doenca de chagas e açaí

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE BIOLOGIA

RODRIGO LABELLO BARBOSA

TRANSMISSO ORAL DO Trypanosoma cruzi PELA POLPA DE AA EM CAMUNDONGOS

Dissertao apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas para obteno do ttulo de Mestre em Parasitologia.

Orientadora: Profa. Dra. ANA MARIA APARECIDA GUARALDO

Campinas/SP 2010 i

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LOCAL E DATA DA DEFESA: Campinas, 11 de Junho de 2010.

BANCA EXAMINADORA:

Profa. Dra. Ana Maria Aparecida Guaraldo (Orientadora) Prof. Dr. Luiz Augusto Corra Passos

Profa. Dra. Nanci do Nascimento

Prof. Dr. Eros Antonio de Almeida

Profa. Dra. Wirla Maria da Silva Cunha Tamashiro

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s pessoas de todo o Brasil envolvidas nos casos de doena de Chagas aguda pelo consumo da polpa de aa contaminada com Trypanosoma cruzi com a conscincia do meu papel na sociedade, eis a minha contribuio cientfica e a minha sincera solidariedade a todos aqueles que tiveram suas vidas modificadas.

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AGRADECIMENTOS Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES) e ao Ministrio da Sade (MS), instituies responsveis pelo financiamento desse projeto. Ao Programa de Ps Graduao em Parasitologia e ao Departamento de Biologia Animal do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas (IB/UNICAMP), por toda colaborao durante as atividades envolvidas nesse trabalho. Ao Centro Multidisciplinar para a Investigao Biolgica na rea da Cincia de Animais de Laboratrio da Universidade Estadual de Campinas (CEMIB/UNICAMP), pelo treinamento e infra-estrutura indispensveis ao desenvolvimento dessa pesquisa. Ao Prof. Dr. Luiz Augusto Corra Passos, meu orientador de corao, no somente pela grande amizade, ensino e disponibilidade, mas principalmente por me proporcionar uma experincia diferenciada, por acreditar em mim, reconhecer o meu esforo e pela confiana depositada para a realizao desse trabalho. orientadora Profa. Dra. Ana Maria Aparecida Guaraldo, pelas consideraes sempre to enriquecedoras e de fundamental importncia a esse estudo, pela sabedoria, generosidade, amizade, ateno, pacincia e especialmente por me mostrar e fazer abraar tantas outras oportunidades. A todos os funcionrios e colegas de trabalho do CEMIB, mas especialmente Viviane Liotti Dias, Andria Ruis Salgado, Ana Paula Gimenes, Snia Cano Montebelo Rachel, Jssica Maria Incio Madoenho, Danielle Maria Silva Yahn, Mirian Michelle Machado e ao Prof. Dr. Marcus Alexandre Finzi Corat, no apenas pela ajuda, incentivo e profissionalismo, como tambm pela convivncia diria e por tornarem o ambiente de trabalho um lugar mais divertido e mais agradvel.

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s colegas de Mestrado, Laura Jane Gisloti e Carina Mara de Souza, pela amizade, alegria, parceria nos estudos e pelos momentos compartilhados. Profa. Dra. Nanci do Nascimento (IPEN/USP), ao Prof. Dr. Flvio Luis Schmidt (FEA/UNICAMP), Profa. Dra. Regina Maura Bueno Franco, Profa. Dra. Silmara Marques Allegretti e ao Prof. Dr. Arcio Xavier Linhares (IB/UNICAMP), pelas valiosas sugestes e crticas durante as diversas etapas, at a finalizao dessa pesquisa. Profa. Dra. Karen Signori Pereira (EQ/UFRJ), pela parceria de trabalho, amizade e que por toda sua determinao, merece igualmente o meu sincero reconhecimento. A minha famlia: a minha me Rita de Cssia Labello, a minha irm Aline de Cssia Labello Monti, ao Luiz ngelo Monti (in memorian) e em especial aos meus avs Neuza Dalbo Labello e Vicente Labello, pelo apoio incondicional e compreenso durante esse perodo. Aos meus amigos e a todas as pessoas que passaram pelo meu caminho durante esse tempo e que, direta ou indiretamente, contriburam para minha formao e se sentem parte dela. Aos animais de laboratrio. A todos eles, o meu profundo respeito. A Deus, pela minha vida e por colocar em meu caminho pessoas to especiais. Ao tempo, por me fazer acreditar que o amanh ser ainda melhor.

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No vai demorar que passemos adiante uma grande e bela cincia, que faz arte em defesa da vida. Carlos Chagas

Viver como andar de bicicleta. preciso estar em constante movimento para manter o equilbrio. Albert Einstein

Ns somos do tamanho dos nossos sonhos. Fernando Pessoa

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RESUMO TRANSMISSO ORAL DO Trypanosoma cruzi PELA POLPA DE AA EM CAMUNDONGOS. Em virtude de seu alto grau de impacto socioeconmico, a doena de Chagas est entre as mais importantes doenas parasitrias das Amricas Central e do Sul. Entre as vias de transmisso, a forma oral tem contribudo para o surgimento de novos casos e se d principalmente pela ingesto de formas tripomastigotas metacclicas de Trypanosoma cruzi presentes em diferentes alimentos. A polpa de aa possui excelentes propriedades nutricionais e muito consumida em todo o Brasil e no exterior. Entretanto, ela vem sendo associada nos ltimos anos a microepidemias da doena de Chagas aguda, especialmente na regio Norte do pas, onde esse fruto o principal suplemento da dieta alimentar da populao e movimenta uma parcela significativa da economia local. O objetivo desse trabalho foi a avaliao da sobrevivncia in vitro e da virulncia do T. cruzi em polpa de aa mantida por diferentes perodos de incubao e submetida a diferentes tratamentos trmicos, por meio de infeces experimentais. Alquotas de polpa in natura de aa proveniente de Belm (PA) foram misturadas a 105 formas tripomastigotas de T. cruzi obtidas do plasma de camundongos CBA/JUnib. As amostras, devidamente homogeneizadas, foram mantidas temperatura ambiente, refrigerao ou congelamento por perodos de incubao de at 144 horas e descongeladas quando necessrio. Em seguida, para a anlise da sobrevivncia, a metodologia in vitro adotada foi o isolamento do parasito por filtrao em l de nylon. O produto obtido foi analisado por microscopia ptica comum e utilizado para a anlise in vivo da virulncia do parasito. Camundongos isognicos imunodeficientes C.B-17-Prkdcscid/PasUnib, fmeas e machos adultos, infectados com esse produto pelas vias intraperitonial, gavagem e oral, foram previamente submetidos antibioticoterapia com cefalexina e posteriormente observados durante 40 dias. A parasitemia foi realizada pelo mtodo de Brener e a mortalidade registrada diariamente. Os resultados relevantes demonstraram que a sobrevivncia e a virulncia do parasito foram preservadas aps 144 horas da mistura mantida sob refrigerao (4C), aps 26 viii

horas de congelamento (-20C) e tambm aps tratamento trmico combinado, sendo a mistura mantida inicialmente por 48 horas temperatura ambiente e em seguida, por 72 horas a 4C. O estudo demonstrou ainda, que todas as vias de inoculao utilizadas foram eficientes, havendo retardo significativo no incio da parasitemia por infeco oral. A mortalidade dos animais ocorreu at o 25 dia aps a infeco. Concluiu-se que o T. cruzi foi capaz de sobreviver na polpa de aa por diferentes perodos de incubao e sob diversos tratamentos trmicos, alm de preservar a sua virulncia em camundongos. Esse fato de importncia epidemiolgica e descarta os processos de refrigerao e congelamento convencionais, durante os perodos de tempo testados, como mtodos de controle da transmisso oral da doena de Chagas aguda. Palavras-chave: Trypanosoma cruzi, doena de Chagas aguda, transmisso oral, polpa de aa, camundongo imunodeficiente.

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ABSTRACT ORAL TRANSMISSION OF Trypanosoma cruzi BY AA PULP IN MICE. Due to the high social and economic impact, Chagas' disease is among the most important parasitic infection in the South and Central Americas. Concerning the routes of transmission, the oral way has been contributing to the arising of new cases and it occurs as a consequence of the ingestion of metacyclic trypomastigotes present in different foods. The aa pulp has an elevated nutritional trace and is very popular in Brazil and abroad. However, in recent years, it has been associated with outbreaks of acute Chagas disease, especially in the northern region of the Brazil, where this fruit is the main diet supplement for the population and drives a significant portion of the local economy. Thus, the aims of this study were to evaluate the in vitro survival, the virulence of Trypanosoma cruzi in the aa pulp and the potential of this mixture for oral infection. For that, the mixture was maintained for different periods on different temperatures of incubation. These thermic treatments were followed by experimental infections in immunodeficient mice. Aliquots of fresh aa pulp from Belm (PA) were mixed with 105 trypomastigotes of T. cruzi Y strain obtained from blood plasma of CBA/JUnib. The samples, properly homogenized, were kept at room temperature, refrigerated or frozen by periods of incubation up to 144 hours and thawed for analysis. The methodology used for survival analysis was by isolation of parasites in vitro using isolation of parasites by nylon wool membrane for filtration. The yield collected was examined on optical microscope and used for virulence analysis in vivo. C.B-17-Prkdcscid/PasUnib immunodeficient inbred mice, adult males and females, were previously submitted to antibiotic therapy with cephalexin and followed infection by inserting the filtrated into the animals through different routes: intraperitonial, gavage or oral and during at least 40 days the animals had been observed. Thereafter, the parasitemy was performed by Breners method and their mortality was daily recorded. The relevant results demonstrated the survival and the virulence of the parasite were preserved even after 144 hours in the mixture, when it was kept under refrigeration (4 after 26 hours of C), freezing (-20C) and also after combined thermic treatment, which was the mixture x

initially maintained initially for 48 hours at room temperature and then after maintained for 72 hours at 4C. The study also demonstrated that all routes used for the mice inoculations were effective, but a significant delay was observed at the onset of parasitemy by oral infection was observed. The death of the animals occurred until the 25th day after infection. It was concluded that T. cruzi was able to survive in aa pulp for different periods of incubation and thermic treatment, moreover the aa pulp did not interfere in the parasite capacity to cause Chagas disease. This fact is very important at the epidemiological point of view and discards the processes of conventional cooling and freezing, during these time periods tested, as methods for control of the oral transmission of acute Chagas disease. Key words: Trypanosoma cruzi, acute Chagas disease, oral transmission pathway, aa pulp, immunodeficient mice.

