. A estrutura proposta do complexo naftaurano-2-carbohidrazida
com 8-formil-7-hidroxi-4-metil-cumarina com diferentes metais é apresentada na
OH
H
NO2CH
3OH
29 Figura 11 (HALLI et al., 2012).
Figura 11 - Proposta da estrutura de Naftofuran-2-carbohidrazida com 8-formil-7-hidroxi-4-metil cumarina e seus metais (M) Cd(II), Co(II), Cu(II), Hg(II), Ni(II) e Zn(II). Fonte: HALLI; SUMATHI; KINNI, 2012.
2. 4 Atividade antimicrobiana dos complexos
Estudos da literatura indicam que a coordenação de cumarinas com
metais mostram aumento na atividade biológica contra várias espécies de micro-
organismos, indicada em diversos trabalhos. (GUDASI; PATIL; VADAVI, 2016).
Estudos com complexos de 8-(2-aminofeniliminio) etil] -2-oxo-2H-cromen-
7-olato, ligados com cumarina-imina e metais de Cd(II), Cu(II), Ni(II), Pd(II) e
Zn(II), e foram submetidos à atividade antibacteriana em cepas Gram-positivas
(Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilize e Micrococcus luteus) e Gram-
negativas (Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa
e Salmonella typhi). A inibição do crescimento das cepas Gram-positivas foi
superior ao das Gram-negativas.
Os resultados podem ser explicados em termos de reforço do caráter
lipofílico do metal central, o que favorece maior permeação na membrana celular
(ELHUSSEINY; AAZAM; AL-AMRI, 2014). Ensaios realizados com os complexos
CH3
H
M
H
H
CH3
H
30 4-hidroxicumarina-3-tiocarbohidrazona contendo Co(III) e o Cl- frente a bactérias
Gram-negativas tais como: Candida albicans, Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa, confirmaram a inibição dos micro-
organismos através da técnica de difusão em disco (MOSAA et al., 2011).
Karatas et al. (2016), realizaram testes com complexos de prata (I),
carbeno N-heterocíclico e cumarina, em cepas de Enterococcus faecalis,
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa. Os
compostos foram avaliados quanto a sua atividade antifúngica em Candida
albicans e Candida tropicalis. Os resultados indicaram a inibição do crescimento
das bactérias e fungos.
Os complexos de [7-hidroxi-4-metil-8-cumarinil] glicina com íons de
transição Cd(II), Co(II), Cu(II), Ni(II) e Zn(II), exibiram atividade antimicrobiana
contra bactérias Gram negativa (Escherichia coli) e Gram positiva (Bacillus
cirroflagellosus) e fungos como Aspergillus niger e Candida albicans. Esses
efeitos foram observados através da coordenação com íons metálicos, o qual
potencializou a sua atividade microbiana quando comparados com o composto
padrão (GUDASI; PATI; VADAVI, 2008).
2. 5 Atividade antitumoral
Alguns trabalhos investigaram a atividade citotóxica de biscumarinas
complexadas com metais de lantanídeos como cério, neodímio e zircônio em
células de leucemia mielóide aguda e crônica. Todos os compostos foram
considerados biologicamente ativos, inibindo a proliferação das células tumorais
(KOSTOVA; MANOLOV; MOMEKOV, 2004; KOSTOVA et al., 2005).
O complexo de 4-hidroxi-3-nitro-cumarina com prata ligado a 4-oxi-3-
nitrocumarinabifenantrolina (Figura 12), foi aplicado a neoplasia renal e hepática
ocorrendo diminuição na síntese do DNA. Portanto esse complexo foi
considerado biologicamente mais ativo quando comparado com o composto sem
o metal, apresentando inibição na proliferação de células tumorais (THATI et al,.
2009). O complexo de ácido-3-carboxicumarina com prata foi testado na
linhagem de células carcinogênicas de (A-498 e Hep-G2). Os resultados obtidos
sugerem que a complexação promoveu um aumento significativo na
31 citotoxicidade do ácido-3-carboxicumarina livre (THAITI et al. 2007).
Figura 12 - Estrutura do complexo de 4-hidroxi-3-nitrocumarina de prata de 4-oxi-3-nitrocumarinabisfenantrolina. Fonte: THATI et al., 2009.
Atribuiu-se aos novos complexos de ácido-3-carboxicumarina com
lantanídeos Dy(III)) Gd(III) e Sa(III), a atividade antiproliferativa na leucemia
mielóide crônica K-562 (KOSTOVA; MOMEKOV; STANCHEVA, 2007). O
resultado do complexo de Sa(III) expressou maior atividade quando comparado
com os complexos de Dy(III) e Gd(III) (GRAZUL; BUDZISZ, 2009).
Em tumores em ratos de melanoma (B16) e fibrossarcoma (L 929) o
ácido-3-carboxicumarina com metal Ga(III) mostrou importante efeito nas
propriedades citotóxicas / citostáticas. Os complexos inibiram a liberação de NO,
o qual atua como vasorelaxante, broncodilatador e na agregação plaquetária,
implicando na regulação da resposta imune dos tumores (KOSTOVA et al.,
2012). A combinação de terapia fotodinâmica e quimioterapia é uma estratégia
promissora para eliminar problemas com medicamentos que apresentam baixa
eficácia terapêutica. O complexo de Zn(II) com ftalocianina-cumarina foi
sintetizados e caracterizados o qual apresentou atividade fotossensibilizadora
que foi ligado com tri (etileno glicol). Esse conjugado exibiu alta fotocitotoxicidade
contra células G2 de hepatocarcinoma e alto nível fotodinâmico. (ZHOU, et al.,
2015.
32 3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
O objetivo deste trabalho foi sintetizar complexos contendo ácido 3-
carboxicumarina como ligantes, caracterizar e avaliar sua atividade antioxidante
e antimicrobiana.
3. 2 Objetivos específicos
• Sintetizar e caracterizar novos complexos de Cu(II), Ni(II) e Zn(II)
contendo a ácido-3-carboxicumarina.
• Avaliar a condutividade, ponto de fusão e determinar a solubilidade em
diferentes solventes.
• Caracterizar os compostos utilizando métodos de espectroscopia no
infravermelho, ultravioleta, análise elementar de carbono, hidrogênio e
nitrogênio e análise termogravimétrica (TG e DTG).
• Testar a atividade antioxidante dos novos complexos.
• Avaliar a inibição de cepas de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,
Staphylococcus aureus, frente aos complexos.
33 4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material
4.1.1 Reagentes e equipamentos
Nas análises foram utilizados reagentes e equipamentos descritas nas
Tabelas 2 e 3.
Tabela 2 - Relação de reagentes utilizado nas análises.
Reagentes Fabricante
Acetona PA Sigma aldrich
Acetonitrila Synth
Acetato de cobre monohidratado Sigma aldrich
Acetato de etila Sigma aldrich
Acetato de ferro Sigma aldrich
Acetato de níquel tetrahidratado Sigma aldrich
Acetato de zinco dihidratado Sigma aldrich
Ácido-3-carboxicumarina Sigma aldrich
Agar Mueller Hinton Acumedia
Clorofórmio PA Synth
Diclorometano PA Synth
Dietilamina PA Sigma aldrich
Dimetilformamida PA Synth
Dimetilsulfóxido PA Synth
DPPH (Radical difenilpicrilidrazila) PA Sigma aldrich
Etanol PA Merck
Metanol PA Merck
Tert-butilamina PA Sigma aldrich
Fonte: Arquivo pessoal.
