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Disciplina de Engenharia de Proteínas
Curso de Ciências Biológicas
2º Semestre de 2018
Aula 5: Ferramentas Computacionais e
Técnicas para “Engenheirar” Proteínas
Prof. Marcos Túlio de Oliveira [email protected]
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
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Ferramentas Computacionais
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Protein Data Bank (PDB)
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Transcriptase Reversa do HIV-1
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Transcriptase Reversa do HIV-1
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Visualização de Estruturas
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Visualização de Estruturas
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Visualização de Estruturas
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Visualização de Estruturas
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Visualização de Estruturas
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Visualização de Estruturas
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Estudo de caso 1 – evolução estrutural
da pol γ
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Maquinaria de replicação do DNAmt
Cielsielski et al., 2016. Enzymes 39:255-292.
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Variabilidade oligomérica da pol γ
Humanos e camundongo = 1 α / 2 β
Drosophila melanogaster = 1 α / 1 β
Saccharomyces cerevisiae = 1 α / 0 β
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Buscas por outras pol γs animais
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Buscas por outras pol γs animais
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Buscas por outras pol γs animais
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Buscas por outras pol γs animais Species Common name Phylum Class Order Accession Number
Pol γ-α
Amphimedon queenslandica sponge Porifera Demospongiae Haplosclerida XM_003389221.1
Trichoplax adhaerens placozoan Placozoa Tricoplacia - XM_002116311.1
Nematostella vectensis starlet sea anemone Cnidaria Anthozoa Actiniaria scaffold_62
Hydra magnipapillata fresh water polyp Cnidaria Hydrazoa Hydroida XP_002166917.2
Crassostrea gigas pacific oyster Mollusca Bivalvia Ostreoida EKC38630.1
Caenorhabditis elegans roundworm Nematoda Chromadorea Rhabditida NM_064191.1
Bursaphelenchus xylophilus pine wood nematode Nematoda Chromadorea Tylenchida scaffold01109
Oscheius tipulae hermaphroditic soil
nematode
Nematoda Chromadorea Rhabditida 959 Nematode Genomes
Dirofilaria immitis heartworm Nematoda Chromadorea Spirurida 959 Nematode Genomes
RNA-seq
Loa loa eye worm Nematoda Chromadorea Spirurida XM_003141747
Daphnia pulex water flea Arthropoda Crustacea Diplostraca EFX73911.1
Pediculus humanus corporis human body louse Arthropoda Insecta Phthiraptera XM_002425672.1
Drosophila melanogaster fruitfly Arthropoda Insecta Diptera NM_057473.3
Drosophila sechellia fruitfly Arthropoda Insecta Diptera XM_002035723.1
Drosophila yakuba fruitfly Arthropoda Insecta Diptera XM_002088608.1
Drosophila erecta fruitfly Arthropoda Insecta Diptera XM_001969538.1
Drosophila simulans fruitfly Arthropoda Insecta Diptera XM_002079353.1
Drosophila persimilis fruitfly Arthropoda Insecta Diptera XM_002023169.1
Drosophila pseudoobscura
pseudoobscura
fruitfly Arthropoda Insecta Diptera XM_001356205.2
Drosophila ananassae fruitfly Arthropoda Insecta Diptera XM_001962747.1
Drosophila willistoni fruitfly Arthropoda Insecta Diptera XM_002066715.1
Drosophila grimshawi fruitfly Arthropoda Insecta Diptera XM_001988310.1
Drosophila virilis fruitfly Arthropoda Insecta Diptera XM_002057431.1
Drosophila mojavensis fruitfly Arthropoda Insecta Diptera XM_002004015.1
Aedes aegypti yellow fever mosquito Arthropoda Insecta Diptera XM_001647501.1
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Alinhamento de sequências
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Alinhamento de sequências
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Alinhamento de sequências
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Alinhamento de sequências
pol γ-α
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Alinhamento de sequências
pol γ-α
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Identificação de um novo motivo
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Identificação de um novo motivo na
subunidade catalítica
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Cadê a subunidade acessória?
