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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁPRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

DIRETORIA DE PESQUISA

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA

RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO

Período: Agosto de 2014 a Agosto de 2015

( ) PARCIAL(X) FINAL

IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO

Título do Projeto de Pesquisa: Conservação de recursos zoogenéticos: produção in vitro de embriões de Pecari tajacu

Nome do Orientador: Hilma Lúcia Tavares Dias

Titulação do Orientador: doutorado

Unidade: Núcleo de Ciências Agrárias e Desenvolvimento Rural - NCADR

Laboratório: Laboratório de Tecnologia Biomolecular

Título do Plano de Trabalho: Avaliação da qualidade microbiológica de sushi comercializado na região metropolitana de Belém, Pará.

Nome do Bolsista: Blenda Manueli Simões

Tipo de Bolsa:( ) PIBIC/CNPq( ) PIBIC/CNPq-AF( x ) PIBIC/UFPA( ) PIBIC/UFPA-AF

( ) PIBIC/INTERIOR( ) PIBIC/FAPESPA( ) PARD( ) PARD – renovação( ) PADRC( ) Bolsistas PIBIC do edital CNPq 001/2007

Resumo do Projeto de Pesquisa: Atualmente, a Amazônia está no centro das

discussões sobre a conservação ambiental, assim como dos conflitos agrários,

uma vez que o índice de desenvolvimento humano (renda, educação e saúde)

desta região é considerado um dos mais baixos do Brasil (PUDN-ONU, 2012).

Em parte, esses problemas sócio-ambientais são reflexos da política de

desenvolvimento econômico adotado no passado para a região, a qual foi

baseada fundamentalmente em grandes latifúndios para a pecuária e no

comércio da madeira, e mais recentemente na exploração mineral. Entretanto, é

possível diminuir ou mesmo excluir alguns problemas enfrentados atualmente

nesta região, quer seja do ponto de vista ambiental, social ou econômico, por

meio do desenvolvimento e da difusão do conhecimento sobre

processos/atividades alternativos e rentáveis. Neste contexto, a exploração

racional da rica biodiversidade em benefício das comunidades é de fundamental

importância. As espécies autóctones, adaptadas as condições locais, são

geneticamente importantes e ideais para o manejo ou a criação. Em estudo

sobre os produtos florestais não madeireiros, a FAO (1999) afirma que o Brasil,

em especial a região Amazônica, possui uma grande quantidade destes recursos

genéticos. Entre esses há uma lista de animais da fauna nativa de interesse em

bioprospecção. Algumas espécies da fauna silvestre como o caititu (Pecari

tajacu), a capivara (Hydrochoerus hydrochaeris), a cutia (Dasyprocta sp.), a paca

(Cuniculus paca) e alguns quelônios são amplamente utilizados para o consumo

de carne e/ou ovos (Bonaudo et al., 2005; Pezzuti et al., 2004, 2010). Em

relação à biodiversidade de pouco adiantará possuí-la se não for possível

conhecê-la e utilizá-la em melhorias para a sociedade (Rumpf et al., 2000). O

uso da biotecnologia da reprodução possibilita a conservação da diversidade

biológica, sendo mais um recurso para evitar a perda das espécies (Barbosa,

2001). O caititu (Pecari tajacu) é um dos animais mais caçados na Amazônia

para alimentação humana e a sua criação em cativeiro é um instrumento legal

para a comercialização. Apesar do interesse na criação, há poucos dados sobre

a sua biologia, o que dificulta o aumento da produção desta espécie. Diante do

exposto, torna-se importante e necessário a aplicação de pesquisa na área da

reprodução animal que contribuam para o aumento na oferta produtiva, e

auxiliem o desenvolvimento sustentado da Amazônia.

INTRODUCAO

Nos últimos anos houve um grande aumento no consumo de sushi, e

diante da presença de um estimável número de agentes zoonóticos, os

pesquisadores e as autoridades sanitárias passaram a refletir sobre tal consumo

(SILVA & SOUZA, 2003). Entretanto, juntamente com o crescimento desses

serviços observa-se que os alimentos ficaram mais expostos a diversos perigos

ou oportunidades de contaminações microbianas associadas a práticas

incorretas de manipulação e processamento. Pois nos últimos anos tem se

mostrado cada vez mais comum, em diversos países casos de doenças

veiculadas por alimentos de etiologia variados muitas vezes por contaminação

da matéria prima ou do produto para o consumo.

