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Análises moleculares - DNA
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Como o mapeamento genético contribui
para a genética médica ?
•A caracterização de um gene e suas mutações
aumenta a compreensão da doença
Aplicações:
-Desenvolvimento de diagnóstico específico e
sensível por meio da detecção direta das mutações
-Identificação do risco do indivíduo em desenvolver
a doença ou transmiti-la para seus filhos
-Terapias com drogas para prevenir ou aliviar as
doenças, ou reduzir sua progressão
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2 obstáculos para a obtenção de uma
quantidade suficiente de uma sequência de
DNA ou RNA:
➢Cada célula apresenta duas cópias de um
gene e alguns genes são expressos apenas em
um subgrupo de tecidos ou em baixos níveis, ou
ambos
➢Dificuldade em purificação da sequência em
questão a partir de todos os outros segmentos
da molécula de DNA ou RNA presentes na célula
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Reação em cadeia da polimerase (PCR)
• Processo de replicação do DNA “in vitro”
• Amplificação dos fragmentos de DNA
• Pode gerar grande quantidade de uma
sequência de interesse em poucas horas
• Componentes:
-Iniciadores (oligonucleotídeos)
-DNA polimerase (enzima + Tampão de reação + MgCl2)
-Nucleotídeos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
-DNA molde
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• Ciclos repetidos de desnaturação pelo calor,
hibridização com os iniciadores, e síntese de
DNA resultam em uma amplificação exponencial
do DNA alvo
• PCR: aplicação clínica para diagnóstico de
doenças
Gel de agarose
Fragmento amplificado
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(DNA com carga negativa
corre em direção à eletrodo
com carga positiva)
Eletroforese
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![Page 10: Análises moleculares - DNAcbsflab.com/wp-content/uploads/2017/03/analise-dna-e-diagnostico.pdf · Hibridização com sonda marcada de fita simples Exposição da membrana a filmes](https://reader036.vdocuments.com.br/reader036/viewer/2022081401/5c65096909d3f2a36e8c3112/html5/thumbnails/10.jpg)
PCR / eletroforese e diagnóstico
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DNA Fingerprint
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![Page 13: Análises moleculares - DNAcbsflab.com/wp-content/uploads/2017/03/analise-dna-e-diagnostico.pdf · Hibridização com sonda marcada de fita simples Exposição da membrana a filmes](https://reader036.vdocuments.com.br/reader036/viewer/2022081401/5c65096909d3f2a36e8c3112/html5/thumbnails/13.jpg)
DNA
Fingerprint
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DNA Fingerprint
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PCR-RFLP
• Polimorfismos de tamanho de fragmentos de
restrição;
• Amplificação dos fragmentos de DNA
Utiliza enzimas de restrição
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Sítios de restrição
![Page 17: Análises moleculares - DNAcbsflab.com/wp-content/uploads/2017/03/analise-dna-e-diagnostico.pdf · Hibridização com sonda marcada de fita simples Exposição da membrana a filmes](https://reader036.vdocuments.com.br/reader036/viewer/2022081401/5c65096909d3f2a36e8c3112/html5/thumbnails/17.jpg)
PCR-Multiplex
• Vários primers específicos em uma mesma
reação PCR;
Ex: Vários exons
Para o gene da distrofina
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SNP – Single nucleotide Polimorphism
• Polimorfismos de um único nucleotídeo;
Amplificação do DNA via PCR e
análise em eletroforese a partir
do DNA amplificado
desnaturado.
Serve para detectar polimorfismos
em cadeias de DNA.
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DNA heteroduplex
• Polimorfismos de um único nucleotídeo;
Amplificação de sequências de DNA via
PCR, desnaturação das sequências e
reanelamento para posterior
eletroforese.
Serve para detectar polimorfismos em
cadeias de DNA.
