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Controle de florações de cianobactérias tóxicas – busca por auto-inibidores de crescimento em Microcystis

DIOGO DE ABREU MEIRELES

Dissertação apresentada ao centro de Biociências e Biotecnologia, da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Biociências e Biotecnologia, com ênfase em Biologia Molecular e Biotecnologia.

Orientadora: Dra. Denise Saraiva Dagnino

Campos dos Goytacazes - RJ

Maio, 2006

ii

Controle de florações de cianobactérias tóxicas – busca por auto-inibidores de crescimento em Microcystis

DIOGO DE ABREU MEIRELES

Dissertação apresentada ao centro de Biociências e Biotecnologia, da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Biociências e Biotecnologia, com ênfase em Biologia Molecular e Biotecnologia.

Aprovada em 24 de maio de 2006. Comissão examinadora: ___________________________________________________________________ Profa. Anna Lvovna Okorokova Façanha (Dra. em Química Biológica) – UENF ___________________________________________________________________ Prof. Arnoldo Rocha Façanha (Dr. em Química Biológica) – UENF ___________________________________________________________________ Prof. Gonçalo Apolinário de Souza Filho (Dr. em Biociências e Biotecnologia) – UENF ___________________________________________________________________ Profa. Vera Lúcia de Moraes Huszar (Dra. em Ecologia e Recursos Naturais) – Museu Nacional/RJ ___________________________________________________________________ Profa. Denise Saraiva Dagnino (Dra. em Ciências Matemáticas e da Natureza) – UENF

(Orientadora)

iii

“Se um dia já homem feito e realizado

sentires que a terra cede aos teus pés,

que tuas obras desmoronam,

que não há ninguém a tua volta

para te estender a mão,

esquece a tua maturidade,

passa pela tua mocidade,

volta a tua infância e balbucia,

entre lágrimas e esperanças,

as últimas palavras que sempre te

restarão na alma

Minha Mãe, Meu Pai!”

Rui Barbosa

Dedico este trabalho a minha família: meu

pai, Idevaldo; minha mãe, Norma; minha

irmã, Elaine e meu sobrinho, Gabriel. EU

AMO VOCÊS.

Agradecimentos ___________________________________________________________________

iv

Agradecimentos:

Agradeço a Deus por me dar força nos momentos de luta e esperança quando

sentia que tudo estava perdido.

Agradeço aos meus tios e primos por todo carinho e conforto.

Agradeço aos meus amigos: Ana Lustozza, Gabriela Gesualdi, Gustavo Chagas,

Izabela da Silva, Maria Cristina, Thaís Granato, Wendell e em especial Anna Rosa

Carvalho, Inês Costa, Janice Dias e Viviane Cabral, por sete anos companheirismo.

Agradeço as minhas companheiras de trabalho e amigas: Ana Laura Boechat, Erika

Fraga, Érica Santana, Gláucia Fragoso, Marina Silva, Rafaela Silva e Thays Abreu.

Agradeço a Débora Abreu Rangel pelo carinho e amizade.

Agradeço a minha orientadora, profa. Denise Saraiva Dagnino pela minha formação.

Agradeço ao prof. Jan Schripsema, pela interpretação dos espectros de RMN e

apoio na realização deste trabalho.

Agradeço ao prof. João Carlos de Aquino Almeida, pelas micrografias eletrônicas e

também pela amizade.

Agradeço ao revisor desta dissertação, o prof. Ekkhard Ernst Theodor Hansen pela

boa vontade.

Agradeço as profas. Anna L. Okorokova Façanha e Tânia Jacinto pelo apoio nos

momentos finais de minha formação.

Agradeço a todos os membros da banca por terem participado da defesa desta

dissertação.

Agradeço a todos os companheiros de laboratório que por muitos anos estiveram

presentes em minha vida acadêmica.

Agradecimentos ___________________________________________________________________

v

Agradeço aos demais professores que compartilharam seus conhecimentos ao

longo do curso.

Índice ___________________________________________________________________

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Índice geral: Lista de abreviaturas...........................................................................................

Índice de figuras..................................................................................................

Índice de tabelas.................................................................................................

Resumo................................................................................................................

Abstract...............................................................................................................

1- Introdução........................................................................................................

1.1- As cianobactérias......................................................................................

1.2 - A fisiologia da fase estacionária...............................................................

1.2.1- Introdução......................................................................................

1.2.2 - Em cianobactérias.........................................................................

1.3 - A comunicação intercelular em microorganismos....................................

1.3.1- Introdução......................................................................................

1.3.2- Outras classes de sinais extracelulares presentes em culturas

estacionárias de microorganismos...........................................................

2- Objetivos..........................................................................................................

2.1- Objetivo geral...........................................................................................

2.2- Objetivos específicos...............................................................................

3- Material e Métodos........................................................................................

3.1- Cepas de cianobactérias e condições de cultivo......................................

3.2- Caracterização das células de Microcystis PCC 7806 em diferentes

estágios de crescimento...................................................................................

3.2.1- Crescimento e perfil de pigmentos.................................................

3.2.2- Estimativa do conteúdo de glicogênio – método enzimático..........

3.2.2.1- Hidrólise ácida...................................................................

3.2.2.2- Quantificação de glicose...................................................

3.2.2.3 -Quantificação das amostras..............................................

3.2.3 -Estimativa do conteúdo de proteínas solúveis...............................

3.2.3.1 - Extração de proteínas solúveis........................................

3.2.3.2 - Obtenção da curva de calibração.....................................

3.2.3.3 - Quantificação das amostras.............................................

3.2.4- Perfil metabólico - Ressonância Magnética Nuclear (RMN)..........

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Índice ___________________________________________________________________

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3.2.4.1- Procedimento de extração................................................

3.2.4.2- Análise dos extratos..........................................................

3.2.5- Ultra-estrutura – microscopia eletrônica.........................................

3.2.6- Viabilidade das células cloróticas...................................................

3.2.6.1- Capacidade de crescimento de cultivos cloróticos

inoculados em 2 ASM-1.................................................................

3.2.6.2- Verificação da integridade de membrana de células

cloróticas........................................................................................

3.3- Auto-regulação do crescimento.................................................................

3.3.1- Efeito do meio condicionado, obtido de culturas cloróticas, sobre

o crescimento de culturas da mesma cepa, mantidas em meio rico em

nutrientes...................................................................................................

3.3.1.1- O ensaio de inibição...........................................................

3.3.2- Investigação do mecanismo envolvido na inibição do crescimento

3.3.2.1- Perfil de pigmentos e ultraestrutura de células tratadas

com meio condicionado...................................................................

3.3.2.2- Atividade do meio condicionado sobre culturas da

mesma cepa de diferentes idades..................................................

3.3.3- Especificidade da atividade do meio condicionado.........................

3.4- Extração e caracterização preliminar do fator responsável pela atividade

do meio condicionado sobre culturas saudáveis de Microcystis PCC

7806..................................................................................................................

3.4.1- Extração do meio condicionado....................................................

3.4.1.1- Empacotamento e ativação da coluna..............................

3.4.1.2- Obtenção do extrato..........................................................

3.4.2- Testes de estabilidade...................................................................

3.4.3- Purificação inicial............................................................................

3.4.4- Análise por CLAE...........................................................................

3.4.4.1- Parâmetros da análise......................................................

3.4.4.2- Processamento das frações..............................................

4- Resultados e discussão.................................................................................

4.1- Caracterização de culturas de Microcystis PCC 7806 de diferentes

estágios de crescimento...................................................................................

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Índice ___________________________________________________________________

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4.1.1- Curva de crescimento e dinâmica no conteúdo de pigmentos

durante cultivo de Microcystis PCC 7806 por longos períodos.................

4.1.2- Cultivo de células cloróticas em meio 2 ASM-1.............................

4.1.3 - Verificação da integridade de membrana.......................................

4.2 - Caracterização dos dois fenótipos...........................................................

4.2.1 - Diferenças na ultraestrutura...........................................................

4.2.2 - Diferenças no acúmulo de glicogênio............................................

4.2.3 – Conteúdo de proteínas solúveis....................................................

4.2.4 - Diferenças no perfil metabólico......................................................

4.3- Auto-regulação do crescimento de Microcystis PCC 7806.......................

4.3.1 - O efeito do meio condicionado de Microcystis sobre o

crescimento e conteúdo de pigmentos da mesma cepa..........................

4.3.2 - Atividade do meio condicionado ativo sobre outras cepas...........

4.4 - Investigação do mecanismo de inibição...................................................

4.4.1 - Efeito do meio condicionado ativo sobre o perfil de pigmentos,

ultraestrutura e viabilidade de células de Microcystis PCC 7806.............

4.5 - Extração e caracterização preliminar do fator responsável pela

atividade do meio condicionado em culturas de Microcystis PCC 7806..........

4.5.1 - Extração.......................................................................................

4.5.2 - Análise por CLAE.........................................................................

4.6 - Considerações finais................................................................................

5- Conclusões......................................................................................................

5.1- Caracterização de culturas de Microcystis PCC 7806 em diferentes

estágios de crescimento...................................................................................

5.2 - Auto-regulação do crescimento em Microcystis PCC 7806.....................

6- Referências bibliográficas..............................................................................

7- Anexos.............................................................................................................

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Lista de abreviaturas ___________________________________________________________________

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Lista de abreviaturas:

AHB:

AHL:

ASB:

ADN:

DO:

EDTA:

GOD:

CLAE:

HSL:

ODS:

PCC:

PHB:

POD:

RMN:

ARN:

TFA:

UV:

Alquilhidroxibenzeno;

N-acil homoserina lactona;

Albumina sérica bovina;

Ácido desoxiribonucléico;

Densidade óptica;

Àcido etilenodiaminotetracético;

Glicose oxidase;

Cromatografia líquida de alta eficiência

Homoserina lactona;

Octadodecilsilano;

Pasteur culture collection;

Poli-hidroxibutirato;

Peroxidase;

Ressonância magnética nuclear;

Ácido ribonucléico;

Ácido trifluoracético;

Ultravioleta;

Índice de figuras ___________________________________________________________________

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Índice de figuras:

Figura 1- Exemplo de floração de cianobactéria do gênero Microcystis....................3

Figura 2 - Mecanismo de ‘quorum sensing’ em Photobacterium fischeri..................15

Figura 3 - Alguns exemplos de moléculas envolvidas no processo de comunicação

intercelular em microorganismos...............................................................................20

Figura 4 - Curva de crescimento...............................................................................41

Figura 5 - Espectros de absorção de suspensão de células de Microcystis PCC

7806 coletadas com 3, 15 e 35 dias de cultivo..........................................................42

Figura 6 - Fenótipos de Microcystis PCC 7806 em diferentes estágios de cultivo....43

Figura 7 - Experimento de regeneração....................................................................44

Figura 8 - Micrografias eletrônicas de células de Microcystis sob diferentes

condições...................................................................................................................48

Figura 9 - Estimativa do conteúdo de glicogênio.......................................................49

Figura 10 - Espectros de 1H RMN (400 mHz) de células de Microcystis PCC 7806

coletadas em diferentes estágios de crescimento da cultura.....................................56

Figura 11 - Efeito do meio condicionado ativo sobre o crescimento de culturas de

Microcystis crescidas em meio repleto de nutrientes.................................................58

Figura 12 - Efeito da adição do meio condicionado ativo em culturas de Microcystis

com 4, 7, 10 e 14 dias de crescimento.......................................................................61

Figura 13 - Cromatograma da fração ativa e atividade das frações coletadas após

passagem por CLAE..................................................................................................68

Índice de tabelas ___________________________________________________________________

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Índice de tabelas:

Tabela 1- Informações auxiliares aos espectros dos extratos aquosos.................55

Tabela 2- Informações auxiliares aos espectros dos extratos metanólicos............55

Tabela 3- Informações auxiliares aos espectros dos extratos clorofórmicos..........55

Tabela 4- Comparação do efeito do meio condicionado de culturas cloróticas de

Microcystis PCC 7806 sobre o crescimento de outras cepas....................................60

Resumo ___________________________________________________________________

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Resumo

A ocorrência de florações de cianobactérias em corpos d´água vem aumentando em

todo o mundo nos últimos anos. Essas florações geralmente são tóxicas e por isso,

geram sérios riscos de intoxicação à população humana. O objetivo deste trabalho

foi detectar a produção de auto-inibidores de crescimento em Microcystis PCC 7806.

O cultivo de Microcystis por longos períodos de tempo em meio ASM-1 líquido leva

ao aparecimento de dois fenótipos distintos: um durante a fase de multiplicação

celular onde a cultura é verde e outro na fase estacionária onde a cultura torna-se

clorótica (sem pigmentos). O espectro visível dessas culturas cloróticas mostrou a

redução da concentração de clorofila a. A comparação do perfil metabólico,

conteúdo de glicogênio e da ultraestrutura entre as células verdes e cloróticas

revelou várias diferenças. As culturas cloróticas permanecem viáveis e voltam a

adquirir o tom verde característico da cultura em fase de crescimento, quando

inoculadas em meio repleto de nutrientes. Um sinal extra-celular foi detectado no

meio de cultura (meio condicionado) das células cloróticas: quando o meio

condicionado de células cloróticas é adicionado a culturas verdes em fase de

crescimento, a multiplicação das células dessa cultura é drasticamente reduzida

quando comparada à multiplicação em culturas controle (onde foram adicionados ou

água ou meio novo ao invés de meio condicionado). A inibição da multiplicação com

a adição de meio condicionado foi observada em culturas em qualquer fase de

crescimento. Esses efeitos não são específicos para a cepa, mas parecem ser, no

mínimo específicos para o gênero já que outras cepas de Microcystis respondem da

mesma maneira ao tratamento com o meio condicionado e outros gêneros testados

(Synechocystis e Synechococcus) não tiveram seu crescimento alterado após a

Resumo ___________________________________________________________________

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adição deste meio. A investigação do mecanismo de inibição da multiplicação celular

revelou que as culturas tratadas com o meio condicionado adquirem também um

aspecto clorótico, com a concentração de pigmentos similar ao encontrado em

culturas cloróticas. A observação da ultra-estrutura das células tratadas demonstrou

que o meio condicionado induz a desorganização dos tilacóides. Um extrato ativo foi

obtido e experimentos mostraram que a sua atividade não é alterada após fervura ou

adição de solventes. Estes fatos indicam que o (s) fator (es) encontrado (s) no meio

condicionado de células cloróticas se trata de um composto não-proteico e apolar.

Parte deste trabalho foi publicado na revista Environmental Microbiology (2006) 8(1):

30-36.

Abstract ___________________________________________________________________

xiv

Abstract

The frequency of cyanobacterial blooms has been increasing all over the world.

These blooms are often toxic and have become a serious health problem. The aim of

this work was to detect extra-cellular signalling molecules that could coordinate

proliferation of Microcystis PCC 7806. Microcystis cultured for long periods in liquid

ASM-1 medium looses its characteristic green colour. Whole cell visible spectra of

these cultures show a reduced chlorophyll peak. The comparison of the metabolic

profiles, glycogen acummulation and the ultra-structure of green and chlorotic cells

revealed several differences between these cells. Chlorosis is reversible; when the

pale culture is transferred back to ASM-1 medium it regains its characteristic colour

within a week or two. An extra-cellular signal has been found in the culture medium

of starved cultures: when culture medium from chlorotic cells is added to a normal

culture, cell density increase (measured by turbidity) is drastically reduced when

compared to controls. Inhibition of cell proliferation by the conditioned medium occurs

during all stages of development; reduced cell density increase and induced

chlorosis occur no matter at what stage the conditioned medium is added to cultures.

These effects are not strain specific but seem to be at least genus specific; other

Microcystis strains respond the same way to the conditioned medium, but other

genera tested (Synechocystis e Synechococcus) showed no detectable response.

Investigations on the mechanism of growth inhibition showed that cultures treated

with the conditioned medium acquired a pale colour, with pigment concentration

similar to that found in chlorotic cultures. Ultrastructural examination showed that the

condicioned medium induced thylakoid membrane disorganization, typical of the

chlorotic cells, in nutrient-replete cultures. An active extract was obtained and

Abstract ___________________________________________________________________

xv

investigations showed that activity was retained after heating and after addition of an

apolar solvent. This indicates that activityof the condicioned medium from chlorotic

cells results from non-protein, apolar compound (s). Part of this work was published

in Environmental Microbiology (2006) 8(1): 30-36.

Introdução ___________________________________________________________________

1

1- Introdução:

1.1- As cianobactérias:

As cianobactérias, também chamadas de cianofíceas ou algas azuis, são

organismos procariontes que diferem das demais bactérias fotossintetizantes pelo

fato de serem fototróficas oxigênicas, ou seja, realizam a fotossíntese com a

liberação de oxigênio. Esses microorganismos possuem diversos mecanismos para

se adaptar a diferentes condições ambientais. São amplamente distribuídos pelo

mundo ocorrendo nos mais variados tipos de ambientes terrestres e aquáticos e são

capazes de colonizar ambientes extremos, como por exemplo, cinzas vulcânicas,

desertos arenosos e rochas (Dor & Danin, 1996).

As cianobactérias possuem grande importância econômica. Alguns gêneros

são diazotróficos (fixadores de nitrogênio molecular) e contribuem para a fertilização

da água e do solo (Rai, 1990). Algumas espécies são usadas na indústria alimentícia

por apresentarem alto valor nutricional (Borowitska & Borowitska, 1988). Elas

também são uma rica fonte de novas substâncias com potencial interesse

farmacêutico, já que produzem uma grande variedade de metabólitos secundários

com atividade biológica (Patterson et al., 1994).

As cianobactérias têm a capacidade de se multiplicar rapidamente em águas

ricas em nutrientes (principalmente fósforo e compostos nitrogenados) (Watanabe et

al., 1986; Codd, 1984). Durante os últimos anos, o que tem chamado atenção para

este grupo de microorganismos são as florações. Florações de cianobactérias são o

resultado da multiplicação excessiva das células que chega a alterar a coloração da

água para verde ou vermelha.

Introdução ___________________________________________________________________

2

A freqüência de florações vem aumentando nos últimos anos devido aos

problemas crescentes de poluição em corpos d’água (rios, lagos, reservatórios, etc).

A atividade agrícola e o lançamento descontrolado de esgoto não tratado, devido ao

crescimento das cidades, são tidos como os maiores responsáveis pela aceleração

dos processos naturais de eutrofização.

Fatores climáticos que favorecem o surgimento de florações são altas

temperaturas e ambiente sem chuva. A população de cianobactérias quando

dispersa na coluna d’água pode parecer pouco densa. No entanto, quando as

condições atmosféricas são favoráveis as células concentram-se na superfície da

água em poucas horas. Estas podem, em seguida, ser arrastadas para as margens

da massa d’água por ação do vento e gerar uma concentração maior de células (Fig.

1). A decomposição de enorme quantidade de biomassa acumulada por esses

microorganismos, leva à desoxigenação da água causando prejuízos em todo o

ecossistema.

As florações são indesejáveis não apenas por prejudicar a estética local

devido à formação de grossas natas verdes e odores fétidos nas margens, mas

também porque cerca de 60 % das florações são tóxicas (Carmichael & Gorham,

1981; Repavich et al., 1990; Costa & Azevedo, 1995).