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SUMRIO 1. Introduo --------------------------------------------------------------------------2. Reviso da Literatura ------------------------------------------------------------2.1. A doena de Chagas -----------------------------------------------------2.2. A transmisso oral da doena de Chagas aguda experimental 2.3. A transmisso oral da doena de Chagas aguda em humanos 2.4. O aa ------------------------------------------------------------------------2.5. O modelo animal -----------------------------------------------------------3. Objetivos -----------------------------------------------------------------------------3.1. Objetivo geral ----------------------------------------------------------------3.2. Objetivos especficos ------------------------------------------------------4. Material e Mtodo -----------------------------------------------------------------4.1. O parasito --------------------------------------------------------------------4.2. Os animais -------------------------------------------------------------------4.3. A polpa de aa -------------------------------------------------------------4.4. Procedimentos experimentais -------------------------------------------4.4.1. Isolamento das formas de T. cruzi presentes na polpa de aa -------------------------------------------------------------------------------4.4.1.1. Pr-teste ---------------------------------------------------------4.4.1.2. Teste de isolamento do parasito por centrifugao ---4.4.1.3. Teste de isolamento do parasito por tamisao forada ----------------------------------------------------------------------4.4.2. Avaliao da interferncia da polpa de aa na sobrevivncia do T. cruzi: testes in vitro -------------------------------4.4.3. Avaliao da influncia da polpa de aa na virulncia do T. cruzi: testes in vivo --------------------------------------------------------4.4.4. Certificao do modelo animal imunodeficiente --------------4.4.5. Manuteno dos animais -------------------------------------------4.4.6. Tratamento da polpa de aa --------------------------------------4.4.7. Tratamento dos animais para os ensaios com a polpa de xii 30 30 30 31 29 27 26 26 26 1 3 4 6 8 14 18 22 23 23 24 25 25 25 26

aa in natura -------------------------------------------------------------------4.4.7.1. Administrao do antibitico pela via i.p. ---------------4.4.7.2. Administrao do antibitico pela via gavagem -------4.4.7.3. Administrao do antibitico na gua do bebedouro 4.4.8. Avaliao da viabilidade e do poder de infeco do T. cruzi 4.4.8.1. Verificao da parasitemia e da mortalidade ----------4.4.9. As amostras ------------------------------------------------------------4.4.9.1. Controle negativo ----------------------------------------------4.4.9.2. Controle positivo -----------------------------------------------4.4.9.3. Grupos teste: eluato ------------------------------------------4.4.9.4. Grupos teste: mistura -----------------------------------------4.4.10. Os grupos experimentais ------------------------------------------4. 5. Anlise estatstica ---------------------------------------------------------5. Resultados --------------------------------------------------------------------------5.1. Pr-teste -----------------------------------------------------------------------5.2. Testes de isolamento das formas de T. cruzi presentes na polpa de aa -------------------------------------------------------------------------------5.2.1. Mtodo da centrifugao -------------------------------------------5.2.2. Mtodo da tamisao forada ------------------------------------5.3. Avaliao da interferncia da polpa de aa na sobrevivncia do T. cruzi: testes in vitro -------------------------------------------------------------5.3.1. Sobrevivncia do T. cruzi em polpa de aa autoclavada e mantida temperatura ambiente -----------------------------------------5.3.2. Sobrevivncia do T. cruzi em polpa in natura de aa e mantida a 4C ------------------------------------------------------------------5.3.3. Sobrevivncia do T. cruzi em polpa in natura de aa e mantida a -20C ---------------------------------------------------------------5.4. Avaliao da interferncia da polpa de aa na virulncia do T. cruzi: Testes in vivo ---------------------------------------------------------------5.4.1. Mistura produzida com a polpa de aa autoclavada e mantida temperatura ambiente ------------------------------------------

31 32 32 32 32 33 33 34 35 35 36 36 39 41 42 42 42 42 43 43 44 44 45 45 xiii

5.4.2. Tratamento combinado: mistura produzida com a polpa in natura de aa e mantida temperatura ambiente e a 4C --------5.4.3. Mistura produzida com a polpa in natura de aa e mantida a 4C -----------------------------------------------------------------------------5.4.4. Mistura produzida com a polpa autoclavada e polpa in natura de aa mantidas a -20C ------------------------------------------5.4.5. Grupos experimentais: misturas produzidas com a polpa in natura de aa contaminada e mantidas por 24 horas sob diferentes tratamentos trmicos -------------------------------------------5.4.5.1. Evoluo da parasitemia dos grupos experimentais -6. Discusso ----------------------------------------------------------------------------7. Concluses --------------------------------------------------------------------------8. Referncias Bibliogrficas -------------------------------------------------------9. Anexo ---------------------------------------------------------------------------------9.1. Evoluo da parasitemia --------------------------------------------------9.2. Dados estatsticos ----------------------------------------------------------9.3. Certificao da Comisso de tica na Experimentao Animal (CEEA/UNICAMP) ----------------------------------------------------------------- 119 59 65 73 91 93 111 112 116 52 48 47

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1. INTRODUO

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Em decorrncia de seu alto grau de impacto socioeconmico, a doena de Chagas est entre as mais importantes doenas parasitrias do continente americano. Entre as suas vias de transmisso, a forma oral tem contribudo para o surgimento de novos casos e se d principalmente pela ingesto de formas tripomastigotas metacclicas de Trypanosoma cruzi presentes em diferentes alimentos. A ocorrncia de doena de Chagas aguda (DCA) relacionada ao consumo de alimentos constitua, at o ano de 2004, um evento pouco conhecido ou investigado, embora notificados pelo Ministrio da Sade. Recentemente, microepidemias de DCA com casos graves e importante letalidade na regio Norte do Brasil, tm sido associadas transmisso do T. cruzi pela polpa de aa, seja pela contaminao dos frutos ou da prpria polpa por meio de dejetos de animais reservatrios ou de insetos vetores infectados das reas endmicas. Dadas as suas propriedades nutricionais, a polpa de aa um alimento muito consumido no Brasil e em diversos outros pases. Na regio amaznica, especialmente no estado do Par, esse fruto o principal suplemento da dieta alimentar da populao e em virtude de sua alta produtividade, a comercializao de aa representa uma importante fonte de renda, o que o torna imprescindvel economia local. Apesar de surtos de DCA indicarem a possibilidade da transmisso oral, o levantamento bibliogrfico concernente a alimentos e relao parasito-hospedeiro, demonstrou que essa relao pouco estudada. At o momento eram ainda controversos os dados referentes sobrevivncia e infectividade de formas tripomastigotas em polpa de aa contaminada. Por se tratar de uma questo relevante sade pblica e pesquisa aplicada em doena de Chagas, tendo em vista que o aa foi o alimento associado ao maior nmero de casos ocorridos na regio Norte nos ltimos anos, estudos envolvendo modelos animais apropriados sero determinantes para melhor entender a relao T. cruzi - aa. Por esta razo, no CEMIB/UNICAMP, que apresenta infra-estrutura adequada e experincia prvia em trabalhos experimentais com T. cruzi, foi estabelecido um convnio com o Ministrio da Sade, n 667/2008, para a realizao de ensaios in vitro e in vivo, mediante a infeco experimental da polpa de aa contaminada em camundongos imunodeficientes, por diferentes perodos. 2

2. REVISO DA LITERATURA

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2.1. A doena de Chagas A tripanossomose americana foi descoberta em 1909 pelo pesquisador brasileiro Carlos Ribeiro Justiniano das Chagas (1878-1934), no municpio de Lassance, interior do Estado de Minas Gerais (CHAGAS, 1909). Aps 100 anos de sua descoberta e caracterizao, a doena ainda no apresenta cura e muitos aspectos cientficos ainda carecem de esclarecimentos. Historicamente, a transmisso ao homem acontece sobretudo em reas rurais da Amrica Latina e nas proximidades da zona urbana, quando nelas h modificao ou destruio do ambiente natural (DIAS, 1999; DIAS, 2000). A doena se estabelece por meio de um ciclo biolgico complexo e ocorre pela transmisso do Trypanosoma cruzi, um protozorio hemoflagelado, da Ordem Kinetoplastida e da Famlia Trypanosomatidae. O ciclo inclui dois tipos de hospedeiros. O primeiro um inseto hemptero e hematfago, popularmente conhecido como barbeiro, e o segundo, um mamfero reservatrio que pode pertencer a diversas classes, como marsupiais e roedores (DEANE et al., 1984). Nos triatomneos, o T. cruzi multiplica-se no tubo digestrio, alcanando a sua forma infectante, denominada tripomastigota metacclica, na poro terminal do intestino, sendo eliminada nas excrees dos insetos. Nos mamferos, o parasito circula no sangue, alojando-se principalmente nos tecidos musculares, como o corao, onde ocorre a sua multiplicao (COURA, 2003). A doena apresenta duas fases distintas: a inicial ou aguda, muitas vezes assintomtica ou oligossintomtica, caracterizada pela presena do tripomastigota no sangue do hospedeiro; e a segunda fase, quando h evoluo para a forma crnica, que caracterizada pelo comprometimento dos tecidos cardaco e/ ou digestrio do doente, com difcil deteco de parasitos circulantes (COURA, 2003; BRITTO, 2009). Pode ainda existir a fase indeterminada ou de latncia, na qual no h sintomatologia clnica importante. Alguns pacientes chagsicos permanecem nessa fase sem nunca atingir a fase crnica da doena (COURA, 2003; BRITTO, 2009). Em indivduos cuja doena evolui para a fase crnica, pode haver o aparecimento de insuficincia cardaca, megaesfago e megaclon (LOPES & 4

CHAPADEIRO, 2004). Os custos do tratamento de um doente chagsico crnico para o sistema pblico de sade so enormes, em decorrncia da morbidade, da hospitalizao e do tratamento dos sintomas. H sobrecarga da previdncia social com um montante de aposentadorias precoces e os pacientes podem-se tornar marginalizados na sociedade em funo de sua aparente impossibilidade de trabalhar (MONCAYO & SILVEIRA, 2009). A doena de Chagas est entre as mais importantes infeces parasitrias e no final do sculo passado foi considerada como a mais importante pelo Banco Mundial, por apresentar um impacto socioeconmico significativamente maior que o obtido pelo efeito combinado de todas as outras infeces causadas por parasitos (WHO, 2002). Est amplamente distribuda nas Amricas Central e do Sul, estendendo-se do sul dos Estados Unidos at a Argentina (SZAJNMAN et al., 2005). Embora a prevalncia da infeco no continente americano tenha reduzido cerca de 70% por volta do ano 2000 (MONCAYO, 2003), em 2009, a Organizao Mundial de Sade (WHO, 2009) estimou que cerca de 12 milhes de pessoas estivessem infectadas com doena de Chagas nas Amricas - sendo dois milhes somente no Brasil - e que mais de dez mil pessoas morreriam por ano em consequncia da doena (MINISTRIO DA SADE, 2009). Na Amrica do Sul, principalmente no Brasil, Equador, Chile, Paraguai, Uruguai e na Bolvia, Argentina e Venezuela, a doena de Chagas constitui grave e alarmante problema de sade pblica e, por afetar principalmente pessoas de pases em desenvolvimento, ainda uma doena negligenciada, com pouco investimento em diagnstico, tratamento e preveno (WHO, 2009). Em funo de aes de controle de vetores a partir da dcada de 1980, o Brasil recebeu, em 2006, a Certificao Internacional pela Interrupo da transmisso da doena de Chagas pelo Triatoma infestans, espcie importada e responsvel pela maior parte da transmisso vetorial (MINISTRIO DA SADE, 2009). Apesar do sucesso de programas para a reduo da transmisso vetorial e do registro de menos ocorrncias pelas vias congnita e transfusional, assim como por meio de secrees das relaes sexuais, por acidentes laboratoriais ou por transplantes de rgos no inspecionados (DIAS et al., 2000), o Brasil no estar livre da doena 5

nas prximas dcadas, seja pelo grande nmero de chagsicos crnicos idosos, seja porque nos ltimos anos vm ocorrendo mudanas em seu perfil epidemiolgico, com destaque para a via oral, por meio do consumo de alimentos contaminados (MONCAYO & SILVEIRA, 2009). Segundo a Secretaria de Estado da Sade do Amazonas (SUSAM), em 2009, o municpio de Barcelos, localizado no Norte do Amazonas, registrou casos da infeco durante trabalhos de coleta de piaaba, uma espcie de palmeira cujas fibras so utilizadas na confeco de vassouras e escovas (AGNCIA BRASIL, 2010). De acordo com o Relatrio Tcnico elaborado na cidade de Manaus (2005) pela Secretaria Tcnica da Organizao Pan-Americana de Sade de fundamental importncia a orientao da populao sobre como evitar a contaminao acidental pelo T. cruzi durante a coleta dessa matria-prima, que apesar de se constituir em importante atividade comercial e particular daquela regio, pode ampliar sobremaneira as possibilidades de transmisso da doena. De acordo com Rodriguez-Morales et al. (2009), atualmente, muitos estudos esto voltados para a ocorrncia da doena de Chagas em pases europeus como Espanha, Sua, Frana, Itlia, Alemanha e Inglaterra, pois a transmisso oral da doena de Chagas implica na transmisso do T. cruzi para reas antes consideradas no endmicas, em virtude da exportao de alimentos contaminados. 2.2. A transmisso oral da doena de Chagas aguda experimental A transmisso oral da doena de Chagas se estabelece por meio da ingesto de formas tripomastigotas metacclicas, dada a capacidade de sobrevivncia do parasito na presena do suco gstrico (CAMANDAROBA et al., 2002). Embora tenha sido amplamente divulgada pela mdia a partir de 2005, estudos revelaram que a via oral na transmisso do T. cruzi no um fato recente. Sua importncia conhecida h muito tempo e a infeco em animais onvoros e insetvoros susceptveis ocorrem com a predao ou com a ingesto de um alimento contaminado (PEREIRA et al., 2009).

