RODRIGO ANTONIO PELICIARI GARCIA
A SINCRONIZAÇÃO NORADRENÉRGICA E O
PAPEL DA INSULINA NA MODULAÇÃO DA
SÍNTESE DA MELATONINA PELA GLÂNDULA
PINEAL DE RATOS
São Paulo
2008
RODRIGO ANTONIO PELICIARI GARCIA
A SINCRONIZAÇÃO NORADRENÉRGICA E O
PAPEL DA INSULINA NA MODULAÇÃO DA
SÍNTESE DA MELATONINA PELA GLÂNDULA
PINEAL DE RATOS
Tese apresentada ao Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Doutor em Ciências (Fisiologia Humana).
São Paulo
2008
RODRIGO ANTONIO PELICIARI GARCIA
A SINCRONIZAÇÃO NORADRENÉRGICA E O
PAPEL DA INSULINA NA MODULAÇÃO DA
SÍNTESE DA MELATONINA PELA GLÂNDULA
PINEAL DE RATOS
Tese apresentada ao Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Doutor em Ciências.
Área de concentração: Fisiologia Humana Orientador: Prof. Dr. José Cipolla Neto Co-orientadora: Dra. Solange Castro Afeche
São Paulo
2008
DEDICATÓRIA
À minha mãe Jacira Peliciari, pelo seu apoio não somente
na realização deste trabalho, mas por sua dedicação
e constante presença em meu coração.
Muito obrigado!
AGRADECIMENTOS
Agradeço ao Professor Dr. José Cipolla Neto, pela oportunidade, confiança, por
todos seus conselhos e principalmente pela sua prestimosa orientação. O verdadeiro
mestre será sempre lembrado com respeito, admiração e gratidão. Muito obrigado
Professor Cipolla!
À Dra. Solange Castro Afeche, pela co-orientação, ajuda e pelas preciosas dicas
as quais me dera para a realização desse trabalho.
Ao Dr. Martin E. Young do USDA/ARS Children’s Nutrition Research Center,
Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA, pelos
ensinamentos durante o doutorado sanduíche.
À CNPq, pelos apoios financeiros (PGI e SWE).
À Julieta Helena Scialfa, por todo o seu carinho, atenção, dedicação, e por todos
os sacrifícios. Muito obrigado Ju!
À Dra. Melissa Moreira Zanquetta, por toda ajuda, não somente na realização
deste. Muito obrigado!
Ao meu pai Luis Antonio Vieira Garcia, por ter me incentivado a seguir a ciência
biomédica e pelo seu carinho.
Aos amigos do laboratório: Sabrina, Simone, Daniella, Fernanda, Rafael, Marco,
Ana Carolina e Ana Lopes, obrigado pelas horas inestimáveis e pela convivência
pacífica.
Aos professores do ICB-I, os quais tive a oportunidade de conhecer e de trabalhar
direta ou indiretamente, especialmente à Profa. Maria Tereza, Profa. Carla R. O.
Carvalho, Prof. Fernando Abdulkader, Prof. Fábio B. Lima e Profa. Silvana Bordin.
Muito Obrigado!
Aos amigos Eduardo Rebelato Lopes de Oliveira e Cleyton R. Sobrinho.
Aos funcionários José Maria Rodrigues Júnior, Itamar Klemps Filho, Maria Alice
Silva Lima, Ilza Terra, Cláudio Lúcio de Castro, José Luis dos Santos, Edson Miranda,
Adilson Alves e a todos os funcionários e pessoas que direta ou indiretamente
contribuíram para a realização deste.
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Charles Louis de Montesquieu (1689-1755).
RESUMO
GARCIA, R. A. P. A SINCRONIZAÇÃO NORADRENÉRGICA E O PAPEL DA INSULINA NA MODULAÇÃO DA SÍNTESE DA MELATONINA PELA GLÂNDULA PINEAL DE RATOS. 2008. 126 p. Tese (Doutorado em Fisiologia Humana) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.
A glândula pineal de mamíferos sintetiza o hormônio melatonina exclusivamente durante
o período noturno, caracterizando uma variação diária típica dos ritmos circadianos e
sazonais. Como a glândula perdeu sua característica de fotosensibilidade (característica
essa ainda observada em vertebrados não mamíferos), em vertebrados mamíferos, ela
depende de células gânglionares fotoceptoras presentes na retina e de uma via neural que
integra o eixo retino-hipotalâmico-pineal, para a geração de sua ritmicidade e
sincronização ao ciclo de iluminação ambiental. A complexidade da regulação da
produção da melatonina é, além disso, denotada pela presença de vários sistemas
peptidérgicos que estão potencialmente envolvidos na funcionalidade da glândula.
Entretanto, alguns processos na modulação ou potencialização dessa produção ainda não
foram descritos. Dentro dessa perspectiva, o papel da insulina na regulação da síntese de
melatonina foi estudado em culturas de glândulas pineais de ratos estimuladas com
noradrenalina, insulina e noradrenalina associada à insulina, em culturas temporizadas ou
não pela noradrenalina, avaliando: a produção de melatonina por Cromatografia Líquida
de Alto Desempenho (HPLC) com detecção eletroquímica; as atividades das enzimas
envolvidas na síntese da melatonina, por radiometria; assim como, a expressão gênica das
enzimas quantificada por Real-Time PCR. Os resultados demonstram que: a insulina em
uma concentração de 10-8M potencializa o efeito estimulatório noradrenérgico sobre a
síntese da melatonina, através da indução de um aumento da atividade da Triptofano
Hidroxilase (TPOH) em glândulas cultivadas de acordo com o protocolo de estimulação
aguda; enquanto que, em culturas temporizadas pela noradrenalina (12 h com
noradrenalina / 12 h sem noradrenalina, 2 ciclos), a insulina também manteve sua
capacidade estimulatória, potencializado a síntese da melatonina através da indução,
agora, de um aumento da atividade da Arilalquilamina-N-Acetiltransferase (AANAT); a
insulina por si, não afetou a atividade da Hidroxindol-Oxi-Metiltransferase (HIOMT), e
nem alterou as expressões dos genes que codificam as enzimas envolvidas na síntese da
melatonina tpoh, aanat e hiomt em ambas condições investigadas. Os resultados sugerem
uma interação entre as vias de sinalização da noradrenalina e da insulina, com a
respectiva potencialização da síntese da melatonina, induzida por noradrenalina,
observada pela adição da insulina, efeito esse que se dá, provavelmente, através de
mecanismos pós-transcricionais.
Palavras-chave: glândula pineal, melatonina, insulina, noradrenalina, triptofano
hidroxilase, arilalquilamina-N-acetiltransferase e hidroxi-O-metiltransferase.
ABSTRACT
GARCIA, R. A. P. NORADRENERGIC SYNCHRONIZATION AND THE ROLE OF INSULIN ON THE MODULATION OF MELATONIN SYNTHESIS IN RAT PINEAL GLANDS. 2008. 126 p. Ph. D. thesis (Human Physiology) – Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo, São Paulo, 2008.
The mammalian pineal gland synthesizes melatonin in a circadian manner, peaking
during the dark phase. This synthesis is primarily regulated by sympathetic innervations
via noradrenergic fibers, but is also modulated by many peptidergic and hormonal
systems. A growing number of studies reveals a complex influence of melatonin in
various physiological processes, including modulation of insulin secretion and action. In
contrast, a role for insulin as a modulator of melatonin synthesis has not been
investigated previously. The aim of the current study was to determine whether insulin
modulates norepinephrine (NE)-mediated melatonin synthesis. The results demonstrate
that insulin (10-8M) potentiated norepinephrine-mediated melatonin synthesis and
tryptophan hydroxylase (TPOH) activity in ex vivo incubated pineal glands. When ex vivo
incubated pineal glands were synchronized (12 h NE-stimulation, followed by 12 h
incubation in the absence of NE), insulin potentiated NE-mediated melatonin synthesis
and arylalkylamine-N-acetyltransferase (AANAT) activity. Insulin did not affect the
activity of hydroxyindole-O-methyltranferase (HIOMT), nor the gene expression of tpoh,
aanat, or hiomt, under any of the conditions investigated. We conclude that insulin
potentiates NE-mediated melatonin synthesis in cultured rat pineal gland, potentially
through post-transcriptional events.
Key words: pineal gland, melatonin, insulin, norepinephrine, tryptophan hydroxylase,
arylalkylamine-N-acetyltransferase and hydroxyindol-O-methyltransferase.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA ..............................................16
2 OBJETIVOS.............................................................................................................36
3 MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................38
3.1 Animais ..................................................................................................................38
3.2 Culturas da Glândula Pineal................................................................................38
3.2.1 Culturas padrão da glândula pineal......................................................................38
3.2.2 Culturas temporizadas pela noradrenalina ...........................................................39
3.3 Dosagem de Melatonina .......................................................................................40
3.4 Atividades Enzimáticas ........................................................................................41
3.4.1 Análise radiométrica da atividade da TPH ..........................................................41
3.4.2 Análise radiométrica da atividade da NAT..........................................................41
3.4.3 Análise radiométrica da atividade da HIOMT.....................................................42
3.5 Extração de RNA e Análise Quantitativa por PCR em Tempo-Real...............43
3.6 Análise Estatística .................................................................................................44
4 RESULTADOS ........................................................................................................47
4.1 Culturas Padrão da Glândula Pineal ..................................................................47
4.2 Culturas Temporizadas pela Noradrenalina......................................................48
4.3 Atividades Enzimáticas ........................................................................................49
4.3.1 Atividade da TPH .............................................................................................49
4.3.2 Atividade da NAT.............................................................................................50
4.3.3 Atividade da HIOMT........................................................................................51
4.4 Expressão Gênica por PCR em Tempo-Real .....................................................52
4.4.1 Expressão da tph ...............................................................................................52
4.4.2 Expressão da nat ...............................................................................................53
4.4.3 Expressão da hiomt ...........................................................................................54
5 DISCUSSÃO.............................................................................................................57
6 CONCLUSÕES ........................................................................................................62
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................64
ANEXOS ......................................................................................................................77
ANEXO A: Tabela 1.....................................................................................................78
ANEXO B: Figura complementar ...............................................................................79
ANEXO C: Artigos completos publicados em periódicos ...........................................80
I) Publicação da tese .....................................................................................................80
II) Demais artigos publicados durante o doutorado......................................................88
ANEXO D: Artigo em preparação................................................................................102
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1 INTRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA
A glândula pineal e a biossíntese de melatonina
A glândula pineal, também denominada de órgão pineal, participa na
organização temporal de ritmos biológicos, atuando como mediadora entre o ciclo
claro/escuro ambiental e os processos fisiológicos regulatórios, incluindo a regulação
endócrina da reprodução, a regulação dos ciclos de atividade-repouso e sono/vigília,
assim como a regulação do sistema imunológico, entre outros (CIPOLLA NETO e
AFECHE, 1992).
A glândula pineal é uma estrutura epitalâmica pequena e única, situada
dorsalmente à região caudal do diencéfalo. Deriva-se de células neuroectodérmicas e,
semelhantemente às células da retina, desenvolve-se a partir de uma evaginação do teto
da parede do terceiro ventrículo (KAPPERS et al., 1960).
Nos roedores, a glândula pineal apresenta três porções distintas que
formam o complexo pineal: pineal profunda, pedúnculo pineal e pineal superficial. A
pineal profunda, ou lâmina intercalar, está localizada entre as comissuras posterior e
habenular, delimitando uma região ventricular chamada de recesso pineal, e da sua
porção dorsal emerge o pedúnculo pineal que se comunica com a pineal superficial.
(MOLLER, 1992) (Figura 1).
Figura 1. A figura apresenta a localização anatômica da glândula pineal de rato localizada na região epitalâmica, representada por três porções distintas: pineal superficial, pedúnculo pineal e pineal profunda. Modificado de Swanson, L. W. 1998.
Cérebro Cerebelo
Glândula Pineal
Córtex
Cerebral Cerebelo
Glândula Pineal
Cérebro Cerebelo
Glândula PinealGlândula Pineal
Cerebelo
Córtex
Cerebral Cérebro Cerebelo
Glândula Pineal
Córtex
Cerebral Cerebelo
Glândula Pineal
Cérebro Cerebelo
Glândula PinealGlândula Pineal
Cerebelo
Córtex
Cerebral
A síntese da melatonina, hormônio produzido e secretado
predominantemente á noite, é realizada pela glândula pineal de mamíferos, apresentando
uma flutuação circadiana (ritmo com ciclo em torno de 24 horas, podendo variar em até
4 horas) e sazonal de acordo com a variação do fotoperíodo (Figura 2).
Figura 2. Representação esquemática da informação fotoperiódica transmitida pela síntese de melatonina,
mostrando suas variações circadiana (A) e sazonal (B).
A produção dos indóis pineais precursores da melatonina inicia-se a partir
do aminoácido triptofano, que é hidroxilado pela enzima triptofano-hidroxilase (TPH)
formando 5-hidroxitriptofano (5-HTP), o qual é descarboxilado pela enzima
descarboxilase de L-aminoácido aromático (LAAD), gerando-se assim a serotonina (5-
hidroxitriptamina, 5-HT). A serotonina sofre ação da enzima passo-limitante
arilalquilamina N-acetiltransferase (AANAT ou NAT), que transfere um grupamento
acetil para a serotonina, tendo como produto a N-acetilserotonina (NAS). Essa, por sua
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A
B
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A
B
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vez, sofre ação da enzima hidroxi-indol-O-metiltransferase (HIOMT), que, substituindo o
hidrogênio do grupamento hidroxila do carbono 5 do grupo indólico por um grupamento
metil, forma a melatonina (N-acetil-5-metoxitriptamina) (SUGDEN, 1989) (Figura 3).
Figura 3. Representação dos indóis precursores da síntese de melatonina, e do ponto de atuação de cada
enzima.