34 Tabela 3 - Relação de equipamentos utilizados nas análises.
Equipamentos Fabricante Modelo/Série
Agitador magnético Fisatom 752 A
Analisador Elementar CHN Perkin Elmer 2400II
Autoclave Vertical Phoenix Luterco AV-75
Balança analítica Scientech ISO 210
Condutivímetro Quimis 0405 M
Espectrofotometro (IV) Thermo-Nicolet
Nexus 670
Espectrofotômetro (UV/Vis) Femto 800 XI
Estufa de secagem Olidef CZ
Estufa microbiológica Fanem 502
Ponto de fusão Quimis340S 340.5.13
pHmetro Digimed DM20
Ultrassom Unique Ultra1600
Termogravimétrico Netszch-Thermische Analyse STA 409C
Fonte: Arquivo pessoal.
4.2 Métodos
4.2.1 Síntese dos complexos
Foram pesados 0,5028 g (0,0016 mols) de ácido-3-carboxicumarina
(C3C) e quantidade equimolar do sal desejado, [Cu(CH3COO)2.H2O],
[Ni(CH3COO)2.4H2O] e [Zn(CH3COO)2.2H2O]. Em um béquer de 100 mL foi
solubilizado C3C em 50 mL de metanol a 50ºC. Em um segundo béquer
solubilizou-se o sal desejado com 50 mL de metanol. Logo após a solubilização
dos compostos, adicionou-se lentamente a solução do sal à solução de C3C, e
a mistura foi deixada sob agitação por 1 hora.
Em segundo momento do processo os complexos foram armazenados em
temperatura de 5 ºC por 24 horas, até que ocorresse a precipitação. Na
sequência realizou uma filtração a vácuo, para obtenção dos novos complexos
representado no fluxograma da Figura 13.
35
1 mol ácido-3-carboxicumarina e
50 mL Metanol 50 ºC.
1 mol sal (Cu,Ni e Zn)
50 mL Metanol 50 ºC.
A solução de acetato foi adicionada lentamente
à solução de C3C e deixada sob agitação
Repouso em temperatura de 5 ºC por
24 h. C3CNi
C3CZn
Precipitação dos complexos
Obtenção dos complexos Filtração a vácuo
Figura 13 - Fluxograma da síntese dos complexos (Cu, Ni e Zn). Fonte: Arquivo pessoal.
36 4.2.2 Caracterização dos complexos
4.2.2.1 Ponto de fusão
Para se determinar o ponto de fusão triturou-se em um almofariz 100 mg
de cada composto, introduzindo–os no tubo capilar de modo a formar uma coluna
de aproximadamente 3 a 4 mm de altura. O capilar foi inserido no equipamento
até que ocorresse o ponto de fusão.
4.2.2.2 Condutividade
Na análise de condutividade foram pesados 5 mg de cada composto e
adicionados em frasco de 10 mL, em seguida foram adicionados 5 mL de DMF
(dimetilformamida) deixando-os em agitação por 30 minutos no ultrassom. Em
seguida foram realizadas as leituras em triplicatas. As análises foram expressas
em Ω −1 cm2 mol−1.
4.2.2.3 Teste de Solubilidade dos complexos
Foram pesados 10 mg de cada complexo, em seguida transferidos para
tubos de ensaio, os quais se adicionaram 1 mL do solvente escolhido Acetona,
Água, Acetato de etila, Clorofórmio, Diclorometano, DMF, Dimetilsulfóxido
(DMSO) e mantidos sobre agitação no ultrassom. A cada intervalo de tempo de
30 minutos, foi adicionado mais 1 mL do solvente, até completa dissolução. Na
sequência as amostras ficaram em repouso por 30 minutos, e foram avaliados
como ligeiramente solúvel, pouco solúvel, insolúvel e solúvel. Nesse teste os
complexos foram realizados em duplicata.
4.2.2.4 Espectroscopia vibracional no Infravermelho
Uma pequena alíquota de cada amostra foi colocada diretamente sobre o
cristal de Reflectância Total Attenuada (ATR) e levada para a análise sem
qualquer preparação adicional de amostra. As ligações químicas foram
37 analisadas por espectroscopia entre 4000-400 cm-1 a 64 scans de acumulação
e resolução de 4 cm-1.
4.2.2.5 Espectrofotometria de Ultravioleta
Na obtenção dos espectros eletrônicos no Ultravioleta-Visível foram
pesados 1 mg de cada composto, e transferiu–se quantitativamente para um
balão volumétrico de 10 mL, sendo adicionada 1 mL DMF e completou o volume
com metanol até o menisco. Transferiu-se uma alíquota de 0,5 mL para um balão
volumétrico de 5 mL e completou o volume com metanol. O espectrofotômetro
foi zerado, e realizou-se a leitura em um comprimento de onda entre 190 a 400
nm e varredura de 2 nm.
4.2.2.6 Análise termogravimétrica
A análise termogravimétrica (TGA) e a calorimetria diferencial de
varredura (DSC) foram utilizadas simultaneamente para a caracterização térmica
dos complexos selecionados. Aproximadamente 10 mg de cada complexo foram
colocados em cadinhos padrão de 85 mL de alumina NETZSCH ligados à
unidade termo analítica (STA 409C Netszch-Thermische Analyse, Selb,
Alemanha) com um controlador de sistema TA (TASC 414/2). Uma gama de
temperatura de 30-800 °C, a uma taxa de aquecimento de 05 °C / min, e sob
atmosfera dinâmica de ar sintético (90 mL / min). A TGA mediu a variação na
massa das amostras em função da temperatura. Em DSC, cada amostra e a
referência inerte passaram por ciclos térmicos idênticos, enquanto registravam
quaisquer diferenças de temperatura entre os espécimes e a referência. Esta
temperatura diferencial das amostras foi traçada contra o aquecimento. Foram
detectadas alterações na temperatura dos espécimes, exotérmicos ou
endotérmicos, relativamente à referência. A linha de base para corrigir as curvas
termo-analíticas dos espécimes foi também realizada para ambas as análises
utilizando cadinhos vazios de alumina sob as mesmas condições experimentais.
38 4.3 Avaliação da atividade biológica
4.3.1 Atividade antioxidante
O método utilizado para avaliar a atividade antioxidante dos complexos foi
o radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH), onde o radical livre DPPH é
capturado por antioxidante ocorrendo um decréscimo na absorbância (Figura 14)
do radical que é em torno de 515 nm (RUFINO et al., 2007).
Figura 14 - Estabilização do radical livre DPPH. Fonte: RUFINO et al., 2007.
4.3.1.1 Preparação da solução de DPPH
Foi preparada uma solução de DPPH, pesando-se 20 mg e transferindo-
se para um balão volumétrico. Adicionou-se 200 mL de etanol até completa
dissolução, na concentração de 0,25 mM, armazenando-o em frasco âmbar no
freezer.
