distribuição de espécies e perfil fenogenotípico da resistência
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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE VETERINÁRIA
DOUTORADO EM MEDICINA VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CLÍNICA E REPRODUÇÃO ANIMAL
IGOR MANSUR MUNIZ DISTRIBUIÇÃO DE ESPÉCIES E PERFIL FENOGENOTÍPICO DA RESISTÊNCIA
ANTIMICROBIANA EM Staphylococcus sp. ISOLADOS DA CAVIDADE ORAL DE GATOS
NITERÓI 2012
IGOR MANSUR MUNIZ
DISTRIBUIÇÃO DE ESPÉCIES E PERFIL FENOGENOTÍPICO DA RESISTÊNCIA
ANTIMICROBIANA EM Staphylococcus sp. ISOLADOS DA CAVIDADE ORAL DE GATOS
Tese apresentada ao Programa de Pós Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor. Área de concentração: Clínica e Reprodução Animal.
ORIENTADOR: PROF. DR. WALTER LILENBAUM
NITERÓI 2012
IGOR MANSUR MUNIZ
DISTRIBUIÇÃO DE ESPÉCIES E PERFIL FENOGENOTÍPICO DA RESISTÊNCIA
ANTIMICROBIANA EM Staphylococcus sp. ISOLADOS DA CAVIDADE ORAL DE GATOS
Tese apresentada ao Programa de Pós Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor. Área de concentração: Clínica e Reprodução Animal.
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________________ Prof. Dr. Walter Lilenbaum (UFF) – presidente
_____________________________________________________
Profa. Dra. Miliane Moreira (UFRRJ)
_____________________________________________________ Profa. Dra. Marcia Giambiagi de Marval (UFRJ)
_____________________________________________________
Profa. Dra. Shana de Mattos de Oliveira Coelho (UFRRJ)
_____________________________________________________
Profa. Dra. Ana Maria Ferreira (UFF)
NITERÓI
2012
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente ao meu orientador, professor Walter Lilenbaum, por ter me concedido a oportunidade de realizar meu sonho, e por ter acreditado na minha capacidade. Ao laboratório de microbiologia pelo apoio financeiro para realização da pesquisa. Ao grande mestre, professor Alcides Pissinatti, pelo seu apoio incondicional e estímulo na realização deste curso. Ao meu amigo Bruno Penna, por ser essa pessoa tão generosa, ter um coração tão grande que mal cabe no peito, apesar de ainda nem me conhecer teve a grandeza de ofertar sua ajuda. À professora Renata Rabello, por passar sua experiência, mostrar dicas, e empregar seus conhecimentos para o desenvolvimento da minha pesquisa. Ao meu ex-aluno e hoje colega da pós- graduação Wiliam Mendes, pela ajuda concedida. A todo o grupo “STAPHYLO”. À Sabrina Alves Thomé pela grande ajuda, fazendo com que minha pesquisa desse um grande avanço. À Eliana Fernandes de Oliveira, por sempre estar pronta a preparar o material do estudo. À Luciana Fonseca, por estar sempre pronta a nos servir na compra de materias. Aos meus companheiros de trabalho, Vander da Silva e Ailton da Silva, por terem me apoiado constantemente na organização do material, sem essa ajuda seria impossível prosseguir com o trabalho. Ao técnico Marcus Vieira de Souza por ter me apoiado quando possível na bancada. Nem tenho palavras para agradecer as minhas queridas alunas Tamara de Souza Fernandes, Sara Rocha Pereira, Jéssica Pecene de Oliveira e Natália Nunes Costa, que me acompanharam incansavelmente durante a realização das provas bioquímicas, não se importando com dia ou hora. Posso dizer sem medo que sem a ajuda delas seria impossível classificar as amostras, pelo número infinito de tubos, repiques e semeaduras executados.
Às minhas alunas Gessi Iara Rabello e Tatiana Mendes que me auxiliaram na coleta das amostras. A toda equipe do laboratório de microbiologia pelo apoio, pelo incentivo e pelas agradáveis horas de lazer que passamos juntos. Ao meu filho por saber compreender as minhas ausências. A Universidade Federal Fluminense, a qual foi o meu berço profissional. Ao Curso de Pós- Graduação da Medicina Veterinária. A todos que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho. Agradeço também, àqueles que não acreditaram ou não deram apoio, porque serviram como fonte de energia para que a cada dia eu tivesse forças para continuar.
SUMÁRIO
Lista de tabelas. p. 7
Lista de figuras. p. 8
Resumo. p. 9
Abstract. p. 10
1. INTRODUÇÃO. p. 11
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA. p. 14
2.1. O GÊNERO Staphylococcus sp. p. 14
2.1.1 Características gerais. p. 14
2.1.2 Fatores de virulência. p. 15
2.1.3 Enzimas extracelulares. p. 16
2.1.4 Exotoxinas. p. 17
2.1.5 Epidemiologia. p. 19
2.1.6 Fisiopatogenia. p. 21
2.2. ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE Staphylococcus sp. p. 22
2.3. RESISTÊNCIA AOS AGENTES ANTIMICROBIANOS. p. 25
2.4. MECANISMOS DE RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA. p. 27
2.5. Staphylococcus COAGULASE-NEGATIVOS. p. 31
2.6. Staphylococcus sp. RESISTENTES A METICILINA (MRS). p. 33
2.7. AS MORDEDURAS CAUSADAS POR ANIMAIS DE COMPANHIA. p. 39
3. OBJETIVOS. p. 50
3.1. OBJETIVO GERAL. p. 50
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS. p. 50
4. MATERIAL E MÉTODOS. p. 51
4.1. LOCAL DO ESTUDO. p. 51
4.2. ANIMAIS ESTUDADOS. p. 51
4.3. COLETA DAS AMOSTRAS. p. 52
4.4. PROCESSAMENTO BACTERIOLÓGICO. p. 52
4.4.1. Cultura bacteriana. p. 52
4.4.2. Identificação bacteriana. p. 53
4.4.2.1 Teste da coagulase. p. 54
4.4.2.2 Teste da catalase. p. 54
4.4.2.3 Teste da oxidação e fermentação da glicose. p. 54
4.4.2.4 Produção de acetoína. p. 55
4.4.2.5 Redução de nitrato. p. 55
4.4.2.6 Fermentação de carboidratos. p. 55
4.4.2.7 Descarboxilação da arginina e ornitina. p. 56
4.4.2.8 Produção de fosfatase. p. 56
4.4.2.9 Hidrólise da ureia. p. 56
4.4.2.10 Teste PYR. p. 57
4.4.2.11 Teste da resistência a novobiocina, polimixina e
desferroxamina.p. 57
4.4.3. Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos (TSA). p. 57
4.5. DETECÇÃO DO GENE mecA p.58
4.5.1. Liberação do DNA p.59
4.5.2. Reação em cadeia da polimerase p.59
5. ANÁLISE DE DADOS. P.60
6. RESULTADOS. p. 61
7. DISCUSSÃO. p. 71
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS. p. 79
9. OBRAS CITADAS. p. 80
10. APÊNDICE. p. 96
10.1 APÊNDICE I Termo de consentimento livre e esclarecido. p. 96
10.2 APÊNDICE II Artigo aceito para publicação. p.97
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Distribuição de espécies de Staphylococcus sp. obtidas de amostras
da cavidade oral de 200 gatos da cidade de Teresópolis, RJ. p. 62
TABELA 2 - Perfil de resistência das 212 amostras de Staphylococcus sp. isoladas
da cavidade oral de gatos frente à classe e aos 16 antimicrobianos
testados. p. 63
TABELA 3 - Perfil de resistência das 212 amostras de Staphylococcus sp. isoladas
da cavidade oral de gatos em relação às dez classes de
antimicrobianos testadas. p. 64
TABELA 4 - Número de amostras resistentes dentre as 190 amostras de
Staphylococcus coagulase-negativas (CoNS) e 22 coagulase-
positivas (CoPS) isoladas da cavidade oral de gatos em relação à
classe de antimicrobianos e as 16 drogas testadas. p. 66
TABELA 5 - Número de amostras resistentes dentre as 190 amostras de
Staphylococcus coagulase-negativas (CoNS) e 22 coagulase-
positivas (CoPS) isoladas da cavidade oral de gatos em relação às
espécies e á 16 antimicrobianos testados. p. 68
TABELA 6 - Resultado dos testes moleculares de 30 amostras fenotipicamente suspeitas submetidas à pesquisa do gene mecA. p.70
LISTA DE FIGURAS QUADRO 1: Gêneros comuns de bactérias aeróbicas e anaeróbicas isoladas de
feridas por mordeduras de gatos. p. 48
FIGURA 1: Coleta de amostra com swab estéril na região sublingual do gato. p.52 FIGURA 2: Padrão de resistência das 212 amostras de Staphylococcus sp. de
acordo com a quantidade de drogas, frente aos 16 antimicrobianos avaliados. p. 64
FIGURA 3: Eletroforese de produdos obtidos da PCR para pesquisa do gene
mecA de cepas de Staphylococcus sp. isoladas da cavidade oral de gatos em gel de agarose 1%. p. 69
RESUMO
Membros do gênero Staphylococcus pertencem à família Staphylococcaceae e determinam infecções piogênicas com múltiplas apresentações clínicas. O aparecimento de cepas resistentes aos antimicrobianos representa um problema cosmopolita. Devido à estreita convivência com que o homem compartilha atualmente com seus animais de companhia, os acidentes envolvendo ataques desses animais aos humanos se tornou frequente. Logo, faz-se necessário verificar as espécies mais frequentemente encontradas na microbiota bucal dos animais e seu perfil de resistência, para orientação terapêutica em casos desses acidentes em humanos. O objetivo deste estudo foi identificar a presença de Staphylococcus na cavidade oral de gatos, verificando as espécies envolvidas bem como sua suscetibilidade aos antimicrobianos, em particular a resistência à meticilina, com vistas ao seu papel em Saúde Pública. As amostras foram colhidas da região sublingual de 200 gatos clinicamente saudáveis e processadas por métodos bacteriológicos padronizados, identificadas por provas bioquímicas e testadas quanto à susceptibilidade a 16 antimicrobianos. Das 212 amostras bacterianas obtidas, as espécies coagulase-negativas foram as mais frequentemente encontradas, tendo sido isoladas em 89,6% das amostras, enquanto as espécies coagulase-positivas foram obtidas em 10,4% delas. Dentre as espécies coagulase-negativas, a mais frequentemente isolada foi Staphylococcus xylosus (50,9%) seguida por Staphylococcus felis (27,4%), Staphylococcus simulans (6,1%), e Staphylococcus sciuri (5,2%). Já as espécies coagulase-positivas se distribuíram em Staphylococcus aureus (4,7%), e grupo intermedius (SIG) (5,7%). Quanto à resistência aos antimicrobianos, 39,1% das amostras se mostraram multirresistentes. Dentre os antimicrobianos testados no presente estudo a rifampicina foi a que apresentou melhores resultados, com 100% das amostras sensíveis. Por outro lado, altos índices de resistência foram observados para a penicilina e tetraciclina (58%;57,5%). Foram ainda encontradas 30 amostras classificadas fenotipicamente resistentes a meticilina (MRS) e destas, em 26 foi confirmada a presença do gene mecA pela realização da PCR.