O sushi por ser um prato preparado com pescado cru e é considerado um

produto altamente perecível não só porque é consumido in natura apenas

ligeiramente resfriado, mas também pelos aspectos higiênicos – sanitários

envolvidos na sua preparação e conservação os quais exigem cuidados e

conhecimento (VIEIRA et al., 2006). E ainda, o pescado é um excelente alimento

equilibrado e rico em vários nutrientes essenciais, pelo que os microrganismos

não têm qualquer dificuldade de crescimento neste meio (VAZ- PIRES,2006). Os

microrganismos representam uma ameaça à segurança dos alimentos, pois

podem ser causadores de doenças de origem alimentar.

A captura de pescado contaminado com microrganismos potencialmente

patogênicos (Salmonella, Shigella, E.coli e vírus entéricos) podem oferecer

riscos, porque baixas doses infectantes são capazes de provocar doenças de

origem alimentar. Os alimentos que possuem este tipo de contaminação

poderiam eliminar os riscos destes microrganismos através da temperatura,

entretanto, a principal preocupação com segurança alimentar relaciona-se com o

consumo destes alimentos crus, como no caso do sushi e sashimi (HUSS et al.,

2000). Segundo Vaz Pires (2006), o pescado sofre diversas alterações após a

sua morte, destacando-se alterações sensoriais, químicas, físicas,

microbiológicas. Todas estas formas de degradação estão interligadas e não são

facilmente distinguíveis entre si (GUZMÁN, 1998).

Dentre as patogenias que podem ser transmitidas por esses pratos estão

as salmoneloses, causadas pelas bactérias do gênero Salmonella, o qual é

considerado o principal agente etiológico de doenças transmitidas por alimentos

no mundo (CDC,1999). A ocorrência de Salmonella em pescados de origem

marinha tem vindo a ser comunicada e representa perigo para a saúde publica, e

predomina nas aguas poluídas por esgotos. Como consequência direta da

manipulação inadequada é apontada Staphylococcus aureus, de origem

humana, encontrado nas mucosas e superfície da pele, e que encontra no

pescado um ambiente favorável para sua multiplicação (COSTA et al., 2007). A

presença de S. aureus em pescados e seus subprodutos ocorrem durante o

processamento pelo contato com as mãos do manipulador sem que sofram

modificações em sua aparência e sabor.

As analises microbiológicas permitem detectar a presença de bactérias

patogênicas, de microrganismos indicadores de contaminação fecal ou até de

eventuais práticas de manuseio deficiente (HUSS, 2000).

JUSTIFICATIVAReconhecendo os riscos que envolvem a venda de sushi por serem

pratos preparados com pescado cru e também pelos aspectos higiênicos –

sanitários envolvidos em sua preparação e conservação (MENEZES, 2006), a

Agência Nacional de Vigilância Sanitária estabeleceu valores de referencia para

estabelecer os padrões microbiológicos sanitários para alimentos. E diante de

diversas ocorrências, de que estes pratos causaram à saúde publica em

diversas regiões brasileiras como em Cariri no Ceará, pelo menos 30 pessoas

foram hospitalizadas após consumirem sushi e apresentarem sintomas de

intoxicação alimentar. Recentemente em Belém foi encontrado em sushi

adquirido em restaurante de culinária japonesa, larvas e que possivelmente

podem ser sinais de má manipulação podendo até mesmo, conter outros micro-

organismos não visíveis a olho nu.

Um alimento produzido ou manipulado com condições precárias de

higiene pode oferecer riscos à saúde de quem o ingere. Alguns microrganismos

que podem contaminar os alimentos são patogênicos, causando doenças em

seu hospedeiro. Outros não causam enfermidades nos seres humanos, mas são

indícios de condições higiênicas inadequadas, e sua presença sugere a

existência de outros microrganismos (BASTI et al., 2006). Dentre os

microrganismos destaca-se a bactéria Staphylococcus aureus, em que alguns

casos produzem uma enterotoxina termoestável, responsável no homem pelo

quadro de intoxicação alimentar.