Diferentemente de outros vertebrados, a glândula pineal de mamíferos não
possui características fotossensíveis, sendo que, para sua sincronização ao ciclo diário de
iluminação ambiental (refletindo-se na síntese de melatonina), depende de células
ganglionares fotoceptoras presentes na retina, e da via de projeção retino-hipotalâmica
para os núcleos hipotalâmicos, incluindo os núcleos supraquiasmáticos. Estes, por sua
vez, conectam-se funcionalmente com a glândula pineal através dos núcleos
paraventriculares hipotalâmicos, neurônios pré-ganglionares simpáticos da coluna
intermediolateral da medula espinhal, gânglios cervicais superiores, dos quais se
originam os neurônios pós-ganglionares simpáticos, que se projetam para a glândula
N H
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N H
CH2CH(NH2)COOH
CH2CH2NHCOCH3 CH3O
CH2CH2NH2 HO
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CH2CH(NH2)COOH HO
CH2CH2NHCOCH3 HO
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SEROTONINA
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N H
TRIPTOFANO ������!!����""������ ���������������������� ����##��
pineal através dos ramos carotídeos internos e dos nervos conários (CIPOLLA NETO e
AFECHE, 1992; MOORE et al., 1995). A síntese da melatonina, que é deflagrada no
período escuro, deve-se à liberação de noradrenalina (Nor) pelos terminais simpáticos
que inervam a glândula pineal (KAPPERS, 1960) (Figura 4).
Figura 4. Representação esquemática da via de sinalização da síntese de melatonina em roedores. O
fotoestímulo é transmitido por células ganglionares específicas presentes na retina pela via de projeção retino hipotalâmica (RHP), incluindo os núcleos supraquiasmáticos (NSQs) presentes no hipotálamo (H), localizados acima do quiásma óptico (QO). Esses se comunicam com a glândula pineal por uma via que inclui os núcleos paraventriculares (PV), os neurônios pré-ganglionares simpáticos da coluna intermediolateral da medula espinhal (IML) e gânglios cervicais superiores (GCS), de onde se originam os neurônios pós-ganglionares simpáticos que inervam a glândula pineal (P), através dos ramos carotídeos internos (RCI) e nervos conários (NC).
A noradrenalina liberada no interstício da glândula interage com os
adrenoreceptores do tipo �1 e �1 (KLEIN, et al., 1983; VANECEK, et al., 1985). A
ativação do adrenoreceptor �1 mediado pela proteína G estimulatória (Gs), promove o
aumento da quantidade intracelular de monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) pela
ativação da enzima adenilato ciclase (AC). Esse efeito é potencializado pela estimulação
dos adrenoceptores � (�1B), cujos efeitos são mediados por uma proteína Gq, levando à
ativação da fosfolipase C, a qual promove a hidrólise de fosfoinositídios de membrana,
com a conseqüente produção de trifosfato de inositol (IP3) e diacilglicerol (DAG). O IP3,
atuando em seus receptores no retículo endoplasmático, induz a liberação do cálcio
RETINA��������
RHP
NSQ PVH
P NC
RCI SCG
IML
GCS RHP
QO
desses estoques, tendo como conseqüência um aumento do cálcio citoplasmático. O
aumento do cálcio induzido por noradrenalina caracteriza-se por um pico seguido de um
platô. A rápida elevação do cálcio deve-se à liberação do cátion a partir do retículo
(SCHAAD et al., 1995) e o platô que se segue se deve ao influxo de cálcio pelos canais
da membrana plasmática responsáveis pela reposição dos estoques intracelulares
(GOMPERTS et al., 2002).
O cálcio e o DAG ativam a proteína quinase C (PKC), potencializando o
aumento do AMPc, pois essa enzima pode fosforilar a adenilato ciclase ou a proteína Gs,
ativando-as. O AMPc e o cálcio intracelular são fundamentais para o processo de
ativação da enzima NAT. Em ratos, esse processo sinérgico entre AMPc e cálcio resulta
na transcrição e tradução protéica e, conseqüentemente, na síntese e ativação da NAT
(BORJIGIN et al, 1995; KLEIN et al, 1983; CHIK et al, 1988; SUGDEN et al., 1985;
SUGDEN et al., 1988; VANECEK et al., 1985). A NAT quando fosforilada pela
proteína quinase A (PKA), interage com a proteína 14-3-3 formando um complexo
protetor contra proteólise proteassomal (KLEIN et al., 2002) (Figura 5).
Figura 5. Figura ilustra os eventos desde a liberação da noradrenalina até a síntese e secreção da melatonina. Modificado de: (GANGULY et al., 2002). 5HT- serotonina; NAS- N-acetilserotonina; NAT-N-acetiltransferase; pNAT-NAT fosforilada; AR-receptor noradrenérgico; AC-adenilato ciclase; DAG-diacilglicerol; cAMP-monofosfato cíclico de adenosina; PKA-proteína quinase dependente de cAMP; CREB-proteína ligante a elemento responsivo ao cAMP; pCREB-CREB fosforilado; NOR/A-noradrenalina e adrenalina.
Em maiores detalhes, no rato, o aumento do AMPc e, conseqüentemente, a
ativação da PKA fazem com que a subunidade catalítica da PKA fosforile o fator de
transcrição CREB (proteína ligante a elementos responsivos ao AMPc). Este, por sua vez,
se liga ao seu sítio CRE na região promotora do gene da NAT, induzindo a transcrição
seguida da tradução citoplasmática da enzima. Porém, esse mecanismo regulatório da
transcrição do gene da NAT parece não ser único. Recentes publicações especulam ainda
a participação de uma histona (H3) que é fosforilada pelo estímulo noradrenérgico,
apresentando um transiente de fosforilação, refletindo provavelmente ativações noturnas
de genes controlados pela noradrenalina na glândula pineal de ratos (KLEIN, 2007;
CHIK et al., 2007).
O aumento do AMPc mencionado acima ocorre rapidamente após a
estimulação noradrenérgica dos adrenoceptores �1 e �1, alcançando níveis máximos em
minutos, com um aumento de aproximadamente 60 vezes em relação aos controles não
estimulados. Portanto, é possível que a grande quantidade inicial de AMPc seja
necessária para induzir processos de transcrição e tradução gênica, enquanto que
concentrações menores de AMPc são suficientes para manter a atividade da NAT. No
entanto, a indução máxima da atividade da NAT ocorre aproximadamente 4 a 6 horas
após o início da estimulação noradrenérgica, quando os níveis de AMPc já não são tão
elevados (KLEIN et al., 1978).
Um mecanismo de regulação inibitória que acontece na segunda metade da
noite deve-se à desfosforilação da CREB. Esse processo ocorre em paralelo a um
mecanismo inibitório direto envolvendo a síntese da proteína ICER (inducible cAMP
early repressor), a qual inibe a transcrição do gene da NAT, e conseqüentemente causa
redução na atividade da NAT. Esses dois fatores contribuem para a queda circadiana da
atividade da NAT que ocorre no fim da noite (KLEIN et al., 1970) (Figura 6).
Sinais adrenérgic
Figura 6. Representação esquemática da via de regulação pela geração rítmica da síntese de melatonina.
CREB fosforilada ativa a transcrição do gene da NAT, e na segunda metade da noite ocorre a ativação da região promotora P2 do gene CREM induzindo a síntese do ICER. FOULKES et al., 1997.
Os eventos pós-transcricionais também têm um papel importante na
regulação da NAT pois, como demonstrado em ratos, a fotoestimulação noturna reduz a
atividade da enzima sem alterar a quantidade de RNAm (ROMERO et al., 1975). A NAT
estabiliza sua atividade enzimática através da fosforilação pela PKA, associando-se com
a proteína 14-3-3, formando um complexo NAT/14-3-3 (GANGULY et al., 2001). Essa
associação impede que a NAT seja metabolizada por um mecanismo de proteólise
proteassomal (GASTEL et al., 1998).
A TPH é a responsável pela formação do 5-hidroxitriptofano, enzima
passo-limitante na síntese da serotonina. A concentração de triptofano na pineal é muito
elevada, sendo maior do que em qualquer outra parte do sistema nervoso central. O
transporte de triptofano no sistema nervoso central se dá através de um sistema de
transporte de aminoácidos neutros, e, assim, um sistema semelhante a esse poderia
carregar o triptofano para o interior dos pinealócitos (SUGDEN et al., 1989;
GUTIERREZ et al., 2003). A TPH não parece ser regulada negativamente por seu
substrato, uma vez que a síntese de serotonina em glândulas pineais em culturas não é
limitada pela captação aumentada do aminoácido triptofano (YOUNG e ANDERSON,
1982; GUTIERREZ et al., 2003).
Na glândula pineal do rato, a TPH apresenta um ritmo circadiano de
atividade, com atividade mais elevada no período noturno, fazendo com que a síntese de
5-hidroxitriptofano seja maior durante a noite. Esse aumento da atividade de cerca de 2
vezes durante a noite deve-se tanto à sua síntese aumentada, pela indução de transcrição
gênica e síntese protéica, como à ativação da enzima por fosforilação (BESANÇON et
al., 1996; SITARAM e LEES, 1978; SHIBUYA et al., 1978). Tanto o ritmo de formação
do RNAm, como o ritmo de atividade da TPH são induzidos por estimulação
noradrenérgica, pela via do AMPc e PKA, a qual através da fosforilação do CREB,
promove a transcrição da enzima TPH (BOADLE-BIBER, 1980; EHRET et al., 1991;
SHEIN e WURTMAN, 1971; SITARAM e LEES, 1984). A fosforilação da TPH pode
ocorrer pela PKA, pela quinase dependente de cálcio e calmodulina (CaMK) e pela PKC
(EHRET et al., 1989, 1991; JOHANSEN et al., 1995, 1996; KUHN et al., 1978;
SIMONNEAUX e RIBELAYGA, 2003).
A regulação da atividade da TPH também ocorre pela associação com a
proteína 14-3-3. A TPH fosforilada pela CaMK, PKC ou pela PKA liga-se à proteína 14-
3-3, aumentando, assim, a sua atividade e impedindo a sua desfosforilação (ICHIMURA
et al., 1987, 1995; BANIK et al., 1997; KLEIN et al., 2003).
A concentração de serotonina no pinealócito (regulada pela TPH)
apresenta uma variação diária, com concentrações mais elevadas durante o período claro
(apesar de sua taxa de renovação ser maior à noite: maior síntese e maior degradação).
No período claro, ela é metabolizada através da via da monoamina oxidase B (MAO B),
que possui uma variação circadiana com valores elevados durante o período claro (KING
e STEINLECHNER, 1985). A serotonina sob ação da MAO B é transformada em 5-
hidroxi-indolacetaldeído (5-HIAL), e este, por sua vez, sofre a ação da enzima aldeído
desidrogenase transformando-se em ácido 5-hidroxi-indolacético (5-HIAA) e sob ação da
enzima álcool desidrogenase é transformado em 5-hidroxitriptofol (5-HL). Ambos podem
ser O-metilados por ação da (HIOMT) (Figura 7).
Monoamina Oxidase (MAO B)
Aldeído Desidrogenase Álcool Desidrogenase
HIOMT HIOMT
5-Hidroxi-Indol-Acetaldeído
Figura 7. Via Desaminativa-Oxidativa da serotonina na Glândula Pineal.
A redução dos níveis de serotonina à noite deve-se a dois fatores: a
ativação da NAT pela estimulação noradrenérgica, transformando serotonina em N-
acetilserotonina; e a liberação de serotonina da glândula pineal também induzida pela
estimulação noradrenérgica (WALKER e ALOYO, 1985; ALOYO e WALKER, 1987,
1988).
A HIOMT, por sua vez, age na N-acetilserotonina (NAS), transformando-
a em melatonina. A atividade da enzima HIOMT no período noturno apresenta um
aumento de 1.5 vezes, enquanto o seu RNAm tem um aumento de 2 vezes
(RIBELAYGA et al., 1999 a, b; SIMONNEAUX e RIBELAYGA, 2003). O ritmo
circadiano do RNAm da HIOMT é dependente da estimulação adrenérgica, através da
ativação do receptor β-adrenérgico, e do aumento na concentração de AMPc. Já a
regulação do ritmo de atividade da enzima HIOMT parece ser dependente de eventos
pós-transcricionais, induzidos por neurotransmissores que aumentam a concentração
intracelular de cálcio (SIMONNEAUX et al., 1999).
O neuropeptídio Y (NPY) tem um efeito estimulatório sobre a atividade
da HIOMT, potencializando a síntese de melatonina (RIBELAYGA et al., 1997). Esse
efeito estimulatório se dá pelo influxo de cálcio na célula. O NPY também está
envolvido na regulação do ritmo de atividade da HIOMT. Estudos in vivo demonstraram
que a atividade da HIOMT correlaciona-se significativamente com a concentração do
NPY, que possui um ritmo diário e sazonal. SIMONNEAUX et al. (1999) observaram
que o aumento noturno do RNAm da HIOMT não tem relação direta com o aumento da
atividade dessa enzima. E adicionalmente a regulação da atividade da HIOMT parece
ocorrer em longo prazo, pois em trabalhos com animais expostos à luz constante ou em
que seus gânglios cervicais superiores foram removidos, verificou-se uma redução na
atividade da HIOMT (SUGDEN, 1989).
Uma vez sintetizada, a melatonina é secretada diretamente para a
circulação sangüínea, sendo degradada nos rins e no fígado, onde é convertida em 6-
sulfatoximelatonina (BROWN et al., 1991). A melatonina também pode ser metabolizada
no cérebro, onde é transformada em N-acetil-5-metoxiquinurenina pela enzima 2,3-
indolamina dioxigenase (HIRATA et al., 1974) (Figura 8).
Figura 8. Via de degradação da melatonina no fígado, rins e sistema Nervoso.
Dados na literatura demonstram que outras substâncias também podem
Melatonina
2,3-Indolamina Dioxigenase
6-Sulfatoximelatonina
6-Hidroximelatonina
Melatonina
2,3-Indolamina Dioxigenase
6-Sulfatoximelatonina
6-Hidroximelatonina
modular a síntese de melatonina, como acetilcolina, dopamina (DOPA), GABA,
prostaglandinas e serotonina. Peptídios, como o peptídeo intestinal vasoativo (VIP)
também regulam a síntese de melatonina, podendo induzir a transcrição do gene da NAT
e estimular a atividade da enzima por promover um aumento na quantidade da AMPc
(OLCESE, 1991; SIMMONEAUX et al., 1994).