Ex. gel de poliacrilamida para 16S
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Sequenciamento de DNA
• Utiliza alguns análogos químicos dos 4 nucleotídeos
conhecidos, chamados didesoxinucleotídeos
• Não apresentam o grupo OH na posição 3` da
desoxirribose não permitem extensão da cadeia
término da cadeia
Cada nucleotídeo marcado com
um corante fluorescente diferente
Término de cadeia
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Sequenciador ABI
![Page 22: Análises moleculares - DNAcbsflab.com/wp-content/uploads/2017/03/analise-dna-e-diagnostico.pdf · Hibridização com sonda marcada de fita simples Exposição da membrana a filmes](https://reader036.vdocuments.com.br/reader036/viewer/2022081401/5c65096909d3f2a36e8c3112/html5/thumbnails/22.jpg)
![Page 23: Análises moleculares - DNAcbsflab.com/wp-content/uploads/2017/03/analise-dna-e-diagnostico.pdf · Hibridização com sonda marcada de fita simples Exposição da membrana a filmes](https://reader036.vdocuments.com.br/reader036/viewer/2022081401/5c65096909d3f2a36e8c3112/html5/thumbnails/23.jpg)
Eletroferograma
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Sequenciamento do gene MECP2 verificar ocorrência de
mutação no DNA (proteína não será capaz de exercer sua função
biológica de forma adequada) causa da síndrome de Rett
Sequência de DNA do gene MECP2
TRADUÇÃO
Síndrome de Rett
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Southern blot
• Técnica que permite localizar uma quantidade
de fragmentos de DNA de interesse em meio a
fragmentos de DNA clivados por enzimas de
restrição
• Possível determinar se uma mutação em
particular está presente ou ausente em um
paciente mutação em uma base impossibilita
a hibridização por complementariedade de
bases (sondas alelo-específicas)
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Digestão do
DNA com
enzimas de
restrição
Eletroforese dos fragmentos em gel de agarose
Transferência dos
fragmentos do gel para a
membrana por
capilaridade
Hibridização com sonda marcada de fita simples
Exposição da
membrana a
filmes de raio-X
Desnaturação
do DNA
(Condições que
proporcionem o
pareamento de
bases)
Isolamento de DNA
genômico (linfócitos de
sangue, por exemplo)
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![Page 29: Análises moleculares - DNAcbsflab.com/wp-content/uploads/2017/03/analise-dna-e-diagnostico.pdf · Hibridização com sonda marcada de fita simples Exposição da membrana a filmes](https://reader036.vdocuments.com.br/reader036/viewer/2022081401/5c65096909d3f2a36e8c3112/html5/thumbnails/29.jpg)
Detecção de uma deleção do gene receptor de androgênio por
Southern Blot indivíduo com insensibilidade ao andrógeno
apresenta cariótipo 46,XY, mas fenotipicamente é feminino
DNA genômico digerido
por enzima de restrição e
corado com brometo de
etídeo após eletroforese
Após Southern Blot e
hibridização com uma
sonda de cDNA para o
gene receptor do
androgênio
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Uso de oligonucleotídeos alelo específicos:
Detecção anemia falciforme
Permite uma identificação exata de uma sequência particular do
DNA, onde é possível distinguir homozigotos de heterozigotos
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FISH
(Fluorescence in situ hibridization)
• Citogeneticistas são capazes de hibridizar as
sondas alvo ,marcadas com corantes
fluorescentes, contidas dentro de cromossomos
imobilizados em lâminas de microscopia
• Visualização de aberrações cromossômicas
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![Page 33: Análises moleculares - DNAcbsflab.com/wp-content/uploads/2017/03/analise-dna-e-diagnostico.pdf · Hibridização com sonda marcada de fita simples Exposição da membrana a filmes](https://reader036.vdocuments.com.br/reader036/viewer/2022081401/5c65096909d3f2a36e8c3112/html5/thumbnails/33.jpg)
![Page 34: Análises moleculares - DNAcbsflab.com/wp-content/uploads/2017/03/analise-dna-e-diagnostico.pdf · Hibridização com sonda marcada de fita simples Exposição da membrana a filmes](https://reader036.vdocuments.com.br/reader036/viewer/2022081401/5c65096909d3f2a36e8c3112/html5/thumbnails/34.jpg)
Detecção da leucemia mielóide crônica
•Expansão anormal de células progenitoras hematopoiéticas
transformadas, que aumenta o número de células mielóides circulantes
•Translocação cromossômica que leva a superexpressão do proto-
oncogene BCR-ABL
•15% das leucemias
CROMOSSOMO PHILADELPHIA:
•Genes ABL e BCR são rompidos e
unidos em um novo cromossomo 22
•Abl-bcr: fosforilam muitos substratos,
ativando cascatas de sinalização que
controlam crescimento e diferenciação
proliferação descontrolada de
células-tronco hematopoiéticas
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Gene ABL:
cromossomo 9
Gene BCR:
cromossomo 22
CROMOSSOMO
PHILADELPHIA: verde
+vermelho=sinal amarelo
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Principais indicações de
diagnóstico pré-natal
•Idade materna avançada
•Filho anterior com aneuploidia cromossômica
•Presença de anomalia cromossômica estrutural em
um dos pais
•Histórico familiar de um distúrbio genético que pode
ser diagnosticado por análises bioquímicas ou de DNA
•Histórico familiar de um distúrbio ligado ao X
•Risco de um defeito do tubo neural
•Triagem do soro materno e exame de ultra-sonografia
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![Page 38: Análises moleculares - DNAcbsflab.com/wp-content/uploads/2017/03/analise-dna-e-diagnostico.pdf · Hibridização com sonda marcada de fita simples Exposição da membrana a filmes](https://reader036.vdocuments.com.br/reader036/viewer/2022081401/5c65096909d3f2a36e8c3112/html5/thumbnails/38.jpg)
Punção de vilosidades coriônicas