Palavras - chave: Staphylococcus, antimicrobianos, resistência, gatos
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ABSTRACT
Members of the genus Staphylococcus belong to the Staphylococcaceae family and determine pyogenic infections with multiple clinical presentations. The emergence of strains resistant to antimicrobials represents a cosmopolitan problem. Due to the close interaction with the man currently share with their pets, accidents involving these animals to humans attacks became frequent. Therefore, it is necessary to verify the species most commonly found in the oral microbiota of animals and their resistance profile for therapeutic guidance in cases of such accidents in humans. The aim of this study was to identify the presence of Staphylococcus in the oral cavity of cats, checking the species involved and their antimicrobial susceptibility, particularly methicillin resistance, with a view to their role in public health. Samples were taken from the sublingual area of 200 clinically healthy cats, and processed by standard bacteriological methods, identified by biochemical and tested for susceptibility to 16 antibiotics. Of the 212 bacterial samples obtained, the coagulase-negative species were most often found and have been isolated in 89.6% of samples, while coagulase-positive species were obtained in 10.4% of them. Among the coagulase-negative species, was the most frequently isolated Staphylococcus xylosus (50.9%) followed by Staphylococcus felis (27.4%), Staphylococcus simulans (6.1%), and Staphylococcus sciuri (5.2%). Already coagulase-positive species were distributed in Staphylococcus aureus (4.7%), and intermedius group (SIG) (5.7%). As for antimicrobial resistance, 39.1% of the samples showed multiresistant. Among the antimicrobials tested in this study rifampicin showed the best results, with 100% of sensitive strains. Moreover, high levels of resistance were observed for penicillin and tetracycline (58%, 57.5%). We also found 30 samples classified phenotypically resistant to methicillin (MRS) and of these, 26 were confirmed the presence of the mecA gene by PCR. . Keywords: Staphylococcus, resistance, antimicrobial agents, cats,
11
1. INTRODUÇÃO
Os estafilococos são conhecidos com esta denominação desde Ogston
(1882) devido à disposição em cachos de uva com que se apresentam. Membros
desse gênero pertencem à família Staphylococcaceae, e são Gram-positivos.
Relatos identificando os estafilococos causando infecções piogênicas com múltiplas
apresentações clínicas já foram descritos em diversos países, sendo um
microrganismo cosmopolita, isolado pela primeira vez por Rosembach (1884) apartir
de ferimentos humanos supurados. Todas as espécies animais são susceptíveis a
infecções causadas por estafilococos, independentemente do sexo, raça ou idade do
hospedeiro, além da estação do ano e clima. Esses microrganismos são residentes
da microbiota da pele e das mucosas de humanos, mamíferos e aves. Apesar disso,
são microrganismos oportunistas e estão rotineiramente envolvidos numa grande
variedade de doenças.
A patogenicidade dos estafilococos está associada com uma série de
enzimas e toxinas que estes microrganismos podem produzir.
Podem ser agentes de pneumonias, piodermites, furunculoses, abscessos,
conjuntivites, otites e septicemia. O potencial zoonótico dos estafilococos vem sendo
amplamente estudado e é relatada a transmissão entre animais de estimação e seus
proprietários. Tem ocorrido uma seleção de patógenos oportunistas resistentes a
antibióticos, com aumento da virulência originando doenças resistentes à terapia
usual.
Microrganismos multirresistentes a antibióticos são conhecidos desde a
década de 1960, e atualmente, representam um grande problema em Saúde
Pública. No início da década de 1940, com a introdução da penicilina, a letalidade
por infecções bacterianas diminuiu muito, mas em 1942 já haviam sido relatadas
cepas resistentes à penicilina. Muitos destes microrganismos têm padrões de
susceptibilidade aos antimicrobianos bastante variáveis, principalmente em função
da troca de material genético e em especial pela transferência de plasmídeos que
podem conter genes que conferem resistência a diferentes antimicrobianos às
bactérias. Desde a introdução das drogas antimicrobianas na prática da medicina
12
veterinária moderna, os microrganismos evoluíram em resposta a essa pressão por
meio de resistência. O uso indiscriminado de drogas antimicrobianas,
frequentemente prescritas por clínicos de pequenos animais sem a prévia realização
de cultura bacteriana e testes de suscetibilidade aos antimicrobianos (TSA), também
tem contribuído para o aparecimento de cepas multiresistentes. Dentre estes,
Staphylococcus sp. vem se destacando pelo aumento de sua frequência como
causa de infecções nosocomiais, representando crescente problemática em
unidades de saúde e em comunidades do mundo inteiro.
Staphylococcus sp. resistentes a meticilina (MRS-methicillin resistant
staphylococci) são importantes causas de infecções nosocomiais, e sua frequência
tem aumentado e se tornando significativa em animais de companhia. Existem
diversos estudos recentes descrevendo amostras indistinguíveis de MRS em
humanos e animais, suspeitando-se da transmissão dessas cepas entre os humanos
e seus animais de companhia.
O dinamismo da transmissão de estafilococos interespécies ainda é pouco
estudado. Os animais de companhia têm sido colonizados e infectados com MRS e
têm atuado como reservatório de infecções para humanos. Técnicas moleculares
avançadas têm sido realizadas no intuito de caracterizar a origem dessas cepas.
Desde o fim do século XX, se reconhece a importância dos animais de
estimação para melhorar não só a qualidade de vida, como também a saúde física e
mental dos humanos. Historicamente, a convivência entre os humanos e os animais
tem aumentado consideravelmente, estreitando sobremaneira a relação de contato
entre essas duas espécies principalmente em relação aos animais ditos de
companhia como o cão e o gato. Esse íntimo contato tem facilitado o aparecimento
de injúrias ocorridas entre as espécies. Dados estatísticos revelam que a cada ano,
mais de 330.000 pessoas são admitidas em serviços de saúde, vitimas de
mordedura de cão, dados que na realidade podem ser bem mais vultuosos, já que
os pequenos acidentes não são computados. No caso de gatos, um estudo nos
Estados Unidos revelou que 300.000 pessoas procuram os serviços de saúde a
cada ano, tendo sido mordidas por esses felinos.
No Brasil, segundo dados oficiais do SUS (Sistema Único de Saúde), de 2000
a 2007 ocorreram 4.520 internações por mordeduras de gatos e outros mamíferos
(pequenos roedores) sem contar os cães e de 2008 á 2010 ocorreram 1.022
13
internações em consequência desses acidentes, gerando alto custo para Saúde
Pública.
Como os acidentes são muito frequentes, e que no caso das mordeduras de
gatos tem um grau de infecção elevado, o tratamento efetivo em substituição ao
empírico, evita as internações, diminuindo os gastos com a saúde pública. Conhecer
a microbiota da cavidade oral de gatos permite utilizar antimicrobianos mais
adequados nos casos de ferimentos causados por eles. As injúrias podem ocorrer
na população em geral e em grupos de riscos, como crianças com menos de dez
anos de idade, médicos veterinários e seus assistentes, e todos que lidam
diretamente com esses animais.
14
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1. O GÊNERO Staphylococcus
2.1.1. Características gerais
Staphylococcus são microrganismos da família Staphylococcaceae,
possuem metabolismo anaeróbio facultativo, são imóveis e catalase-positivos.
