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Avanços na Transformação Agrícola na Era da Edição de Genomas
Giancarlo Pasquali
Universidade Federal do Rio Grande do SulInstituto de Biociências & Centro de Biotecnologia
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Biossegurança frente às Novas Metodologias de Melhoramento Genético de Plantas como a Edição de DNA
Tópicos
1.Edição de DNA: principais metodologias
2.Vantagens e aplicações das técnicas de edição de DNA a vegetais
3.Exemplos de plantas geradas por edição de DNA
4.Organizações envolvidas
5.Biossegurança relativa à edição de DNA em plantas
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Edição de DNA: Principais Metodologias
Meganucleases - 2001 - Engineered Meganuclease Re-engineered Homing
Endonucleases
ZFN - 2003 - Zinc Finger Nucleases (Nucleases do Tipo “Dedos-de-Zinco”)
TALENs - 2009 - Transcription Activator-like Effector Nucleases (Nucleases Efetoras
Semelhantes a Ativadores da Transcrição)
CRISPR/Cas9 - 2012/2013 - Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
/Cas9 System (Agrupamentos de Repetições Palindrômicas Curtas
Interespaçadas Regularmente/Sistema Cas9)
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CRISPR/Cas9Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
Genome Editing with CRISPR-Cas9Published on Nov 5, 2014
This animation depicts the CRISPR-Cas9 method for genome editing – a powerful new technology with many applications in biomedical research, including the potential to treat human genetic disease. Feng Zhang, a leader in the development of this
technology, is a faculty member at MIT, an investigator at the McGovern Institute for Brain Research, and a core member of the Broad Institute. Further information can be found on Prof. Zhang’s website at http://zlab.mit.edu.
https://www.youtube.com/watch?v=2pp17E4E-O8
Wiedenheft et al. (2012) RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea.Nature 15: 331 (doi: 10.1038/nature10886)
Mali et al. (2013) RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339: 823(doi:10.1126/science.1232033)
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Ann Ran et al. (2013) Nature Protocols 8: 2281 (doi:10.1038/nprot.2013.143)
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https://www.neb.com/tools-and-resources/feature-articles/crispr-cas9-and-targeted-genome-editing-a-new-era-in-molecular-biology
New England Biolabs Inc. - CRISPR/Cas9 and Targeted Genome Editing
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http://www.artofthecell.com/animation/crispr-cas9-gene-editing
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ZFNsZinc Finger Nucleases
Urnov et al. (2010) Genome editing with engineered zinc fingernucleases. Nature Reviews Genetics 11: 636
Isalan (2012) Zinc-finger nucleases: how to play two good handsNature Methods 9: 32
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ZFNsZinc Finger Nucleases
http://cen.acs.org/articles/87/i30/Knockout-Rats-Easy-Way.html
Each zinc finger protein (Zn is silver) iscoupled to a FokI domain (central ribbonstructures). When two of the proteins bindto their target sequence, the FokI domainsjoin and create a double-strand break.
Credit: Sangamo Biosciences
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TALENs or TAL Effector NucleasesTranscription Activator-like Effector Nuclease(s)
Bogdanove & Voytas (2011) TAL effectors:customizable proteins for DNA targeting.Science 333: 1843(doi: 10.1126/science.1204094)
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TALENs or TAL Effector NucleasesTranscription Activator-like Effector Nuclease(s)
Bogdanove & Voytas (2011) TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science 333: 1843 (doi: 10.1126/science.1204094)
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Structure of a TAL effector protein wrapped arounda DNA double helix. Image based on data fromMak et al. (2012) Science
http://mcgovern.mit.edu/news/?attachment_id=1807#sthash.xuVcALVi.dpuf
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Engineered Meganuclease Re-engineeredHoming Endonucleases
Meganucleases are endodeoxyribonucleases characterized by a large recognition site:
double-stranded DNA sequences of 12 to 40 base pairs.