4.3.1.1.1 Análise dos complexos
Foram pesados 10 mg de cada composto, C3C, C3CCu, C3CNi e C3CZn,
solubilizados em 1 mL de DMF os quais foram transferidos para balões
volumétricos de 10 mL e completou o volume com etanol. Os tubos de ensaio
.
Agente Antioxidante Agente Redutor
O2N
O2N
NO2 R
RO2N
O2N
NO2
39 utilizados nesse teste eram de vidro âmbar para proteger o experimento da luz,
uma vez que o radical DPPH é sensível à mesma.
As diluições para a preparação das amostras foram feitas conforme a
Tabela 4, sendo a solução com DPPH a última a ser adicionada aos tubos de
ensaio.
Tabela 4 - Forma de preparação do experimento DPPH.
Tubo Vol. Composto
(µL)
Vol. Etanol (µL)
Vol. DPPH (µL)
0 0 1000 1000
1 40 960 1000
2 80 920 1000
3 120 880 1000
4 200 800 1000
5 240 760 1000
6 280 720 1000
7 360 640 1000
8 400 600 1000
Fonte: Arquivo pessoal.
A adição do radical foi cronometrada mantendo-se o intervalo de 30
segundos a partir a adição de DPPH ao primeiro tubo. Terminados os 8 tubos,
os mesmos foram agitados, fechados e deixados em repouso por 30 minutos.
Encerrado esse período fez-se as leituras em 515 nm no espectrofotômetro.
Mediu-se o branco no aparelho com metanol e foram lidas as absorbâncias
cronometradas de 30 em 30 segundos para cada composto, e seus valores
anotados para a elaboração da curva.
4.3.2 Atividade microbiológica
4.3.2.1 Análise de difusão em disco
As placas de petri foram preparadas com meio de cultura Mueller Hinton Agar
(MHA) e foram adicionados 100 µL de suspensão de células 0,5 escala Mc
Farland (1,5 x 10 8 UFC/mL) e espalhadas pela placa com uma alça de Drigalsky.
Após o plaqueamento, foram preparados quatro discos estéreis contendo 20, 30,
40 40 e 50 µL dos compostos sintetizados e incubados a 37ºC em estufa
bacteriológica por 24 horas. O controle positivo foi com disco de antibiótico
contendo 30 µg de Ciprofloxacina. A leitura dos resultados foi através da
medição dos halos de inibição ao redor dos discos. Todos os ensaios foram
realizados em triplicata.
41 5 RESULTADOS E DISCUSSÕES
5.1 Cor, ponto de fusão, condutividade, rendimento e solubilidade
A análise do ponto de fusão é aplicada para identificar a pureza de
matérias primas em diversos seguimentos das indústrias (GIL, 2010). Essa
análise foi aplicada nos complexos, porém a presença de metais com alto ponto
de fusão tais como: cobre 1 085 ºC, ferro 1 538ºC, níquel 1 455 ºC e zinco 420
ºC elevaram o ponto de fusão dos complexos para valores maiores que 300ºC,
na maioria das vezes, o que impediu sua determinação (Tabela 6).
Tabela 5 - Cor, ponto de fusão, condutividade e rendimento.
Complexos Cor Ponto de
Fusão (ºC) Condutividade (Ω −1 cm2 mol−1)
Rendimento
C3CCu Verde claro 300 8,14 40%
C3CNi Verde claro 300 5,42 36%
C3CZn Branco 300 5,55 33%
C3CFe Marrom
avermelhado
300 12,43 37%
Fonte: Arquivo pessoal.
A análise de condutividade elétrica dos complexos foi realizada
trabalhando-se a uma concentração de 6,3 mM em DMF. A literatura aponta que
anteriormente utilizava-se água como solvente, mas devido ao alto poder de
sofrer hidrólise ou dificuldades de solubilizar os complexos, passou-se a utilizar
solventes não aquosos como: metanol, etanol, dimetilformamida, acetona entre
outros, melhorando-se os resultados (GEARY, 1971).
De acordo com os experimentos realizados por EL-Wahab (2004),
complexos que apresentaram condutividade acima de 54 Ω −1 cm2 mol−1 foram
caracterizados como sendo iônicas e valores menores como não iônicos. Os
resultados obtidos mostraram que os complexos apresentaram baixa
condutividade, sendo classificados como não iônicos (Tabela 5). Os repectivos
rendimentos dos complexos estão descritos conforme a Tabela 5. O complexo
que apresentou maior rendimento foi o complexo de cobre com 41%.
A solubilidade dos complexos foi avaliada na concentração de 32 mM em
diversos solventes (Tabela 6). A grande maioria dos complexos apresentou baixa
42 solubilidade nos solventes avaliados. Os complexos apresentaram maior
solubilidade em DMSO e DMF, mostrando domínio da região apolar da molécula.
Tabela 6 - Solubilidade dos complexos.
Solvente
C3CDi Cu
C3CDi Fe
C3CDi Ni
C3CDi Zn
C3CTert Cu
C3CTert Fe
C3CTert Ni
C3CTert Zn
Acetato etila
de
Etila
P. S P. S P. S P. S P. S P.S P.S P.S
Acetona P. S P. S P. S P. S P. S P.S P.S P.S
Acetonitrila
P. S P. S P. S P. S P. S P.S P.S P.S
Água L. S L. S L. S L. S L. S L.S L. S L.S
Clorofórmio P. S P. S P. S P. S P. S P.S P.S L.S
Diclometano P. S P. S P. S P. S P. S P.S P.S P.S
DMF S S S S S S S S
DMSO S S S S S S S S
L.S (Pouco solúvel); L.S (Ligeiramente solúvel); S (Solúvel). Fonte: Arquivo pessoal.
Pesquisadores buscam compostos com maior espectro de solubilidade
em solventes. A solubilidade de compostos orgânicos é um ponto importante no
desenvolvimento de novas moléculas, pois quanto maior a faixa de solubilidade
em que determinado composto for solúvel, maior a liberdade para formulações
e desenvolvimento de novos fármacos (ALCÂNTARA et al. 2015).
5.2 Análise elementar
Os complexos foram caracterizados por análise elementar de carbono e
hidrogênio conforme a Tabela 7.
Tabela 7 - Análise elementar dos complexos.
Amostras Carbono (%) Hidrogênio (%) Fórmula molecuar mínima
Obser. Calc.
Obser. Calc.
C3CCu 46,0 46,3 2,9 2,6 [Cu(C10H5O4)(CH3COO)]
C3CNi 49,3 50,8 2,9 3,0 [Ni(C20H10O8).2H2O]
C3CZn 49,7 50,1 2,7 2,9 [Zn(C20H10O8).2H2O]
Fonte: Arquivo pessoal.
De acordo com o resultado de análise elementar foi possível propor uma
fórmula molecular mínima para os complexos de ácido-3-carboxicumarina de
43 C3CCu, C3CNi e C3CZn obtidos no teste de analise elementar.
5.3 Espectroscopia no ultravioleta visível
Nos espectros de Ultravioleta dos complexos metálicos, as principais
bandas de absorção são atribuídas principalmente a três tipos de transições
eletrônicas. As absorções na região do ultravioleta de alta energia, estão
relacionadas com as transições internas dos ligantes, (-* e n-), onde n é o
orbital não ligante, é o orbital ligante e * é o orbital antiligante (SALLES, 2005),
além das bandas de transição M-L e L-M.