Papel do Cálcio na Síntese de Melatonina
O cálcio, além de participar da ativação da PKC e na potenciação da
síntese do AMPc, parece também ter um papel importante nos eventos subsequentes à
elevação do AMPc intracelular que induzem a síntese de melatonina. Utilizando-se
análogos do AMPc, e aumentando-se o cálcio intracelular por várias manobras
experimentais, verificou-se que o cálcio tem um papel potenciador da atividade da NAT
(YU et al., 1993). Os mecanismos dessa ativação da NAT pelo cálcio não são conhecidos,
mas poderiam envolver a fosforilação da proteína CREB, através da ativação de uma
quinase dependente de cálcio. Evidências nesse sentido provêm de dados demonstrando
que agentes despolarizantes, como o KCl e a ouabaína (inibidor de Na+-K+ ATPase), que
aumentam o cálcio intracelular, induzem a fosforilação da CREB nos pinealócitos
(ROSEBOOM e KLEIN, 1995). Ainda, eventos pós-transcricionais poderiam estar
envolvidos, uma vez que estes também parecem ter um papel importante na regulação da
NAT (ROMERO et al., 1975). Os eventos pós-transcricionais poderiam envolver os sítios
de fosforilação pelas quinases protéicas dependentes de Ca2+, que foram identificados na
enzima, ou os grupos tióis, ou, ainda, a fosforilação de enzimas citosólicas que poderiam
regular a síntese, atividade ou estabilidade da NAT (BORJIGIN et al., 1995; COON et
al., 1995; KLEIN e NAMBOODIRI, 1982; KLEIN et al., 1992, 1996; NAMBOODIRI et
al., 1981; YU et al., 1993).
Da mesma forma que a NAT, as enzimas TPH e HIOMT também parecem
ser ativadas pelo cálcio. Foi demonstrado que a enzima TPH cerebral é um substrato para
a fosforilação por uma quinase protéica dependente de cálcio e calmodulina (EHRET et
al., 1989). De modo semelhante, a enzima na pineal poderia apresentar esse mesmo
mecanismo. Com relação à HIOMT, a sua dependência de mecanismos ativadores que
utilizam o cálcio foi demonstrada devido à sua ativação por neurotransmissores que
aumentam o cálcio intracelular na glândula pineal, como VIP e NPY (RIBELAYGA et
al., 1997; SIMMONEAUX et al., 1999).
O bloqueio de canais para cálcio dependentes de voltagem, por uma
neurotoxina do veneno da aranha Phoneutria nigriventer (ω-Phonetoxina IIA)
(AFECHE, 1994; CASSOLA e AFECHE, 1996; CASSOLA et al., 1998), que atua como
antagonista de canais L, N e, possivelmente, P/Q, reduziu as concentrações de N-
acetilserotonina de glândulas pineais de ratos, in vitro, estimuladas por noradrenalina.
Além da regulação da atividade da NAT por meio dos canais do tipo L,
sua síntese e atividade são reguladas também pelo cálcio liberado dos estoques
intracelulares devido a estimulação �1-adrenérgica.
Outros autores, no entanto, caracterizaram, na glândula pineal de ratos, a
presença de canais catiônicos não-seletivos, os quais seriam ativados pela noradrenalina,
promovendo a entrada de sódio e despolarização da membrana dos pinealócitos. Em
consequência, canais de cálcio dependentes de voltagem poderiam ser ativados,
induzindo um aumento do cálcio intracelular. Além disso, o AMPc parece ter um papel
importante na mediação dos efeitos da noradrenalina sobre a ativação dessas correntes
despolarizantes, pois análogos do AMPc induziram a mesma resposta (DARVISH e
RUSSELL, 1998).
Vários trabalhos demonstraram a importância e o envolvimento dos canais
de cálcio do tipo L na ativação da enzima NAT ou na síntese de melatonina (MEYER et
al., 1986; ZAWILSKA e NOWAK, 1991; ZHAO e TOUITOU, 1994). Dados recentes
obtidos em nosso laboratório mostraram que o bloqueio dos canais de cálcio dependentes
de voltagem do tipo L, pela nifedipina, reduziu as respostas máximas das curvas dose-
resposta de melatonina de glândulas pineais, em cultura, estimuladas com noradrenalina
(AFECHE et al., 2006). Esses dados demonstraram a importância do influxo de cálcio
através dos canais dependentes de voltagem do tipo L na potenciação da síntese de
melatonina, e que os seus efeitos dependem da estimulação dos receptores β-adrenérgicos
e ocorrem após os mecanismos de elevação do AMPc na glândula.
Uma provável ação do cálcio seria sobre os mecanismos de ativação da
NAT. De fato, os resultados obtidos em nosso laboratório mostraram uma redução na
atividade dessa enzima pelo bloqueio dos canais de cálcio do tipo L com a nifedipina. No
entanto, a redução da atividade da NAT foi bastante pequena (10%) quando comparada à
redução do conteúdo de melatonina (aproximadamente 40%).
O bloqueador de canais para cálcio do tipo N, a ω-conotoxina GVIA,
reduziu a resposta máxima de melatonina em glândulas pineais em cultura estimuladas
com noradrenalina. Esses resultados indicam também a importância desses canais na
potenciação da síntese de melatonina pelas glândulas pineais de ratos. Nesse caso,
também, verificou-se uma redução da atividade da NAT pelo bloqueio dos canais do tipo
N, o que explicaria a diminuição da síntese de melatonina (AFECHE et al., 2006).
Mecanismos de ação da melatonina
A ação biológica da melatonina pode ser atribuída tanto à sua interação
com receptores específicos (KRAUSE e DUBOCOVICH, 1990; STANKOV e REITER,
1990) quanto à sua capacidade de seqüestrar radicais hidroxila (TAN et al., 1993a;
1993b).
As características químicas da molécula da melatonina, pela presença dos
grupamentos metóxi, no carbono 5, e do grupamento acil, ligado ao nitrogênio do grupo
amina, são de anfifilicidade. Isto é, a melatonina tem a propriedade de difundir-se, com
igual capacidade, tanto em meios hidrofílicos quanto lipofílicos. Dessa forma, a
melatonina, uma vez produzida na glândula pineal, é imediatamente secretada e pode ser
encontrada em todos os compartimentos do organismo. Além disso, os carbonos 2 e 3 do
anel pirrólico possuem uma alta capacidade de doar elétrons. Isso confere a melatonina
uma alta capacidade redutora ou anti-oxidante. Ela é considerada um dos mais poderosos
agentes anti-oxidantes naturais (TAN et al., 2002) (Figura 9).
Figura 9. Representação esquemática das características químicas da molécula de melatonina.
A melatonina é uma molécula ubiqüamente encontrada nos seres vivos,
podendo ser encontrada em seres procariotos e eucariotos (unicelulares e pluricelulares).
Dadas essas características de aparecimento, manutenção e prevalência da melatonina,
desenvolveu-se, nas matérias vivas, uma grande série de mecanismos de ação mediando
as funções dessa molécula.
Assim, dependendo do local de sua produção e da organização do ser vivo
considerado, ela pode agir no interior da própria célula que a produz. Da mesma maneira,
ela pode sair da célula que a produz e exercer ações autócrinas (na própria célula),
parácrinas (em células vizinhas) e endócrinas (em células-alvo localizadas à distância)
(Figura 10).
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CH
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Figura 10. Ilustra os modos pelos quais a melatonina pode agir. Modificado de: CARRILLO-VICO et al.,
2004.
É provável que, ao longo da evolução, os mecanismos de ação da
melatonina tenham se tornado gradativamente mais complexos. Inicialmente a
melatonina poderia ter efetuado seu papel de sinalizador principalmente como anti-
oxidante, através de interações molécula a molécula e de modulador da atividade
enzimática. Posteriormente, quando da sua ação à distância, passou a interagir com
moléculas receptoras específicas, sejam de membrana, ou nucleares.
Dentre as suas ações intracelulares diretas pode-se ressaltar, além de seu
papel anti-oxidante: a mobilização de mecanismos reparadores do DNA; a regulação
EFEITO PARÁCRINO
EFEITO ENDÓCRINO
EFEITO AUTÓCRINO
EFEITO INTRÁCRINO
direta da atividade de várias enzimas; a ação intra-mitocondrial, regulando o metabolismo
oxidativo e o transporte de elétrons, além de regular processos de apoptose celular
(REITER 1995).
Em vertebrados, além de a melatonina ter uma produção e ação localizada
em diversos tecidos (retina, células do trato gastrointestinal, células imunocompetentes,
células da medula óssea, etc), através de ações autócrinas ou parácrinas, ela é produzida
centralmente, numa glândula endócrina (pineal), e passa a ter uma ação sistêmica,
hormonal, agindo, portanto, em células-alvo localizadas à distância, caracterizadas pela
presença de receptores específicos.
Os efeitos modulatórios da melatonina sobre os ritmos circadianos são
provavelmente mediados por receptores de alta afinidade localizados em células dos
núcleos supraquiasmáticos (REPPERT et al., 1996). Os receptores foram exaustivamente
demonstrados em ensaios de “binding” de derivados da melatonina marcados com
radioisótopos. Ligações de alta afinidade foram detectadas em alguns territórios do
sistema nervoso central e medula espinal, e em outros órgãos, como o rim, pulmão,
intestino, vasos sangüíneos e retina (KRAUSE e DUBOCOVICH, 1991).
A melatonina pode se ligar a vários receptores de membrana acoplados a
proteína G, exceto MT3, os quais são divididos em três classes de proteínas: MT1, MT2 e
MT3, uma enzima da família das quinonas redutases (WITT-ENDERBY et al., 2003).
Além disso, a melatonina pode se ligar diretamente ao seu receptor nuclear da família dos
receptores órfãos do ácido retinóico (RZR/ROR), a qual é composta por três membros: �,
� e � (SMIRNOV, 2001).
Os receptores MT1 e MT2 são homólogos e formam receptores de sete
alças que ativam proteínas Gi. Nos receptores ligam-se derivados da melatonina que
inibem, por mecanismo sensível à toxina pertussis, a ativação da adenilato ciclase,
induzida por forskolina, ou ativam canais para K+ do tipo retificador para dentro
(NELSON et al., 1996; KRAUSE e DUBOCOVICH, 1991; WHITE et al., 1987;
REPPERT et al., 1994; LIU et al., 1997). Trabalhos recentes demonstraram que a
melatonina também ativa a via de sinalização do Ca2+, potencializando a ativação da
fosfolipase C e da atividade da proteína quinase C (GODSON e REPPERT, 1997;
McARTHUR et al., 1997; BARRETT et al., 1999) bem como a via do ácido araquidônico
(BARRETT et al., 1999).
Por hibridização “in situ” verificou-se que a expressão dos receptores no
sistema nervoso central de mamíferos está restrita a algumas áreas, entre as quais os
núcleos supraquiasmáticos, a pars tuberalis, área postrema, cerebelo e hipocampo, sendo
as duas primeiras áreas os principais sítios de ligação para melatonina, tanto para
roedores como para humanos (REPPERT et al., 1988; VANECEK et al., 1987;
WILLIAMS, 1989). As áreas de hibridização são as mesmas que haviam sido marcadas
em ensaios de “binding” de derivados da melatonina (GILLETTE e McARTHUR, 1995).
Nos núcleos supraquiasmáticos de ratos, a expressão dos receptores é
variável no período de um dia, e o efeito da melatonina sobre os neurônios desses núcleos
dependerá, portanto, do momento da sua aplicação no período circadiano. O efeito,
quando ocorre, é o de inibição da atividade elétrica tônica, isto é, da freqüência de
disparos de potenciais de ação (STEHLE et al., 1989).
Glândula Pineal, Melatonina e Insulina.
A insulina (Ins) e os fatores de crescimento semelhantes à insulina dos
tipos I e II (IGF-I e IGF-II) são polipeptídios semelhantes em sua estrutura primária,
secundária e terciária. A insulina, além de suas ações específicas sobre o metabolismo de
carboidratos, gorduras e proteínas, tem também um papel no crescimento e na maturação
de células do sistema nervoso central e atua como modulador da atividade neuronal.
Assim, ela compartilha com os IGFs ações mitogênicas e promotoras do crescimento. Os
IGFs, por sua vez, exibem moderadamente os efeitos metabólicos da insulina.
O receptor de insulina (IR) é constituído por duas subunidades α e duas
subunidades ß. A subunidade α é extracelular e possui o sítio de ligação para a insulina e
inibe a atividade tirosina quinase da subunidade ß. Assim que ocorre a ligação hormônio-
receptor, há uma mudança conformacional no receptor e a subunidade ß que é uma
proteína transmembrana, se autofosforila e fosforila outros substratos endógenos em
resíduos de tirosina, e o ATP é a principal fonte de doação de fosfatos. Dessa maneira,
pela autofosforilação da subunidade ß do receptor de insulina, ocorre a fosforilação dos
substratos endógenos do IR.
O primeiro substrato endógeno descrito foi denominado substrato 1 do
receptor de insulina (IRS-1) (WHITE et al., 1985). O IRS-1 localiza-se no citoplasma e
na sua sequência básica são encontrados muitos sítios de fosforilação de serina, treonina e
tirosina.
Foi demonstrada uma associação entre a enzima fosfatidilinositol 3'-
quinase (PI3-K) com IRS-1 após estímulo com insulina através dos domínios YMXM e
YXXM do IRS-1 e os domínios SH2 da PI 3-kinase (FOLLI et al., 1992).
A PI3-K consiste de duas subunidades, uma catalítica e uma regulatória,
que contém dois sítios SH2 e desempenha um papel central nas ações metabólicas e
mitogênicas da insulina. A associação/ativação da PI3-K pela insulina pode transmitir
múltiplos sinais intracelulares. PI3-K catalisa a fosforilação dos fosfoinositóis na posição
três e produz fosfatidilinositóis, especialmente PI 3,4,5P3, que se liga a domínios de
diferentes moléculas sinalizadoras, alterando suas atividades e localizações intracelulares.
Além disso, esta proteína possui atividade serina quinase e tanto a subunidade catalítica
quanto a subunidade regulatória podem interagir com outras proteínas sinalizadoras.