São mesófilos, podendo crescer em temperaturas entre 18 a 40ºC, têm
tamanhos variados de 0,5 a 1,5µm de diâmetro, sendo cocos Gram positivos
(BIBERSTEIN; HIRSH, 2003; COX, 2006). O nome Staphylococcus provém do
grego staphylé, que significa “cacho de uvas”, referindo-se as suas células que
crescem em grumos e se dividem em vários planos para formar cachos
irregulares seguindo um padrão que se assemelha a um cacho de uvas
(BIBERSTEIN; JANG; HIRSH, 1984). Essa configuração em cachos ajuda a
distinguir os estafilococos dos estreptococos, que por sua vez são
discretamente oblongos e normalmente aparecem em cadeias por se dividirem
em apenas um plano (TODAR, 2008). Dentre os microrganismos que não
formam esporos, Staphylococcus são dos mais resistentes à dessecação e aos
agentes desinfetantes (COX, 2006). As espécies não formam gás a partir de
carboidratos (BANNERMAN, 2003).
Uma importante modificação na taxonomia do gênero foi adotada e uma
nova espécie foi descrita, Staphylococcus pseudintermedius (DEVRIESE et al.,
2005). A espécie Staphylococcus intermedius, quando descoberta, foi de
extrema utilidade por possibilitar a separação desses estafilococos de
Staphylococcus aureus, evitando assim um importante equivoco
15
epidemiológico, já que ambas são coagulase-positivas. Posteriormente, Van
Hoovels et al. (2006) conseguiram identificar uma estirpe desta nova espécie, e
pesquisadores japoneses relataram S. pseudintermedius resistentes à
meticilina em um hospital veterinário (SASAKI et al., 2007a). Uma investigação
exaustiva de 117 estirpes do mesmo grupo (SASAKI et al., 2007b) confirmou
esta observação pela análise filogenética das sequências sodA ou hsp60. Em
torno de 40 espécies do gênero Staphylococcus foram identificadas, além de
dez que contém subdivisões com subespécies (HAUSSCHILD; STEPANOVIC,
2008). Utilizando técnicas moleculares, tem sido demonstrado que as amostras
fenotipicamente identificados como S. intermedius, consistem em três espécies
distintas: S. intermedius, S. pseudintermedius e S. delphini, os quais, juntos,
representam o grupo intermedius (SIG) (BANNOEHR et al., 2009).
2.1.2. Fatores de virulência
A virulência das cepas está diretamente relacionada à presença de
cápsula, toxinas e enzimas extracelulares que produzem uma grande
variedade de efeitos biológicos no hospedeiro após a invasão tecidual. Os
fatores de virulência são mediados por plasmídeos ou fagos, e a maioria está
codificado no genoma dos estafilococos (TRABULSI; ALTHERTUM, 2008).
Dentre os principais mecanismos de agressão deste gênero estão à
produção e liberação de enzimas extracelulares, adesinas, cápsula e toxinas,
tais como lipases, estearases, desoxirribonucleases, hialuronidase, fosfolipase,
catalase, além da estafiloquinase, um potente ativador de plasminogênio, e
leucocidinas, que lisam leucócitos e macrófagos (KONEMAN, 2008). Algumas
espécies mais virulentas produzem ainda hemolisinas, que interferem na
resposta quimiotáxica das células de defesa, e coagulase, que além de ser um
dos mais importantes fatores de agressão dos estafilococos, pode ser utilizada
para a diferenciação e identificação de espécies patogênicas (BIBERSTEIN;
HIRSH, 2003).
Os polissacarídeos capsulares, também chamados de
exopolissacarídios, podem impedir a fagocitose do microrganismo por células
polimorfonucleares. Esse material pode promover a aderência dos
16
microrganismos as células do hospedeiro e a próteses. A cápsula contribui
para patogenicidade e virulência dos estafilococos. As paredes celulares dos
estafilococos contêm peptideoglicanos que se assemelham aos encontrados
em outras bactérias Gram-positivas, além de ácidos teicóicos, que atuam na
aderência das bactérias Gram-positivas as mucosas. A parede celular dos S.
aureus contém ainda uma proteína, denominada proteína A, que atua como
fator de virulência ao interferir na opsonização e consequente fagocitose dos
microrganismos pelas células polimorfonucleares e ao ativar o complemento
desencadeando repostas de hipersensibilidade do tipo imediato e do tipo tardio
(KONEMAN, 2008). Um fator importante é a presença do biofilme que protege
os Staphylococcus contra a ação dos antibióticos administrado para o
tratamento das infecções e também contra o sistema imune do paciente. O
biofilme consiste em camadas de aglomerados de células incorporado a matriz
extracelular polissacarídica, chamada adesina polissacarídica intercelular (PIA).
A síntese da PIA é mediada por produtos do gene cromossomial ica. A
presença do biofilme facilita o desenvolvimento das infecções pelo
comprometimento do sistema imune do paciente e contribui para a falência da
antibioticoterapia que pode resultar em infecções recorrentes e a emergência
de patógenos multirresistentes (OLIVEIRA; CUNHA, 2010).
2.1.3. Enzimas extracelulares
Os estafilococos produzem diversas enzimas que contribuem para sua
virulência. A produção de catalase por esses microrganismos pode atuar ao
inativar o peróxido de hidrogênio e radicais livres tóxicos formados pelo sistema
da mieloperoxidase no interior das células fagocíticas, após a fagocitose dos
microrganismos. O fator de agregação, um material fixado a célula que tem a
capacidade de ligar-se ao fibrinogênio, é responsável pela ligação da bactéria
tanto à fibrina quanto ao fibrinogênio (TRABULSI; ALTHERTUM, 2008).
A coagulase, que pode existir na forma livre no meio ou numa forma
ligada a célula, liga-se à protrombina e torna-se enzimaticamente ativa,
catalisando a transformação do fibrinogênio em fibrina. Essa atividade pode
atuar para recobrir as células bacterianas com fibrina, tornando-as mais
17
resistentes a opsonização e a fagocitose. As fibrinolisinas produzem
degradação dos coágulos de fibrina e facilitam a disseminação da infecção
para os tecidos adjacentes. De forma semelhante, a hialuronidase hidrolisa o
ácido hialurônico da matriz extracelular nos tecidos, facilitando a disseminação
dos microrganismos para áreas adjacentes. As lipases podem ajudar a
disseminação dos microrganismos nos tecidos cutâneos e subcutâneos
(KARLSSON; ARVIDSON, 2002; BIBERSTEIN; HIRSH, 2003). Foi descrita
ainda uma fosfolipase C, e os tecidos afetados por essa enzima tornam-se
mais sensíveis à lesão e destruição por componentes do complemento e
produtos bioativos durante a ativação do complemento. As nucleases ou
fosfodiesterases com atividades tanto de exonuclease quanto de
endonucleases também podem ser produzidas (KONEMAN, 2008).
2.1.4. Exotoxinas
Membros do gênero Staphylococcus produzem diversas toxinas que
participam de diferentes síndromes clínicas (COX, 2006). As hemolisinas
possuem várias atividades biológicas. A α-hemolisina exerce efeitos letais
sobre uma ampla variedade de tipos celulares, incluindo polimorfonucleares, e
provoca lise de eritrócitos de diversas espécies animais. A toxina é uma
proteína com peso molecular de 33 kDa, e é secretada no meio durante o
crescimento logarítmico tardio. Também é dermonecrótica quando
administrada por injeção subcutânea, sendo letal para animais quando
administrada por via intravenosa (KANEKO; KAMIO, 2004).
A β-hemolisina é uma esfingomielinase, que possui atividade contra
uma variedade de células, mas não é dermonecrótica. Essa toxina é proteica,
com peso molecular de 35kDa, que é secretada no meio quase ao término da
fase de crescimento logarítmico. A atividade hemolítica requer íons magnésio e
a especificidade do substrato limita-se à esfingomielina e a lisofosfastidilcolina.
Ocorre susceptibilidade variável dos eritrócitos de diferentes espécies animais
à lise devido à variação da membrana em esfingomielina (TRABULSI;
ALTHERTUM, 2008).
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A δ-hemolisina e a γ-hemolisina são encontradas em algumas cepas
bacterianas e também causam hemólise em uma variedade de tipos celulares.
A δ-hemolisina é uma proteína com peso molecular de 3kDa, secretada no
meio quase ao final da fase exponencial de crescimento. Produzida por mais
de 97% das cepas de S. aureus e de 50 a 70% dos estafilococos coagulase-
negativos. Essa toxina atua primeiro como surfactante, rompendo a membrana
celular, podendo também interagir com a membrana formando canais, e com o
decorrer do tempo resulta em extravasamento do conteúdo celular. O termo γ-
hemolisina descreve na realidade três proteínas que juntamente com as duas
proteínas que compreendem a leucocidina de Panton-Valentine (Leucocidina
PV), constituem seis toxinas de dois componentes. Nenhuma dessas proteínas
tem qualquer atividade hemolítica ou leucotóxica por si só. Apenas quando
combinadas exibem graus variáveis de atividade hemolítica, e lise dos
leucócitos (KONEMAN, 2008).