Existem vários gêneros de cianobactérias de água doce, capazes de produzir

potentes toxinas, tais como Anabaena, Aphanizomenom, Microcystis e Oscillatoria

(Chorus & Bartram, 1999). As toxinas produzidas por estes gêneros são

classificadas, de acordo com os sintomas que provocam em mamíferos:

hepatotoxinas, neurotoxinas e dermatotoxinas.

Introdução ___________________________________________________________________

3

As neurotoxinas produzidas por cianobactérias são anatoxina-a, anatoxina-

a(s) e saxitoxinas. Em caso de intoxicação aguda seus efeitos são muito rápidos,

provocando a morte por parada respiratória em poucos minutos (Carmichael, 1992).

As hepatotoxinas, microcistinas e nodularinas (peptídeos cíclicos),

cilindrospermopsinas (alcalóides) atuam de um modo mais lento; em animais foi

observado que provocam danos hepáticos e hemorragias, resultando num forte

choque circulatório e na perda de funções hepáticas (Hooser et al., 1991). As

microcistinas, quando ingeridas em doses subletais, podem atuar como promotores

de tumores hepáticos (Falconer, 1991).

Os registros de intoxicações causadas por ingestão de água com florações de

cianobactérias são encontrados em todo o mundo (Carmichael, 1981). A maioria dos

Fig. 1- Exemplo de uma floração de cianobactéria do gênero

Microcystis. Esta densidade só foi atingida graças à ação do

vento.

Retirado de http://bilbo.bio.purdue.edu/www-cyanosite/index.html

Introdução ___________________________________________________________________

4

casos descreve a intoxicação ou morte de animais silvestres e domésticos após o

consumo de água contaminada. Em 1990, na Escócia, foi registrada a morte

imediata de vários cães após a ingestão da água de um lago contendo uma floração

neurotóxica de Oscillatoria (Cood & Battie, 1991; Edwards et al., 1992; Gunn et al.,

1992). Na Inglaterra, em 1989, uma floração de Microcystis aeruginosa, num

reservatório de água, provocou a morte de 20 cordeiros e 15 cães (Codd & Battie,

1991; Hunter & Roberts, 1991).

Apesar da freqüência com que as florações tóxicas surgem, o número de

intoxicações humanas agudas, quando comparadas com o número de intoxicações

em animais, não é elevado. Isto se deve, provavelmente ao fato do homem

selecionar mais a água que consome. Os maiores problemas em humanos surgem

geralmente devido ao contato direto com as cianobactérias durante a recreação em

massas d’água contaminadas, ou devido ao tratamento insuficiente dos

reservatórios de água potável. Durante o tratamento geralmente ocorre a ruptura das

células, o que ocasiona a liberação das toxinas para a água.

As intoxicações agudas provocadas por cianobactérias podem provocar

sintomas no homem, tais como: reações alérgicas (asma, irritação nos olhos,

dermatites), gastroenterites ou hepatoenterites com diarréia e dores, letargia,

tremores musculares e respiração ofegante (Beasley et al., 1989), enfraquecimento,

anorexia, palidez das membranas mucosas e extremidades frias (Carmichael, 1992).

No Brasil, são descritos dois casos trágicos de intoxicação humana por

cianobactérias: em 1988 foi constatada a correlação epidemiológica entre a floração

de cianobactérias no Reservatório de Itaparica, BA e a morte de 88 pessoas entre

2000 intoxicadas (Teixeira et al., 1993). Mais recentemente, em 1996, foi

comprovada a presença de microcistina na água que abastecia o Centro de

Introdução ___________________________________________________________________

5

Hemodiálise de Caruaru, PE. Setenta e seis pacientes morreram de um total de 116

pessoas intoxicadas após tratamento nessa instituição (Azevedo, 1996, Jochimsen

et al.,1998).

No ano de 2002, no município de Campos dos Goytacazes - RJ, o aumento

de matéria orgânica e a baixa vazão do rio Paraíba do Sul contribuíram para o

surgimento de uma floração de cianobactérias. A água deste rio é usada para

abastecimento urbano. O surgimento desta floração causou a interrupção no

abastecimento de água por vários dias, devido a relatos de pessoas hospitalizadas

após o consumo desta água.

Os casos descritos acima tornam evidente a importância do estudo da

fisiologia e do metabolismo desses microorganismos, com o objetivo buscar

maneiras de controlar a formação de florações de cianobactérias potencialmente

tóxicas.

Várias estratégias de combate às florações de cianobactérias têm sido

desenvolvidas. Na tentativa de prevenir o surgimento de florações procura-se

diminuir a descarga de matéria orgânica em corpos d’ água como rios, lagos e

reservatórios, desacelerando o processo de eutrofização. Quando já existe a

floração, outros métodos podem ser aplicados na tentativa de diminuir a

concentração das células: métodos físicos, que incluem a regulação do fluxo da

água, sua aeração e/ou controle da luminosidade e métodos químicos, como o uso

de algicidas, sendo o exemplo mais comum o uso de sulfato de cobre. Todas essas

alternativas de solucionar o problema têm se mostrado ineficazes, ou por serem

praticamente inaplicáveis em larga escala, ou porque durante o processo ocorre a

lise das células, aumentando a liberação de toxinas para a água o que, muitas

vezes, agrava o problema.

Introdução ___________________________________________________________________

6

1.2- A fisiologia da fase estacionária:

1.2.1- Introdução:

As bactérias são os organismos mais abundantes da superfície terrestre,

podendo ser encontradas praticamente em qualquer tipo de ambiente. Em seus

habitats naturais elas se encontram, na maior parte do tempo, em um estado

fisiológico caracterizado por ausência de multiplicação (Kolter et al., 1993 e Huisman

et al., 1996) principalmente devido à baixa disponibilidade de nutrientes. Estudos

sobre a multiplicação celular bacteriana em laboratório mostram que a limitação de

um ou mais nutrientes durante o cultivo leva a uma progressiva parada na

multiplicação das células até a entrada para a fase estacionária (Kolter, 1993).

Vários estudos demonstram que populações de bactérias na fase estacionária

não só simplesmente param de se multiplicar, durante esta fase são iniciados

elaborados programas do desenvolvimento celular que estão intimamente

associados aos mecanismos de sobrevivência destes microorganismos no ambiente

- ciclos de vida (para citar alguns exemplos: Shapiro et al., 2000; Kjelleberg et al.,

1993; Lange et al., 1991). O exemplo mais claro deste tipo de adaptação é quando

bactérias formam esporos.

Os esporos bacterianos são células metabolicamente inativas que

apresentam alta resistência a estresses ambientais (como dissecação, frio e calor) e

deste modo, são capazes de persistir no ambiente por longos períodos de tempo

(Atrih & Foster, 1999). As bactérias que formam esporos são Gram-positivas e

geralmente pertencem aos gêneros Bacilli, Clostridia e Azospirilli. O processo de

esporulação nestas bactérias está relacionado com a resposta à privação de

nutrientes e ocorre durante a entrada para a fase estacionária.

Introdução ___________________________________________________________________

7

O processo de esporulação mais estudado é o que ocorre na bactéria

Baccillus subtilis. A entrada para a fase estacionária nesta bactéria leva à ativação

de um programa genético que culmina na formação de um endosporo (Shapiro et al.,

2000) que após sucessivos estágios de amadurecimento é liberado, com a lise da

célula-mãe, para o ambiente. Este esporo permanece viável, pois assim que as

condições favoráveis são re-estabelecidas ele é capaz de germinar dando origem a

uma nova população de células.

Para bactérias que não produzem esporos, as estratégias desenvolvidas para

resistir ao período de falta de nutrientes não são tão claras. A adaptação à exaustão

de nutrientes em bactérias Gram-negativas envolve uma série de eventos

intracelulares altamente organizados que capacitam as células à sobrevivência ao

período de privação de nutrientes (Kjelleberg et al., 1993).

Em E. coli, a entrada para a fase estacionária é acompanhada por mudanças

na morfologia das células; estas se apresentam menores e mais esféricas (Lange et

al., 1991). Essas mudanças na morfologia são acompanhadas por uma alteração

nos compartimentos sub-celulares, o citoplasma se apresenta mais condensado e o

volume periplasmático maior (Reeve et al., 1984). A redução do tamanho celular em

resposta à entrada para fase estacionária parece ser uma estratégia de

sobrevivência bastante comum em bactérias marinhas como Vibrio, Pseudomonas,

Aeromonas, Alcaligenes spp. (para uma revisão detalhada ver Kjelleberg et al.,

1987) e bactérias do solo como Rhizobium leguminosarium. Esta redução no

tamanho celular ocorre de maneira geral como resultado de sucessivas divisões

celulares sem que ocorra um aumento na massa celular (Ingramham et al., 1983 e

Williams & Thorne, 1997).

Introdução ___________________________________________________________________

8

Estudos mais recentes demonstram que durante a privação de nutrientes o

material genético de E. coli também passa por modificações estruturais. Foi visto

que a cromatina sofre uma transição reversível que permitem a proteção de seu

DNA: ela se apresenta altamente condensada e ordenada. Essa modificação parece

ser ditada por propriedades intrínsecas da molécula de DNA e parece ser um

mecanismo comum entre bactérias Gram-negativas (Frenkiel-Krispin et al., 2004 e

Minsky et al., 2002).

Os estudos demonstram também que as células bacterianas na fase

estacionária apresentam no geral um decréscimo na síntese de RNA, DNA e

proteínas (Schultz et al., 1988 e Williams & Thorne, 1997) e adquirem resistência a

vários tipos de estresses, tais como: agentes oxidativos, altas temperaturas,

radiação ultravioleta, resistência a ácidos, etc (Foster et al., 1995; Kjelleberg et al.,

1993).

Bactérias Gram-positivas que não esporulam também sofrem mudanças na

fisiologia das células. Em Micrococcus luteus foi mostrado que, quando esta bactéria

é submetida a prolongados períodos de ausência de nutrientes, ela se mantém num

estado de dormência; as células neste estado foram incapazes de formar colônias

em placas contendo meio sólido apropriado (Kaprelyants & Kell, 1993) e somente

foram ‘ressuscitadas’ quando condições especiais de cultivo foram aplicadas

(Mukamolova et al., 1998).

A resposta de Staphylococccus aureus à limitação de glicose ou à limitação

de vários de nutrientes resulta numa estratégia um pouco diferente. Inicialmente

ocorre a perda de viabilidade de 99 a 99,9 % da população. As células que

sobrevivem ao período de privação de nutrientes permanecem viáveis por muito

tempo e adquirem um maior potencial de sobrevivência. As células que sobrevivem

Introdução ___________________________________________________________________

9

também apresentam uma diminuição do tamanho e um aumento na resistência a

estresses oxidativos e a ácidos; adaptações que se assemelham às descritas para

bactérias Gram-negativas (Watson et al., 1998).

1.2.2- Em cianobactérias:

Em cianobactérias adaptações a condições de escassez de nutrientes

também ocorrem. A transcrição de um grande número de genes é influenciada por

mudanças ambientais (Tandeu de Marsac & Houmand, 1993) e em resposta a essas

mudanças, alguns gêneros de cianobactérias filamentosas, pertencentes à ordem

Nostocales (subseção IV) e à ordem Stigonematales (subseção V), são capazes de

produzir células altamente especializadas: os acinetos e heterocitos.

Os acinetos são células especializadas que funcionalmente se assemelham

aos esporos bacterianos. Eles se originam a partir da diferenciação de uma célula

vegetativa do filamento, e são observados com maior freqüência em culturas

estacionárias. Os acinetos são resistentes ao frio e à dissecação, mas não ao calor

(Nichols & Adams, 1982; Adams, 1992). Os acinetos apresentam um grande

espessamento da parede celular (Herdman, 1987,1988) e podem apresentar um

volume celular até dez vezes maior ao de uma célula vegetativa (Fay, 1969). No

citoplasma é observado um grande acúmulo de grânulos de cianoficina e glicogênio

(Simon, 1987). Também são consideradas células dormentes por apresentarem

atividade metabólica muito baixa ou indetectável (Raí et al., 1985; Sarma & Ghai,

1998). Assim como os esporos de bactérias, os acinetos são capazes de germinar

quando as condições de crescimento são re-estabelecidas (Nichols & Adams, 1982;

Herdman, 1987).

Os heterocitos são células especializadas que são responsáveis pelo

processo de fixação de nitrogênio. Eles se originam a partir da diferenciação de

Introdução ___________________________________________________________________

10

algumas células vegetativas dentro do filamento sempre em resposta a escassez de

nitrogênio (Adams & Duggan, 1999). As enzimas responsáveis pela fixação do

nitrogênio (as nitrogenases) são extremamente sensíveis à presença de oxigênio.

Deste modo, ao longo do processo de diferenciação em heterocitos, as células

vegetativas sofrem uma série de modificações estruturais que permitem criar, no seu

interior, um ambiente livre de oxigênio (Wolk et al., 1998).

Para cianobactérias que não possuem a capacidade de produzir acinetos e

heterocitos, outros tipos de estratégias parecem ter sido desenvolvidas na tentativa

de se adaptar ao período de privação de nutrientes.

Cianobactérias incapazes de produzir acinetos e heterocitos podem

responder à privação de seus nutrientes essenciais (p. ex. nitrogênio, fósforo e

enxofre) pela degradação reversível de seus pigmentos fotossintéticos, num

processo conhecido como clorose (Allen & Smith, 1969 e Lau et al., 1977). O

fenômeno de clorose é observado tanto em gêneros de cianobactérias filamentosas

quanto unicelulares (Allen & Smith, 1969).

Em 1998, Görl e colaboradores iniciaram estudos sobre os efeitos da privação

de nitrogênio em culturas do gênero unicelular Synechococcus PCC 7942. Eles

observaram que após a transferência da cultura para um meio de cultivo sem

nitrogênio (em condições padronizadas), o processo de clorose apresenta três fases

distintas: Uma fase inicial marcada por um rápido declínio no conteúdo das

ficobiliproteínas e quase nenhuma alteração no conteúdo de clorofila a; uma fase

intermediária onde é observada uma gradativa redução nos níveis de clorofila a; e

uma fase final, onde os níveis dos pigmentos fotossintéticos chegam a valores

indetectáveis e as células se tornam completamente apigmentadas (cloróticas). Esta

acentuada queda nos níveis dos pigmentos fotossintéticos, observada nesta fase

Introdução ___________________________________________________________________

11

final, poderia ser interpretada como irreversível perda de viabilidade (Tandeu de

Marsac & Houmard, 1993). Porém, os experimentos de regeneração mostraram, que

as células cloróticas mantiveram sua viabilidade, ou seja, poucos dias após re-

inoculadas em meio de cultura contendo nitrato, os pigmentos fotossintéticos foram

re-sintetizados e o crescimento da cultura foi novamente observado (Görl et al.,

1998). A diferenciação em células cloróticas, em resposta à privação de nitrogênio,

mostra características de um estado de dormência. Em 2001, Saüer e colaboradores

investigaram os mecanismos de manutenção de viabilidade nas células cloróticas de

Synechococcus PCC 7942. Eles observaram que durante o processo de aclimatação

à falta de nitrogênio as células apresentam uma drástica redução no conteúdo de

proteínas solúveis. Experimentos sobre a síntese protéica (através da incorporação

de aminoácidos radioativos) mostraram que as células cloróticas mantêm um nível

basal de expressão gênica e que a homeostase energética, nas células cloróticas,

foi mantida por uma pequena fração da atividade fotossintética de células em fase

de crescimento.

Estes estudos demonstram claramente que o fenômeno de clorose nesta

cepa faz parte de um processo de aclimatação no qual as células vegetativas, em

resposta a falta de nitrogênio, se diferenciam em células não pigmentadas

(cloróticas) que apresentam características de um estado de dormência. Este

mecanismo possibilita a sobrevivência a prolongados períodos de privação de

nutrientes, uma vez que mutantes que não reagem desta maneira perdem

rapidamente a viabilidade (Görl et al., 1998).

No meio ambiente também podem ser observadas células de cianobactérias

com características de um estado de dormência. Em países onde as estações do

ano são bem definidas, o surgimento de florações de Microcystis parece obedecer a

Introdução ___________________________________________________________________

12

um ciclo anual. O aparecimento das células na coluna d’água é observado no final

da primavera e é seguido por sucessivas florações durante todo o verão. Durante o

outono e o inverno raramente são observadas células na coluna d’água (Brunberg &

Boström, 1992). Os estudos iniciais demonstram que durante o inverno as células

persistem nos sedimentos (forma bentônica) dos lagos. Esta forma bentônica parece

ser de grande importância ecológica, pois estas células permanecem viáveis e

servem como inóculo para o recomeço de seu ciclo anual (Brunberg et al., 2003;

Fallon & Brock, 1981; Reynolds et al., 1981 e Preston et al., 1980).

Em 2004, Latour e colaboradores publicaram estudos sobre a caracterização

metabólica da população de células bentônicas de Microcystis. Neste estudo, a

atividade metabólica das células, medida através de atividade enzimática, foi

monitorada ao longo do ano. Foi observado que durante o inverno, quando as

temperaturas são menores, as células bentônicas apresentam um nível residual de

atividade enzimática, permanecendo viáveis. Na primavera, o aumento da

temperatura leva a reativação das células e novamente o ciclo é recomeçado.

Estudos mais detalhados sobre os mecanismos envolvidos na manutenção da

viabilidade em Microcystis durante o período de baixa atividade metabólica ainda

não foram realizados.

1.3- A comunicação intercelular em microorganismos:

1.3.1- Introdução:

A comunicação intercelular é utilizada por muitos tipos de microorganismos

para regular a expressão de genes da população e o seu desenvolvimento. Uma das

formas de sinalização intercelular mais bem estudadas envolve uma resposta

regulatória a sinais relacionados com a densidade celular. Este processo, às vezes

Introdução ___________________________________________________________________

13

chamado de ‘quorum sensing’ (Fuqua et al., 1994), é caracterizado tipicamente por

eventos de regulação metabólica que são induzidos em células crescendo em altas

densidades. Em bactérias gram-negativas a comunicação intercelular

freqüentemente envolve a utilização de pequenas moléculas sinais chamadas de N-

acil homoserina lactonas – as AHLs (Fuqua et al., 1996). Em bactérias gram-

positivas o processo de ‘quorum sensing’ utiliza peptídeos ou peptídeos

processados como moléculas sinalizadoras (Miller & Bassler, 2001).

O primeiro modelo de ´quorum sensing´ caracterizado foi o da bactéria

luminescente gram-negativa Photobacterium fischeri (mais conhecida como Vibrio

fischeri). Esta bactéria habita ambientes marinhos, e quando se encontra livre na

água do mar, sua densidade populacional geralmente é menor do que 100 céls/mL

(Ruby & Nealson, 1978; Ruby et al., 1980; Baumann & Baumann, 1981), e suas

células não emitem luz. Porém, em simbiose com alguns peixes e lulas de águas

profundas, essa bactéria atinge concentrações de 1010 - 1011 céls/ml (Dunlap &

Greenberg, 1991; Ruby, 1996), e nessa concentração emite luminescência. Esse

fato levou os pesquisadores a investigar o mecanismo que a bactéria utiliza para

monitorar a expressão dos genes relacionados com a produção de luz.