Fosfatidilinositóis 3-fosfato regulam três classes principais de moléculas
sinalizadoras: a família das proteínas serina/treonina quinases AGC, a família das
GTPases Rho e a família de tirosinas quinases TEC.
A proteína mais bem caracterizada das quinases AGC é a PDK-1, quinase
dependente de fosfoinositol-1, que ativa a serina/treonina quinase AKT, também
conhecida como PKB. AKT tem sido sugerida como uma importante proteína na
transmissão do sinal insulínico, através da fosforilação da enzima glicogênio sintase
quinase 3 (GSK3), de fatores de transcrição denominados forkhead e do CREB.
A insulina estimula a MAPK (mitogen-activated protein kinase). Esta via
envolve a associação ao IRS-1 das seguintes proteínas: Shc, SHP2 e Grb-2. A proteína
SHP2 é uma fosfotirosina fosfatase que contém duas porções SH2 e se liga ao IRS-1
(SUN et al., 1991). Essa ligação ativa a fosfatase que parece exercer um importante papel
no crescimento celular induzido pela insulina. A Grb-2 é uma pequena proteína
citoplasmática que se liga ao IRS-1. A Grb-2 age como uma molécula adaptadora que
liga o fator permutador de guanina para a p21 ras, chamado mSOS (son-of-sevenless), a
fosfoproteínas como o receptor do EGF e o IRS-1. O complexo Grb/mSOS ativa a
p21ras, estimulando a sua ligação ao GTP.
A proteína ras se liga a Raf-1, a qual fosforila e ativa a MAP quinase
quinase (MAPKK), que finalmente ativará a MAP quinase (também conhecida como
ERK).
Desta forma o IRS-1 é uma proteína fundamental no processo de
transmissão do sinal insulínico, sendo recrutada na fase inicial dessa sinalização e
atuando como proteína ancoradoura capaz de ativar diversas enzimas.
Há pelo menos nove substratos do receptor de insulina descritos. Quatro
desses substratos compreendem a família de proteínas que apresentam homologia entre si
e são denominadas IRS-1, IRS-2, IRS-3 e IRS-4. Outros substratos incluem Gab-1,
p60dok, Cbl, APS e isoformas da proteína Shc (SALTIEL e KAHN, 2001).
As distintas proteínas IRSs parecem, portanto, servir a diferentes funções
celulares, provavelmente devido a diferenças na distribuição tecidual, localização
intracelular e atividade intrínseca das proteínas. Assim, há vários estudos sugerindo um
papel da sinalização insulínica no sistema nervoso central (SNC), na regulação da
ingestão alimentar, no crescimento e diferenciação neuronal, na liberação de
neurotransmissores e na plasticidade neuronal (BASKIN et al., 1999; SCHWARTZ et al.,
1992; HEIDENREICH, 1993; ROBINSON et al., 1994; JONAS et al., 1997; PLITZKO
et al., 2001).
Os receptores para insulina e para o IGF-I, no sistema nervoso central, são
muito semelhantes e compostos por duas subunidades, a �, à qual se liga o agonista, e a �,
que tem atividade de quinase específica para tirosina. As subunidades � de ambos os
receptores têm um peso molecular de 115.000 Da e as subunidades �, de 94.000 Da. O
receptor para o IGF-II apresenta estrutura monomérica e peso molecular de 250.000 Da,
sem atividade aparente de quinase.
O receptor para insulina apresenta maior afinidade à insulina do que para
IGF-I e IGF-II. O receptor para IGF-I tem alta afinidade para o IGF-I, mas também
reconhece o IGF-II e, em altas concentrações, a insulina. O receptor para IGF-II tem
maior afinidade para IGF-II do que para IGF-I, e não se liga à insulina (KAR et al.,
1993).
Os receptores para insulina no sistema nervoso central do rato foram
localizados e quantificados por ensaios de binding sites, e estão presentes em estruturas
como: cerebelo, bulbo olfatório, hipocampo, córtex, núcleos hipotalâmicos, substância
negra, gânglios da base, glândula pineal e outras (HILL et al., 1986; KAR et al., 1993).
Os receptores para IGF-I e II também foram caracterizados na glândula pineal (DE
KEYSER et al., 1994; SMITH et al., 1988), assim como o RNAm do receptor de
insulina, IGF-I e seus receptores e do IGF-II (PESCHKE et al., 2006.; AYER-LE
LIEVRE et al., 1991).
Em glândulas pineais cultivadas e tratadas com Losartan (antagonista do
receptor de Angiotensina II (AT1)), foi demonstrada uma inibição na síntese de
melatonina induzida pela noradrenalina, apresentando uma redução em todos os indóis
precursores da melatonina, mas principalmente do 5-HTP. Isso sugere uma ação
potencializadora da angiotensina II sobre a atividade da enzima TPH, possivelmente
dependente de vias de transdução que impliquem em fosforilação em tirosina
(BALTATU et al., 2002). Dessa forma, na glândula pineal, vê-se que a mobilização de
vias de transdução intracelular que impliquem na fosforilação de tirosina resulta na
amplificação do sinal da noradrenalina necessário para a síntese de melatonina. Assim, a
insulina promovendo fosforilações em resíduos de tirosina, poderia alterar a via de
síntese da melatonina na glândula pineal.
Em adição, a influência da melatonina inibindo a secreção da insulina (em
ilhotas de ratos isoladas), a qual também apresenta um ritmo circadiano observado nos
níveis plasmáticos, foi caracterizada (LIMA, et al., 1998; PICINATO et al., 2002 b, a).
Porém, a possível influência da insulina sobre a síntese de melatonina ainda não
caracterizada, nos possibilitou postular a hipótese de que o sinal insulínico modularia a
síntese de melatonina induzida pela noradrenalina.
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2 OBJETIVOS
Tivemos assim, como objetivo deste trabalho, estudar in vitro, utilizando
técnica de cultura de glândula pineal, o papel da insulina na regulação da síntese de
melatonina pela glândula pineal de ratos, através da quantificação de melatonina por
cromatografia líquida de alto desempenho com detecção eletroquímica e medição da
expressão e atividade das principais enzimas (TPH, NAT e HIOMT) envolvidas nesse
processo biossintético.
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3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Animais
Foram utilizados ratos da linhagem Wistar com peso corporal entre 150-
180g, fornecidos pelo biotério do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de
São Paulo (USP), São Paulo, SP, Brasil. Os animais foram mantidos em um ciclo de 12h:
12h ciclo claro/escuro (início do período claro às 06:00 h, zeitgeber 0 (ZT0)),
acondicionados em biotério termorregulado (21 ± 2 oC), com comida e água ad libitum. O
protocolo experimental foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal
(CEEA) do Instituto de Ciências Biomédicas da USP, protocolo no 79 fls 09 livro 2.
3.2 Culturas da Glândula Pineal
Os animais foram sacrificados por decapitação, e as glândulas pineais, 12
glândulas por grupo experimental, foram coletadas e colocadas imediatamente em meio
de cultura BGJb com fenol red (Fitton-Jackson Modification) modificado com BSA
(Albumina Sérica Bovina) (1 mg/mL), acrescido de glutamina (2 mM), ácido ascórbico
(0,1 mg/mL) e penicilina (100 U/mL)-estreptomicina (100 µg/mL) (Gibco, Grand Island,
NY, 14072, USA), mantidas em gelo. No fluxo laminar as glândulas foram transferidas
para placas de cultura com 24 poços (2 glândulas por poço), contendo em cada poço 200
µL de meio de cultura e um disco de nylon de 4 mm, sobre o qual as glândulas foram
colocadas. As placas foram acondicionadas em uma câmara incubadora modular,
preenchida com carbogênio (95% O2 e 5% CO2), saturada de umidade, mantida na estufa
de CO2 a 37 oC (AFECHE et al., 2006).
3.2.1 Culturas padrão da glândula pineal
As glândulas foram mantidas em cultura por 48 h, sendo transferidas para
uma nova placa, com meio fresco, a cada 24 h. Após 48 h de cultura uma nova troca do
meio foi realizada e após as glândulas permanecerem 1 h no meio fresco, as glândulas
+ NORADRENALINA 10-6M
- NORADRENALINA
+ NORADRENALINA + INSULINA
12h
foram submetidas à estimulação, incubadas por 5 h de acordo com os seguintes
tratamentos: 1) Controle (grupos sem tratamento algum); 2) Nor (10-9M a 10-6M); 3) Nor
(10-6M) + Ins (10-9M a 10-7M) e Ins (10-8M) + Nor (10-9M a 10-6M) (Sigma Biochemical
CO, St. Louis, MO, USA). Após 5 horas, a incubação foi interrompida e as glândulas
coletadas individualmente em gelo seco, foram armazenadas a -80 ºC até a realização das
análises posteriores. Para o preparo das concentrações desejadas de Nor, foi utilizado HCl
0,01N com as diluições subseqüentes feitas em solução de Ác. ascórbico (50 mg/L)
(Figura 11).
Figura. 11. Desenho experimental da cultura padrão da glândula pineal. As glândulas foram incubadas na presença de noradrealina e noradrenalina + insulina por 5 h após 48 h em cultura.
3.2.2 Culturas temporizadas pela noradrenalina
Nas culturas temporizadas pela noradrenalina os animais foram
sacrificados e as glândulas cultivadas pouco antes do horário de transição do período
claro para o escuro (ZT 11). A temporização noradrenérgica foi realizada desde o
primeiro dia de cultura, pela adição de Nor (10-6M) por 12 horas em cada período de 24
h, em um total de 48 h de cultura, validada pela atividade da NAT (figura em anexo).
5h5h5h
Semelhantemente à cultura padrão da glândula pineal, a cada período de 24 h o meio de
cultura foi trocado. Após 48 h de cultura uma nova troca do meio foi realizada e após as
glândulas permanecerem 1 h no meio fresco, as glândulas foram submetidas à
estimulação, incubadas por 5 h com: Nor (10-6M) e Nor (10-6M) + Ins (10-8M). Após 5
horas, a incubação foi interrompida e as glândulas coletadas individualmente em gelo
seco, foram armazenadas a -80 ºC até a realização das análises subseqüentes (Figura 12).
Figura. 12. Desenho experimental da cultura temporizada pela adição de noradrenalina (10-6M ) por 12
h em intervalos de 24 h. As glândulas foram incubadas na presença de noradrenalina e noradrenalina (10-6M) + insulina (10-8M ) por 5 h após 48 h em cultura.
3.3 Dosagem de Melatonina
O conteúdo de melatonina presente nas glândulas pineais foi dosado por
cromatografia líquida de alta resolução com detecção eletroquímica (Waters System,
Milford, MA, USA). O sistema cromatográfico é composto por uma bomba Waters® 600
operada isocraticamente, uma coluna Resolve C18 (partícula esférica de 5µm;
3,9x150mm) e um detector eletroquímico 464 operado em modo DC, controlado pelo
programa computacional Empower (Waters System, Milford, MA, USA) através de uma
interface Bus/SATIN.
5h5h5h
Cada glândula foi sonicada (Microson XL 2005, Heat System Inc.,
Farmingdale, NY, USA) por 10 s em 120 µL de uma solução de ácido perclórico (0,1 M),
EDTA (0,02%) e metabissulfito de sódio (0,02%). Foram então centrifugadas por 2min a
13000 g (Eppendorf 5415C Centrifuge, Brinkman Instruments Inc., Westbury, NY,
USA), retirando-se o sobrenadante, injetado no sistema de cromatografia (Injetor Mod.
7125, com loop de 20 µl, Rheodyne Inc., CA, USA).
O sistema utilizado é o de cromatografia de fase reversa, isocrática, tendo
como fase móvel uma solução contendo tampão acetato de sódio 0,1 M e ácido cítrico 0,1
M, EDTA 0,15 M e metanol (30%), com fluxo de 1 mL/min, potencial de oxidação de
900 mV e duração de aproximadamente 6 minutos para cada corrida.
Foram realizadas no início das dosagens curvas de calibração com 4
concentrações conhecidas do padrão (melatonina). As curvas de calibração foram obtidas,
usando-se o programa Empower da Waters, pela relação das diferentes concentrações de
cada padrão com as áreas dos picos correspondentes nos cromatogramas. A identificação
do pico de melatonina das amostras foi realizada pela comparação de seu tempo de
retenção com a dos padrões, e a quantificação realizada pelo programa computacional.
Soluções-estoque do padrão de melatonina (1 mM) foram preparadas em
HCl 0,1M, acrescido de EDTA 0,02% e metabissulfito de sódio 0,02%, aliquotadas em
tubos de microcentrífuga, e mantidas a -80 °C. Na ocasião de sua utilização, foram
descongeladas e diluídas em uma solução de ácido perclórico 0,1 M, EDTA 0,02% e
metabissulfito de sódio 0,02%, para a obtenção das concentrações desejadas.
3.4 Atividades Enzimáticas
3.4.1 Análise radiométrica da atividade da TPH
O método baseia-se na quantificação do [3H]-5-hidroxitriptofano, que é o
produto da reação catalisada pela enzima triptofano hidroxilase (TPH) e que tem como
precursor o [3H]triptofano.
Após os tratamentos, cada glândula foi sonicada em 0,2% de Triton X-100
em tampão fosfato de sódio (2 mM, pH=7, 40 µL). À cada amostra foram acrescentados:
HEPES (0,5 M, pH 7), catalase (1 mg/mL), triptofano (2 mM), ditiotreitol (1 M),
Fe(NH4)2 (SO4)2 (1 mM), 6-MPH4 (6-Metiltetrahidropteridina) (20 mM), de modo a
obter-se, respectivamente, as seguintes concentrações finais: 50 mM, 100 µg/ml, 50 µM,
5 mM, 10 µM, 500 µM; e 1 �l de [3H]triptofano (1 mCi/mL – previamente seco com
nitrogênio). O material foi incubado em banho-maria a 37 °C por 10 minutos. Em
seguida, foi acrescentada uma solução de carvão ativado (7,5% em 1 M HCl, 500 �L) de
modo a interromper a reação. As amostras foram centrifugadas por 2 minutos a 8000 rpm
(2 vezes). 200 µL do sobrenadante foram transferidos para tubos de cintilação. O líquido
de cintilação para amostras aquosas (Optiphase Hisafe-PerkinElmer) foi acrescentado e a
radioatividade foi determinada pela contagem em contador � (Beckman – LS 6500),
incluindo os brancos e totais.