Dentre as toxinas superantigênicas as enterotoxinas são responsáveis
principalmente por intoxicações alimentares. Uma de suas principais
características é o fato de serem toxinas termoestáveis, o que facilita a sua
presença em alimentos já cozidos. Já a toxina da síndrome do choque tóxico,
que inicialmente foi denominada de exotoxina C pirogênica estafilococica, é a
principal toxina associada com a síndrome do choque tóxico em seres
humanos, que é caracterizada por febre alta, eritema difuso, hipotensão, além
de no mínimo três sistemas do organismo afetados (DINGES; ORWIN;
SCHLIEVERT, 2000).
As toxinas esfoliativas ou epidermolíticas são produzidas por algumas
cepas de Staphylococcus e são responsáveis pela síndrome da pele
escaldada, que se caracterizada por formação de bolhas na pele e perda de
camadas da epiderme. Dois tipos dessa toxina já foram descritos: ETA
(termoestável) cujo gene estrutural é cromossômico, e a ETB (termolábil) que
tem sua origem em plasmídios (TRABULSI; ALTHERTUM, 2008).
19
2.1.5. Epidemiologia
As bactérias do gênero Staphylococcus sp. estão amplamente
distribuídas em infecções humanas e animais representando os patógenos
mais significantes dessas espécies (PITKALA et al., 2007; ZUBIER et al.,
2007).
Staphylococcus fazem parte da microbiota da pele e das mucosas de
humanos e animais havendo o isolamento de espécies coagulase- positivas e
coagulase-negativas. São patógenos oportunistas em humanos e animais.
Reconhecidos por vários autores como constituintes da microbiota de várias
espécies animais, ocasionalmente podem causar uma variedade de infecções
em cães e gatos (LILENBAUM et al., 2000; RICH, 2005; SASAKI et al. 2007a;
BERA et al., 2006; HANSELMAN et al. , 2009; MOODLEY et al., 2009; OTTO,
2009). No caso dos Staphylococcus coagulase-negativos, apesar de terem sido
considerados saprófitas por muito tempo, as infecções ocasionadas por eles
tem provado sua importância na clínica. Cada vez mais, estudos demonstram
que essas espécies também devem receber atenção especial (MORRIS et al.,
2006; SOARES et al., 2008). Mesmo as espécies de Staphylococcus isoladas
de animais clinicamente hígidos são potencialmente patogênicas (COX, 2006).
Não são somente colonizadores de humanos e outros mamíferos, mas também
já foram encontrados em populações naturais de aves, em répteis e em
indústrias de alimentos (CUNY et al., 2010).
A apresentação clínica mais comum nas infecções por estafilococos são
os abscessos, uma vez que os leucócitos representam o primeiro mecanismo
de defesa nas infecções por bactérias desse gênero (COX, 2006). Ainda
podem ocorrer pneumonias, piodermites, furunculoses, conjuntivites, infecções
do trato urinário, otites e septicemia (LILENBAUM et al., 2000; GARNIERE;
MEDAILLE; MANGION, 2005; ROUGIER et al., 2005).
Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis foram isolados de
aspirados de mordeduras por cães e gatos em crianças, sugerindo a presença
desses agentes na cavidade oral desses animais (BROOK, 1987). Esses
microrganismos têm sido isolados de gatos doentes e saudáveis, dependendo
da parte do corpo escolhida para a seleção da cultura bacteriológica e do meio
20
habitado pelos gatos. Kohal; Pelz e Strub (2004) isolaram dentre outros
microrganismos, Staphylococcus sp. da cavidade oral de cães saudáveis. Em
mordeduras de gatos em mãos de humanos, coletas das feridas revelaram
dentre outros microrganismos Staphylococcus coagulase-negativos (COX et
al., 1985; MITNOVETSKI; KIMBLE, 2004).
Segundo Biberstein e Hirsch (2003), dentre as várias espécies deste
gênero, quatro delas merecem destaque na clínica de pequenos animais: S.
aureus, S. pseudintermedius, S. epidermidis e S. schleiferi coagulans. S.
aureus são frequentemente associados a infecções supurativas (HOEKSTRA;
PAULTON, 2002; CASEY; LAMBERT; ELLIOTT, 2007), enquanto S.
pseudintermedius é um residente da pele canina saudável (ROSSER JR,
2006), mas também é sabidamente o principal agente envolvido em infecções
de cães e gatos (DEVRIESE, 1990; GARNIERE; MEDAILLE; MANGION, 2005;
ROSSER JR, 2006; DEVRIESE; HERMANS; BAELE, 2009).
S. epidermidis é membro da microbiota de algumas superfícies
corpóreas dos animais, mas é pouco relatado como agente causador de
doenças em pequenos animais, embora tenha sido identificado como
responsável por diversas infecções profundas, em especial em animais
imunocomprometidos (LILENBAUM et al., 2000).
Num estudo em Lousiana (EUA), de isolamento de Staphylococcus de
gatos saudáveis, colhidos das narinas anteriores, boca, faringe, conjuntiva,
orelhas, ânus, vagina e prepúcio, das 827 amostras isoladas, 12 espécies
foram identificadas. S. simulans (43,9%) foram os mais encontrados, seguidos
por S. epidermidis (16,7%), S. intermedius (13,5%), S. xylosus (10,5%), e S.
aureus (5,0%). As espécies menos frequentes incluíram S. haemolyticus
(2,7%), S. sciuri (2,2%), S.warneri (1,6%), S.hominis (1,3%), S. hyicus (1,2%),
S. capitis (1,0%) e S. saprophyticus (0,5%). Das 87 amostras de S. xylosus
isoladas, 75 foram provenientes de gatos de gatis. S. xylosus e S. sciuri, tem
sido isolados de todos os mamíferos estudados (COX et al., 1985).
S. aureus é um agente etiológico importante associado às infecções
adquiridas tanto na comunidade quanto em hospitais, e se tornou um
paradigma das infecções bacterianas. Considerado um dos principais
patógenos humanos, tem sua frequência elevada e pode produzir doenças em
21
indivíduos hígidos e imunocomprometidos por sua fácil disseminação intra-
hospitalar associada à resistência aos antibióticos. A forma mais comum de
introdução de MRSA (Staphylococcus aureus resistentes a meticilina) em uma
instituição se dá por meio da admissão de paciente colonizado ou infectado.
Uma vez que esta bactéria tenha sido detectada em um determinado hospital,
tende a persistir aumentando sua prevalência (MENEGOTTO; PICOLI, 2007).
As infecções por cepas HA-MRSA (nosocomiais) estão associadas a
ambientes hospitalares, mas cada vez mais vem aumentando as cepas CA-
MRSA (adquiridas na comunidade) (HAENNI et al., 2011). Essas cepas diferem
fenotipicamente e genotipicamente umas das outras (DEURENBERG;
STOBBERINGH, 2008).
2.1.6. Fisiopatogenia
Os estafilococos são bactérias piogênicas, frequentemente causadoras
de lesões supurativas. Pequenos traumas ou imunossupressão podem
predispor ao desenvolvimento de infecções (QUINN et al., 2005). O
conhecimento sobre a fisiopatogenia das infecções estafilocócicas ainda é
limitado, porém sabe-se que a virulência das cepas está diretamente
relacionada à presença de cápsula, toxinas e enzimas extracelulares que
produzem uma grande variedade de efeitos biológicos no hospedeiro após a
invasão tecidual (COX, 2006; TODAR, 2008).
S. aureus são organismos comensais ou patógenos porque se adaptam
rapidamente a pressões seletivas. Os elementos genéticos que produzem
mobilidade têm grande contribuição nesse processo de adaptação e
representam um meio de transferir informações genéticas (DNA) entre as
espécies bacterianas. Os elementos móveis carream fatores de virulência e
moléculas que conferem resistência aos antibióticos (MALACHOWA; DE LEO,
2010). A produção de coagulase pelos estafilococos é um importante indicador
de patogenicidade, e outros marcadores adicionais são a atividade da DNAse e
produção de proteína A (QUINN et al., 2005).
Staphylococcus coagulase- negativos, que anteriormente pensava-se
não terem importância por não serem patogênicos, estão cada vez mais sendo
22
relatados como causadores de várias doenças, apresentando grande
significado clínico e resistência aos antimicrobianos (SOARES et al., 2008).
2.2. ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE Staphylococcus sp.
Como ação inicial pode-se elaborar um esfregaço do material e realizar
a coloração pelo método de Gram (COX, 2006). Após identificação os
microrganismos são semeados em meios de cultura enriquecidos, sendo os
mais frequentemente utilizados para o isolamento de Staphylococcus sp. o
Agar sangue, Agar manitol salgado e Agar tripticase-soja (BIBERSTEIN;
HIRSCH, 2003).
O Agar manitol salgado ou meio de Chapman é o mais comumente
utilizado para isolamento dos Staphylococcus, sendo um meio de cultura sólido
com propriedades seletiva e indicadora. Sua seletividade deve-se à alta
concentração de NaCl (7,5%), que inibe o crescimento de outras espécies
bacterianas no meio, enquanto a atividade de indicador é dada por possuir
manitol em sua composição; este carboidrato é consumido apenas por algumas
espécies de Staphylococcus (manitol-positivas), que quando fermentam manitol
tornam o pH do meio ácido, mudando a coloração do meio de cultura, através
de um indicador de pH - o vermelho de fenol (BIBERSTEIN; HIRSCH, 2003).