Os espectros no UV do C3C e dos complexos foram obtidos no intervalo
de 190 a 400 nm e varredura de 2 nm. O espectro do C3C apresenta duas
bandas definidas em 208 e 290 nm relacionadas à transição -*, e um ombro
em 324 nm interação n- (Figura 15).
Os complexos de C3CCu e C3CZn apresentaram perfis parecidos, porém
com deslocamentos hipsocrômico da banda de 206 nm e o complexo de C3CZn
apresentou maior efeito hipercrômico. Na região de 290 nm ocorreu um efeito
hipocrômico da transição -* e do ombro em 332 nm.
Figura 15 – Espectroscopia no Ultravioleta dos complexos.
Fonte: Arquivo pessoal.
O espectro de C3CNi quando comparado com o espectro de C3C sofre
00,20,40,60,8
11,21,41,61,8
22,22,4
190 210 230 250 270 290 310 330 350 370 390
Ab
so
rbâ
nc
ia
Comprimento de onda (nm)
C3C C3CCu C3CZn C3CNi
OH
44 um deslocamento hipsocrômico na banda em 206 nm correspondente a
transição -* e um efeito hipocrômico. Na banda de 286 nm dos complexos foi
o que apresentou maior absorção. Na transição n- de maior energia, também
foi identificado um ombro com efeito de hipocrômico em 318 nm.
5. 4 Espectroscopia no infravermelho
A estrutura do ácido-3-carboxicumarina (C3C) está ilustrada na Figura 16,
e os espectros no infravermelho dos compostos estão apresentados nos
Apêndices 1, 2, 3 e 4. No espectro no IV de C3C observa-se uma banda larga
pouco intensa em 3055 cm-1 correspondente a O-H do grupo do ácido
carboxílico, em 1738 cm-1 uma banda correspondente a C=O da carbonila do
anel benzopirano e em 1673 cm-1 referente à C=O da carbonila do ácido
carboxílico. No espectro de C3C ainda são observadas as bandas em 1607 e
1565 cm-1 referentes a C=C do anel aromático e em 1417 cm-1 corresponde à
C-O do anel pirânico conforme a Tabela 8.
Figura 16 - Estrutura do ácido-3-carboxicumarina. Fonte: Arquivo pessoal.
Para determinar os locais de coordenação que podem estar envolvidos
na complexação, os espectros dos compostos foram comparados com os de
C3C. Os complexos C3CCu, C3CNi e C3CZn apresentaram bandas
característica de O-H na região de 3192 cm-1, com maior intensidade para o
complexo de C3CNi em 3219 cm-1. Os complexos de C3CCu, C3CNi e C3CZn
apresentaram deslocamentos nas bandas de C=O dos grupamentos
carboxílicos, e das bandas de C-O.
Conforme os espectros C3CCu e C3CNi (apêndice 2 e 3), a frequência de
OH
45 estiramento referente à ligação M-O apareceu em 594 cm-1, porém o complexo
de C3CZn na ligação entre M-O aparece em 592 cm-1.
Tabela 8 - Dados espectrais no infravermelho dos compostos.
Fonte: Arquivo pessoal.
Segundo Patil et al. (2015), para os complexos de 6-formil-7,8-dihidroxi-
4-metilcumarina e o-toluidina-3-aminobenzotrifluorido com Cu(II) foi observada
uma banda na região de 580 cm-1, atribuída à M-O, corroborando com a
atribuição da Cu-O de C3CCu. Todos os dados referentes aos deslocamentos
das bandas e suas repectivas variações estão resumidas na Tabela 8.
5. 5 Análise termogravimétrica
O comportamento térmico dos Complexos C3CCu e C3CZn foi avaliado
por análise termogravimétrica (TG) a fim de verificar os intervalos de temperatura
onde ocorrem as maiores perdas de massa. As Figuras 17 e 18 ilustram as
curvas de perda de massa (%) em função da temperatura para os complexos de
C3CCu e C3CZn sintetizados. Nessas mesmas figuras estão representadas as
curvas de derivada da perda de massa (DTG), onde são evidenciadas as
temperaturas referentes à maior taxa de decomposição dos materiais.
Os resultados obtidos indicam que a decomposição do complexo de
C3CCu envolveu dois processos de perda de massa. Na curva TG, a primeira
etapa de decomposição indica uma perda de massa de aproximadamente 20,3%
no intervalo de 29°C e 253°C, com máximo de perda de massa em 179°C como
Compostos O-H C=O C=C C-O M-O
Número de onda ( cm-1 )
C3C 3055 1738, 1673 1607, 1565 1417 -
C3CCu 3160 1686, 1610 1576, 1552 1339 594
Delta (Δ) 105 52 63 31 13 78 -
C3CNi 3219 1663, 1616 1584, 1561 1394 594
Delta (Δ) 164 75 57 23 4 23 -
C3CZn 3198 1662, 1608 1584, 1560 1390 592
Delta (Δ) 143 76 65 23 5 27 -
46 evidenciado na curva DTG.
Figura 17 - Curva de decomposição térmica do complexo de C3CCu (TG) e curva de termogravimetria diferencial (DTG). Fonte: Arquivo pessoal.
Na segunda etapa de decomposição compreendida no intervalo de 253°C
a 330°C, verificou-se uma perda de aproximadamente 69,5%, com máximo de
perda em 304°C. Portanto, a perda de massa total compreendida no intervalo de
29°C e 330°C foi de aproximadamente 89,8 %. No intervalo de 330°C e 776°C
não foi observada perda de massa e a mesma se manteve constante.
Por outro lado, com relação ao complexo de C3CZn sintetizado, a curva
de TG indica que a perda de massa envolvida foi de 100% entre o intervalo de
30°C e 507°C. Da mesma forma que no complexo de Cu, a curva de DTG do
complexo C3CZn indica que durante a decomposição térmica estão envolvidas
duas etapas de perda de massa. A primeira, compreendida entre 29°C e 355°C,
indica uma perde de massa de 74,2%, com maior taxa de decomposição em
255°C. A segunda etapa de decomposição ocorre entre 355°C e 507°C e está
associada a uma perda de massa de 25,8% (maior taxa de decomposição em
430°C, conforme a curva DTG). Acima desta temperatura nenhuma
47 decomposição térmica foi observada. As perdas de massa envolvidas nas
primeiras etapas de decomposição térmica de ambos complexos podem ser
atribuídas à eliminação de resíduos de água (proveniente das águas de
hidratação) e volatilização de resíduos de metanol provenientes das etapas de
síntese.
Figura 18 – Curva de decomposição do complexo de C3CZn (TG) e curva de termogavimetria diferencial (DTG). Fonte: Arquivo pessoal.
Por outro lado, na segunda etapa de decomposição do complexo C3CCu
ocorre a quebra das cadeias orgânicas, com consequente eliminação de CO2, e
provável formação da fase estável metal-oxigênio (Cu-O). Na segunda etapa de
decomposição térmica do complexo C3CZn, além da quebra das cadeias
orgânicas ocorre também o rompimento das ligações nas moléculas de água.
Porém, neste complexo o tratamento térmico resultou na decomposição total da
amostra.
