DOSEAMENTO DE COLESTEROL TOTAL E FRAÇÕES

Objetivos:

Determinar as concentrações plasmáticas de colesterol total e frações.

O colesterol é encontrado em todas as células do organismo, sendo um dos principais

componentes das membranas plasmáticas. No sangue o colesterol é transportado associado às

proteínas e outros lipídeos, formando complexos denominados lipoproteínas. A utilidade

clínica da determinação do colesterol consiste na avaliação do risco de doenças coronarianas

isquêmicas e de hiperlipidemias.

1. Determinação de colesterol total:

esterase

ésteres de colesterol colesterol + ácidos graxos oxidase

colesterol + O2 colestenona + H2O2 peroxidase

H2O2 + fenol + 4-aminoantipirina antipirilquinonimina + 4H2O

1.1 Material necessário por bancada:

Estante para tubos de ensaio

4 tubos de ensaio

Pipetas automáticas para 1,0 mL e 10 µL

Ponteiras

Reagente 1 (contém tampão pH 7,0, fenol, 4-aminoantipirina, colesterol esterase, colesterol

oxidase e peroxidase)

Solução padrão de colesterol na concentração de 200 mg dL-1

Espectrofotômetro

1.2 Procedimento Identificar 3 tubos de ensaio como B (branco), P (padrão) e A (amostra) e pipetar:

B P A

Amostra -- -- 0,01 mL

Padrão de colesterol -- 0,01 mL --

Reagente 1 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

Misturar bem e colocar em banho-maria a 37°C durante 10 minutos.

Determinar as absorbâncias em 500 nm, acertando o zero do aparelho com o branco.

A cor é estável por 60 minutos.

1.3 Cálculo:

Colesterol (mg/dL) = Absorbância amostra x concentração do padrão

Absorbância do padrão

1.3 Valores de referência: Desejável: <200 mg dL

-1

Limiar elevado: 200-239 mg dL-1

Elevado: > 240 mg dL-1

.

2. Determinação de colesterol HDL

Técnica baseada na precipitação das lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL) e as

lipoproteínas de baixa densidade (LDL). Após centrifugação o colesterol ligado às

lipoproteínas de alta densidade (HDL) é determinado no sobrenadante através após ação da

esterase e oxidase, como ocorre na determinação do colesterol total.

2.1 Material necessário por bancada:

Estante para tubos de ensaio

4 tubos de ensaio

Pipetas automáticas para 1,0 mL e 10 µL

Ponteiras

Reagente precipitante (1,5 mmol/L de ácido fosfotúngstico e 54 mmol/L cloreto de magnésio)

Reagente 1 (contém tampão pH 7,0, fenol, 4-aminoantipirina, colesterol esterase, colesterol

oxidase e peroxidase)

Solução padrão de colesterol na concentração de 20 mg dL-1

Centrífuga

Agitador de tubos

Espectrofotômetro

2.2 Procedimento

1. Em um tubo de centrífuga pipetar 0,250 mL do soro e 0,250 mL do precipitante.

2. Agitar vigorosamente durante 30 segundos. A agitação é fundamental para a obtenção de

resultados consistentes.

3. Centrifugar a 3.500 rpm por pelo menos 15 minutos para obter um sobrenadante límpido.

4. Pipetar o sobrenadante límpido imediatamente após a centrifugação, tomando o cuidado

para não ressuspender o precipitado, a fim de evitar resultados falsamente elevados.

5. Identificar 3 tubos de ensaio como B (branco), P (padrão) e A (amostra) e pipetar:

6. Misturar e colocar no banho-maria a 37°C durante 10 minutos.

7. Ler as absorbâncias do Teste e do Padrão em 500 nm, acertando o zero com o Branco.

2.3 Cálculo

HDL colesterol (mg dL-1

) = absorbância do Teste x 20 X 2

absorbância do Padrão

O valor 2 é utilizado para considerar a diluição da amostra (1:1) no momento da precipitação

2.4 Valores de referência: Baixo: < 40 mg dL

-1

Desejável > 60 mg dL-1

.

B A P

Sobrenadante -- 0,10 mL --

Padrão HDL

colesterol

-- -- 0,10 mL

Reagente 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL