Download - Curso CG Final
Cromatografia Gasosa
Bruno Carius Garrido Pesquisador-tecnologista em Metrologia e Qualidade
Cromatografia Gasosa
da teoria básica ao desenvolvimento de métodos
Cromatografia Gasosa
Gênese da cromatografia
- Primeiros trabalhos por Runge em 1834 (spot tests), mais tarde Goppelsroeder e Schönbein
- Day (1897-1903) – análises de petróleo por fluxo ascendente em colunas empacotadas
- Tswett (1906-1907) – Separação de pigmentos vegetais em coluna aberta com fase
estacionária
-
- Kuhn (1931), Tiselius (1940), Wilson (1940), Tiselius (1941), Martin & Synge (1941)
- Martin e cols. - 1944 – Cromatografia em papel
- Cremer (1951) - Cromatografia gás-sólido
- James & Martin (1952) – Cromatografia gás-líquido
- Glueckauf (1955) – Primeira equação para a relação entre HETP e tamanho de partícula e
difusão
- Van Deemter e cols. – Desenvolveu a teoria cinética pela simplificação do trabalho de Lapidus
e Ammundson para uma função Gaussiana
Cromatografia Gasosa
O que é cromatografia?
Técnica de separação de componentes de uma mistura baseada
em diferentes graus de interação dos componentes da mistura
com uma fase estacionária e uma fase móvel
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Gasosa
Classificação das técnicas cromatográficas
Pela natureza das fases:
Cromatografia Fase Móvel Fase Estacionária Tipo*
Gasosa (CG) Gás Líquido Gás-líquido
Sólido Gás-sólido
Líquida (CL) Líquido Líquido Líquido-líquido
Sólido Líquido-sólido
Supercrítica (CS) Fluido supercrítico Líquido
Sólido
* Denominações ultrapassadas
Cromatografia Gasosa
Classificação das técnicas cromatográficas
Pelo suporte da fase estacionária:
- Planar:
• Em camada delgada (CCD)
• Em papel (CP)
- Coluna
Pelo fluxo da fase móvel:
- Unidimensional
- Bidimensional
- Radial
Pela natureza da fase móvel (Cromatografia Líquida)
- Fase normal
- Fase reversa
Cromatografia Gasosa
Classificação das técnicas cromatográficas
Pelo tipo de interação responsável pela separação:
- Adsorção
- Partição
- Exclusão
- Complexação (troca iônica)
- Afinidade (imunoafinidade (CIA), bioafinidade)
Pela pressão (Cromatografia em coluna):
- Normal
- Média pressão
- Média pressão (tipo flash)
- Alta pressão (CLAE)
Pelo objetivo da separação:
- Analítica
- Preparativa (ou semi-preparativa)
- Extrativa ou para pré-tratamento da amostra (EFS)
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Gasosa (CG)
- A cromatografia gasosa com o emprego de colunas capilares pode ser denominada
cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR)
Cromatografia Gasosa
Pergunta
Eletroforese é um tipo de cromatografia?
Cromatografia Gasosa
Parâmetros cromatográficos e seus símbolos
Cromatografia Gasosa
Principais parâmetros cromatográficos e seus símbolos
Cromatografia Gasosa
Principais parâmetros cromatográficos e seus símbolos
Cromatografia Gasosa
A resolução cromatográfica
A resolução cromatográfica é o parâmetro cromatográfico de maior importância
Uma resolução igual a 1,5 ou maior garante a
separação em linha de base de dois sinais
cromatográficos, permitindo boas medidas de
área e altura dos sinais.
Cromatografia Gasosa
O desafio da cromatografia:
Ter a resolução adequada no menor tempo
possível!
Cromatografia Gasosa
Equação fundamental da resolução cromatográfica
Eficiência
Seletividade
Retenção
Sem retenção não há
separação! Principal parâmetro
para uma separação
na cromatografia
líquida
Principal parâmetro
para uma separação
na cromatografia
gasosa devido a ser
intrinsecamente
grande
Cromatografia Gasosa
Importância da eficiência em CG
- A cromatografia gasosa de alta resolução produz bandas muito estreitas e de volume
muito baixo – Alta eficiência!
- Isso permite a separação de muitos componentes em tempos de corrida
relativamente baixos
- De maneira geral, a resolução cromatográfica em CG depende menos da
seletividade do que a cromatografia líquida
- Parâmetros que influenciam a seletividade em CG: química da fase estacionária e
temperatura
- Parâmetros que influenciam a seletividade em HPLC: química da fase estacionária,
solvente orgânico na fase móvel, pH da fase móvel, tipo e concentração do tampão
na fase móvel, presença e tipo de reagente de pareamento iônico
Cromatografia Gasosa
Importância da eficiência em CG
HPLC
CG
Bandas em azul com mesma seletividade e fator de retenção similar
Cromatografia Gasosa
Importância da eficiência em CG
HPLC
Bandas em azul com mesma seletividade e fator de retenção similar
CG
Cromatografia Gasosa
Se a seletividade e a retenção são tão semelhantes,
porque a resolução resultante é tão diferente nesses
cromatogramas?
Cromatografia Gasosa
Importância da eficiência em CG
HPLC
Sinais em azul com mesma seletividade e fator de retenção similar
CG
Cromatografia Gasosa
A eficiência é determinante nessa separação!
Mas o que é a eficiência???
Cromatografia Gasosa
Teoria cinética da cromatografia gasosa
Cromatografia Gasosa
Toda separação
cromatográfica resulta na
separação de moléculas de
compostos diferentes, mas
o efeito colateral é uma
leve separação entre
moléculas do mesmo
composto – Fenômeno de
alargamento de bandas
A eficiência é a medida do alargamento das bandas, estamos lembrados?
Cromatografia Gasosa
Alargamento de bandas em cromatografia gasosa
O alargamento das bandas cromatográficas em cromatografia gasosa se deve
principalmente a três efeitos:
- Difusão longitudinal (Ordinary diffusion): Refere-se à difusão que ocorre sempre
que há uma região de alta concentração adjacente a uma região de baixa
concentração. A difusão ocorre no nível molecular, resultando do movimento de
moléculas após a colisão.
- Difusão por turbilhonamento (difusão de eddy): “Efeito dos caminhos múltiplos”.
- Desequilíbrio local (Local nonequilibrium) : Desequilíbrio que ocorre na coluna
devido ao perfil de concentração variável ao qual cada diferente área da coluna está
exposta.
Cromatografia Gasosa
Alargamento de bandas em cromatografia gasosa
Cromatografia Gasosa
Alargamento de bandas em cromatografia gasosa
Cromatografia Gasosa
Alargamento de bandas em cromatografia gasosa
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Gasosa
Difusão de eddy
Cromatografia Gasosa
Efeito de desequilíbrio local
Cromatografia Gasosa
Efeito de desequilíbrio local
Cromatografia Gasosa
Efeito de desequilíbrio local
Cromatografia Gasosa
Efeito de desequilíbrio local
Cromatografia Gasosa
Alargamento de bandas
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Gasosa
- Conhecida como equação de Van Deemter, onde:
λ = constante adimensional característica do empacotamento, sendo menor que
1 para empacotamentos regulares
dp = diâmetro das partículas em centímetros
γ = fator de correção para padrões irregulares de difusão
Dg = difusividade molecular real
u = velocidade linear aparente
k = fator de capacidade
df = diâmetro efetivo de filme na fase líquida
Dl = difusibilidade do soluto na fase líquida
- O primeiro termo corresponde à geometria do empacotamento, o segundo à
difusão longitudinal na fase gasosa e o terceiro ao processo de resistência à
transferência de massa.
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Gasosa
- O termo A é característico do tamanho de partícula e da qualidade do
empacotamento de uma coluna e só pode ser reduzido alterando-se o
empacotamento.
- As colunas capilares permitem a eliminação do termo A, visto que não possuem
múltiplos caminhos para que ocorra a difusão de eddy
Cromatografia Gasosa
- O termo B é uma medida da difusão molecular
- Pode ser reduzido pela redução da difusividade molecular.
- Difusividade molecular - depende da natureza do vapor e da temperatura e pressão do
sistema.
- Maior em gases de baixa massa molecular (H2, He) do que em gases de massa molecular
mais elevada (N2, CO2).