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Lewis et al. (2015) PLOS Genetics 11: e1004985
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Distribuição do domínio de dimerização
na subunidade acessória
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Alinhamento + Estrutura
HLH-β3
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Distribuição do domínio de dimerização
na subunidade acessória
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Modelagem de Estrutura
HLH-β3
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Modelagem de Estrutura
HLH-β3
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Modelagem de Estrutura
HLH-β3
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usa a estrutura de uma proteína (que foi determinada experimentalmente) para
predizer a estrutura de uma proteína homóloga
Modelagem por Homologia
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usa a estrutura de uma proteína (que foi determinada experimentalmente) para
predizer a estrutura de uma proteína homóloga
Modelagem por Homologia
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Modelagem por Homologia
https://www.bioscience.org/2004/v9/af/1437/fulltext.php?bframe=figures.htm
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Resumo: algumas (poucas) ferramentas
Bancos de dados – PDB, NCBI, SwissProt, etc.
Buscas por sequências similares – BLAST e suas
variações
Visualização de estruturas – PyMOL, MolScript,
Jmol, etc.
Alinhamentos de sequências – Clustal, MUSCLE,
T-Cofee, etc.
Modelagem por homologia – I-Tasser, Modeller,
etc.
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Estudo de caso 2 – o sítio ativo da Twinkle
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Alinhamento de sequências
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Estudos fisiológicos e bioquímicos
![Page 44: Aula 5: Ferramentas Computacionais e · Clonagem em Vetor de Expressão . ... Sequencie o fragmento de DNA Expresse a proteína em células de E. coli apropriadas ... Slide 1 Author:](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021808/5be4bc2509d3f219598d47ad/html5/thumbnails/44.jpg)
Modelagem do sítio ativo
Ziebarth et al., 2010. JBC 285:14639-14647.
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Resumo: mesmo tipo de ferramentas
Bancos de dados – PDB, NCBI, SwissProt, etc.
Buscas por sequências similares – BLAST e suas
variações
Visualização de estruturas – PyMOL, MolScript,
Jmol, etc.
Alinhamentos de sequências – Clustal, MUSCLE,
T-Cofee, etc.
Modelagem por homologia – I-Tasser, Modeller,
etc.
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Estudo de caso 3 – aqueles que não são, mas se parecem,
e aqueles que se parecem, mas não são...
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Similaridade Estrutural
Fribourg S , and Conti E EMBO Rep. 2003;4:699-703
Mex67 e TAP – proteínas homólogas
Mtr2 e p15 – nenhuma similaridade de sequência / análogos funcionais
em leveduras em animais
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Similaridade Estrutural
Kaguni LS , and Oliveira MT CRBMB. 2016;51:53-64
As primases de bactéria e de bacteriófagos são homólogas, e possuem similaridade
de sequência com o domínio N-terminal da Twinkle mitocondrial de animais
Mas a Twinkle não faz primers durante a replicação do DNAmt animal (no
entanto, ela faz em plantas...)
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Kaguni LS , and Oliveira MT CRBMB. 2016;51:53-64
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Mas como engenheirar a proteína de interesse?
Como testar a relação estrutura-função?
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Análise de Estruturas
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Análise de Estruturas
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Análise de Estruturas
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Análise de Estruturas
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E se sua proteína favorita não possui
estrutura já determinada?