3.4.2 Análise radiométrica da atividade da NAT
O método baseia-se na quantificação da N-[3H] acetiltriptamina que é o
produto da reação da [3H] acetil-coenzima A ([3H] acetil CoA) e da triptamina, como uma
indicação da atividade da enzima N-acetiltransferase. O produto marcado foi extraído em
clorofórmio e medida a radioatividade (DEGUCHI e AXELROD, 1972; modificado por
PARFITT et al., 1975).
Para isso, foram adicionados aos tubos de microcentrífuga, contendo uma
glândula pineal, 25 µl de triptamina (40 mM), 25 µL de [3H] acetilCoA (2 mM, atividade
final= 4 mCi/ mmol) e 50 µL de tampão fosfato de sódio (0,1 M, pH= 6,8), mantidos no
gelo. As glândulas foram sonicadas e incubadas em banho seco a 37 ºC, por 20 minutos.
Em seguida, em cada amostra foi acrescentado 1 mL de clorofórmio saturado com água,
agitado por 1 minuto. Para a separação completa das fases aquosa e lipossolúvel, as
amostras foram centrifugadas por 40 s, a 14000 rpm.
A fase aquosa foi removida e foi acrescentado 200 µL do tampão fosfato.
Novamente as amostras foram agitadas, centrifugadas e a fase aquosa foi removida. 500
µL do clorofórmio contendo o produto da reação (3H-N-acetiltriptamina) foram
transferidos para o tubo de cintilação. Após a evaporação total do clorofórmio contendo o
produto da reação, o líquido de cintilação para amostras não-aquosas (Optiphase Hisafe-
PerkinElmer) foi acrescentado e a radioatividade medida em contador β (Beckman – LS
6500), incluindo os brancos e totais.
3.4.3 Análise radiométrica da atividade da HIOMT
Os substratos utilizados para a avaliação da atividade da enzima HIOMT
foram 14[C]-S-adenosil-L-metionina e N-acetilserotonina. O produto (14[C] melatonina)
foi extraído em clorofórmio e medida a sua radioatividade (RIBELAYGA et al., 1997).
As glândulas pineais foram sonicadas separadamente em tampão fosfato
de sódio (0,05 M, pH=7,9, 50 µL) e, em seguida, acrescentados 150 µL de uma solução
contendo 14C-S-adenosil-L-metionina (atividade 43,8 mCi) e N-acetilserotonina (1 mM).
As glândulas foram incubadas em banho seco por 30 minutos a 37 °C. Após 30 minutos
as amostras foram mantidas no gelo e acrescentados 200 µL de tampão borato de sódio
(12,5 mM, pH=10) e 1 mL de clorofórmio saturado em água, de modo a interromper a
reação. Os tubos foram agitados por 15 s e centrifugados a 13000 rpm (centrifuga
Eppendorf, Mod. 5804R) por 5 minutos a 4 °C. A fase aquosa foi aspirada e dispensada e
novamente acrescentados 200 µL de tampão borato de sódio. Os tubos foram agitados,
centrifugados e novamente retirada a fase aquosa. 600 µL do clorofórmio foram
transferidos para tubos de contagem e, após a total evaporação do clorofórmio, foi
acrescentado o líquido de cintilação para amostras não-aquosas (Optiphase Hisafe-
PerkinElmer) e contada a radioatividade em contador β (Beckman – LS 6500), incluindo
os brancos e totais.
3.5 Extração de RNA e Análise Quantitativa por PCR em Tempo-Real
A extração de RNA e a quantificação das amostras por PCR em tempo-
real (7900 HT Fast Real-Time PCR System, Applied Biosystem, Foster city, CA, USA),
foram realizadas de acordo com os protocolos previamente publicados (BRAY et al.,
2008; YOUNG et al., 2002; GIBSON et al., 1996; CHOMCZYNSKI et al., 1987;
DEPRE et al., 1998). Para a quantificação da expressão dos genes pesquisados por PCR
em tempo-real foram desenhados, especificamente para cada gene analisado, primers e
probes utilizando o programa computacional Primer Express 3.0 (Applied Biosystem,
Foster city, CA, USA) a partir das respectivas seqüências disponibilizadas pelo banco
genômico (GenBank). As seqüências dos primers e probes (Taqman®) para os genes da
tph, nat e hiomt estão descritos na tabela 1 (ver anexos). Padrões de RNA foram
preparados para cada gene pesquisado, pelo uso do método T7 polimerase (Ambiom,
Austin, TX, USA), a partir do RNA total extraído das glândulas pineais; o uso dos
padrões de RNA permite a quantificação absoluta da expressão gênica. Foram preparados
padrões com concentrações conhecidas de RNA (2 pg; 200 fg; 20 fg; 2 fg e 0.2 fg/µl),
proporcionando-se assim a construção de uma curva de calibração, permitindo-se a
quantificação absoluta das amostras. Para a quantificação absoluta das expressões gênicas
foi utilizado o programa computacional SDS 2.2.2 (Applied Biosystem, Foster city, CA,
USA). A correlação entre o Ct (número de ciclos de PCR necessários para alcançar o
limiar de detecção do sinal de fluorescência) e a quantidade dos padrões de RNA foi
linear para todos os padrões preparados. Os resultados das expressões gênicas foram
representados como moléculas de RNAm por ng de RNA total (20 ng RNA total). As
figuras a seguir exemplificam a curva de calibração dos padrões (plaqueados em
duplicatas) e a correlação do número de ciclos e o sinal de fluorescência, assim como o
gráfico da amplificação das amostras (Figuras 13 A e B).
Figura. 13 A. Exemplificação da construção da curva de calibração e da correlação do número de ciclos e o sinal de fluorescência.
Figura. 13 B. Exemplificação do plotter de amplificação das amostras quantificadas correlacionadas com a curva de calibração construída pelos devidos padrões.
3.6 Análise Estatística
Os conteúdos de melatonina (expressos em ng/glândula), as atividades
enzimáticas (expressas em pmol/glândula/h) e os resultados das expressões gênicas
(moléculas/ng RNA total) foram representados como média ± SEM. Para cada bloco
experimental (3 replicatas) foi utilizado o teste ANOVA (Análise de Variância de uma
via), seguido de comparações entre grupos pelo teste de Bonferroni. Quando vários
grupos experimentais foram comparados a um grupo controle foi utilizado o teste de
segunda ordem de Dunnett. O programa utilizado para análise estatística foi o Graphpad
Prism data analysis and graph package (v 4.03, GraphPad Software, Inc., San Diego,
California, USA).
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4 RESULTADOS
4.1 Culturas Padrão da Glândula Pineal
Nos primeiros experimentos, utilizou-se noradrenalina em uma
concentração de 10-6M, como controle positivo, associada a diferentes concentrações de
insulina (10-9M a 10-7M). A figura 14 mostra o efeito da estimulação aguda da síntese de
melatonina induzida pela noradrenalina, com adicional potencialização da síntese pela
insulina. Foram observadas diferenças significativas nas médias dos grupos em
comparações entre o grupo controle (sem estimulação) e o grupo controle positivo (Nor
10-6M; P <0,001), adicionalmente aumentada para o grupo Nor+Ins 10-8M (P <0,01)
versus o grupo controle positivo.
Figura 14. Cultura padrão da glândula pineal. Efeito das diferentes concentrações de insulina sobre a
síntese de melatonina associadas com noradrenalina (10-6M). Na abscissa: grupos experimentais representados como média ± SEM, correlacionados com os valores da ordenada expresso em ng/glândula. One-way ANOVA, Bonferroni’s Multiple Comparison Test. #P < 0,001 vs controle e *P < 0,01 vs Nor 10-6M.
Sob o mesmo protocolo de estimulação referido na figura 14, foi realizado
um novo tratamento das culturas de glândulas pineais, no qual, diferentemente ao
Controle M-6
Nor 10
M-9
Nor+Ins1
0M-8
Nor+Ins1
0M-7
Nor+Ins1
0
0
5
10
15
#
*
Mel
aton
ina
ng/g
lând
ula
experimento mostrado na figura anterior, foram utilizadas várias concentrações de
noradrenalina, de 10-9M a 10-6M, e a concentração de insulina de 10-8M foi mantida fixa.
Analisando a indução da síntese de melatonina, foram obtidas respostas máximas para os
grupos: Ins+Nor 10-6M (P <0,001), seguido do grupo Ins+Nor 10-7M (P <0,05), em
comparações com seus respectivos grupos controles (Nor 10-6M; Nor 10-7M,
respectivamente), mostrando que o efeito da insulina foi observado somente diante da
resposta máxima (9.41 ± 0.63 vs. 13.20 ± 0.80 ng/glândula; P=0.002), uma vez que não
foram caracterizadas diferenças entre as EC50s (6.9 x 10-8 vs 5.5 x 10-8 M; P>0.05)
(Figura 15).
Figura 15. Curva dose-resposta para noradrenalina e noradrenalina+insulina , relacionando as
concentrações com os valores da quantificação da melatonina expressos em ng/glândula, representados como média ± SEM. One-way ANOVA, Bonferroni's Multiple Comparison Test. *P<0,05 vs Nor 10-7M, # P<0,001 vs Nor 10-6M.
4.2 Culturas Temporizadas pela Noradrenalina
Nas culturas temporizadas pela noradrenalina, pode-se observar que o
fator temporização por si provocou um aumento adicional na síntese de melatonina em
comparação com o tratamento noradrenérgico agudo (Nor 10-6M (T) vs Nor 10-6M (A); P
<0,01). O efeito potencializador da insulina também pode ser observado diante da
temporização noradrenérgica, promovendo um efeito similar ao demonstrado nos grupos
3
6
9
12
15
Mel
aton
ina
(ng/
glân
dula
)
10-9 10-8 10-7 10-6
[Noradrenalina] M
Noradrenalina
Noradrenalina +Insulina 10-8M
tratados agudamente (Nor 10-6M (T) + Ins 10-8M vs Nor 10-6M (T); P <0,01) (Figura
16).
Figura 16. Cultura temporizada pela noradrenalina. (A) grupos experimentais estimulados agudamente
pela noradrenalina e noradrenalina associada à insulina. (T) grupos experimentais temporizados pela noradrenalina, associados ou não à insulina. Os valores da quantificação da melatonina estão expressos em ng/glândula, representados como média ± SEM. One-way ANOVA, Bonferroni’s multiple comparisons test, #P< 0.001 vs demais grupos, *P< 0.05 vs Nor 10-6M (A), ***P< 0.01 vs Nor 10-6M (A), **P< 0.001 vs Nor 10-6M (A), +P< 0.01 vs Nor 10-6M (T), @P< 0.05 vs Nor 10-6M (A) + Ins 10-8M.
4.3 Atividades Enzimáticas
As atividades das enzimas-chave envolvidas na síntese da melatonina
foram avaliadas no intuito de revelar suas respectivas participações no processo
biossintético da melatonina, induzida pela noradrenalina de maneira aguda e temporizada,
potencializada ou não pela ação da insulina.
Controle
M (A
)
-6
Nor 10
M-8
M (A) +
Ins 1
0
-6
Nor 10
M (T)
-6
Nor 10
M-8
M (T) +
Ins 1
0
-6
Nor 10
0
5
10
15
20@
#
***
**
*
+M
elat
onin
ang
/glâ
ndul
a
Temporizado Agudo
4.3.1 Atividade da TPH
Nas culturas de glândulas destinadas ao estudo da atividade da TPH, foi
observado um aumento significativo da atividade enzimática diante da estimulação
noradrenérgica aguda associada à insulina (Nor 10-6M (A) + Ins 10-8M vs Nor 10-6M (A);
P< 0,001). Nas culturas temporizadas também se pode observar um aumento na atividade
da TPH, porem somente para o grupo Nor 10-6M (T) (P <0,01). A associação da insulina
no grupo temporizado não alterou o padrão de resposta observado no seu respectivo
controle (Nor 10-6M (T)) (Figura 17).
Figura 17. Análise da atividade da TPH em culturas estimuladas pela noradrenalina de maneira aguda (A) e temporizada (T), avaliando a formação do produto 3H-5 hidroxitriptofano. Valores expressos em pmols/glândula/h, representados como média ± SEM. One-way ANOVA, Bonferroni’s Multiple Comparison Test. *P <0,001 vs Controle; # P < 0,001 vs Nor 10-6M (A); *** P < 0,01 vs Nor 10-6M (A); **P < 0,05 vs Controle.
Controle
M (A)
-6
Nor 10
M-8
M (A) +
Ins 1
0
-6
Nor 10
M (T)
-6
Nor 10
M-8
M (T) +
Ins 1
0
-6
Nor 10
0
50
100
150
200
250
*
**
****
#
Ati
vida
de d
a TP
H3 H
-5 h
idro
xitr
ipto
fano
pmol
/gl/h
Agudo Temporizado
4.3.2 Atividade da NAT
Em relação aos estudos onde a atividade da NAT foi analisada, uma
atividade noradrenalina-dependente foi caracterizada, mostrada pelos grupos: Controle vs
Nor 10-6M (A) e Nor 10-6M (T); P <0,001. Na estimulação noradrenérgica aguda, a
insulina não foi capaz de alterar o padrão de atividade em relação ao seu grupo controle
positivo. Diferentemente, no tratamento temporizado a atividade da NAT demonstrou-se
significativamente alterada (P <0,01), e adicionalmente, essa atividade foi potencializada
pela associação da insulina ao tratamento (Nor 10-6M (T) vs Nor 10-6M (T) + Ins 10-8M;
P< 0,01). (Figura 18).
Figura 18. Análise da atividade da NAT em culturas estimuladas pela noradrenalina de maneira aguda (A)
e temporizadas (T), avaliando a formação do produto N-3H acetiltriptamina. Valores expressos em pmols/glandula/h, representados como média ± SEM. One-way ANOVA, Bonferroni’s Multiple Comparison Test. *P <0,001 vs Controle, **P <0,01 vs Nor 10-6M (T), ***P <0,001 vs Nor 10-6M (T) + Ins 10-8M, @P <0,001 vs NE 10-6M (T), #P <0,01 vs Nor 10-6M (T) + Ins 10-8M.