48 5. 6 Estrutura proposta para os complexos de C3CCu, C3CNi e C3CZn
De acordo com os espectros no IV de C3CCu, C3CNi e C3CZn, as duas
bandas referentes às carbonilas sofreram deslocamentos significativos, o que
sugere que a coordenação da cumarina ocorre através de um dos oxigênios do
grupamento carboxílico e da carbonila do anel pirânico. Além disso, a formação
de um anel de seis membros é mais estável que a formação de um anel de 4
membros (caso a coordenação ocorresse através dos oxigênios do grupamento
carboxílico, sem a participação da carbonila do anel pirânico). Os dados de
análise elementar para o complexo C3CCu indicam a coordenação de um único
grupamento cumarínico, e uma molécula de acetato.
Na análise termogravimétrica dos complexos C3CCu e C3CZn é
compreendida com a eliminação de resíduos a água ou metanol, e no segundo
estágio ocorreu a quebra da cadeia orgânica, tendo eliminação de CO2 é
possível formação da fase estável metal-oxigênio. Sendo assim, as perdas de
massa observadas confirmam os resultados obtidos nas análises elementar das
epécies de carbono e hidrogênio. Portanto através dos resultados obtidos pelas
técnicas de identificação foi proposta a estrutura conforme o esquema reacional
da Figura 19.
49
Figura 19 - Esquema reacional dos complexos de Cu, Ni e Zn. Fonte: Arquivo pessoal.
M=Ni e Zn
Acetato de (Cu,Ni e Zn)
H2O
H2O
CH3
Ácido-3-carboxicumarina
M=Cu
M
MeOH
50º CC
H
50
5. 7 Ensaios biológicos com os complexos
5.7.1 Atividade antioxidante
Na avaliação do potencial antioxidante foi utilizado o método com o radical
2,2-difenil-1-picrilhidrazila (DPPH), (HALLI, 2012), e os dados estão mostrados
na Figura 20.
No presente trabalho constatou-se que C3C não apresenta atividade
antioxidante pelo método do DPPH, nas concentrações de estudo na faixa entre
1,1 a 10,5 mM. Nos complexos avaliados a maior porcentagem de inibição do
radical livre observada foi de 22%. O complexo de C3CZn foi o que apresentou
inibição na menor concentração 2,9 mM. A C3CCu inibiu no mesmo percentual
na concentração de 4,5 mM e C3CNi na concentração de 4,2 mM. Comparando-
se a atividade antioxidante de C3CCu, C3CNi e C3CZn com o controle positivo
(rutina), a porcentagem de inibição da rutina é 4,5 vezes maior (Figura 20),
porém os complexos derivados de C3C apresentaram um aumento significativo
no potencial antioxidante, quando comparado com C3C.
Figura 20 - Atividade antioxidante dos compostos em (%). Fonte: Arquivo pessoal.
0
20
40
60
80
100
C3C C3CNi C3CZn C3CCu RUTINA
(%)
inib
içã
o d
o D
PP
H
Compostos
4,2 mM 2,9 mM 4,5 mM
0,32 mM
7,5 mM
51
Segundo a literatura complexos a base de Cu(II) apresentam maior
atividade antioxidante quando comparados com complexos de metais de Ni(II) e
Zn(II). Além disso, complexos metálicos que contém em sua estrutura
grupamentos hidroxila apresentam maior atividade antioxidante (ALCANTA et
al, 2015; RAJ; MRUTHYUNJAYASWAMY, 2014).
5.7.2 Atividade antimicrobiana
No estudo da atividade antimicrobiana por difusão em disco, os
componentes da formulação (C3C, Cu(CH3COO)2, Ni(CH3COO)2
Zn(CH3COO)2), foram testados previamente, os quais não tiveram atividade
antimicrobiana contra nenhuma das cepas avaliadas (Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae e Staphylococcus aureus).
Tabela 9 - Atividade inibitória dos complexos.
Zona de inibição (mm) bactérias
Klebsiella
pneumoniae Escherichia
coli Staphylococcus
aureus
Compostos 20 µL
30 µL
40 µL
50 µL
20 µL
30 µL
40 µL
50 µL
20 µL
30 µL
40 µL
50 µL
CP 30 30 31 31 41 40 41 41 25 23 25 25
C3C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
C3CCu 0 9 9 11 10 11 12 12 0 7 8 9
C3CNi 0 9 10 11 9 11 11 12 0 0 0 8
C3CZn 0 8 10 11 9 10 12 12 0 7 8 10
CP: Padrão de Ciprofloxacina. Fonte: Arquivo pessoal.
Foi utilizado como padrão positivo Ciprofloxacina (CP) e foram testados
em quatro diferentes volumes de 20, 30, 40 e 50 µL. De acordo com os dados
da Tabela 9, a única cepa que apresentou halo de inibição no volume de 20 µL
foi a Escherichia coli com inibição entre 9 e 10 mm, quando comparado com as
cepas de Klebsiella pneumoniae e Staphylococcus aureus. As bactérias
Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae apresentaram formação de halo de
52 inibição com todos os complexos no volume de 30 µL, porém neste mesmo
volume a cepa de Staphylococcus aureus não apresentou formação de halo de
inibição com C3CNi. Como exemplo do experimento de difusão em disco
realizado (Figura 21) são apresentados os halos de inibição de C3CNi na cepa
de Staphylococcus aureus nos volumes de 20, 30, 40 e 50 µL e o padrão de
ciprofloxacina.
Volumes testados em microlitros: 1 - 20µL; 2 – 30µL; 3 – 50µL; 4 – 40µL; 5 – 40µL Figura 21 – Halo de inibição no complexo de C3CNi na cepa de Staphylococcus aureus Fonte: Arquivo pessoal.
Avaliando-se o volume de 40 µL em todos as cepas testadas, a que
apresentou maior suscetibilidade foi a cepa de Escherichia coli com 11 e 12 mm
de halo. No entanto, a cepa menos sensível foi a Staphylococcus aureus
apresentado um halo de 8 mm nos complexos de C3CCu e C3CZn e com o
complexo de C3CNi não houve inibição. A cepa que apresentou maiores halos
de inibição no volume de 50 µL foi a Escherichia coli com halo de inibição de 12
mm para os três complexos testados, seguido da Klebsiella pneumoniae e
Staphylococcus aureus que apresentaram halos de inibição entre 8 e 11 mm. Os
resultados da literatura indicam que complexos com Cu(II) e Ni(II) apresentam
atividade antimicrobiana contra bactérias Escherichia coli e Staphylococcus
aureus. Devido a inserção dos metais ocorre o aumento da lipofilicidade desses
complexos facilitando a sua entrada nas células microbianas. (PRABHAKARA et
53 al. 2016; PATIL et al., 2015). O melhor resultado entre as cepas testadas com
os diferentes complexos é para a Escherichia coli que em variados volumes
ocorreu inibição. As bactérias Gram negativas Klebsiella pneumoniae e
Escherichia coli, apresentaram maior espectro nos resultados quando
comparados com as Gram positivas como por exemplo a Staphylococcus
aureus.
54 6 CONCLUSÃO
Neste trabalho foram sintetizados 3 novos complexos de ácido-3-
carboxicumarina através da complexação com metais de Cu(II), Ni(II) e Zn(II).
