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Colónias satélite: ao fim de 2 dias (a e b) e de 4 (c)
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Regulação da expressão de genes
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A decisão em iniciar a transcrição de um gene que codifica uma proteína em particular é o principal mecanismo que controla a produção dessa mesma proteína:
◦ Expressão reprimida: há pouca síntese de mRNA e da proteína correspondente;
◦ Expressão activada: há produção elevada de mRNA e da respectiva proteína.
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Unicelular vs multicelular Organismos unicelulares: ◦ A expressão de genes é regulada de modo a
ajustar a célula às alterações nutricionais e físicas no meio ambiente.
Organismos pluricelulares: ◦ A expressão dos genes é regulada de modo a
garantir que o gene correcto está a ser expresso no momento e no tecido certos.
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Operão Nos procariotas, cerca de 50% dos genes estão
organizados em “pacotes” – operões – que codificam:
◦ Enzimas envolvidas numa determinada via metabólica, ou ◦ Proteínas que interagem de modo a formar uma
proteína com várias subunidades.
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Regulação da transcrição do operão O operão é transcrito a partir de um local único.
Todos os genes do operão são regulados de modo coordenado, i.e., são activados ou reprimidos ao mesmo tempo.
A transcrição do operão, assim como dos genes eucariotas, é regulada pela interacção entre a RNA polimerase e proteínas repressoras / activadoras específicas.
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O operão lac de Escherichia coli Quando a E. coli se encontra num ambiente:
◦ Sem lactose: há repressão da síntese do mRNA lac; ◦ Com lactose e glucose: a célula usa a glucose; há repressão
da síntese do mRNA lac; ◦ Só com lactose: há activação da síntese do mRNA lac;
A regulação da transcrição do operão lac é controlada por:
◦ Repressor lac; ◦ CAP (“Catabolite Activator Protein”) (situação de “fome”).
◦ Ligam-se a uma sequência específica na região promotora que controla a transcrição do operão – operador.
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Sem lactose – repressão
Há ligação do repressor lac a uma sequência designada operador lac, a qual engloba o local de início da transcrição;
Bloqueia a ligação da RNA polimerase ao Plac;
Não há transcrição. 9
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Com lactose – indução
A lactose associa-se ao repressor lac, alterando a sua conformação;
O repressor dissocia-se do operador lac;
A RNA polimerase associa-se ao Plac e inicia a transcrição. 10
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Porquê? Na maioria dos operões, a sua não transcrição deve-se à
ligação de um repressor no operador do promotor;
A ligação de uma (ou várias) pequenas moléculas ao repressor – indutores – vai alterar a sua capacidade de ligação ao operador, fazendo com que se dissocie;
Há INDUÇÃO da síntese de mRNA.
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Plasmídios derivados do pUC UC = Universidade da Califórnia
local de clonagem múltipla inserido na grelha de leitura correcta do gene lacZ’ ⇒ proteína funcional/não funcional...
possuem um segmento de DNA derivado do operão lac de E. coli que codifica o fragmento amino-terminal (correspondente aos primeiros 146 aa) da β-galactosidase (LacZ) – fragmento α (LacZ’)
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as estirpes usadas com estes vectores são mutantes - possuem uma delecção no gene que codifica o fragmento α da LacZ (ΔM15), mas possuem a informação para a restante LacZ (fragmento ω)
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Selecção de bactérias pela cor a síntese do fragmento α pode ser induzida pelo
IPTG (isopropil-tio-β-galactosídeo) – análogo da lactose
se ambos os fragmentos (α e ω) forem sintetizados na bactéria, interagem um com o outro originando uma β-galactosidase funcional – α complementação
esta β-galactosidase funcional pode degradar a substância cromogénica X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indoil-β-galactosídeo), conduzindo à formação de colónias azuis
As bactérias são não recombinantes!! 15
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Bactérias recombinantes nos vectores derivados do pUC, o local de clonagem múltipla
encontra-se inserido no gene lacZ’, o que permite a distinção histoquímica das bactérias recombinantes das não recombinantes
a inserção de DNA estranho no polylinker conduz à inactivação do gene lacZ’ tornando as bactérias incapazes de produzir uma β-galactosidase funcional. Neste caso, as colónias resultantes não serão azuis
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O operão trp de E. coli Codifica 5 enzimas envolvidas na biossíntese do triptofano;
Quando no citosol ou meio ambiente há:
◦ ↑ triptofano: Não há síntese de mRNA trp;
◦ ↓ triptofano: Há síntese de mRNA trp.
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Regulação pelo triptofano Há ligação do triptofano ao repressor trp;
Causa uma modificação conformacional do repressor trp;
Há associação deste ao operador trp;
Não há síntese de mRNA trp;
Há REPRESSÃO da transcrição.
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Na ausência de triptofano Há dissociação do
triptofano do repressor trp;
O repressor sofre modificação conformacional;
Dissocia-se do operador;
Há transcrição do mRNA trp.
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Em qualquer dos casos (↑) só há transcrição se o repressor estiver
dissociado do promotor do operão!
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O operão ara (e o pGLO) Codifica 3 enzimas envolvidas no
metabolismo da arabinose (açúcar): AraB, AraA e AraD (BAD);
O operão é regulado pela proteína AraC, a qual também funciona como sensor dos níveis de arabinose na célula;
A principal função da AraC é induzir a expressão do mRNA bad;
O promotor deste operão está geralmente desligado, sendo ligado pela AraC após a percepção da arabinose;
Regulação positiva da transcrição. 25
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O que se passa no pGLO O operão bad foi substituído pela
sequência codificante da proteína verde fluorescente – GFP.
A arabinose liga-se à AraC, alterando a sua conformação e activando-a.
A AraC activada associa-se ao promotor PBAD promovendo a ligação da RNA polimerase;
Há transcrição do mRNA gfp e consequente produção da proteína fluorescente.
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