Controle
M (A)
-6
Nor 10
M-8
M (A) +
Ins 1
0
-6
Nor 10
M (T)
-6
Nor 10
M -8
M (T) +
Ins 1
0
-6
Nor 10
0
1000
2000
3000
*
****#
*** ***@
*
Ati
vida
de d
a N
AT
N-3 H
ace
tilt
ript
amin
apm
ol/g
l/h
Agudo Temporizado
4.3.3 Atividade da HIOMT
Na análise da atividade da HIOMT, apesar de se caracterizar uma
tendência ao aumento da atividade enzimática no tratamento noradrenérgico, não foram
observadas diferenças significativas para os grupos com tratamento agudo e temporizado.
Diante da associação da insulina aos tratamentos, nenhum efeito que levasse à
modificação da atividade da enzima foi observado (Figura 19).
Figura 19. Análise da atividade da HIOMT estimuladas pela noradrenalina de maneira aguda (A) e
temporizada (T), avaliando a formação do produto 14C Melatonina. Valores expressos em pmols/glandula/h, representados como média ± SEM. One-way ANOVA, Bonferroni’s Multiple Comparisons Test.
Controle
M (A)
-6
Nor 10
M-8
M (A)+
Ins 1
0
-6
Nor 10
M (T)
-6
Nor 10
M -8
M (T)+
Ins10
-6
Nor 10
0
150
300
450
Ati
vida
de d
a H
IOM
T14
C M
elat
onin
apm
ol/g
l/h
Agudo Temporizado
4.4 Expressão Gênica por PCR em Tempo-Real
O estudo da expressão gênica, tph, nat e hiomt, mostrou-se necessário para
se esclarecer o possível mecanismo de regulação (em nível transcricional ou pós-
transcricional) induzido pelos tratamentos.
4.4.1 Expressão da tph
Diferentemente do observado na figura 18 (atividade enzimática), o
tratamento insulínico não alterou a expressão da tph em ambos os tratamentos (agudo e
temporizado). Adicionalmente, a temporizarão noradrenérgica não promoveu alterações
no padrão da expressão gênica (Figura 20).
Figura 20. Análise da expressão da tph por PCR em tempo-real. Glândulas estimuladas pela noradrenalina
de maneira aguda (A) e temporizada (T). Valores expressos em moléculas de RNAm/ng de RNA total, representados como média ± SEM. One-way ANOVA, Bonferroni’s Multiple Comparisons Test.
Controle
M (A)
-6
Nor 10
M-8
M (A) +
Ins 1
0
-6
Nor 10
M (T)
-6
Nor 10
M-8
M (T) +
Ins 1
0
-6
Nor 10
0
30000
60000
90000
120000
tph
RN
Am
/ ng
RN
A t
otal Agudo Temporizado
4.4.2 Expressão da nat
Coincidentemente com a atividade da NAT (figura 18), a expressão gênica
também apresentou (como esperado) a regulação noradrenérgica-dependente, observada
na comparação do grupo controle com o grupo controle positivo (Nor 10-6M (A)) e
demais grupos (P <0,001). A adição da insulina aos dois protocolos de estimulação
(agudo e temporizado) não induziu alteração na expressão do gene, o que também foi
observado para o grupo somente temporizado pela noradrenalina (Figura 21).
Figura 21. Análise da expressão da nat por PCR em tempo-real. Glândulas estimuladas pela noradrenalina
de maneira aguda (A) e temporizada (T). Valores expressos em moléculas de RNAm/ng de RNA total, representados como média ± SEM. One-way ANOVA, Bonferroni’s Multiple Comparisons Test. *P <0,001 vs demais grupos.
4.4.3 Expressão da hiomt
De maneira similar à analise da atividade da HIOMT (figura 19), os
tratamentos noradrenérgicos (agudo e temporizado), assim como a adição da insulina aos
Controle
M (A)
-6
Nor 10
M-8
M (A) +
Ins 1
0
-6
Nor 10
M (T)
-6
Nor 10
M-8
M (T) +
Ins 1
0
-6
Nor 10
0
3000
6000
9000 ** **
nat
RN
Am
/ ng
RN
A t
otal
Agudo Temporizado
respectivos tratamentos, não promoveram alterações na expressão da hiomt, com exceção
do grupo Nor 10-6M (T) + Ins 10-8M comparado ao controle (sem estímulo) (Figura
22).
Figura 22. Análise da expressão da hiomt por PCR em tempo-real. Glândulas estimuladas pela noradrenalina de maneira aguda (A) e temporizada (T). Valores expressos em moléculas de RNAm/ng de RNA total, representados como média ± SEM. One-way ANOVA, Bonferroni’s Multiple Comparisons Test. *P <0,05 vs Controle.
Controle
M (A)
-6
Nor 10
M-8
M (A) +
Ins 1
0
-6
Nor 10
M (T)
-6
Nor 10
M-8
M (T) +
Ins 1
0
-6
Nor 10
0
350
700
1050
1400 *hi
omt
RN
Am
/ ng
RN
A t
otal
Agudo Temporizado
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5 DISCUSSÃO
Cultura padrão da glândula pineal
De acordo com resultados previamente descritos (AFECHE et al., 2006;
BARBOSA, 2000), foi utilizada como constituinte dos grupos controles positivos, a
noradrenalina numa concentração de 10-6M, sendo esta uma concentração ideal para a
indução da síntese de melatonina em glândulas pineais cultivadas. Adicionalmente,
construiu-se uma curva dose-resposta para noradrenalina, onde se pode validar o efeito
indutor da noradrenalina como controle positivo nesses experimentos, acordando com os
resultados previamente descritos (Figura 15).
No primeiro bloco experimental, a síntese de melatonina em glândulas
cultivadas foi induzida agudamente pela estimulação noradrenérgica (controle positivo).
No intuito de se testar a hipótese formulada, foram analisados os efeitos de diferentes
concentrações de insulina, associadas ao principal estímulo indutor da síntese da
melatonina (noradrenalina). Pôde-se correlacionar ao efeito indutor noradrenérgico um
aumento significativo no conteúdo de melatonina, diante da associação insulínica na
concentração de 10-8M (Figura 14).
Adicionalmente, a concentração de insulina 5nM foi utilizada no
tratamento de cultura de células primárias (adipócitos), concentração esta que
corresponde à concentração da estimulação máxima do transporte de glicose, além de ser
uma concentração muito próxima da concentração fisiológica, que é da ordem de 10-9M
(ALONSO-VALE et al., 2006).
O fato de que uma concentração maior de insulina do que 10-8M não
promoveu um efeito dose-dependente sobre a síntese de melatonina pode ser justificado
uma vez que concentrações maiores de insulina podem agir não somente em receptores
de insulina, mas também em receptores de IGF do tipo I e II (KAR et al., 1993). Os quais
ocasionalmente já foram caracterizados e descritos como presentes na glândula pineal
(SMITH et al., 1988.; DE KEYSER et al., 1994.; AYER-LE LIEVRE et al., 1991). Dessa
forma, a insulina poderia atuar em um cross talk ou em uma cross-activation, diminuindo
assim a especificidade da sinalização da insulina. Suplementarmente, em experimentos
preliminares, a utilização da insulina no tratamento das culturas de glândulas pineais na
ausência de Nor não promoveu alteração no padrão da indução da síntese da melatonina
em comparação com seu respectivo controle (dado não mostrado).
Complementando a caracterização do papel da insulina na potencialização
da síntese de melatonina nos tratamentos agudos, na figura 15, onde as curvas dose-
resposta para noradrenalina e noradrenalina associada à concentração fixa de insulina (10-
8M) foram construídas, pôde-se evidenciar o efeito potencializador da insulina quando
associada à concentração de noradrenalina de 10-6M, promovendo assim a indução
máxima da síntese de melatonina.
Na tentativa de identificar o possível mecanismo pelo qual a insulina
associada à noradrenalina estaria promovendo a potencialização da síntese da melatonina
em glândulas pineais cultivadas, as análises das atividades das enzimas envolvidas na
síntese da melatonina, assim como os estudos das expressões gênicas foram realizados.
Isso permitiu estabelecer-se o nível de participação do mecanismo recrutado, seja em
nível transcricional e/ou pós-transcricional.
O aumento na síntese de melatonina diante do estimulo noradrenérgico
associado à insulina nos experimentos agudos (Figs. 14 e 15) pode ser justificado uma
vez que a atividade enzimática da TPH foi significativamente aumentada para o grupo de
mesmo tratamento (Figura 17).
Estudos recentes caracterizaram diferentes mecanismos capazes de ativar a
enzima TPH, seja por mecanismo dependente de fosforilação em tirosina, seja por PKA,
e até mesmo via indução da transcrição gênica. Dessa forma, a sinalização da
angiotensina II de maneira tirosina kinase, dependente do receptor AT1, em culturas de
glândulas pineais incubadas com losartan (antagonista do receptor AT1), participa na
ativação da TPH, promovendo uma redução em todos os indóis precursores da
melatonina, mas principalmente do 5-HTP (BALTATU et al., 2002). A ativação da via
tirosina quinase através do receptor AT1 também foi caracterizada por DOAN e
colaboradores (2001).
O aumento da atividade da TPH também foi caracterizado como
dependente da fosforilação por PKA (EHRET et al., 1991; JOHANSEN et al., 1995), e
pela CaMK e/ou PKC (RIBELAYGA et al., 1999). Assim, com a ativação da cascata de
sinalização induzida pela insulina, sabidamente poderia se ter a ativação da PI3-K e PKC
(SALTIEL e KAHN, 2001), levando à possível fosforilação direta da TPH, e à
potencialização da atividade da AC aumentando os níveis de AMPc, com conseqüente
ativação da PKA (KLEIN et al., 1983; SUGDEN e KLEIN, 1988; SUGDEN et al., 1988).
Devido ao fato de que o aminoácido triptofano é pré-requisito na síntese
de serotonina, a insulina poderia estar induzindo a captação de aminoácidos (CYNOBER,
2002), nas glândulas em cultura. Entretanto, estudos previamente publicados
demonstraram que a síntese de serotonina, em cultura de pinealócitos, não é limitada pela
taxa de captação do triptofano (GUTIERREZ et al., 2003).
Alternativamente, apesar da transcrição do gene da TPH poder ser
induzida por ativação da MAP quinase (WOOD e RUSSO, 2001), pudemos observar com
as análises das expressões gênicas que, de forma aguda (Figura 20), o mecanismo
transcricional induzido pela insulina sobre a referida enzima parece não participar na
potencialização da síntese de melatonina em glândulas pineais em cultura, o que é
consistente com os estudos que caracterizaram a atividade da TPH mediada por
mecanismos pós-transcricionais.
Dessa forma, nos experimentos com estimulação aguda, o efeito
potencializador observado pela associação da insulina ao tratamento noradrenérgico
aparentemente não se deveu ao aumento das atividades da NAT e da HIOMT, assim
como o das expressões gênicas (Figuras 18, 19 e 21, 22, respectivamente).
Culturas temporizadas pela noradrenalina
Nas culturas temporizadas pela noradrenalina (10-6M), tentou-se criar um
novo modelo de cultura de glândula pineal que pudesse se assemelhar ao ciclo de
estimulação in vivo. Períodos de 12 h de estimulação foram alternados com períodos de
igual duração, porém não-estimulados (ver materiais e métodos). Esse procedimento por
si foi capaz de induzir um aumento na síntese de melatonina maior do que o observado no
grupo estimulado agudamente. Semelhante ao tratamento agudo, o efeito de
potencialização da síntese da melatonina pela adição da insulina foi observado (Figura
16).
Da mesma forma que tentou-se esclarecer o mecanismo responsável pelo
aumento na síntese de melatonina pela insulina no tratamento agudo, o mesmo foi
averiguado no grupo temporizado, através das análises das expressões e atividades das
enzimas-chave envolvidas na biossíntese da melatonina.
Nas culturas temporizadas pela noradrenalina pode-se observar um
aumento significativo nas atividades das enzimas TPH e NAT. Entretanto, a associação
da insulina promoveu um aumento adicional na atividade da NAT (Figuras 17 e 18).
Novamente o efeito potencializador insulínico foi caracterizado em nível pós-
trancricional, uma vez que as expressões gênicas demonstraram-se inalteradas (Figuras
20- 22).
Assim, os dois modelos de cultura da glândula pineal apresentam
diferenças quanto à resposta da síntese de melatonina, sendo que as glândulas
temporizadas apresentaram uma resposta aumentada em comparação aos controles
positivos, caracterizando e enfatizando a importância do ritmo circadiano fisiológico da
liberação de noradrenalina no interstício da glândula, o qual sabidamente é um dos
principais reguladores da NAT e TPH.
A regulação da transcrição e atividade da NAT vem sendo extensivamente
estudada nos últimos tempos (KLEIN, 2007). Porém, acredita-se que ainda não foram
elucidados todos os processos responsáveis por essa regulação. Um dos processos
envolvidos na estabilização e proteção da NAT contra a proteólise proteassomal é a
interação que ocorre com a proteína 14-3-3, após sua ativação (KLEIN et al., 2002). Em
estudo recente, foi demonstrado que o estímulo insulínico é capaz de promover a
interação da proteína 14-3-3 com o substrato AKT, presente na via de sinalização da
insulina (RAMM et al., 2006). Entretanto, a possibilidade que ainda remanesce a ser
testada é a de que: a interação da proteína 14-3-3/NAT estimulada pela insulina seria a
responsável pelo aumento observado na atividade da NAT?
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6 CONCLUSÕES
Os resultados sugerem uma interação entre noradrenalina e insulina, com a
insulina potencializando a síntese de melatonina induzida pela noradrenalina em
glândulas pineais de ratos em cultura. Esse efeito ocorre aparentemente em nível pós-
transcriscional, uma vez que não foram observadas alterações nas expressões gênicas.
