UNIVERSIDADE CATÓLICA DOM BOSCO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA

INGRID BATISTA PINTO

Caracterização dos genes matK e rbcL e da variabilidade genética entre os acessos de Araruta (Maranta arundinacea L.).

CAMPO GRANDE

2015

UNIVERSIDADE CATÓLICA DOM BOSCO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA

Caracterização dos genes matK e rbcL e da variabilidade genética entre os acessos de Araruta (Maranta arundinacea L.).

Autora: Ingrid Batista Pinto Orientadora: Carina Elisei de Oliveira

Coorientadora: Marney Pascoli Cereda

. "Dissertação apresentada, como parte das exigências para obtenção do título de MESTRE EM BIOTECNOLOGIA, no Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Católica Dom Bosco - Área de concentração: Biotecnologia Aplicada à Agropecuária "

Campo Grande, Mato Grasso do Sul, Fevereiro – 2015.

ii

iii

iv

EPÍGRAFE

Os passos da Grande Obra correspondem aos da

criação do Mundo, demonstrando uma analogia entre

microcosmo e macrocosmo. Mas isto é apenas uma

analogia, porque, segundo os sábios antigos, o

'Magisterius' não é criação, e, sim, um processo gerador

realizado pelo Artista – que é conduzido pela Natureza –

e está apenas acelerando seu próprio trabalho de

purificação.

Christian Balister.

v

DEDICATÓRIA

A minha família em especial ao meu

Pai, Pedro Batista Pinto pela

dedicação, carinho e por sempre ter

me apoiado na busca e realização

dos meus sonhos.

vi

AGRADECIMENTOS

À Deus pela concretização deste trabalho, por ter me iluminado e por me dar força

interior para superar as dificuldades, me suprir em todas as minhas necessidades.

Às minhas orientadoras Professoras Carina Elisei de Oliveira e Marney Pascoli

Cereda por me apresentar o caminho da ciência e principalmente, acreditarem em

mim.

A Dra. Josimara Nolasco Rondon, pelo incentivo e dicas valiosas.

A Dra. Lucimara Chiari pelos ensinamentos.

A Dra. Renata Dias, pela contribuição significativa nesse trabalho.

À minha família, ao meu pai Pedro Batista Pinto, meu filho Pedro Fernando B.

Hormung e a minha Irmã Irina Batista Pinto, pelo apoio e carinho prestados mesmo

sem saberem exatamente, o que eu faço.

Ao meu namorado pela imensa paciência, colaboração, compreensão, amor,

carinho, por todo incentivo e pelo companheirismo incondicional.

Aos meus amigos de laboratório Guilherme A. Abrantes Souza, que compartilhou

ensinamento, ajudando-me em vários momentos, e a Poliene Costa, pelas

conversas e pela gratificante “parceria”.

A técnica do laboratório Maria Helena pela colaboração e ajuda durante a execução

deste trabalho.

A Capes/ CNPQ e a UCDB pela bolsa concedida.

Enfim a todos que contribuíram de forma direta ou indireta para resolução deste

trabalho o meu MUITO OBRIGADA.

vii

BIOGRAFIA DO AUTOR

Nascida em Campo Grande - MS em 28 de maio de 1984, Ingrid Batista Pinto, filha

de Pedro Batista Pinto e Graça Maria Colavite Pinto. Teve uma infância tranquila e

feliz.

Em 2003 entrou para o curso de Nutrição da Universidade Católica Dom Bosco,

onde cursou apenas dois anos, terminando a graduação na Universidade

Anhanguera- Uniderp na mesma área. Fez estágios em nutrição clínica no Hospital

Regional e na Unidade de Alimentação e Nutrição da Santa Casa de Campo

Grande.

Trabalhou em empresas de Alimentação e em Hospitais como nutricionista.

Em 2012 visando aperfeiçoar seus conhecimentos, decidiu se especializar iniciando

o Programa de Pós Graduação Mestrado em Biotecnologia da UCDB, onde através

da ciência encontrou seu espaço e realização.

viii

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 1

1.1 A família Marantaceae ....................................................................................... 1

1.2 Maranta arundinacea L. ..................................................................................... 2

1.3 Importância Econômica de Maranta arundinacea . ............................................ 5

1.4 Marcadores Moleculares ................................................................................. 10

1.5 Marcador Molecular RAPD .............................................................................. 12

1.6 PCR Convencional ........................................................................................... 15

1.7 DNA barcoding ................................................................................................. 16

1.7.1 MatK ............................................................................................................ 20

1.7.2 rbcL .............................................................................................................. 21

2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 21

REFERÊNCIAS ............................................................................................................ 22

CAPÍTULO I:. Caracterização dos genes matK e rbcL e da variabilidade

genética entre os acessos de Araruta (Maranta arundinacea L.)........................... 31

Introdução .................................................................................................................... 33

Material e Métodos ...................................................................................................... 34

Amostras .................................................................................................................... 34

Obtenção das amostras ............................................................................................. 34

Avaliação do perfil genético ....................................................................................... 35

Extração do material genético .................................................................................... 35

Verificação da quantidade e qualidade do DNA ........................................................ 36

Desenho dos Primes (iniciadores) dos genes matK e rbcL ....................................... 37

PCR convencional ..................................................................................................... 37

Análise das sequências dos genes matK e rbcL........................................................ 38

Marcadores RAPD ..................................................................................................... 38

Análise dos dados obtidos através de marcadores RAPD ........................................ 39

Resultados e Discussão ................................................................................................ 40

Variabilidade genética ............................................................................................... 44

Conclusão ..................................................................................................................... 46

Referências Bibliográficas ............................................................................................. 47

Apêndices ..................................................................................................................... 51

v

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Composição nutricional da araruta crua por 100 gramas ................................ 9

CAPÍTULO I

Tabela 1. Genes utilizados, primers e os números de acesso no GenBank ................. 37

Tabela 2. Lista dos primers utilizados com suas respectivas sequências de bases ..... 37

Tabela 3. Dados de quantificação via espectrofotometria das extrações de material

genético foliar de quatro acessos de araruta. A absorbância (Abs) foi medida no

comprimento de onda de 260 a 280 nanômetros .......................................................... 41

Tabela 4. Lista dos primers e suas respectivas sequências, número de fragmentos

amplificados e número de fragmentos polimórficos obtidos dos quatro acessos .......... 44

APÊNDICE

Tabela 1. Análise do acesso de Araruta Comum comparadas com sequências

depositadas no BOLD Systems de rbcL ........................................................................ 51

Tabela 2. Análise das seqências SC, Guadalupe e Seta comparadas com

sequências depositadas no BOLD Systems de rbcL .................................................... 51

Tabela 3. Análise das sequências Comum, SC, Guadalupe e Seta comparadas com

sequências depositadas no BOLD Systems de matK ................................................... 51

vi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Aspecto geral da Araruta (Maranta arundinacea L.) ........................................ix

Figura 2. Aspecto geral do rizoma da Araruta ................................................................. x

Figura 3. Principais áreas de ocorrência de Maranta Arundinacea L ............................ 37

Figura 4. Esquema da reação de Polimorfismos de DNA amplifocados ao acaso

(RAPD) ........................................................................................................................ 137

Figura 5. Regiões mais utilizadas como DNA Barcoding em plantas ............................ 17

Figura 6. Esquema do genoma do cloroplasto .............................................................. 19

CAPÍTULO I

Figura 1. Imagens dos quatro acessos de M. arundinacea .......................................... 37

Figura 2. Dendograma obtido a partir da análise de Neighbor-joining (NJ), dos

acessos Comum, SC, Guadalupe e Seta, utilizando Siphonochilus decorus como

outgroup. Os valores encontrados nos ramos indicam os valores de boostrap (>50)

baseado em 1.000 interações ....................................................................................... 44

Figura 3. Dendograma de similaridade genética, obtido a partir dos produtos de

amplificação por RAPD para quatro genótipos de Araruta ............................................ 45

APÊNDICE

Figura 1. Resultado do sequenciamento de gene rbcL dos quatro acessos de M.

arundinacea .................................................................................................................. 52

Figura 2. Resultado do sequenciamento de gene matK dos quatro acessos de M.

arundinacea .................................................................................................................. 54

Figura 3. Padrão eletroforético obtido com primers OPF5 e OPAF5. PM: Peso

Molecula 1kb plus. CO: Araruta Comum. SC: Araruta SC. G: Araruta Guadalupe e

ST: Araruta Seta, C- controle negativo ......................................................................... 56

Figura 4. Padrão eletroforético obtido com primers OPA1 e OPA2. PM: Peso

Molecula 1kb plus. CO: Araruta Comum. SC: Araruta SC. G: Araruta Guadalupe e

ST: Araruta Seta, C- controle negativo ..................................................................... 3757

Figura 5. Padrão eletroforético obtido com primers OPA17. PM: Peso Molecula 1kb

plus. CO: Araruta Comum. SC: Araruta SC. G: Araruta Guadalupe e ST: Araruta

Seta, C- controle negativo ............................................................................................ 58

vii

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

LISTA DE ABREVIATURAS

atpF - Gene que codifica as subunidade CFO I da ATP sintase

atpH - Gene que codifica a subunidade CFO III da ATP sintase

BLAST -Basic Local Alignment Search Tool

CBOL - Consortium for the Barcode of Life

CIA - clorofórmio: álcool isoamilico

COI - Citocromo oxidase I

dNTP – Desoxirribonucleotideo trifosfato

ddNTP – Di Desoxirribonucleotideo trifosfato

DNA – Ácido desoxirribonucleico

EDTA - Ácido etilenodiaminotetracético

et al - E outros.

IR (a ou b) - Large Inverted Reapets

ITSs - Espacadores internos transcritos

kb - Kilo pares de bases

LSC - Large Single Copy Region

matK – Gene que codifica a proteina maturase K

mtDNA - DNA mitochondrial

ng - nanograma

pb - Pares de bases

PCR - Polymerase Chain Reaction

PlantGDB - Plant Genomic Database

psbA – Gene que codifica a proteina D1 do fotossistema II do cloroplasto

psbI – Gene que codifica o polipeptideo I de massa molecular baixa do sistema de

fotossistema II do cloroplasto

psbK - Gene que codifica o polipeptideo K de massa molecular baixa, do sistema de

fotossistema II

RAPD - Random Amplification of Polymorphic DNA

rbcL -Gene que codifica a grande subunidade da ribulose-1,5-bifosfato carboxilase/

oxigenase (RuBisCo)

viii

rDNA - DNA ribossomal

RFLPs - Restriction Fragment Lenght Polymorfisms

RNA – Acido ribonucleico

RNase – Enzima que degrada especificamente o RNA

rpoB - Gene que codifica a subunidade β da RNA polimerase

rpoC1 - Gene que codifica a subunidade β’ da RNA polimerase

sp - Espécie

spp - Espécies

SSC - Small Single Copy Region

Taq – Thermus aquaticus, bactéria termófila da qual se obtém uma das DNAs

polimerases termoestáveis utilizadas em PCR.

tRNA – Ácido ribonucleico transportador

trnH - Gene de tRNA

trnK - Gene de Trna

LISTA DE SÍMBOLOS

°C - Graus Celcius

% - Percentagem

h - Hora(s)

G - grama

μL - Microlitro(s)

μM - Micromolar

mg - Miligrama(s)

mL - Mililitro(s)

min - Minuto(s)

s - Segundo(s)

ix

RESUMO

PINTO, I. B. Caracterização dos Genes matK e rbcL e da

Variabilidade Genética entre os Acessos de Araruta (Maranta

arundinacea L.). Campo Grande, 2015. (Dissertação Mestrado em

Biotecnologia) – Universidade Católica Dom Bosco, Campo Grande,

2015.