- Considerando apenas isso, escolheríamos esses gases (N2, CO2) para CG.
- Há outros efeitos a considerar – Tipo de detector, viscosidade do gás
- Além disso, esse termo é dividido por u na equação – aumentamos u para reduzir o seu
efeito
- O aumento de u dá mais peso ao termo C – considerar o balanço – depende do tipo de
coluna – maior ou menor resistência à transferência de massa!
Cromatografia Gasosa
A grande vantagem da CGAR
O que faz da CGAR a técnica analítica mais utilizada em química?
Sua altíssima eficiência intrínseca mencionada
anteriormente conseguida pela eliminação do termo A
da equação de van Deemter pelo uso de colunas
capilares!
Cromatografia Gasosa
A grande vantagem da CGAR
Cromatografia Gasosa
FE líquida
SUPORTE Sólido inerte
poroso
Tubo capilar de material inerte
Separação de C14, C15 e C16 (1, 2 e 3) em
coluna empacotada (esquerda) e coluna capilar (direita)
Cromatografia Gasosa
CGAR como Método Analítico
Vantagens
Excelente poder de resolução;
Análise de dezenas de substâncias em uma única amostra;
Alta sensibilidade (10–12 g);
Injeção de pequena quantidade de amostra;
Excelente técnica quantitativa.
Limitações
Análise de substâncias voláteis e termicamente estáveis;
Uso de derivados para obtenção de volatilidade.
Cromatografia Gasosa
Radler & Nunes, 2003
Cromatografia Gasosa
- Sistema cromatográfico – Só é capaz de promover separação!
- Voltando:
Cromatografia Gasosa
Técnicas de introdução de amostras em CG
Cromatografia Gasosa
- Em cromatografia gasosa o coração (ou calcanhar de Aquiles) é a injeção da
amostra pois após a entrada da amostra na coluna, só é possível separá-la – Não se
junta moléculas em um sistema cromatográfico!
- Requisitos iniciais:
• Compostos voláteis
• Termicamente estáveis
- O que fazer se meus compostos de interesse não são voláteis e/ou termicamente
estáveis?
• Injeção na coluna a frio (cold on-column)
• PTV
• Derivatização
Cromatografia Gasosa
- Relembrando volatilidade:
• Massa molecular
- Quanto maior a massa, menor a pressão de vapor
• Interações intermoleculares
- Interações carga-carga > carga-dipolo > ligação hidrogênio > dipolo-dipolo >
dipolo-dipolo induzido > van der Waals
- Lembrar da estereoquímica (E- e Z-) e seu efeito duplo dependendo do tamanho da
molécula.
Cromatografia Gasosa
- Derivatização pode aumentar dramaticamente a volatilidade e a estabilidade de
compostos
- A derivatização mais comum é a sililação – Reagentes mais comuns: MSTFA e
BSTFA
- Existem diversas outras reações de derivatização: Acilação, alquilação, formação
de derivados cíclicos, derivatizações quirais.
- Na prática, o procedimento de derivatização deve visar a substituição de grupos
funcionais mais polares por outros de menor polaridade, reduzindo a força das
interações intermoleculares – Atenção para a massa!
- Uma boa revisão sobre as principais derivatizações usadas em CG está em: Segura
et al., 1998 – J. Chromatogr. B.
Cromatografia Gasosa
Amostragem em CG
- As amostras de interesse podem ser gasosas, líquidas ou sólidas
- Em todos os casos, deve-se garantir uma amostragem representativa e
homogênea
- A coluna suporta apenas amostras gasosas – conversão para líquidos e sólidos
Cromatografia Gasosa
Amostragem em CG - Gases
- Existem diversas formas de se introduzir uma amostra gasosa em CG:
cilindros, bolsas herméticas, seringas herméticas e válvulas
- A amostra pode ser inserida diretamente na coluna ou via injetor convencional
(p.ex.: split/splitless)
- A amostragem de Headspace também é usada para análise do gás sobre uma
amostra líquida ou sólida (voláteis)
Cromatografia Gasosa
Amostragem em CG - Sólidos
- Muito rara - mais comum: solubilização da amostra sólida em solvente
adequado para posterior análise
- A amostragem de sólidos se limita basicamente à análise dos seus voláteis –
Headspace ou análise por vaporização térmica programada
Cromatografia Gasosa
Amostragem em CG - Líquidos
- Forma mais comum de amostragem em CG
- Uso de seringa – Manual ou automaticamente
- Aplica uma pequena alíquota de amostra na forma líquida para posterior
vaporização
- Idealmente: Líquidos voláteis
- Líquidos menos voláteis podem ser usados – on-column e PTV
- A expansão dos líquidos ao passar para o estado gasoso deve ser considerada
- O aquecimento necessário em muitos injetores também deve ser levado em
conta – degradação térmica da amostra
Cromatografia Gasosa
Amostragem em CG – Líquidos – Injeção Manual
- Consiste literalmente na injeção manual com uma seringa
- Duas técnicas principais podem ser usadas: Injeção com agulha fria e injeção
com agulha aquecida
- Basicamente a injeção consiste dos seguintes passos:
• Limpeza da seringa
• Retirada de amostra com volume cuidadosamente medido
• Injeção
Cromatografia Gasosa
Amostragem em CG – Líquidos – Injeção Manual com agulha fria
- Inserir a agulha até o fim no injetor
- Rapidamente pressionar o êmbolo da
seringa para injetar o líquido
- Retirar a seringa
- Vantagem: Injeção rápida
- Desvantagem: Discriminação de
substratos pouco voláteis (condensação na
agulha) e baixa repetitividade.
Analito volátil
Analito pouco volátil
Cromatografia Gasosa
Amostragem em CG – Líquidos – Injeção Manual com agulha aquecida
- Inserir a agulha até o fim no injetor
- Permitir tempo suficiente para que a
agulha seja aquecida (3 – 5 s)
- Rapidamente pressionar o êmbolo da
seringa para injetar o líquido
- Aguardar cerca de 15 – 20 s e retirar a
seringa
- Vantagens: Injeção muito reprodutível e
praticamente sem discriminação dos pouco
voláteis
- Desvantagem: Injeção demorada
Analito volátil
Analito pouco volátil
Cromatografia Gasosa
Amostragem em CG – Líquidos – Técnica de Air Gap ou lacuna de ar
- Usada para evitar a discriminação de substratos pouco
voláteis
- Sugar amostra acima do volume pretendido e devolver até o
mesmo
- Após retirar a alíquota de amostra do vial, preenchemos a
seringa com ar (2 vezes o volume de amostra)
- Promover a injeção com agulha fria ou aquecida
- Vantagens: Evita a perda de voláteis antes da injeção, evita a
discriminação e ajuda a promover a transferência completa
de amostra: repetitividade melhorada
Cromatografia Gasosa
Amostragem em CG – Líquidos – Técnica de Solvent flushing ou
lavagem com solvente
- Usada para evitar a discriminação de substratos polares
- Sugar solvente, ar, amostra e mais ar
- Promover a injeção com agulha fria ou aquecida
- Vantagens: Todas da injeção com lacuna de ar. Evita
discriminação de substratos polares que estejam adsorvidos
no vidro ou na agulha.
Cromatografia Gasosa
Sistemas de Injeção
- Promover propriamente a introdução da amostra na coluna
- O tipo mais antigo de injeção em CGAR é a injeção com divisão de fluxo
(Split)
- Outro tipo muito comum (geralmente associado) é a vaporização sem divisão
de fluxo (Splitless)
- Outros tipos também muito comuns são a vaporização com temperatura
programada (PTV) e a injeção na coluna a frio (cool on-column)
Cromatografia Gasosa
O injetor split/splitless
- Bloco metálico aquecido com 3 entradas e 3 saídas (basicamente)
- Revestido com um tubo de vidro chamado encamisamento de vidro (liner) –
proteger a amostra de degradação em contato com o metal aquecido
Coluna Seringa
Septo Purga do septo
Entrada de Gás Saída do divisor de fluxo
Encamisamento de vidro
Câmara de vaporização
Cromatografia Gasosa
O injetor split/splitless
- Permite fazer injeções com divisão de fluxo (Split) e sem divisão de fluxo
(Splitless)
- O que determina o tipo de injeção a ser feita é a natureza da amostra
Cromatografia Gasosa
A injeção com divisão de fluxo (Split)
- É a forma mais antiga de
introdução de amostras em
colunas capilares
- Volume de vapor gerado no
injetor – geralmente da ordem de
0,5 a 1 mL
- Fluxo na coluna da ordem de 1
mL/min
- Efeito de alargamento no tempo
- Usa-se a divisão de fluxo para
evitar esse alargamento
Coluna
Divisor de fluxo
1 minuto para
esvaziar o injetor
Cromatografia Gasosa
A injeção com divisão de fluxo (Split)
Coluna (1 mL/min)
Divisor de fluxo (10 mL/min)
5,45 segundos para
esvaziar o injetor!