Grizot et al. (2009) Nucleic Acids Research 38: 2006 (doi:10.1093/nar/gkp1171)
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Crystal structure of I-DmoI meganuclease in complex with its target DNA.
Marcaida et al. (2008) PNAS 105: 16888
Cientistas da Cellectis(França) desenvolveram umacoleção de mais de 20.000 domínios proteicos a partirda meganucleasehomodiméricaI-CreI, assim como para outros arcabouços de meganucleases.
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Vantagens e Aplicações das Técnicas de Edição de DNA
Edição direta de sequências cromossômicas sem extensos
programas de melhoramento
vs
Melhoramento genético tipicamente obtido por métodos
aleatórios seguido de seleção, incluindo:
Indução de mutações aleatórias
Cruzamentos genéticos
Transformação genética mediada por agrobactérias, biobalística, etc.
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Vantagens e Aplicações das Técnicas de Edição de DNA
Silenciamento por “deleção”: as nucleases direcionadas a sítios
específicos do genoma promovem quebras de dupla fita (DSB).
Ao reparar a quebra de DNA, a célula inadvertidamente rompe a
sequência gênica, adicionando ou removendo alguns
nucleotídeos (união terminal não-homóloga ou nonhomologous
end-joining - NHEJ).
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Vantagens e Aplicações das Técnicas de Edição de DNA
Correção de genes: ao combinar ao sistema da nuclease um
fragmento de DNA exógeno com complementaridade às
extremidades do DNA clivado, a sequência-alvo pode ser
reescrita por reparação dirigida por homologia (homology
directed repair - HDR).
Especificidade: a tecnologia CRISPR/Cas9 potencialmente possui
uma razão de um erro a cada 100 bilhões de bp (teoria), ou seja,
especificidade suficiente para aplicações em pesquisa.
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Edição de DNA – Vetores
Integração de DNA: plantas transgênicasTransformação mediada por agrobactérias.
Injeção de 3 RNAs ou Cas9 + 2 RNAsEletroporação, choque osmótico, biobalística.
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Exemplos de Plantas Geradas por Edição de DNA
1....
http://dx.doi.org/10.1016/j.tplants.2015.01.010
Araki & Ishii
Disease R
Oil Qlity
Disease R
Herbicide
Nutrition
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Exemplos de Organizações Atuando em Edição de DNA
http://www.thermofisher.com/br/en/home/life-science/genome-editing/genome-editing-publications/genome-engineering-poster.html#
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Exemplos de Organizações Comerciais(ordem alfabética)
Cellectis – Meganucleases
Dow – ExZact™ – ZNF
Horizon Discovery – GENASSIST™ – CRISPR/Cas9
New England Biolabs – CRISP/Cas9
OriGene – CRISPR/Cas9
Precision Biosciences – Meganucleases
Sigma (Aldrich) Life Science – CompoZr™ – ZNF & CRISPR/Cas9
Thermo Fisher Scientific – CRISPR/Cas9
Addgene – TAL Effectors & CRISPR/Cas9
Life Technologies – GeneArt® Precision TALs – TALENs & CRISPR/Cas9
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Biossegurança Relativa à Edição de DNA em Plantas
A edição de DNA permite o melhoramento vegetal sem a
introdução de transgenes. Permite gerar plantas semelhantes ou
essencialmente idênticas àquelas geradas por técnicas
convencionais de melhoramento, criando fronteiras indistinguíveis
para a regulamentação de OGMs.
Transgênese vs Cisgênese vs Intragênese: a engenharia genética
convencional é trabalhosa e requer longa e intensa seleção para
encontrar os vegetais mutantes desejados.
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Biossegurança Relativa à Edição de DNA em Plantas
Off-target effects: a ocorrência de mutações não-alvo é a mais
forte crítica ao emprego das tecnologias de edição de DNA.
Pesquisadores vem desenvolvendo estratégias que permitirão
reduzir a um mínimo a possibilidade de mutações não-alvo.