Maranta arundinacea é uma planta nativa da América do Sul, apresenta potencial

econômico como uma matéria prima não convencional para amido, através de seus

caules subterrâneos denominados rizomas. Devido à falta de informações sobre o

número de espécies, o risco de extinção e o crescente interesse no uso e na

comercialização de seu amido fazem da M.arundinacea uma espécie ideal para

estudos moleculares. Assim, o objetivo deste trabalho foi a identificação de quatro

acessos de M. arundinacea denominados de Comum, (CeTeAgro); SC, Guadalupe

e Seta (EMBRAPA-CENERAGEM) através dos genes cloroplastidiais matK e o rbcL,

e avaliar a similaridade genética, através de marcadores moleculares RAPD. Para

análise de RAPD utilizou-se 25 primers, destes, o primer OPA 02 foi selecionado por

apresentar maior número de bandas polimórficas. Através do coeficiente de

similaridade de Jaccard, juntamente com o teste de UPGMA, foi possível

estabelecer dois grupos distintos, Grupo I (Comum) e Grupo II (SC, Guadalupe e

Seta). A identificação dos acessos por meio dos genes cloroplastidiais matK e o

rbcL, foram submetidas por busca BLAST (GenBank) e BOLD Systems, resultando

em 99,66 a 100% de identidade para o gene matK e rbcL, respectivamente, dos

quatro acessos estudados, comparados com M. arudinacea. A construção da árvore

filogenética, utilizando o gene rbcL, realizada por Neighbor-Joining, observou-se

após a separação do grupo externo, um grande grupo de M. arundinacea contendo

os acessos SC, Guadalupe, Seta e o acesso do banco de doados M. arundinacea

(3845927560), não apresentado diferenças entre eles. Outro grupo interno foi

constituído por Comum e o acesso do banco de dados M. arundinacea

(JQ592613.1), evidenciando que o Comum se diferenciou dos demais acessos SC,

Guadalupe e Seta, entretanto indicando que todos os acessos são da espécie M.

arundinacea.

Palavras-chave: DNA Barcoding, Marantaceae, RAPD.

x

ABSTRACT

PINTO, I. B. Characterization of Genes matK and rbcL and Genetics

variability between Arrowroot accesses (Maranta arundinacea L.).

Campo Grande, 2015. (Master Master in Biotechnology) - Dom Bosco

Catholic University, Campo Grande, 2015.

Maranta arundinacea is a plant native to South America, has economic potential as a

non-conventional raw material for starch, through its underground stems called

rhizomes. Due to lack of information on the number of species at risk of extinction

and the growing interest in the use and marketing of its starch M.arundinacea make

an ideal species for molecular studies. The objective of this study was the

identification of four hits M. arundinacea Joint denominated, (CeTeAgro); SC,

Guadeloupe and Arrow (EMBRAPA-CENERAGEM) through the chloroplast genes

matK and rbcL, and assess the genetic similarity using RAPD molecular markers.

For RAPD analysis was performed using 25 primers, of these, the primer OPA 02

was selected due to its higher number of polymorphic bands. Through the Jaccard

similarity coefficient, together with the UPGMA test, it was possible to establish two

groups, Group I (Common) and Group II (SC, Guadeloupe and Arrow). The

identification of the accesses through the plastid rbcL gene and matK were

submitted by BLAST search (GenBank) and BOLD Systems, resulting in 99.66 to

100% Identity to the rbcL gene and matK, respectively, of the four accesses studied,

M. arudinacea compared. The construction of the phylogenetic tree using the rbcL

gene carried by neighbor-joining, was observed after separation of the outer group, a

large group containing M. arundinacea SC accesses, Guadeloupe arrow and given

access database M . arundinacea (3845927560), did not present differences

between them. Another internal group consisted of Common and the database

access M. arundinacea (JQ592613.1), showing that the Joint different from the other

SC access, Guadeloupe and arrow, however, indicating that all accesses are the

species M. arundinacea .

Keywords: DNA Barcoding, Marantaceae, RAPD.

1

1 INTRODUÇÃO

1.1 A Família Marantaceae

Em 1890 O. G. Petersen descreveu a família Marantaceae, sendo que o

nome da família foi uma homenagem ao botânico italiano Bartolomeo Maranta, que

viveu entre 1500 e 1571.

A família Marantaceae é um grande grupo de plantas compostas por 530

espécies e 31 gêneros (KENNEDY, 1977; ANDERSSON, 1986; KENNEDY,1997,

2000). Das 530 espécies conhecidas, cerca de 80% ocorrem na América Tropical,

9% na África e 11% na Ásia (HAMMEL, 1986). Esta família pertencente à ordem

Zingiberales (NEVES et al., 2005). As espécies de Marantaceae apresentam

distribuição pantropical e são típicas de florestas úmidas tropicais, crescendo

principalmente a margens de rios e clareiras, podendo também ser encontradas em

locais com vegetação aberta em áreas encharcadas e em depressões nas margens

de estradas (COSTA et al., 2008).

De acordo com Souza e Lorenzi (2005), no Brasil a família Marantaceae,

possui 150 espécies, das quais o gênero mais representativo no país é Calathea

seguido de Maranta. Dez gêneros são encontrados na Amazônia brasileira:

Calathea, Ischnosiphon, Monotagma, Hylaeanthe, Thalia, Maranta, Koernickanthe,

Monophyllanthe, Saranthe e Myrosma (COSTA et al., 2008).

As plantas da família Marantaceae são facilmente identificadas, pela

combinação de folhas com nervuras paralelas e presença de um engrossamento do

pecíolo na junção entre este e a lâmina foliar denominado pulvino, possuem rizomas

subterrâneos, com exceção de algumas espécies que o rizoma pode estar

parcialmente fora da terra (rizomas aéreos) e as suas flores nascem em dupla,

formando uma estrutura chamada de inflorescência (COSTA et al., 2008).

As marantáceas possuem sementes com apenas um cotilédone

(monocotiledôneas), raiz fasciculada e folhas com nervuras paralelas. As

monocotiledôneas representam 22% de todas as Angiospermas (COSTA et al.,

2008).

Os principais representantes da família Marantacea apresentam grande

importância como plantas ornamentais, sendo estas Calathea, Ctenanthe, Maranta

e Stromanthe, e fonte de fibras como a espécie Ischnosiphon gracilis, conhecida

2

como “arumã”, que é utilizada para produção de cestas e criação de utensílios

domésticos de índios e caboclos (COSTA et al., 2008).

As folhas das espécies de Calathea fragilis e Calathea lutea são muito

utilizadas para embalar peixes, bolos de mandioca e milho, e outras espécies são

utilizados na alimentação humana tais como Calathea allouia e M. arundinacea L.

(ARNS, 1997; COSTA et. al., 2008). A espécie Calathea allouia, conhecida como

“ariá”, é cultivada por índios e caboclos da Amazônia, para a obtenção de seus

tubérculos, os quais são consumidos após a cocção. A espécie considerada mais

importante economicamente é M. arundinacea, que tem como principal atrativo o

rizoma que consiste da parte comestível que podem também ser consumido após o

cozimento ou usado para extração do amido (COSTA et al., 2008).

1.2 Maranta arundinacea L.

A araruta é uma planta herbácea cujo nome científico é M. arundinacea L.

(Figura 1), pertencente à família Marantaceae e à ordem Zingiberales. A araruta é

uma planta rizomatosa, que produz rizomas em forma de fuso, coberto por

escamas, os rizomas podem chegar de 10 a 25 cm de comprimento, em algumas

ocasiões dependendo do solo até 30 cm (Figura 2). Nas condições tropicais

caracteriza-se pelo pouco ou nenhum florescimento (PIO CORRÊA, 1984).

Figura 1. Aspecto geral da Araruta (Maranta arundinacea L). Fonte:<http://www.agrosoft.org.br/agropag/211821.htm#.VFvS0TTF_Qw>. Acesso em: 03 de nov. 2014.

3

Figura 2. Aspecto geral do Rizoma da Araruta. Fonte: <http://hortas.info/como-plantar-araruta>. Acesso em: 03 de nov. 2014.

Vários autores discorrem sobre a possível origem e áreas da ocorrência

desta planta, alguns a consideram nativa das Antilhas, México e de outros países

da América Central (BENTLEY e TRIMEN 1880). Segundo León (1987) a planta é

nativa da América do Sul e das Antilhas. Peckolt e Peckolt (1893) afirmam que são

nativas do Brasil. Erdman e Erdman (1984) citam que as espécies crescem na

América do Sul, Sudeste da Ásia, Caribe, Filipinas e Índia (Figura 3).

Há indícios do cultivo da araruta pelos índios há mais de 7000 anos atrás. Os

vegetais mais cultivados nas roças dos caboclos e de índios amazônicos nas terras

baixas da América do Sul eram a mandioca (Manihot esculenta), batata-doce

(Ipomoea batatas) taioba ou taiá (Xanthosoma sp.), ariá (Maranta lutea), araruta

(Maranta arundinacea), inhame (Dioscorea alata), cupá (Cissus gongylodes) e

amendoim (Arachis sp) (MARTINS, 2005).

Os índios Aruak, que habitavam desde o Amazonas até a região do Caribe,

cultivavam a araruta e as chamavam de planta "aruaque aruá-aru", significando

"refeição das refeições", pelo fato de considerarem especiais as refeições

preparadas com o amido que destaca-se pela sua digestibilidade (NEVES et al.,

2005).

4

Os índios extraiam o amido e utilizavam para diversas aplicações como

engrossar sopas, tratar diarreia (especialmente em crianças), fortificar parturientes e

purificar o sangue. As substâncias ácidas contidas no macerado fresco dos rizomas

também eram utilizadas como compressas contra feridas provocadas por flechas ou

como antídoto nas picadas de insetos e outros animais peçonhentos (SILVA e

MONTEIRO, 1968).

As indicações da araruta na medicina tradicional são relatadas para

convalescença, dispepsia, irritação do canal digestivo, acidez estomacal,

machucados, fortificação de crianças e idosos, queimaduras de sol, picadas de

cobras e de mosquitos, para os quais são utilizados os rizomas (BERNAL e

CORREA, 1994; DELGADO e SIFUENTES, 1995; MILLIKEN e ALBERT, 1997;

PECKOLT e PECKOLT; 1893; REVILLA, 2002).