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Conservação de sequências
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pol γ-α
Conservação de sequências
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pol γ-α
Conservação de sequências
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Clonagem em Vetor de Expressão
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Clonagem em Vetor de Expressão
![Page 62: Aula 5: Ferramentas Computacionais e · Clonagem em Vetor de Expressão . ... Sequencie o fragmento de DNA Expresse a proteína em células de E. coli apropriadas ... Slide 1 Author:](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021808/5be4bc2509d3f219598d47ad/html5/thumbnails/62.jpg)
Com o gene da sua proteína clonado em
vetor de expressão…
CDS proteína de interesse
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Com o gene da sua proteína clonado em
vetor de expressão…
CDS proteína de interesse
![Page 64: Aula 5: Ferramentas Computacionais e · Clonagem em Vetor de Expressão . ... Sequencie o fragmento de DNA Expresse a proteína em células de E. coli apropriadas ... Slide 1 Author:](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021808/5be4bc2509d3f219598d47ad/html5/thumbnails/64.jpg)
Com o gene da sua proteína clonado em
vetor de expressão…
GGTCATGAAAGATCCCGTAAAGCTGACCAGTCT
CCAGTACTTTCTAGGGCATTTCGACTGGTCAGA
G H E R S R K A D Q S
![Page 65: Aula 5: Ferramentas Computacionais e · Clonagem em Vetor de Expressão . ... Sequencie o fragmento de DNA Expresse a proteína em células de E. coli apropriadas ... Slide 1 Author:](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021808/5be4bc2509d3f219598d47ad/html5/thumbnails/65.jpg)
Com o gene da sua proteína clonado em
vetor de expressão…
GGTCATGAAAGATCCCGTAAAGCTGACCAGTCT
CCAGTACTTTCTAGGGCATTTCGACTGGTCAGA
G H E R S R K A D Q S
![Page 66: Aula 5: Ferramentas Computacionais e · Clonagem em Vetor de Expressão . ... Sequencie o fragmento de DNA Expresse a proteína em células de E. coli apropriadas ... Slide 1 Author:](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021808/5be4bc2509d3f219598d47ad/html5/thumbnails/66.jpg)
Com o gene da sua proteína clonado em
vetor de expressão…
GGTCATGAAAGATCCCGTAAAGCTGACCAGTCT
CCAGTACTTTCTAGGGCATTTCGACTGGTCAGA
G H E R S R K A D Q S
![Page 67: Aula 5: Ferramentas Computacionais e · Clonagem em Vetor de Expressão . ... Sequencie o fragmento de DNA Expresse a proteína em células de E. coli apropriadas ... Slide 1 Author:](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021808/5be4bc2509d3f219598d47ad/html5/thumbnails/67.jpg)
Com o gene da sua proteína clonado em
vetor de expressão…
GGTCATGAAAGATCCCGTAAAGCTGACCAGTCT
CCAGTACTTTCTAGGGCATTTCGACTGGTCAGA
G H E R S R K A D Q S
Codons para Ala:
GCU
GCA
GCG
GCC
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Com o gene da sua proteína clonado em
vetor de expressão…
GGTCATGAAAGATCCCGTAAAGCTGACCAGTCT
CCAGTACTTTCTAGGGCATTTCGACTGGTCAGA
G H E R S R K A D Q S
Codons para Ala:
GCU
GCA
GCG
GCC
Primer 1: 5’GGTCATGAAAGATCCGCTAAAGCTGACCAGTCT3’
Primer 2: 3’CCAGTACTTTCTAGGCGATTTCGACTGGTCAGA5’
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Mutagênese Sítio-Dirigida
PCR
…GGTCATGAAAGATCCCGTAAAGCTGACCAGTCT…
…CCAGTACTTTCTAGGGCATTTCGACTGGTCAGA…
Primer 1: 5’GGTCATGAAAGATCCGCTAAAGCTGACCAGTCT3’