Aumento do tamanho de RNAs guias
Emprego de duas CRISPR/Cas9 combinadas com quebras
de fitas-simples
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Canela et al. (2015) Collateral DNA damage produced by genomeediting drones: exception or rule? (Review)Molecular Cell 58: 565
Translocations Discovered by LAM-PCR HTGTS (human DNA-edited)
(A) Top: CRISPR/Cas9 wild-type (left) and D10A nickase (right) generates DSBs and DNA nicks, respectively, leading to on-target and potentially off-target DSBs; aberrant fusions of the DNA ends can cause chromosomal translocations. Bottom: scheme of LAM-PCR HTGTS technology to detect novel translocation partners. Cartoon illustrates the arrangement of chromosomes into three distinct territories within the nucleus. The highlighted square indicates the enlarged view of the on-target (red) and off-target (green) DSBs that are in proximity to each other, thus promoting translocations. Following DNA extraction and shearing, a biotinylated primer specific to the bait DSB is extended, amplifying the hybrid fragment on-target-off-target (bait-prey). The product is subsequently purified with streptavidin and ligated to an adaptor, allowing PCR amplification followed by the identification of the off-targets by next-generation sequencing.
(B) Circos plot illustrating the different type of translocations discovered by the HTGTS method, including off-targets DSB ‘‘hotspots,’’ widespread DSBs reflecting non-specific and endogenous DSBs, and inter-homologous fusions involving DSBs generated on both homologous chromosomes. CRISPR/Cas9 (D10A nickase) suppresses translocation hotspots and reduces widespread DSBs in contrast to wild-type CAS9, although inter-homologous fusions at the bait chromosome still persist.
(C) Combination of a known DNA break instigator (CRISPR/Cas9; leading to translocation pattern depicted by red lines, bottom) together with an uncharacterized genomic mutator (e.g., TALEN or AID, top) reveal novel translocation partner induced by the latter (blue lines, bottom).
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Biossegurança Relativa à Edição de DNA em Plantas
Off-target effects: plantas mutantes geradas por agentes
mutagênicos clássicos (raios X ou químicos) apresentam
(inúmeras) mutações não-alvo (e raríssimamente investigadas).
Qual é a diferença entre produtos?
Protocolo de Cartagena sobre Biossegurança: “Organismo vivo
modificado é qualquer organismo vivo que possua uma nova
combinação de material genético obtida por meio do uso da
biotecnologia moderna.”
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Biossegurança Relativa à Edição de DNA em Plantas
Plantas geradas por edição de DNA podem gerar segregantes
nulos, isto é, linhagens sem quaisquer transgenes ou insertos de
DNA exógeno integrados nos cromossomos e, assim, escapariam
da definição do Protocolo e das regulamentações sobre OGMs.
Lei Brasileira de Biossegurança (No 11.105): “Organismo
Geneticamente Modificado - OGM: organismo cujo material
genético – ADN/ARN tenha sido modificado por qualquer técnica
de engenharia genética.”
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Process-based GMO Regulations:
União Europeia, Austrália e Nova
Zelândia: mais exigentes
A adição de sequências/genes mediada
por HDR (reparação dirigida por
homologia) será regulamentada.
A introdução de indels por NHEJ (união
terminal não-homóloga) será
regulamentada na EU, mas não na Nova
Zelândia (Suprema Corte vs EPA).
Product-based GMO Regulations:
EUA, Argentina e Canadá: menos
restritivas
A adição de sequências/genes mediada
por HDR (reparação dirigida por
homologia) será regulamentada.
A introdução de indels por NHEJ (união
terminal não-homóloga) não será
regulamentada.
Araki & Ishii (2015) Trends in Plant Science 20: 145
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Araki & Ishii (2015) Towards social acceptance of plant breeding by genome editing. Trends in Plant Science 20: 145 http://dx.doi.org/10.1016/j.tplants.2015.01.010
The presumed regulatory relevance of crop mutants generated with genome editing technology.