A contaminação de alimentos por bactérias Gram-negativas patogênicas

ao homem é de grande interesse do ponto de vista da saúde publica. Nos

alimentos o estudo desta bactéria é de extrema importância, não apenas como

deteriorante, mas também sendo considerado o melhor indicador de sua

contaminação fecal. O reservatório natural da Salmonella é o trato intestinal de

mamíferos, aves e repteis e podem alcançar o ambiente aquático através da

contaminação fecal, desta forma serem detectadas em peixes e produtos

pesqueiros.

Neste contexto é ressaltado que, a avaliação microbiológica dos

alimentos constitui-se em um dos parâmetros mais importantes para se

determinar a qualidade e sanidade dos alimentos, e é igualmente relevante para

verificar se padrões e especificações microbiológicas nacionais e internacionais

estão sendo atendidas (ROÇA, 1994).

A conservação e higiene dos equipamentos, a origem e a qualidade das

matérias-primas, o grau de conhecimento e o preparo dos manipuladores, os

responsáveis técnicos, são imprescindíveis para garantir a segurança dos

alimentos.

OBJETIVOSObjetivo geral

Avaliar a qualidade microbiológica de sushi comercializado em diferentes

pontos da cidade de Belém, Pará, observando se os resultados obtidos

encontram-se dentro dos valores permitidos pela legislação vigente.

Objetivos Específicos

o identificar e quantificar Staphylococcus aureus, microrganismos aeróbios

mesófilos, coliformes totais, termotolerantes e Salmonella sp. em sushi

comercializado na cidade de Belém-Pa;

o estabelecer a relação entre os resultados e a forma como esses pratos

são apresentados aos consumidores.

MATERIAIS E MÉTODOS

As amostras de sushi foram adquiridas em estabelecimentos

especializados e não especializados em culinária nipônica da região

metropolitana de Belém, expostas em sistemas de buffet e a qualquer horário,

realizando-se três coletas alternadas em cada estabelecimento. As amostras

foram embaladas em sacos estéreis e acondicionadas em caixa isotérmica com

gelo reciclável e conduzidas ao Laboratório de Tecnologia Biomolecular para

início das análises.

Coleta e preparo das amostras

Cerca de 200 gramas de preparações de 18 amostras de pescado cru

foram retiradas do balcão onde estavam expostas e acondicionadas em sacos

estéreis em caixa isotérmica para conservar a temperatura de exposição até a

chegada ao laboratório.

Isolamento dos microrganismos

Os procedimentos para a análise microbiológica foram realizados de

acordo com a metodologia preconizada por Métodos Analíticos Oficiais para

Análises Microbiológicas para Controle de Produtos de Origem Animal e Água

(BRASIL, 2003).

Para cada coleta, os alimentos foram homogeneizados assepticamente,

em liquidificador, a fim de formar uma mistura em proporções idênticas ao da

amostra original.

As amostras de sushi foram avaliadas, em duplicata, as seguintes

análises: determinação do Número Mais Provável (NMP) de Coliformes a 35 ºC,

Coliformes termotolerantes a 45 °C e E. coli, contagem de Staphylococcus spp.

e pesquisa de Salmonella sp.

Pesquisa de Coliformes e E. coli

A pesquisa de coliformes foi realizada através da técnica de tubos

múltiplos com série de três tubos de cada diluição seriada, até 10 -3 para

determinação do número mais provável de organismos por grama (NMP/g).