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Logo aps a descoberta da tripanossomose, Carlos Chagas e Oswaldo Cruz descreveram o primeiro caso de transmisso oral da doena quando saguis (Callitrix penicillata), colocados em jaula juntamente com insetos infectados pelo protozorio, adquiriram o parasito durante a predao. Na ocasio, a hiptese considerada para a contaminao foi a ingesto dos insetos pelos saguis (DIAS, 2006). No entanto, Coura em 1997 relatou os achados de Nattan-Larrier em 1921: a demonstrao experimental de transmisso da infeco chagsica pela via oral ao reproduzir a doena de Chagas em animais de laboratrio por meio da administrao oral de formas tripomastigotas (COURA, 1997). Da mesma maneira, Dias (1940) relatou que o pesquisador Ezequiel Dias fez a primeira referncia oficial a esse modo de transmisso em 1933, ao observar, em seu laboratrio, tatus se alimentarem do triatomneo Panstrongylus megistus. Posteriormente, a confirmao da transmisso se deu pela observao de gatos que se alimentaram de barbeiros e roedores infectados. Yaeger (1971), na Lousiana, nos Estados Unidos, demonstrou que gambs adquiriram infeco experimental por T. cruzi por meio da ingesto de dois triatomneos (Rhodnius prolixus). De acordo com o autor, a infeco por T. cruzi pode ser frequente em mamferos e roedores devido a seus hbitos alimentares insetvoros ou da predao de outros mamferos infectados. Ainda nos Estados Unidos, Roellig et al. (2009) demonstraram, pela primeira vez, a transmisso oral de T. cruzi experimental em guaxinim (Procyon lotor), um reservatrio natural naquele pas, por meio da ingesto de tripomastigotas e hempteros infectados. Na Amrica Latina, investigaes realizadas na Venezuela por Diaz-Ungra (1968), comprovaram a contaminao oral de ces e roedores por meio de cepas locais de T. cruzi originadas de triatomneos naturalmente infectados. Ainda na dcada de 1980, Jansen e Deane (1985) ressaltaram a importncia do gamb (Didelphis marsupialis) como reservatrio e transmissor do T. cruzi. Essas autoras constataram a infeco de camundongos que ingeriram alimentos contaminados com excrementos do marsupial. Calvo-Mndez et al. (1994) demonstraram a infeco chagsica por via oral em camundongos pela administrao de gua potvel, leite pasteurizado, carne moda crua 7

ou cozida, queijo fresco e arroz cozido contaminados com fezes de Triatoma pallidipennis. Os autores observaram existir variao na eficincia da infeco de acordo com o tipo de alimento ingerido e demonstraram que o leite se apresentou como o meio mais efetivo para a transmisso do protozorio. Mais recentemente, Castanho et al. (2002) relataram a infeco chagsica em camundongos por meio da ingesto de caldo de cana contaminado com fezes de Rhodnius neglectus contendo T. cruzi. 2.3. A transmisso oral da doena de Chagas aguda em humanos No Brasil, a transmisso oral da DCA em humanos est especialmente associada contaminao de leite materno via congnita, de leite cru ou de sucos de frutas e verduras por vetores silvestres e reservatrios vertebrados de T. cruzi (CAMANDAROBA et al., 2002). Muitas vezes, os insetos vetores so triturados no momento da preparao do alimento ou ento h contaminao por dejetos dos reservatrios ou dos prprios vetores (RIBEIRO et al., 1987). Entretanto, a contaminao oral tambm pode ocorrer pelo manuseio ou consumo de carcaa crua, mal cozida ou apenas defumada de mamferos silvestres obtidos em atividades de caa (FORATTINI et al., 1980), pela ingesto de sangue de tatus e gambs usados como remdio na medicina tradicional da Amaznia colombiana ou at mesmo por hbitos primitivos de ingesto de triatomneos (DIAS, 2006). O primeiro caso humano de transmisso da doena de Chagas pelo leite materno foi relatado na Argentina por Mazza et al. (1936). Aps esse fato, diversos outros autores evidenciaram a presena de T. cruzi em leite de animais infectados experimentalmente com o parasito (FERREIRA et al., 2001). Do ponto de vista epidemiolgico, surtos da doena aguda por via alimentar vm sendo observados desde o sculo passado. Porm, o destaque importncia da via oral para a transmisso da DCA aconteceu somente na dcada de 1960, quando Shaw et al. (1969) anteviram a possibilidade da transmisso oral da doena de Chagas na cidade de Belm (PA). Os autores observaram que quatro pessoas de uma mesma

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famlia estavam envolvidas e que trs delas encontravam-se na fase aguda da doena no momento do diagnstico. Desde ento, muitos so os registros de microepidemias (PANAFTOSA, 2006) da DCA por transmisso alimentar em diversos estados brasileiros. A Figura 1 retirada de Transmission of Chagasdisease (American Trypanosomiasis) by Foods (PEREIRA et al., 2010) apresenta o mapa do Brasil, com as regies envolvidas em episdios da DCA pela transmisso oral.

Figura 1. Estados brasileiros com relatos de surtos da doena de Chagas aguda por meio de transmisso alimentar, retirada de Transmission of Chagasdisease (American Trypanosomiasis) by Foods (PEREIRA et al., 2010). Ainda na dcada de 1960, foi descrito de fato o primeiro surto de infeco humana pelo T. cruzi devido transmisso oral do parasito em alimentos. Silva et al. (1968) relataram o caso no distrito de Teutnia, municpio de Estrela (RS), no ano de 1965, envolvendo 17 pessoas, das quais seis vieram a falecer. Nesse episdio, as pessoas adoeceram praticamente no mesmo dia e apresentaram quadro clnico de miocardite aguda. Todos os suspeitos (funcionrios, alunos e professores) possuam em comum 9

apenas o fato de frequentarem a Escola Agrcola e l realizarem suas refeies. Um estudo sorolgico e entomolgico sugeriu a contaminao da horta por excretas e secrees provenientes das glndulas anais de marsupiais, uma vez que foram encontrados nas proximidades exemplares infectados pelo T. cruzi. Outro importante surto de etiologia alimentar foi identificado 20 anos mais tarde, em Catol do Rocha (PB), em 1986. Nele, 26 pessoas adoeceram entre sete e 22 dias aps participar de uma festividade na fazenda Aroeira. Uma delas faleceu de insuficincia cardaca congestiva (SHIKANAY-YASUDA, 1987). A refeio era composta de churrasco de boi e carneiro, buchada de carneiro, carne de porco cozida, salada e caldo de cana modo no local. Os estudos epidemiolgicos preliminares apontaram para uma provvel contaminao da comida e/ou dos utenslios por excretas contaminadas do mamfero Didelphis albiventris (denominado popularmente como gamb-de-orelha-branca, saru ou mucura), frequente nas proximidades do domiclio (MARCONDES et al., 1987). Posteriormente, evidncias relacionadas sobrevivncia de T. cruzi em caldo de cana, associadas ao fato de a mquina de moer cana abrigar barbeiros, sugeriram a possibilidade de esse alimento ter atuado como veculo de transmisso da infeco chagsica na Paraba (LEWINSOHN, 2005a,2005b). Em Mazago (AP), em outubro de 1996, um surto de DCA afetou 17 pessoas de trs famlias diferentes. O possvel mecanismo de transmisso foi a ingesto de suco de aa contaminado com fezes de triatomneos. O suco foi preparado noite e os insetos atrados pela luz eltrica caram dentro da mquina de moer e foram triturados juntamente com o fruto (VALENTE et al., 1999). Pinto et al. (2003) informaram a ocorrncia de um surto de DCA provavelmente transmitida via oral, envolvendo 12 pessoas de duas famlias, com dois bitos, em Igarap-Miri (PA), em julho de 2002. Em maro de 2005, com destaque dado pela mdia internacional, foi registrado um surto de DCA no estado de Santa Catarina, decorrente do consumo de caldo de cana especificamente em um quiosque da BR-101, na cidade de Navegantes, importante rea turstica no sul do Brasil (PANAFTOSA, 2006). Na ocasio, a Secretaria de Sade do Estado divulgou uma nota oficial em que foram constatadas infeces de 24 pessoas e que trs delas evoluram para bito (SVS, 2007c). 10

Duas hipteses foram sugeridas para a contaminao do caldo de cana com os protozorios. A primeira delas foi a moagem de triatomneos com cana; e a segunda, a contaminao da garapa com excretas de animais silvestres, tendo em vista que foram encontrados dez triatomneos em uma palmeira prxima ao local; 30 na mata fechada atrs do quiosque; um vetor infectado no quiosque; e ainda, uma fmea de gamb com quatro filhotes, todos infectados (IANNI & MADY, 2005). Na sequncia, em 31 de maro do mesmo ano, um relatrio do Instituto Evandro Chagas (PA) esclareceu um surto de doena aguda na comunidade do Igarap da Fortaleza, rea porturia da cidade de Santana (AP), ocorrido em dezembro de 2004. Nesse surto, 27 pacientes, de seis famlias diferentes, foram confirmados com DCA e o relato comum era o consumo de aa, possivelmente contaminado com fezes de barbeiro no local de venda (SVS, 2005). A ocorrncia desses episdios em um curto intervalo de tempo e em locais to distintos foi determinante para que a transmisso oral da doena de Chagas ganhasse espao na imprensa escrita e falada e, tambm, no meio cientfico. A partir de ento, a divulgao de matrias referindo-se ao consumo de aa como meio de transmisso da doena de Chagas surpreendeu a populao brasileira, gerando insegurana tanto entre produtores como entre consumidores do pas. Os artigos The oral transmission of Chagas disease: An acute form of infection responsible for regional outbreaks (BARBOSA, 2006) e Further comments on oral transmission of Chagas' disease in Brazil: Epidemiology, geographical distribution and viability of the infective parasite (BENCHIMOL-BARBOSA, 2009) retomaram as discusses sobre os dados cientficos at ento pouco difundidos na rea de alimentos com relao transmisso pela via oral, bem como sobre as estratgias de preveno. Segundo o Laboratrio de Doena de Chagas do Instituto Evandro Chagas (PA) e da Secretaria de Vigilncia em Sade, foram registrados 592 casos de doena de Chagas na Amaznia brasileira entre 1968 e 2007. Deste nmero, 587 foram confirmados como DCA, sendo 440 (74,95%) associados a surtos familiares. At 2006, apesar de ser um evento pouco divulgado, foram notificados cerca de 430 casos de DCA relacionados ao consumo de alimentos contaminados somente na regio amaznica brasileira (SVS, 2007a). 11