3’CCAGTACTTTCTAGGCGATTTCGACTGGTCAGA5’ :Primer 2
Template
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Mutagênese Sítio-Dirigida
PCR
Primer 1: 5’GGTCATGAAAGATCC TAAAGCTGACCAGTCT3’
3’CCAGTACTTTCTAGG ATTTCGACTGGTCAGA5’ :Primer 2
…GGTCATGAAAGATCC TAAAGCTGACCAGTCT…
…CCAGTACTTTCTAGG ATTTCGACTGGTCAGA… GC
CG
CG
GC
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Mutagênese Sítio-Dirigida
PCR
Primer 1: 5’GGTCATGAAAGATCC TAAAGCTGACCAGTCT3’
3’CCAGTACTTTCTAGG ATTTCGACTGGTCAGA5’ :Primer 2
…GGTCATGAAAGATCC TAAAGCTGACCAGTCT…
…CCAGTACTTTCTAGG ATTTCGACTGGTCAGA… GC
CG
CG
GC
Primer 1: 5’GGTCATGAAAGATCCGCTAAAGCTGACCAGTCT3’
3’CCAGTACTTTCTAGGCGATTTCGACTGGTCAGA5’ :Primer 2
![Page 72: Aula 5: Ferramentas Computacionais e · Clonagem em Vetor de Expressão . ... Sequencie o fragmento de DNA Expresse a proteína em células de E. coli apropriadas ... Slide 1 Author:](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021808/5be4bc2509d3f219598d47ad/html5/thumbnails/72.jpg)
Mutagênese Sítio-Dirigida
PCR Primer 1
Primer 2
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Mutagênese Sítio-Dirigida
PCR
![Page 74: Aula 5: Ferramentas Computacionais e · Clonagem em Vetor de Expressão . ... Sequencie o fragmento de DNA Expresse a proteína em células de E. coli apropriadas ... Slide 1 Author:](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021808/5be4bc2509d3f219598d47ad/html5/thumbnails/74.jpg)
Mutagênese Sítio-Dirigida
PCR
![Page 75: Aula 5: Ferramentas Computacionais e · Clonagem em Vetor de Expressão . ... Sequencie o fragmento de DNA Expresse a proteína em células de E. coli apropriadas ... Slide 1 Author:](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021808/5be4bc2509d3f219598d47ad/html5/thumbnails/75.jpg)
Mutagênese Sítio-Dirigida
PCR
![Page 76: Aula 5: Ferramentas Computacionais e · Clonagem em Vetor de Expressão . ... Sequencie o fragmento de DNA Expresse a proteína em células de E. coli apropriadas ... Slide 1 Author:](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021808/5be4bc2509d3f219598d47ad/html5/thumbnails/76.jpg)
Mutagênese Sítio-Dirigida
…dentro do tubo de PCR no final.
![Page 77: Aula 5: Ferramentas Computacionais e · Clonagem em Vetor de Expressão . ... Sequencie o fragmento de DNA Expresse a proteína em células de E. coli apropriadas ... Slide 1 Author:](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021808/5be4bc2509d3f219598d47ad/html5/thumbnails/77.jpg)
Mutagênese Sítio-Dirigida
…dentro do tubo de PCR no final.
![Page 78: Aula 5: Ferramentas Computacionais e · Clonagem em Vetor de Expressão . ... Sequencie o fragmento de DNA Expresse a proteína em células de E. coli apropriadas ... Slide 1 Author:](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021808/5be4bc2509d3f219598d47ad/html5/thumbnails/78.jpg)
Mutagênese Sítio-Dirigida
Digestão com DpnI
![Page 79: Aula 5: Ferramentas Computacionais e · Clonagem em Vetor de Expressão . ... Sequencie o fragmento de DNA Expresse a proteína em células de E. coli apropriadas ... Slide 1 Author:](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021808/5be4bc2509d3f219598d47ad/html5/thumbnails/79.jpg)
Mutagênese Sítio-Dirigida
Digestão com DpnI