Após o isolamento, as amostras são identificadas de acordo com provas
bioquímicas (HOLT et al., 1994; MAC FADDIN, 1997; BANNERMAN, 2003).
Métodos moleculares têm sido utilizados para estudos epidemiológicos
sobre membros do gênero Staphylococcus. A maioria dos estudos tem utilizado
metodologias que se baseiam na comparação de perfis de bandas de DNA em
géis de agarose, assim como a análise do DNA polimórfico amplificado
randomicamente pela reação em cadeia de polimerase (RAPD-PCR – random
amplified polymorphic DNA polymerase chain reaction) (SAIJONMAA-
KOULUMIES et al., 2003; HAENNI et al., 2011), a análise do perfil
eletroforético de isoenzimas (MLEE – multilocus enzyme electrophoresis)
(BARRS et al., 2000), e a análise de perfis de fragmentação de DNA por
digestão enzimática por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE –
pulsed-field gel electrophoresis) (SAZAKI et al., 2007a).
23
Técnicas de tipagem molecular como sequência multilócus, “pulsed- field
gel eletroforesis” (PFGE), e detecção de SCCmec (estafilococo cassete
cromossomo) são úteis na tipificação das cepas (MENEGOTTO; PICOLI,
2007), sendo assim, a tipificação das cepas é uma parte integrante do estudo
epidemiológico e controle da infecção hospitalar. Os métodos moleculares
devem ser explorados para tipificar as amostras isoladas de Staphylococcus
meticilina resistentes (MRS). Dentre os vários métodos, a genotipagem spa é
simples, rápida e prática para se monitorar a variação na população de MRS de
várias regiões (MEHNDIRATTA et al, 2009).
A PFGE é o método mais discriminativo para S. aureus e é considerado
prova padrão ouro para investigar surtos de MRSA em hospitais
(DEURENBERG; STOBBERINGH, 2008).
Martineau e colaboradores (2001) desenvolveram um ensaio espécie-
específico para Staphylococcus baseado na identificação do gene tuf, que
mostrou boa sensibilidade e especificidade para identificação das 27 espécies
do gênero Staphylococcus isolados de amostras clínicas humanas. Então,
baseando-se em identificação molecular, uma importante modificação na
taxonomia do gênero foi adotada: uma nova espécie foi descrita, S.
pseudintermedius (DEVRIESE et al., 2005). Posteriormente os isolados
fenotipicamente identificados como S. intermedius foram reclassificados por
meio de análise molecular filogenética por sequenciamento parcial dos genes
sodA e hsp60 (SASAKI et al., 2007b).
A identificação dos Staphylococcus resistentes à meticilina (MRS) no
laboratório é complicada pela natureza heterogênea da resistência e pelas
variáveis que influenciam a expressão, como o tamanho do inóculo, pH,
temperatura, e concentração salina. Vários estudos demonstram que a PCR
(reação em cadeia da polimerase) é um método sensível para detecção da
resistência à meticilina em CoNS (Staphylococcus coagulase-negativos)
(OLIVEIRA et al., 2007), como também a estrutura do SCCmec pode ser
determinada com um número de métodos baseados em PCR (DEURENBERG;
STOBBERINGH, 2008).
Vários pesquisadores têm descrito técnicas baseadas em DNA para
tipificar amostras de S.aureus. Eletroforese em campo pulsado (PFGE) é
24
reconhecida como a mais discriminatória, mas seu custo é alto e tecnicamente
complexo. Alternativamente, os métodos baseados em PCR têm sido utilizados
com sucesso para esse propósito (MEHNDIRATTA et al., 2009).
Métodos distintivos e que possam tipificar as amostras isoladas são
necessários para estudar a epidemiologia dos MRS. Os métodos
frequentemente utilizados incluindo a ribotipagem, PFGE e PCR, produzem
resultados diferentes, em diferentes laboratórios devido à alta variabilidade e
envolvimento da região genômica bacteriana. Vinte estudos descreveram
clones de MRSA no Brasil, sendo a primeira a descrição de um clone de MRSA
de hospitais de São Paulo entre 1990 e 1992 (RODRÍGUEZ-NORIEGA et al.,
2010). Na tentativa de diminuir custos, na última década, programas
simplificados mostrando bons níveis de acurácia para identificação dos
estafilococos têm sido desenvolvidos. Entretanto, tais métodos identificam
poucas espécies de estafilococos e assim continua-se utilizando um grande
número de testes, tornando a rotina laboratorial mais difícil. Um estudo
utilizando método simplificado composto por nove testes para identificação de
isolados de estafilococos mostrou que o curto tempo de incubação usado
nesse sistema é impróprio, especialmente quando se analisa estafilococos
coagulase-negativos, tornando a acurácia de identificação muito difícil (IÓRIO
et al., 2007).
As diferentes técnicas laboratoriais tem variabilidade em especificidade e
sensibilidade para resistência à meticilina. A PCR é a técnica de escolha para
identificar o gene mecA (DUQUETTE; NUTTALL, 2004), e uma boa opção para
triagem de resistência à oxacilina é o teste de difusão em disco (OLIVEIRA et
al., 2007). O teste da susceptibilidade em discos de cefoxitina é recomendado
como equivalente ou substituição do teste de susceptibilidade a oxacilina para
S. aureus e grande parte dos coagulase-negativos (BEMIS et al., 2006) e em
um estudo de testes em disco, a especificidade do teste em disco da cefoxitina
foi de 100% para todas as espécies de Staphylococcus coagulase-negativos
(CoNS), enquanto que o teste em disco de oxacilina foi de 64% em todas as
espécies de CoNS (PERAZZI et al., 2006).
25
2.3. RESISTÊNCIA AOS AGENTES ANTIMICROBIANOS
Antes da introdução dos antimicrobianos na prática clínica, a letalidade
por doenças infecciosas era muito alta. No início da década de 1940, quando
houve a introdução da penicilina, o prognóstico dos pacientes melhorou muito.
No entanto, rapidamente (1942) foram relatadas cepas de S. aureus resistentes
à penicilina. A resistência à penicilina foi então reconhecida, inicialmente, em
cepas hospitalares e logo em seguida, na comunidade. No final dos anos 1960
a resistência de cepas hospitalares já chegava a 90% (JESSEN et al., 1969
apud MIMICA; MENDES; LOWY, 2003; MIMICA; MENDES, 2007).
S. aureus foi identificado em 1880, e desde então tem se mostrado como
uma bactéria Gram-positiva patogênica (DEURENBERG; STOBBERINGH,
2008). Estudos conduzidos desde 1950, quando os antibióticos foram
introduzidos no uso clínico em gatos, mostraram que a maioria dos S. aureus
isolados das narinas destes animais eram susceptíveis à penicilina. Desde
então, Staphylococcus isolados de gatos se tornaram resistentes a pelo menos
uma classe de antibióticos (LOVE et al., 1981; WESTLING, K.; JORUP, 2009)
S. aureus foram capazes de apresentar rapidamente resistência aos
antibióticos, tornando-se resistentes a oxacilina na década de 1960, devido à
presença do gene mecA, que caracterizava a resistência aos antibióticos β-
lactâmicos em geral. Esses antimicrobianos interagem com as PBP´s (Penicillin
Binding Proteins), impedem a formação completa da camada de
peptideoglicano da parede celular, desencadeando a morte bacteriana. Na
presença do gene mecA, ocorre alterações das proteínas de ligação através de
uma nova proteína alvo, PBP2a, que apresenta baixa afinidade aos β-
lactâmicos (MENEGOTTO; PICOLI, 2007).
Em 1959, o isolamento do ácido 6- aminopenicilânico (6 APA) tornou
possível a produção de penicilinas semissintéticas. As modificações na cadeia
desse precursor da penicilina possibilitaram a proteção do anel betalactâmico
contra a ação hidrolítica das betalactamases. Os primeiros desses
antimicrobianos disponíveis para uso clínico foram a oxacilina e a meticilina,
que, temporariamente, solucionaram o problema da resistência, mas
26
rapidamente, já em 1961, surgiam as cepas resistentes (MARANAN et al.,
1997).
Amostras de S.aureus meticilina resistentes (MRSA) foram
primeiramente identificadas em 1961, imediatamente depois da introdução da
meticilina no uso clínico. Subsequentemente, a resistência à meticilina entre os
isolados de S.aureus aumentou e vem sendo observada em todo o mundo
(MEHNDIRATTA et al., 2009).
Ao longo dos anos vem ocorrendo à disseminação de cepas resistentes
aos beta-lactâmicos, anteriormente eficazes no tratamento das infecções
estafilocócicas (COELHO et al., 2007). A transmissão de Staphylococcus
patogênicos entre humanos e animais foi primeiramente suspeitada em animais
de fazenda em 1960. Estudos recentes, investigando a transmissão
interespécies, elucidaram resultados contraditórios, embora amostras similares
e distintas tenham sido isoladas de animais e pessoas em contato com eles. As
primeiras análises genéticas dos MRSA (Staphylococcus aureus resistente a
meticilina) de origem canina e felina indicam mas não provam, que os isolados
dessas espécies foram originados em hospitais humanos e que a transmissão
original ocorreu dos humanos para seus animais de companhia. A importância
do contato com humanos portadores de MRSA no desenvolvimento de
infecções caninas e felinas por MRSA indica que essa potente fonte de contato
deve ser considerada (LOEFFER; LLOYD, 2010).