Cromatografia Gasosa
A injeção com divisão de fluxo (Split)
Pergunta:
Um equipamento de CG sabe medir fluxo de gás?
Resposta:
Não!
Cromatografia Gasosa
A injeção com divisão de fluxo (Split)
- O que determina o fluxo de gás de arraste na coluna é a diferença de pressão
entre a cabeça da coluna (no injetor) e o detector – Importante informar o
detector e dimensões da coluna corretamente!
Ex.:
- Coluna de 0,25 mm DI e 30 m para fluxo 1 mL/min a 140°C, P = 16,5 psi
- Coluna de 0,32 mm DI e 30 m para fluxo de 1 mL/min a 140°C, P = 7,6 psi
- Se uso uma coluna de 0,32 mm DI e informo para o equipamento que é uma
0,25 mm DI, tento colocar 1 mL/min na coluna mas terei 2,7 mL/min!
- A mesma consideração vale para o comprimento da coluna – Medir!
- Como medir a coluna: lembrar da geometria! Circunferência = 2.π.r
Cromatografia Gasosa
A injeção com divisão de fluxo (Split)
- Desvantagem imediata: Perda de sensibilidade – Joga mais amostra pra fora do
que pra dentro do sistema
- Necessidade de pré-concentração da amostra
- A princípio esse tipo de injeção não é recomendado para análise de traços
- Vantagem imediata: Forma mais rápida de transferência de uma amostra para a
coluna em CGAR – Sinais mais estreitos
- Discriminação e divisão não linear – Sempre manter o injetor extremamente
limpo!
- Troca de septos a cada 30-50 injeções, liner a cada 100 injeções e limpeza do
corpo do injetor a cada 200 injeções (sempre que abaixar a temperatura – liner e
septo)
Cromatografia Gasosa
A injeção sem divisão de fluxo (Splitless)
- Desenvolvida por acaso por Grob em 1969
- Análise de uma mistura de esteróides em split
- Grob esqueceu-se de abrir a válvula no momento da injeção e abriu mais tarde –
Cromatograma com sinais grandes e bem formados para uma amostra muito
diluída
Cromatografia Gasosa
A injeção sem divisão de fluxo (Splitless)
- A estrutura do injetor é exatamente a
mesma do split
- A injeção é feita com o divisor de fluxo
totalmente fechado
- A amostra só pode ir para a coluna
- Após um curto período (chamado de
tempo de amostragem; geralmente de
30-60 s), a válvula é totalmente aberta –
limpar o injetor
- Alargamento no tempo vai acontecer
- Alargamento no espaço pode acontecer
Coluna
Divisor de fluxo
Cromatografia Gasosa
A injeção sem divisão de fluxo (Splitless)
- Alargamento no tempo – Devido simplesmente ao grande tempo que se leva
para transferir a amostra do injetor para a coluna
- Alargamento no espaço – Efeito de alagamento com amostra líquida de uma
parte da coluna – analitos se espalham no solvente
- A injeção em splitless requer o uso de um mecanismo de reconcentração
(focalização) de amostra
- Os mais usuais: Efeito de solvente e captura a frio
- É a técnica de injeção mais comum para análise de traços em matrizes
complexas
Cromatografia Gasosa
Técnicas de reconcentração – Captura a frio
- A técnica da captura a frio é usada para analitos pouco voláteis
- Temperatura do forno ~ 90°C abaixo do PE do analito e ~ 40°C acima do PE
do solvente
- Na coluna o solvente permanecerá no estado gasoso, sendo carreado
- O analito passará para o estado líquido sendo capturado pela fase móvel
- Após algum tempo (1,5 – 2 min) inicia-se a rampa de temperatura do forno
para eluição dos analitos
Cromatografia Gasosa
Técnicas de reconcentração – Efeito de solvente
- Requer o uso de uma lacuna de retenção (retention gap)
- Temperatura do forno ~ 30°C abaixo do PE da amostra (solvente + analitos)
- Toda a amostra será condensada rapidamente na saída do injetor –
alargamento no espaço
- Redução drástica de volume – cerca de 100 x menor – Acelera a saída da
amostra do injetor
- Nunca fazer isso na coluna! Usar lacuna de retenção
Cromatografia Gasosa
Técnicas de reconcentração – Efeito de solvente
- Assim como na captura a
frio, começa-se a
programação de
temperatura
- O solvente começa a
evaporar, concentrando os
analitos
- Ao chegar na fase
estacionária, os analitos
estão concentrados e
prontos para serem
eluídos
Coluna Lacuna
FE
Amostra
Gás de arraste
Gás de arraste
Gás de arraste
Gás de arraste
Cromatografia Gasosa
Técnicas de injeção - Splitless
- Tanto na injeção com divisão de fluxo quanto na injeção sem divisão é
possível realizar uma injeção pulsada (pulsed split ou pulsed splitless)
- Aplica-se um pulso de pressão (cerca de 3 x a pressão normal) durante a
injeção a fim de acelerar a saída da amostra do injetor
- Essa técnica aumenta a sensibilidade da análise e gera picos muito mais
estreitos e simétricos
- O efeito é sentido muito mais fortemente na injeção em splitless pois no split
a saída da amostra do injetor já é rápida
Cromatografia Gasosa
Técnicas de injeção – Liners para split e splitless
Cromatografia Gasosa
Técnicas de injeção – Cool on column – Injeção na coluna a frio
- Apesar de serem os mais utilizados, os injetores split/splitless possuem a
desvantagem de necessitarem da volatilização da amostra em alta
temperatura – Degradação térmica das amostras
- Para os casos de analitos termolábeis, pode-se utilizar a injeção na coluna a
frio (cool on-column)
- É o único tipo de injetor onde a amostra não precisa passar por uma câmara
adicional, sendo depositada diretamente na porção inicial da coluna
- Além da degradação, evita problemas de discriminação
- Toda a amostra atinge a coluna – Principal vantagem, mas também principal
desvantagem
Cromatografia Gasosa
Técnicas de injeção – Cool on column – Injeção na coluna a frio
- Os injetores on-column
podem ter um septo ou
uma válvula de
isolamento
- Abaixo, encontra-se a
coluna
- A seringa especial com
agulha de pequeno
diâmetro é inserida pelo
guia de agulha, até a parte
interna da coluna
- As seringas com agulha
de metal podem ser
usadas manualmente ou
com autoamostradores
para colunas com DI de
0,53; 0,32 ou 0,25 mm
Cromatografia Gasosa
Técnicas de injeção – Cool on column – Injeção na coluna a frio
- A injeção na coluna a frio é a mais repetitiva e reprodutiva entre as diferentes
injeções para CG
- Geralmente a temperatura do injetor é controlada juntamente com a temperatura do
forno
- Por ser uma injeção que não sofre de discriminação, pode ser usada como controle
na otimização de outras técnicas
- Assim como na injeção em splitless, é necessário que se use um mecanismo de
reconcentração da amostra devido ao alargamento no espaço
Cromatografia Gasosa
Técnicas de injeção – Vaporização com temperatura programada - PTV
- Desenvolvido no fim da década de 1970, baseado no injetor splitless
- O injetor splitless apresenta suas maiores desvantagens devido ao fato de ser um
injetor aquecido
- O injetor PTV permite a injeção de amostras em split ou splitless com o corpo do
injetor resfriado
- É considerado o mais versátil dos injetores em CG
- Permite a injeção de grandes volumes de amostra (até 100 µL)
Cromatografia Gasosa
Técnicas de injeção – Vaporização com temperatura programada - PTV
- A estrutura do injetor é muito
semelhante à de um
split/splitless, exceto pela
entrada adicional de gás de
resfriamento (Ar, CO2 ou
N2(l))
- O corpo do injetor, assim
como os liners tem massa
menor, para permitir seu
rápido resfriamento/
aquecimento
- O injetor pode operar nos
modos de split/splitless a
quente, split/splitless a frio ou
splitless a frio para grandes
volumes
Cromatografia Gasosa