Figura 3. Principais áreas de ocorrência de Maranta arundinacea. Fonte: <http://www.boldsystems.org/index.php/Taxbrowser_Taxonpage?taxon=maranta+arundinacea&searchMenu=taxonomy&query=maranta+arundinacea>. Acesso em: 03 de nov. 2014.

A araruta é uma planta de fácil cultivo. No Brasil, adaptou-se pelas

características climáticas de chuvas bem distribuídas e temperatura média mensal

maior que 22ºC, em geral seu cultivo encontra boas condições em clima temperado

e ao nível do mar (MONTEIRO e PERESSIN, 2002).

Em relação ao solo, a araruta prefere solos arenosos e profundos os quais

são ideais por proporcionar um bom crescimento dos rizomas. O solo precisa ser

arado com até 20 cm de profundidade e com bom teor de matéria orgânica

(COELHO et al., 2005).

5

Em regiões tropicais e equatoriais, o cultivo da araruta pode ser realizado o

ano inteiro, tendo como exigência para o seu desenvolvimento presença de

umidade. Entretanto em regiões sub-tropicais ou tropicais de altitude, os meses

mais indicados são (setembro-outubro a março-abril), permanecendo a cultura em

dormência durante o período frio e/ou seco do ano (BRASIL, 2010). Apresenta

resistência a pragas e doenças, sendo que os nematóides do gênero Meloidogyne

podem causar danos aos rizomas (BRASIL, 2010).

A colheita da araruta é realizada entre 9 e 10 meses após o plantio, quando

as plantas apresentam as folhas amareladas e secas, tombadas sobre o solo. Os

tratos culturais consistem de capinas e amontoas, que podem ser manuais ou

mecanizadas. (MONTEIRO e PERESSIN, 2002, BRASIL, 2010). Após a colheita,

uma porção de rizoma é destinada ao novo plantio e a outra para extração do amido

(MARTINS, 1943).

Para a produção do amido os rizomas são processados na seguinte ordem

descascamento e lavagem, desintegração (liquidificador industrial), separação

(peneira 60 tyler), resultando em leite de amido passando pela purificação (peneira

200 tyler) novamente, pré secagem (filtro a vácuo) e secagem (flash -dryer 70oC), o

resultado é um pó fino, branco e inodoro (LEONEL, 2007).

1.3 Importância Econômica de Maranta arundinacea

Os amidos e seus derivados são importantes fontes de matéria prima, pois

são aplicados em diversas áreas de interesse econômico, tais como fabricação de

papéis, adesivos, embalagens biodegradáveis, indústria têxtil, indústria

farmacêutica, na produção de cola e principalmente na indústria alimentícia. Suas

características em alimentos permitem alterar ou controlar a textura, aparência,

umidade e consistência (ZHAO e WHISTLER, 1994 apud MEDINA, 2008).

Os amidos produzidos a partir de grãos de cereais, leguminosas e tuberosas

são importantes comercialmente, pois são muito utilizados nas indústrias,

principalmente no setor alimentício, tendo como principais fontes de matéria prima

milho, batata, trigo e mandioca (CEREDA et al., 2003). A produção mundial de

amido é de aproximadamente 48,5 milhões de toneladas de amido, sendo os EUA

responsável pela maior produção de amido de milho (24,6 milhões de toneladas) a

União Europeia a maior fabricante de amido de batata (1,8 milhão de toneladas) e

6

de trigo (2,8 milhões de toneladas), outros amidos produzidos mundialmente,

principalmente o da mandioca, correspondem a 2,5 milhões de toneladas (GUILBOT

e MERCIER, 1985; FRANCO et al., 2002).

Países da Ásia, em especial a China, produzem amidos alternativos com

diferentes propriedades, tais como arroz (Oryza sativa), araruta (Maranta

arundinacea), biri (Canna edulis), inhame (Dioscorea alata), feijão mugo (Vigna

radiata) dentre outros (CEREDA et al., 2003).

Os grânulos de amido apresentam forma e tamanhos diversos de acordo com

o grupo de planta pertencente (cereais, raízes, tubérculos e leguminosas),

apresentando também características e propriedades funcionais diferentes, inclusive

entre plantas da mesma espécie (CEREDA et al., 2002).

Segundo Madineni et al., (2012) o amido da araruta contêm grânulos que são

de pequeno, médio e grande (2,92-6,42 µm) com tamanho médio de 4,84 µm, e L /

D de 1,20 com arredondamento de 0,73. O amido tem 24,8% de teor de amilose

com uma temperatura de gelatinização de 74.8 oC.

Possui temperatura relativamente alta de gelatinização e resistência ao

cisalhamento mecânico. Portanto, apresenta textura satisfatória para alimentos

industrializados em alta temperatura ou como agente estabilizador para produtos

esterilizados tais como alimentos infantis e produtos processados em ultra-alta

temperatura (UHT) (MADINENI et al., 2012).

Estudos realizados com M. arundinacea, relatam diversas utilidades para

essa planta.

Os efeitos imunoestimulantes de extratos do rizoma de araruta, foram

analisados in vitro utilizando técnicas de cultura de células animais, e in vivo,

usando ratinhos BALB / c. Os resultados indicaram que o extrato do rizoma de

araruta estimularam a produção de IgM por células HB4C5 e imunoglobulina (IgG,

IgA e IgM) in vitro. Além disso, a análise in vivo indicou que a dieta contendo

extratos de araruta aumentou os níveis séricos de IgG, IgA e IgM em ratinhos,

revelando os efeitos imunoestimuladores in vivo bem como in vitro ( KUMALASARI,

et al., 2012).

Estudo realizado em 1984 avaliou o potencial de produção de álcool

combustível a partir de biomassa de araruta suplementado com levedura. O resíduo

grosso demonstrou qualidades adequadas para produção de papel resistente à

7

ruptura e dobramento. Além de utilização da araruta como alimentos, combustível e

recursos de fibras, ele também pode ajudar a reduzir a poluição ambiental resultante

da descarga direta do subproduto metanol não utilizado (ERDMAN e ERDMAN,

1984).

A produção de amidos não convencionais visa principalmente à obtenção de

produtos diferenciados, a serem comercializados em mercado específico

possibilitando a ascensão dos preços e a diminuição da competição entre empresas

produtoras de fécula e farinha de mandioca, pela mesma matéria prima, além de

proporcionar alimentos livres de glúten, que os tornam recomendáveis para pessoas

que apresentam intolerância alimentar a esta proteína, evitando assim o consumo

de qualquer produto contendo trigo, aveia, centeio, cevada e seus derivados.

(CEREDA et al., 2002, CEREDA et al., 2003).

Na América latina a produção de amidos alternativos, tais como biri é feita

pela Colômbia. No Brasil a produção de amido da araruta, foi substituída pela

mandioca por ser mais produtiva, entretanto inúmeras espécies tais como, açafrão,

inhame, batata doce, taioba, gengibre, araruta entre outras, são matérias primas

com potencial para a produção de amido (CEREDA et al., 2003).

Segundo Cereda (2002), a maioria dos amidos não convencionais segue a

mesma linha de produção da mandioca, sendo que no Brasil testes feitos em

fecularias, com batata doce e araruta apresentaram resultados satisfatórios tanto

em extração quanto em qualidade.

O preço do amido da araruta no mercado varia entre R$ 15,00 a R$ 20,00

reais o quilo e no mercado internacional chega a alcançar preços ainda mais

elevados (450 gramas custam cerca de US$ 22,19) (EBDA, 2013). Cerca de 50

plantas bastam para consumo próprio, rendendo de 5 a 10 quilos de fécula (amido

ou polvilho) ou de 15 a 20 quilos de farinha. Para produção comercial, ao menos

500 metros quadrados são necessários para o plantio (GLOBO RURAL, 2013). O

amido da araruta, retirado do rizoma é o principal recurso explorado nessa planta,

tem características e qualidades consideradas inigualáveis, conferindo leveza e alta

digestibilidade aos confeitos preparados (NEVES et al., 2005).

O mercado nacional e internacional de alimentos tem interesse em M.

arundinacea especialmente pela elaboração de produtos destinados a confeitaria

(LEONEL et al., 1998).

8

As características culinárias do amido, o destacam principalmente pela

leveza dos biscoitos, mingaus e bolos, em substituição às farinhas de trigo, milho ou

mandioca, além de ser utilizada para diversos usos medicinais (COELHO et al.,

2005).

O amido da araruta pode ser qualificado através da limpeza, conteúdo de

polpa e fibras, umidade, pH, viscosidade, cinzas e o mais importante, classificação

através de sua cor que deve ser mais branca possível (PURSEGLOVE, 1985). Suas

características básicas são de um pó branco, inodoro e insípido (BERNAL e

CORREA, 1994).

O rizoma contém, além de amido, celulose, proteína, açúcar, mucilagem e

sais minerais, betacaroteno, niacina, riboflavina, tiamina entre outros (Tabela 1),

algumas alterações desses componentes podem ocorrer devido a fatores como

clima, grau de fertilidade do solo, dentre outros fatores bióticos e abióticos

(MARTINS, 1943).

O cultivo das hortaliças não-convencionais, tais como a araruta no Brasil é

realizado principalmente por agricultores familiares. O conhecimento para o cultivo e

consumo destas plantas foi passado através das gerações. A maioria do cultivo é

através da agricultura familiar para consumo próprio, sem desígnio comercial

(BRASIL, 2010).

A araruta já foi muito cultivada no Brasil, mas perdeu espaço nos últimos 50

anos, chegando quase à extinção, devido à concorrência de outros amidos

produzidos em nível industrial como a mandioca, milho, aveia, cevada e trigo, o

cultivo da araruta foi sendo gradualmente substituído, porém, o amido de mandioca

não possui as mesmas características de fácil digestibilidade e capacidade de

gelificação (SILVA et al., 2000). Portanto, devido a sua importância é fundamental a

caracterização do seu material genético, através de marcadores moleculares, como

meio de preservação e conservação de seu germoplasma, com a possibilidade

futura da introdução de características fundamentais e que permanecem aos

diferentes genótipos, para formação de uma espécie melhorada.

9

Tabela 1 - Composição nutricional da araruta crua por 100 gramas

Nutrientes Unidade Valor por 100 g

Relacionados

Água g 80.75

Calorias kcal 65

Proteínas g 4.24

Lípides totais (gordura) g 0.2

Carboidratos, por diferença g 13.39

Fibra total dietética g 1.3

Cinzas g 1.42

Minerais

Cálcio, Ca mg 6

Ferro, Fe mg 2.22

Magnésio, Mg mg 25

Fósforo, P mg 98

Potássio, K mg 454

Sódio, Na mg 26

Zinco, Zn mg 0.63

Cobre, Cu mg 0.121

Manganês, Mn mg 0.174

Selênio, Se mcg 0.7

Vitaminas

Vitamina C, ácido ascórbico total mg 1.9

Tiamina mg 0.143

Riboflavina mg 0.059

Niacina mg 1.693

Ácido pantotênico mg 0.292

Vitamina B6 mg 0.266

Folato total mcg 338

Vitamina B12 mcg 0

Vitamina A UI 19

Vitamina A, RAE mcg_RAE 1

Lípides

Ácidos graxos, total saturados g 0.039

Ácidos graxos, total mono-insaturados g 0.004

Ácidos graxos, total poli-insaturados g 0.092

Fonte: USDA Nutrient Database for Standard Reference, Release 14 (Julho

2001)<http://www.unifesp.br/dis/servicos/nutri/nutri.php?id=2987> A acesso em: 03 de nov.2014.