Foi possível elucidar a estrutura química para os complexos C3CCu, C3CNi e
C3CZn obtidos através de técnicas de caracterização por análise elementar,
espectroscopia no infravermelho, ultravioleta e análise termogravimétrica. Foi
testada a atividade antioxidante de todos os complexos pelo método DPPH. Os
complexos C3CCu, C3CNi e C3CZn apresentaram melhor atividade antioxidante
em relação ao composto de partida da ácido-3-carboxicumarina, o qual não
apresentou atividade nas concentrações testadas. Os complexos apresentaram
atividade antibactériana contra as cepas Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus
aureus e Escherichia coli. A maior atividade dos compostos foi contra a cepa de
Escherichia coli. O ácido-3-carboxicumarina não apresentou atividade
antibacteriana indicando que a complexação proporciona atividade
antimicrobiana. Os resultados obtidos nas análises antioxidante e antimicrobiana
sugere que os complexos poderão ser utilizados em outros estudos biológicos.
55 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALCANTARA, F. C. D.; LOZANO V.; VELOSA, A. S. V.; SANTOS, M.R.M. D.; PEREIRA, R. M. S. New coumarin complexes of Zn, Cu, Ni and Fe with antiparasitic activity. Polyhedron, v. 101, p. 165–170, 2015. ANAND, P.; SINGH, B.; SINGH, N. A review on coumarins as acetylcholinesterase inhibitors for Alzheimer’s disease. Bioorg Med Chem, v. 5, p. 1175-1180, 2012. BALASUBRAMANIAN, K. P.; PARAMESWARI, K.; CHINNUSAMY, V.; PRABHAKARAN, R.; NATARAJAN, K. Synthesis, characterization, electro chemistry, catalytic and biological activities of ruthenium (III) complexes with bidentate N, O/S donor ligands. Spectrochimica Acta Part A, v. 65, p. 678–683, 2006. BARBOSA, K. B. F.; COSTA, N. M. B.; ALFENAS, R. C. G.; DE PAULA, S. O.; MINIM, V. P. R.; BRESSAN, J. Oxidative stress: concept, implications and modulating factors. Revista Nutrição Campinas, v. 23, n. 4, p. 629 - 643, 2010. BOOTH, N. L.; NIKOLIC, D.; VAN, B. R. B.; GELLER, S. E.; BANUVAR, S.; SHULMAN, L. P.; FARNSWORTH, N. R. Confusion regarding anticoagulant coumarins in dietary supplements. Clinical Pharmacology e Therapeutics, v. 76, n.6, p. 511-516, 2004. BRUNETON, J.C. Coumarins. In: Pharmacognosy, Phytochemistry, Medicinal Plants. Paris: Intercepted Ltd, p. 229-240, 1995. CELEGHINI, R. M. S. Extração e análise cromatográfica (HPLC) de cumarinas em plantas medicinais brasileiras. Tese de doutorado, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, 1997. COSTA, Aloísio Fernandes. Farmacognosia. 5ª edição Lisboa: Fundação Calouste Gulbenkian, v. 2, 2002. CREAVEN, B. S.; EGAN, D. A.; KAVANAGH, K.; MCCANN, M.; MAHON, M.; NOBLE, A. THATI, B.; WALSH, M. Synthesis and antimicrobial activity of copper(II) and silver(I) complexes of hydroxyl nitrocoumarins: X-ray crystal structures of [Cu(hnc) 2(H2O)2] Æ 2H2O and [Ag(hnc)] (hncH = 4-hydroxy-3-nitro-2H-chromen-2-one). Polyhedron, v. 24, p. 949-957, 2005. CZELUSNIAK, K. E.; BROCCO, A.; PEREIRA, D.F.; FREITAS, G. B. L. Farmacobotânica, fitoquímica e farmacologia do Guaco: revisão considerando Mikania glomerata Sprengel e Mikanialae vigata Schulyz Bip. ex Baker. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 14, n. 2, p. 400-409, 2012. DEWICK, P.M. Medicinal natural products: a biosynthetic approach, West Sussex: Ed. John Wiley & Sons, 515 p., 1997.
56 DOUGLAS, C. J. Phenylpropanoid metabolism and lignin biosynthesis: from weeds to trees.Trends Plant Sci, v. 1, p. 171-178, 1996. EGAN, D.; O'KENNEDY, R.; MORAN, E.; COX, D.; PROSSER, E.; THORNES, R. D. The Pharmacology, Metabolism, Analysis, and Applications of coumarin and coumarin-related compounds. Drug Metabolism Review, v. 22, n. 5, p. 503-529, 1990. EL-WAHAB, Z. H. A.; MASHALY, M. M.; SALMAN, A. A.; EL-SHETARY, B. A.; FAHEIM, A. A. Co(II), Ce(III) and UO2 (VI) bis-salicylatothiosemicarbazide complexes Binary and ternary complexes, thermal studies and antimicrobial activity. Spectrochimica Acta Part A, n. 60, p. 2861–2873, 2004. ELHUSSEINY, A. F.; AAZAM, E. S.; AL-AMRI, H. M. Synthesis of new microbial pesticide metal complexes derived from coumarin-imine ligand. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, v.128, p. 852-863, 2014. FERREIRA, A. L. A.; MATSUBARA, L. S. Radicais Livres: conceito, doenças relacionadas, sistema de defesa e estresse oxidativo. Revista da Associação Medica Brasileira, v. 43, n. 1, Pag. 61- 68, 1997. FINN, G. J.; CREAVEN, B. S.; EGAN, D. A. Daphnetin induced differentiation of human renal carcinoma cells and its mediation by mitogen-activated protein kinase. Biochemical Pharmacology, v. 67, n. 9, p. 1779-1788, 2004. GEARY, W. L. The use of conductivity measurement in organic solvent for the characterization of coordination compounds. Coord. Chem. Rev, v. 7, p. 81-122, 1971. GEORGIEVA, I.; TRENDAFILOVA, N.; KIEFER, W.; RASTOGI, V.K., KOSTOVA, I. Vibrational and theoretical study of coumarin-3-carboxylic acid binding mode in Ce(III) and Nd(III) complexes. Vibrational Spectroscopy, v. 44, p. 78-88, 2007. GIL, E. S. Controle Físico-Químico de Qualidade de Medicamentos. 3. ed. São Paulo - SP: Pharmaboks, 2010. GÓMEZ-OUTES, A.; SUÁREZ-GEA, M. L.; CALVO-ROJAS, G.; LECUMBERRI, R.; ROCHA, E.; POZO-HERNÁNDEZ, C.; TERLEIRA-FERNÁNDEZ, A.I.; VARGAS-CASTRILLÓN, E. Discovery of anticoagulant drugs: a historical perspective. Curr Drug Discovery Technol, v. 9, p. 83-104, 2012. GRAZUL, M. BUDZISZ, E. Biological activity of metal ions complexes of chromones, coumarins and flavones. Coordination Chemistry Reviews, v. 258, p. 2588-2598, 2009. GUDASI, K. B; PATIL, M. S; VADAVI. R. Synthesis, characterization of Cu(II), Co(II), Ni(II), Zn(II) and Cd(II) complexes of [7-hydroxy-4-methyl-8-coumarinyl] glycine and a comparitive study of theirmicrobial activities. European Journal of