Técnicas de injeção – Vaporização com temperatura programada - PTV
- Para split/splitless a quente, a operação é exatamente igual à do injetor clássico
- A injeção split/splitless a frio pode ser vantajosa para transferência de compostos
termicamente instáveis
- Nesse caso, a amostra é depositada no liner como um líquido, evitando a
evaporação imediata do solvente, sendo então aquecida em uma taxa programada
para sua transferência para a coluna de maneira similar ao split/splitless clássico
- Essa injeção reduz/elimina os problemas de discriminação na agulha
- O aquecimento controlado da amostra reduz os problemas de degradação térmica
Cromatografia Gasosa
Técnicas de injeção – Vaporização com temperatura programada - PTV
- A injeção splitless a frio para grandes volumes é a grande inovação do PTV
- Nesse tipo de injeção, um grande volume (até 100 µL) é inserido no injetor (todo
de uma vez ou em várias pequenas injeções) a frio com a purga do split aberta
- Geralmente se utiliza um liner empacotado a fim de suportar melhor a grande
quantidade de líquido
- Utiliza-se uma temperatura na qual haja evaporação do solvente, mas não dos
analitos
- Após a evaporação de cerca de 95% do solvente a purga do split é fechada para
promover a transferência do material para a coluna em temperatura programada
- Assim como no splitless, após algum tempo a purga é aberta novamente para
limpar o injetor
- As mesmas considerações de alargamento e reconcentração que se aplicam ao sless
Cromatografia Gasosa
Técnicas de injeção – Vaporização com temperatura programada - PTV
- Como o PTV promove uma injeção a frio que também utiliza um liner, oferece
várias vantagens: ideal para misturas com ampla faixa de ebulição, injeção de
grandes volumes e grande versatilidade
- A grande versatilidade é também a maior desvantagem: o PTV é de longe o injetor
mais complexo para CG
- Existe menos informação na literatura sobre o uso do PTV e o equipamento tem
maior custo
Cromatografia Gasosa
Colunas capilares em CG – fases estacionárias e outros parâmetros
Cromatografia Gasosa
Colunas capilares em CG
- Marcel Golay é considerado o inventor das colunas capilares, após seus trabalhos
nas décadas de 1950 e 1960. As colunas propostas por ele foram chamadas de
WCOT (Wall Coated Open Tubular)
- As colunas capilares (ou tubulares abertas) de sílica fundida (FSOT) foram
introduzidas em 1979
- Esse desenvolvimento, em conjunto com a criação de novas fases estacionárias
quimicamente ligadas específicas para colunas de sílica contribuíram para sua larga
aceitação
- Após a introdução das mesmas, houve um rápido declínio no uso de colunas
empacotadas em CG
- Diversas são as vantagens das colunas capilares: separações com resolução muito
maior, tempo de análise reduzido, necessidade de menor volume de amostra e
menores limites de detecção
Cromatografia Gasosa
Colunas capilares em CG
- As colunas capilares
modernas são capazes de
resolver misturas de mais de
1000 componentes
- A escolha da coluna ideal
para o trabalho a ser
realizado deve levar em
conta os seguintes fatores:
fase estacionária, diâmetro
interno, espessura de fase e
comprimento da coluna
- Quanto menor o diâmetro
interno, maior a eficiência da
coluna
Cromatografia Gasosa
Colunas capilares em CG
- A consideração prática para escolha do diâmetro interno é que a capacidade da
coluna diminui com a diminuição do diâmetro, ou seja, amostras muito
concentradas necessitam de colunas de maior diâmetro
- Para amostras complexas – usar sempre o menor diâmetro possível
- Ao usar colunas de grande diâmetro com EM, atenção ao fluxo
- As colunas de 0,10 mm DI podem gerar a mesma resolução em um tempo muito
menor – a pressão será muito maior
Cromatografia Gasosa
Colunas capilares em CG
- Quanto à espessura de filme:
• Maior espessura, aumenta a capacidade da coluna e a retenção – maior tempo de
análise
• Quanto maior a espessura de filme, menor a eficiência da coluna
• Exceção, compostos muito voláteis podem ter baixa resolução com filmes muito
finos
• Quanto menor a espessura do filme, menor será a temperatura de eluição dos
compostos, logo filmes finos se aplicam bem a compostos pouco voláteis
Cromatografia Gasosa
Colunas capilares em CG
- Quanto ao comprimento da coluna
• Deve-se ter em mente que a resolução é proporcional à raiz quadrada do número de
pratos teóricos (ou tamanho) da coluna
• Dobrar o tamanho de uma coluna aumenta em 1,4 x a resolução, mas dobra o tempo
de análise
Cromatografia Gasosa
Colunas capilares em CG
- Seleção da fase móvel:
• O nitrogênio é o gás de arraste que
pode, teoricamente, gerar a melhor
eficiência cromatográfica
• O uso do nitrogênio, entretanto
requer velocidades lineares muito baixas,
sacrificando o tempo de análise
• O gás com a melhor relação velocidade/eficiência é o hidrogênio
• Por ser um gás muito perigoso e, no passado, incompatível com EM, o gás mais
utilizado é o He
Cromatografia Gasosa
Colunas capilares em CG - Escolha da fase estacionária
• A escolha da fase estacionária é muito menos importante em CG (existem menos de
100 fases diferentes) do que em CLAE (centenas de fases)
• Ainda assim, a escolha da fase estacionária é um dos principais fatores que
influenciam a seletividade em CG
• Para a separação em CG, deve-se usar a regra “semelhante dissolve semelhante”, ou
seja, escolhemos uma fase que “dissolva” os analitos
• Importante: Muita interação em CG é ruim!
• Importante 2: Fases polares em geral têm menor eficiência e estabilidade
Cromatografia Gasosa
Colunas capilares em CG
- Usar sempre a fase estacionária mais apolar capaz de promover a separação
desejada
- Fases apolares são mais resistentes a água, oxigênio e outros oxidantes
- Fases apolares são mais inertes, sangram menos e têm melhor eficiência
- Nas fases apolares a separação ocorre basicamente pelos pontos de ebulição.
Aumentar o conteúdo de fases trifluoropropil, cianopropil ou fenil gera mais
interações dipolares
- As separações de compostos que têm diferentes forças para realizar ligações
hidrogênio como os álcoois, aldeídos, aminas e ácidos geralmente são melhores em
colunas com fase estacionária de poli-etilenoglicol ou semelhantes
Cromatografia Gasosa
Colunas capilares em CG
- Na prática, cerca de 90% das análises em CG podem ser feitas utilizando-se uma
coluna 100% poli-dimetilsiloxano ou 5% fenil, 95% poli-dimetilsiloxano
- Os polisiloxanos são as fases estacionárias mais utilizadas em CG, devido à sua alta
estabilidade química e térmica e por oferecerem excelente difusividade aos solutos
- Estrutura do 100% poli-dimetilsiloxano:
- Os polisiloxanos substituídos podem ser representados:
- Onde os R´s podem ser CH3, fenil, CH2CH2CF3 ou
CH2CH2CH2CN e “x” e “y” representam o percentual de
uma unidade de repetição no polímero
- Ex: DB-1301 (6% cianopropilfenil–94% dimetilpolisiloxano, R1 = CH2CH2CH2CN,
R2 = fenil, R3 e R4 são metilas; X = 6% e Y = 94%
Cromatografia Gasosa
Colunas capilares em CG
- Após os polisiloxanos, as fases mais comuns são os polietilenoglicóis de estrutura
geral:
- Disponíveis em diversas massas moleculares com denominações como Carbowax,
FFAP, etc.
- São as fases ideias quando se necessita de uma seletividade alternativa, além de
ideais para separação de álcoois, aminas, ácidos etc.