A idéia de que animais de companhia podem agir como reservatórios de
bactérias e transmiti- las para humanos não é nova. Em 1959, S. aureus eram
isolados das narinas de cães e gatos e foi sugerido que estes animais
poderiam ser portadores de infecções estafilocócicas para humanos. Fica claro,
em vários estudos, que os animais domésticos podem adquirir MRSA de
humanos. A frequência da transmissão entre animais e humanos parece ser
muito baixa, embora seja possível que vários casos não sejam investigados e
não sejam computados (DUQUETTE; NUTTALL, 2004).
Várias publicações científicas relatam a relação entre os antibióticos usados
em animais e o aparecimento de resistências em cepas bacterianas de
importância em patologia humana e animal como resultado da exposição aos
antibióticos (POETA; RODRIGUES, 2008). A resistência bacteriana continua
27
sendo um problema global de saúde pública que ameaça a terapia
antibacteriana e também desafia o desenvolvimento de novos antibacterianos.
Uma grande variedade de patógenos isolados pelo mundo, tem se tornado
multirresistente (LI; NIKAIDO, 2009).
2.4. MECANISMOS DE RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA
Os cães e gatos se tornaram uma parte importante na sociedade moderna,
especialmente em países desenvolvidos. Uma grande parte da população
mantém contato diário com esses animais, e isto se torna um risco potencial
para transferência de bactérias ou genes de resistência entre os animais de
companhia e humanos (MALIK; PENG; BARTON, 2005).
Diversos mecanismos são utilizados pelos microrganismos para escapar da
ação dos antimicrobianos, entre eles, a alteração da estrutura molecular dos
antimicrobianos, produção de enzimas que inativam a droga, alteração das
proteínas ligadoras da penicilina ou outros pontos-alvo nas paredes das
células, alvos modificados da DNA-girase, mutações de permeabilidade e
modificações ribossômicas (CATÃO et al., 2005) e as bactérias também podem
usar várias vias bioquímicas para escapar da ação letal das drogas. A
coexistência de vários desses mecanismos no mesmo patógeno pode conduzir
a multirresistência, que é definida quando o microrganismo possui resistência a
três ou mais classes de drogas (DEPARDIEU et al., 2007).
A resistência intrínseca às penicilinas causada pela produção de β-
lactamases é amplamente distribuída. A detecção do gene mecA que é
responsável pela produção da proteína PBP2A, que tem baixa afinidade de
ligação à penicilina é importante na epidemiologia. Quatro diferentes genes de
resistência à tetraciclina têm sido detectados, sendo eles das classes K, L, M e
O. Esses genes conferem mecanismos de resistência ocasionando proteção
ribossomal. Nos macrolídeos ocorrem as metilases, inativação enzimática, e
vários genes estão envolvidos. A resistência as fluoroquinolonas ocorre por
mutações na DNA girase. Para as sulfonamidas e trimetropim ocorre
superprodução de p-amino ácido benzóico, provavelmente por mutação no
DNA. Quanto ao cloranfenicol, a resistência ocorre por inativação enzimática.
28
Face aos aminoglicosídeos, vários genes causam resistência por
acetiltransferases, nucleotideotransferases e fosfotransferases (PATEL;
LLOYD; LAMPORT, 1999; SCHWARZ; NOBLE, 1999; PRESCOTT et al., 2002;
GANIERE; MEDAILLE; MANGION, 2005).
Rich (2005) citou vários mecanismos de resistência dos microrganismos
aos antimicrobianos. Na família dos β-lactâmicos, os microrganismos formam
as β-lactamases ou causam diminuição na permeabilidade, os
aminoglicosídeos, metilação ribossomal com modificação enzimática, nas
tetraciclinas, mecanismos de efluxo ocorrendo ligação alterada, nas
sulfonamidas, alteração do metabolismo enzimático aumentando a produção
do PABA, redução da apreensão, nas quinolonas mutação dos genes e
mecanismos de efluxo, nas rifampicinas alteração da RNA polimerase, nos
glicopeptídeos, mutações, nas polimixinas o aumento de permeabilidade.
Dois mecanismos básicos são responsáveis pela resistência dos
estafilococos aos antimicrobianos β-lactâmicos; em primeiro lugar a produção
de β-lactamases que destroem esses agentes e depois a alteração das
proteínas localizadas na parede celular das bactérias, chamadas de proteínas
de ligação à penicilina (PBP).
O mais comum dos mecanismos de resistência à oxacilina pelos
estafilococos é mediada pelo gene mecA, que codifica a produção da proteína
PBP2a ou PBP2` as quais são expressadas homogeneamente ou
heterogeneamente. A PBP2a possui baixa afinidade aos antibióticos β-
lactâmicos. A resistência homóloga é facilmente detectada com testes padrões,
enquanto a expressão heterogênea é mais difícil de detectar com alguns
métodos, porque somente uma fração da população bacteriana (Um em
100.000 células) expressa à resistência fenotípica (OLIVEIRA et al., 2007).
O SCCmec (estafilococo cassete cromossomo) é o elemento genético
móvel que carreia o gene mecA que é determinante para resistência à
meticilina, possibilita o estafilococo a manter a integridade da parede celular e
continuar seu desenvolvimento na presença de antibióticos β-lactâmicos
(BERGLUND et al., 2009).
Os elementos genéticos móveis foram primeiramente descritos em 1940,
e são um importante meio para transferência de informações genéticas entre
29
procariotas e eucariotas. Os elementos móveis são tipicamente identificados
como fragmentos de DNA que codificam uma variedade de fatores de
virulência e determinantes de resistência bem como as enzimas que mediam
sua própria transferência e integração. A transferência de elementos móveis
entre células é conhecida como transferência de genes lateral ou horizontal. Os
elementos móveis podem consistir de sequências de inserções, elementos de
transposição, fagos, plasmídeos, ilhas patogênicas e cassete- cromossomos.
Esses segmentos de DNA são amplamente propagados por transferência
vertical de genes, com transmissão da informação genética das células mães
para as células filhas (MALACHOWA; DE LEO, 2010).
O elemento genético SCCmec onde está localizado o gene mecA tem
um maior reservatório de genes nos estafilococos coagulase-negativos (CoNS)
que em S. aureus. Os CoNS meticilina resistentes tem sido obtidos
provenientes de animais e são uma potencial fonte de infecções humanas e
reservatórios de genes de resistência à meticilina (ZHANG; AGIDI; LEJEUNE,
2009).
A resistência nos estafilococos aos aminoglicosídeos por genes que
fazem com que haja produção de uma enzima bifuncional encontrado em 70%
a 90% dos resistentes é o mecanismo mais comum. Modificações ribossomais
conferem resistência a eritromicina, e a resistência aos macrolídeos pode
ocorrer também por efluxo ativo pela membrana. Esses genes de resistência
estão nos cromossomos ou carreados por elementos como os tranposons e
plasmídeos (ZHU et al., 2007).
Os plasmídeos são provavelmente uma parte muito importante na
propagação da resistência aos antimicrobianos nos estafilococos. Os
plasmídeos podem agir diretamente carreando os genes de resistência ou
como vetores para transportar esses genes (SCHWARZ; NOBLE, 1999).
Os plasmídeos são moléculas de DNA auto-replicantes. Staphylococcus
tipicamente carream um ou mais plasmídeos por célula e eles tem uma
variedade no conteúdo de genes. Os plasmídeos nos estafilococos são
classificados em três grupos: plasmídeo pequeno que determina uma
resistência única; maior, que geralmente carrega vários determinantes de
30
resistência; e plasmídeos de multirresistência conjugada, que são os maiores
plasmídeos (MALACHOWA; DE LEO, 2010).
Uma forma induzida de resistência à clindamicina pode estar presente
em alguns estafilococos. As cepas de estafilococos parecem susceptíveis num
teste de susceptibilidade antimicrobiana de rotina, mas a resistência pode ser
induzida durante o tratamento, resultando em falência deste. A detecção da
resistência induzida à clindamicina pode ser efetuada utilizando-se o D-teste e
o teste de difusão em disco, mas este não é utilizado de rotina nos laboratórios
veterinários comerciais (FAIRES et al., 2009).
Genes específicos de resistência aos antibióticos estão distribuídos em
S. epidermidis, e em vários países 75% a 90% das cepas isoladas de hospitais
são resistentes à meticilina. Além desta resistência, também foi verificada a
resistência adquirida a vários outros antimicrobianos, como rifampicina,
fluoroquinolonas, gentamicina, tetraciclina, cloranfenicol, eritromicina,
clindamicina e sulfonamidas. A maioria dos genes de resistência aos
antibióticos é transferida por plasmídeos. Esse amplo perfil de resistência só
reflete o uso indiscriminado de antibióticos (OTTO, 2009).
A resistência à oxacilina resulta em resistência cruzada a todos os
antibióticos β-lactâmicos, como penicilinas, cefalosporinas e carbapenêmicos
(ALMEIDA et al., 2007).