10

1.4 Marcadores Moleculares

Com o advento das técnicas moleculares os marcadores de DNA tornaram-

se indicadores para o estudo de genética de vários organismos, incluído as plantas.

Estas técnicas tornaram-se rotineiramente aplicadas em pesquisa sobre a

biodiversidade, estudos de evolução e biotecnologia. Os marcadores moleculares

são características que identificam o perfil da molécula de DNA (fingerprinting) que

podem ser herdados e são capazes de diferenciar dois ou mais indivíduos (MILACH,

1998).

As técnicas aplicadas aos estudos de marcadores moleculares tornaram-se

cada vez mais rápidas, precisas e baratas, nas análises de detecção das variações

genéticas entre os organismos. No entanto, algumas técnicas são mais adequadas

do que outras.

Um marcador molecular deve apresentar algumas características

desejáveis, como: (i) ser de natureza altamente polimórfica para uso em estudos de

diversidade genética; (ii) possuir herança codominante para a determinação de

homozigose e ou heterozigose de organismos diplóides; (iii) ocorrer com frequência

no genoma, de forma uniforme e distribuída; (iv) apresentar comportamentos

seletivos neutros, pois as sequências de DNA são neutras em condições

ambientais; (v) fácil de ser detectado (disponibilidade): simples e rápido; (vi) ensaios

fáceis, rápidos e baratos; (vii) alta reprodutibilidade e (viii) fácil troca de dados entre

os laboratórios (KUMAR et al., 2009).

Entretanto, é extremamente difícil encontrar um marcador molecular, que

reúna todos os critérios acima mencionados.

Para avaliação e detecção do polimorfismo em nível de DNA, há diversas

técnicas moleculares disponíveis e a escolha da técnica ideal depende do tipo de

estudo a ser realizado. A escolha de um marcador deve ser determinada, quando

preenche pelo menos algumas das características acima citadas (WEISING et al.,

1995).

Vários tipos de marcadores moleculares são utilizados para avaliar o

polimorfismo de DNA e são geralmente baseados na hibridação e/ou na reação em

cadeia da polimerase (PCR). Na hibridização, os perfis dos tamanhos dos

fragmentos de restrição da molécula de DNA são visualizados por hibridação de

uma sonda marcada com substância radioativa e/ou fluorescente, a partir de um

11

fragmento de DNA de origem conhecida. A PCR é baseada na amplificação in vitro

de sequências de DNA específicas ou loci, orientada por oligonucleotídeos

específicos ou aleatórios (MATIOLI, 2001).

Em relação ao tipo de marcador é importante diferenciar aqueles que

fornecem dados de um único loci, daqueles que possuem múltiplos loci. Esta

informação é extremamente importante devido à quantidade de informações e

interpretação dos dados (MATIOLI, 2001).

Os marcadores multilocos utilizados em DNA fingerprinting, são as técnicas

denominadas de DNA polimórfico amplificado ao acaso (RAPD), polimorfismo de

tamanho de fragmentos amplificados (AFLP), Microssatélites e Minissatélites, os

quais são mais adequados para estudos de identificação genética, teste de

paternidade e estudo de variabilidade genética intra-espécie. Enquanto os

marcadores de Amplified Fragment Length Polymorphism (RFLPs) obtidos de DNA

mitocondrial (mtDNA), DNA de cloroplasto (cpDNA), DNA ribosomal (rDNA) são

mais apropriados para análises de espécies relacionadas (interespécies) (MATIOLI,

2001).

O uso da técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR), utilizada para

vários marcadores, como Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) ou DNA

amplificado ao acaso (WILLIAMS et al., 1990), AFLP ou polimorfismo de

comprimento de fragmento amplificado (VOS et al., 1995) e marcadores

microssatélites ou sequências simples repetidas (SSR) (MORGANTE e OLIVIERI,

1993).

As informações obtidas por meio dos marcadores moleculares são muito

úteis para auxiliar na identificação dos genótipos contrastantes em programas de

melhoramento de plantas o qual incluem diversos padrões para obtenção de

variabilidade genética, seleção de indivíduos superiores, avaliação de materiais

genéticos promissores para o comércio. Nesses programas os usos de marcadores

de DNA são aplicados no monitoramento e organização da variabilidade genética, a

seleção assistida por marcadores moleculares no qual detecta diferenças genético-

moleculares, representando o futuro promissor na agricultura e a proteção de

cultivares (FARALDO et al., 2003, FUKUDA et al., 1994; LEE, 1995).

Os marcadores moleculares constituem ferramentas de grande importância

para a identificação e caracterização dos acessos mantidos em Bancos de

Germoplasma de várias plantas tais como: mandioca, milho, feijão, soja, entre

12

outras, cujo principal objetivo é a manutenção da variabilidade genética (FALEIRO,

2007).

Sabe-se que muitos pesquisadores melhoristas, evitam trabalhar com

materiais disponíveis nas coleções de genótipos silvestres e etnovariedades por

falta de identificação e caracterização de genes com potencial para melhoramento

genético (FARALDO et al., 2003; NASS, 2001).

A escolha de genitores e o planejamento de cruzamento em programas de

melhoramento genético são etapas fundamentais para o sucesso do programa. Para

balizar este processo são essenciais a realização de caracterização genética

apuradas e precisas da coleção de acesso do banco de germoplasma, a qual é

obtida com base na avaliação acurada de características morfológicas, fisiológicas e

agronômicas, além de dados de pedigree (FALEIRO, 2007).

Dados adicionais sobre a diversidade genética de potenciais genitores

obtidos com base em marcadores moleculares podem auxiliar na escolha dos

genitores e no planejamento dos cruzamentos visando o melhoramento do efeito da

heterose e das recombinações gênicas desejadas (FALEIRO, 2007).

1.5 Marcador Molecular RAPD

A técnica de PCR permitiu o desenvolvimento de várias classes de

marcadores moleculares os quais são cada vez mais utilizados em várias espécies

de plantas. Dentre esses marcadores, destaca-se o Random Amplified Polymorphic

DNA (RAPD) ou DNA amplificado ao acaso (WILLIAMS et al.,1990).

A técnica de RAPD (Figura 6) é baseada na repetição cíclica da extensão

enzimática de iniciadores, como pequenos primers complementares, que se

hibridizam ao DNA e servem como molde na amplificação através da PCR. Os locos

que apresentam duas sequências alvo em fitas opostas com orientação e

espaçamento adequado são amplificados pelo processo de PCR (TINGEY et al.,

1992). Nesse método um único primer é utilizado o qual é normalmente formado por

diferentes combinações das quatro bases nitrogenadas que apresentam uma

sequência predominante de bases citosina e guanina (C/G 60 a 80%) e com alvos

desconhecidos. O RAPD tem sido adotado por alguns pesquisadores envolvidos no

desenvolvimento de métodos de identificação de cultivares, principalmente por ser

uma técnica simples que não requer nenhuma informação prévia sobre as

13

sequências de nucleotídeos do genoma da espécie, além de ser bastante acessível

e de custo relativamente baixo e pode ser utilizado sobre as informações

moleculares escassas (FRITSCH e RIESEBERG,1996; WEEDEN, 1992; MENEZES

et al., 2002).

Figura 4. Representação esquemática da técnica (RAPD).Fonte adaptada pela autora:

Disponível em: <http://www.usask.ca/.../projects_2002/pawlin/resources/rapd1.jpg>. Acesso em: 03

de nov. 2014.

Por apresentarem primers de sequência curta, há grande probabilidade de

que esses primers encontrem regiões do genoma onde se anelarem, fazendo com

que diversos fragmentos de tamanhos diferentes resultem de uma reação

(WILLIAMS et al., 1990).

Os polimorfismos são identificados pela presença de um fragmento específico

de DNA amplificado em um determinado genoma, comparado à ausência do mesmo

fragmento de outro genoma por apresentar de diferentes comprimentos, podem ser

separados e distinguidos por eletroforese (TINGEY et al., 1992). Apresentam

algumas limitações por serem marcadores dominantes, ou seja, indivíduos

homozigotos dominantes e heterozigotos não podem ser diferenciados, pois ambos

serão visualizados pela presença de uma banda no gel (WILLIAMS et al., 1990).

Contudo existem muitos trabalhos demonstrando resultados de identificação de

14

acessos com marcadores RAPD, utilizados na alimentação humana, tais como

mandioca, milho, arroz, cúrcuma longa e pimenta são alvos dessa técnica.

O uso da técnica RAPD produz um grande número de marcadores

moleculares, permitindo encontrar marcadores específicos de gêneros, espécies,

subespécies, ou raças, sendo de grande interesse para o estabelecimento de

relações taxonômicas (HADRYS et al., 1992; AAGAARD et al., 1995), para o

estabelecimento de relações filogenéticas e diferenciação de espécies próximas

(ARNOLD et. al., 1991; LINFANTE e AGUINAGALDE, 1996; WOLFF e MORGAN-

RICHARDS, 1998), e para detecção de híbridos (DAEHLER e STRONG, 1997; DE

GREEF e TRIEST, 1999; KUEHN et al., 1999).

Nos estudos de Angel et al. (2008), utilizando 11 espécies de cúrcuma,

testados com 20 primers, no total de 274 bandas foram geradas, das quais 264

foram polimórficas revelando um elevado grau de polimorfismo, possibilitando a

identificação da espécie.

A técnica de RAPD e ISSR foram utilizadas para avaliar a variação genética

entre 13 cultivares de Calathea em 11 espécies. No total, 262 bandas foram

encontradas, das quais 252 eram polimórficas, resultando em alto grau de

polimorfismo 96,1%. Assim, estes marcadores têm o potencial para a identificação

de espécies / variedades e útil em programas de melhoramento genético (ROUT, et

al.,2007).

Outro estudo analisou a variabilidade genética entre Açafrão (Curcuma longa)

entre 20 acessos obtidos de diferentes regiões do Brasil, onde foram utilizados 45

loci polimórficos. Através de teste estatístico AMOVA houve a formação de dois

grupos. A proporção da variabilidade genética existente entre os três acessos pré-

estabelecidos permitiu verificar 44,49% de variabilidade genética entre os grupos

(PINHEIRO et al., 2003).

Estudos já publicados envolvendo plantas da mesma família, como o açafrão

e o gengibre, foram utilizados como referência para o desenvolvimento deste

trabalho, utilizando a M. arundinacea. Existem muitos trabalhos na literatura

utilizando marcadores de DNA para a caracterização da variabilidade genética em

muitas espécies de populações naturais (JAGGI et al., 2000; BOUZAT, 2001).