- Sua principal desvantagem é a instabilidade térmica – temperaturas máximas na
faixa de 225°C
- Além disso, água e oxigênio podem ser prejudiciais
Cromatografia Gasosa
Colunas capilares em CG - Fases recomendadas para diferentes aplicações:
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Gasosa
Detectores em CG
Cromatografia Gasosa
Detectores em CG – Propriedades iniciais
- Características de ruído – Ruído químico, ruído
elétrico
- O ruído é calculado como a média entre o ponto mais
baixo e mais alto da linha de base em um período de
tempo
- Há diferentes tipos de ruído: ruído rápido (curta
duração), ruído de longa duração e deriva
- O ruído rápido é de alta frequência (maior do que
àquela do sinal de interesse), enquanto o ruído de
longa duração é exatamente o oposto
- A deriva é a inclinação do envelope de ruído em
função do tempo, sendo normalmente causada por
sangramentos e outros problemas semelhantes
Cromatografia Gasosa
Detectores em CG – Propriedades iniciais
- Uma das características mais observadas na detecção cromatográfica é a relação
sinal-ruído – Representa a probabilidade de que um pico em uma linha de base
ruidosa represente um sinal de analito
- Uma razão sinal-ruído de 2 indica probabilidade de 95%, enquanto uma relação
S/R = 2,65 indica probabilidade de 99%
Cromatografia Gasosa
Detectores em CG – Propriedades iniciais
- Como estimar a relação S/R:
1 – Definir o envelope de ruído (entre L1 e L2)
2 – Identificar o ruído médio (C)
3 – Medir a altura do pico (S2: de C a D2)
4 – Calcular a relação
Para um sinal ruidoso (S1), deve-se calcular
uma altura média (D1)
Cromatografia Gasosa
Detectores em CG – Propriedades iniciais
- Sensibilidade: quanto o sinal varia para dada variação de massa – Geralmente dada
pela inclinação da curva de calibração – Não confundir com capacidade de detecção
– Tem a unidade da resposta do detector por unidade de concentração ou massa (ex:
mV/pg)
- Limite de detecção – Expressa a capacidade de detecção – Geralmente corresponde
à concentração capaz de gerar um sinal com relação S/R = 3, ou seja, é a
concentração na qual o detector é capaz de dar uma resposta com 99% de
probabilidade de um pico representar um sinal da amostra
- Faixa dinâmica – Faixa que vai do LD até a concentração na qual um aumento na
concentração não promove aumento de sinal – Sua faixa mais relevante é a faixa
linear que é a faixa na qual a sensibilidade (inclinação) é constante
- Detectores universais, seletivos e específicos
Cromatografia Gasosa
Detectores em CG – Propriedades iniciais
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Gasosa
Detectores em CG – Detector de condutividade térmica (DCT ou TCD)
- Detector universal e não destrutivo
- Baseia-se na medição de diferença na
condutividade térmica entre uma célula
analítica e uma célula de referência
- A passagem de um composto pela célula
de referência causa uma alteração na
condutividade térmica, desbalanceando a
ponte de Wheatstone
- Um potenciômetro refaz o balanceamento
da ponte e a corrente necessária será
traçada no cromatograma, gerando um
sinal
Cromatografia Gasosa
Detectores em CG – Detector de condutividade térmica
- Características:
• Detectabilidade mínima (LD): 10-9 g (1 ng)
• Resposta: Universal
• Linearidade: 104 (limitada)
• Estabilidade: Moderada
• Limite de temperatura: ~400°C
• Gases: Carreador (geralmente Hélio) e Makeup: O mesmo do carreador
Cromatografia Gasosa
Detectores em CG – Detector de ionização por chamas (DIC ou FID)
- Detector seletivo e destrutivo
- Baseia-se na criação de íons pela queima
de um composto hidrocarbônico em uma
chama neutra
- A criação dos íons permite a passagem de
corrente elétrica entre dois eletrodos (o
Jet e o eletrodo coletor), gerando um sinal
elétrico que é traçado no cromatograma
- É o detector mais usado em CG
Cromatografia Gasosa
Detectores em CG – Detector de ionização por chamas
- Características:
• Detectabilidade mínima (LD): 10-11 g (10 pg)
• Resposta: Somente para compostos contendo carbono orgânico (o sinal é reduzido
de acordo com a presença de átomos eletronegativos)
• Linearidade: 107 (faixa linear muito ampla)
• Estabilidade: Excelente
• Limite de temperatura: ~400°C
• Gases: Carreador (Hélio ou Hidrogênio), mistura combustível e comburente (ar e
hidrogênio) e Makeup: (hélio ou nitrogênio)
Cromatografia Gasosa
Detectores em CG – Detector de ionização por chamas (DIC ou FID)
- Compostos que geram pouca ou nenhuma resposta no FID:
- A otimização dos fluxos de gás é importante:
- Makeup deve ser aproximadamente igual a hidrogênio +
carreador
Cromatografia Gasosa
Detectores em CG – Detector de captura de elétrons (DCE ou ECD)
- Detector seletivo e destrutivo
- Uma fonte radioativa (63Ni) emite partículas β:
- Esses elétrons de baixa energia colidem com o gás
de arraste, liberando elétrons de mais alta energia:
- Esse fluxo de elétrons gera uma corrente entre o
corpo do detector e eletrodo coletor
- A passagem de um analito muito eletronegativo
(com poder de capturar elétrons – halogenado)
gera uma redução nessa corrente produzindo um
sinal negativo que é invertido para a saída em
forma de cromatograma
Cromatografia Gasosa
Detectores em CG – Detector de captura de elétrons (DCE ou ECD)
- Características:
• Detectabilidade mínima (LD): 10-13 g (0,1 pg)
• Resposta: Altamente seletivo para compostos contendo átomos eletronegativos
(especialmente halogenados)
• Linearidade: 103 - 104 (faixa linear bem limitada)
• Estabilidade: Razoável – Suscetível a vazamentos no corpo do detector e a
impurezas nos gases
• Limite de temperatura: ~400° C (com emissor 63Ni) ou 220° C (com 3H)
• Gases: Carreador (Hélio ou Hidrogênio), Makeup: (nitrogênio ou 5% de metano
em argônio) – Todos os gases devem ser ultrapuros
Cromatografia Gasosa
Detectores em CG – Detector de nitrogênio e fósforo (DNP ou NPD)
- Detector seletivo e destrutivo
- Construção muito similar ao DIC – Também pode
ser chamado de TSD (ou DTE)
- Acima do jet é colocada uma pérola de rubídio
silicato envolta em uma resistência
- Quando aquecida, essa pérola emite elétrons
termo-iônicos que formam o sinal de fundo
- O fluxo de H2 usado é muito menor do que em um
FID e é insuficiente para sustentar uma chama, o
que se forma na verdade é um plasma que passa
pela pérola aquecida
- Esse plasma, em contato com a pérola aquecida,
promove a combustão parcial dos efluentes da
coluna
- Os produtos de combustão parcial contendo
nitrogênio e fósforo são adsorvidos na pérola,
fazendo com que aumente a densidade de elétrons
produzidos pela mesma, gerando o sinal
cromatográfico
Cromatografia Gasosa
Detectores em CG – Detector de nitrogênio e fósforo (DNP ou NPD)
- Características:
• Detectabilidade mínima (LD): 10-11 g (10 pg)
• Resposta: Seletivo para nitrogênio e fósforo
• Linearidade: 106 (faixa linear ampla)
• Estabilidade: Excelente, desde que as temperaturas e fluxos de gases sejam bem
controlados. A pérola tende a se degradar com o tempo e o sinal será reduzido
• Limite de temperatura: ~400° C
• Gases: Carreador (Hélio ou Hidrogênio), mistura combustível e comburente (ar e
hidrogênio) e Makeup: (hélio ou nitrogênio)
Cromatografia Gasosa
Detectores em CG – Espectrômetro de massas
- O espectrômetro de massas opera sob vácuo
- Existem diferentes fontes de ionização (EI, CI, APGC) e diferentes analisadores
(Quadrupolo, setor magnético, TdV, ion trap 3D, QqQ...)
