BiotecnologiaProf. Priscilla Russo
Métodos para a quantificação de
proteínas
Como estudar uma proteína?
1. Separá-la e purificá-la.
2. Determinar a sua massa molecular.
3. Determinar a sua composição e seqüência de aminoácidos.
4. Elucidar a sua estrutura tridimensional.
5. Caracterizá-la funcionalmente.
Proteínas
Para separar proteínas• Utilizam-se diferenças nas
propriedades físico-químicas das proteínas, resultantes das diferentes sequências de aa:– Tamanho– Solubilidade– Carga– Afinidade de ligação
Técnicas de separação e purificação de proteínas:
• Diálise, ultrafiltração, centrifugação, precipitação
• Cromatografia de exclusão molecular• Cromatografia de troca iônica e da fase
reversa• Cromatografia de afinidade• Eletroforese
Princípio: diferente dimensão e forma molecular
• Diálise• A solução contendo a proteína é colocada no
interior do saco de diálise, que é imerso em um grande volume de solvente
• Chega-se ao equilíbrio entre as concentrações dos dois meios, sendo que as proteínas continuam no interior do saco de diálise e as outras moléculas no exterior.
Ultracentrifugação Zonal• A solução contendo as proteínas é
colocada no topo de um gradiente de densidade.
• Durante a centrifugação, cada proteína se move de acordo com seu coeficiente de sedimentação.
• Após a centrifugação, as zonas individuais são recolhidas com auxílio de uma seringa.
Centrifugação Diferencial
• A centrifugação separa os componentes celulares por tamanho e densidade
• Componentes maiores e mais densos sedimentam (pellet) e os componentes menores e menos densos permanecem suspensos (sobrenadante).
Gradiente de Densidade
Princípio: diferença de solubilidade (precipitação)
• A solubilidade das proteínas varia com:– pH– Temperatura– Força iônica– Constante dielétrica do solvente
Técnicas baseadas em diferenças de solubilidade
• Precipitação isoelétrica (variação de pH)
• Salting in / salting out (variação da força iônica)
• Precipitação por solventes orgânicos
• Salificação (salting in): a solubilidade aumenta até certo ponto, com o aumento da concentração de sal
• Dessalificação (salting out): os sais com concentração muito elevada retiram a água de hidratação da proteína, então as suas moléculas precipitam
• É uma série de processos de separação de misturas.
• Ocorre pela passagem de uma mistura através de duas fases: uma estacionária (fixa) e outra móvel.
• A grande variabilidade de combinações entre a fase móvel e estacionária faz com que a cromatografia tenha uma série de técnicas diferenciadas.
Cromatografia
Métodos cromatográficos de separação de proteínas
• Diferentes tipos:– Exclusão
molecular– Troca iônica– Afinidade– Fase reversa
Cromatografia de exclusão molecular
• Utilizado para a determinação do peso molecular de diferentes proteínas
• Após o empacotamento da coluna, aplica-se a amostra e é feita a eluição
• As moléculas maiores, que não são capazes de penetrar nos poros do gel, serão eluídas antes das moléculas menores.
Cromatografia de troca iônica
• As colunas são carregadas com grânulos de carga oposta, retendo as proteínas– Ex: moléculas de carga
negativa ficam retidas, enquanto as de carga positiva passam pela coluna
Cromatografia de Troca iônica
Cromatografia de afinidade• A fase estacionária consiste geralmente de
agarose ligada a brometo de cianogênio, formando uma ligação covalente.
• A amostra é aplicada e a proteína que possui afinidade pelo ligante se liga a ele enquanto as demais são eluídas da coluna.
• A proteína de interesse é então liberada da coluna, com o uso de uma substância que tenha mais afinidade pela proteína do que o ligante
Determinação da composição dos aminoácidos de uma proteína
• Ex: determinação da composição de aa do fragmento
Ala-gly-asp-phe-arg-gly1.Hidrolise ácida (HCl 6N, 110ºC, 24h)2.Reação de revelação dos aa (ex ninidrina)3.Separação e quantificação dos aa (ex.
cromatografia)
Separação e quantificação dos aa por cromatografia HPLC
• High Pressure Liquid Chromatography (cromatografia líquida de alta eficiência)
• Matriz de separação: utilizando diferentes propriedades físicas de cada um dos aa, ex carga, forma, hidrofobicidade
• Eluente: variação controlada das condições do meio
• Detecção: após sua derivação
Resultado de uma cromatografia de aa
Integrando os picos, determina-se a quantidade relativa de cada aa, mas não a sequência
Uso da cromatografia no diagnóstico clínico
• Leucinose • Ex.: aumento de
leucina, isoleucina e valina
• Defeito da desidrogenase dos alfa-cetoacidos ramificados