De acordo com Nbrega et al. (2009), em 2006, ano em que a forma oral foi identificada como um potencial risco para a sade pblica, um total de 116 casos de DCA foram notificados em todo o Brasil. Na cidade de Barcarena (PA) foram registradas 11 ocorrncias possivelmente associadas ao consumo de aa e no distrito de Moju dos Campos, em Santarm (PA), ocorreu um surto vinculado ao consumo de aa branco, ou bacaba, com 17 casos, entre eles um bito confirmado (SVS, 2007c). Alm disso, nesse mesmo ano, a Secretaria da Sade do Estado do Cear informou um relato da doena aguda envolvendo oito pessoas das famlias de duas irms, em Redeno (CE). As idades variaram de dois a 35 anos, sendo duas pessoas do sexo masculino e seis do sexo feminino. Estudos epidemiolgicos apontaram a transmisso pela via oral e o veculo possvel foi uma sopa preparada com gua de um reservatrio em condies precrias de higiene (SESA, 2006; OLIVEIRA et al., 2007). Em 2007, no municpio de Coari (AM) um surto vinculado ao consumo de suco de aa em um nico ponto atingiu 25 pessoas. Nesse mesmo ano, foram registrados 161 casos da doena no Brasil, principalmente nos estados do Par, Amazonas e Amap, de acordo com dados do Ministrio da Sade (SVS, 2007c). Ainda em 2007, em Belm (PA), trs pessoas foram diagnosticadas com DCA. Os estudos epidemiolgicos concluram que o consumo de camaro cru esteve associado infeco, possivelmente contaminado com fezes de triatomneos ou dejetos de marsupiais e roedores infectados, durante o armazenamento ou o transporte para a comercializao do produto (FREITAS et al., 2008). Nesse mesmo perodo, foram ainda notificados dois casos de DCA, sem bitos, provavelmente associados transmisso alimentar, nas cidades de Breves e Bagre (PA). Em Breves, 12 pacientes diagnosticados pertenciam mesma famlia e haviam compartilhado o almoo e o jantar, composto de carne seca, frango, farinha de mandioca, aa e gua. Em Bagre, os 13 pacientes participaram de uma reunio familiar e dormiram na mesma casa, sendo a refeio composta de peixe, farinha de mandioca, aa, acar e gua (BELTRO et al., 2009). Em 2008, no Brasil, foram notificados 131 casos de DCA. Apesar de a maioria dos relatos se concentrarem na regio amaznica (com 129 casos na regio Norte) e estar associada transmisso oral pelo consumo frequente da polpa de aa 12

contaminada (SVS, 2010), a gua tambm esteve vinculada a outro surto. Em Macabas (BA), houve o relato de transmisso a sete indivduos da mesma famlia (pai, me e cinco filhos), sendo dois bitos, provavelmente decorrentes da ingesto de gua inadequadamente armazenada e contaminada com fezes de triatomneos (DIAS et al., 2008). Dados divulgados pela mdia paraense (INSTITUTO EVANDRO CHAGAS, Dirio do Par, 25/08/2009) indicaram que apesar das medidas de preveno j adotadas, at agosto de 2009, o Instituto Evandro Chagas havia identificado 22 casos agudos no estado do Par, nos municpios de Paragominas, Belm, Moju, Castanhal, Abaetetuba, Barcarena, com o maior nmero de casos ocorrido em uma comunidade rural do rio Mutuac, em Curralinho, extremo sul da Ilha de Maraj. Segundo comunicao pessoal com a Coordenadora Estadual de Controle da Doena de Chagas da Secretaria de Estado e Sade Pblica do Par (SESPA), Elenild de Ges Costa, at novembro de 2009, foram confirmados mais de 100 casos. Mais uma vez, associava-se hiptese de transmisso pela via oral, por meio da ingesto de aa contaminado pelo parasito. Dados ainda no publicados, porm difundidos pela mdia mostraram que em janeiro de 2010, o municpio de Santa Isabel do Rio Negro (AM) registrou um surto de DCA em que 12 pessoas, sendo oito adultos e quatro crianas, foram infectadas aps a ingesto de polpa de aa produzida em condies sanitrias inadequadas. De acordo com a SUSAM, os pacientes no apresentaram risco de morte, mas precisaro ser acompanhados pelos prximos cinco anos (AGNCIA BRASIL, 2010). Outros estudos recentes relataram casos da doena de Chagas na Amrica Latina. O surto com o maior nmero de casos j relacionado transmisso oral da doena aguda ocorreu na Escola Municipal Andrs Bello, na cidade de Chacao, regio metropolitana de Caracas, na Venezuela, em dezembro de 2007. Dos 128 casos confirmados, 75% eram de jovens menores de 18 anos que apresentaram sintomatologia caracterstica de fase aguda como febre persistente por mais de sete dias, dor abdominal, dor de cabea, mialgia, diarreia, edema facial e taquicardia. Do total, 12 pacientes foram hospitalizados, e, entre eles, houve um bito. Os estudos epidemiolgicos concluram que a fonte de infeco foi a contaminao de suco de goiaba produzido sem condies adequadas de higiene. Insetos vetores infectados 13

foram coletados prximos ao local de processamento do suco, alm de uma funcionria responsvel pela produo da bebida ser soropositiva para IgM e IgG (VILLALOBOS, 2007; RODRIGUEZ-MORALES, 2008; MILES, 2010; NOYA et al., 2010). Ainda na Venezuela, no municpio de Chichiriviche de la Costa, no estado de Vargas, em abril de 2009, 47 estudantes e trs professores adoeceram. Nesse surto, foram registrados trs bitos e a hiptese mais provvel da morte na fase aguda da doena de Chagas foi a ingesto de suco de goiaba contaminado (ISID, 2009). Na Colmbia, foram notificados dois surtos de DCA provavelmente causados por alimentos contaminados. O primeiro ocorreu em 1999 na cidade de Guamal, estado de Magdalena, onde 13 pacientes com febre e miocardite aguda foram diagnosticados, dos quais cinco faleceram. Exemplares de Panstrongylus geniculatus infectados foram coletados em palmeiras prximas rea e a concluso foi de que o vio de palma, uma bebida tpica fermentada e consumida na regio, sofreu contaminao por fezes de triatomneos (PANAFTOSA, 2006; HERNANDZ et al., 2009). O segundo surto ocorreu em 2008, em Bucaramanga, envolvendo dez pacientes. O ponto em comum foi a ingesto de suco de tangerina de um mesmo local por nove pacientes sintomticos, sendo trs de uma mesma famlia e trs trabalhadores, jovens entre 21 e 22 anos de idade, do aeroporto Palonegro de Lebrija, dos quais um morreu. (HERNANDZ et al., 2009). 2.4. O aa A regio amaznica apresenta grande quantidade de plantas perenes, com particular relevncia para as espcies frutferas (NOGUEIRA et al., 1995). Dentre elas destaca-se o aa, fruto do aaizeiro (Euterpe oleracea Martius), que uma palmeira pertencente diviso Magnoliophyta, antiga Angiospermae, e membro da famlia Arecaceae, que por sua forma e seu aspecto a mais caracterstica da flora tropical (OLIVEIRA et al., 2002). O gnero Euterpe rene aproximadamente 30 espcies, ocorre nas Amricas Central e do Sul e est distribudo por toda bacia amaznica, sendo E. oleraceae, E. edulis e E. precatoria as trs espcies mais frequentes (SIQUEIRA et al., 1998). 14

Segundo definio encontrada no Dicionrio Houaiss da Lngua Portuguesa (HOUAISS et al., 2001), a etimologia da palavra aa wasa'i ou i-ai que em tupi significa fruto que chora, isto , que deita gua, fazendo referncia lenda indgena e ao fato de a fruta expelir gua. Alm disso, o termo aa utilizado no somente para denominar o fruto do aaizeiro ou a prpria palmeira, mas tambm a bebida que obtida a partir de seu fruto (OLIVEIRA et al., 2002). Aaizais nativos so comumente encontrados ao longo dos rios, em terrenos de vrzea, baixadas, igaraps, reas muito midas e tambm em terra firme. Em territrio brasileiro, encontrado no Acre, Amap, Maranho, Par e principalmente no esturio do rio Amazonas, estendendo-se ainda Colmbia, ao Equador, s Guianas e Venezuela (ROGEZ, 2000). Aproveitado integralmente pelos habitantes da regio amaznica brasileira, com destaque produo do palmito oriundo do caule, o aaizeiro, a partir da dcada de 1970, foi introduzido nos estados do Sul e Sudeste do pas, principalmente por instituies pblicas, para pesquisa e ensino, e l se propagou (BOVI, 2004). Atualmente, a atividade extrativista em aaizeiros tem diminudo dado o interesse em seu manejo nas reas de vrzeas para a produo de frutos (HOMMA et al., 2006) por meio de programas de melhoramento gentico, com a produo de hbridos obtidos por cruzamentos controlados e/ou naturais entre espcies (BOVI, 2004). O aaizeiro pode atingir altura de at 25m, possui caule de 15 a 25cm de dimetro e ocorre geralmente formando touceiras com vrios estipes (TATENO, 2001; OLIVEIRA et al., 2002). Por ser uma espcie que se adapta facilmente a sistemas agroflorestais, uma vez que possui copa aberta, talo ereto, fcil propagao e autopoda, de uso mltiplo (OLIVEIRA, et al., 2002) e de acordo com Oliveira & Mller (1998), seu potencial econmico encontra-se nos frutos e na palmeira, seja para a alimentao, produo de celulose, fabricao de casas, confeco de chapus, rao animal, arborizao, medicina caseira e corante natural. Os frutos encontram-se inseridos em cachos ou infrutescncias, so pequenos e arredondados e medem entre 1 e 2cm de dimetro (TATENO, 2001; OLIVEIRA et al., 2002). 15

A maior parte do fruto composta do endocarpo, ou caroo, bastante volumoso e duro. A parte comestvel do aa compe-se, porm, do epicarpo e do mesocarpo polposo e corresponde a apenas 26,54% do peso do fruto, com cerca de 1mm de espessura, de colorao violcea ou roxo-escura quando maduros, em funo da presena de antocianinas (TATENO, 2001; OLIVEIRA et al., 2002). As flores e os frutos do aa so essenciais para o desenvolvimento agroindustrial da regio amaznica e ocorrem em todos os meses do ano, porm concentram-se no segundo semestre, entre os meses de setembro e dezembro, quando h diminuio do perodo de chuvas e aumento da produo de aaizeiros (OLIVEIRA et al., 2002). De acordo com Rogez (2000), em virtude de sua grande utilizao e de suas excelentes propriedades nutricionais e sensoriais, o aa constitui-se a base da culinria paraense, sendo o mais importante suplemento alimentar da dieta da populao da bacia amaznica e uma tima alternativa para a melhoria de vida do meio rural, principalmente no estado do Par. Sua composio caracterizada por um elevado teor de cidos graxos monoinsaturados e poliinsaturados, fibras, protenas, minerais (como potssio, clcio e ferro), vitaminas E e B1 e por um baixo teor de acares (ROGEZ, 2000; OLIVEIRA et al., 2002). O potencial do aa como alimento funcional torna-se atraente por seu conjunto de substncias fitoqumicas, incluindo os flavonides, as antocianinas e os polifenis, que se destacam pelas propriedades antioxidantes e moduladoras do metabolismo (LICHTENTHLER et al., 2005; KUSKOSKI et al., 2006; POZO-INSFRAN et al., 2006; SCHAUSS et al., 2006a,2006b; PACHECO-PALENCIA et al., 2007). Alm disso, o alto teor de pigmentos naturais d a cor ao alimento e contribui para o seu aspecto visual, que um quesito de fundamental importncia para sua aceitao e escolha pelos consumidores (NEIDA & ELBA, 2007). O transporte do fruto de sua colheita a seu processamento realizado em sacos ou cestos de palha conhecidos como paneiros, destampados ou descobertos (Figura 2) e seu consumo feito aps um pr-processamento do fruto com adio de gua morna para seu despolpamento e posterior filtrao, originando uma bebida chamada de aa,

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de suco de aa, ou ainda, de vinho de aa, como comumente conhecida na regio Norte do pas (ROGEZ, 2000).