- Cada combinação fonte-analisador é um sistema diferente
- O EM não é somente um “detector” para cromatografia, sendo a própria
espectrometria de massas uma área muito ampla
- Nesse curso: abordagem extremamente simples limitada a características simples
- Usado como detector para CG pode ser universal ou seletivo e é destrutivo
Cromatografia Gasosa
Detectores em CG – Espectrômetro de massas
- Características:
• Detectabilidade mínima (LD): 10-12 g (1 pg) em SIM e 10-9 (1 ng) em SCAN
(quadrupolo simples – detectabilidade pode ser menor com outro analisador)
• Resposta: Universal (podendo ser seletivo com SIM)
• Linearidade: 106 (Faixa linear ampla)
• Estabilidade: Excelente
• Limite de temperatura: ~350° C na linha de transferência e na fonte
• Gases: Para EI – nenhum; CI – metano ou amônia
Cromatografia Gasosa
Detectores em CG
- Temperatura do detector:
- A temperatura de qualquer detector sempre deve ser cerca de 15-20 °C acima da
temperatura máxima de coluna usada no método – evitar a condensação
- A chama de um FID nunca deve ser acesa em temperaturas menores que 100 °C
(recomendável 150 °C) – evitar formação de vapor d’água no detector
Cromatografia Gasosa
Análise de dados e técnicas de
quantificação em CG
Cromatografia Gasosa
Técnicas de análise e quantificação em CG
- Técnicas gerais da química analítica e outras mais específicas:
- Padronização externa
- Padronização interna
- Diluição isotópica
- Normalização de áreas
- Normalização de áreas com fator de resposta
- Adição padrão
Cromatografia Gasosa
Normalização de áreas
- É a técnica de quantificação mais simples usada em cromatografia
- Não requer o uso de padrões
- Pode ser usada com quantidade de amostra desconhecida – resultado relativo
- Resultados pouco dependentes das condições de CG
- Desvantagens: Não aplicável a todas as amostras, deve ser checada por análises
independentes, todos os componentes têm que dar picos, e todos teriam que ter o
mesmo fator de resposta
Cromatografia Gasosa
Normalização de áreas com fator de resposta
- Na verdade é como uma correção da normalização de áreas simples com melhor
exatidão
- Não requer o uso de padrões caso os Rw sejam conhecidos – se desconhecidos será
necessária uma calibração
- Pode ser usada com quantidade de amostra desconhecida – resultado relativo
- Resultados pouco dependentes das condições de CG – inclusive fatores de resposta
- Desvantagens: Não aplicável a todas as amostras, deve ser checada por análises
independentes, todos os componentes têm que dar picos.
Cromatografia Gasosa
Padronização externa
- Consiste na comparação de uma amostra problema com uma amostra controle com
concentração conhecida
- Requer o uso de um padrão para preparo do controle – pode ser feita uma curva de
calibração – recomendado!
- A quantidade de amostra deve ser conhecida
- Resultados totalmente dependentes das condições de CG – Amostra e controles
devem ser analisados em sequência – exatidão muito melhor do que normalização
- Só o pico do composto de interesse é necessário
- Desvantagens: massa (ou volume) de amostra deve ser conhecida, calibração é
recomendada para maior exatidão, condições de CG devem ser constantes e se
houverem muitos componentes a calibração pode ser cara e trabalhosa
Cromatografia Gasosa
Padronização externa
- Cálculos com padronização simples (admitindo volume ou massa igual entre
amostra e controle):
- Cálculos usando curva de calibração
Considerando o modelo de regressão:
y = b0 + b1x
Cromatografia Gasosa
Padronização interna
- Consiste na comparação da resposta de um componente de interesse com um
padrão adicionado à própria amostra
- Requer o uso de um padrão para preparo – padrão interno também pode ser usado
como correção do preparo da amostra
- A quantidade de amostra não precisa ser conhecida
- Resultados independentes das condições de CG
- Só o pico do composto de interesse e do PI são necessários
- Pode ser associada a uma calibração – um dos melhores métodos de quantificação
em CG
- Desvantagens: Padrão interno deve ter propriedades particulares, pode ter custo
elevado para muitas amostras
Cromatografia Gasosa
Padronização interna
- Cálculos com padronização simples:
- Associada à calibração – construir uma curva de calibração conforme feito para a
padronização externa e adicionar o padrão interno na mesma concentração em
todos os pontos da curva e nas amostras problema
- A curva de calibração deve ser construída com concentração do analito no eixo “x”
e razão de áreas do analito/padrão interno no eixo “y”
- Para interpolar a amostra problema, usar a sua razão analito/padrão interno
- O padrão interno corrige pequenos desvios ocorridos no preparo de amostras
Cromatografia Gasosa
Padronização interna
- Ex.: Análise de soro: Alíquota de soro – adição de padrão interno – adição de
solvente para precipitação de proteínas – centrifugação – separação do
sobrenadante – evaporação – derivatização – análise por CG-EM
- Imaginando uma curva de calibração:
Dados:
Conc. Aanalito API A/PI
5 1450 2000 0,73
10 2110 1800 1,17
15 3400 2000 1,70
20 1980 1000 1,98
30 5880 1900 3,09
Cromatografia Gasosa
Diluição isotópica - Considerada um caso especial da padronização interna na qual o padrão interno é
um isotopômero do analito
- Pode ser usada exatamente como a padronização interna: de forma simples ou
associada à calibração
- Resultados muito mais exatos – Só pode ser usada com EM
- Pode ser usada na abordagem da correspondência exata (Exact Matching
Approach)
- Nessa abordagem, preparam-se amostras controle fortificadas com o analito e o
padrão interno e estima-se a concentração da amostra problema
- Repete-se o preparo das amostras controle aproximando-se cada vez mais a sua
concentração da concentração da amostra problema até que se tornem
indistinguíveis
Cromatografia Gasosa
Diluição isotópica
Cromatografia Gasosa
Diluição isotópica - Para controles a amostras problema indistinguíveis aplica-se a seguinte equação:
Cromatografia Gasosa
Diluição isotópica
- Principais cuidados:
- O padrão interno deve ter tempo de equilibrar-se com a amostra
- Avaliar a interferência (seletividade) de ambos compostos (nativo e marcado) entre
si
Cromatografia Gasosa
Testosterone in Serum - 2.4 ng/g Spike
31
2
6
4
5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
0.5 1.5 2.5 3.5 4.5 5.5 6.5
ng
/g
1 - Matrix Standards
Isotopic Internal
Standardisation
2 - Matrix Standards
Non-isotopic Internal
Standardisation
3 - Matrix Standards
External Calibration
4 - Solvent Standards
Isotopic Internal
Standardisation
5 - Solvent Standards
Non-isotopic Internal
Standardisation
6 - Solvent Standards
External Calibration
Gravimetric Value
17%U
Work undertaken by Chris Mussell and Anna Pardos-Pardos Dados de O´Connor et al., 2012
Cromatografia Gasosa
Adição Padrão
- Método de quantificação usado quando há necessidade de preparo dos controles
em matriz e não há matriz “branca” disponível
- Ex.: Quantificação de testosterona em urina
- Prepara-se uma curva de calibração com a adição de concentrações conhecidas do
analito incluindo o ponto “zero” – sem adição
- É necessário que a faixa de concentrações estudadas exiba resposta linear
- Após a construção da curva, determina-se a concentração original por extrapolação
Cromatografia Gasosa
Adição Padrão
- A extrapolação é feita até a intercessão da curva com o eixo “x”
- Matematicamente, define-se y = 0
- Obtém-se um resultado negativo – inverte-se o sinal = concentração original na
matriz
Cromatografia Gasosa
Considerações importantes:
Análises quantitativas devem sempre que possível usar replicatas verdadeiras (3 ou
mais)
Ao construir qualquer curva de calibração, deve-se colocar todas as replicatas de cada
nível de concentração na curva, NUNCA usar o valor médio
Nunca forçar uma curva de calibração a passar pela origem
Cromatografia Gasosa
Análise qualitativa
- O tempo de retenção simplesmente não pode ser usado como critério para a
conclusão da identidade de uma substância em cromatografia
- Para dar suporte a esse tipo de conclusão: análise em diferentes fases estacionárias
(pelo menos 2)
- Análise com co-eluição
- Combinação de ambos
- Emprego de detectores seletivos
- Emprego de detectores que produzam informação estrutural (EM; EM-EM –
quanto mais seletivo, melhor)
Cromatografia Gasosa