Os bacteriófagos parecem ter grande impacto na diversidade e evolução
dos estafilococos. Todos os fagos são classificados como líticos ou
temperados. As ilhas de patogenicidade são elementos móveis. Essas ilhas
estão integradas em um dos seis locais diferentes específicos no cromossomo.
Os SCCmec são fragmentos do DNA relativamente grandes, sempre inseridos
dentro do gene orfX no cromossomo. Os elementos de transposição
(transposons) predominantemente codificam genes de resistência aos
antimicrobianos. Geralmente estão inseridos no cromossomo ou nos elementos
móveis como os SCC ou plasmídeos (MALACHOWA; DE LEO, 2010).
31
2.5. Staphylococcus COAGULASE-NEGATIVOS
Os estafilococos coagulase-negativos (CoNS) fazem parte da microbiota
(BANNERMAN, 2003; SOARES et al., 2008). Sua transmissão entre os
animais e humanos tem sido relatada sugerindo que os estafilococos nas
espécies animais podem servir como reservatórios para infecções humanas
(ZHANG; AGIDI; LEJEUNE, 2009). Essas várias espécies de Staphylococcus e
entre elas, muitas coagulase-negativas resistentes à meticilina provenientes de
animais, indicam um vasto reservatório de Staphylococcus coagulase-
negativos e genes mecA em animais. Um estudo isolou Staphylococcus de
diversas fontes animais e obteve várias espécies coagulase- negativas,
incluindo S. xylosus, isolados de bovinos, cabras, porcos e até mesmo do leite
(ZHANG; AGIDI; LEJEUNE, 2009), enquanto Rich (2005) isolou de gatos S.
felis, S. saprophyticus, S.sciuri e S. xylosus.
S. aureus, e várias espécies coagulase-negativas foram isoladas da pele
e membrana mucosa de gatos saudáveis. As espécies coagulase-positivas são
as causas mais comuns de infecções estafilocócicas em gatos, entretanto os
Staphylococcus coagulase-negativos receberam renovada atenção em
consideração à importância médica em humanos e gatos (GANIERE;
MEDAILLE; MANGION, 2005).
Os estafilococos coagulase-negativos são frequentemente isolados de
hemoculturas, contribuindo com um terço das bacteremias nosocomiais. A
notável habilidade de S. aureus e CoNS em adquirirem resistência aos
antibióticos limita as opções de terapia e consequentemente podem aumentar
a morbidade e mortalidade dos pacientes (IÓRIO et al., 2007), com isso o
aumento do número de infecções por estafilococos coagulase-negativos, e sua
frequente resistência à meticilina tem se tornado uma dificuldade adicional no
controle da infecção por estes agentes (PALAZZO; DARINI, 2006). Um
aumento na resistência em estafilococos coagulase-negativos à lincomicina,
enrofloxacina e oxitetraciclina foi reportado na Inglaterra (PATEL; LLOYD;
LAMPORT, 1999).
O gene mecA foi detectado em Staphylococcus coagulase-negativos
isolados de amostras clínicas de animais. Foram isoladas amostras de gatos,
32
cães, cavalos, bovinos e pássaros. A resistência à ampicilina, tetraciclina,
eritromicina e lincomicina foi comum neste estudo (DUIJKEREN et al., 2004).
Num estudo isolando Staphylococcus de cães e gatos, dos 252 animais
analisados foram encontrados dez MRS (Staphylococcus meticilina resistente).
As espécies mais encontradas em animais sadios foram os coagulase-
negativos, e os MRS compostos por S. haemolyticus, S. warneri, S. hominis e
S. epidermidis (MALIK; PENG; BARTON, 2005).
Oliveira et al., (2007) isolaram 69 Staphylococcus coagulase-negativos
de queratites, conjuntivites e endoftalmites humanas, sendo 71% mecA
positivos e 29% mecA negativos. Os isolados coagulase positivos foram mais
resistentes à penicilina G, amoxicilina, cefazolina, eritromicina, clindamicina,
gentamicina e tetraciclina, já em 72 isolados de estafilococos coagulase-
negativos obtidos de amostras humanas e animais, S. xylosus foi o
microrganismo mais isolado da amostragem animal, sendo detectado um
elevado nível de resistência à penicilina e ampicilina (SOARES et al., 2008). S.
xylosus é uma bactéria comensal encontrada habitando a pele e membrana
mucosa de mamíferos e aves. A habilidade desta bactéria em formar biofilme e
a ubiquidade pode ser explicada pela habilidade de se adaptar a diferentes
ambientes (DORDET-FRISONI et al., 2007).
Num hospital veterinário no Reino Unido, foram isolados estafilococos de
humanos (funcionários), cães e gatos num total de 118 coagulase-positivos e
162 coagulase-negativos, e esses últimos predominaram nos gatos. Vários
padrões de resistência aos antimicrobianos foram encontrados, como
amoxicilina, ciprofloxacina, meticilina, clindamicina e β-lactâmicos (LOEFFLER
et al., 2005).
Tenssay (2000), em seu estudo, analisou 432 CoNS e encontrou 95% de
resistência à penicilina. Já Barelli et al. (1999) encontraram 88,6% em 42
amostras e Farias (2002) relatou que os aminoglicosídeos se mostraram
efetivos contra infecções por estafilococos, sendo apontados como fármacos
de eleição para tratamento dessas infecções.
A resistência à vancomicina entre os Staphylococcus coagulase-
negativos foi relatada a primeira vez há 20 anos e as amostras (CoNS) têm
demonstrado aumento na resistência a esse antibiótico (SOARES et al., 2008).
33
Num estudo da prevalência de Staphylococcus isolados da saliva de
gatos clinicamente saudáveis, provenientes da região sublingual com swab
estéril foram obtidos 104 isolados. As espécies coagulase-negativas foram as
mais comuns, representando 71% dos isolados. A espécie mais
frequentemente isolada foi S. felis, e entre outros coagulase-negativos isolados
estavam S. haemolyticus, S. simulans, S. epidermidis, S. saprophyticus. Os
Staphylococcus coagulase-positivos foram isolados de 30 gatos e 23 amostras
se mostraram resistentes à oxacilina, 33 à tetraciclina, 24 à enrofloxacina e o
antimicrobiano mais ativo contra os Staphylococcus isolados da saliva dos
gatos foi à gentamicina (LILENBAUM; ESTEVES; SOUZA, 1999).
No Japão, Igimi et al. (1994) estudando a frequência dos Staphylococcus
mais isolados de amostras clínicas de gatos, das 93 amostras, encontraram
45% de S.felis, outras espécies como S.xylosus, S. epidermidis S. aureus S.
simulans e S. sciuri foram encontradas em menor escala.
2.6. Staphylococcus sp. RESISTENTE A METICILINA (MRS)
A resistência à oxacilina em Staphylococcus é determinada por um gene
localizado no cromossomo, o gene mecA. Ele é responsável pela síntese da
PBP2a ou PBP2’ que substitui as outras proteínas ligadoras de penicilina na
membrana, e tem baixa afinidade não só para a oxacilina como para os outros
antibióticos β-lactâmicos. O gene mecA faz parte de uma ilha genômica de
resistência chamada staphylococcal cassete chomosome mec (SCCmec),
podendo essas ilhas conter também outros genes de resistência a
antimicrobianos. Os MRSA nosocomiais (HCA-MRSA) carregam SCCmec dos
tipos I a III, e os MRSA comunidade adquiridos (CA-MRSA) estão mais
associados aos tipos IV e V. Os tipos IV e V são elementos genéticos menores
e com mais mobilidade de que os outros. Esses tipos carregam menos genes
de resistência do que os tipos I, II e III. Por isso os CA-MRSA tende a ser
menos multirresistentes que os HCA-MRSA (DUIJKEREN et al., 2004;
MACHADO et al., 2007; MIMICA; MENDES, 2007; OLIVEIRA et al., 2007;
DESCLOUX; ROSSANO; PERRETEN, 2008; WAN et al., 2011).
34
A organização genética do mecA é definida como complexo gene mec e
nos S. aureus três maiores classes tem sido descritas: Classe A, contendo o
mecA completo (mecI-mecR1-mecA), e Classes B e C, contendo genes
regulatórios partidos por sequências de inserções. A mobilidade do SCCmec
em parte se dá pela presença do complexo gene cromossomo cassete
recombinase (ccr). Esse complexo pode ser constituído por dois genes (ccrA e
ccrB) ou por um gene só (ccrC) (KIM et al., 2007; MILHEIRIÇO; OLIVEIRA;
LENCASTRE, 2007).
O SCCmec contém uma combinação característica de dois
componentes genéticos essenciais, o complexo gene mec com mecA e seu
regulador de genes e o ccr que garante a mobilidade. O SCCmec é classificado
em I, II, III, IV, V ou VI, dependendo da combinação do complexo gene mec
(classe A, B ou C), e do ccr gene complexo (tipo 1, 2, 3, 4 ou 5) contidos nele.
A região J1, localizada entre o ccr e a região inferior no cromossomo, é a mais
importante região para classificar os subtipos do tipo IV SCCmec (KONDO et
al., 2007; BERGLUND et al., 2009).