Hoje se sabe que o sistema utilizado por P. fischeri é composto de: uma AHL,

purificada e identificada como 3-oxo-hexanoil-L-homoserina lactona (3-oxo-C6 HSL)

(Eberhard, 1981) e de genes lux que estão organizados em duas unidades

transcricionais: luxR e luxICDABEG. O gene luxR codifica um regulador

transcricional que, quando ligado à AHL, interage com a RNA polimerase,

aumentando sua afinidade pela região promotora do operon luxICDABEG (o operon

lux propriamente dito) (Engebrecht & Silverman, 1984) O operon lux codifica

diferentes proteínas, inclusive enzimas e proteínas responsáveis pela produção de

Introdução ___________________________________________________________________

14

luz. O primeiro gene do operon lux (luxI) merece destaque pois ele codifica uma

enzima chamada de acil-AHL sintase, que é responsável pela síntese de AHLs,

amplificando o sinal uma vez iniciado o processo. Deste modo os genes luxR e o

luxI, juntamente com as moléculas de AHLs, são responsáveis pela regulação da

expressão da bioluminescência dependentes de altas concentrações celulares (Ver

Fig. 2).

O sistema ‘quorum sensing’ descrito acima é descrito, hoje, em mais de 70

espécies de bactérias gram-negativas e regula a expressão de diversos fenótipos

(Miller et al., 2001; de Kievit & Iglewski, 2000; Fuqua et al., 2001; Parsek e

Greenberg, 2000). Esses sistemas têm em comum a enzima acil-AHL sintase,

homóloga a LuxL, bem como um regulador transcricional, homólogo ao LuxR.

Alguns exemplos de sistemas homólogos ao utilizado por P. fischeri são: TraR e

TraL de Agrobacterium tumefaciens que regulam a transferência por conjugação do

plasmídeo Ti (Tumor inducing) (Zhang et al, 1993); LasR e LasL de Pseudomonas

aeruginosa, que regulam a transcrição de uma série de fatores de virulência,

incluindo a elastase (Passador et al, 1993); e ExpR e ExpL de Erwinia carotovora,

que controlam a síntese de antibióticos e a produção de exoenzimas (Beck von

Bodman & Farrand, 1995).

Introdução ___________________________________________________________________

15

As bactérias que utilizam um sistema homólogo ao LuxR/LuxL também

produzem autoindutores similares ou idênticos a 3-oxo-C6 HSL produzido por P.

fischeri. Exemplos de outros tipos de autoindutores descobertos subseqüentemente

incluem o de V. harveyi N-(3-hidroxibutanoil)-L-homoserina lactona (3-hidroxi-C4-

HSL), o autoindutor de A. tumefaciens N-(3-oxooctanoil)-L-homoserina lactona (3-

oxo-C8-HSL) e o autoindutor de P. aeruginosa, N-(3-oxododecanoil)-L-homoserina-

lactona (3-oxo-C12-HSL). Essas moléculas variam quanto ao comprimento da

Fig. 2 – Mecanismo de ‘quorum sensing’ em P. fischeri.: A baixa densidade

populacional, a transcrição do operon lux ocorre a níveis basais e não há

acúmulo significante do autoindutor. Quando a densidade de células

aumenta, há um acúmulo desse autoindutor que interage com o regulador

transcricional, permitindo a transcrição dos genes responsáveis pela

bioluminescência. Repare que a transcrição do gene luxL leva a uma

amplificação do sinal, uma vez iniciado o processo.

Alta densidade celular

Baixa densidade celular

Adaptado de www.nottingham.ac.uk/quorum

luz

Alta densidade celular

Baixa densidade celular

Adaptado de www.nottingham.ac.uk/quorum

Alta densidade celular

Baixa densidade celular

Alta densidade celular

Baixa densidade celular

Adaptado de www.nottingham.ac.uk/quorum

luz

Introdução ___________________________________________________________________

16

cadeia acil, quanto ao grau de oxidação no C3 e quanto à presença ou ausência de

insaturações (Fig. 3a).

1.3.2- Outras classes de sinais extracelulares presentes em culturas

estacionárias de microorganismos:

A comunicação intercelular por sinais químicos para coordenar eventos

intracelulares de uma população é hoje bem documentado em eubactérias.

Micromoléculas envolvidas no processo de ‘quorum sensing’ (AHLs, peptídeos ou

peptídeos processados) são os exemplos melhor caracterizados deste tipo de

estratégia. Porém, outros tipos de metabólitos extracelulares estão freqüentemente

sendo descobertas.

Um exemplo bem estudado deste tipo de estratégia é a produção de alquil-

hidroxibenzenos (AHBs). AHBs são compostos anfifílicos de baixo peso molecular

produzidos por culturas de Azotobacter vinelandii (Reusch & Sadoff, 1979), A.

chroococcun (Batvakov et al., 1982), Pseudomonas carboxydoflava (Osipov et al.,

1985), Bacillus cereus (Gryaznova et al., 1985), Micrococcus luteus (Mulzukin et al.,

1996) e pela levedura Sacharomyces cerevisiae (Batrakov et al., 1993). Eles foram

encontrados em culturas estacionárias desses microorganismos como misturas de

isômeros com diferenças na posição e tamanho da cadeia do substituinte alquil do

anel aromático (Fig. 3b).

AHBs são autoreguladores naturais da multiplicação celular, pois ao

acumularem no meio de cultivo ao longo do crescimento induzem a cultura à entrada

para a fase estacionária. Estas moléculas, em altas concentrações, também são

responsáveis pela formação de ‘resting cells’ – células caracterizadas por um alto

grau de refratividade (quando observadas ao microscópio óptico) e profundo estado

Introdução ___________________________________________________________________

17

de dormência (células anabióticas ou hipometabólicas) (Svetlichnyi et al., 1986).

Estudos da atividade de AHBs sobre o metabolismo das células revelam que estas

moléculas atuam como modificadores naturais de estruturas enzimáticas, formando

complexos enzimáticos termo-estáveis que possuem baixa atividade catalítica, e

contribuem para bloqueio do processo metabólico nas células anabióticas (Bespalov

et al., 2000 e Kolpakov et al., 2000).

Estudos ‘in vitro’ mostram que estas moléculas parecem possuir um

mecanismo de ação bem simples. Foi demonstrado que AHBs formam interações

não covalentes (pontes de hidrogênio, interações hidrofóbicas e iônicas) com

moléculas biológicas (proteínas, lipídeos de membrana, DNA e RNA) atuando como

chaperonas químicas (Martirosova et al., 2004). Estudos sobre a influência de

moléculas do tipo AHBs sobre a expressão gênica ainda não foram realizados.

Outro exemplo deste tipo de comunicação é o que ocorre nas bactérias do

gênero Streptomyces. Foi mostrado que este gênero produz uma classe de

moléculas auto-reguladoras denominadas de γ-butirolactonas (Fig. 3e). Estas

moléculas participam diretamente na regulação do metabolismo secundário das

células atuando principalmente no controle da produção de antibióticos (Yamada,

1999 e Shikura et al., 2002).

Outros exemplos de fatores extracelulares produzidos por culturas

estacionárias são encontrados; fatores de sinalização produzidos por Stigmatella

são necessários para o desenvolvimento de estruturas de reprodução em condições

onde os nutrientes são limitados (Fig. 3c) (Plaga & Schairer, 1999). Quando as

condições voltam a ser favoráveis, os esporos formados nestas estruturas germinam

formando uma nova população. Em culturas de Vibrio sp. submetidas a regimes de

falta de nutrientes foi encontrado um composto que, quando adicionado a uma

Introdução ___________________________________________________________________

18

cultura rica em nutrientes, induz a síntese de proteínas encontradas apenas em

culturas cujos nutrientes estavam esgotados (Srirnivasan et al., 1998).

Em cianobactérias, também é relatada a existência de fatores extracelulares

produzidos em resposta a condições desfavoráveis.

Da década de 70 existem relatos sobre o papel de sinais extracelulares

envolvidos na indução de acinetos. Foi demonstrado que a cianobactéria

Cylindrospermum lincheniforme Kütz produz um composto capaz de estimular a

formação de acinetos em culturas jovens da mesma cianobactéria (Fisher & Wolk,

1976; Hirosawa & Wolk, 1979 a). A fórmula molecular deste composto foi identificada

como sendo C7H5OSN e sua suposta estrutura química determinada (Fig. 3d)

(Hirosawa & Wolk, 1979 b).

A formação de heterocitos também parece ser regulada por moléculas

sinalizadoras. Nos filamentos da cianobactéria Anabaena sp. cada heterocito é

separado por aproximadamente dez células vegetativas. Este padrão de ocorrência

de heterocitos dentro do filamento é regulado por um peptídeo PatS (Yoon &

Golden, 1998). O mecanismo molecular proposto sugere que durante as primeiras

horas após a privação de nitrogênio, algumas células do filamento aumentam a

produção do peptídeo PatS. Este peptídeo então, se difunde através do filamento,

inibindo a formação de heterocitos nas células adjacentes. As células produtoras do

PatS são imunes a ação inibitória do próprio peptídeo e portanto, completam sua

diferenciação em heterocitos. Deste modo, a ação deste peptídeo também ocorre

através de mecanismos de sinalização intercelular (neste caso interfilamentar).

Em 1998, Bachofen e Schunk demonstraram, através de bioensaios de

detecção, a presença de AHLs no sobrenadante obtido de uma amostra natural de

uma floração de cianobactéria onde o gênero dominante era Microcystis. Porém,

Introdução ___________________________________________________________________

19

este estudo não foi conclusivo, pois por se tratar de uma amostra natural, outros

microorganismos poderiam estar produzindo a molécula de AHL detectada no

bioensaio. Em um trabalho anterior (Meireles, 2002) foi investigada a produção de

moléculas de AHLs em duas cepas axênicas de Microcystis. Através de bioensaios

de detecção foi mostrado que Microcystis, nas condições testadas, não foi capaz de

produzir as AHLs descritas pela literatura.

Este trabalho investiga formas de auto-regulação do metabolismo de

cianobactérias tóxicas. O gênero escolhido inicialmente para os estudos foi

Microcystis. Este gênero tem sido responsável pelo maior número de relatos de

intoxicações em animais e humanos (Carmichael, 1996). Microcystis é uma

cianobactéria não diazotrófica que é freqüentemente encontrada como gênero

dominante numa floração. É um gênero cosmopolita, sendo encontrada em

ambientes de água doce a salobra.

Introdução ___________________________________________________________________

20

Fig. 3 – Alguns exemplos de moléculas envolvidas no processo de

comunicação intercelular em microorganismos; a. Moléculas do tipo N-

acil homoserina lactonas, envolvidas no processo de comunicação

intercelular em bactérias Gram-negativas; b. Análogos químicos de alquil-

hidroxibenzenos (AHBs); c. Composto que coordena a formação de corpos

de frutificação em Stigmatella aurantiaca; d. Estrutura aproximada do fator

envolvido na estimulação da produção de acinetos em Cylindrospermum

licheniforme Kütz; e. Dois tipos de autoreguladores (γ-butirolactonas).

Ambos estão envolvidos na regulação da produção de antibióticos em

espécies de Streptomyces sp..

Objetivos ___________________________________________________________________

21

2- Objetivos:

2.1- Objetivo geral:

� Este trabalho visou verificar a existência de mecanismos de auto-regulação

da multiplicação celular em culturas de Microcystis PCC 7806.

2.2- Objetivos específicos:

� Cultivar Microcystis PCC 7806 em meio 2 ASM-1, por longos períodos de

tempo, buscando caracterizar bioquimicamente e fisiologicamente células em

diferentes estágios de cultivo.

� Testar a atividade do sobrenadante, obtido em diferentes tempos de

crescimento da cepa Microcystis PCC 7806, sobre a capacidade de inibir o

crescimento de culturas do próprio microorganismo crescidas em meio repleto

de nutrientes.

� Detectada a presença de atividade inibitória no meio condicionado, buscou-se

também investigar o mecanismo de inibição do crescimento.

Material e Métodos ___________________________________________________________________

22

3- Material e Métodos:

3.1 - Cepas de cianobactérias e condições de cultivo:

O gênero escolhido para os estudos foi Microcystis. Este gênero tem sido

responsável pelo maior número de relatos de intoxicações em animais e humanos

(Carmichael, 1996).

Todos os experimentos foram realizados utilizando a cepa Microcystis

aeruginosa PCC 7806 (Pasteur Culture Collection, Instituto Pasteur, Paris, França).

Outras cepas utilizadas neste estudo foram:

- Microcystis UENF Mic1, isolada da Lagoa de Jacarepaguá - Rio de Janeiro -

RJ;

- Microcystis UENF Mic2, isolada da Lagoa de Iquipari – São João da Barra –

RJ;

- Synechococcus PCC 7942;

- Synechocystis PCC 6803;

Todas as cepas foram mantidas em meio de cultura com o dobro da

concentração do ASM-1 (Gorhan et al., 1964), daqui a diante chamado de 2 ASM-1,

em câmara de cultivo com temperatura mantida a 25 ± 3 ºC sob lâmpadas

fluorescentes (lâmpadas frias PHILIPS TLT 20 W/75 S) com fotoperíodo de 16 h.

Material e Métodos ___________________________________________________________________

23

3.2 - Caracterização de culturas de Microcystis PCC 7806 de

diferentes idades:

3.2.1- Crescimento e perfil de pigmentos:

Microcystis foi inoculada em Erlenmeyers de 1 L contendo 200 mL de meio 2

ASM-1 com DO750 inicial de 0,2. A cultura foi incubada em agitador rotatório (Nova

Ética modelo 109 B) com velocidade variando entre 90 e 100 rpm e mantida em

câmara de cultivo com densidade de fluxo de fótons variando entre 30-45 µmol

fótons m-2 s-1. O crescimento da cultura foi monitorado periodicamente em função da

densidade óptica a 750 nm por 35 dias (espectrofotômetro Shimadzu UV/V-1203).

Mudanças ocorridas no perfil de pigmentos fotossintéticos ao longo do

crescimento da cultura de Microcystis foram monitorados através do espectro de

absorção da suspensão de células. A absorbância foi medida entre 600 e 800 nm.

Os espectros foram obtidos de culturas coletadas em diversos estágios de

cultivo. Antes de cada medição a DO760 de cada suspensão de células era ajustada

com água para 0,22 ± 0,01.

Este experimento foi repetido três vezes em culturas independentes.

3.2.2- Estimativa do conteúdo de glicogênio – método enzimático:

O conteúdo de glicogênio foi determinado indiretamente após hidrólise ácida e

liberação dos monômeros de D-glicose utilizando o método enzimático/colorimétrico

(glicose oxidase) do Kit Bioliquid (Biodiagnóstica).

As culturas de Microcystis foram cultivadas conforme descrito no item 3.2.1 e

as células coletadas em dois momentos do cultivo: durante a fase de crescimento da

Material e Métodos ___________________________________________________________________

24

cultura (8 dias de cultivo) e quando as culturas já se encontravam na fase

estacionária (40 dias de cultivo).

3.2.2.1- Hidrólise ácida:

Cerca de 108 células foram ressuspensas em tubos de ensaio contendo 500

µL de solução de H2SO4 a 2,5%. Em seguida, os tubos foram deixados em banho

maria (100 ºC) por 80 min sendo homogeneizados a cada 10 min. Após o término da

hidrólise, os tubos foram centrifugados a 10000 x g por 5 min a temperatura

ambiente. O sobrenadante foi coletado e reservado.

3.2.2.2- Quantificação de glicose:

A detecção de D-glicose ocorre segundo a reação na qual a glicose, através

da ação da enzima glicose oxidase (GOD), é oxidada gerando ácido glicônico e

peróxido de hidrogênio (H2O2). O peróxido de hidrogênio pela ação de uma

peroxidase (POD) reage com corantes apropriados (hidroxibenzoato e 4-

aminofenazona) formando um complexo corado. A absorbância da solução onde o

complexo vermelho é formado apresenta absorbância proporcional a concentração

de glicose na amostra analisada, medida a 500 nm.

GOD*

D-glicose + H20 + O2 ���� Ac. Glicônico + 2 H2O2

POD**

2 H2O2 + Hidroxibenzoato + 4-aminofenazona ���� Complexo corado.

* GOD = Glicose oxidase;

** POD = Peroxidase.

Material e Métodos ___________________________________________________________________

25

A curva de calibração foi obtida a partir de diluições de uma solução padrão

contendo 5 mg/mL de D-glicose em H2SO4 a 2,5%. As reações foram montadas

conforme descrito a seguir: em tubos de ensaio foram misturados 10 µL de cada

diluição da solução padrão com 990 µL do reagente enzimático contendo glicose

oxidase (10.000 U/L), peroxidase (500 U/L), 4-aminofenazona (0,2 mmol/L) e

hidroxibenzoato (5 mmol/L). A concentração final de glicose em cada diluição foi de

0, 2,5, 5, 7,5, 10, 12,5 µg de glicose por mL de reação. Em seguida os tubos foram

deixados em banho-maria a 37 ºC por 10 min.

Após o término da reação as amostras foram medidas a 500 nm. Os valores

de absorbância x concentração de glicose foram plotados em um gráfico. A

correlação entre concentração de glicose e ABS500 foi de 0,996 (y = 0,0261x +

0,0066).

3.2.2.3 -Quantificação das amostras:

A curva de calibração foi obtida simultaneamente com a incubação das

amostras. A reação foi montada conforme descrito para obtenção da curva padrão.

As amostras foram diluídas para que ficassem no intervalo de concentração onde as

relações absorbância x concentração fossem lineares. Todos os ensaios foram

realizados em triplicata.

Este experimento foi repetido duas vezes em culturas independentes.

3.2.3 - Estimativa do conteúdo de proteínas solúveis:

O conteúdo de proteínas solúveis, determinado pelo método descrito por

Bradford (1976), se baseia na colorimetria para quantificar proteínas solúveis. O

Material e Métodos ___________________________________________________________________

26

reagente principal é um corante que interage com resíduos de aminoácidos básicos

e aromáticos produzindo cor. Esta coloração é detectada por espectrofotometria e é

lida a 595 nm.

Para este experimento foram coletadas culturas de Microcystis, cultivadas

conforme descrito no item 3.2.1, coletadas em dois momentos: durante a fase de

crescimento (8 dias de cultivo) e quando as culturas já se encontravam na fase

estacionária (40 dias de cultivo).

3.2.3.1 - Extração de proteínas solúveis:

Cerca de 108 células foram ressuspensas em tampão 20 mM Tris-HCl pH 7,4,

contendo 0,5 mM de CaCl2 e 0,5 mM de MgCl2. A extração de proteínas solúveis foi

realizada após sonicar células em banho de gelo, utilizando processador ultra-sônico

na potência máxima, num tempo total de 7,5 min (15 ciclos de 1 min: 30 s sonicando

e 30 s resfriando a amostra). A lise total das células foi verificada por observações

ao microscópio óptico. Os restos celulares foram removidos por centrifugação

(18000 x g por 40 min a 4 ºC). O sobrenadante foi coletado e preservado sob

refrigeração até a quantificação.