Após a homogeneização da amostra, 25 gramas da mistura inicial foram

adicionados a 225 mL de água peptonada estéril com 0,1% de NaCl e foram

realizadas as diluições sucessivas, a partir da diluição inicial (10 -1), inoculando-

se volumes de 1 mL em serie de 3 tubos contendo Lauril triptose. De cada

diluição foi transferido 1mL para três tubos contendo 9mL de Caldo Lauril triptose

estéril, com tubo de Durham invertido e incubados a 35 ºC até 48 horas. Foram

considerados positivos para coliformes totais os tubos que apresentaram

turvação e formação de gás. Com auxílio de alça microbiológica, três alçadas

foram transferidas dos tubos positivos para os tubos com 9 mL de caldo

Escherichia coli (EC) estéril e para o caldo Verde Brilhante. Após foram

incubados a 45 ºC e 35 °C, respectivamente, por até 48 horas. Foram

considerados para contagem do número mais provável (NMP) de coliformes

termotolerantes os tubos que apresentasse turvação e formação de gás.

Pesquisa de Staphylococcus sp.

Para contagem presuntiva de Staphylococcus sp. foi utilizado o método

de contagem direta em placas. A partir das diluições seriadas preparadas, foram

transferidas alíquotas de 100 µL de cada uma das diluições 10 -1 a 10-3 em placas

contendo meio Baird Parker (BP) adicionados de 5% de solução de gema de ovo

com telurito e espalhadas com alça de Drigaslski estéril. As amostras foram

incubadas por 48 horas a 37ºC. As colônias negras com bordas regulares,

apresentando halo de hidrólise foram contadas e transferidas para microtubos

com ágar Lúria semi-sólido. As cepas foram reisoladas em placas de ágar com

ágar Cystine Lactose Electrolyte Deficient (CLED) e identificadas pelos testes de

catalase e coagulase. A quantidade de unidades formadoras de colônias por

grama de amostra (UFC/g) foi determinada em função do número de colônias

típicas contadas, diluição inoculada e porcentagem de colônias confirmadas.

Pesquisa de Salmonella sp.

Uma porção de 25 gramas de cada amostra inicial foi adicionada em 225

mL de solução salina peptonada 1% e incubada a 36 °C por 16 a 20 horas. Após

esse período, 0,1 mL foram inoculados em caldo seletivo Rappaport e 1 mL para

tubos contendo Selenito cisteina que foram incubados a 41 °C por 24 a 30

horas.

O isolamento foi realizado a partir de caldos seletivos de enriquecimento e

repicado sobre a superfície previamente seca de placas com cada meio sólido

seletiva, estriando de forma a se obter colônias isoladas. Dessa forma foram

obtidas 2 placas de BPLS, uma originária do caldo Rappaport Vassiliadis e outra

originária do caldo selenito cistina e 2 placas de Agar XLD, obtidas do mesmo

modo. Incubaram-se todas as placas, invertidas, a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas.

As colônias com suspeita de Salmonella sp., em ambas as metodologias

foram submetidas as seguintes provas bioquímicas: TSI, teste de indol, teste de

uréase, teste de fermentação do ducitol, teste de fermentação da glicose,

lactose,sacarose, maltose e manitol, teste descarboxilação de lisina, teste

de citrato.

RESULTADOS E DISCUSSÃODo total de 18 amostras analisadas foi possível observar a presença de

Staphylococcus sp., Escherichia coli e coliformes termotolerantes e ausência de

Salmonella sp.

Na tabela 1 encontram se as variações das contagens para

Staphylococcus sp. em UFC/g das 18 amostras de sushis. Diante dos resultados

obtidos foi possível observar que grande parte das amostras encontram se

dentro do valor permitido e preconizado pela RDC n°12 que admite valores até a

diluição 10-3, entretanto, também foram encontrados valores acima do limite

permitido como nas amostras 09 e 14.

A presença deste microrganismo em todas as amostras deve-se ao

contato direto dos manipuladores com alimento uma vez que os mesmos não

utilizam luvas no momento do preparo facilitando a veiculação do

Staphylococcus sp., pois são encontrados na pele e mucosas de seres humanos

mas também pode ocorrer devido a uma possível inadequada limpeza e

sanificação dos materiais e equipamentos.

A presença de Staphylococcus sp. e da espécie S. aureus, foi confirmada

pelos testes bioquímicos que revelaram 4 amostras positivas para

Staphylococcus aureus. Entretanto vale ressaltar que os estafilococos

coagulase-negativos também são de grande relevância visto que nos últimos

anos foram reconhecidos como agentes de doenças humanas (KONEMAN,

2001).