Figura 2. Paneiro de aa comercializado na cidade de Belm do Par (arquivo pessoal). Estudos apontaram que a polpa um alimento muito perecvel e de fcil deteriorao por fungos e bactrias, porque o fruto extremamente manipulado durante toda a cadeia produtiva do suco (SOUSA et al., 2006). A forma de consumo do aa na regio amaznica difere da dos demais estados brasileiros. Na cidade de Belm do Par, por exemplo, ele comercializado diariamente, in natura ou congelado, em cerca de trs mil pontos de venda (MONTEIRO, 2006) e consumido na forma de vinhos, cremes, mingaus, geleias, iogurtes, sorvetes, bombons, licores, em p, sucos (aa grosso ou especial, aa mdio ou regular e aa fino ou popular, dependendo da quantidade de slidos totais), combinado com doce de leite, arroz com feijo, camaro seco, charque, peixe frito ou com alimentos regionais como farinha de mandioca ou tapioca, raramente acompanhado de acar, durante ou bem prximo ao perodo das refeies (OLIVEIRA et al., 2002; DONADIO et al., 2004). Nas demais regies, o aa comumente consumido na forma de polpa congelada, sobretudo entre os esportistas, por ser considerado uma bebida energtica e, na maior parte das vezes, acrescido de xarope de guaran e/ou frutas, cereais e carboidratos de assimilao rpida para compensar sua deficincia em acares simples (NOGUEIRA et al.,1995; OLIVEIRA, 1998).

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O Brasil o principal produtor natural do aaizeiro e o estado do Par, o maior produtor e consumidor de aa. Na entressafra, o pas abastecido parcialmente com frutos oriundos dos estados do Amap e Maranho (HOMMA et al., 2006). No ano de 2006, cerca de dez mil toneladas de polpa congelada de aa e 120 mil litros de vinho foram destinados a So Paulo, Rio de Janeiro, Pernambuco, Gois e Braslia (PORTES, 2008). Estima-se que de 1999 a 2004 o Brasil produziu aproximadamente 740 mil toneladas de aa (MONTEIRO, 2006). Nos anos seguintes, estudos de mercado constataram o aumento da demanda de polpa, e s em 2007, o Par produziu cerca de dois milhes de toneladas, sendo 25% da produo destinada exportao. No mercado interno, a comercializao correspondeu a 60% dessa produo, com a liderana do Rio de Janeiro no consumo da polpa (PORTES, 2008). Dessa maneira, o aa tem conquistado consumidores no apenas no Brasil; ele j foi eleito um dos principais sabores de 2007 nos Estados Unidos (DUAILIBI, 2007), alm de estar presente em importantes mercados, como Japo, Alemanha, Frana, Itlia e Oriente Mdio (MONTEIRO, 2006). 2.5. O modelo animal O avano na gentica de camundongos, com o desenvolvimento de novos modelos animais, permitiu esclarecer alguns mecanismos envolvidos na patogenicidade de vrias doenas humanas. Os camundongos de laboratrio suportam muito bem o sistema de cruzamentos consanguneos. Em ratos e camundongos, podem ser feitos acasalamentos entre irmos durante vrias geraes, obtendo, assim, populaes muito homogneas do ponto de vista gentico. Essas populaes so denominadas linhagens consanguneas e, quando acasaladas entre si durante 20 geraes, so denominadas isognicas (GODARD & GUNET, 1999). As linhagens isognicas so muito estveis e geneticamente padronizadas, pois apresentam formas allicas homozigticas para todos os loci do genoma e o conjunto de alelos que compe o genoma so distribudos de forma aleatria. 18

Um fator importante a ser considerado que todas as linhagens consanguneas de camundongos de laboratrio derivam de um pequeno nmero de genitores. Do ponto de vista gentico, isso significa que as diferenas entre os genomas das vrias linhagens so tambm reduzidas. Esse fato se constitui em uma grande vantagem, pois permite avaliar a importncia de regies do genoma por meio de acasalamentos programados. Linhagens consanguneas podem apresentar uma grande variabilidade de respostas em relao a agentes infecciosos. Nesse caso, observado que, enquanto algumas linhagens so susceptveis infeco de um agente patognico, outras so resistentes a ele (GODARD & GUNET, 1999). Considerando a variao de susceptibilidade ao Trypanosoma cruzi apresentada por diversas linhagens de camundongos, possvel estabelecer alguns parmetros da fase aguda quando a evoluo do parasitismo encontra um background gentico susceptvel ou resistente (PASSOS, 2003). Passos et al. (2002) desenvolveram uma linhagem de camundongo recombinante congnica por meio do acasalamento programado das prognies obtidas de duas linhagens isognicas com fentipos distintos de resistncia cepa Y do T. cruzi (C57BL/6/JUnib - resistente e A/JUnib - susceptvel). A linhagem recombinante congnica, dotada de um background susceptvel, apresenta fentipo de alta resistncia ao parasito, graas transferncia de regies importantes dos cromossomos 7, 11, 14, 17 e 19. O uso de modelos animais para o estudo da infeco por Trypanosoma cruzi foi estabelecido por Carlos Chagas (CHAGAS, 1909) e, at 1940, cobaias, ces, coelhos, macacos e tambm camundongos, foram utilizados para o estudo da infeco experimental. A partir de 1960, provavelmente por influncia do intenso uso de camundongos como modelo bsico em estudos de imunologia geral, bem como pela facilidade e pelo baixo custo de manuteno desses animais em biotrio, os trabalhos com infeco experimental por T. cruzi acumularam-se no modelo do camundongo (CABEZA-MECKERT & LAGUENS, 1994). Caractersticas importantes desse modelo so a heterogeneidade do curso e a intensidade da infeco e das leses em diferentes populaes (raas, cepas), que se expressam na distino entre modelos resistentes e susceptveis a condies similares 19

de infeco. Essas caractersticas, j apontadas na dcada de 1940 (PIZZI et al., 1948), foram exploradas quanto ao mapeamento gentico da resistncia durante as dcadas de 1970 e 1980 (JURI et al., 1990) e at hoje so utilizadas para facilitar estudos sobre as caractersticas da resposta imune inata e adquirida. Os padres de resistncia e susceptibilidade infeco, medidos por meio de taxas de mortalidade, tempo de sobrevida e nveis de parasitemia, dependem da conjuno das cepas do camundongo e do parasito, o que implica que qualquer estudo tenha de ser interpretado luz do modelo usado (ARAJO-JORGE, 2000). Como a doena humana tambm varia desde formas assintomticas e muito brandas at as muito severas e letais, o fato de o camundongo apresentar fentipos heterogneos quanto resistncia infeco o torna um modelo adequado. As diferentes combinaes de cepa de camundongo com cepa/clone de parasito tendem a se distribuir nesse espectro quando analisados diversos parmetros, sejam eles parasitolgicos, imunolgicos, histopatolgicos, eletrofisiolgicos ou bioqumicos (ARAJO-JORGE, 2000). Modelos animais portadores das mais variadas expresses fenotpicas passaram a compor o repertrio de animais disponibilizados, destacando-se as linhagens portadoras de deficincias imunolgicas, principalmente os scid (BOSMA et al., 1983). A imunodeficincia severa combinada ou severe combined immunodeficiency disease (scid) foi descrita pela primeira vez em cavalos da raa rabe por McGuire & Poppie (1973) e posteriormente foram reconhecidos diferentes tipos que afetam diversas espcies como equinos, ces, camundongos e o homem (McGUIRE & POPPIE, 1973; BOSMA et al., 1983; CUSTER et al., 1985; SOMBERG et al., 1995). A doena est inserida em um grupo de raras deficincias congnitas, caracterizadas pela ausncia de um sistema imunolgico funcional (BOSMA et al., 1983) e associa-se a um aumento da susceptibilidade a infeces. Em humanos, popularmente conhecida como sndrome do menino da bolha, ocorre nos primeiros meses de vida e pode levar morte (BOWLING, 1996; REED & BAYEY, 1998). Em camundongos, ocasionada por uma mutao pontual recessiva do gene Prkdc localizado no cromossomo 16, a qual os torna deficientes em linfcitos T e B funcionais, que so as clulas especializadas na defesa do organismo contra infeces 20

por vrus, bactrias e fungos (BOWLING, 1996; REED & BAYEY, 1998), embora apresentem clulas granulocticas e natural killer (NK) normais (BOSMA et al., 1989), o que garante a sobrevivncia e proteo por interferon gama. Dessa maneira, a escolha dos scid para esta pesquisa foi estratgica, pois dada a sua alta susceptibilidade, favorece a deteco de formas tripomastigotas do parasito e pode trazer contribuies interessantes para a avaliao da DCA.

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3. OBJETIVOS

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3.1. Objetivo geral Esclarecer eventos relacionados transmisso oral do Trypanosoma cruzi, por meio da ingesto de polpa de aa, mediante a infeco experimental de camundongos isognicos imunodeficientes com a polpa contaminada, mantida por diferentes perodos de incubao e tratamentos trmicos. 3.2. Objetivos especficos Desenvolver uma metodologia de isolamento de formas tripomastigotas da cepa Y do Trypanosoma cruzi presente na polpa de aa; Estudar a sobrevivncia do Trypanosoma cruzi na mistura com a polpa de aa; Avaliar in vivo a viabilidade e a virulncia do T.cruzi aps sua permanncia na polpa, em diferentes perodos de incubao e sob diversos tratamentos trmicos; Analisar o poder de infeco do T. cruzi e comparar diferentes vias de administrao; Avaliar a evoluo da fase aguda da doena experimental, por meio de infeces por diferentes vias com formas tripomastigotas recuperadas da polpa de aa, submetidas a diferentes perodos de incubao e tratamentos trmicos.

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4. MATERIAL E MTODO

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4.1. O parasito Para os testes de sobrevivncia e infeco foi utilizada a cepa Y de Trypanosoma cruzi, proveniente do Centro Multidisciplinar de Investigao Biolgica na rea de Cincia de Animais de Laboratrio da Universidade Estadual de Campinas (CEMIB/UNICAMP), cedidas pelo Prof. Dr. Luiz Augusto Corra Passos. As formas tripomastigotas foram utilizadas na contaminao da polpa e na infeco dos camundongos. A manuteno in vivo dos tripomastigotas foi realizada semanalmente, em camundongos CBA/JUnib mantidos em unidades isoladoras e periodicamente a cepa Y foi congelada em nitrognio lquido. A parasitemia foi determinada mediante a contagem de tripomastigotas no sangue dos camundongos, segundo metodologia preconizada por Brener (1962). 4.2. Os animais Para a realizao dos experimentos, foram utilizados camundongos

imunodeficientes da linhagem C.B-17-Prkdcscid/PasUnib (scid) oriundos de colnias do CEMIB/UNICAMP, machos e fmeas, entre oito e 12 semanas de idade, com peso mdio de 30 g e marcados por amputao de falange por ocasio do desmame. Todos os procedimentos com animais obedeceram aos Princpios de tica na Experimentao Animal do Colgio Brasileiro de Experimentao Animal/Sociedade Brasileira da Cincia de Animais de Laboratrio (COBEA/SBCAL), de acordo com protocolo experimental n 1569-1 submetido Comisso de tica na Experimentao Animal (CEEA/UNICAMP) e aprovado em 30 de Junho de 2008 (Anexo 9.3, Figura 22). 4.3. A polpa de aa A polpa in natura de aa utilizada era proveniente do comrcio local da cidade de Belm (PA) e congelada para transporte. Assim que chegou ao laboratrio foi distribuda em alquotas de 50mL, em cmara de fluxo laminar, e mantida em freezer a 25

-20C at o momento de uso. Na data da utilizao, cada alquota foi descongelada e, quando necessrio, foi submetida ao processo de autoclavagem, a 121C durante 20 minutos, antes dos procedimentos experimentais. 4.4. Procedimentos experimentais 4.4.1. Isolamento das formas de T. cruzi presentes na polpa de aa Para a escolha da melhor metodologia para a recuperao dos parasitos da polpa, foram realizados dois procedimentos: centrifugao e tamisao forada, precedidos de um pr-teste. 4.4.1.1. Pr-teste Uma quantidade conhecida de parasitos (105 tripomastigotas), obtida de camundongos CBA/JUnib infectados, foi misturada diretamente polpa de aa e tambm ao sobrenadante da polpa, previamente centrifugada a 705,6g. A atividade dos parasitos foi observada por microscopia ptica comum, em triplicata, com e sem colorao vital pelo Azul de Trypan, em intervalos regulares de 15 minutos, por um perodo de 15 a 60 minutos, aps o contato inicial da polpa ntegra ou de seu sobrenadante com os parasitos e aps a homogeneizao das amostras. 4.4.1.2. Teste de isolamento do parasito por centrifugao Foram utilizadas misturas de polpa e plasma (duas partes de polpa para cada uma parte de plasma contaminado) distribudas em tubos tipo eppendorf de 1,5mL e centrifugadas a 313,6g e 1254,4g, em microcentrfuga Heraeus Biofuge, durante intervalos de tempo compreendidos entre trs e cinco minutos. A primeira fase do teste foi realizada apenas com a polpa no contaminada pelo tripomastigota. Etapas da primeira fase do teste: 26