3.2.3.2 - Obtenção da curva de calibração:

A curva de calibração foi obtida a partir de diluições de uma solução padrão

contendo 0,1 mg/mL de ASB (albumina sérica bovina). As diluições do ASB foram

feitas em H2O ultrapura e ajustadas para um volume final de 200 µL As reações

foram montadas conforme descrito a seguir: em tubos para microcentrífuga novos de

1,5 mL foram misturados 800 µL de cada diluição da solução padrão com 200 µL do

reagente de Bradford. A concentração final de ASB, após a mistura, em cada tubo

Material e Métodos ___________________________________________________________________

27

foi de 0, 2, 4, 6, 8 e 10 µg de ASB por mL de reação. Após homogeneizar

vigorosamente os tubos foram lidos a 595 nm.

Os valores de absorbância x concentração de ASB foram plotados em um

gráfico. A correlação entre concentração de ASB e ABS595 foi de 0,986 (y = 0,0383x

+ 0,0395).

3.2.3.3 - Quantificação das amostras:

A curva de calibração foi obtida simultaneamente com o preparo das

amostras (extração). As amostras foram diluídas para que ficassem no intervalo de

concentração em que as relações absorbância x concentração de ASB fossem

lineares. A reação foi preparada misturando-se 800 µL da amostra diluída com 200

µL do reagente de Bradford. Todos os ensaios foram realizados em triplicata.

Este experimento foi repetido duas vezes em 6 culturas independentes (três

cloróticas e três verdes)

3.2.4- Perfil metabólico - Ressonância Magnética Nuclear (RMN):

As culturas de Microcystis foram cultivadas conforme descrito no item 3.2.1 e

as células coletadas em dois momentos do cultivo: durante a fase de crescimento da

cultura (8 dias de cultivo) e quando as culturas já se encontravam na fase

estacionária (40 dias de cultivo).

As células foram separadas do meio de cultura por centrifugação (Beckman

Coulter Allegra 6R), liofilizadas (Labconco freeze-dry system/freezone 4.5) e

mantidas no freezer até a extração.

Este experimento foi repetido duas vezes em culturas independentes.

Material e Métodos ___________________________________________________________________

28

3.2.4.1- Procedimento de extração:

Três extratos foram obtidos por extrações sucessivas do mesmo material

utilizando solventes de polaridade decrescente: água, metanol e clorofórmio. O

procedimento de extração foi o mesmo para os dois tipos de células.

A 500 mg de biomassa liofilizada, condicionada em tubo de vidro para

centrífuga, foram adicionados 10 mL de solvente. O tubo foi agitado vigorosamente

em vortex por 1 min e em seguida centrifugado a 3000 x g por 30 min. O

sobrenadante foi reservado. Este procedimento foi repetido 3 vezes para cada

solvente. Ao final de cada ciclo de extração (cerca de 30 mL para cada solvente) os

extratos foram coletados e armazenados a -20 ºC. Os extratos, metanólico e

clorofórmico, foram secos à pressão negativa em evaporador rotativo (Fisotom

Modelo 802) e o extrato aquoso foi liofilizado.

3.2.4.2- Análise dos extratos:

Os extratos foram ressuspensas nos respectivos solventes deuterados (D2O,

MeOD e CDCL3) e em seguida foram centrifugados e analisados por Ressonância

Magnética Nuclear (RMN) operando a 400 MHz para análise de prótons (RMN JOEL

Eclipse +400 MHz).

3.2.5- Ultra-estrutura – microscopia eletrônica:

Para esta análise foram coletadas alíquotas de culturas de Microcystis com 8

e 41 dias de cultivo. As células foram separadas do meio de cultura por

centrifugação e, em seguida, lavadas em meio ASM-1 e pré-fixadas em uma mistura

9:1 de tampão cacodilato 0.1 M e glutaraldeído 2.5%. As amostras pré-fixadas foram

mantidas a 4 ºC até o processamento.

Material e Métodos ___________________________________________________________________

29

Durante o processamento as amostras foram lavadas três vezes com PBS pH

7,2 e pós-fixadas por 20 min, no escuro, em uma solução de tetróxido de ósmio 1 %

(em solução de cloreto de cálcio 5 mM) e ferrocianeto de potássio 0,8 %. Em

seguida, as amostras foram lavadas três vezes em PBS pH 7,2 e desidratadas em

gradiente crescente de acetona 30%, 50%, 70%, 90% e duas vezes em acetona

super seca (100%). Depois de desidratadas as amostras foram infiltradas em

diluições crescentes de acetona:epon (3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 0:1) e incluídas em resina

epon (Poly-BED 812). Cortes ultrafinos com espessura de 70 nm foram obtidos em

ultramicrótomo (Ultracut S Reichest) utilizando faca de diamante. Estes cortes foram

coletados em grade de cobre com malha de 400 µm. Os cortes foram examinados

ao microscópio eletrônico de transmissão (Zeiss EM 900) operando a 80 KV.

Este experimento foi repetido duas vezes a partir de culturas independentes.

3.2.6- Viabilidade das células cloróticas:

3.2.6.1- Capacidade de crescimento de cultivos cloróticos inoculados em 2 ASM-1:

Uma alíquota de 10 mL de uma cultura clorótica com 40 dias de cultivo foi

coletada e centrifugada. Após a centrifugação o sobrenadante foi descartado e as

células foram lavadas duas vezes em água destilada estéril (2 x 10 mL).

Após a lavagem das células, elas foram ressuspensas em 40 mL de meio 2

ASM-1. Em seguida essa suspensão foi diluída cerca de cinco vezes em meio 2

ASM-1 obtendo-se uma DO750 de 0,84. A suspensão foi distribuída em tubos de

ensaio (1,5 mL para cada tubo) que foram incubados em sala de cultivo nas mesmas

condições de iluminação e temperatura já descritas no item 3.1. Este experimento foi

repetido duas vezes em culturas independentes.

Material e Métodos ___________________________________________________________________

30

O perfil de pigmentos e o aumento da densidade celular foram monitorados

conforme descrito no item 3.2.1 acima.

3.2.6.2- Verificação da integridade de membrana de células cloróticas:

A viabilidade de culturas cloróticas foi investigada com uso do Kit de

viabilidade LIVE/DEAD BacLight (Molecular Probes). O Kit é composto por dois

corantes: iodeto de propídio e o Syto 9®. Estes corantes permitem verificar a

integridade da membrana célula. A visualização das células depois de coradas foi

realizada por microscopia de fluorescência (Zeiss Axiovert), utilizando filtros para

rodamina e fluoresceína.

Para este experimento foram utilizadas culturas cloróticas de Microcystis com

pelo menos 40 dias de idade. As células foram separadas do sobrenadante por

centrifugação e em seguida lavadas duas vezes em meio ASM-1 sem fosfato. Para

corar as células, elas foram novamente ressuspensas em meio ASM-1 sem fosfato e

logo após 1 mL da suspensão foi misturada a 3 µL da solução dos corantes

(proporção 1:1 das soluções de iodeto de propídio e Syto 9®). A suspensão de

células, após a mistura com os corantes, foi mantida no escuro por 15 min antes de

ser observada ao microscópio de fluorescência.

Este experimento foi repetido três vezes em culturas independentes.

3.3- Auto-regulação do crescimento:

3.3.1- Efeito do meio condicionado, obtido de culturas cloróticas, sobre o

crescimento de culturas da mesma cepa, mantidas em meio rico em

nutrientes:

Material e Métodos ___________________________________________________________________

31

Microcystis foi inoculada a uma DO750 de 0,1 em Erlenmeyers de 1 L

contendo 200 mL de meio 2 ASM-1. A cultura foi incubada em agitador rotatório (90-

100 rpm) mantido em câmara de cultivo, com intensidade de luz variando entre 30-

45 µmol fótons m-2 s-1. Após a cultura ter se tornado clorótica alíquotas foram

coletadas. As células foram separadas do sobrenadante (meio condicionado) por

centrifugação a 3000 x g por 20 min. A capacidade do meio condicionado em inibir o

crescimento de culturas saudáveis da mesma cepa foi verificada através do ensaio

descrito abaixo.

3.3.1.1- O ensaio de inibição:

A DO750 de uma cultura de Microcystis em fase de crescimento linear foi

ajustada para 0,3 com meio 2 ASM-1. Em seguida 500 µL desta cultura foram

distribuídas para tubos de ensaio. Em cada tubo contendo a cultura diluída foram

adicionados mais 500 µL de meio condicionado. Duas culturas controle foram

utilizadas neste experimento: em uma foram adicionados 500 µL de meio 2 ASM-1 e

na outra 500 µL de água ao invés do meio condicionado.

Os tubos foram incubados em sala de cultivo sem agitação nas mesmas

condições de luz e temperatura. Os resultados foram observados três a cinco dias

após o inicio do experimento. Todos os ensaios foram feitos em triplicata em

condições estéreis.

Este experimento foi repetido três vezes a partir de culturas cloróticas

independentes.

Material e Métodos ___________________________________________________________________

32

3.3.2- Investigação do mecanismo envolvido na inibição do crescimento:

3.3.2.1- Perfil de pigmentos e ultraestrutura de células tratadas com meio

condicionado:

A inibição do crescimento de culturas de Microcystis foi investigada através do

ensaio de inibição descrito no item 3.3.1.1. Após a confirmação da inibição do

crescimento, as células foram coletadas e os efeitos sobre o perfil de pigmentos e a

ultra-estrutura foram verificados conforme métodos já descritos nos itens 3.2.1 e

3.2.5, respectivamente.

3.3.2.2- Atividade do meio condicionado sobre culturas da mesma cepa de

diferentes idades:

Durante este experimento todas as culturas foram incubadas em agitador

rotatório (90-100 rpm) mantido em câmara de cultivo sob condições já descritas. O

crescimento das culturas foi monitorado em função da DO750.

No primeiro dia de experimento, uma cultura de Microcystis foi inoculada em

dois Erlenmeyers de 500 mL contendo 100 mL de meio 2 ASM-1 cada (DO750 inicial

de 0,2). O mesmo procedimento foi realizado no 3º, 7º, 11º e 14º dia do experimento.

Ao chegar no 18º dia de experimento, já com culturas em diferentes fases de

crescimento, a atividade do meio condicionado foi testada em cada cultura através

do ensaio de inibição descrito no item 3.3.1.1. O efeito do meio condicionado sobre o

crescimento e sobre o perfil de pigmentos destas culturas foi analisado conforme

procedimento já descrito. Todos os ensaios foram realizados em triplicata.

Material e Métodos ___________________________________________________________________

33

3.3.3- Especificidade da atividade do meio condicionado:

A atividade do meio condicionado, obtido de culturas cloróticas de Microcystis,

foi testada em outras cepas de cianobactérias através do ensaio inibição já descrito.

Foram testadas tanto cepas pertencentes ao mesmo gênero como Microcystis UENF

Mic1 e Microcystis UENF Mic2 (cepas independentes isoladas das Lagoas de

Jacarepaguá e Iquipari, RJ) quanto cepas pertencentes a outros gêneros:

Synechococcus PCC 7942 e Synechocystis PCC 6803. Todos os ensaios foram

realizados em triplicata.

Este experimento foi realizado três vezes a partir de culturas cloróticas

independentes.

3.4 - Extração e caracterização preliminar do fator responsável pela

atividade do meio condicionado sobre culturas saudáveis de

Microcystis PCC 7806:

3.4.1- Extração do meio condicionado:

Culturas de Microcystis foram cultivadas em Erlenmeyers de 1 L contendo

200 mL de meio 2 ASM-1 até se tornarem cloróticas. Periodicamente, alíquotas das

culturas cloróticas eram retiradas e sua atividade monitorada através da realização

dos ensaios de inibição. Uma vez detectada atividade no meio condicionado, o

restante das culturas era centrifugado para obtenção do restante do meio

condicionado.

O meio condicionado foi passado por uma coluna de fase reversa C18 (ODS

– octadodecilsilano) conforme procedimento descrito a seguir:

Material e Métodos ___________________________________________________________________

34

3.4.1.1- Empacotamento e ativação da coluna:

Cerca de 700 mg ODS foram empacotados em uma coluna (1 x 8 cm). Depois

de empacotada a fase estacionária foi ativada pela passagem de cinco volumes de

metanol (1 volume corresponde a altura da fase estacionária na coluna) seguidos de

cinco volumes de água.

3.4.1.2- Obtenção do extrato:

Após a ativação, cerca de 30 mL de meio condicionado foram passados

através da coluna. O líquido não retido foi coletado e liofilizado. O material retido na

coluna foi eluído com 5 volumes de metanol 100 % e seco em evaporador rotativo.

Os extratos, retido e o não retido, foram ressuspensos em cerca de 15 mL de

meio 2 ASM-1, ficando cerca de 2 vezes concentrado em relação ao meio original.

Após sonicar a suspensão para deixar os extratos em solução eles foram

esterilizados por filtração (0,22 µm, filtro lavado previamente com 10 mL de H2O

estéril). Em seguida a eficiência da extração foi verificada através do ensaio de

inibição já descrito. A inibição do crescimento destes ensaios foi comparada aos

controles negativos realizados com adição de: água, meio 2 ASM-1, água

esterilizada por filtração (0,22 µm, filtro lavado previamente com 10 mL de H2O

estéril), extrato 10 vezes concentrado de meio condicionado de células verdes e

extrato 10 vezes concentrado do meio de cultura 2 ASM-1.

3.4.2- Testes de estabilidade:

Para investigar e caracterizar inicialmente a natureza química do fator

presente no meio condicionado ele foi deixado em banho-maria (100 ºC) por 5 min

Material e Métodos ___________________________________________________________________

35

ou congelado e descongelado três vezes consecutivas. Para testar a estabilidade a

solventes orgânicos os extratos foram re-dissolvidos em metanol, secos sobre

pressão negativa e reconstituídos em meio 2 ASM-1.

A atividade do meio condicionado submetido aos tratamentos descritos acima

foi comparada à atividade do meio condicionado original, conforme ensaio de

inibição descrito anteriormente.

3.4.3- Purificação inicial:

Após a passagem do meio ativo por uma coluna contendo ODS, um gradiente

de metanol:água (10, 20, 40, 60, 80 e 100% de metanol) foi usado para eluir uma

série de frações. O metanol destas frações foi evaporado sob pressão negativa e a

água eliminada por liofilização. Após a reconstituição dos extratos em meio 2 ASM-1

e esterilização por filtração (0,22 µm, filtro lavado previamente com 10 mL de H2O

estéril) a atividade inibitória foi verificada através do ensaio de inibição.

3.4.4- Análise por CLAE:

Cerca de 500 mL de meio condicionado ativo foi extraído com 4 g de ODS. A

coluna (diâmetro 3,2 cm x altura de 50 cm) foi ativada conforme já descrito no item

3.4.1.1 e o meio condicionado passado pela coluna. Em seguida o material retido foi

eluído em gradiente de metanol:água 20, 40, 60, 80 e 100 % de metanol. As frações

que apresentaram atividade foram reunidas, liofilizadas e ressuspensas em 200 µL

de metanol.

Material e Métodos ___________________________________________________________________

36

3.4.4.1- Parâmetros da análise:

Coluna de fase reversa C18 - Merck C18 50981 GORP (5 µm; 125 x 4 mm)

Volume de amostra injetado: 20 µL;

Fluxo: 1,5 mL/min;

Detecção: UV (ultravioleta - detector de arranjo de diodos), cromatograma

monitorado à 200, 250, 300 e 360 nm de comprimento de onda.

Eluente A: Ácido trifluoracético (TFA) 0,05 % em àgua;

Eluente B: TFA 0,05 % em metanol.

Gradiente:

Durante a corrida, frações foram coletadas a cada minuto até o tempo de 50

min. Essas frações foram então processadas para a análise da atividade através dos

ensaios de inibição.

3.4.4.2- Processamento das frações:

Para neutralizar o TFA (utilizado durante a corrida) foi adicionado em cada

fração coletada 100 µL de uma solução de K2HPO4 1 M e KH2PO4 1 M (proporção

de 94:6). O pH final de cada fração após a mistura com a solução de neutralização

foi de aproximadamente 8. Em seguida cada uma das frações foi diluída em água,

Tempo (min) B (%)

0,01 5

47 100

57 100

72 5

72,1 stop

Material e Métodos ___________________________________________________________________

37

obtendo uma concentração final de 5 % de metanol, e posteriormente passada por

coluna com ODS conforme descrito a seguir:

A fração processada foi passada através da coluna e em seguida a coluna foi

lavada com 5 volumes de água a fim de eliminar o restante de sais e TFA. Em

seguida cada fração foi eluída em 100 % de metanol.

A atividade de cada fração eluída foi verificada, pelo ensaio de inibição item

3.3.1.1, após evaporação do metanol em evaporador rotativo, reconstituição em

meio 2 ASM-1 e esterilização por filtração (0,22 µm, filtro lavado previamente com 10

mL de H2O estéril). Este ensaio foi realizado com as frações concentradas cerca de

doze vezes, ou seja, com a atividade 12 vezes maior que a atividade do meio

condicionado original.

O crescimento destas frações foi comparado ao crescimento de culturas

controle: controles negativos - água, 2 ASM-1 e água esterilizada por filtro

previamente lavado e controle positivo - fração ativa 12 vezes concentrada,

reconstituída em meio 2 ASM-1 e esterilizada por filtração (0,22 µm, filtro lavado

previamente com 10 mL de H2O estéril).

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

38

4- Resultados e Discussão:

4.1-Caracterização de culturas de Microcystis PCC 7806 de

diferentes estágios de crescimento:

4.1.1 - Curva de crescimento e dinâmica no conteúdo de pigmentos durante

cultivo de Microcystis por longos períodos:

Cultivos de cianobactérias apresentam um crescimento muito lento quando

comparado à maioria das bactérias heterotróficas cultivadas em laboratório. Por

exemplo, enquanto um cultivo de Escherichia coli, em condições ideais, pode

alcançar uma taxa de crescimento de 72 duplicações diárias, cianobactérias

apresentam taxas que podem variar de 0,3 a 1,4 duplicações por dia (Van Liere &

Walsby, 1982). Deste modo para confeccionar a curva de crescimento de

Microcystis foram necessários muitos dias de cultivo.

O crescimento da cepa Microcystis em meio 2 ASM-1 foi monitorado durante

35 dias conforme curva de crescimento mostrada pela figura 4. Neste período a

cultura apresentou um crescimento predominantemente linear. A entrada para fase

estacionária ocorreu aproximadamente após 27 dias de cultivo. Durante a confecção

da curva de crescimento também foi observado que Microcystis apresentou dois

fenótipos distintos; um durante o crescimento ativo onde a cultura apresentou a

típica coloração verde da maioria das cianobactérias, e outro, cerca de trinta dias

após o inicio do cultivo, onde a cultura experimentou uma progressiva perda de sua

coloração original até se tornar creme (clorótica), ver figura 6. A mudança descrita

no fenótipo da cultura foi monitorada através da obtenção de espectros de absorção

(medido entre 600 e 800 nm) ilustrados pela figura 5. Os espectros demonstram que

o perfil de pigmentos da suspensão de células de Microcystis no inicio do cultivo

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

39

(t=0) apresentou dois picos de absorção máxima, um λmáx=635 nm e outro λmáx =

680 nm. Estes picos de absorção correspondem aos principais pigmentos

fotossintéticos encontrados em Microcystis: as ficocianinas e a clorofila a,

respectivamente. Após 15 dias de cultivo o perfil de pigmentos da cultura apresentou

uma gradual redução no pico de clorofila a (680 nm) que chegou no 35º dia a cerca

de um quarto da intensidade do inicio do cultivo. Nenhuma ou pouca alteração foi

observada em relação ao pico de ficocianina. Deste modo conclui-se que a

degradação da clorofila a é o principal fator relacionado ao surgimento do fenótipo

clorótico.