15

1.6 PCR Convencional

As técnicas que envolvem o uso de DNA apresentam alto poder de

resolução, com as diferenças entre os indivíduos detectadas nas sequências de

nucleotídeos distribuídas pelo genoma (FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998), que

permitem a distinção entre genótipos com elevada facilidade, utilizando primers

pequenos e de sequência arbitrária, revelando ser uma técnica muito simples e de

custo moderado, permitindo a análise genética de varias espécies (HADRYS et al.,

1992).

Diversas técnicas estão disponíveis, as baseadas na reação da polimerase

em cadeia (PCR) oferecem vantagens em relação a outros métodos, pois as

quantidades de DNA utilizadas são mínimas na proporção de picogramas ou

nanogramas, permitindo a amplificação do produto, resultando em moléculas de

DNA com sequência homóloga ao DNA, que serviu de origem e os perfis

eletroforéticos são obtidos com maior rapidez (FERREIRA e GRATTAPAGLIA,

1998; GUIMARÃES, 1999; TAYLOR, 1993).

Kary Mullis nos anos 80 desenvolveu a técnica de PCR Polymerase Chain

Reaction ou Reação em Cadeia de Polimerase, realizada em um termociclador,

aparelho que permite a realização de três etapas fundamentais para amplificação do

DNA, que são desnaturação, anelamento e extensão.

A desnaturação do DNA consiste na elevação da temperatura a 92/95°C e

no rompimento das pontes de hidrogênio, separando a fita dupla de DNA. As fitas

simples de DNA são expostas, criando um molde, nas quais serão anelados o

primer ou iniciador, complementando sua sequência (EISENSTEIN, 1990,

SCHEINERT et al., 2005). Na etapa de anelamento ocorre uma variação na

temperatura de 35/60°C dependendo essencialmente do tamanho e sequencia dos

iniciadores utilizados, permitindo a hibridização DNA-DNA de cada iniciador com as

sequências complementares da fita simples (molde) que flanqueiam a região alvo.

Na última etapa ocorre a extensão no sentido 5’- 3’, através da ativação da enzima

DNA polimerase, em uma temperatura elevada 72°C (TAYLOR, 1993) .

Um fator importante deve-se aos seus sítios de anelamentos que devem

estar em uma distância suficiente para que não ocorra o anelamento entre os

primers, assim permitindo a síntese subsequente de um novo produto. Para uma

amplificação perfeita se faz necessária à padronização da reação e esta consiste na

16

otimização dos reagentes utilizados, como o tampão da Taq DNA polimerase,

MgCl2, iniciadores (com pequenas sequências de nucleotídeos, denominados de

primers), desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dATP, dCTP, dGTP,dTTP) e a

enzima termoestável Taq DNA polimerase, isolada da bactéria termofílica Thermus

aquaticus (EISENSTEIN, 1990).

A quantidade de ciclos geralmente é determinada pelo pesquisador e/ou de

acordo com o tamanho do produto a ser amplificado e a especificidade do primer, o

ciclo é repetido por algumas dezenas de vezes, as fitas de DNA se multiplicam à

medida que os ciclos vão se repetindo e os primers consumidos, esses primers irão

definir a sequência a ser replicada, resultando na amplificação de uma determinada

sequência de DNA com bilhões de cópias (EISENSTEIN, 1990; MULLIS, 1987).

1.7 DNA barcoding

Nas plantas, as sequências de DNA podem ser obtidas a partir de três

genomas: cloroplasto (cpDNA), mitocôndria (mtDNA) e núcleo (nDNA). As variações

que ocorrem nesses genomas, tais como mutações pontuais e rearranjos, incluindo

inversões, deleções e inserções, são os caracteres utilizados em estudos de

filogenia (Figura 4).

Estas sequências de DNA de regiões padrão têm sido utilizadas como

ferramentas para a identificação de espécies de organismos e são denominadas de

barcoding (código de barra).

Segundo o - Consortium for the Barcode of Life - CBOL (2009), DNA

barcoding envolve o sequenciamento de uma região padrão de DNA como uma

ferramenta para a identificação de espécies. Lahaye et al., (2008), afirmam que

DNA barcoding é uma técnica em que a identificação de espécies é realizada

usando sequências de DNA a partir de um pequeno fragmento do genoma, com o

objetivo de contribuir nos estudos ecológicos e de conservação em que a

identificação taxonômica tradicional seria inviável.

17

Figura 5. Regiões mais utilizadas como DNA Barcoding em plantas Fonte modificada pela autora de: <http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Morfofisiologia_vegetal/morfovegetal17.php>

<http://losrelatosdesamid.blogspot.com.br/2013/05/mitocondriashtml>

<http://cmapspublic2.ihmc.us/rid=1N2FN04F7JMPKS2109/Recursos%20para%20organelas%20citopl

asmaticos>. Acesso em: 03 de nov. 2014.

Para uma região do gene se tornar um DNA barcoding foram definidos três

critérios: conter variabilidade genética entre espécies em nível significativo de

divergência, possuir locais de flancos conservados para o desenvolvimento de

primers universais para PCR a fim de serem aplicados em estudos de taxonomia,

além de terem um comprimento de sequência curta, para facilitar a extração e

amplificação do DNA (KRESS et al., 2008).

O marcador barcoding, mais utilizado é uma região do gene citocromo c

oxidase mitocondrial (COI ou cox1), muito empregado nos grupos de animais. O

mesmo barcoding foi testado para as plantas terrestres, entretanto não

demonstraram sucesso, a dificuldade está nas 300,000 espécies de plantas

terrestres (HEBERT et al., 2003).

Portanto, é inviável sua utilização em plantas principalmente as

Angiospermas, devido a divergências das regiões codificantes do gene COI e por

rapidamente terem a estrutura do seu genoma mitocondrial modificada, além de

18

apresentarem baixas taxas de substituição de bases no DNA mitocondrial,

características que levaram a busca de regiões barcoding alternativos, como as

regiões do DNA plastidial (KRESS et al., 2005; FAZEKAS et al., 2008; CBOL,

2009).

O Consortium for the Barcode of Life criado em 2004 com intuito de facilitar e

formalizar a seleção de um código de barras de plantas. Para isso realizou-se a

formação de um grupo de trabalho com representantes de consórcios de diferentes

grupos de pesquisa por parte da comunidade sistemática que propôs, os sete

principais marcadores barcoding candidatos, presentes no DNA de cloroplasto

(HOLLINGSWORTH et al., 2011).

O cloroplasto é uma organela citoplasmática, abundante nas células vegetais

constituído por apenas um cromossomo circular facilmente isolado (PALMER,

1987). O genoma plastidial possui 120-160 kilo pares de bases (kpb) a estrutura

geral é representada por duas regiões a Large Single Copy Region (LSC) e a Small

Single Copy Region (SSC) interrompidas por duas copias de Large Inverted

Reapets (IRa e IRb) (Figura 5). O genoma do cloroplasto contem todos os genes

ribosomais (rRNA) e transportadores para a síntese das proteínas fundamentais

para seu funcionamento (SHINOZAKI et al., 1986).

Geralmente, o cpDNA apresenta herança unipariental, sendo transmitido

apenas pelo gameta feminino na maioria das angiospermas (DEMESURE et al.,

1995). Além disso, é altamente conservado em termos de tamanho, conteúdo,

estrutura e ordem dos genes (JUDD et al., 2002). Isso permite que iniciadores

específicos desse genoma sejam utilizados em quase todo o reino vegetal,

facilitando a comparação entre os diferentes táxons.

A recomendação de um código de barras padrão de plantas foi realizada pelo

CBOL (2009), que comparou o desempenho das sete principais regiões presentes

no cpDNA, denominadas de matK, rbcL, rpoB, e rpoC1,ATPF-atpH, trnH-psbA, e

psbK-psbI (KRESS et al., 2005; SHAW et al., 2007; ŠTORCHOVÁ e OLSON, 2007).

19

Figura 6. Esquema do Genoma do Cloroplasto. Fonte:<http://pt.slideshare.net/lonachaliha/chloroplast-21493415>. Acesso em 03 de nov.

2014.

.

O gene matK codifica a proteína maturase K, o gene rbcL codifica a

subunidade grande da ribulose-1,5- bifosfato carboxilase/oxigenase, o gene rpoB

codifica a subunidade β da enzima RNA polimerase do cloroplasto, e o gene rpoC1

codifica a subunidade β’ da enzima RNA polimerase do cloroplasto. As regimer

atpF-atpH, trnH-psbA e psbI-psbK são espaçadores Intergênicos. Os genes atpF e

atpH codificam as subunidades CFO I e CFO III da ATP síntase, respectivamente.

Os genes psbK e psbI codificam dois polipeptídios de baixa massa molecular do

fotossistema II; estas duas regiões são altamente conservadas desde as algas até

as plantas terrestres e parasitarias (LAHAYE et al., 2008, LOPES 2011). O gene

trnH e um gene de tRNA e psbA codifica a proteina D1 do fotossistema II. Todos

20

estes dez genes são cloroplastidiais e localizam-se na região Large Single Copy

(LSC) do genoma do cloroplasto (LOPES, 2011).

Após a avaliação das propostas e inúmeros trabalhos na busca barcoding em

plantas o comitê executivo da CBOL concluiu que só rbcL (marcador de taxa

evolutiva lenta, porém conservada) e matK (mais variável porém de maior

resolução) estão entre as regiões de código de barras aprovados para as plantas

terrestres (CBOL, 2009).

Portanto, o CBOL ao recomendar os genes rbcL e matK como o código de

barras para as plantas terrestres, considerou ser necessário a introdução de novos

dados para a caracterização desses genes, assim como os progressos obtidos

através dos primers do matK e rbcL.

1.7.1 Maturase K

O gene matK é utilizado como um marcador na construção filogenética e tem

mostrado alto poder de distinção taxonômico tanto em níveis de ordem e família

quanto em níveis de gênero e espécies de plantas, devido a sua rápida evolução,

presença em todas as plantas e elevado poder de discriminação entre espécies

(HILU e LIANG, 1997).

O gene matK tem aproximadamente 1500 pb está localizado dentro de um

íntron classe II, entre os exons 5’ e 3’ do gene que codifica o trnK. (SUGITA et al.,

1985; STEANE, 2005; DANIELL et al., 2006; TURMEL et al., 2006). Este gene é de

cópia única contém altas taxas de substituição dentro da espécie e está emergindo

como potencial candidato para estudos de sistemática vegetal e evolução. Desta

forma, filogeneticamente, a taxa de evolução do matK é adequada para resolver

relações intergênero, bem como as relações interespécies em muitas plantas

angiospermas (HILU e LIANG, 1997) .