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����� ����� ����� �����
ANEXO A – Tabela 1. Seqüência de primers e probes para tpoh, aanat e hiomt, para análise
quantitativa por PCR em tempo real.
Gene Primer/Probe Sequence
Tpoh
Forward
Reverse
Probe
5’ –GCTGAACCCAGTTTTGCTCA –3’
5’ –TTGCTTGCACAGTCCAAACTC –3’
5’6 –FAM – AAGTAGCACGTTGCCAGTTTCTGAACCG – TAMRA – 3’
Aanat
Forward
Reverse
Probe
5’ –CCACCAGTGCGTTTGAGATT –3’
5’ –GACACAGGGTGAGGAAGTGC –3’
5’ 6 –FAM – AGCGCGAAGCCTTTATCTCAGTCTCG – TAMRA – 3’
Hiomt
Forward
Reverse
Probe
5’ –GGGCAAGACCCAGTGTGAG –3’
5’ –GGGCAAGAATGAAGAGGTCAG –3’
5’6 –FAM –TTTGTCGCTGGTGACTTCTTCCGTTC– TAMRA – 3’
ANEXO B – Figura complementar. Atividade da NAT em culturas de glândulas pineais
temporizadas pela noradrenalina em ciclos de 48 e 72 h.
Figura complementar. Análise da atividade da NAT em culturas estimuladas pela noradrenalina de
maneira aguda (A) e temporizadas (T) por 48 e 72 h, avaliando a formação do produto N-3H acetiltriptamina. Valores expressos em pmols/glândula/h, representados como média ± SEM.
Controle
M (A)
-6
Nor 10
M (T) 4
8h
-6
Nor 10
M (T) 7
2h
-6
Nor 10
0
300
600
900
1200A
tivid
ade
da N
AT
H3 -N
ace
tiltr
ipta
min
apm
ols/
gl/h
ANEXO C – Artigos completos publicados em periódicos I) Publicação da tese
II) Demais artigos publicados durante o doutorado
ANEXO D – Artigo em preparação
Melatonin receptors and circadian clock genes expressions
within cultured rat cardiomyocytes
Rodrigo Antonio Peliciari Garcia1,2, Melissa Moreira Zanquetta2, Molly S. Bray2, José
Cipolla Neto1, Martin E. Young2.
1 University of Sao Paulo, Institute of Biomedical Sciences, Department of Physiology
and Biophysics, Sao Paulo, SP, Brazil.
2 USDA/ARS Children’s Nutrition Research Center (CNRC), Baylor College of
Medicine, Department of Pediatrics, Houston, TX, USA.
Key words: melatonin, circadian clock genes, cardiomyocytes, nuclear receptors, ROR,
RORE.
Running title: Melatonin receptors and clock genes in heart
Address for correspondence:
Martin E. Young, D. Phil.
United States Department of Agriculture/Agricultural Research Service. Children’s
Nutrition Research Center, Baylor College of Medicine, Dept. of Pediatrics, 1100 Bates
St. Suite 5078, Houston, TX, 77030, USA.
Tel. 713-798-7567; Fax 713-798-7101
E-mail: [email protected]
Abstract
The pineal gland hormone melatonin provides the entrainment of various rhythms
to the external light/dark cycle. Recently, cardiovascular studies have demostrated that
melatonin interacts with many physiological processes and diseases as hypertension and
cardiopathologies. Down regulating blood pressure in nocturnal hypertension patients,
melatonin seems to be involved with: protective effects in the heart after infarction,
reduction of ventricular arrhythmias and preservation of capillary perfusion during
ischemia-reperfusion events. Additionally, cardiomyocytes circadian clocks might be
responsible for a great variety of intrinsic cell regulations, controlling contractile
function, metabolism and gene expression. Melatonin receptors (MT1, MT2, and
RZR/ROR) have been reported to be expressed in the heart but whether melatonin affects
and/or alters the pattern of gene expression within the cardiomyocytes, especifically the
circadian clock genes, was not established. Thus, the aim of this study was to evaluate
whether melatonin directly influences circadian clock genes expressions within cultured
rat cardiomyocytes. Adult cardiomyocyte isolation and cultures were performed,
melatonin 1nM and/or ethanol as vehicle were used for all treatments and gene
expressions were assayed by Real-Time PCR. Expression of melatonin receptors mt1,
mt2 and ror� was established within adult rat cardiomyocytes, highlighting the nuclear
receptor ror� expression. Melatonin did not alter the rhythmic expression pattern of
analyzed circadian genes, although avoided the decline in rev-erb� expression keeping its
expression chronically high for 12 hours. Thereby, in adult rat cardiomyocytes, melatonin
seems to exerce its action via nuclear receptor, potentially mediating an important role on
the light signal transduction to peripheral organs as the heart.
INTRODUCTION
The neurohormone melatonin synthesized by the pineal gland exclusively during
the dark period, reflecting the dark phase duration, characterizes a typical circadian and
seasonal rhythmic variation. The retino hypothalamic pathway (RHP), via
suprachiasmatic nuclei (SCN), regulates melatonin synthesis, controlling the
norepinephrine release in the pineal gland perivascular space at night [1], complementally
modulated by peptidergic systems [2-5]. Signalizing period and duration of night to the
body, melatonin provides the entrainment of various rhythms to the ambiental cycles,
including light/dark (LD) [6, 7] and seasonal cycles, for example, entraining the
sleep/awake cycles and reproductive rhythm [8].
The role of melatonin on the regulation of many physiological processes has been
extensively studied. Classically, its effects are well known on the amelioration of some
circadian rhythm disorders found on jet lags, shift workers, as well as on sleep disorders
[9] and on the energy metabolism regulation [6]. Melatonin is also known for its highly
efficient antioxidant capacity, neutralizing and scavenging free radicals, which can cause
serious damage to the cell, including nuclear DNA damage [10, 11]. In addition,
melatonin is used as an efficient anticarcinogenic molecule, exerting an important role on
tumors treatment and prevention [12-14].
With regard to melatonin’s action on the cardiovascular regulation, some
researches have shown a reduction on nocturnal blood pressure in nocturnal hypertension
patients treated with melatonin [15, 16]. Melatonin also participates in the reduction of
ventricular arrhythmias and preserves capillary perfusion during ischemia-reperfusion
events in cardiomyopathic hamsters [17], and seems to be involved with protective
effects in the heart after infarction [18].
Several cell surfaces receptors are utilized by melatonin, which are divided in two
classes: G-protein coupled melatonin receptors MT1 and MT2, and MT3 melatonin
receptor, a quinone reductase type II enzyme family [19]. In addition, melatonin can bind
directly to the nuclear receptor RZR/ROR (retinoic acid receptor-related orphan receptor)
family, which is comprised of three family members: �, � and � [20- 22]. Melatonin
receptors are expressed in the central nervous system, including SCN, and in peripheral
tissues [20, 23].
The SCN, located in the ventral anterior hypothalamic region, is entrained by the
LD cycle via RHP [24], and possesses the central oscillatory machinery (biological
clocks) where the so called clock genes, such as bmal1 (brain and arylhydrocarbon
receptor nuclear translocator (arnt)-like protein 1), clock; per (period), cry
(cryptochrome) and rev-erb� (reverse strand of the c-erb� gene), are rhythmically
expressed and auto-regulated by a transcriptional and translational positive and negative
feedback loops. CLOCK and BMAL1 proteins heterodimerize and form a complex that
activates rhythmic transcription of various clock controlled genes, including clock
component genes itselves, as bmal1. PER and CRY, once synthesized, inhibit
CLOCK:BMAL1 complex with additional participation of REV-ERB� [25- 29]. It is well
known that this molecular clockwork is much more complex, involving a great number of
molecular factors, new players and processes that affects the function of the clock [30].
Clock genes were also characterized in almost all peripheral tissues (e. g. heart,
adipose tissue, muscle cells) and in central structures outside the SCN [29, 31-33]. The
circadian clock genes expression is not only auto-regulated by feedback loops. Their
expression also can be driven and/or modulated by neurohumoral factors, such as: 1)
norepinephrine, which influences the timing of the circadian clock within the
cardiomyocytes in culture [34], and induces per1 expression (but not circadian
expression) with no effect on per2 expression in rat pineal gland cultures [35]; 2)
angiotensin II, that acts as a zeitgeber (timekeeper) to the circadian clock within vascular
smooth muscle cells [36]. Furthermore, in rats, circadian genes participate in the
stablishment of some behavioral rhythms controlled by other central structures outside
SCN, for example, locomotor activity rhythm, driven by caudade and putamen nuclei
with per1, per2 and bmal1 involvement [32], and feeding rhythm, with dorsomedial
hypothalamic nucleus participation in per oscillatory expression under restricted feeding
[37].
It has been shown that nuclear receptors as RZR/ROR, when activated by its
ligands, bind to RORE (retinoic acid receptor–related orphan receptor response element)
in E-box sequences, activating transcriptional processes. In the rat SCN, melatonin phase-
advances the rev-erb� mRNA expression rhythm and phase-shifts the bmal1 mRNA
expression [38]. Additionally, bmal1 mRNA rhythmic expression can be driven by ROR�
and REV-ERB� competing for the same promoter element (RORE) [39]. Melatonin
induces cry1 mRNA expression; acutely inhibits mt1 expression; advances the timing of
rev-erb� expression peak and modulates per1 expression in the pars tuberalis of Siberian
hamster [40]. The cry1 expression melatonin-induced, was also demonstrated in the rat
pars tuberalis [41].
The intrinsic regulation of gene expressions within the cardiomyocytes have been
extensively studied [29, 33, 34, 42, 43], in an attempt to clarify the knowledge of
molecular mechanisms controlling the daily variations in the circadian clock expressions
within the heart, and conseqüently, to help to understand cardiovascular diseases and the
repercussion of many pathophysiological states, like diabetes, obesity and sleep
disorders, on the cardiovascular system.
Although the expression of melatonin receptors (MT1, MT2, and RZR/ROR) in
peripheral organs has been reported by many authors [18, 22, 44], cell type expressing
receptors and whether melatonin directly affects and/or alters the pattern of gene
expression within cultured rat cardiomyocytes were not identified and established yet.
Thus, the aim of this study was to demonstrate whether melatonin directly influence
circadian gene expression in cultured rat cardiomyocytes.
MATERIAL AND METHODS
Animals
Male Wistar rats (150-175g) were housed in the animal facility of the Children’s
Nutrition Research Center, Baylor College of Medicine, Houston, TX, and kept under a
12 h: 12 h light/dark cycle (lights on at 06:00AM), in a temperature controlled room
(23±1 oC), with food and water ad libitum at least 10 days before the sacrifice. Ethics
approval was granted by the Institutional Animal Care and Use Committee (AN-4049).
Adult Rat Cardiomyocyte Isolation and Culture
Cardiomyocytes were isolated and cultured in L-glutamine-free DMEM (Sigma
Biochemical CO, St. Louis, MO, USA) with 4500mg glucose/l, supplemented as
described previously [34]. Before all treatments, cardiomyocytes were cultured for 24
hours (2 hours in a 5% FBS (Fetal Bovine Serum, Invitrogen CO, Carlsbad, California,
USA) labeled plating medium + 22 hours in a medium without FBS, labeled
equilibration medium), incubated at 37 oC, 95% O2, 5% CO2. All media were pre-
warmed to 37 °C, 95% O2, 5% CO2, for at least 2 hours before utilization (culture flasks
– Corning Inc, Lowell, MA, USA). Additionally, all media changes were performed on a
37 °C pre-heated gel pad within a biological safety cabinet.
Treatments
To promote the activation of gene rhythmic expressions, a serum shock (50% of FBS -
challenge medium) was applied exclusively during the first 2 hours (starting at time 0).
At the end of serum shock, the medium was changed for a post-challenge medium,
constituted of 2.5% of FBS [34] (except for the experiment 2), followed by the
treatments. Two kinds of treatments using melatonin (Sigma Biochemical CO, St. Louis,
MO, USA) at 1nM and vehicle (ethanol) as control were performed: 1) melatonin/vehicle
were applied after the serum shock for a 2 hours period. After this treatment period, the
media were changed (no treatment) (Fig. 3 A); 2) 14 h after the serum shock (time 16)
melatonin/vehicle were applied in the cardiomyocytes cultures (Fig. 4 A). In both kinds
of experiments the cells were kept in culture for 40 hours. 750 µl of Tri-Reagent
(Molecular Research Center, Inc. Cincinnati, OH, USA) per well was used for all
terminating cell time points (arrows), as depicted in figures 2 - 4. All samples were stored
and kept at -80 °C until subsequent analysis.
RNA extraction and quantitative RT-PCR
RNA extraction and quantitative RT-PCR were performed by using methods described
previously [43, 45, 46]. Specific quantitative assays were designed from rat sequences
available in the GenBank, for two core circadian clock genes bmal1 and rev-erb� and for
one circadian clock regulated gene dbp (albumin D-element binding protein); primers and
probes sequences for these Taqman assays have been published previously [33, 47] with
melatonin’s receptor genes exceptions. Taqman assays for rat mt1, mt2 and ror� are
presented in table 1. Standard RNA was made for all assays by the T7 polymerase
method (Ambion, Austin, Texas, USA), using total RNA isolated from rat hearts; the use
of standard RNA allows absolute quantification of gene expression. The correlation
between the Ct (the number of PCR cycles required for the fluorescent signal to reach a
detection threshold) and the amount of standard was linear over at least a 5-log range of
RNA for all assays (data not shown). Gene expression data are represented as mRNA
molecules per ng total RNA.
RESULTS
Isolated rat cardiomyocytes, without any stimulation and/or treatment, were kept
for a 24 hours period under culture condition. Three types of melatonin receptors, mt1,
mt2 and ror� were amplified within the cardiomyocytes. The nuclear receptor ror� has
shown the higher expression compared to the membrane receptors (Fig. 1).
As ror� expression was observed in cardiomyocytes, a circadian protocol was
tested on an activated transcriptional mechanism by the use of 50% serum shock (Fig. 2
A), to identify whether ror� expression could present a rhythmic pattern. �-actin did not
show rhythmic expression after serum shock, and then was used as negative control (Fig.