4.1.2 - Cultivo de células cloróticas em meio 2 ASM-1:

As células cloróticas de Microcystis, quando observadas ao microscópio

óptico, apresentam as mesmas características das células em crescimento ativo, ou

seja, não apresentam nenhuma alteração morfológica que pudesse ser interpretada

como perda de viabilidade. Segundo a literatura, a acentuada queda nos níveis de

clorofila a, como observado com Microcystis, geralmente seria interpretada como

uma irreversível perda de viabilidade (Tandeu de Marsac & Houmard, 1993). Porém

estudos sobre o processo de clorose em Synechoccocus PCC 7942 mostraram que

este fenótipo é reversível, pois assim que os nutrientes suprimidos novamente eram

adicionados, as culturas regeneravam, ou seja, re-adquiriam seus pigmentos

fotossintéticos e voltavam a crescer dentro de 4-5 dias (Görl et al., 1998).

O experimento com Microcystis descrito a seguir buscou verificar se as

culturas cloróticas desta espécie também mantinham sua capacidade de

regeneração. A capacidade de regeneração das culturas cloróticas de Microcystis é

demonstrada pela figura 7. O espectro da suspensão de células cloróticas no início

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

40

do experimento mostrou ausência de absorção da clorofila a, como já podia ser

esperado (linha tracejada). O meio 2 ASM-1 foi adicionado a estas células e, após

13 dias de incubação, as culturas já apresentavam um pico de absorção da clorofila

a bem definido, e a sua coloração verde característica. A densidade da cultura

durante o experimento também foi monitorada. A cultura aumentou sua densidade

de DO750 0,84, no início do experimento, para praticamente o dobro (DO750 1,55 ±

0,254), após 13 dias de cultivo. Os resultados descritos neste experimento mostram

que pelo menos uma parte das células cloróticas de Microcystis mantém sua

capacidade de regeneração e, portanto permanecem viáveis.

4.1.3 - Verificação da integridade de membrana:

As células de culturas de Microcystis em crescimento (verdes), quando observadas

ao microscópio de fluorescência, apresentam forte auto-fluorescência vermelha.

Esta fluorescência é atribuída principalmente à abundante presença de clorofila a.

Assim a viabilidade de uma população de células de Microcystis em crescimento

pode ser facilmente verificada. De maneira contrária, as células cloróticas de

Microcystis quando observadas ao microscópio de fluorescência não apresentam

esta auto-fluorescência típica. Este fato já era esperado, pois as células cloróticas

como já descrito, apresentam uma drástica redução no conteúdo de clorofila a. Para

determinar qual a percentagem de células na cultura clorótica permanecia viável,

outro método, através do uso de marcadores fluorescentes, foi utilizado. Neste

método a viabilidade das células é verificada pela manutenção da integridade da

membrana.

O uso de marcadores fluorescentes para avaliar a viabilidade de culturas

cloróticas de cianobactérias já havia sido reportado na literatura por Forchhammer e

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

41

Fig. 4- Curva de crescimento. O crescimento de Microcystis PCC 7806

em meio 2 ASM- 1 foi monitorado em função da densidade ótica (DO),

medida à 750 nm.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

0 5 10 15 20 25 30 35 40

tempo (dias)

DO

75

0

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

42

0,18

0,19

0,20

0,21

0,22

0,23

590 640 690 740

comprimento de onda (nm)

abso

rbân

cia

rela

tiva

3 dias 15 dias 35 dias

Fig. 5- Espectros de absorção de suspensão de células de Microcystis

PCC 7806 coletadas com 3, 15 e 35 dias de cultivo. Os espectros foram

medidos de 600 a 760 nm.

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

43

Fig. 6 – Fenótipos de Microcystis PCC 7806 em diferentes estágios de cultivo;

a. Aspecto de uma cultura com 8 dias de cultivo; b. Aspecto de uma cultura com 35

dias de cultivo.

a. b.

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

44

Fig. 7 – Experimento de regeneração. A linha contínua representa o espectro

da cultura clorótica 1 dia após adição de meio 2 ASM-1. A linha pontilhada

representa o espectro de uma cultura clorótica 13 dias após a adição de meio

2 ASM-1.

0,2

0,21

0,22

0,23

0,24

590 640 690 740

comprimento de onda (nm)

abso

rbân

cia

rela

tiva

13 dias

1 dia

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

45

colaboradores (1998). Em seus estudos, a viabilidade de culturas de Synechococcus

PCC 7942 submetidas à privação de nitrogênio foi monitorada por duas técnicas. Em

uma, foi utilizado o kit de viabilidade ‘LIVE/DEAD Baclight’ (Molecular Probes), onde

foi demonstrado que após 28 dias de privação de nitrogênio as células de

Synechococcus ainda preservavam sua integridade de membrana. Na outra técnica,

culturas submetidas à privação de nitrogênio por um período de 20 dias foram

avaliadas quanto sua capacidade de retomar o crescimento e readquirir os

pigmentos fotossintéticos (regenerar). Elas foram re-inoculadas em meio de cultura

completo na presença de um agente inibidor da formação de septo. Deste modo, as

células que readquiriam seus pigmentos eram facilmente visualizadas por retomar a

auto-fluorescência característica e as que se dividiam formavam filamentos, pois

devido a ação do agente inibidor da formação de septo elas não se separavam. Foi

observado que após 3 - 4 dias de incubação praticamente todas as células cloróticas

de Synechococcus foram capazes de regenerar, confirmando assim sua viabilidade.

As observações feitas em culturas cloróticas de Microcystis coradas com o kit

de viabilidade mostraram que a integridade da membrana se mantinha, em cada

população observada, geralmente entre 70 - 90%. Assumindo que a manutenção da

integridade de membrana é um fator suficiente para a célula se regenerar podemos

concluir então que a maior parte das células cloróticas dentro de cada cultura

permanecia com capacidade de regeneração. Estas suposições poderão ser

confirmadas em experimentos com culturas sobre lâminas de microscópio.

Outros experimentos realizados mostraram que culturas de Microcystis

cloróticas foram capazes de manter sua viabilidade por aproximadamente um ano

quando mantidas em sala de cultivo e sob iluminação, somente com a adição de

água para evitar o ressecamento (dados não mostrados).

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

46

4.2 - Caracterização dos dois fenótipos:

Após observar que Microcystis PCC 7806 apresenta dois fenótipos distintos

ao longo do cultivo, os experimentos posteriores visaram uma melhor caracterização

destes dois estados metabólicos.

4.2.1 - Diferenças na ultraestrutura:

Estudos sobre alterações na ultraestrutura de células de cianobactérias

decorrentes da privação de nutrientes essenciais são escassos e antigos (Ariño et

al., 1995; Stevens et al., 1985; Wanner et al., 1986; Sherman et al., 1983; Miller et

al., 1977; Vasconcelos & Fay, 1974). Nestes estudos um tipo de alteração na

ultraestrutura freqüentemente relatado ocorre em relação aos grânulos de reserva

(Allen, 1984). Outra alteração constantemente observada ocorre no aparato

fotossintético (desaparecimento dos tilacóides) da célula que quase sempre é

afetado.

As micrografias eletrônicas das células de Microcystis de diferentes fenótipos

são mostradas na figura 8. Foi observado que as células coletadas durante a fase de

crescimento apresentaram a típica organização ultraestrutural de uma célula de

cianobactéria. No citoplasma observou-se a presença de estruturas esféricas eletro-

densas e eletro-lucentes. Estas estruturas provavelmente se tratam de grânulos de

reserva encontrados em cianobactérias, como por exemplo, grânulos de polifosfato e

corpos lipídicos (Allen, 1984). É também claramente observado no citoplasma um

proeminente sistema interno de membranas tilacoidais que constituem o aparato

fotossintético da célula. A parede celular se apresentou bem estruturada, com o

arranjo multi-laminar típico das bactérias gram-negativas (figura 8 A).

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

47

As micrografias das células cloróticas mostraram que ocorrem profundas

mudanças na organização celular durante a clorose. Nestas células foi observado o

desaparecimento do aparato fotossintético que era caracterizado principalmente pela

abundante presença dos tilacóides. As células cloróticas apresentaram também uma

marcante reorganização na parede celular (figura 8 B).

4.2.2 - Diferenças no acúmulo de glicogênio:

O glicogênio é um polissacarídeo formado por subunidades de glicose unidas

através de ligações α1�4, com ligações α1�6 nas ramificações. Em cianobactérias,

o glicogênio é acumulado sob a forma de pequenos grânulos localizados

principalmente entre os tilacóides. O glicogênio pode ser degradado em

cianobactérias a dióxido de carbono pela via pentose fosfato e os elétrons

transferidos ao oxigênio via cadeia transportadora de elétrons (Van Liere et al.,

1979), portanto sua principal função é de servir como produto de reserva; provável

fonte de carbono e energia na ausência luz.

O acúmulo de glicogênio ocorrido durante o processo de clorose já foi

relatado para outros gêneros de cianobactérias. Em culturas de Synechococcus

PCC 7942, por exemplo, o processo de clorose foi acompanhado por um aumento

de aproximadamente 4 vezes no conteúdo de glicogênio, após 30 dias de privação

de nitrogênio (Görl et al., 1998).

A quantificação de glicogênio nas células de Microcystis foi obtida

indiretamente, após hidrolise ácida com liberação de monômeros de glicose. Este

dado está representado pelo gráfico de barras da figura 9. Os resultados mostram

que as células cloróticas apresentam cerca de 5 vezes mais glicogênio que as

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

48

Fig. 8 – Micrografias eletrônicas de células de Microcystis sob diferentes

condições; a. Ultraestrutura de células coletadas durante a fase de crescimento. As

setas pretas mostram a organização dos tilacóides; b. Ultraestrutura de células cloróticas.

Nestas células observa-se a ausência das membranas tilacoidais e uma reorganização da

parede celular; c. Efeito do meio condicionado ativo, sobre a ultraestrutura de células

crescidas em meio repleto de nutrientes. Estas células tratadas também apresentaram a

perda dos tilacóides. As micrografias selecionadas são representativas de cada estágio

analisado. As barras representam 0,25 µm.

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

49

0

2

4

6

8

10

12

média

glic

ose

g/1

08

céls

)

Fig. 9 – Estimativa do conteúdo de glicogênio. Os resultados foram

obtidos a partir de culturas com 8 (células verdes) e 40 dias (células

cloróticas). O conteúdo de glicogênio foi determinado indiretamente após

hidrólise ácida e liberação dos monômeros de D-glicose utilizando o

método enzimático/colorimétrico (glicose oxidase) do Kit Bioliquid

(Biodiagnóstica).

culturas

cloróticas

culturas

verdes

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

50

células em fase de crescimento. As células cloróticas com 40 dias de cultivo

apresentaram 8,11 ± 2,18 µg de glicose/108 células enquanto as células verdes, com

8 dias de cultivo, apresentaram 1,55 ± 0,68 µg de glicose/108 células.

4.2.3 – Conteúdo de proteínas solúveis:

A análise proteômica de proteínas solúveis em Synechocystis PCC 6803

revelou que grande parte das proteínas identificadas está relacionada ao

metabolismo energético (fotossíntese) e ao metabolismo de aminoácidos (Simon et

al., 2002). Além disso, estima-se que cerca de um terço do total de proteínas

solúveis em Synechocystis esteja associada a membranas (Norling et al., 1998).

A estimativa do conteúdo de proteínas solúveis em Microcystis revelou que na

média não houve diferença clara entre os fenótipos: as células verdes apresentaram

17,5 ± 4 µg enquanto as células cloróticas apresentaram 20 ± 9,3 µg de proteínas

solúveis/108 células. A grande variação no conteúdo de proteínas solúveis

observada dentro de cada fenótipo analisado (alto desvio padrão) pode ter sido

influenciada por problemas na metodologia. Durante o processo de extração das

proteínas solúveis foi observado que as células cloróticas apresentaram maior

resistência à lise quando comparada às células verdes. Deste modo foi preciso

aumentar o número de ciclos de sonicação no processo de extração para garantir

que todas as células cloróticas rompessem. O procedimento de sonicação é um

método agressivo e a extensão do número de ciclos pode ocasionar a desnaturação

de proteínas o que poderia influenciar os resultados obtidos. Assim, os resultados

deste experimento são preliminares, pois o método de extração deverá ser otimizado

a fim de minimizar os efeitos do procedimento de sonicação na quantificação das

proteínas solúveis de cada fenótipo.

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

51

Mais uma razão para questionar os resultados acima, são os dados obtidos

nos estudos sobre clorose em Synechococcus PCC 7942 (Sauer et al., 2001). Os

autores mostraram que as células mantidas por 70 dias em meio sem nitrogênio

apresentaram cerca de 0,4% do total de proteínas solúveis de células coletadas na

fase de crescimento (Sauer et al., 2001). Portanto os resultados apresentados neste

trabalho para as células cloróticas de Microcystis diferem do que foi observado

durante a clorose em Synechococcus PCC 7942 (Sauer et al., 2001).

4.2.4 - Diferenças no perfil metabólico:

O uso da ressonância magnética nuclear como ferramenta na área da

microbiologia vem ganhado destaque nos últimos anos (Kell, 2004; Grivet et al.,

2003 e Fiehn, 2002). Entre as principais aplicações desta técnica destaca-se a

possibilidade de se obter um perfil químico completo de uma amostra e ainda ser

possível identificar um composto dentro dessa mistura complexa, sem a

necessidade de purificá-lo. Neste estudo a RMN foi utilizada para obter o perfil

químico das micro-moléculas solúveis presentes em diferentes extratos de células

de Microcystis PCC 7806 de diferentes fenótipos.

A medição dos espectros do extrato aquoso e metanólico mostrou que, no

geral as células cloróticas apresentaram uma redução na intensidade dos sinais,

quando comparadas com as células verdes. No extrato aquoso os compostos

identificados foram: colina, ácido acético, ácido láctico, ácido β-hidroxi butírico,

açúcares e dois compostos que não puderam ser identificados (figura 10 A e B). No

extrato metanólico os compostos identificados foram: ácido fórmico, clorofila a e

ácido acético, além de ácidos graxos saturados e insaturados, açúcares e um

composto não identificado (figura 10 C e D).

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

52

A comparação dos espectros dos extratos clorofórmicos mostrou claramente

uma mudança no perfil de ácidos graxos (figura 10 E e F). As células cloróticas

apresentaram maior quantidade de ácidos graxos insaturados em relação às células

verdes. Este fato é evidenciado principalmente pelo aparecimento do sinal com

deslocamento químico em 5.35, que provavelmente corresponde a uma insaturação

na cadeia de C.

A presença de ácido β-hidroxi butírico no extrato aquoso de cianobactérias é

comum já que este composto pode formar um polímero, o poli-β-hidroxibutirato

(PHB) que é unicamente encontrado em bactérias. Em algumas espécies de

cianobactérias, o acúmulo de PHB é induzido pela privação de nutrientes, como em

Synechococcus sp. MA19 que foi capaz de acumular rapidamente PHB quando

cultivada em condições de privação de nitrogênio (Miyake et al., 1997). Em outras

espécies o acúmulo de PHB ocorre em função de excesso de poder redutor ou pela

presença de excesso de ácido acético (De Phillipis et al., 1992). No extrato aquoso

de células cloróticas de Microcystis foi observado uma redução em torno de 2,5

vezes nos sinais relativo ao ácido β-hidroxi butírico. A diminuição dos sinais relativos

ao ácido β-hidroxi butírico, junto ao fato de ocorrer um aumento de 3,8 vezes no

sinal relativo ao ácido acético no extrato metanólico sugere que ocorreu um

acúmulo, nas células cloróticas, de ácido β-hidroxi butírico na sua forma polimérica

(PHB). O PHB não é detectado nos espectros por se tratar de uma molécula

polimérica e por isso há a necessidade de técnicas específicas de RMN para

confirmar este acúmulo nas células cloróticas de Microcystis.

No espectro do extrato aquoso de células verdes foi detectado um sinal

relativo a molécula de colina. Este sinal estava ausente no extrato aquoso das

células cloróticas. Em bactérias a colina pode participar da formação de

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

53

fosfatidilcolina – um tipo de fosfolipídio de membrana (Sohlemkamp et al., 2003). A

ausência deste sinal nas células cloróticas pode ser explicada pelo fato desta cultura

já se encontrar na fase estacionária e, portanto o processo de formação de

membranas nestas células estar reduzido.

A comparação da intensidade dos sinais relativos aos açúcares entre as

células verdes e cloróticas revelou que houve uma redução em torno de 60 vezes no

conteúdo destas moléculas nas células cloróticas. Esta redução é prontamente

justificada pela marcante redução do processo de fotossíntese nas células

cloróticas.

O ácido lático é uma molécula proveniente da fermentação da glicose. Ele é

formado a partir do piruvato e em cianobactérias é sintetizado principalmente

durante o período de escuro, para produção de ATP. O sinal relativo ao ácido lático

se apresentou cerca sete vezes menos intenso nas células cloróticas. Este fato

provavelmente é mais um reflexo da redução no metabolismo das células. Como a

produção de açucares foi drasticamente reduzida o metabolismo do piruvato a

lactato durante o período de ausência de luz também foi diminuído.

O espectro aquoso e metanólico das células cloróticas revelou um aumento

na intensidade dos sinais relativos ao ácido acético e ao ácido fórmico, quando

comparado com os espectros das células verdes. Esses compostos também são

produtos de fermentação.

Apesar da respiração aeróbica ser considerada o modo habitual de geração

de energia em cianobactérias na ausência de luz, esses microorganismos podem

ser encontrados em ambientes sob permanente condição de anoxia (por exemplo,

quando formam grossas natas durante as florações) ou temporariamente,

principalmente durante a noite, quando a oferta de oxigênio é limitada pela

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

54

supressão da fotossíntese. Sob condição de falta de oxigênio o metabolismo aeróbio

pode ser substituído pelo metabolismo anaeróbio através do processo fermentativo.

Em cianobactérias vários tipos de fermentação já foram reportados: culturas aeradas

de Microcystis PCC 7806 e crescidas em meio de cultura BG11, foram capazes de

fermentar, na ausência de luz, o glicogênio de reserva em etanol, acetato, dióxido de

carbono (CO2) e H2 (Moezzelaar & Stal, 1994); Oscillatoria limnetica, quando em

condições de anoxia foi capaz de realizar fermentação homolática (Oren & Shilo.,

1979); Oscillatoria limosa, uma espécie que pode formar densas camadas de células

onde a difusão de gases é dificultada (Revsbech et al., 1983), é capaz de realizar

uma fermentação heterolática e homoacética simultaneamente (Heyer et al., 1989);

em Cyanothece PCC 7822, um gênero unicelular, quando incubada na ausência de

oxigênio e luz e foi capaz de utilizar suas reservas de carbono gerando acetato,

etanol, formato e lactato caracterizando um tipo de fermentação ácida mista (Van

der Oost et al., 1989). Os dados relativos aos produtos da fermentação sugerem que

durante o crescimento no meio ASM-1 (homeostase energética) as células de

Microcystis apresentaram uma fermentação preferencialmente homolática (ac.

lático). Durante a clorose com a drástica mudança no metabolismo energético das

células vias alternativas de obtenção de energia se tornaram ativas, como foi

observado pela produção de ácido acético e ácido fórmico nas células cloróticas.