1. primeiramente, foi realizada uma autoclavagem da polpa de aa; 2. em seguida, foi feita a decantao de uma alquota da polpa, a fim de separar os elementos de diferentes densidades, sendo a fase superficial investigada por microscopia ptica comum para excluir a presena de T. cruzi; 3. essa frao superficial foi, ento, centrifugada sob diferentes condies; Na segunda fase do teste, foram realizadas as seguintes etapas com o parasito: 4. quantificao dos parasitos recolhidos no sobrenadante (plasma sanguneo) pelo mtodo de Brener (1962), aps a centrifugao do sangue obtido de camundongos previamente infectados com a cepa Y de T. cruzi, a 705,6g, durante cinco minutos; 5. produo da mistura pelo depsito de uma quantidade conhecida de parasitos (105 tripomastigotas) na polpa; 6. centrifugao da mistura nas condies estabelecidas previamente; 7. recuperao e anlise do sobrenadante da mistura (viabilidade e contagem). 4.4.1.3. Teste de isolamento do parasito por tamisao forada A) Preparo da coluna de tamisao Uma segunda metodologia utilizada para o isolamento do parasito foi a tamisao forada ou sob presso do mbolo, uma tcnica de filtrao adaptada no CEMIB/UNICAMP: Para a sua realizao, foram confeccionadas colunas com seringas de 3mL (Figura 3) e sua montagem se processou em cmara de fluxo laminar, como ser explicado a seguir: Primeiramente, uma camada de l de nylon estril foi depositada na base da coluna. Em seguida, foram adicionadas, intercaladamente, microesferas estreis de plstico e de metal com dimetro igual a 3mm, at aproximadamente a altura de 1/3 da coluna. Finalmente, a extremidade superior foi coberta com uma nova camada de l de nylon estril (Figura 4), antes da aplicao de cada amostra.

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Figura 3. Coluna da tamisao sob presso (arquivo pessoal). B) Aplicao das amostras

Figura 4. Detalhe da coluna com as microesferas (arquivo pessoal).

Para a realizao da tcnica, foram preparadas misturas homogeneizadas de polpa com plasma de camundongo contendo tripomastigotas, nas propores 1:2; 1:3 e 1:4, posteriormente aplicadas individualmente s colunas (Figuras 5 e 6). Durante a tamisao, uma pequena presso foi exercida sobre a mistura empregando-se o mbolo da seringa (Figura 7) e cada frao resultante, denominada eluato (o produto derivado deste processo de separao), em princpio em volumes de no mximo 50L, foi examinada individualmente, de maneira qualitativa, no microscpio ptico comum. Aps a coleta de todas as fraes, a coluna foi lavada com soluo de NaCl 0,15M e o eluato novamente examinado.

Figura 5. Coluna de tamisao e mistura (arquivo pessoal).

Figura 6. Aplicao das amostras (arquivo pessoal).

Figura 7. Obteno do eluato (arquivo pessoal).

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C) Avaliao microscpica Procedeu-se a pesquisa de tripomastigotas por microscopia ptica comum. Para tanto, um volume igual a 5L de cada uma das fraes do eluato recolhido, (Figura 8), em triplicata, foi inspecionado para a deteco da presena das formas tripomastigotas do parasito. As amostras foram recolhidas aps intervalos regulares e observadas e a quantidade de parasitos foi determinada pelo mtodo de Brener (1962). Diferentes perodos de tempo foram testados, pois inicialmente no havia um direcionamento dos intervalos de tempo para a sobrevivncia do parasito na polpa de aa.

Figura 8. Alquota de eluato para avaliao microscpica (arquivo pessoal). 4.4.2. Avaliao da interferncia da polpa de aa na sobrevivncia do Trypanosoma cruzi: testes in vitro Misturas formadas de polpa e parasito foram mantidas por at 144 horas, seja temperatura ambiente, a 4C ou a -20 C e, aps sua tamisao, o eluato obtido de cada tratamento foi inspecionado. Os resultados foram considerados segundo critrios de motilidade dos parasitos, comparando-se o padro observado para T. cruzi proveniente de plasma sanguneo, adotando-se intervalos regulares de observao por microscopia ptica comum. Os critrios adotados para classificar a atividade dos tripomastigotas foram: bem ativos (BA); ativos (A) e lentos (L). Os resultados foram expressos em porcentagem de sobrevivncia e ilustrados com registros de filmagem em vdeo. 29

4.4.3. Avaliao da influncia da polpa de aa na virulncia do Trypanosoma cruzi: testes in vivo A avaliao da capacidade da polpa para atuar na preservao da virulncia de tripomastigotas recuperados da mistura exigiu testes in vivo utilizando-se modelos animais. Os ensaios foram realizados empregando-se camundongos imunodeficientes da linhagem isognica scid. 4.4.4. Certificao do modelo animal imunodeficiente O animal da linhagem scid foi previamente certificado no CEMIB/UNICAMP quanto sua capacidade de produzir anticorpos. Os animais scid leaky, que produziram um ttulo basal de anticorpos, foram descartados. Foram selecionados os que apresentaram nvel de imunoglobulina srica inferior a 2,5L/mL, dosado pelo mtodo Immunoblot (GORDON et al., 1991). Em funo deles, os casais foram formados, os animais mantidos em unidade isoladora de presso positiva (PASSOS & ALVES, 1996) e a prognie utilizada neste projeto. 4.4.5. Manuteno dos animais A integridade sanitria e gentica dos camundongos scid foi preservada por meio de sua manuteno em condies controladas, utilizando-se unidades isoladoras flexveis e em mini-isoladores dentro de racks ventiladas ALESCO, instaladas dentro da rea experimental (Figura 9). Os animais receberam rao autoclavada Nuvital e gua ad libitum, mantidos em salas a 22C (2), com perodos de luz de 12-14 horas/24 horas (SANTOS, 2002) e umidade relativa (UR) entre 45 e 75%, de acordo com os padres internacionais (MERUSSE & LAPICHIK, 1996).

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Aps a infeco experimental, todos os animais foram mantidos com a mxima indicao de biossegurana na rea experimental e manipulados apenas por tcnico qualificado. Os animais mortos e infectados foram separados em sacos plsticos vedados e incinerados (ARAJO-JORGE & PIRMEZ, 2000).

Figura 9. Sala de alojamento dos animais com a rack ventilada e a estao de troca de mini-isoladores (arquivo pessoal). 4.4.6. Tratamento da polpa de aa Os ensaios para avaliao da interferncia da polpa na virulncia do parasito foram conduzidos utilizando polpa previamente submetida autoclavagem e tambm polpa in natura. Fundamentalmente, os mesmos procedimentos foram utilizados nos dois grupos, exceto pela adoo de um esquema prvio de tratamento com antibitico nos animais que receberam a polpa in natura. 4.4.7. Tratamento dos animais para os ensaios com a polpa de aa in natura A proteo dos camundongos foi alcanada por meio de antibioticoterapia com Cefalexina 500mg. Cada animal recebeu a dose de 1,75mg de antibitico/dia, administrada pela via intraperitonial (i.p.), por gavagem e pela via oral, diretamente na gua do bebedouro.

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4.4.7.1. Administrao do antibitico pela via intraperitonial A soluo usada para a injeo i.p. foi obtida do sobrenadante, aps a diluio das cpsulas de antibitico em gua milli-Q, centrifugada a 1960g, por cinco minutos, para a remoo do talco e substncias diferentes do princpio ativo. Os animais receberam a dose de 1,75mg/dia, dois dias antes da infeco com os T. cruzi. 4.4.7.2. Administrao do antibitico por gavagem A dose de antibitico foi administrada no dia seguinte administrao via i.p., ou seja, um dia antes da infeco com os T. cruzi. De igual maneira, foi utilizado o sobrenadante obtido na centrifugao aps a diluio das cpsulas e os animais foram monitorados por 3 a 4 horas para avaliao do sucesso da tcnica de gavagem. 4.4.7.3. Administrao do antibitico na gua do bebedouro No esquema de cobertura adotado, imediatamente aps a infeco com os tripomastigotas, foi administrado o antibitico na gua do bebedouro e o tratamento foi realizado no perodo de sete dias consecutivos. Conforme descrito, as cpsulas foram diludas, centrifugadas e ajustadas para a concentrao de 1,75mg-animal/dia, considerando o peso mdio de cada animal (30g), a ingesto mdia de gua de 15mL/100g de peso-animal/dia para camundongos (MEZADRI et al., 2004) e o volume do bebedouro (200mL). 4.4.8. Avaliao da viabilidade e do poder de infeco do T. cruzi A avaliao da viabilidade do T. cruzi foi analisada em camundongos imunodeficientes isognicos scid mediante a infeco experimental pela polpa de aa contaminada com formas tripomastigotas metacclicas do parasito e a observao durante a fase aguda da doena de Chagas. 32

O poder de infeco do T. cruzi foi analisado por meio da administrao dos inculos em grupos de camundongos relacionados a cada tipo de tratamento trmico testado e por meio de trs diferentes vias de inoculao (infeco via i.p., gavagem e oral) (Figuras 10, 11 e 12).

Figura 10. Infeco i.p. Figura 11. Infeco por gavagem Figura 12. Infeco oral (arquivo pessoal). (arquivo pessoal). (arquivo pessoal).

4.4.8.1. Verificao da parasitemia e da mortalidade O nmero de parasitos circulantes na infeco aguda foi determinado pela contagem de tripomastigotas presentes em amostras de 5L de sangue, por meio de pequena seco da ponta da cauda dos camundongos, segundo metodologia preconizada por Brener (1962), durante cinco dias consecutivos, a se iniciar a partir da data da constatao da infeco experimental. Todos os animais foram observados por um perodo mnimo de 40 dias e a mortalidade foi registrada diariamente. 4.4.9. As amostras Todos os procedimentos, desde a coleta dos parasitos at as infeces experimentais, foram realizados em cmara de fluxo laminar. A composio das amostras utilizadas nos ensaios in vitro e in vivo descrita a seguir:

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4.4.9.1. Controle negativo Alquotas contendo somente polpa in natura de aa foram homogeneizadas manualmente e em seguida, submetidas temperatura de refrigerao (4C) ou ao processo de congelamento em freezer (-20C) ou ainda, mantidas temperatura ambiente por perodos de at 144 horas. Aps o tratamento trmico, quando necessrio, as misturas foram descongeladas temperatura ambiente e homogeneizadas manualmente; e seu volume total utilizado para a infeco experimental pela via oral. Dada a necessidade, aps o descongelamento e a homogeneizao manual, outras amostras passaram pelo processo de tamisao forada e o eluato obtido foi inoculado pelas vias intraperitonial ou por gavagem. 4.4.9.2. Controle positivo Fraes de plasma contaminado com 105 tripomastigotas com a cepa Y de T. cruzi, obtido de animais CBA/JUnib, foram homogeneizadas manualmente e observadas por microscopia ptica comum, em triplicata, segundo o mtodo de Brener (1962). As formas tripomastigotas foram classificadas de acordo com os critrios de motilidade preestabelecidos, para confirmao da sua viabilidade em relao aos perodos de incubao e tratamento trmico ao quais seriam submetidas. Posteriormente, diferentes amostras do plasma contaminado foram mantidas temperatura ambiente ou temperatura de refrigerao (4C) ou ainda, submetidas ao processo de congelamento em freezer (-20C) por perodos de at 144 horas. Logo em seguida, as alquotas foram descongeladas temperatura ambiente, quando necessrio, e aps nova homogeneizao manual, as lminas preparadas foram examinadas, em triplicata, seguindo a metodologia anteriormente descrita. As formas tripomastigotas foram quantificadas e classificadas de acordo com critrios de motilidade preestabelecidos (bem ativo, ativo ou lento), para a