57 Medicinal Chemistry, v. 43, p. 2436–2441, 2008. HALLI, M. B.; SUMATHI, R. B.; KINNI, M. Synthesis, spectroscopic characterization and biological evaluation studies of Schiff’s base derived from naphthofuran-2-carbohydrazide with 8-formyl-7-hydroxy-4-methyl coumarin and its metal complexes. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, v. 99, p. 46-56, 2012. HALLIWELL, B.; GUTTERIDGE, J.M. Free Radicals in Biology and Medicine. New York: Oxford University Press, p. 851, 2007. HOULT, J. R. S.; PAYÁ, M. Pharmacological and Biochemical Actions of Simple Coumarins: Natural Products with Therapeutic Potential. General Pharmacology, v. 27, n. 4, p. 713-722, 1996. KABEYA, L. M. Estudo do efeito de cumarinas simples no metabolismo oxidativo de neutrófilos de coelho: aspectos metodológicos, avaliação da atividade e da sua relação com a toxicidade e com propriedades físico-químicas dos compostos. 140 f. 2002. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas, Área de concentração: Fármacos e Medicamentos). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2002. KANG, T. J.; LEE S. Y.; SINGH R. P.; AGARWAL, R.; YIM D. S. Anti-tumor activity of oxypeucedanin from Ostericum koreanum against human prostate carcinoma DU145 cells. Acta Oncologica, v. 48, n. 6, p. 895-900, 2009. KARATAS, M. O.; OLGUNDENIZ, B.; GÜNAL, S.; ÖZDEMIR, I.; ALICI, B.; ÇETINKAYA, E. Synthesis, characterization and antimicrobial activities of novel silver(I) complexes with coumarin substituted N-heterocyclic carbene ligands. Bioorganic & Medicinal Chemistry, v. 24, p. 643– 650, 2016. KOFINAS, C.; CHINVU, I.; LOUKIS, A.; HARVALA, C.; MAILLARI, MARC.; HOSTETTMANU.; K. Flavonoids and bioactive coumarins of Tordylium apulum. Phytochemistry, v. 48, n. 4, p. 637-641, 1998. KOSTOVA, I.; MANOLOV, I.; MOMEKOV, G. Citotoxicactivity of new neodymium (III) complexes of bis-coumarins. European Journal of Medicinal Chemistry, v. 39, p. 765-775, 2004. KOSTOVA, I.; MOMEKOV, G.; ZAHARIEVA, M.; KARAIVANOVA, M. Citotoxic activity of new lanthanum (III) complexes of bis-coumarins. European Journal of Medicinal Chemistry, v. 40, p. 542-551, 2005. KOSTOVA, I.; MOMEKOV, G.; STANCHEVA, P. New Samarium(III), Gadolinium (III), and Dysprosium(III) Complexes of Coumarin-3-Carboxylic Acid as Antiproliferative Agents. Metal-Based Drugs, v. 2007, p.8, 2007. KOSTOVA, I.; BHATIA, S.; GRIGOROV, P.; BALKANSKY, S.; PARMAR, V.S.;
58 PRASAD, A. K.; SASO, L. Coumarins as antioxidants. Curr Med Chem, v.18, p. 3929-3951, 2011. KOSTOVA, I.; STEFANOVA, T. New gallium(III) complex-synthesis, spectral characterization and cytotoxicity. Indian Journal of Pure, v. 50, p. 547-554, 2012. KUSTER, R. M.; ROCHA, L. M. Cumarinas, Cromonas e Xantonas. In: SIMÕES, C. M. O. et al. Farmacognosia da planta ao medicamento, 5° ed., Porto Alegre/ Florianópolis: Editora da UFRGS/Editora da UFSC, p.247-262. 2003. LV, H. N.; WANG, S. H.; ZENG, K. W.; LI, J.; GUO, X. Y.; FERREIRA, D.; ZJAWIONY, J. K.; TU, P. F.; JIANG, Y. Anti-inflammatory Coumarin and Benzocoumarin Derivatives from Murraya alata. Jornal of natural products, v. 78, p. 279–285, 2015. MESQUITA, A. K. D. F.; MACHADO, K. D. C.; NUNES, L. C. C.; MORAES, J. D.; FREITAS, R. M. D. Estudo Prospectivo Tecnológico e Científico do potencial antischistosoma mansoni da cumarina e do ácido o-hidroxicinâmico. Prospect, v. 6, n. 3, p. 386-397, 2013. MEYER, B. N.; FERRIGNI, N. R.; PUTNAM J. E., JACOBSEN, L. B.; NICHOLS, D. E.; MCLAUGHLIN, J. L. Brine shrimp: a convenient general bioassay for active plant constituents. Planta Med, v. 45, n. 5, p. 31–34, 1982. MIRANDA, J. A. Caracterização fotofísica de derivados de cumarina. 144 f. 2001. Dissertação (Pós-Graduação em Química), Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia-MG, 2001. MOSAA, A. I.; EMARAB, A. A. A.; YOUSEFA, J. M.; SADDIQD, A. A. Novel transition metal complexes of 4-hydroxy-coumarin-3-thiocarbohydrazone: Pharmacodynamic of Co(III) on rats and antimicrobial activity. Spectrochimica, v. 81, p.35-43, 2011. MONTAGNER, C. Atividade Antifúngica e Citotóxica de Cumarinas Naturais e Semi sintéticas. x f. 2005. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) Universidade Federal de Santa Catarina, 2005. MUELLER, R. L. First-generationagents: aspirin, heparinandcoumarins. Best Practice & Research Clinical Haematology, v. 17, p. 23-53, 2004. MURAKAMI, A.; NAKAMURA, Y;. TANAKA, T.; KAWABATA, K.; TAKAHASHI D.; KOSHIMIZU, K.; OHIGASHI, H. Suppression by citrus auraptene of phorbol ester-and endotoxin-induced inflammatory responses: role of attenuation of leukocyte activation. Carcinogenesis, v. 21, n. 10, p. 1843-1850, 2000. OJALA, T. Biological Screening of Plant Coumarins Academic Dissertation, University of Helsinki, 2001. Otero, E.; Vergara, Sebastián.; Robledo, S. M.; Cardona, Wilson.; Carda, M.; Vélez, I. D.; Rojas, C.; Otálvaro, F. Synthesis, Leishmanicidal and Cytotoxic