Durante esta fase provavelmente fontes de carbono de reserva (glicogênio e PHB,

por exemplo) serviram como substratos para este tipo de fermentação.

No extrato metanólico das células cloróticas foi observado a ausência do sinal

relativo à clorofila a; Este fato já era esperado, pois como já descrito em

experimentos anteriores, as células cloróticas apresentam redução no conteúdo de

clorofila a.

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

55

Letra Deslocamento químico (p.p.m)***

Células. verdes*

Células. cloróticas*

Molécula identificada Fórmula química

a1 a2 a3

1.2 2.5 4.15

5 2 ácido β-hidroxi butírico

C4H8O3

b 3.25 2 X** colina C5H14ON c 1.35 0.7 0.1 ácido lático C3H6O3 d

1.9 2 3 ácido acético C2H4O2

e1 e2

3.5-4.0 5.4

12 0.2 açúcares variável

f 4.4 0.8 0.05 composto não identificado desconhecida

g 6.9 X** 0.05 composto não identificado desconhecida

* intensidade relativa do sinal; ** sinal não detectado; *** valores aproximados.

Letra Deslocamento químico (p.p.m.)***

Células. verdes* Células cloróticas* Molécula identificada Fórmula química

h 8.55 0.1 1.6 ácido fórmico CH2O2

i 5.96, 6.15, 8.03, 8.45, 9.35 e 9.6 0.8 0 clorofila a

C55H72MgN4O5

j 5.3 e 5.4 9 3 ácidos graxos insaturados variável

k 0.9 e 1.3 16 17 ácidos graxos saturados e insaturados

variável

l 7.05 e 7.75 0.2 X** composto não identificado

desconhecida

e 3.5 - 4.0 4 0.5 açúcares variável

d 1.9 1.3 5 ácido acético C2H4O2

* intensidade relativa do sinal; ** sinal não detectado; *** valores aproximados.

Letra Deslocamento químico (p.p.m.)***

Células. verdes*

Células cloróticas* Molécula identificada Fórmula química

k 0.9 e 1.3 1,7 1,4 ácidos graxos saturados e insaturados

variável

j 5.35 0,02 0,2 ácidos graxos insaturados variável

* intensidade relativa do sinal; ** sinal não detectado; *** valores aproximados.

Tabela 1- Informações auxiliares aos espectros dos extratos aquosos.

Tabela 2- Informações auxiliares aos espectros dos extratos metanólicos.

Tabela 3- Informações auxiliares aos espectros dos extratos clorofórmicos.

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

56

-

i

H2O

a1

a2 a3 e2

e1

d

c

B.

e2

a2

d

a1

b

f c

a3

H2O

g

e1

A.

h

d

MeOH k

k

j

D.

i i i i i j

j k

d

k MeOH

l l

e

C.

k

j k

F.

j

k

k

E.

Fig. 10 - Espectros de 1H RMN (400 mHz) de células de Microcystis PCC 7806 coletadas em

diferentes estágios de crescimento da cultura. Perfil metabólico de células coletas durante a

fase de crescimento; extrato aquoso (A), extrato metanólico (C), extrato clorofórmico (E). Perfil

metabólico de células coletadas na fase estacionária (células cloróticas); extrato aquoso (B), extrato

metanólico (D), extrato clorofórmico (F).

células verdes células cloróticas

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

57

4.3- Auto-regulação do crescimento de Microcystis PCC 7806:

4.3.1 - O efeito do meio condicionado de Microcystis sobre o crescimento e

conteúdo de pigmentos da mesma cepa:

A entrada para a fase estacionária em bactérias quase sempre é

acompanhada por diversas mudanças fisiológicas que visam a sobrevivência das

células no ambiente (Kolter et al., 1993). Em cianobactérias parece não ser

diferente. Mudanças fisiológicas em bactérias estão freqüentemente associadas à

produção de sinais extracelulares que são responsáveis pela coordenação dessas

respostas.

A fim de investigar se o meio de cultura obtido de células cloróticas possui

sinais químicos que coordenem uma resposta da população à falta de nutrientes,

este meio foi adicionado a culturas crescidas em meio repleto de nutrientes. Meio de

cultura de células cloróticas (meio condicionado) foi separado e adicionado em

culturas recém inoculadas em meio 2 ASM-1.

A figura 11 mostra o efeito do meio condicionado de células cloróticas sobre

culturas crescidas em meio repleto de nutrientes. Os experimentos mostraram que

depois de 3 a 5 dias, houve uma clara diferença na densidade das células: enquanto

as culturas controle, onde água ou meio de cultura foram adicionados, apresentaram

aumento na densidade, as culturas que foram tratadas com o meio condicionado da

fase estacionária apresentaram crescimento muito inferior. A DO750 da cultura

tratada foi de 0,36 + 0,04, o que corresponde à cerca de duas vezes a densidade do

inóculo. Já nos controles a absorbância aumentou de 8-9 vezes (DO750 do controle

com água 1,24 + 0,23 e do controle com meio 2 ASM-1 1,35 + 0,09) (figura 11).

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

58

Fig. 11 - Efeito do meio condicionado ativo sobre o crescimento de culturas de

Microcystis PCC 7806 crescidas em meio repleto de nutrientes. 1- Controle

negativo com adição de H2O; 2- Adição do meio condicionado ativo; 3- Controle

negativo com adição de meio 2 ASM-1. A observação foi feita 5 dias após o início do

experimento.

1

3

2

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

59

Para verificar se o acúmulo do composto inibitório se dá especificamente na

fase estacionária de crescimento o mesmo tipo de ensaio foi realizado utilizando-se

meio condicionado de cultivos de Microcystis ainda em crescimento, ou seja,

enquanto as células ainda estavam verdes. Nenhuma inibição no crescimento foi

observada nestes ensaios (dados não mostrados). Deste modo podemos concluir

que o fator responsável pela inibição está presente somente em culturas

estacionárias.

A fim de verificar com mais detalhe a inibição descrita acima, também foi

avaliada a susceptibilidade de cultivos de Microcystis, em diferentes fases de

crescimento, ao tratamento com o meio condicionado.

O efeito do meio condicionado ativo sobre o crescimento de culturas de

Microcystis com 4, 7, 10 e 14 dias de cultivo é mostrado na figura 12 A. A DO750 foi

medida 5 dias após o ensaio ter sido realizado. A inibição da divisão celular ocorreu

de maneira independente da idade da cultura a qual o meio condicionado ativo foi

adicionado.

Estes resultados mostraram que a atividade do meio condicionado sobre

culturas saudáveis de Microcystis independe da fase de crescimento a qual ele é

adicionado.

4.3.2 - Atividade do meio condicionado ativo sobre outras cepas de

cianobactérias:

Os mesmos experimentos de inibição foram realizados em outras cepas

independentes do mesmo gênero, ambas isoladas no Brasil. A tabela 4 mostra que a

inibição do crescimento na cepa de Microcystis UENF Mic1 e Microcystis UENF Mic2

foi cerca de 25% menor quando comparado com o poder de inibição na cepa

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

60

Cepa Força de inibição relativa (%)__

Microcystis PCC 7806 100

Microcystis UENF Mic1 75 - 60

Microcystis UENF Mic2 75 – 60

Synechococcus PCC 7942 0

Synechocystis PCC 6803 0

Tabela 4- Comparação do efeito do meio condicionado de culturas cloróticas de

Microcystis PCC 7806 sobre o crescimento de outras cepas. Resultados

observados 5 dias após a realização do ensaio de inibição. Os valores de

inibição são relativos ao resultado do ensaio obtido com a cepa Microcystis PCC

7806.

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

61

0,19

0,20

0,21

0,22

0,23

590 640 690 740

comprimento de onda (nm)

abso

rbân

cia

rela

tiva

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 5 10 15 20tempo (dias)

abso

rbân

cia

rela

tiva

0

0,5

1

1,5

2

2,5

D.O

. 750

nm

a.

b.

Fig. 12- Efeito da adição do meio condicionado ativo em culturas de Microcystis

com 4, 7, 10 e 14 dias de crescimento; a. (•) Curva de crescimento em função da

DO 750. As barras verticais mostram o crescimento relativo das culturas em cada

idade após o tratamento com: pretas meio 2 ASM-1, cinzas água, brancas meio

condicionado; b. Espectro de uma cultura de Microcystis com 10 dias de crescimento

após tratamento com meio condicionado, onde: ( ) água, ( ) meio

2ASM-1 e ( ) meio condicionado foi adicionado.

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

62

original; deste modo, estes resultados mostraram que a inibição não foi específica, e

que as outras cepas de Microcystis também são sensíveis à adição do meio

condicionado.

A fim de investigar se o meio condicionado de Microcystis PCC 7806 possui

efeito sobre outros gêneros de cianobactérias pertencentes à mesma Seção de

Microcystis, o ensaio de inibição foi realizado em duas culturas: Synechococcus

PCC 7942 e Synechocystis PCC 6803. Como mostrado na tabela 4, nenhuma das

duas cepas respondeu à adição do meio de cultura condicionado, ou seja, as

culturas foram capazes de manter o crescimento mesmo na presença do meio

condicionado de culturas cloróticas de Microcystis PCC 7806.

Os resultados acima sugerem, que o efeito do meio condicionado ativo de

Microcystis PCC 7806 não é universal para cianobactérias e que seja talvez gênero

específico.

4.4 - Investigação do mecanismo de inibição:

4.4.1 - Efeito do meio condicionado ativo sobre o perfil de pigmentos,

ultraestrutura e viabilidade de células de Microcystis PCC 7806.

Os ensaios, no qual o meio condicionado de células cloróticas foram

adicionados em culturas repletas de nutrientes do mesmo organismo, mostraram

que além da inibição da multiplicação das células, o tratamento tornava as culturas

tratadas pálidas, ou seja, com fenótipo semelhante ao observado nas células

cloróticas. Para confirmar esta suspeita, foi medido o perfil de pigmentos de culturas

tratadas com meio condicionado ativo. A figura 12 B mostra o espectro de uma

cultura de Microcystis incubada durante 10 dias com o meio condicionado. Foi

observado que a intensidade do pico de absorção da clorofila a na cultura tratada foi

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

63

bem menor quando comparado às intensidades dos picos de clorofila a nas culturas

controle (tratadas com água ou 2 ASM-1). Deste modo foi confirmado que, além da

inibição da divisão celular, o meio condicionado ativo também possui efeito sobre o

conteúdo de pigmentos das células. Culturas com 4, 7 e 14 dias de cultivo

submetidas ao mesmo tratamento também apresentaram diminuição na intensidade

do pico de clorofila a (dados não mostrados) indicando assim que a redução no

conteúdo de clorofila a também ocorreu de maneira independente da idade da

cultura na qual o meio condicionado ativo foi adicionado.

O efeito do meio condicionado sobre a ultraestrutura das células tratadas

também foi investigado. A figura 8 C (página 49) mostra a ultraestrutura de uma

célula de Microcystis PCC 7806 após tratamento com o meio condicionado. A

principal característica que as células tratadas apresentaram foi o desmantelamento

de seu aparato fotossintético, notado principalmente pela ausência dos tilacóides.

Este fato se assemelha ao observado nas células cloróticas (ver figura 8 B).

A fim de verificar, se as células tratadas com meio condicionado permaneciam

com sua membrana intacta, foram usados novamente marcadores fluorescentes. As

observações após corar as células tratadas com o Kit LIVE/DEAD Baclight

mostraram que mais de 90 % destas células mantinham a integridade de membrana

preservada, e que, provavelmente, estas células permaneciam viáveis.

Os resultados descritos acima sugerem que a redução da multiplicação

celular, nas culturas em que o meio condicionado foi adicionado, foi acompanhada

pelo desmantelamento do aparato fotossintético das células, essencial para a

captação de energia. Também demonstra que as células tratadas com o meio

condicionado adquirem características similares às encontradas nas células

cloróticas na fase estacionária, pois como foi verificado as células tratadas mantêm

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

64

preservada a integridade da membrana e, portanto provavelmente permanecem

viáveis.

4.5 - Extração e caracterização preliminar do fator responsável pela

atividade do meio condicionado em culturas de Microcystis PCC

7806.

Os resultados até agora discutidos sugerem a presença de algum fator

liberado no meio de cultura de células cloróticas capaz de inibir a multiplicação

celular do mesmo microorganismo, mesmo na presença de nutrientes suficientes no

meio de cultura. Uma investigação mais profunda revelou que este composto foi

capaz de levar as células verdes a adquirirem características de células cloróticas.

Este fator seria produzido pelas células durante o processo de clorose (entrada para

a fase estacionária).

Para definir estratégias de isolamento do fator presente no sobrenadante de

células cloróticas, primeiramente foi avaliada a estabilidade do meio condicionado a

altas temperaturas e ao congelamento. Foi observado que após fervura e após

sucessivas etapas de congelamento/descongelamento, o meio condicionado

preservou sua atividade. Também foi verificado que este fator preservou sua

atividade após a sua solução em solventes orgânicos. Destes resultados conclui-se

que o composto ativo deve se tratar de uma micro-molécula relativamente apolar e

por isso foi definida uma estratégia de purificação.

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

65

4.5.1 - Extração:

A eficiência da extração do composto ativo foi avaliada após tentativas de

adsorção em ODS. O ensaio de inibição realizado com a fração eluída e não-eluída

revelou a fração eluída apresentou os mesmos resultados de inibição do meio

condicionado original (que não foi passado pela coluna) e a fração não-eluída não

apresentou nenhuma atividade. Conclui-se então que o composto responsável pela

atividade é capaz de ficar retido em ODS.

Em outro experimento o mesmo procedimento de extração, utilizado para

meio condicionado de células brancas, foi realizado com meio condicionado de

células ainda em fase de crescimento (verdes) e com o meio de cultura 2 ASM-1

fresco (sem inóculo). Após passados por cada coluna o material retido foi eluído com

metanol 100 %, seco em rotavapor e concentrado cerca de 10 vezes, ou seja,

reconstituído em meio 2 ASM-1 ao equivalente a décima parte do volume do meio

condicionado de células verdes ou do meio de cultura 2 ASM-1 sem inóculo

passados inicialmente pela coluna. Os extratos concentrados foram usados como

controles negativos nos ensaios de inibição.

O resultado do ensaio de inibição mostrou que os extratos do meio

condicionado de células ainda em fase de crescimento (verdes) e do meio de cultura

2 ASM-1 fresco sem inóculo mesmo concentrados, não apresentaram atividade

inibitória e o crescimento das culturas tratadas desta maneira foi similar ao das

culturas onde somente água e meio 2 ASM-1 foram adicionados (dados não

mostrados). Estes resultados confirmam que a atividade do meio condicionado

ocorre somente quando as células estão na fase estacionária de crescimento, ou

seja, quando as células já estão cloróticas. Mostram também que nenhum

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

66

componente presente no meio de cultura 2 ASM-1 é responsável pela inibição do

crescimento.

Depois de confirmada a retenção do composto ativo em ODS foi iniciada

etapa de purificação. Primeiramente foram realizados ensaios de atividade com as

frações eluídas em 5, 10, 20, 40, 60, 80 e 100% de metanol. O resultado destes

ensaios indicou que somente as frações eluídas a 60 e 80% de metanol

apresentaram atividade. Nenhuma inibição foi observada com as frações eluídas a

5, 10, 20, 40 e 100% de metanol. Estes resultados confirmam se tratar de um

composto relativamente apolar.

4.5.2 - Análise por CLAE:

Após extrair uma grande quantidade de meio condicionado as frações eluídas

entre 60 e 80% de metanol foram reunidas e concentradas para a análise por CLAE.

O cromatograma da fração ativa se mostrou bastante complexo, como é

mostrado pela figura 13. Os compostos detectados no cromatograma foram

exclusivamente oriundos do metabolismo das células uma vez que cianobactérias

são organismos autotróficos e seu meio de cultura é composto apenas de sais

minerais (ver anexo I) e EDTA.

A atividade das frações coletadas após a passagem pelo CLAE foi monitorada

através do ensaio de inibição (figura 13). O resultado dos ensaios revelou várias

frações com atividade inibitória. As frações coletadas que apresentaram atividade

são representadas pelos vales no gráfico da figura 13. A atividade das frações se

concentrou nos intervalos entre 23 e 24 minutos, entre 35 e 38 minutos e entre 40 e

44 minutos.

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

67

Ao comparar os intervalos onde houve a inibição de crescimento com o tempo

de saída de picos no cromatograma foi observado que a fração coletada no intervalo

entre 23 e 24 min embora tenha mostrado atividade não coincidiu com nenhum pico

de absorção. No intervalo entre 35 e 38 min a atividade inibitória foi acompanhada

por vários picos que absorveram mais fortemente a 200 e 250 nm. O intervalo entre

40 e 44 min apresentou dois picos bem definidos que absorveram somente a 200

nm. Neste intervalo de tempo também foram observadas regiões que embora tenha

apresentado atividade inibitória não apresentaram picos de absorção nos

comprimentos de onda monitorados. A presença de atividade inibitória em regiões

do cromatograma onde não apresentam absorção no ultravioleta próximo (200 – 380

nm) indica que existem compostos que embora contribuam para a atividade do meio

condicionado não apresentam cromóforos, ou seja, são invisíveis no ultravioleta

próximo e, portanto não podem ser detectadas por esta técnica. Portanto o

fracionamento da amostra por CLAE indica que mais de um fator estaria envolvido

com a atividade do meio condicionado.

Resultado e discussão _______________________________________________________________________________________________________

68

Fig. 13 - Cromatograma da fração ativa e atividade das frações coletadas após passagem por CLAE. A amostra

foi injetada em coluna C18 em CLAE com detector de diodo. O volume de amostra injetado foi de 20 µL com fluxo de

corrida a 1,5 mL/min. Os eluentes usados na corrida foram: eluente A: TFA 0,05 % em água e eluente B: TFA 0,05 %

em metanol. O espectro foi monitorado a 200 (linha verde), 250 (linha vermelha) e 300 nm (linha azul). Após passagem

pela coluna as amostras foram coletadas, processadas e testadas quanto a sua atividade. Os vales indicam os tempos

que apresentaram atividade inibitória. DO750 das culturas controle: 1,086 (água), 1,155 (2 ASM-1), 1,035 (água

esterilizada por filtro) e 0,189 (controle positivo).

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

OD

750

Ab

sorb

ância r elativa

crescimentocromatograma - HPLC

tempo (min)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1 20001000

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

OD

750

Ab

sorb

ância r elativa

crescimentocromatograma - HPLC

tempo (min)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1 20001000CLAE

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

69

4.6 - Considerações finais:

As culturas de Microcystis apresentam uma coloração verde-azulada

característica da maioria das cianobactérias unicelulares (figura 6 a). Esta coloração

é atribuída principalmente à presença dos seus principais pigmentos fotossintéticos:

a clorofila a e a ficocianina. Cultivos de Microcystis mantidos por longos períodos de

tempo são reportados na literatura (Lyck, 2004), porém em nenhum estudo foi

descrito o fenômeno de clorose. Apesar das condições de cultivo e as cepas

testadas serem diferentes da nossa, este parece ser um dos primeiros estudos que

reportam este fenômeno no gênero Microcystis.