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avaliao da sobrevivncia do parasito, dados o perodo de incubao e tratamento trmico aos quais foram submetidas. Finalmente, o volume total restante de plasma mantido por diferentes perodos de incubao (por at 144 horas), foi individualmente utilizado para a infeco experimental, obedecendo a via de administrao de cada grupo experimental, de modo a permitir a avaliao da virulncia e do poder de infeco do parasito. 4.4.9.3. Grupos teste: eluato Os grupos teste foram constitudos pelas misturas compostas de polpa de aa e de formas tripomastigotas, respectivamente, na proporo 1:3. Trs partes de plasma contaminado com 105 tripomastigotas da cepa Y de T. cruzi, obtido de animais CBA/JUnib, foram homogeneizadas manualmente e analisadas por microscopia ptica comum, em triplicata, segundo o mtodo de Brener (1962) para determinar a quantidade de parasitos existentes na mistura a ser formada com a polpa. Em seguida, uma parte de polpa de aa foi adicionada a cada alquota de plasma. As misturas formadas foram devidamente homogeneizadas manualmente e mantidas temperatura ambiente ou submetidas temperatura de refrigerao (4C) ou ainda, ao processo de congelamento em freezer (-20C) por perodos de at 144 horas. Aps o tratamento trmico, as misturas foram descongeladas temperatura ambiente, quando necessrio, e em seguida a nova homogeneizao manual, foi realizado o processo de tamisao forada. O produto obtido da tamisao foi homogeneizado manualmente e a inspeo direta das formas tripomastigotas foi determinada quantitativamente, de acordo com os critrios de motilidade preestabelecidos, em triplicata, com 5L cada, em lminas examinadas por microscopia ptica comum, seguindo a metodologia proposta por Brener (1962), para a avaliao da sobrevivncia do parasito, dadas as condies de tratamento.

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Logo em seguida, foram feitas duas lavagens sucessivas para cada coluna de tamisao com soluo de NaCl 0,15M. O contedo juntou-se ao eluato j recolhido e, finalmente, aps nova homogeneizao manual, o volume total foi utilizado na infeco experimental, obedecendo via de administrao de cada grupo experimental. 4.4.9.4. Grupos teste: mistura O tratamento dado ao grupo teste mistura foi semelhante ao procedimento adotado para o grupo teste eluato. As amostras que continham a mistura total no passaram pelo processo de tamisao forada e foram administradas aos animais apenas pela via oral. 4.4.10. Os grupos experimentais Inicialmente, foi utilizado um nmero reduzido de animais distribudos em grupos experimentais variados, classificados de acordo com a esterilizao ou no da polpa, com o perodo de incubao e com o tratamento trmico adotado para as misturas. A escolha das metodologias mais adequadas e a padronizao das tcnicas, logo aps a realizao dos experimentos preliminares, permitiram a definio de grupos experimentais conforme indicado abaixo (Tabelas 1, 2 e 3), para a realizao do tratamento estatstico dos dados obtidos e da anlise da evoluo da parasitemia, reagrupados de acordo a via de administrao e temperatura de incubao (Anexo 9.1).

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Tabela 1. Formao do grupo experimental utilizando polpa in natura, com a mistura mantida por 24 horas temperatura ambiente, demonstrando as variveis e o nmero de animais. Condio da polpa de aa Tempo e temperatura de incubao da mistura Volume do inculo/ animal Controle Negativo (Eluato) Controle 24 h In natura Temperatura ambiente 100 L Grupo Teste (Eluato) Grupo Teste (Mistura) Oral 5 5 Positivo i.p. Gavagem Oral i.p. Gavagem Oral i.p. Gavagem Oral 1 1 1 1 1 1 5 5 5 1 1 1 1 1 1 5 5 5 Inculo Via de administrao Nmero de animais Macho Fmea

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Tabela 2. Formao do grupo experimental utilizando polpa in natura, com a mistura mantida por 24 horas 4C, demonstrando as variveis e o nmero de animais. Condio da polpa de aa Tempo e temperatura da mistura Volume do animal Controle Negativo (Eluato) Controle 24 h In natura 4C 100 L Grupo Teste (Eluato) Grupo Teste (Mistura) Oral 5 5 Positivo i.p. Gavagem Oral i.p. Gavagem Oral i.p. Gavagem Oral 1 1 1 1 1 1 5 5 5 1 1 1 1 1 1 5 5 5 Inculo Via de administrao Nmero de animais Macho Fmea

de incubao inculo/

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Tabela 3. Formao do grupo experimental utilizando polpa in natura, com a mistura mantida por 24 horas -20C, demonstrando as variveis e o nmero de animais. Condio da polpa de aa Tempo e temperatura da mistura Volume do animal Controle Negativo (Eluato) Controle 24 h In natura -20C 100 L Grupo Teste (Eluato) Grupo Teste (Mistura) 4.5. Anlise estatstica Os resultados da anlise de sobrevivncia do Trypanosoma cruzi foram expressos em porcentagem de sobrevivncia, em relao motilidade e ao tempo de exposio na polpa de aa. Para os testes da virulncia do parasito, os valores foram submetidos a anlises de mdia e desvio padro considerando a constatao da infeco experimental e a data da mortalidade dos animais, expressa em dias aps a infeco (d.a.i.). Oral 5 5 Positivo i.p. Gavagem Oral i.p. Gavagem Oral i.p. Gavagem Oral 1 1 1 1 1 1 5 5 5 1 1 1 1 1 1 5 5 5 Inculo Via de administrao Nmero de animais Macho Fmea

de incubao inculo/

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A anlise estatstica dos grupos experimentais foi realizada pelo software Statistical Analysis System (SAS) para Windows (2007), utilizando ANOVA quatro fatores para o teste de Comparaes Mltiplas a posteriori de Duncan, com 99% de confiana.

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5. RESULTADOS

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Seguem os resultados obtidos durante os ensaios in vivo e in vitro envolvendo a polpa de aa contaminada por T. cruzi, mantidos por diferentes perodos de incubao e submetidos a diferentes tratamentos trmicos. 5.1. Pr-teste Por um lado, o depsito de 105 formas de tripomastigotas diretamente na polpa de aa no permitiu a visualizao dos parasitos durante a inspeo microscpica, com e sem colorao vital pelo Azul de Trypan. Por outro lado, a utilizao do sobrenadante da polpa de aa permitiu a visualizao dos parasitos com sua motilidade caracterstica. A observao de 100% das formas tripomastigotas bem ativas indicou que o contato com a polpa no promoveu a morte imediata do parasito, tampouco nos 15, 30, 45 e 60 minutos seguintes. 5. 2. Testes de isolamento das formas de T. cruzi na polpa de aa Os resultados foram analisados de maneira qualitativa, visando avaliar a eficincia do mtodo no isolamento das formas de T. cruzi da polpa aa. 5. 2. 1. Mtodo de centrifugao Aps a centrifugao, foi possvel a observao dos parasitos em ensaios com volumes reduzidos da mistura, porm o rendimento dessa tcnica foi muito baixo e, por isso, a metodologia em questo no se mostrou eficiente no isolamento dos parasitos. 5. 2. 2. Mtodo da tamisao forada O mtodo que se mostrou adequado ao isolamento de tripomastigotas presentes na mistura foi a tamisao forada. Os resultados demonstraram que a

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pequena presso exercida sobre a mistura facilitou a separao das fases slida e lquida da polpa. Paralelamente, a tcnica proporcionou a livre passagem dos parasitos ao longo da coluna e permitiu que eles fossem obtidos em sua totalidade junto na fase lquida, por meio da coleta do eluato. 5.3. Avaliao da interferncia da polpa de aa na sobrevivncia do T. cruzi: testes in vitro A avaliao da interferncia da polpa de aa na sobrevivncia do T. cruzi foi realizada por meio de testes in vitro, utilizando polpa de aa autoclavada e in natura, mantida por diferentes perodos de incubao e tratamentos trmicos. 5.3.1. Sobrevivncia do T. cruzi em polpa de aa autoclavada e mantida temperatura ambiente: A mistura de polpa de aa e plasma com T. cruzi (1:3) contendo 105 tripomastigotas foi mantida temperatura ambiente por 6, 18, 24, 42 e 48 horas para a observao de parasitos em movimento. Aps a tamisao forada da mistura, os eluatos foram analisados por microscopia ptica comum segundo os critrios de motilidade adotados. Aps 6 horas de incubao, 100% dos tripomastigotas estavam bem ativos; aps 18 horas, 70,0% estavam bem ativos e 30,0% ativos; aps 24 horas, 60,0% estavam ativos e 40,0% lentos; aps 42 horas foram encontrados 33,3% ativos e 66,7% lentos e aps 48 horas, 100% lentos (Tabela 4).

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Tabela 4. Sobrevivncia da cepa Y do T. cruzi na mistura com polpa de aa autoclavada e contaminada com 105 tripomastigotas na proporo 1:3, observada no tempo inicial e aps um perodo de incubao de at 48 horas, mantida temperatura ambiente. Motilidade Bem Ativo (BA) Ativo (A) Lento (L) 6h (%) 100 0 0 Grupo Teste (Eluato) 18 h 24 h 42 h (%) (%) (%) 70,0 0 0 30,0 60,0 33,3 0 40,0 66,7 48 h (%) 0 0 100

5.3.2. Sobrevivncia do T. cruzi em polpa in natura de aa e mantida a 4 C A sobrevivncia de formas tripomastigotas na polpa de aa mantida a 4 C foi observada por perodos de 7, 24, 30, 48 e 144 horas. Foi utilizada a mesma proporo da mistura (1:3) com 105 tripomastigotas e aps 7 horas, os eluatos obtidos apresentaram 100% de tripomastigotas bem ativos; aps 24 horas, 50,0% bem ativos, 42,0% ativos e 8,0% lentos; aps 30 horas, 40,0% bem ativos e 60,0% ativos; aps 48 horas, 54,5% bem ativos e 45,5% ativos e aps 144 horas, 100% ativos (Tabela 5). Tabela 5. Sobrevivncia da cepa Y do T. cruzi na mistura com polpa de aa in natura e contaminada com 105 tripomastigotas na proporo 1:3, observada no tempo inicial e aps um perodo de incubao de at 144 horas, mantida a 4C. Grupo Teste (Eluato) 24 h 30 h 48 h (%) (%) (%) 50,0 40,0 54,5 42,0 60,0 45,5 8,0 0 0

Motilidade Bem Ativo (BA) Ativo (A) Lento (L)

7h (%) 100 0 0

144 h (%) 0 100 0

5.3.3. Sobrevivncia do T. cruzi em polpa in natura de aa e mantida a -20 C Considerando o perodo de incubao de at 26 horas, no foram encontrados parasitos no eluato das misturas descongeladas. 44