59 Activity ofTriclosan-Chalcone, Triclosan-Chromone and Triclosan-Coumarin Hybrids. Molecules, v.19, p. 13251-13266, 2014. PATEL, K. S.; PATEL, J. C.; DHOLARIYA, H. R.; PATEL, K. D. Multiple heating rate kinetic parameters, thermal, X-ray diffraction studies of newly synthesized octahedral copper complexes based on bromo-coumarins along with their antioxidant, anti-tubercular and antimicrobial activity evaluation. Spectro chimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, v.96, p.468-479, 2012. PATIL, S. A.; UNKIA, N.; KULKARNIA, A. D.; NAIKA, V. H.; BADAMIB, P. S. Co(II), Ni(II) and Cu(II) complexes with coumarin-8-yl Schiff-bases: Spectroscopic, in vitro antimicrobial, DNA cleavage and fluorescence studies. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, v. 79, p. 1128–1136, 2011. PATIL, S. A.; PRABHAKARA, C. T.; HALASANGI, B. M.; TORAGALMATH, S. S.; BADAMI, P. S. DNA cleavage, antibacterial, antifungal and anthelmintic studies of Co(II), Ni(II) and Cu(II) complexes of coumarin Schiff bases: Synthesis and spectral approach. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, v.137, p. 641-651, 2015. PAYÁ, M. et al. Superoxide scavenging activity in leukocytes and absence of cellular toxicity of a series of coumarins. Biochemical Pharmacology, v. 48, n. 3, p. 445-451, 1994. PENG, X. M.; DAMU, G.L.V.; ZHOU, C. H. Current Developments of Coumarin Compounds in Medicinal Chemistry. Bentham Science Publishers, v. 19, p. 3884-3930, 2013. PRABHAKARA, C. T.; PATIL S. A.; KULKARNI, A. D.; NAIK, V. H.; MANJUNATHA, M.; KINNAL, S. M.; BADAMI, P. S. Synthesis, spectral, thermal, fluorescence, antimicrobial, anthelminticand DNA cleavage studies of mononuclear metal chelates of bi-dentate 2H-chromene-2-one Schiff base. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, v.148, p. 322–332, 2015. PRABHAKARA, C. T.; PATIL, S. A.; TORAGALMATH, S. S.; KINNAL, S. M.; BADAM, P. S. Synthesis, characterization and biological approach of metal chelates of some first row transition metal ions with halogenated bidentate coumarin Schiff bases containing N and O donor atoms. Journal of Photochemistry & Photobiology, B: Biology, v. 157, p.1–14, 2016. RAJ, K. M.; MRUTHYUNJAYASWAMY, B. H. M. Synthesis, spectroscopic characterization, electrochemistry and biological evaluation of some metal (II) complexes with ONO donor ligand containing benzo[b]thiophene and coumarinmoieties. Journal of Molecular Structure, v.1074, p. 572-582, 2014. RIVEIRO, M. E.; DEKIMPE, N.; MOGLIONI, A.; VÁZQUEZ, R.; MONCZOR, F.; SHAYO, C.; DAVIO, C. Coumarins old compounds with novel promising therapeutic perspectives. Curr Med Chem, v. 68, p.1325-1338, 2007.
60 ROSSELLI, S.; MAGGIO, A. M.; FARAONE, N.; SPADARO, V.; MORRIS-NATSCHKE, S. L.; BASTOW, K. F.; LEE, K. H.; BRUNO, M. The cytotoxic properties of natural coumarins isolated from roots of Ferulago campestris (Apiaceae) and of synthetic ester derivatives of aegelinol. Natural Product Communications, v. 4, n. 12, p. 1701-1706, 2009. RUFINO, M. S. M.; ALVES, R. E.; BRITO, E. S.; MORAIS, S. M. D.; SAMPAIO, C. D. G.; JIMÉNEZ, J. P.; SAURA-CALIXTO, F. D. Metodologia científica: Determinação da Atividade Antioxidante Total em Frutas pela Captura do Radical Livre DPPH. Embrapa Comunicado Técnico 127 ISSN 1670-6535 p.1- 4, Fortaleza, CE, Julho de 2007. SALLES, M. R. Espectroscopia Eletrônica dos Compostos de Coordenação. In: FARIAS, R. F. (Org.); Química de Coordenação: Fundamentos e Atualidades. 1 ed. Campinas-SP: Atomo, 2005. SIMÕES, C. O. S.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETROVICK. P. R Farmacognosia: da planta ao medicamento, 5. ed. Porto Alegre/Florianópolis: Universidade UFRGS/ Ed. Da UFSC, p. 404-420, 2003. SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETROVICK. P. R. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 6. ed. Porto Alegre: Editora da UFRGS: Florianópolis: Editora da UFSC, 2010. SOUZA, S. M.; DELLE-MONACHE, F.; SMÂNIA, A. Antibacterial Activity of Coumarins. Zeitschrift für Naturforschung, v. 60, n. 9-10, p. 693-700, 2005. THATI, B.; NOBLE, A.; ROWAN, R.; CREAVEN, B. S.; WALSH, M.; MCCANN M.; EGAN, D.; KAVANAGH, K. Mechanism of action of coumarin and silver(I)–coumarin complexes against the pathogenic yeast Candida albicans. Science Direct, v. 21, p. 801-808, 2007. THATI, B.; NOBLE, A.; CREAVEN, B. S.; WALSH, M.; MCCANN, M.; DEVEREUX, M.; KAVANAGH, K.; EGAN, D. A. Role of cell cycle events and apoptosis in mediating the anti-cancer activity of a silver(I) complex of 4- hydroxy-3-nitro-coumarin-bis(phenanthroline) in human malignant cancer cells. European Journal of Pharmacology, n. 602, p. 203-214, 2009. Yu, T.; Zhang, P.; Zhao, Y.; Zhang, H.; Fan, D.; Dong, W.; Ding, L. Synthesis and Cytotoxic Activity of Coumarin Derivatives Containing Benzotriazole Moieties. Phosphorus, Sulfur and Silicon and the Related Elements, v. 184, n. 10, p. 2655-2663, 2009. ZHANG, C. X.; LIPPARDS. J. New metal complexes as potential therapeutics. Current Opinion in Chemical Biology, v. 7, p. 481–489, 2003. ZHANG, H.; WANG, L. Theoretical elucidation of structure-activity relation ship for coumarins to scavenge peroxyl radical. Journal of Molecular Structure (Theochem), v. 673, p. 199-202, 2004.
61 ZHANG, H.; TIAN-ZHI, Y.; YU-LING, Z.; ZHANG, S. Cytotoxic activity of some novel dicoumarin derivatives in vitro. Chemical Research in Chinese Universities, v. 25, n. 5, p. 644-647, 2009. ZHOU, X. Q.; MENG, L. B.; HUANG, Q.; LI J.; ZHENG, K.; ZHANG, F. L.; LIU J. Y.; XUE, J. P. Synthesis and in vitro Anticancer Activity of Zinc(II) Phthalocyanines Conjugated with Coumarin Derivatives for Dual Photodynamic and Chemotherapy. Chem Med Chen, v. 10, p. 304-311, 2015. WU, L.; WANG, X.; XU, W.; FARZANEH, F.; XU, R. The structure and pharmacological functions of coumarins and their derivatives. Curr Med Chem, v. 16, p. 4236-4260, 2009. WATERMAN, P.G.; MOLE, S. Analysis of phenolic plant metabolites. London: ed. Blackwell Scientific Publication, p. 238, 1994.
62
APÊNDICES
63
Apêndice 1 – Espectro vibracional no Infravermelho do C3C. Fonte: Arquivo pessoal.
64
Apêndice 2 – Espectro vibracional no Infravermelho do complexo de C3CCu. Fonte: Arquivo pessoal.
65
Apêndice 3 – Espectro vibracional no Infravermelho do complexo de C3CNi. Fonte: Arquivo pessoal.
66
Apêndice 4 – Espectro vibracional no Infravermelho do complexo de C3CZn. Fonte: Acervo pessoal.