O complexo gene matK - trnK é comumente utilizado para estudos de

evolução de plantas e aborda a solução para vários níveis taxonômicos. O gene

matK tem o tamanho ideal, elevada taxa de substituição, grande proporção da

variação em nível do ácido nucleico, na primeira e segunda posição do códon,

baixo razão de transição/ transversão, e a presença de setores mutacionalmente

conservadas (HILU e LIANG, 1997) .

Para os estudos de barcoding o segmento utilizado de matK compreende em

aproximadamente 790 pb (STOECKLE et al., 2011). Devido as características de

21

alto poder de discriminação e universalidade das espécies o CBOL recomendou

como código de barras de plantas o matK em combinação com rbcL (VIJAYAN e

TSOU, 2010).

1.7.2 rbcL

Pela sua característica a maior subunidade da ribulose-1,5-bifosfato

carboxilase oxidase (RuBisCO ) desperta o interesse de engenheiros genéticos e

filogenistas de plantas, por ser um gene codificante de uma proteína altamente

conservada o rbcL. O sítio ativo, que é responsável por quase toda a fixação de

carbono na terra (KELLOGG e NICKOLAS, 1997) é o gene mais comum utilizado

para fornecer dados filogenéticos.

Este gene está localizado na região Large Single Copy do cloroplasto, com

aproximadamente 1.430 pares de bases, e apresenta uma taxa de evolução lenta e

bastante conservada, apresentando boa resolução em níveis taxonômicos mais

elevados, como família. Como a RuBisCo é uma enzima fotossintética muito

importante, o rbcL foi o primeiro gene das plantas a ser sequenciado (ZURAWSKI et

al., 1981). Este gene tem sido utilizado amplamente em estudos filogenéticos de

plantas com mais de 10000 sequências do rbcL, já disponíveis no GenBank

(CHASE et al., 2007).

2 OBJETIVOS

Identificar os acessos de M. arundinacea por meio dos genes cloroplastidiais

matK (maturase K) e o rbcL (ribulose-1,5-bifosfato carboxilase/oxigenase).

Determinar a similaridade genética entre os acessos de M. arundinacea

(intraespecífica), por meio de marcadores RAPD.

22

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CAPÍTULO I: Caracterização dos genes matK e rbcL e da

variabilidade genética entre os acessos de Araruta (Maranta

arundinacea L.).

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Caracterização dos genes matK e rbcL e da variabilidade genética

entre os acessos de Araruta (Maranta arundinacea L.).1

1 Parte da dissertação de mestrado da primeira autora

Ingrid Batista Pinto2; Carina Elisei de Oliveira 3 .

2 Aluna do mestrado em Biotecnologia da UCDB;

3 Professora Dra. responsável pelo laboratório de Biologia Molecular da UCDB;

.

Autor para correspondência: ingridbatistabiotec@gmail.com;

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INTRODUÇÃO

A família Marantaceae é um grande grupo de plantas da ordem Zingiberales

(NEVES et al., 2005), apresenta distribuição de forma pantropical, são plantas

típicas de florestas úmidas tropicais, crescendo principalmente em margens de rios

e clareiras, são compostas por 530 espécies e 31 gêneros (KENNEDY, 1977;

ANDERSSON, 1986; KENNEDY,1997, 2000). De acordo com Souza e Lorenzi,

2005 o Brasil, possui 150 espécies, o gênero mais representativo no país é

Calathea e Maranta.

Os representantes desta família são utilizadas como plantas ornamentais e

algumas espécies são utilizados na alimentação humana tais como Maranta

arundinacea L. e Calathea allouia Lindl, (ARNS, 1997).

Maranta é um gênero exclusivamente neotropical com 34 espécies

distribuídas em toda a América Central e do Sul, mas com a maioria das espécies

concentrada na mata Atlântica, floresta Amazônica brasileira e no cerrado (VIEIRA e

SOUZA, 2008).

A araruta (Maranta arundinacea L.) é uma planta herbácea, com caule

articulado de 1,20 m de altura, rizoma fuziforme, casca brilhante, com escamas e

produzido em tufos aderentes aos rizomas (MONTEIRO e PERESSIN, 2002). Sua

principal importância esta relacionada às características do seu amido, o qual

confere leveza e alta digestibilidade aos confeitos (NEVES et al., 2005).

Devido à produção industrial de outras fontes de amido, tais como mandioca,

milho, aveia, cevada e trigo, o cultivo da araruta foi sendo gradativamente

substituído, chegando a quase extinção, sendo de grande importância a

caracterização de seu material genético através de marcadores moleculares, como

meio de preservação e conservação da sua diversidade e populações (FARALDO et

al., 2003, NASS, 2001).

Uma das técnicas utilizadas atualmente para a identificação de espécies é

baseada na técnica de DNA barcoding a qual realizada usando sequências de DNA

a partir de um pequeno fragmento do genoma, com o objetivo de contribuir para

uma ampla gama de estudos ecológicos e de conservação em que identificação

taxonômica tradicional não é viável (LAHAYE et al., 2008). Sete principais regiões

do DNA do cloroplasto foram analisadas como potencial barcoding, mais somente o

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gene rbcL e matK estão entre as regiões de código de barras aprovados para as

plantas terrestres, segundo o CBOL (Consortium for the Barcode of Life).

A caracterização morfológica dos acessos de plantas visa basicamente à

diferenciação fenotípica entre os acessos, contribuindo para reduzirem as

duplicações. A caracterização e avaliação do germoplasma de algumas plantas são

fundamentais para a sua utilização mais eficiente nos trabalhos de melhoramento.

(FUKUDA et al., 1994).

Técnicas envolvendo marcadores moleculares permitem compreender e

organizar a variabilidade genética de um programa de melhoramento, acessando

variabilidade de DNA, que não é influenciado pelo ambiente como são, por exemplo,

os caracteres morfológicos e fenotípicos em geral de uma planta. Entre as técnicas

disponíveis, os marcadores RAPD (WILLIAMS et al., 1990), são utilizados por

alguns pesquisadores envolvidos no desenvolvimento de métodos de identificação

de cultivares (WEEDEN, 1992; MENEZES et al., 2002), principalmente por ser uma

técnica simples que não requer nenhuma informação prévia sobre sequências de

nucleotídeos do genoma da espécie. Além disso é bastante acessível e de custo

relativamente baixo que pode ser utilizada em organismos cujas informações

moleculares ainda são escassas.

Diante do exposto, este trabalho teve como objetivo identificar os acessos de

M. arundinacea através dos genes cloroplastidiais matK (maturase K) e o rbcL

(ribulose-1,5-bifosfato carboxilase/oxigenase), assim como determinar a

variabilidade genética entre os acessos de M. arundinacea (intraespecífica), por

meio de marcadores RAPD.

MATERIAL E MÉTODOS

AMOSTRAS

Obtenção das amostras

As amostras foram obtidas de plantas matrizes de M. arundinacea do acesso

denominado de Comum (adquirido do Centro de Tecnologia e Estudos do

Agronegócio da UCDB- CeTeAgro) e os rizomas dos acessos denominados de SC ,

Guadalupe e Seta adquiridos de banco de germoplasma CERNAGEM –EMBRAPA

Brasília e cultivados no CeTeAgro (Figura 1). Os acessos foram cultivados em

35

vasos no pátio lateral da casa de vegetação do CeTeAgro e posteriormente as

folhas foram coletadas para as análises.

Figura 1. Imagens dos quatro acessos da M. arundinacea. A) Acesso Comum-CeTeAgro, B) Acesso SC- CERNAGEM –EMBRAPA Brasília, C) Acesso Guadalupe- CERNAGEM –EMBRAPA Brasília, D) Acesso Seta- CERNAGEM –EMBRAPA Brasília.

AVALIACÃO DO PERFIL GENÉTICO

Para a análise molecular foram coletadas com aproximadamente três meses

de cultivo 10 folhas jovens, de cada acesso. O material colhido foi lavado com

hipoclorito e álcool 70%, e enxaguados com água destilada. Acondicionados em

placas de Petri e secos com toalha de papel esterilizada. Com auxílio de um pistilo

esterilizado, as folhas foram maceradas em cadinho de porcelana separadamente

com nitrogênio líquido, e transferidos para tubo tipo falcon de 50 mL e

imediatamente, acondicionados em ultrafreezer – 80°C.

EXTRAÇÃO DO MATERIAL GENÉTICO

A extração de DNA foi realizada a partir de folhas de acordo com Saghai-

Maroof et al. (1984), otimizado para extração de DNA de araruta.

36

Aproximadamente, 10g de tecido foliar fresco, macerado com nitrogênio

líquido, e ressuspendidas em 10 mL de tampão de extração CTAB 1% (70 μM de

NaCl; 50 μM de EDTA pH 8,0; 100 μM Tris-HCl pH 7,5; 1% de p/v de CTAB; 1% de

p/v de polivinil pyrrolidone, 140 μl de β- mercaptoetanol e água destilada

deionizada). A seguir, as amostras foram incubadas em banho-maria a 65ºC por

aproximadamente 60 minutos, agitadas levemente a cada cinco minutos. Após foi

adicionado 15 mL de fenol/clorofórmio (1:1), invertendo os tubos. Transferindo o

sobrenadante para tubos novos e o procedimento foi repetido mais uma vez. Em

seguida, foram adicionados 15 mL de clorofórmio/álcool isoamílico (CIA) na

proporção de 24:1 (v:v), efetuando-se a inversão dos tubos seguida de

centrifugação à 3400xg por 10 minutos. O sobrenadante foi coletado e transferido

para tubos novos e adicionado 20mL de isopropanol absoluto (v:v) a –20ºC,

promovendo a precipitação do DNA, o qual foi centrifugado, retirado o

sobrenadante, permanecendo o pellet. Após o DNA foi ressuspendido em 13mL de

TE (10 mM de Tris-HCl pH 8,0 e 1 mM de EDTA). Para precipitar o DNA foi

adicionado 0,5mL de NaCl 5M e 20 mL de etanol absoluto.Os tubos foram invertidos

e centrifugados. Em seguida foi acrescentado 10 ml de etanol 70% a –20ºC,

promovendo a lavagem do DNA, seco ao ar, e suspender novamente em 1mL de

tampão TE, adicionando 120 μL de RNAse (4 mg/mL), incubando a 37ºC por

30minutos. Em seguida, a suspensão de DNA foi armazenada a 20ºC até o

momento do uso.

A concentração do DNA foi estimada através de Biofotômetro (Eppendorff). A

integridade do DNA foi avaliada por eletroforese em gel de agarose 0,8 % em

tampão TBE 1x (89mM de Tris-base; 89mM de ácido bórico; 2 mM de EDTA pH 8,0

e água destilada e deionizada até completar o volume de 100 mL). Para a

visualização do DNA, o gel foi corado com brometo de etídio na proporção de 0,5

μg/mL de gel. Após a eletroforese, foi fotografado sob luz UV em sistema digital

L.Pix Image (Loccus Biotechnology).