5.4. Avaliao da interferncia da polpa de aa na virulncia do T. cruzi: testes in vivo A influncia do contato com a polpa de aa sobre a integridade, viabilidade e virulncia do T. cruzi foi analisada por meio de experimentos in vivo. 5.4.1. Mistura produzida com a polpa de aa autoclavada e mantida temperatura ambiente O T. cruzi misturado polpa de aa autoclavada e mantida temperatura ambiente preservou sua virulncia, em 100% dos animais scid, por at 7 horas. Nos controles negativos, no houve constatao de DCA e morte. Aps 3 horas, no controle positivo, o incio da parasitemia e a morte dos animais foram, em dias aps a infeco, respectivamente, 4,01,0 e 11,01,0 (i.p.); 7,02,0 e 14,03,0 (gavagem) e 9,02,0 e 15,02,0 (oral). Os animais do grupo teste que receberam o eluato da tamisao apresentaram incio de parasitemia e morte, respectivamente, nos dias 7,01,0 e 13,00,0 (i.p.); 9,00,0 e 16,00,0 (gavagem) e 12,02,0 e 18,02,0 (oral). Aps 5 horas, no controle positivo, o incio da parasitemia e a morte dos animais foram, respectivamente, 7,01,0 e 15,02,0 (i.p.); 9,01,0 e 17,02,0 (gavagem) e 13,01,0 e 19,03,0 (oral). Os animais do grupo teste que receberam o eluato da tamisao apresentaram incio de parasitemia e morte, respectivamente, nos dias 8,00,0 e 17,01,0 (i.p.); 11,00,0 e 20,01,0 (gavagem) e 12,01,0 e 20,01,0 (oral). Aps 7 horas, no controle positivo, o incio da parasitemia e a morte dos animais foram, respectivamente, 7,02,0 e 18,03,0 (i.p.); 10,02,0 e 20,00,0 (gavagem) e 12,02,0 e 21,01,0 (oral). Os animais do grupo teste que receberam o eluato da tamisao apresentaram incio de parasitemia e morte, respectivamente, nos dias 8,01,0 e 19,02,0 (i.p.); 12,00,0 e 22,01,0 (gavagem) e 14,02,0 e 23,02,0 (oral). J os animais do grupo teste que receberam a mistura total pela via oral apresentaram incio de parasitemia e morte, respectivamente, nos dias 14,01,0 e 23,01,0

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(Tabela 6), sendo observado um retardo na parasitemia da infeco oral em relao s demais vias de administrao. Tabela 6. Resultados da constatao da infeco pelo tempo de incio da parasitemia e de mortalidade em camundongos scid infectados por diferentes vias de inoculao com polpa de aa autoclavada e contaminada com 105 tripomastigotas da cepa Y do T. cruzi na proporo 1:3, mantida por 3, 5 e 7 horas temperatura ambiente. Perodo de Incubao (h) Controle Negativo (Eluato) Controle 3 Positivo Grupo Teste (Eluato) Controle Negativo (Eluato) Controle 5 Positivo Grupo Teste (Eluato) i.p. Gavagem Oral i.p. Gavagem Oral i.p. Gavagem Oral i.p. Gavagem Oral i.p. Gavagem Oral i.p. Gavagem Oral 0/1 0/1 0/1 2/2 2/2 2/2 2/2 2/2 2/2 0/1 0/1 0/1 2/2 2/2 2/2 2/2 2/2 2/2 0 0 0 100 100 100 100 100 100 0 0 0 100 100 100 100 100 100 Inculo Via N infectados / N inoculados % de infeco Constatao Mortalidade da DCA* (d.a.i.)** Negativo Negativo Negativo 4,01,0 7,02,0 9,02,0 7,01,0 9,00,0 12,02,0 Negativo Negativo Negativo 7,01,0 9,01,0 13,01,0 8,00,0 11,00,0 12,01,0 0 0 0 11,01,0 14,03,0 15,02,0 13,00,0 16,00,0 18,02,0 0 0 0 15,02,0 17,02,0 19,03,0 17,01,0 20,01,0 20,01,0 (d.a.i.)

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[Continuao Tabela 6] Controle i.p. Negativo (Eluato) Controle Positivo 7 Grupo Teste (Eluato) Grupo Teste (Mistura) * DCA: doena de Chagas aguda ** d.a.i.: dias aps infeco Oral Gavagem Oral i.p. Gavagem Oral i.p. Gavagem Oral

0/1 0/1 0/1 2/2 2/2 2/2 2/2 2/2 2/2 2/2

0 0 0 100 100 100 100 100 100 100

Negativo Negativo Negativo 7,02,0 10,02,0 12,02,0 8,01,0 12,00,0 14,02,0 14,01,0

0 0 0 18,03,0 20,00,0 21,01,0 19,02,0 22,01,0 23,02,0 23,01,0

5.4.2. Tratamento combinado: mistura produzida com a polpa in natura de aa e mantida temperatura ambiente e a 4 C Um grupo de animais recebeu tratamento combinado em que a mistura permaneceu por 48 horas temperatura ambiente e depois foi mantida por 72 horas a 4 em geladeira. C, No controle negativo, no houve constatao de DCA e morte. No controle positivo, a virulncia foi preservada em 100% dos animais. O incio da parasitemia e a morte foram, respectivamente, 7,00,0 e 16,00,0 (i.p.). No grupo teste, a virulncia foi preservada em 50,0% dos animais. O incio da parasitemia e morte foram, respectivamente, nos dias 16,02,0 e 22,01,0 (i.p.) (Tabela 7).

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Tabela 7. Resultados da constatao da infeco pelo tempo de incio da parasitemia e de mortalidade em camundongos scid infectados por diferentes vias de inoculao com polpa de aa in natura e contaminada com 105 tripomastigotas da cepa Y do T. cruzi na proporo 1:3, utilizando-se tratamento trmico combinado, mantida temperatura ambiente por 48 horas e posteriormente por 72 horas a 4C. N infectados / Inculo Controle Negativo (Eluato) Controle Positivo Grupo Teste (Eluato) * DCA: doena de Chagas aguda ** d.a.i.: dias aps infeco 5.4.3. Mistura produzida com a polpa in natura de aa e mantida a 4 C Alm das anlises in vivo com a polpa autoclavada, foram realizados testes com a polpa in natura contaminada com o T. cruzi por at 144 horas. T. cruzi misturado polpa de aa in natura e mantida a 4C preservou sua virulncia, em 100% dos animais scid, por at 144 horas. Nos controles negativos, no houve constatao de DCA e morte. Aps 3 horas, no controle positivo, o incio da parasitemia e a morte dos animais foram, respectivamente, 7,02,0 e 17,01,0 (i.p.). Os animais do grupo teste que receberam o eluato da tamisao apresentaram incio de parasitemia e morte, respectivamente, nos dias 8,02,0 e i.p. 2/4 50 16,02,0 22,01,0 i.p. 2/2 100 7,00,0 16,00,0 i.p. 0/2 0 Negativo 0 Via N inoculados % de infeco Constatao da DCA* (d.a.i.)** Mortalidade (d.a.i.)

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17,02,0 (i.p.). Aps 7 horas, no controle positivo, o incio da parasitemia e a morte dos animais foram, respectivamente, 8,02,0 e 18,01,0 (i.p.). Os animais do grupo teste que receberam o eluato da tamisao apresentaram incio de parasitemia e morte, respectivamente, nos dias 11,01,0 e 19,02,0 (i.p.). Aps 24 horas, no controle positivo, o incio da parasitemia e a morte dos animais foram, respectivamente, 10,02,0 e 19,03,0 (i.p.). Os animais do grupo teste que receberam o eluato da tamisao apresentaram incio de parasitemia e morte, respectivamente, nos dias 11,03,0 e 20,02,0 (i.p.). Aps 30 horas, no controle positivo, o incio da parasitemia e a morte dos animais foram, respectivamente, 10,02,0 e 19,02,0 (i.p.). Os animais do grupo teste que receberam o eluato da tamisao apresentaram incio de parasitemia e morte, respectivamente, nos dias 10,03,0 e 18,01,0 (i.p.). Aps 48 horas, no controle positivo, o incio da parasitemia e a morte dos animais foram, respectivamente, 10,01,0 e 19,01,0 (i.p.). Os animais do grupo teste que receberam o eluato da tamisao apresentaram incio de parasitemia e morte, respectivamente, nos dias 10,02,0 e 18,01,0 (i.p.). Aps 94 horas, no controle positivo, o incio da parasitemia e a morte dos animais foram, respectivamente, 10,02,0 e 19,01,0 (i.p.). Os animais do grupo teste que receberam o eluato da tamisao apresentaram incio de parasitemia e morte, respectivamente, nos dias 11,03,0 e 21,02,0 (i.p.). Aps 144 horas, no controle positivo, o incio da parasitemia e a morte dos animais foram, respectivamente, 10,01,0 e 18,03,0 (i.p.). Os animais do grupo teste que receberam o eluato da tamisao apresentaram incio de parasitemia e morte, respectivamente, nos dias 9,03,0 e 19,02,0 (i.p.) (Tabela 8).

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Tabela 8. Resultados da constatao da infeco pelo tempo de incio da parasitemia e de mortalidade em camundongos scid infectados por diferentes vias de inoculao com polpa de aa in natura e contaminada com 105 tripomastigotas da cepa Y do T. cruzi na proporo 1:3, mantida por 3, 7, 24, 30, 48, 94 e 144 horas a 4C. Perodo de Incubao (h) Controle Negativo (Eluato) Controle 3 Positivo Grupo Teste (Eluato) Controle Negativo (Eluato) Controle 7 Positivo Grupo Teste (Eluato) i.p. 4/4 100 11,01,0 19,02,0 i.p. 4/4 100 8,02,0 18,01,0 i.p. 0/2 0 Negativo 0 i.p. 4/4 100 8,02,0 17,02,0 i.p. 2/2 100 7,02,0 17,01,0 i.p. 0/2 0 Negativo 0 Inculo Via N infectados / N inoculados % de infeco Constatao da DCA* (d.a.i.)** Mortalidade (d.a.i.)

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[Continuao Tabela 8] Controle Negativo (Eluato) Controle 24 Positivo Grupo Teste (Eluato) Controle Negativo (Eluato) Controle 30 Positivo Grupo Teste (Eluato) Controle Negativo (Eluato) Controle 48 Positivo Grupo Teste (Eluato) i.p. 4/4 100 10,02,0 18,01,0 i.p. 2/2 100 10,01,0 19,01,0 i.p. 0/2 0 Negativo 0 i.p. 4/4 100 10,03,0 18,01,0 i.p. 4/4 100 10,02,0 19,02,0 i.p. 0/2 0 Negativo 0 i.p. 4/4 100 11,03,0 20,02,0 i.p. 4/4 100 10,02,0 19,03,0 i.p. 0/2 0 Negativo 0

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[Continuao Tabela 8] Controle Negativo (Eluato) Controle 94 Positivo Grupo Teste (Eluato) Controle Negativo (Eluato) Controle 144 Positivo Grupo Teste (Eluato) * DCA: doena de Chagas aguda ** d.a.i.: dias aps infeco 5.4.4. Mistura produzida com a polpa autoclavada e polpa in natura de aa mantidas a -20C Foram realizados, ainda, testes com polpa autoclavada e polpa in natura, contaminadas com o T. cruzi e submetidas ao processo de congelamento (-20C) por 26 horas. O T. cruzi misturado polpa de aa autoclavada e mantida a -20C preservou sua virulncia, em 100% dos animais scid, por at 7 horas (i.p.). Nos controles negativos, no houve constatao de DCA e morte. Aps 4 horas, no controle positivo, o incio da parasitemia e a morte dos animais foram, respectivamente, 9,00,0 e 22,00,0 (i.p.). Os animais do grupo teste que 52 i.p. 4/4 100 9,03,0 19,02,0 i.p. 4/4 100 10,01,0 18,03,0 i.p. 0/2 0 Negativo 0 i.p. 4/4 100 11,03,0 21,02,0 i.p. 4/4 100 10,02,0 19,01,0 i.p. 0/2 0 Negativo 0

receberam o eluato da tamisao apresentaram incio de parasitemia e morte, respectivamente, nos dias 7,01,0 e 16,01,0 (i.p.). Aps 5 horas, no controle positivo, o incio da parasitemia e a morte dos animais foram, respectivamente, 8,00,0 e 17,00,0 (i.p.) e 11,02,0 e 20,03,0 (gavagem). Os animais do grupo teste que receberam o eluato da tamisao apresentaram incio de parasitemia e morte, respectivamente, nos dias 10,03,0 e 17,02,0 (i.p.). Aps 7 horas de congelamento, a vir