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1
Cardosina ACardosina A Estrutura terciáriaEstrutura terciária
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2
Precursor Intermediário Cardosina Amadura Modelo proposto para o processamento proteolítico da Cardosina A. Os locais de clivagem Pro/cadeia de 31 KDa, cadeia de 31 KDa/PSI e PSI/cadeia de 15 KDa estão assinalados com setas.
Pro 31 KDa 15 KDaPSI
RGTVRDSGSA HAIGANGVMNQQ
EHLSTSSEE
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3
Cardosina ACardosina A Estrutura secundáriaEstrutura secundária
Cadeia de 15 KDaCadeia de 15 KDa
Cadeia de 31 KDaCadeia de 31 KDa
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4
Extracção e purificação de cardosinas a partir dos Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de pistilos de Cynara cardunculus Cynara cardunculus L.L.
Tampão citrato de Tampão citrato de sódio 100 mM, pH 3,5sódio 100 mM, pH 3,5
1 Passo. Extracção Acídica1 Passo. Extracção Acídica
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5
Separação baseada em Separação baseada em propriedades dos propriedades dos
compostoscompostosExclusão MolecularExclusão Molecular
Detector UVDetector UV
MBarros
Direcção do fluxoDirecção do fluxo
Solvente Solvente
Proteínas fraccionadasProteínas fraccionadas
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6
2 Passo. Cromatografia de Exclusão 2 Passo. Cromatografia de Exclusão MolecularMolecular
Coluna: Superdex G75Eluente: Tampão Tris 25 mM, pH
7,6
-200
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
0 50 100 150 200
Tempo de retenção (min)
Abs
orvâ
ncia
a 2
80 n
m (
mA
U)
Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara Cynara cardunculus cardunculus L.L.
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7MBarros
Separação baseada em Separação baseada em propriedades dos compostospropriedades dos compostos
Detector UVDetector UV
Cromatografia de Troca IónicaCromatografia de Troca Iónica
++
++
--++ --
TampãoTampãoBB
TampãoTampãoAA
BombasBombasA e BA e B
Aplicaçãoda amostra
Mistura Mistura dede
proteínaproteínass
Proteínas Proteínas carregadas + são carregadas + são eluídas primeiroeluídas primeiro
Coluna Coluna de DEAEde DEAE
ResinaResina
Proteína Proteína ++
Proteína Proteína --
Gradiente linear de Gradiente linear de salsal
Fo
rça
ión
i ca
Fo
rça
ión
i ca
Mistura Mistura dede
proteínaproteínass
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8
Coluna: Q Sepharose (trocador aniónico forte DEAE)
Eluentes: Tampão Tris 25 mM, pH 7,6 Eluentes: Tampão Tris 25 mM, pH 7,6
Gradiente crescente de 1M Gradiente crescente de 1M NaClNaCl
-100
0
100
200
300
400
500
600
700
0 20 40 60 80 100 120
Tempo de retenção (min)
Abs
orvâ
ncia
a 2
80 n
m (m
AU
)
Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara Cynara cardunculus cardunculus L.L.
3 Passo. Cromatografia de troca iónica3 Passo. Cromatografia de troca iónica
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9
31 KDa
15 KDa
34 KDa
14 KDa
A0
5. Controlo de Pureza das Cardosinas5. Controlo de Pureza das Cardosinas
Para o controlo de
pureza das amostras
de cardosinas
recorre-se a
electroforese vertical
em gel de
poliacrilamida, em
condições
desnaturantes (SDS-
PAGE).
Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara Cynara cardunculus cardunculus L.L.
Após Q Sepharose (trocador aniónico forte DEAE)
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10
As amostras de cardosinas A0, A e B recolhidas na cromatografia de troca iónica são sujeitas a uma nova cromatografia de exclusão molecular numa coluna Desalting G25, com o objectivo de remover o sal.
4 Passo. Desalting – eliminar o sal das 4 Passo. Desalting – eliminar o sal das amostras da cromatografia anterioramostras da cromatografia anterior
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 2 4 6 8 10
Tempo de retenção (min)
Abs
orvâ
ncia
a 2
80
nm
(m
AU
)
Coluna: Sephadex G25Eluente: Água Mili_Q (água ultra
pura)
Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara Cynara cardunculus cardunculus L.L.
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11
Coluna: Mono Q (trocador aniónico)
Eluentes: Tampão Tris 25 mM, pH 7,6
Gradiente crescente de 1 M NaCl
-100
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo de retenção (min)
Abs
orvâ
ncia
a 2
80 n
m (m
AU
)
Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara Cynara cardunculus cardunculus L.L.
A amostra de cardosina B necessita de ser submetida a uma nova cromatografia de troca iónica numa coluna de maior resolução, a fim de remover a maior parte da cardosina A que contamina a amostra obtida na primeira troca iónica.
6 Passo. Recromatografia de troca 6 Passo. Recromatografia de troca iónica da amostra de cardosina Biónica da amostra de cardosina B
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12
ResumoResumo
• A cromatografia liquida separa as proteínas, ácidos nucleicos A cromatografia liquida separa as proteínas, ácidos nucleicos
e outras moléculas de acordo com a sua massa, carga ou e outras moléculas de acordo com a sua massa, carga ou
afinidade por determinados ligandosafinidade por determinados ligandos
• Baseia-se no princípio de que moléculas dissolvidas numa Baseia-se no princípio de que moléculas dissolvidas numa
solução podem interagir (ligar e dissociar-se) com uma solução podem interagir (ligar e dissociar-se) com uma
superfície sólida.superfície sólida.• A cromatografia líquida é realizada numa coluna que contém A cromatografia líquida é realizada numa coluna que contém
um gel constituído por esferas.um gel constituído por esferas.• A natureza das esferas determina o tipo de separação A natureza das esferas determina o tipo de separação
realizado. De acordo com:realizado. De acordo com:• - a massa, cromatografia de exclusão molecular- a massa, cromatografia de exclusão molecular• - a carga, cromatografia de troca iónica- a carga, cromatografia de troca iónica• - a afinidade, cromatografia de afinidade- a afinidade, cromatografia de afinidade
ResumoResumo
• A cromatografia liquida separa as proteínas, ácidos nucleicos A cromatografia liquida separa as proteínas, ácidos nucleicos
e outras moléculas de acordo com a sua massa, carga ou e outras moléculas de acordo com a sua massa, carga ou
afinidade por determinados ligandosafinidade por determinados ligandos
• Baseia-se no princípio de que moléculas dissolvidas numa Baseia-se no princípio de que moléculas dissolvidas numa
solução podem interagir (ligar e dissociar-se) com uma solução podem interagir (ligar e dissociar-se) com uma
superfície sólida.superfície sólida.• A cromatografia líquida é realizada numa coluna que contém A cromatografia líquida é realizada numa coluna que contém
um gel constituído por esferas.um gel constituído por esferas.• A natureza das esferas determina o tipo de separação A natureza das esferas determina o tipo de separação
realizado. De acordo com:realizado. De acordo com:• - a massa, cromatografia de exclusão molecular- a massa, cromatografia de exclusão molecular• - a carga, cromatografia de troca iónica- a carga, cromatografia de troca iónica• - a afinidade, cromatografia de afinidade- a afinidade, cromatografia de afinidade MBarros