VERIFICACÃO DA QUANTIDADE E QUALIDADE DO DNA

A concentração e pureza do DNA foram avaliadas através de

espectrofotômetro (modelo Epperdorf AG 2231 Homburg, Bio Photometer) pela

leitura de absorbância a 260nm e a 280nm, razão das leituras A260/ A280. Para cada

amostra foram realizadas três leituras e consideradas as médias.

37

DESENHO DE PRIMERS (INICIADORES) DOS GENES MATK E RBCL

Nas análises de (PCR), foram utilizados quatro primers desenhados,

utilizando o Custom Primers - OligoPerfect™ Designer da Invitrogem, balizados nas

sequências depositadas no GenBank ( Tabela 1).

PCR CONVENCIONAL

As reações de polimerase em cadeia (PCR) foram preparadas em volume de

50μ L contendo, tampão de PCR 1X, 1,65mM MgCl2, 0,1mM de cada dNTP, 20pM

de primer, 100ng de DNA genômico e 1U de TaqDNA polimerase (Invitrogen). A

amplificação foi realizada em termociclador PTC-100 (MJ Research) programado

como se segue: desnaturação inicial de 5min a 94ºC, 35 ciclos de 1min a 94ºC, 1

min a 50ºC e 1min a 72ºC, com extensão final de 10min a 72ºC, resfriamento a 4ºC.

Os produtos da PCR foram analisados em gel de agarose 2,0% e corados com

brometo de etídio a 0,5 μg/mL. A eletroforese foi realizada em cuba horizontal (Bio

Rad®) com tampão TBE 1X. As amostras foram submetidas à eletroforese a 100

Volts por duas horas, através de fonte Power Pac HV (Bio Rad®). O gel foi

fotografado sob luz UV em sistema digital L.Pix Image (Loccus Biotechnology). Após

o método de PCR as amostras foram purificadas, quantificadas, seguido de

sequenciamento. Ambas as cadeias de DNA foram geradas em um sequenciador

automatizado UP TO 950pb (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, EUA), e o

alinhamento foi determinado manualmente por meio do software BioEdit v.7.2.5

(HALL, 1999). As sequências obtidas foram comparadas nos bancos de dados

internacionais como o BOLD System do International Barcode of Life, e Genbank.

Tabela 1. Genes utilizados, primers e os números de acesso no GenBank

Primer Sequência 5’ 3’ GenBank Região de

Amplificação

rbcL forward AGTGTTGGATTTAAAGCTGGTGTT JQ592613.1 1-24

rbcL reverse TGGTTTAATAGTACATCCCAATAGGG JQ592613.1 503-476

matK forward GATCACGGTTTAACTAGTTCGATTTT JQ341325.1 100-125

matK reverse CTTGTTGCAATAGAAGAAAACCC JQ341325.1 1800-1778

38

ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS DOS GENES MATK E RBCL

Para se analisar acessos desconhecidos molecularmente, duas metodologias

foram propostas por Hebert et al.(2003). A primeira Kimura 2- parâmetros ou

K2P(KIMURA, 1980), sendo as árvores construídas utilizando Neighbor-Joining

(SAITOU N. e NEI M., 1987). A segunda é a utilização de busca nos bancos de

dados BLAST e BOLD Systems.

As sequências forward e reverse de cada par de primer foram feitas em

duplicata, editadas, e manualmente selecionado para eliminação de sequências de

baixa qualidade. e convertidas em formato FASTA no programa BioEdit (HALL,

1999). Alinhamentos múltiplos das sequências foram realizados através do software

Jalview (WATERHOUSE, 2009).

As sequências alinhadas foram analisadas através, da busca BLAST

(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) e BOLD Systems (www.barcodinglife.com), onde

um algoritmo procura trechos de similaridade local entre as sequências amostradas

e os resultados podem ser visualizados em ordem decrescente, das espécies já

identificadas, onde foi possível a comparação dos genótipos das plantas usadas

neste trabalho.

O modelo de substituição de nucleotídeos estabelecido para quantificar a

divergência entre indivíduos é o K2P, pois é o modelo mais indicado quando as

distâncias genéticas são pequenas (NEI e KUMAR, 2000). Os padrões de

divergência sugeridos pelas distâncias intra e interespecíficas foram graficamente

representados usando um dendrograma de Neighbor-Joining (NJ) com 1000

réplicas de bootstrap. As análises foram realizadas utilizando o programa MEGA 6

(TAMURA et al. 2013).

MARCADORES RAPD

Para as análises de diversidade genética, entre os acessos foi utilizado o

marcador molecular RAPD (Polimorfismos de DNA amplificados ao acaso), que se

baseia na amplificação arbitrária simultânea de fragmentos de DNA. Os 25 primers

utilizados e as suas respectivas sequências estão descritos na Tabela 2.

39

Tabela 2. Lista dos primers utilizados com suas respectivas sequências de bases.

Primer Sequência 5’ 3’ Primer Sequência 5’ 3’

OP 81 GGA GCG TAC T OPC 08 TGG ACC GGT G

OP 93 GTG CCG CACT OPD 01 ACC GCG AAG G

OP 95 GTG ACC AGA G OPD 08 GTG TGC CCC A

OPA 01 CAG GCC CTT C OPE 03 CCA GAT GCA C

OPA 02 TGC CGA GCT G OPE 06 AAG ACC CCT C

OPA 04 AAT CGG GCT G OPF 05 CCG AAT TCC C

OPA 05 AGG GGT CTT G OPM 05 GGG AAC GTG T

OPA 07 GAA ACG GGT G OPP 14 CCA GCC GAA C

OPA 17 GAC CGC TTG T OPAB 01 CCG TCG GTA G

OPA 18 AGG TGA CCG T OPAF 05 CCC GAT CAG A

OPA 20 GTT GCG ATC C OPAL 03 CCC ACC CTT G

OPC 04 CCG CAT CTA C OPBA 02 TGC TCGGCT C

OPC 07 GTC CCG ACG A - -

As reações de polimerase em cadeia (PCR) foram preparadas em volume de

25μ L contendo tampão de PCR 1X, 3mM MgCl2, 0,1mM de cada dNTP, 0,2μM

de primer, 30ng de DNA genômico e 1U/uL de TaqDNA polimerase (Invitrogen). A

amplificação foi realizada em termociclador PTC-100 (MJ Research) programado

como se segue: desnaturação inicial de 5min a 94ºC, seguido de 40 ciclos de 1min a

92ºC, 1min e 30 sec. a 37ºC, 1min e 30 sec. a 72ºC, com extensão final de 6min a

72ºC. Os produtos amplificados foram analisados em gel de agarose 1,0%. A

eletroforese foi realizada em cuba horizontal (Bio Rad®) com tampão TBE 1X a 100

Volts por duas horas, através de fonte Power Pac HV (Bio Rad). O gel foi corado

com brometo de etídio e foto documentado em grafado sob luz UV em sistema

digital L.Pix Image (Loccus Biotechnology).

Todas as etapas de preparação dos reagentes foram realizadas em capela

específica para PCR com prévia utilização de luz ultravioleta durante 15 minutos.

ANÁLISE DOS DADOS OBTIDOS ATRAVÉS DE MARCADORES RAPD

Com os géis obtidos gerou-se uma matriz binária em que os acessos foram

genotipados quanto à presença (1) e ausência (0) de bandas, com a matriz binária

40

calculou-se a porcentagem de polimorfismo de cada primer utilizado através da

fórmula:

P = nbt

nbp

Sendo que:

P= porcentagem de polimorfismo (ou taxa de polimorfismo);

nbp=número de bandas polimórficas;

nbt=número de bandas total.

Com matriz binária calculou-se também o coeficiente de similaridade de

Jaccard entre todos os acessos conforme a formula abaixo:

Sij= a

a+b+c

Sendo que:

a = número de casos em que ocorre a presença da banda em os ambos acessos,

simultaneamente;

b = número de casos em que ocorre a presença da banda somente no indivíduo i;

c = número de casos em que ocorre a presença da banda somente no indivíduo j.

A análise de agrupamento foi realizada pelo método UPGMA (Unweighted

Pair-group Method with Arithmetical Average. Todas as análises foram rodadas no

programa R Studio, versão 0.98.1091.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O DNA extraído foi avaliado por eletroforese em gel de agarose,

demonstrando que o protocolo segundo Saghai-Marrof et al. (1984), utilizado nesta

pesquisa possibilitou a obtenção de um DNA genômico de boa quantidade e

qualidade. Isso foi possível devido à quantidade de reagentes (EDTA, PVP, 2-

Mercaptoetanol), que inibem a degradação do material genômico, inativando

enzimas específicas ou compostos secundários, promovendo a quelação de cátions

41

divalentes, tais como Mg2+ e Ca2+, mantendo o pH do tampão estável (Tris-HCl) e a

desproteinização gerada por diversos reagentes orgânicos utilizados nas etapas da

extração (Fenol, Clorofórmio, Alcool Isoamílico, Isopropanol), assim como a retirada

de RNA da amostra através do uso de RNAse (BONATO et al., 2002).

A utilização de todos os reagentes combinados em etapas determinadas da

extração, assim como a utilização do CTAB (Cationic hexadecyl trimethyl

ammonium bromide ou brometo de cetiltrimetilamônio), que faz com que

polissacarídeos e ácidos nucleicos possuam solubilidade diferenciada na presença

desse detergente, inibindo a ação de complexos polifenólicos que, segundo Couch

& Fritz (1990), aderem irreversivelmente ao DNA, inibindo a ação das DNA

polimerase e das endonucleases de restrição.

Os dados de quantificação do material genético dos quatro acessos

avaliados via espectrofotometria variou de 1,91 a 1,94 apresentando-se dentro dos

parâmetros desejados (Tabela 3). Segundo Barbosa (1998), um DNA puro tem

OD260/OD280 de 1,8 a 2,0 e uma razão menor que 1,8 indica possível

contaminação das amostras com proteínas e/ou outras substâncias em grande

quantidade na amostra, enquanto a razão maior que 2,0 indica que as amostras

devem estar contaminadas com compostos orgânicos.

Tabela 3. Dados de quantificação via espectrofotometria das extrações de material genético foliar de quatro acessos de araruta. A absorbância (Abs) foi medida no comprimento de onda de 260 a 280 nanômetros

Acesso Concentração

ng/µL

Qualidade

Abs: 260/280

Araruta Comum 3366 1.94

Araruta Seta 1961 1.91

Araruta Guadalupe 1375 1.94

Araruta SC 1936 1.92

A extração de DNA é apenas uma etapa que precede as técnicas aplicadas à

PCR, como a RAPD. A aplicação de um material genético de boa qualidade

empregado na técnica de PCR diminui as chances de alterações de resultados ou

inibição da mesma, ocasionado por algum contaminante que não tenha sido

removido no momento da extração.

42

As amplificações do gene matK e rbcL dos diferentes acesso de araruta

geraram fragmentos de 2000 pb e 500pb respectivamente, e não foi possível

verificar variação nos padrões de bandas amplificados entre os acessos.

Os produtos amplificados foram sequenciados em ambas as direções e estes

foram alinhados. As sequências e os fragmentos com baixa qualidade foram

eliminados manualmente, objetivando minimizar os erros.