Análise qualitativa
- Importante: Lembrar-se sempre da química básica – enantiômeros só podem ser
separados em meio quiral – espectros de massas são idênticos
- Exemplos de critérios de identificação qualitativa de um composto
- Controle de dopagem: tR na amostra não pode diferenciar em mais do que 0,01 min
ou 2% de urina de referência
- Também pode ser usada a massa acurada para dar suporte às conclusões
Cromatografia Gasosa
Análise qualitativa
- Para análises de alimentos e outras no âmbito da 2002/657/CE
- Pontos de identificação – mínimo para um positivo = 4 pontos
Cromatografia Gasosa
Guia prático para o
desenvolvimento de métodos
Cromatografia Gasosa
Guia prático para o desenvolvimento de métodos
- Principal objetivo do desenvolvimento de métodos em CG: obter a resolução
adequada no menor tempo possível
- O procedimento aqui apresentado parte do princípio que a amostra é totalmente
desconhecida
- Protocolo disponível em Radler & Cardoso – Química Nova 11(2) – 1988
Cromatografia Gasosa
Guia prático para o desenvolvimento de métodos
- Condições preliminares:
- Recomendável usar uma lacuna de retenção (amostra totalmente desconhecida) –
focalização da amostra, mas principalmente proteger a coluna de compostos não
voláteis
Cromatografia Gasosa
Guia prático para o desenvolvimento de métodos
- Condições preliminares:
- Usar injeção com divisão de fluxo:
Apesar de não ser o método de injeção mais recomendado para análise de traços e
para substâncias termolábeis, evita a sobrecarga da coluna e sua contaminação com
susbtâncias pouco voláteis
- Usar fase estacionária apolar:
Reduz a possibilidade de retenção de compostos muito funcionalizados, além de
permitir relacionar a ordem de eluição ao ponto de ebulição dos compostos. Também
são fases mais estáveis termicamente – preferência por polimetilsiloxanas
imobilizadas
Cromatografia Gasosa
Guia prático para o desenvolvimento de métodos
- Condições preliminares:
- Comprimento, diâmetro interno e espessura de filme da coluna:
• Comprimento de 10 a 20 m
• Diâmetro interno entre 0,25 e 0,35 mm (usual 0,25 ou 0,32 mm)
• Espessura de filme entre 0,1 e 0,5 µm (depende da concentração esperada)
• Para uma amostra totalmente desconhecida, usar coluna curta (10 ou 15 m), com
diâmetro 0,25 mm e espessura de filme de 0,15 µm ou mais – minimizar a retenção
– análise rápida – detecção de compostos pouco voláteis
Cromatografia Gasosa
Guia prático para o desenvolvimento de métodos
- Condições preliminares:
- Usar detector de ionização por chamas
É o detector mais adequado para análise exploratória de amostras orgânicas – Não há
problemas com relação a concentrações elevadas – é um detector bastante sensível
- Condições de análise:
• Temperatura inicial baixa para observação dos compostos voláteis – pequena
retenção da coluna com temperatura mais alta pode levar à perda dos mesmos
• Programação rápida: 10
C/min ≤ Taxa ≤ 15
C/min
• Temperatura final próxima da Tmax da coluna
• Tempo final infinito – interromper a corrida com tempo = 2 x tR do último pico
Cromatografia Gasosa
Guia prático para o desenvolvimento de métodos
Cromatografia Gasosa
Guia prático para o desenvolvimento de métodos
- Não há picos no cromatograma?
- Causas:
• A amostra não tem componentes volatilizáveis
• As substâncias presentes se degradaram e seus produtos ficaram absorvidos no
sistema
• O detector por ionização em chamas não responde aos compostos
• Amostra muito diluída ou detecção com pouca sensibilidade
Cromatografia Gasosa
Guia prático para o desenvolvimento de métodos
- Não há picos no cromatograma?
- Soluções:
• Usar colunas com menor retenção (reduzir L, dc e E.F.)
• Usar injeção na coluna a frio para evitar a degradação no injetor
• Combinar os dois
• CLÁSSICO: Caso haja suspeita de que o DIC não seja adequado, realizar testes
para a presença de enxofre ou halogênios na amostra – lembrar que
polihalogenados não produzem sinal apreciável no DIC
• Certificar-se de que a amostra é constituída de substâncias orgânicas e que a
quantidade injetada está de acordo com a sensibilidade do detector
Cromatografia Gasosa
Guia prático para o desenvolvimento de métodos
- Não há picos no cromatograma?
- Soluções:
• Caso ainda não apareçam picos, selecionar outro método de análise –
cromatografia líquida
Cromatografia Gasosa
Guia prático para o desenvolvimento de métodos
Cromatografia Gasosa
Guia prático para o desenvolvimento de métodos
- Há picos no cromatograma?
- Iniciar a otimização da separação
• Reduzir a velocidade de programação e observar se há melhoria da resolução
• Se tR for muito pequeno – aumentar comprimento e espessura de fase da coluna
• tR continua reduzido – aumentar a polaridade da fase estacionária (OV-31-OH;
Carbowax; cianopropilsiloxana)
• O uso dessas fases polares também é sugerido se houver suspeita de coeluição
• Observar o espalhamento dos picos com separação razoável entre eles – se houver
separação razoável, seguir para próxima etapa
Cromatografia Gasosa
Guia prático para o desenvolvimento de métodos
Cromatografia Gasosa
Guia prático para o desenvolvimento de métodos
- Há separação preliminar?
- Aprimorar o resultado
• Se não for necessário aprimorar – pular esta etapa
• Se for necessário – seguir o diagrama
Cromatografia Gasosa
Guia prático para o desenvolvimento de métodos
Cromatografia Gasosa
Guia prático para o desenvolvimento de métodos
- Há resolução adequada?
- Otimizar o tempo de análise
• Aumentar a taxa de programação para aproximar todos os picos – tentar um
método com rampas múltiplas
• Aumentar a temperatura inicial até que ela comece a prejudicar a resolução que se
considera adequada
• Aumentar a vazão do gás de arraste (velocidade linear média) – especialemente se
as substâncias eluírem na isoterma final
• Alterar as características da coluna, reduzindo o comprimento e espessura de filme
Cromatografia Gasosa
Guia prático para o desenvolvimento de métodos
Cromatografia Gasosa
Guia prático para o desenvolvimento de métodos
- Há muitos outros recursos que podem ser usados para otimizar um método,
baseados em outros aspectos já abordados no curso
- Esse guia visa ajudar no desenvolvimento inicial para amostras totalmente
desconhecidas
- Leituras recomendadas:
Cromatografia Gasosa
Guia prático para o desenvolvimento de métodos
Cromatografia Gasosa
Guia prático para o desenvolvimento de métodos
Cromatografia Gasosa
Guia prático para o desenvolvimento de métodos - Dicas práticas de utilização de CG
• Substituir septos regularmente – a cada 50 injeções – sempre que resfriar o
equipamento
• Se não tem ideia da temperatura do injetor a usar, comece em 250
C
• Use sempre gases, reguladores e tubulações adequadas
• Sempre verificar vazamentos nas linhas de gases e trocar os cilindros quando a
pressão atingir 200 psi
• Sempre que possível, purgar a coluna com gás carreador (15 – 30 min) antes de
aquecê-la
• Usar sempre a coluna mais apolar possível para a separação desejada
• Sempre que possível utilize colunas de baixo sangramento
Cromatografia Gasosa
Guia prático para o desenvolvimento de métodos - Dicas práticas de utilização de CG
• Sempre corte as pontas da coluna após passar por anilhas de grafite
• Se os picos iniciais forem muito largos tente usar uma coluna com espessura de
fase maior
• Inspecione e troque sempre os liners – liners sujos levam a picos deformados
• Use o liner correto para o tipo de injeção
• Se os picos estiverem deformados – troque o septo, liner e corte 0,5 m da cabeça
da coluna
• Sempre marque qual é a cabeça da coluna
• Sempre use anilhas novas
Cromatografia Gasosa
Guia prático para o desenvolvimento de métodos - Dicas práticas de utilização de CG
• Atenção ao corte da coluna
• Reaperte todas as conexões de uma coluna recém colocada cerca de ¼ a ½ volta
após os primeiros ciclos de aquecimento do equipamento
• Sempre use anilhas de grafite/vespel para a interface com EM
• Não desconecte uma coluna em temperatura ou pressão elevada – deixe atingir a
temperatura e pressão ambientes antes
• Antes do uso sempre condicione as colunas na temperatura máxima recomendada
pelo fabricante por cerca de 1 – 2 h
• Quando guardar uma coluna, feche suas pontas com septos – lembre de cortar pelo
menos 3 cm antes de reutilizá-las
Cromatografia Gasosa
Água em CG – Molhar a coluna,
pode?