Os experimentos indicaram que o fenômeno de clorose em Microcystis

ocorrreu sempre de maneira espontânea e geralmente quando as culturas

apresentavam altas densidades celulares. O pH do meio condicionado, quando as

células já se apresentavam cloróticas, ficou em torno de 8, portanto o pH parece não

possuir influência sobre a indução de clorose.

O efeito da limitação de nutrientes sobre a fisiologia de cianobactérias não

fixadoras de nitrogênio tem sido freqüentemente estudada. Uma freqüente

observação é a redução no conteúdo dos pigmentos fotossintéticos da cultura.

(Wanner et al., 1986, Saha et al., 2003, Görl et al., 1998, Collier & Grossman, 1992).

As culturas permanecem viáveis desde que essa adaptação é prontamente

reversível.

A limitação por nitrogênio leva a uma gradual queda no conteúdo dos

pigmentos fotossintéticos de Synechococcus PCC 7942. Este processo resulta em

baixos níveis de fotossíntese já que a homeostase energética nas células cloróticas

é mantida a 0,1 % da atividade fotossintética de células verdes. Deste modo propõe-

se que esta reação seja um mecanismo de adaptação para a sobrevivência

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

70

prolongada das células (Sauer et al., 2001) já que mutantes que não reagem desta

maneira possuem baixa viabilidade (Sauer et al., 1998). Nestes estudos também foi

mostrado que as culturas cloróticas foram capazes de permanecer viáveis por no

mínimo um ano de privação, desde que fossem mantidas na presença de luz;

culturas cloróticas incubadas na ausência de luz por 14 dias já mostravam atraso no

tempo de regeneração quando colocadas novamente em meio de cultura

suplementado com nitrogênio.

O espectro de Microcystis PCC 7806 no inicio do cultivo mostra um pico

relativamente pequeno de ficocianina, quando comparado ao pico de clorofila a. A

redução de pigmentos mais pronunciada observada durante a clorose foi em relação

ao pico de clorofila a, que foi reduzido a cerca de um quarto da sua intensidade

original de absorção. A degradação da clorofila a e de proteínas associadas, em

Microcystis PCC 7806 teria os mesmos efeitos propostos para a degradação de

ficobiliproteínas em Synechococcus PCC 7942 descritos antes: uma diminuição da

absorção de luz com um concomitante aumento na disponibilidade de nutrientes

limitantes, possibilitando que Microcystis sobreviva às condições de estresse. Além

disso, os resultados sobre o conteúdo de glicogênio mostraram que as células

cloróticas de Microcystis apresentaram um aumento no conteúdo de glicogênio. Este

último fato se assemelha aos experimentos sobre privação de nitrogênio em

Synechococcus PCC 7942, onde também foi observado um acúmulo de glicogênio.

Portanto este estudo mostra que Microcystis e Synechococcus devem adotar

estratégias semelhantes de sobrevivência.

As mudanças fenotípicas, observadas em microorganismos fotossintéticos,

em resposta a vários estresses levam a um balanço entre a absorção de energia

pelo aparato fotossintético e a demanda dos produtos da fotossíntese, ATP e

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

71

NADPH no metabolismo da célula. Falhas neste processo de adaptação levam a

uma série de reações incontroláveis que podem comprometer a viabilidade das

células, já que a diminuição na disponibilidade de nutrientes freia uma série de

processos metabólicos (Hellingwerf, 2002). A diminuição do metabolismo das células

durante a clorose foi observada pelos espectros dos extratos medidos por RMN. A

comparação do perfil metabólico entre as células verdes e cloróticas revelou no

geral que existe uma acentuada queda nos níveis intracelulares das principais micro-

moléculas nas células cloróticas.

A existência de mecanismos químicos de autocontrole da densidade

populacional em Microcystis foi investigada. Os resultados dos experimentos

sugerem a presença de fator(es) no meio extracelular, que aparentemente foi

produzido durante a entrada para a fase estacionária. Este(s) fator(es) foi capaz de

induzir uma resposta similar em células de Microcystis crescidas em meio repleto de

nutrientes.

A auto-inibição do crescimento no gênero Microcystis já foi investigado por

alguns autores. Kozitskaya (1980) investigou a capacidade de Microcystis auto-inibir

seu crescimento, ela correlacionou a diminuição da velocidade de crescimento com

o aparecimento de compostos fenólicos no meio de cultura.

A auto-inibição do crescimento também já foi reportado para outros gêneros

de cianobactérias. Já em 1917, Harder observou uma auto-inibição do crescimento

em Nostoc punctiforme. Em Porphydium tenue foi observado que culturas axênicas

desta espécie morriam repentinamente, enquanto culturas originais, contaminadas

por bactérias, permaneciam saudáveis. Deste modo, Murakami e co-autores em

1990 passaram a investigar a capacidade desta espécie em auto-inibir seu

crescimento. As substâncias responsáveis pela inibição foram identificadas como

Resultado e discussão ___________________________________________________________________

72

uma mistura de ácidos graxos insaturados que quando acumulados no meio de

cultura ao longo do cultivo provocavam a morte das células dentro da população.

(Yamada et al., 1994).

Na tentativa de usar esta abordagem para controlar a formação de florações

tóxicas de cianobactérias, nós procuramos por fatores envolvidos na comunicação

intercelular no meio de cultura de Microcystis. Este gênero é geralmente responsável

pelo maior número de relatos de intoxicação em animais e humanos. Neste trabalho

é reportada a existência de um sinal extracelular no meio de cultura de células

cloróticas de Microcystis PCC 7806 que parece coordenar esta resposta na

população; sua adição a culturas saudáveis promove a redução do crescimento da

população e a desorganização do aparato fotossintético das células.

Estudos sobre o ciclo de vida de células de Microcystis na natureza revelam a

manutenção de um estoque de células nos sedimentos de lagos ao longo do outono

e do inverno. Estas células parecem manter um estado de baixa atividade

metabólica e os estudos sugerem que estas formas são um importante inoculo para

a formação de novas florações na próxima estação (Brunberg & Blomqvist, 2003;

Stahl-Delbanco et al., 2003).

Conclusões ___________________________________________________________________

73

5- Conclusões:

5.1 - Caracterização de culturas de Microcystis PCC 7806 em diferentes

estágios de crescimento:

� Culturas de Microcystis PCC 7806 quando cultivadas por longos períodos em

meio 2 ASM-1 apresentam a redução dos pigmentos fotossintéticos num processo

denominado de clorose.

� Durante a clorose a maior parte das células permanece viável já que a cultura

clorótica é capaz de regenerar quando incubada novamente em meio de cultura

completo e as células permanecem com sua integridade de membrana preservada.

� As células cloróticas de Microcystis têm como características a redução no

conteúdo de clorofila a, desarranjo das membranas tilacoidais, acúmulo de

glicogênio e alterações no perfil intracelular de micro-moléculas.

5.2 - Auto-regulação do crescimento em Microcystis PCC 7806:

� Quando o meio de cultura (meio condicionado) de células cloróticas de

Microcystis PCC 7806 é adicionado a culturas da mesma cepa, crescidas em meio

repleto de nutrientes, ocorre a inibição do crescimento nas culturas tratadas.

� A inibição do crescimento em culturas tratadas com o meio condicionado ocorre

de maneira independente da idade da cultura à qual ele é adicionado.

� A maior parte das células tratadas permanece viável já que mantém a integridade

de membrana preservada.

� A investigação do mecanismo de inibição revelou que as culturas tratadas

apresentam redução no conteúdo de clorofila a e a desorganização dos tilacóides,

fenótipo semelhante ao encontrado em culturas cloróticas.

Conclusões ___________________________________________________________________

74

� O efeito do meio condicionado não é específico para a cepa, mas no mínimo

específico ao gênero, já que outras cepas de Microcystis (UENF Mic1 e UENF Mic2)

foram capazes de responder da mesma maneira a adição do meio e outros gêneros

testados (Synechococcus e Synechocystis) não apresentaram resposta ao

tratamento.

� Um extrato ativo foi obtido e as investigações sobre a sua estabilidade mostraram

que o fator responsável pela inibição é resistente a altas temperaturas, ao

congelamento e descongelamento e a solução em solventes, indicando se tratar de

um composto relativamente apolar e de baixo peso molecular.

� As etapas iniciais de purificação indicam que provavelmente mais de um fator

seria responsável pela atividade do meio condicionado.

Referências bibliográficas ___________________________________________________________________

75

6- Referências bibliográficas:

• Adams, D.G. & Duggan, P.S. (1999) Heterocyst and akinete differentiation in

cyanobacteria. New Phytol. 144:03-33.

• Allen, M.M. (1984) Cyanobacterial cell inclusions. Ann. Rev. Microbiol. 38:1-

25.

• Allen, M.M. & Smith, A.J. (1969) Nitrogen chlorosis in blue-green algae. Arch.

Microbiol. 69:114-120.

• Ariño, X., Ortega-Calvo, J.J., Hernandez-Marine, M. & Saiz-Jimenez, C.

(1995) Effect of sulfur starvation on the morphology and ultrastructure of the

cianobacterium Gloeothece sp. PCC 6909. Arch. Microbiol. 163:447-453.

• Atrih, A. & Foster, S.J. (1999) The role of peptidoglycan structure and

structural dynamics during endospore dormancy and germination. Antonie

Van Leeuwenhoek. 75:299-307.

• Azevedo, S.M.F.O. (1996) Toxic cyanobacteria and the Caruaru tragedy. IV

Simpósio da Sociedade Brasileira de Toxicologia – Livro de resumos. p. 84.

• Bachofen, R. & Schenk, A. (1998) Quorum sensing autoinducers: Do they play

a role in natural microbial habitats? Microbiol. Res. 153:61-63.

• Bainton, N.J., Stead, P., Chhabra, S.R., Bycroft, B.W., Salmond, G.P.,

Stewart, G.S.A.B. & Williams, P. (1992) N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine

lactone regulates carbapenem antibiotic production in Erwinia carotovora. J.

Biochem. 288:997-1004.

• Batrakov, S.G., El’-Registan, G.I., Pridachina, N.N., Nenashev, V.A., Kozlova,

A.N., Gryaznova, M.N. & Zolotareva, I.N. (1993) Tyrosol is the autoregulatory

Referências bibliográficas ___________________________________________________________________

76

d1 factor of the yeast Saccharomyces cerevisae. Microbiology (Moscow)

62:633-638.

• Baumann, P. & Baumann, L. (1981) The marine Gram-negative eubacteria:

genere Photobacterium, Beneckea, Alteromonas, Pseudomonas and

Alcaligenes. In: The Prokaryotes: A Handbook on Habitats, Isolation, and

Identification of Bacteria. (M. P. Starr, H.G. Trüper, A. Balows, H.G &

Schlegel, eds.), pp. 1302-1331. Spring-Verlag, Berlin.

• Beasley, V.R., Cook, W.O., Dahlem, A.M., Hooser, S.B., Lovell, R.A. &

Valentine, N.M. (1989) Algae intoxication in livestock and waterfowl. Clin.

Toxicol. 5:336-345.

• Beck von Bodman, S. & Farrand, S.K. (1995) Capsular polysaccharide

biosynthesis and pathogenicity in Erwinia stewartii require induction by an N-

acyl homoserine lactone autoinducer. J. Bacteriol. 177:5000-5008.

• Bespalov, M.M., Kolpakov, A.I., Loiko, N.G., Doroshenko, E.V., Mulyukin, A.L.,

Kozlova, A.N., Varlamova, E.A., Kurganov, B.I. & El’-Registan, G.I. (2000) The

fuctions of microbial dormancy autoinducers in metabolism blockade.

Microbiology (Moscow) 69:217-223.

• Borowitzka, M.A. & Borowitzka, L.J. (1988) Micro-algal biotechnology.

Cambridge University Press, Cambridge, 477 pp.

• Bradford, M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of

microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding.

Anal. Biochem. 72:248-254.

• Brunberg, A.K. & Boström, B. (1992) Coupling between benthic biomass of

Microcystis and phosphorus release from the sediments of a highly eutrophic

lake. Hydrobiologia 235:375-385.

Referências bibliográficas ___________________________________________________________________

77

• Brunberg, A.K. & Blomqvist, P. (2003) Recruitment of Microcystis

(Cyanophyceae) from lake sediments: the importance of littoral inocula. J.

Phycol. 39:58-63.

• Carmichael, W.W. & Gorham, P.R. (1981) The mosaic nature of toxic blooms

of cyanobacteria. In: The Water Environment: Algal Toxins and Health. (W.W.

Carmichael, ed.), pp.161-172. Plenum Press, New York.

• Carmichael, W.W. (1992) A Status Report on planktonic Cyanobacteria (Blue

Green Algae) and their Toxins. EPA/6000/R-92/079, Environmental Monitoring

Systems Laboratory, Office of Research and Development, US Environmental

Protection Agency, Cincinnati, Ohio.

• Carmichael, W.W. (2001) Health effects of toxin-producing cyanobacteria:

“The cyanoHABs”. Hum. Ecol. Risk Assess. 7:1393-1407.

• Carmichael, W.W. (1996), In: Toxic Microcystis. (M.F. Watanabe, K. Harada,

W.W. Carmichael & H. Fujiki, eds.), CRC Press, London.

• Chorus, I. & Bartram, J. (1999) Toxic Cyanobacteria in water: A Guide to Their

Public Health Consequences, Monitoring and Manegement. Routledge,

London, UK.

• Codd, G.A. & Beattie, K.A. (1991) Cyanobacteria (blue green algae) and their

toxins: awareness and action in the United Kindom. PHLS Microbiology Digest

Supplement 8:82-86.

• Codd, G.A. (1984) Toxins of freshwater cyanobacteria. Microbiol. Sci. 1:48-52.

• Collier, J.L. & Grossman, A.R. (1992) Chlorosis induced by nutrient

deprivation in Synechococcus sp. strain PCC 7942: not all bleaching is the

same. J. Bacteriol. 174:4718-4726.

Referências bibliográficas ___________________________________________________________________

78

• Costa, S.M. & Azevedo, S.M.F.O. (1994) Implantação de um banco de

culturas de cianofíceas tóxicas. Iheringia- Série Botânica 45:69-74.

• Cyanosite - www-cyanosite.bio.purdue.edu/index.html - atualizado em julho

de 2005.

• De Philippis, R., Ena, A., Guastini, M., Sili, C. & Vicenzini, M. (1992) Factor

affecting poly-β-hydroxybutyrate accumulation in cyanobacteria and purple

non-sulfur bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 103:187-194.

• Dor, I. & Danin, A. (1996) Cyanobacterial desert crusts in the Dead Sea

Valley, Israel. Arch. Hydrobiol. Suppl. 177, Algological Studies. 83:197-206.

• Dunlap, P.V. & Greenberg, E.P. (1991) Role of intercellular chemical

communication in the Vibrio fischeri-monocentrid fish symbiosis. In: Microbial

Cell-Cell Interations. (M. Dworkin, ed.), pp. 219-253. American Society for

Microbiology, Washington, D.C.

• Eberhard, A., Burlingame, A.L., Eberhard, C., Kenyon, G.L., Nealson, K.H. &

Oppenheimer, N.J. (1981) Structural identification of autoinducer of

Photobacterium fischeri luciferase. Biochemistry 20:2444-2449.

• Edwards, C., Beattie, K.A., Scrimgeour, C.M. & Codd, G.A. (1992)

Identification of anatoxina-a in benthic cyanobacteria (blue-green algae) and in

associated dog poisonings at Loch Inch, Scotland. Toxicon 30:1165-1175.

• Engebrecht, J. & Silverman, M. (1984) Identification of genes and gene

products necessary for bacterial bioluminescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA

81:4154-4158.

• Falconer, I.R. (1991) Tumor promotion and liver injury caused by oral

consumption of cianobacteria. Environmental Toxicology and Water Quality

6:177-184.

Referências bibliográficas ___________________________________________________________________

79

• Fallon, R.D. & Brock, T.D. (1981) Overwintering of Microcystis in Lake

Mendota. Freswater Biology 11:217-226.

• Fay, P. (1969) Cell differentiation and pigment composition in Anabaena

cylindrica. Archives für Mikrobiologie 67:62-70.

• Fiehn, O. (2002) Metabolomics – the link between genotypes and phenotypes.

Plant Molecular Biology 48:155-171.

• Fischer, R.W. & Wolk, C.P. (1976) Substance stimulating the differentiation os

spores of the blue-green alga Cylindrospermum licheniforme. Nature 259:393-

394.

• Foster, J.W. & Espector, M.P. (1995) How Salmonella survive against the

odds. Annu. Rev. Microbiol. 49:145-174.

• Frenkiel-Krispin, D., Ben-Avraham, I., Englander, J., Shimoni, E., Wolf, S.G. &

Minsky, A. (2004) Nucleoid restructuring in stationary-state bacteria. Molecular

Microbiology 51:395-405.

• Fuqua, C., Parsek, M.R. & Greenberg, E.P. (2001) Regulation of gene

expression by cell-to-cell communication: acyl-homoserine lactone quorum

sensing. Annu. Rev. Genet. 35:439-468.

• Fuqua, W.C., Winans, S.C. & Greenberg, E.P. (1994) Quorum sensing in

bacteria The LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional

regulators. J. Bacteriol. 176:269-275.

• Fuqua, W.C., Winans, S.C. & Greenberg, E.P. (1996) Census and concensus

in bacterial ecosystems: The LuxR-Luxl family of quorum- sensing

transcriptional regulators. Annu. Rev. Microbiol. 50: 727-751.

Referências bibliográficas ___________________________________________________________________

80

• Gorhan, P.R., McLachlav, J.R., Hammer, V.T. & Kim, W.K. (1964) Isolation

and culture of toxic strains of Anabaena flos-aquae (Lyngb.) Int. Ver. Theor.

Angew. Limnol. Verh. 15:796-804.

• Görl, M., Sauer, J., Baier, T. & K. Forchhammer. (1998) Nitrogen starvation-

induced chlorosis in Synechococcus PCC 7942: adaptation to long term

survival. Microbiology 144:2449-2458.

• Grivet, J.P., Delort, A.M. & Portais, J.C. (2003) NMR and microbiology: from

physiology to metabolomics. Biochimie 85:823-840.

• Gryaznova, M.N., El’-Registan, G.I., Koslova, A.N., Morozov, O.V., Osipov,

G.A., Lebkova, G.A., Duda, V.I. & Emtsev, V.T. (1985) The role of the

autoregulatory d1 factor in cytodifferentiation of spore-forming bacteria.

Mikroorganizmy, ikh rol’ v plodorodii pochvy i okhrane okruzhayushchei sredy

(the role of microorganisms in soil fertility and environmental protection),

Moscow: Timiryazev SKhA, p. 88-93.

• Gunn, G.J., Rafferty, A.G., Rafferty, G.C., Cockburn, N., Edwards, C., Beattie,

K.A. & Cood, G.A. (1992) Fatal canine neurotoxicosis attributed to blue green

algae (cyanobacteria). Vet. Rec. 4:301-302.