![Page 80: Aula 5: Ferramentas Computacionais e · Clonagem em Vetor de Expressão . ... Sequencie o fragmento de DNA Expresse a proteína em células de E. coli apropriadas ... Slide 1 Author:](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021808/5be4bc2509d3f219598d47ad/html5/thumbnails/80.jpg)
Mutagênese Sítio-Dirigida
Transformação em E. coli
![Page 81: Aula 5: Ferramentas Computacionais e · Clonagem em Vetor de Expressão . ... Sequencie o fragmento de DNA Expresse a proteína em células de E. coli apropriadas ... Slide 1 Author:](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021808/5be4bc2509d3f219598d47ad/html5/thumbnails/81.jpg)
Inóculo em
meio líquido
Minipreparação do
DNA plasmidial
Mutagênese Sítio-Dirigida
Transformação em E. coli
![Page 82: Aula 5: Ferramentas Computacionais e · Clonagem em Vetor de Expressão . ... Sequencie o fragmento de DNA Expresse a proteína em células de E. coli apropriadas ... Slide 1 Author:](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021808/5be4bc2509d3f219598d47ad/html5/thumbnails/82.jpg)
Mutagênese Sítio-Dirigida
Verificação e Testes
Sequencie o fragmento de DNA Expresse a proteína em células de E. coli apropriadas Faça testes de solubilidade e purificação Parta para os experimentos para comparar a proteína mutada com a tipo selvagem (WT)
![Page 83: Aula 5: Ferramentas Computacionais e · Clonagem em Vetor de Expressão . ... Sequencie o fragmento de DNA Expresse a proteína em células de E. coli apropriadas ... Slide 1 Author:](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021808/5be4bc2509d3f219598d47ad/html5/thumbnails/83.jpg)
Mutagênese Sítio-Dirigida
Resumo
![Page 84: Aula 5: Ferramentas Computacionais e · Clonagem em Vetor de Expressão . ... Sequencie o fragmento de DNA Expresse a proteína em células de E. coli apropriadas ... Slide 1 Author:](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021808/5be4bc2509d3f219598d47ad/html5/thumbnails/84.jpg)
Mutagênese Sítio-Dirigida
Resumo
![Page 85: Aula 5: Ferramentas Computacionais e · Clonagem em Vetor de Expressão . ... Sequencie o fragmento de DNA Expresse a proteína em células de E. coli apropriadas ... Slide 1 Author:](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021808/5be4bc2509d3f219598d47ad/html5/thumbnails/85.jpg)
Mutagênese Sítio-Dirigida
Substituições
Primer 1: 5’GGTCATGAAAGATCC TAAAGCTGACCAGTCT3’
3’CCAGTACTTTCTAGG ATTTCGACTGGTCAGA5’ :Primer 2
…GGTCATGAAAGATCC TAAAGCTGACCAGTCT…
…CCAGTACTTTCTAGG ATTTCGACTGGTCAGA… GC
CG
CG
GC
Codons para Ala:
GCU
GCA
GCG
GCC
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Mutagênese Sítio-Dirigida
Deleções e Inserções
Primer 1: 5’GGTCATGAAAGATCCAAAGCTGACCAGTCT3’
3’CCAGTACTTTCTAGGTTTCGACTGGTCAGA5’ :Primer 2
…GGTCATGAAAGATCCAAAGCTGACCAGTCT…
…CCAGTACTTTCTAGGTTTCGACTGGTCAGA… G
C G T
C A
Primer 1: 5’GGTCATGAAAGATCCCGTAAAGCTGACCAGTCT3’
3’CCAGTACTTTCTAGGGCATTTCGACTGGTCAGA5’ :Primer 2
…GGTCATGAAAGATCCCGTAAAGCTGACCAGTCT…
…CCAGTACTTTCTAGGGCATTTCGACTGGTCAGA…
G
C G T
C A
![Page 87: Aula 5: Ferramentas Computacionais e · Clonagem em Vetor de Expressão . ... Sequencie o fragmento de DNA Expresse a proteína em células de E. coli apropriadas ... Slide 1 Author:](https://reader031.vdocuments.com.br/reader031/viewer/2022021808/5be4bc2509d3f219598d47ad/html5/thumbnails/87.jpg)
Disciplina de Engenharia de Proteínas
Curso de Ciências Biológicas
2º Semestre de 2018
Próximas aulas: Seminários…