Tabela-1. Resultados das contagens para Staphylococcus em UFC/g-1 das 18 amostras de sushis comercializadas na cidade de Belém, 2015.

Amostras Contagem de Staphylococcus (UFC.g-1)

01 2,5 x 10-2 UFC/g Staphylococcus sp.

02 2,5 x 10-2 UFC/g S. aureus03 4,7 x 10-2 UFC/g Staphylococcus sp.





08 2,0 x 10-3 UFC/g S.aureus09 2,7 x 10-5 UFC/g Staphylococcus sp.








A tabela 2 exibe os achados referentes à Escherichia coli, sendo possível

observar que houve similaridade na prevalência deste microrganismo. Pois

foram encontrados resultados relevantes e considerando a RDC nº 12/ANVISA e

a RDC nº 216/ANVISA, pode-se concluir que os estabelecimentos avaliados não

cumprem as regras de boas práticas desta legislação, visto que o contágio por

E. coli se dá através da ingestão de água ou alimentos que não foram

processados e tiveram algum tipo de contaminação fecal durante a sua

produção e, essa bactéria é prejudicial para os alimentos, onde sua presença

determina inutilidade dos mesmos pois oferece grande risco de intoxicação

alimentar (FRAZIER, 1976).

Aspectos também vêm sendo apontados na literatura como contribuidores

ao risco a saúde do consumidor, como a qualidade da água e do gelo utilizados

em conservação e preparo, e a falta de um fluxograma que promova o melhor

controle dos pontos críticos de contaminação (VIEIRA, 2007; FURLAN, 2009).

Na legislação atual, a ANVISA tem uma maior atenção sobre a presença de E.

coli dentre as termotolerantes, com vistas a indicar o produto como impróprio

para consumo.

Tabela 02. Resultados das contagens para Coliformes totais e termotolerantes (NMP.g-1) das 18 amostras de sushis comercializadas na cidade de Belém, 2015.

Amostras Contagem de coliformes termotolerantes (NMP.g-1)

Contagem de coliformes total (NMP.g-1)

01 >1.110 NMP/g >1.110 NMP/g02 >1.110 NMP/g >1.100 NMP/g03 1.100 NMP/g 1.500 NMP/g04 93 NMP/g 330 NMP/g05 1.100 NMP/g 9,2 NMP/g06 1.100 NMP/g 9,2 NMP/g07 >1.110 NMP/g 1.100 NMP/g08 >1.110 NMP/g >1.110 NMP/g09 >1.110 NMP/g >1.110 NMP/g10 20.000 NMP/g 920NMP/g11 >1.110 NMP/g >1.110 NMP/g12 >1.110 NMP/g 11.000 NMP/g13 >1.110 NMP/g >1.110 NMP/g14 430 NMP/g 430 NMP/g15 <3,0 NMP/g <3,0 NMP/g16 920 NMP/g 43 NMP/g17 <3,0 NMP/g 210 NMP/g18 >1.110 NMP/g >1.110 NMP/g

Para pesquisa de Salmonella sp. foram obtidos resultados negativos, o

que é esperado pela RDC nº12/2001 que preconiza a ausência deste

microrganismo.

CONCLUSÃO

As análises microbiológicas dos sushis demonstraram que nos dois tipos de

estabelecimentos, especializados e não especializados, na culinária japonesa,

pode ter ocorrido erros graves em uma ou mais etapas na elaboração do

alimento, armazenamento ou comercialização apresentando como consequência

a presença de coliformes totais e termotolerantes acima dos limites

estabelecidos na legislação brasileira, bem como, para Staphylococcus sp, o que

indica condições higiênico-sanitárias inadequadas dos estabelecimentos

pesquisados.

Foi de grande relevância o conhecimento da presença destes

microrganismos neste alimento, pois é um alerta para os estabelecimentos se

adequarem no preparo de seu produto, que será destinado ao consumo e, que

estão impróprios para este fim. Torna-se necessária a adoção de medidas

higiênico-sanitárias mais rigorosas e a aplicação das Boas Práticas de

Fabricação (BPF), a fim de controlar os possíveis riscos potenciais à saúde do

consumidor.

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