2 B). Rhythmic inductions of bmal1, rev-erb� and dbp were characterized and used as
positive controls (Figs. 2 C-E), proving the success of the circadian induced model.
Although the oscillations showed during the 38 hours period after serum shock, the
expression of ror� did not demonstrate an intrinsic rhythmic pattern, as can be seen on
figure 2 F.
Once melatonin’s receptors expression were stablished, the possible role of
melatonin affecting the pattern of circadian gene expression on an activated clockwork
machinery due to serum shock within the cardiomyocytes, was investigated (Fig. 3 A).
Melatonin did not alter or influence circadian gene expressions of bmal1, rev-erb� and
dbp, as well as the timing of the phase of these investigated genes (Fig. 3 B-D). In fact,
the treatment with only melatonin (without serum shock) was unable to promote
alterations and/or trigger rhythmic transcription of the same genes within the
cardiomyocytes (data not shown).
Another type of treatment with melatonin was made (Fig. 4 A), despite
melatonin’s first treatment did not influence the expression pattern of the analyzed genes
(as demonstrated on Fig. 3). 16 hours after the initial culture time, the presence of
melatonin in the media avoided the decline on rev-erb� expression for 12 consecutive
hours, changing the pattern of gene expression (Fig. 4 B). Circadian expressions of bmal1
and dbp can be seen in figures 4 C and 4 D. No differences were shown with melatonin’s
treatment in both genes.
DISCUSSION
Many researches have shown the importance of melatonin and its interaction with
the cardiovascular system, demonstrating important effects as reductions of blood
pressure [15, 16] and ventricular arrhythmias [17], and its protective effects after heart
infarction [18]. Thus, melatonin could be acting via its membrane and nuclear receptors
in the heart. The expression of melatonin receptors was already characterized within rat
and mouse hearts by many authors [18, 22, 44]. In this study, the cell type expression was
also demonstrated within rat cardiomyocytes, the main functional cell type within the
heart. Of all melatonin receptors analyzed, the nuclear receptor ror� was highly
expressed, while membrane receptors mt1 and mt2 have shown a basal expression. In
cardiomyocytes, ror� seems to be the most relevant melatonin receptor, considering that
expression of other subtypes of melatonin receptors such as ROR�, seems to be
characterized especially within SCN [48, 49].
The question whether melatonin could act as a zeitgeber has been extensivelly
investigated. Considering the presence of melatonin receptors in the SCN and in
peripheral tissues, which permits the action of melatonin in the circadian clock
mechanism, Masson-Pévet (2007) [50] suggested that REV-ERB� could be linking the
physiological effect exerted by melatonin and the circadian clock component genes
functioning. In the rat SCN, melatonin treatment mainly affects bmal1, rev-erb� and
partially prevents the decrease of ror� mRNA expression [38]. In the Siberian hamster
pars tuberalis, melatonin induces cry1, inhibits mt1, alters the timing of rev-erb� and
modulates per1 mRNA expressions [40]. Melatonin also affects the expression of cry1 in
the rat pars tuberalis [41].
Within the cardiomyocytes, the presence of melatonin for a short period of time in
the media did not promote any significant alterations on the expression of analyzed
circadian genes, in spite of the fact that nuclear receptor ror� was highly expressed, and
has an important effect on the modulation of clock machinery. ROR� induces bmal1
expression via its RORE, while REV-ERB� inhibits bmal1 expression, thus competing to
the same RORE [39, 51- 53]. In the present case a similar effect was not shown.
However, based on rev-erb� rhythmic expression (peaking between time 8 and 16),
clearly demonstrated on figure 4, the presence of melatonin (added to media 16 hours
after the culture initial time) for a long period of time kept rev-erb� expression
chronically high for a 12 hours period, attenuating its oscillations. Melatonin avoided the
decline on rev-erb� expression when its peak was declining, by stimulating its
expression. These results are consistent with data presented by AGEZ et al. (2007) [38],
that shown in the rat suprachiasmatic nuclei melatonin affected rev-erb� expression with
no participation of ror�, although in the present study the phase-advance on rev-erb�
within the cardiomyocytes was not observed.
The action of melatonin on SCN circadian clock was shown to be preferentially
post-translational, considering that in rodents clock genes transcription are not affected
by an injection of melatonin on the first circadian night, but it changes some patterns of
clock genes expression on the second night [54]. These data could explain the unchanged
gene expressions of bmal1and dbp with the presence of melatonin, suggesting that
melatonin’s action in the circadian system of the cardiomyocytes may involve not only
transcriptional but also post-translational mechanisms and should be studied further.
Bray et al. (2008) [55] by the use of a cardiomyocyte-specific circadian clock
mutant mice, have demonstrated that cardiomyocyte circadian clock influences
myocardial contractile function, metabolism, and gene expression. And as demonstrated
in this study, melatonin affecting rev-erb� expression could additionally modulate the
functional, metabolic and gene expressions alterations, primarily driven by the circadian
clock within cardiomyocytes.
In summary, the expression of melatonin receptors mt1, mt2 and ror� was
established within adult rat cardiomyocytes, highlighting the nuclear receptor ror�
expression. Melatonin did not alter the rhythmic expression pattern of analyzed circadian
genes. However, melatonin delivered at proper time in the cardiomyocytes culture,
avoided the decline in rev-erb� expression, keeping its expression chronically high for a
12 hours period. Based on the above mentioned facts it is possible to speculate that
melatonin, in adult rat cardiomyocytes, might be exerting its action via nuclear receptor,
potentially mediating an important role on the light signal transduction to peripheral
organs as the heart.
ACKNOWLEDGEMENTS
Supported by FAPESP grant 04/06767-2, CNPq (RAPG scholarship 202127/20060),
(MMZ 200166/20069), and by the National Heart, Lung, and Blood Institute grant (MEY
HL074259).
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Table 1. Primer and probe sequences for rat mt1, mt2 and ror�, real-time quantitative RT-PCR assays
Gene Primers/Probe Sequence
mt1
Forward
Reverse
Probe
5’ –CCTCTACACTGGCCTTCATCC –3’
5’ –CGAGGTCTGCCACAGCTAAA –3’
5’ 6–FAM – ATATTCCCTGCGTTCCTGAGCTTCTTGTTG – TAMRA – 3’
mt2
Forward
Reverse
Probe
5’ –TCCTCTCGGTGCTCAGGAAC–3’
5’ –AGGTCAGCCAAGGCCAGATT–3’
5’ 6–FAM – ACCACAAATAAATTACCTGCGTTCCGCAG – TAMRA – 3’
Ror�
Forward
Reverse
Probe
5’ –CAGGCAGAGCTATGCGAGC –3’
5’ –TCCACAGATCTTGCATGGAAT –3’
5’ 6–FAM –CCAGCCGAGGTATCTCAGTCACGAAGAA – TAMRA – 3’
Legends
Figure 1. Rat cardiomyocytes culture. Melatonin receptors mt1, mt2 and ror� mRNA
expression. Cardiomyocytes were kept in culture for 24 hours, no treatment and/or serum
shock. One-way ANOVA, Bonferroni’s Multiple Comparison Test. *P< 0.001 vs mt1
and mt2.
Figure 2. Rat cardiomyocytes culture. (A) Experimental protocol representation. After 24
hours of equilibration period, a serum shock (50% of FBS - challenge medium), was
applied exclusively during the first 2 hours (time 0-2). At the end of serum shock the
medium was changed for a post-challenge medium, constituted of 2.5% of FBS. The
arrows represent all collecting time points (hours). (B) �-actin mRNA expression
(negative control). (C, D and E) mRNA rhythmic expressions of bmal1, rev-erb� and
dbp, respectivelly (positive controls). (F) ror� mRNA expression. mRNA expressions
values were expressed in mRNA/ng total RNA, plotted as means ± SEM.
Figure 3. Rat cardiomyocytes culture. (A) Experimental protocol representation. After 24
hours of equilibration period, a serum shock (50% of FBS - challenge medium), was
applied exclusively during the first 2 hours (time 0-2). At the end of serum shock the
medium was changed for a post-challenge medium, constituted of 2.5% of FBS, and
melatonin 1 nM and/or vehicle were added to the cultures for a 2 hours period (time 2-4).
The arrows represent all collecting time points (hours). (B, C and D) mRNA rhythmic
expressions of bmal1, rev-erb� and dbp, respectivelly, normalized by �-actin. Values
were expressed in mRNA/ng total RNA, represented in arbitrary units, plotted as means ±
SEM.
Figure 4. Rat cardiomyocytes culture. (A) Experimental protocol representation. After 24
hours of equilibration period, a serum shock (50% of FBS - challenge medium), was
applied exclusively during the first 2 hours (time 0-2). 14 hours after the serum shock
(time 16), melatonin (1nM) and/or vehicle were added to the cultures and kept until the
end of the experiments. The arrows represent all collecting time points (hours). (B, C and
D) mRNA rhythmic expressions of bmal1, rev-erb� and dbp, respectivelly, normalized
by �-actin. Values were expressed in mRNA/ng total RNA, represented in arbitrary units,
plotted as means ± SEM. *P < 0.05.
0
250
500
750
rorαααα mt1 mt2
*
mR
NA
/ng
Tota
l RN
A
FIGURE 1FIGURE 1
40
Time (hours)
Plating
Equilibration
2 h
24 h50% Serum shock
2.5% Serum
0 2 4 8 12 16 20 24 28 32 36
A40
Time (hours)
Plating
Equilibration
2 h
24 h50% Serum shock
2.5% Serum
0 2 4 8 12 16 20 24 28 32 36
A
0
20000
40000
60000
�-a
ctin
mR
NA
/ng
tota
l RN
A
4 8 12 16 20 24 28 32 36 402Time (hours)
B
0
20000
40000
60000
�-a
ctin
mR
NA
/ng
tota
l RN
A
4 8 12 16 20 24 28 32 36 402Time (hours)
4 8 12 16 20 24 28 32 36 402Time (hours)
B
0
2000
4000
6000
bmal
1m
RN
A/n
g to
tal R
NA
4 8 12 16 20 24 28 32 36 402
Time (hours)
C
0
2000
4000
6000
bmal
1m
RN
A/n
g to
tal R
NA
4 8 12 16 20 24 28 32 36 402
Time (hours)4 8 12 16 20 24 28 32 36 402
Time (hours)
C
8000
4 8 12 16 20 24 28 32 36 402
Time (hours)
0
2000
4000
6000
rev-
erb�
mR
NA
/ng
tota
l RN
A
D
8000
4 8 12 16 20 24 28 32 36 402
Time (hours)
0
2000
4000
6000
rev-
erb�
mR
NA
/ng
tota
l RN
A
D
0
2000
4000
6000
8000
dbp
mR
NA
/ng
tota
l RN
A4 8 12 16 20 24 28 32 36 402
Time (hours)
E
0
2000
4000
6000
8000
dbp
mR
NA
/ng
tota
l RN
A4 8 12 16 20 24 28 32 36 402
Time (hours)4 8 12 16 20 24 28 32 36 402
Time (hours)
E
1600
0
400
800
1200
ror�
mR
NA
/ng
tota
l RN
A
4 8 12 16 20 24 28 32 36 402
Time (hours)
F
1600
0
400
800
1200
ror�
mR
NA
/ng
tota
l RN
A
4 8 12 16 20 24 28 32 36 402
Time (hours)4 8 12 16 20 24 28 32 36 402
Time (hours)
F
FIGURE 2FIGURE 2
FIGURE 3FIGURE 3
40
Time (hours)
Plating
Equilibration
2 h
24 h
50% Serum shock
2.5% Serum
0 2 4 8 12 16 20 24 28 32 36
A
Melatonin/Vehicle
40
Time (hours)
Plating
Equilibration
2 h
24 h
50% Serum shock
2.5% Serum
0 2 4 8 12 16 20 24 28 32 36
A
Melatonin/VehicleA
rbitr
ary
units
bmal
1/�
-act
in(m
RN
A/n
g to
tal R
NA
)
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
Time (hours)
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
Melatonin
Vehicle
2
B
Arb
itrar
y un
itsbm
al1/�
-act
in(m
RN
A/n
g to
tal R
NA
)
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
Time (hours)
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
Melatonin
Vehicle
2
B
C
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
Time (hours)
Melatonin
Vehicle
2
Arb
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y un
itsre
v-er
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RN
A/n
g to
tal R
NA
)
C
0
0.1
0.2
0.3
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0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
Time (hours)
Melatonin
Vehicle
2
Arb
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y un
itsre
v-er
b�/�
-act
in(m
RN
A/n
g to
tal R
NA
)
D
0
0.01
0.02
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0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
Time (hours)
Melatonin
Vehicle
2
Arb
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y un
itsdb
p/�
-act
in(m
RN
A/n
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tal R
NA
)
D
0
0.01
0.02
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0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
Time (hours)
Melatonin
Vehicle
2
Arb
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y un
itsdb
p/�
-act
in(m
RN
A/n
g to
tal R
NA
)
FIGURE 4FIGURE 4
A40
Time (hours)
Plating
Equilibration
2 h
24 h50% Serum shock
0 2 4 8 12 16 20 24 28 32 36
Melatonin/Vehicle
A40
Time (hours)
Plating
Equilibration
2 h
24 h50% Serum shock
0 2 4 8 12 16 20 24 28 32 36
Melatonin/Vehicle
*
B
0
0.2
0.4
0.6
0.8
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
Time (hours)
Vehicle
Melatonin
2
*
**
Arb
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v-er
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-act
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RN
A/n
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RN
A) 12 h12 h *
B
0
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0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
Time (hours)
Vehicle
Melatonin
2
*
**
Arb
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y un
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v-er
b�/�
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RN
A/n
g to
tal
RN
A) 12 h12 h
B
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0.4
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0.8
0
0.2
0.4
0.6
0.8
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
Time (hours)
Vehicle
Melatonin
2
*
**
Arb
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RN
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0
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Vehicle
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2
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C
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g to
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Vehicle
Melatonin
2
Time (hours)
D
0
0.050.1
0.150.2
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D
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Vehicle
MelatoninArb
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y un
itsbm
al1/
�-a
ctin
(mR
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/ng
tota
l RN
A)
Time (hours)