O sequenciamento do gene matK, de todos os acessos estudados, produziu

sequências muito pequenas, e o acesso Seta foi excluído devido a má qualidade da

mesma. A falha de amplificação por PCR do matK em alguns grupos taxonômicos

foi relatada em alguns estudos, pois os iniciadores projetados dentro da região de

matK podem ser problemáticos para a amplificação de PCR e sequenciamento,

devido a ampla variabilidade na região do matK, o que leva à concepção de novos

primers taxon-específicos ou modificações dos iniciadores existentes (WOLF et al.,

1987; YU, et al., 2011). No entanto as sequências do gene matK, foram as que

obtiveram desempenho menos satisfatório no sequenciamento.

O matK é bastante útil em reconstruções filogenéticas em níveis taxonômicos

como a ordem ou a família, mas tem sido utilizado igualmente em níveis, como o

gênero ou a espécie (CHASE et al., 2007; LAHAYE et al., 2008), porém, por serem

muito similares, não houve distinção em nenhum dos níveis taxonômicos citados

acima para os acessos de Maranta arundinacea.

A região amplificada correspondente ao gene matK dos quatro acessos

(Comum, SC, Guadalupe e Seta), obteve-se um valor máximo de identidade de

99,66%, quando submetidas no programa, BOLD Systems. Houve uma diferença

quando a comparação ocorreu através do BLAST, onde as sequências deram um

valor de 100% de identidade entre os acessos. Estes resultados só confirmam que

os quatro acessos testados todos são da espécie M. arundinacea.

Já as sequências do gene rbcL, apresentaram boa qualidade no

sequenciamento. Os acessos Comum e JQ592613.1 (Genbank), apresentaram

maior similaridade entre si, diferenciando-se igualmente dos acessos SC,

Guadalupe e Seta. A partir do alinhamento das sequências foi possível gerar um

dendograma (Figura 2), possibilitando a construção de um grupo com subgrupo e o

outgroup. O subgrupo é constituído pelos acessos Comum e rbcL (JQ592613.1) de

M. arundinacea o valor de bootstrap, do ramo ficou em 89%, considerado

aceitável em relação a medida de confiabilidade dos ramos gerados pelas análises

43

filogenéticas, que estima o grau de suporte de cada ramo entre os acessos.

Entretanto, o ramo constituído pelos acessos SC, Guadalupe, Seta e rcbL

(3845927560) de M.arundinacea, retirado do GenbanK, por serem muito similares,

obtiveram valores < 50%, pois o bootstrap analisa a partir da criação de vários

conjuntos de sequências nas quais são escolhidas randomicamente colunas do

alinhamento múltiplo e são geradas novas análises para cada um dos novos

conjuntos gerados (LEPAGE,1992).

As diferenças de similaridade encontradas, neste estudo, provavelmente são

relacionadas, à distribuição geográfica dos diferentes acessos, ocorrendo

possivelmente alterações nas frequências alélicas adaptadas para as condições

ambientais ou simplesmente deriva genética.

Segundo Soltis e Soltis (1998), a maioria dos estudos filogenéticos sugere

que o gene rbcL é o mais adequado para reconstruir as relações em nível de gênero

entretanto, pouco utilizado em níveis específicos. Observou-se neste trabalho que a

região do gene rbcL foi facilmente amplificada e sequenciada para os acessos de M.

arundinacea, apresentando valores máximos de identidade e poder de

discriminação interespecífico satisfatórios.

Comparando - se o acesso Comum de M. arundinacea com as demais,

ocorreu diferença apenas por algumas regiões que apresentaram nucleotídeos

divergentes (Apêndice 1). O achado pode ajudar pesquisadores a distinguir plantas

distintas, mas que aparentemente pareçam estar relacionadas entre si.

As sequências obtidas do gene rbcL, foram analisadas e comparadas com

as sequências depositadas nos bancos de dados do BOLD Systems (Apêndice 1) e

os resultados apresentaram 100% de identidade dos quatro acessos testados. O

mesmo aconteceu quando as sequências foram submetidas à busca na base de

dados genômica BLAST. A região do gene matK, apesar do sequenciamento menos

satisfatório, apresentou valores de identidade através da busca BOLD Systems e

BLAST similares ao gene rcbL, ambos comprovam que os acessos são da espécie

M. arundinacea.

44

Figura 2. Dendograma do gene rcbL, obtido a partir da análise de Neighbor-joining(NJ) ,dos acessos Comum, Seta, SC , Guadalupe, Siphonochilus decorus, foi usado como outgroup. Os valores encontrados nos ramos indicam os valores de bootstrap (>50) baseado em 1.000 interações.

VARIABILIDADE GENÉTICA

Para avaliar a variabilidade genética dos diferentes acessos utilizou-se 25

primers, dos quais oito não amplificaram e 11 geraram quantidade igual ou inferior

de quatro bandas, representando 76% dos primers avaliados. Dos 17 primers que

geraram polimorfismo seis foram selecionados por apresentarem qualidade na

amplificação e maior polimorfismo, dos quais destaca-se o OPA02 (Tabela 4). Os

primers selecionados produziram 57 bandas, sendo 28 polimórficas, o que

representa 49,12% de polimorfismo. Em média, cada primer amplificou 9,5 bandas

polimórficas.

Tabela 4. Lista dos primers e suas respectivas sequências, número de fragmentos amplificados e número de fragmentos polimórficos obtidos dos quatro acessos.

Primer Sequência 5’ 3’ Fragmentos Amplificados

Fragmenntos Polimórficos

OPA 01 CAG GCC CTT C 17 6

OPA 02 TGC CGA GCT G 16 8

OPA 17 GAC CGC TTG T 6 3

OPA18 AGG TGA CCG T 5 5

OPF 05 CCG AAT TCC C 7 3

OPAF 05 CCC GAT CAG A 6 3

O critério utilizado foi à presença de bandas polimórficas que obtivessem

uma melhor qualidade e visualização dos produtos de amplificação para posterior

45

análise. No resultado da RAPD pode-se observar que os acessos SC, Guadalupe e

Seta, apresentaram similaridade genética pelo padrão de bandas evidenciado entre

esses genótipos, no entanto, o acesso denominado Comum se diferenciou por

apresentar bandas com padrões diferentes dos demais acessos.

Por meio do dendrograma formado (Figura 3), verificou-se a formação de

dois grupos em que o acesso denominado Comum, ficou posicionado em um ramo,

enquanto que os outros acessos (SC, Guadalupe e Seta), ficaram agrupados em

outro ramo. Também foi observado que os acessos SC, Guadalupe e Seta podem

ser considerados geneticamente iguais mediantes aos primers testados na análise

realizada pela técnica de RAPD.

Figura 3. Dendrograma de similaridade genética, obtido a partir dos produtos de amplificação por RAPD do primer OPA 02 para quatro acessos de araruta.

Com os resultados obtidos infere-se que o acesso Comum foi o mais

divergente, se diferenciando dos acessos SC, Guadalupe e Seta, supondo que uma

46

mudança evolutiva devido à distância geográfica, que segundo Slatkin (1987),

eventualmente restringe o processo evolutivo por prevenir a adaptação às

condições locais e promover a evolução espalhando novos genes e combinações

gênicas entre populações de uma determinada espécie. Esses acessos de Araruta

podem apresentar variabilidade genética ocasionada por mistura de sementes de

outras populações, por mutações genéticas ou cruzamentos naturais com plantas

de diferentes genótipos.

CONCLUSÃO

Observou-se através das análises de DNA barcoding, que todos os acessos

testados são da espécie M.arundinacea e através da técnica de RAPD conclui-se

que há divergência populacional entre o acesso Comum e os demais acessos.

O presente trabalho envolvendo os quatro acessos de araruta Comum, SC,

Guadalupe e Seta, nas técnicas apresentadas é pioneiro e possibilita a elaboração

de novos estudos para que no futuro ocorra a probabilidade da descoberta de genes

promissores, visando planejar os cruzamentos através do programa de

melhoramento genético de forma a aumentar as diversidades genéticas entre

genótipos de interesse.

47

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51

APÊNDICES

Tabela 1. Análise do acesso de Araruta Comum comparadas com sequências depositadas no BOLD Systems de RbcL

Match

Rank Family Genus Species Score Similarity E-Value Status

1 Marantaceae Maranta arundinacea 483 100 0 Published

2 Marantaceae Maranta arundinacea 483 100 0 Published

3 Marantaceae Maranta arundinacea 483 100 0 Published

4 Marantaceae Maranta arundinacea 483 100 0 Private

5 Marantaceae Maranta arundinacea 483 100 0 Private

Tabela 2. – Análise das sequências SC, Guadalupe e seta comparadas com sequências depositadas no BOLD Systems de rbcL

Match

Rank Family Genus Species Score Similarity E-Value Status

1 Marantaceae Maranta arundinacea 478 100 0 Published

2 Marantaceae Maranta arundinacea 478 100 0 Published

3 Marantaceae Maranta arundinacea 478 100 0 Published

4 Marantaceae Maranta arundinacea 478 100 0 Published

5 Marantaceae Maranta arundinacea 478 100 0 Published

Tabela 3. Análise das sequências Comum, SC, Guadalupe e seta comparadas com sequências depositadas no BOLD Systems de matK

Match

Rank Family Genus Species Score Similarity E-Value Status

1 Marantaceae Maranta arundinacea 373 99.66 2.2251926421931E-

18

Published

2 Marantaceae Maranta bicolor 365 98.31 1.8538385838702E-

17

Published

3 Marantaceae

365 98.31 1.8538385838702E-

17

Published

4 Marantaceae Ctenanthe marantifolia 363 98.31 1.8538385838702E-

17

Published

5 Marantaceae Ctenanthe setosa 363 98.31 1.8538385838702E-

17

Published

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Figura 1. Resultado do sequenciamento do gene rbcL dos quatro acessos de M. arundinacea.

53

Continuação -Figura 1. Resultado do sequenciamento do gene rbcL dos quatro acessos de M.

arundinacea.

54

Figura 2. Resultado do sequenciamento do gene matK, dos quatro acessos de M. arundinacea.

.

55

Continuação- Figura 2. Resultado do sequenciamento do gene matK, dos quatro acessos de M.

arundinacea.

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Figura 3. Padrão eletroforético obtido com primers OPF5 e OPAF5. PM: Peso Molecular 1kb plus.

CO: araruta Comum. SC:Araruta SC. G: araruta Guadalupe e ST: araruta Seta, C- controle negativo.

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Figura 4. Padrão eletroforético obtido com primers OPA1 e OPA2. PM: Peso Molecular 1kb plus. CO:

araruta Comum. SC:Araruta SC. G: araruta Guadalupe e ST: araruta Seta, C- controle negativo.

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Figura 5. Padrão eletroforético obtido com primer OPA17. PM: Peso Molecular 1kb plus. CO: araruta

Comum. SC:Araruta SC. G: araruta Guadalupe e ST: araruta Seta, C- controle negativo.