Cromatografia Gasosa
Água em CG - A água é considerada um solvente menos que ideal em
CG
- Problemas: grande volume de expansão de vapor,
molhabilidade e solubilidade baixas na fase estacionária,
problemas em detectores como o DIC, danos químicos à
fase estacionária ...
- Mas...
- Em alguns casos injetar água é inevitável (como usando
um purge-and-trap) ou é mais conveniente do que fazer
uma longa extração com solvente
Cromatografia Gasosa
Água em CG - Os problemas com a introdução de água em CG começam no injetor – grande
volume de expansão – facilmente pode causar backflash
- Na coluna - baixa molhabilidade na fase estacionária – Grob e cols.: não há uma
fase estacionária que possa ser molhada pela água e, ao mesmo tempo,
suficientemente desativada para uma boa cromatografia – uma parte da água pode
passar como líquido pela coluna – alargamento e divisão de bandas
- Usando temperaturas iniciais do forno acima de 100
C – bons resultados
- Muita água sendo eluída pode apagar a chama do DIC, reduzir a sensibilidade do
DCE
- Nota de aplicação Agilent – fases quimicamente ligadas (tipo DB) - testes antes e
após 1000 injeções de água
Cromatografia Gasosa
Água em CG
- Injeção em split – A injeção sem divisão de fluxo iria levar a um backflash elevado
- Foram testadas 2 temperaturas para a corrida: 60 °C e 130 °C
- Após 1000 injeções em cada temperatura, nenhuma das fases quimicamente ligadas
sofreu danos – testes de Grob repetidos e resultados idênticos
- Uma fase não ligada foi gradualmente perdida – não recomendável o uso com água
Cromatografia Gasosa
Testes de avaliação de colunas capilares
Cromatografia Gasosa
Avaliação de colunas capilares
- As colunas capilares modernas possuem alta inércia e eficiência
- A pequena quantidade de fase estacionária, no entanto, pode fazer com que essas
características se percam rapidamente
- Pequenas quantidades de impureza presentes nas amostras ou no gás carreador
- Quaisquer alterações no desempenho da coluna só podem ser percebidas (a tempo
de uma ação corretiva) com testes de desempenho
- Os testes existentes consistem em uma injeção de padrões selecionados com
características específicas e avaliação do cromatograma resultante
Cromatografia Gasosa
Avaliação de colunas capilares
- As colunas capilares modernas possuem alta inércia e eficiência
- A pequena quantidade de fase estacionária, no entanto, pode fazer com que essas
características se percam rapidamente
- Pequenas quantidades de impureza presentes nas amostras ou no gás carreador
- Quaisquer alterações no desempenho da coluna só podem ser percebidas (a tempo
de uma ação corretiva) com testes de desempenho
- Os testes existentes consistem em uma injeção de padrões selecionados com
características específicas e avaliação do cromatograma resultante
- Existem diferentes misturas-teste para uso nesses testes que também podem ser
feitos em diferentes condições experimentais
Cromatografia Gasosa
Avaliação de colunas capilares
- Informações que se deseja (com um único teste): características de adsorção,
eficiência de separação, comportamento ácido-base e espessura de filme líquido
- A metodologia apresentada aqui foi extraída de Cardoso & Radler – Química Nova,
1986 – por sua vez extraída basicamente dos trabalhos de Grob
- A mistura-teste inclui componentes ácidos, básicos, neutros, hidroxilados e
carbonilados a fim de avaliar a interação da coluna com diferentes grupos
funcionais
Cromatografia Gasosa
Avaliação de colunas capilares
Composição da mistura-teste
Cromatografia Gasosa
Ordem de eluição da mistura-teste em diferentes fases estacionárias
Cromatografia Gasosa
Ordem de eluição da mistura-teste em diferentes fases estacionárias
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Gasosa
Diferentes pares
com a mesma
função (ver A e
am)
Cromatografia Gasosa
- Há casos em que a redução de um sinal não indica um problema ne desempenho
da coluna
-
- Ex: ácido 2-etil-hexanóico (S) em colunas apolares e C10-C12 em fases polares
com filmes delgados (<0,1 μm)
- Esses picos serão deformados – problema causado pela insolubilidade dos
compostos na fase estacionária na concentração usada
- Nem todas colunas conseguem nota dez em todo o teste, mas isso não as
desqualifica
- Uma coluna com característica ácida pode ser usada para separação de alcanos,
ésteres, aldeídos, cetonas etc.
- Cuidado com a neutralidade aparente de uma coluna!
Cromatografia Gasosa
- Para uso diário, se os problemas estão concentrados nos indicadores mais
sensíveis: D, S e am provavelmente não haverá problemas na maioria das
situações
- Quanto mais inerte for a coluna, maior será a sua vida útil e melhor ela será para
análises quantitativas, garantido repetitividade
Cromatografia Gasosa
- Outra informação retirada do teste é a eficiência da coluna
- Medida pelo número de separação (Trenzahl – Tz)
- Sendo ∆tR a diferença de tempo de retenção entre dois picos e W1/2 as larguras
em meia altura
- No teste, calcula-se o Tz para dois pares de picos: E10/E11 e E11/E12 e tira-se a
média
Cromatografia Gasosa
- Valores típicos de Tz:
Cromatografia Gasosa
- Por fim, o teste permite o cálculo da espessura de filme da coluna
- Esse cálculo é importante no diagnóstico de possíveis problemas ocorrendo na
coluna – sangramento, oxidação das extremidades, redistribuição da fase etc.
- Mede-se a temperatura de eluição do E12 e então calcula-se a diferença entre
essa temperatura e a temperatura padronizada para aquela fase (dada nas tabelas
anteriores)
- Medir a temperatura de detecção e subtrair o tempo morto
- Usa-se o normograma para o cálculo
Cromatografia Gasosa
- Normograma:
Cromatografia Gasosa
- Procedimento prático:
1 – Colocar a coluna em equipamento com injetor split e detector de ionização por
chama e resfriar o forno a uma temperatura menor que 40 °C (ou colocar 40 °C
como temperatura inicial do forno)
2 – Ajustar a pressão de entrada e a razão de split para obter para o metano um tR =
3,5 s/m (ou ajustar o sistema para uma velocidade linear média de 28,5 cm/s) +/- 5%
3 – Configurar a programação de temperatura em função do tamanho da coluna: 10
m: 2,5 °C/min e 50 m: 0,5 °C/min
4 – Injetar a mistura padrão de modo que aproximadamente 2 ng de cada
componente cheguem à coluna (ex: 1μL com split 1:20)
5 – Na faixa provável de saída de E12 (110-140 °C), fazer duas aotações com a
temperatura medida naqueles instantes
Cromatografia Gasosa
- Procedimento prático:
6 – Ao final da cromatografia inter- ou extrapolar a temperatura de eluição do E12
7 – Desenhar a linha dos 100% que passa pelos picos dos dois n-alcanos e dos três
ésteres
8 – Expressar a altura dos demais picos como uma porcentagem da distância entre a
linha de base e a linha dos 100%
9 – Determinar o TZ – média de E10/E11 e E11/E12
10 – Determinar a espessura do filme comparando a temperatura determinada na
etapa 6 com os valores de referência da tabela e usar a diferença no normograma
para cálculo da espessura de filme.
Cromatografia Gasosa
Dúvidas?
Questões práticas, teóricas, aplicações específicas...
Cromatografia Gasosa
Obrigado!
Bruno
R: 3095