• Harder, R. (1917) Ernahrungsphysiologische Untersuchungen an

Cyanophyceen,

hauptsachlich. dem endophytischen Nostoc punctiforme. Z. Bot. 9:145-242.

• Hellingwerf, K.J. (2002) The molecular basis of sensing and responding to

light in microorganisms. Antonie Van Leeuwenhoek 81:51-59.

• Herdman, M. (1987) Akinetes:structure and function. In: The cyanobacteria.

(P. Fay & C. Van Baalen, eds.), pp. 227-250. Amsterdam, The Netherlands:

Elsevier.

Referências bibliográficas ___________________________________________________________________

81

• Heyer, H., Stal, L.J. & Krumbein, W.E. (1989) Simultaneous heterolactic and

acetate fermentation in the marine cyanobacterium Oscillatoria limosa

incubated anaerobically in the dark. Arch Microbiol 151:558-564.

• Hirosawa, T. & Wolk, C.P. (1979a) Factors controlling the formation of

akinetes adjacent to heterocysts in the cyanobacterium Cylindrospermum

licheniforme Kütz. Journal of General Microbiology 114:423-432.

• Hirosawa, T. & Wolk, C.P. (1979b) Isolation and characterization of substance

which stimulates the formation of akinetes in the cyanobacterium

Cylindrospermum licheniforme Kütz. Journal of General Microbiology 114:433-

441.

• Hooser, S.B., Beasley, V.R., Waite, L.L. & Carmichael, W.W. (1991) Actin

filament alterations in rat hepatocytes induced in vivo an in vitro by

microcystin-LR, a hepatotoxin from the blue-green algae Microcystis

aeruginosa. Veterinary Pathology 28:259-266.

• Huckauf, J., Nomura, C., Forchhammer, K. & Hagemann, M. (2000) Stress

responses of Synechocystis sp. strain PCC 6803 mutants impaired in genes

encoding putative alternative sigma factors. Microbiology 146:2877-2889.

• Huisman, G.W., Siegele, D.A., Zambrano, M.M. & Kolter, R. (1996)

Morphological and physiological changes during stationary phase. In:

Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology.

(F.C. Neidhardt, R. Curtiss, C.A. Gross, J.l. Ingranham, E.C.C. Lin, K.B. Low,

B. Magasanik, W. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter & H.E. Umbarger,

eds.), pp. 1672-1682. American Society for Microbiology Press, Washington,

DC.

Referências bibliográficas ___________________________________________________________________

82

• Hunter, P.R. & Roberts, C. (1991) Introduction. In: Public Health Aspects of

Cyanobacteria (blue green algae). (G.A. Cood & C. Roberts, eds.), PHLS

Microbiology Digest Supplement 8:80-81.

• Ingraham, J.L., Maalǿe, O. & Neidhardt, F.C. (1983) Growth of the bacterial

cell. Sunderland, Mass.: Sinauer Associates, Inc.

• Jochimsen, E.M., Carmichael, W.W., An, J., Cardo, D., Cookson, S.T.,

Holmes, C.E.M., Antunes, M.B.C., Melo Filho, D.A., Lyra, T.M., Barreto, V.,

Azevedo, S.M.F.O. & Jarvis, W.R. (1998) Liver failure and death following

exposure to microcistin toxins at a hemodialysis center in Brazil. New England

Journal of Medicine 338:873-878.

• Kaiser, D. & Losick, R. (1993). How and why bacteria talk to each other. Cell

73:873-885.

• Kaprelyants, A.S. & Kell, D.B. (1993) Dormancy in stationary phase cultures of

Micrococcus luteus: flow cytometric analysis of starvation and resuscitation.

Appl. Environ. Microbiol. 59:3187-3196.

• Kell, D. (2004) Metabolomics and systems biology: making sense of the soup.

Curr. Opin. Microbiol. 7:296-307.

• Kjelleberg, S., Albertson, N., Flardh, K., Holmquist, L., JouperJaan, A.,

Marouga, R., Ostling, J., Svenblad, B. & Weichart, D. (1993) How do non

differentiating bacteria adapt to starvation? Antonie Leeuwenhock 63:331-

341.

• Kolpakov, A.I., Il’inskaya, O.N., Bespalov, M.M., Kupriyanova-Ashina, F.G.,

Gal’chenko, V.F., Kurganov, B.I. & El’Registan, G.I. (2000) Stabilization of

enzymes by dormancy autoinducers as a possible mechanism or resistance of

resting microbial forms. Microbiology (Moscow) 69:224-230.

Referências bibliográficas ___________________________________________________________________

83

• Kolter, R., Siegele, D.A. & Tormo, A. (1993) The stationary phase of the

bacterial life cycle. Annu. Rev. Microbiol. 41:25-49.

• Kozitskaya, V.N. (1980) Acumulation of phenolic compounds by Microcystis

cultures. Hydrobiol. J. 16:43-44.

• Lange, R. & Hengge-Aronis, R. (1991) Growth phase-regulated expression of

bolA and morphology of stationary-phase Escherichia coli cells are controlled

by the novel sigma factor σs . J. Bacteriol. 173:4474-4481.

• Latour, D., Sabido, O., Salençon, M.J. & Giraudet, H. (2004) Dynamics and

metabolic activity of the benthic cyanobacterium Microcystis aeruginosa in the

Grangent reservoir (France). Journal of Plankton Research. 26:719-726.

• Lau, R.H., Mackenzie, M.M. & Doolittle, W.F. (1977) Phycocyanin synthesis

and degradation in the blue green bacterium Anacystis nidulans. J. Bacteriol.

132:771-778.

• Lyck, S. (2004) Simultaneos changes in cell quotas of microcystin, chlorophyll

a, protein and carbohydrate during different growth phases of a batch culture

experiment with Microcystis aeruginosa. Journal of Plankton Research

26:727-736.

• Marahiel, M.A., Nakmo, M.M. & Zuber, P. (1993) Regulation of peptide

antibiotic production in Bacillus. Mol. Biol. 7:631-636.

• Martirosova, E.I., Karpekina, T.A. & El’Registan, G.I. (2004) Enzyme

modification by natural chemical chaperons of microorganisms. Microbiology

(Moscow) 73:609-615.

• Meireles, D.A. Busca por reguladores do crescimento em cianobactérias -

Investigação da produção de moléculas do tipo N-acil homoserina lactonas.

Referências bibliográficas ___________________________________________________________________

84

2003. 35 f. Monografia - Centro de Biociências e Biotecnologia, Universidade

Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Campos dos Goytacazes.

• Miller, L.S. & Holt, S.C. (1977) Effect of carbon dioxide on pigment and

membrane content in Synechococcus lividus. Arch. Microbiol. 115:185-198.

(OK)

• Miller, M.B. & Bassler, B.L. (2001) Quorum sensing in bacteria. Annu. Rev.

Microbiol. 55:165-199.

• Minsky, A., Shimoni, E. & Frenkiel-Krispin, D. (2002) Stress, order and

survival. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 3:50-60.

• Miyake, M., Kataoka, K., Shirai, M. & Asada, Y. (1997) Control of poly-β-

hydroxybutyrate synthase mediated by acetyl phosphate in cyanobacteria. J.

Bacteriol. 179:5009-5013.

• Moezelaar, R. & Stal, L.J. (1994) Fermentation in the unicellular

cyanobacterium Microcystis PCC 7806. Arch. Microbiol. 162:63-69.

• Mukamolova, G.V., Yanopolskaya, N.D., Kell, D.B. & Kaprelyants, A.S. (1998)

On resuscitation from the dormant state of Micrococcus luteus. Antonie Van

Leeuwenhoek 73:237-243.

• Murakami, N., Yamada, Y. & Sakakibara, J. (1990) An autolytic substance in a

freshwater cyanobacterium Phormidium tenue. Chem. Pharm. Bull. 38:812-

814.

• Nichols, J.M. & Adams, D.G. (1982) Akinetes. In: The biology of

cyanobacteria. (N.G. Carr & B.A.Whitton eds.), pp. 387-412. Oxford, UK:

Blackwell Scientific.

Referências bibliográficas ___________________________________________________________________

85

• Norling, B., Zak, E., Andersson, B. & Pakrasi, H., (1998) 2D-isolation of pure

plasma and thylakoid membranes from the cyanobacterium Synechocystis

PCC 6803. FEBS Lett. 436:189–192.

• Oren, A. & Shilo, M. (1979) Anaerobic heterotrophic dark metabolism in the

cyanobacterium Oscillatoria limnetica: sulfur respiration and lactate

fermentation. Arch. Microbiol. 122:77-84.

• Osipov, G.A., El’-Registan, G.I., Svetlichnyi, V.A., Koslova, A.N., Duda, V.I.,

Kaprel’yants, A.S. & Pomazanov, T.V. (1985) Chemical nature of the d

autoregulatory factor of Pseudomonas carboxydoflava. Microbiology (Moscow)

54:186-190.

• Passador, L., Cook, J.M., Gambello, M.J., Rust, L. & Iglewski, B.H. (1993)

Expression of Pseudomonas aeruginosa virulence genes requires cell-to-cell

communication. Science 260:127-1130.

• Patterson, G.M.L., Laisen, L.K. & Moore, R.E. (1994) Bioactive natural

products from blue-green algae. J. Appl. Phycol. 6:151-157.

• Piper, K.R., Beck von Bodman, S. & Farrand, S.K. (1993) Conjugation factor

of Agrobacterium aureofaciens regulates Ti plasmid transfer by autoinduction.

Nature 362:448-450.

• Plaga, W. & Schairer, H.U. (1999) Intercellular signalling in Stigmatella

aurantiaca. Curr. Opin. Microbiol. 2:593-597.

• Prestton, T., Stewart, W.D.P. & Reynolds, C.S. (1980) Bloom froming

cyanobacterium Microcystis aeruginosa overwinters on sediment surfaces.

Nature 288:365-367.

• Rai, A. N. (1990). CRC Handbook of Symbiotic Cyanobacteria. CRC Press,

Boca Raton, 253 pp.

Referências bibliográficas ___________________________________________________________________

86

• Rai, A.N., Rao, V.V. & Singh, H.N. (1985) The biology of the cyanobacterial

(blue-green algal) akinetes (spores). Journal of Plant Science Research 1:1-

20.

• Reeve, C.A., Amy, P. & Matin, A. (1984) Role of protein synthesis in the

survival of carbon-starved E. coli K12. J. Bacteriol. 160:1041-1046.

• Repavich, W.M., Sonzogni, W.C., Standdridge, J.H., Wedepohl, R.E. &

Meisner, L.F. (1990). Cyanobacteria (blue green algae) in Wisconsin waters:

acute and chronic toxicity. Water Research 24:225:231.

• Reusch, R.N. & Sadoff, H.L. (1979) 5-n-Alkylresorcinols from encysting

Azotobacter vinelandii: isolation and characterization. J. Bacteriol. 139:448-

453.

• Revsbech, N.P., J∅rgensen, B.B., Blackburn, T.H. & Cohen, Y. (1983)

Microelectrode studies of the photosynthesis and O2, H2S and pH profiles of a

microbial mat. Limnol Oceanogr. 28:1062-1074.

• Reynolds, C.S., Jaworsk, G.H.M., Cmiech, H.A. & Leedale, G.F. (1981) On

the annual cycle of the blue-green alga Microcystis aeruginosa Kütz emend

Elenkin. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B

293:419-477.

• Ruby, E.G., Greenberg, E.P. & Hastings, J.W. (1980) Planktonic marine

luminous bacteria: species distribuition in the water column. Appl. Environ.

Microbiol. 39:302-306.

• Ruby, E.G. & Nealson, K.H. (1978) Seasonal changes in the species

composition of luminous bacteria in nearshore waters. Limnol. Oceanogr.

23:530-533.

Referências bibliográficas ___________________________________________________________________

87

• Saha, S.K., Uma, L. & Subramanian, G. (2003) Nitrogen stress induces

changes in the marine cyanobacterium Oscillatoria willei BDU 130511. FEMS

Microbiol. Ecol. 45:263-272.

• Sarma, T.A. & Ghai, R. (1998) Pattern of akinete differentiation in the

cyanobacterium Scytonema fritschii. Folia Microbiologica 105:83-94.

• Sauer, J., Görl, M. & Forchhammer, K. (1999) Nitrogen starvation in

Synechococcus PCC 7942: involvement of glutamine synthetase and NtcA in

phycobiliprotein degradation and survival. Microbiology 172:247-255.

• Sauer, J., Schreiber, U., Schmid, R., Völker, U. & Forchhammer, K. (2001)

Nitrogen starvation-induced chlorosis in Synechococcus PCC 7942. Low-level

photosynthesis as a mechanism of long-term survival. Plant Physiology

126:233-243.

• Schultz, J.E., Latter, G.I. & Matin, A. (1988) Differential regulation by cyclic

AMP of starvation protein synthesis in Escherichia coli. J. Bacteriol. 170:3903-

3909.

• Shapiro, L. & Losick, R. (2000) Dynamic spatial regulation in bacterial cell.

Cell 100:89-98.

• Shermam, D.M. & Shermam, L.A. (1983) Effect of iron deficience and iron

restoration on ultrastructure of Anacystis nidulans. J. Bacteriol. 156:393-401.

• Shikura, N., Yanamura, J. & Nihira, T. (2002) barS1, a gene for biosynthesis

of a γ-butyrolactone autoregulator, a microbial signaling molecule eliciting

antibiotic production in Streptomyces species. J. Bacteriol. 184:5151-5157.

• Simon, R.D. (1987) Inclusion bodies in the cyanobacteria: cyanophycin,

polyphosphate, polyhedral bodies. In: The cyanobacteria. (P. Fay & C. Van

Referências bibliográficas ___________________________________________________________________

88

Baalen, eds.), pp. 199-225. Amsterdam B.V. (Biomedical Division): Elsevier

Science Publishers.

• Simon, W.J., Hall, J.J., Suzuki, I., Murata, N. & Slabas, A.R. (2002) Proteomic

study of the soluble proteins from the unicellular cyanobacterium

Synechocystis sp. PCC 6803 using automated matrix-assisted laser

desorption/ionization-time of flight peptide mass fingerprinting. Proteomics

2:1735-1742.

• Sohlenkamp, C., López-Lara, I. M., & Geiger, O. (2003) Biosynthesis of

phosphatidylcholine in bacteria. Prog. Lipid Res. 42:115-162.

• Srinivasan, S., Östling, J., Charlton, T., de Nys, R., Takayama, K. &

Kjelleberg, S. (1998) Extracellular signal molecule(s) involved in the carbon

starvation response of marine Vibrio sp. strain S14. J. Bacteriol. 180:201-209.

• Stahl-Delbanco, A., Hansson, L.-A. & Gyllstrom, M.J. (2003) Recruitment of

resting stages may induces blooms of Microcystis at low N:P rations. J.

Plankton Res. 25:1099-1106.

• Stevens S.E., Nierzwicki-Bauer, S.A. & Balkwill, D.L. (1985) Effect of nitrogen

starvation on the morphology and ultrastructure of the cyanobacterium

Mastigocladus laminosus. J. Bacteriol. 161:1215-1218.

• Svetlichnyi, V.A., Romanova, A.K. & El’Registan, G.I. (1986) A study of the

content of membrane-active autoregulators during lithoautotrophic growth of

Pseudomonas carboxydoflava. Microbiology (Moscow) 55:55-59.

• Tandeau de Marsac, N., & J. Houmard. (1993) Adaptation of cyanobacteria to

environmental stimuli: new steps toward molecular mechanisms. FEMS

Microbiol. Rev. 104:119-190.

Referências bibliográficas ___________________________________________________________________

89

• Teixeira, M.G.L.C., Costa, M.C.N., Carvalho, V.L.P., Pereira, M.S. & Hage, E.

(1993) Gastroenterites epidemic in the area of Itaparica, Bahia, Brazil. Bulletin

PAHO 27:244-253.

• The Quorum Sensing site - www.nottingham.ac.uk/ - Última atualização

dezembro de 2004.

• Van der Oost, J., Bulthuis, B.A., Feitz, S., Krab, K. & Kraayenhof, K. (1989)

Fermentation metabolism of the unicellular cyanobacterium Cyanothece PCC

7822. Arch Microbiol. 152:415-419.

• Van Liere, L. & Walsby, A.E. (1982) Interactions of cyanobacteria with light. In:

The Biology of the Cyanobacteria. (N.G. Carr & B.A. Whitton. eds.), pp. 9-45.

Blackwell Science Publications, Oxford.

• Van Liere, L., Mur L.R., Gibson, C.E. & Herdman, M. (1979) Arch. Microbiol.

123:315-318.

• Vasconcelos, L. & Fay, P. (1974) Nitrogen metabolism and ultrastructure in

Anabaena cylindrica. Arch. Microbiol. 96:271-279.

• Wanner, G., Henkelmann, G., Schmidt, A. & Köst, H.P. (1986) Nitrogen and

sulfur satrvation of the cyanobacterium Synechococcus 6301. An

ultrastructural, morphometrical and biochemical comparasion. Z. Naturforsch.

41c:741-750.

• Watanabe, M.F., Harada, H., Carmichael, W.W. & Fujiki, H. eds. (1996) Toxic

Microcystis. CRC Press, London, 262 pp.

• Watson, S.P., Clements, M.O. & Foster, S.J. (1998) Characterization of the

starvation survival response of Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 180:1750-

1758.

Referências bibliográficas ___________________________________________________________________

90

• Yamada, N., Murakami, N., Kawamura, N. & Sakakibara, J. (1994)

Mechanism of early lysis by fatty acids from axenic Phormidium tenue (musty

odor-producing cyanobacterium) and its growth prolongation by bacteria. Biol.

Pharm. Bull. 17:1277-1281.

• Yamada, Y. (1999) Autoregulatory factors and regulation of antibiotic

production in Streptomyces. In: Microbial signaling and communication. (R.

England, G. Hobbs, N. Bainton & D.L. McRoberts, eds.), pp. 177-196. Society

for General Microbiology, Cambridge University Press, Cambridge, United

Kingdom.

• Yoon, H-S. & Golden, J.M. (1998) Heterocyst pattern formation controlled by a

diffusible peptide. Science 282:935-938.

• Zhang, L., Murphy, P.J., Kerr, A. & Tate, M.E. (1993) Agrobacterium

conjugation and gene regulation by N-acyl-L-homoserine lactones. Nature

(London) 362:446-448.

Anexos ___________________________________________________________________

91

7- Anexos: 7.1 - Meio de cultura utilizado: 7.1.1- Meio ASM-1:

Composição do meio de cultura ASM-1*

Reagentes g/L

_________________________________________________________________________

NaNO3

MgCl2 . 7 H2O

MgSO4. 7 H2O

CaCl2

K2HPO4

Na2HPO4 7H2O

H3BO3

MnCl2 4 H2O

FeCl3 6 H2O

ZnCl2

CoCl2

CuCl2

EDTA Na2

6,80

1,64

1,96

0,88

0,87

1,33

2,48

1,39

1,08

0,335

0,019

0,0014

1,86

________________________________________________________

*pH ajustado para 8,0 com NaOH;

2 ASM-1: dobrar concentração dos reagentes;

ASM-1 sólido: acrescentar 15 g/L de agarose.


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