Mais recentemente sete tipos mais subtipos de SCCmec tem sido
identificados, e sua identificação pode ser usada para caracterizar
epidemiologicamente isolados e investigar seus relacionamentos. A expressão
do mecA é regulada pela associação dos genes repressor e indutor (mecR,
mecI), e por vários outros genes (fem, aux) (LOEFFER; LLOYD, 2010).
A resistência fenotípica à oxacilina é extremamente variável e depende
da expressão do gene mecA. Essa variabilidade é reconhecida como
heterorresistência fenotípica, e se caracteriza pelo fato de que de toda a
população bacteriana heterogeneamente resistente carrega o gene mecA, mas
nem todas expressam fenotipicamente sua resistência da mesma forma
(MIMICA; MENDES, 2007).
Embora evidências científicas suportem a transferência horizontal do
mecA, o mecanismo de transferência ainda não foi elucidado. Análise do SCC,
o veículo do mecA, pode prover valiosas informações nas bases genéticas, a
qual mecA se transfere entre os Staphylococcus. Novos tipos de SCCmec
estão sendo descobertos continuamente pelo mundo (ZHANG; AGIDI;
LEJEUNE, 2009).
35
Pouco se sabe sobre as origens do gene mecA provenientes de animais
de companhia. Na medicina humana tem sido demonstrada uma transferência
horizontal proveniente de uma espécie primitiva de Staphylococcus, S. sciuri. A
descoberta do SCCmec nas amostras de MRSA de origem humana distanciam
os avanços da teoria que o mecA pode ser compartilhado entre as espécies de
Staphylococcus. O SCCmec tem um tamanho aproximado de 20 a 68 kbp
(MALIK; PENG; BARTON, 2006).
A magnitude da ameaça à saúde causada pelas bactérias resistentes
aos antibióticos em geral e em particular os Staphylococcus aureus meticilina-
resistente (MRSA) tem sido amplamente reconhecida pelas agências de saúde
pública, e pelos governos (STRUELENS et al., 2009), os MRSA não podem
mais ser considerados patógenos restritos a serviços de saúde, visto que, a
partir dos anos 1990, relatos associados à comunidade foram descritos em
várias partes do mundo inclusive no Brasil. Assim, o diagnóstico correto da
resistência à oxacilina é vital por razões clínicas e epidemiológicas.
Inicialmente os Staphylococcus resistentes (MRSA) estavam restritos a
grandes centros hospitalares, mas logo se alastraram para os centros de saúde
menores em todas as partes do mundo (CHAMBERS, 2001; MALIK; PENG;
BARTON, 2006; MIMICA; MENDES, 2007).
As amostras de MRSA comunidade-adquiridas possuem um tipo de
SCCmec (elemento móvel) denominado de tipo IV, que é fisicamente menor
que os outros tipos de SCCmec e não carreia outros genes de resistência, a
não ser o gene mecA. Geralmente são mais virulentos que os MRSA
nosocomiais (REINERT et al., 2008), esses microrganismos podem persistir em
diversos sítios de portadores, pelo menos por três meses depois da alta
hospitalar (CAVALCANTI et al., 2006).
No Brasil, a prevalência de infecções hospitalares por S. aureus tem
variado de 17% a 26% e aproximadamente 70% a 100% são causadas por
cepas multirresistentes (ALMEIDA et al., 2007), sendo que vários clones de
MRSA têm sido identificados pelo mundo. Apesar de relatos no Brasil, a
epidemiologia molecular dos MRSA na América latina ainda é muito
desconhecida (RODRÍGUEZ-NORIEGA et al., 2010).
36
Os clones brasileiros adquiriram genes de multirresistência e as
amostras tem demonstrado resistência a vários antimicrobianos. No entanto,
entre 1992 e 1994, em torno de 74% de clones brasileiros isolados de hospitais
de ensino eram sensíveis somente à vancomicina. Os clones brasileiros de
S.aureus demonstraram potencial para aquisição de genes para produção de
biofilme, como também genes para produção de PVL, toxina capaz de destruir
células. Esses clones desenvolvem rapidamente resistência a antibióticos e em
2008, mais de 90% das amostras de S. aureus eram resistentes à penicilina e a
incidência de MRSA na América Latina foi maior que 50% de todos os isolados
em outros continentes (GONANO et al., 2009; RODRÍGUEZ-NORIEGA et al.,
2010).
O monitoramento da resistência à meticilina é crucial para o tratamento
e programas de vigilância epidemiológica. Nos hospitais brasileiros, MRSA são
responsáveis por 37% das infecções estafilocócicas. Dos 68 MRSA isolados de
hospitais do sul do Brasil, foi encontrada alta resistência à gentamicina
(94,1%), clindamicina (91,1%), ciprofloxacina (89,7%), sulfa-trimetropim
(88,2%), penicilina (97,0%), cloranfenicol (47,0%), tetraciclina (83,8%) e
rifampicina (76,4%) (HANSELMAN et al., 2009; PEREZ; D´AZEVEDO, 2009).
Embora muitos MRSA não expressem multirresistência a drogas, eles
podem mostrar resistência clinicamente relevante a uma parcela de compostos
frequentemente utilizados na profilaxia e terapia, e com isso reduzir o sucesso
do tratamento. MRSA tem sido reconhecidos como patógenos veterinários
importantes. Desde então, os animais hospedeiros tem sido implicados como
reservatórios e vetores para infecções humanas fora dos hospitais. Isto tem se
tornado claro pelas diferenças genéticas e epidemiológicas importantes que
existem nessas amostras infectantes de MRSA encontradas em diferentes
hospedeiros animais (LOEFFER; LLOYD, 2010), sendo assim, reconhecendo a
importância da resistência antimicrobiana que a cada dia vem crescendo na
área da medicina humana e veterinária, os clínicos estão sendo estimulados a
usar antimicrobianos com maior prudência (ROY et al., 2007). Adicionalmente o
uso de antibióticos com fins profiláticos ou terapêuticos na veterinária contribui
para seleção de bactérias resistentes, portanto é necessária a colaboração
37
entre diferentes profissionais para o uso racional de antibióticos para controlar
esse problema (POETA; RODRIGUES, 2008).
O interesse da resistência aos antimicrobianos nos animais de
companhia tem aumentado. Isso se deve em parte ao aumento do número de
casos relatados de animais infectados ou colonizados com microrganismos de
importância clínica e epidemiológica multirresistentes a drogas, como os S.
aureus (MRSA) (GANIERE; MEDAILLE; MANGION, 2005; MURPHY et al.,
2009).
Os primeiros relatos de MRSA em animais de companhia são do Reino
Unido, e o tipo de cepa analisada, sugere sua origem em hospitais humanos.
Os riscos vêm aumentando com a distribuição e transferência de genes de
resistência, e alguns mecanismos ainda não são bem conhecidos. A
transferência dos MRSA dos animais para os humanos causa grande impacto e
torna-se necessário a regulação do uso de antimicrobianos nesses animais. A
prevenção da disseminação dos MRSA com potencial zoonótico necessita da
ação do controle da infecção veterinária, dos especialistas e clínicos (CUNY et
al., 2010), vários animais de companhia como cães, gatos e cavalos tem sido
implicados mais frequentemente como potenciais reservatórios de MRSA
(LOEFFLER et al., 2005; MIDDLETON et al., 2005; JONES et al., 2007;
MOODLEY et al., 2009, COUTO et al., 2012) e estudos epidemiológicos e
moleculares dos MRSA provenientes de origem humana e animal revelaram
que algumas amostras apresentam infecção cruzada entre animais e humanos
ou vice-versa (ZUBEIR et al., 2007).
Por muitos anos os MRSA eram considerados somente um patógeno
humano. Devido à interação social entre os animais de companhia e os
humanos, é esperado que nesse contato ocorra aquisição de MRSA pelos
animais. O carreamento de MRSA em mucosas de atendentes em veterinárias,
donos de animais e trabalhadores da saúde tem sido demonstrado em diversos
estudos. A transferência de MRSA entre humanos e animais tem sido
corroborada por estudos de tipificação, os quais mostram que os MRSA
provenientes de cães e gatos são tipicamente idênticos aos associados a
linhagens hospitalares. A identificação pode facilitar um desenho apropriado de
controle da infecção e estratégias de prevenção nas práticas veterinárias com
38
adicional benefício à saúde pública (MAGALHÃES et al., 2010), e tem sido
relatado o aumento de MRS em animais (DUIJKEREN et al., 2011; PAUL et al.,
2011).
MRSA têm sido isolados de animais doentes e saudáveis. Embora
amostras provenientes de cães e gatos tipicamente mostrem mutirresistência
às drogas, a maioria das infecções pode ser tratada com sucesso. Drogas
antimicrobianas com eficácia “in vitro” contra MRSA são avaliadas para uso em
animais de companhia em vários países, incluindo trimetropim-sulametoxazol,
tetraciclinas, clindamicina, e fluoroquinolonas (SASAKI et al., 2007b;
LOEFFER; LLOYD, 2010), mas uma grande preocupação pode ser a
transferência de resistência aos antimicrobianos de espécies de
Staphylococcus animais para espécies humanas. O uso prudente na terapia
antimicrobiana na prática veterinária limita a emergência da resistência múltipla
aos antibióticos em todas as espécies de bactérias, e reduz o risco de
possíveis transferências de genes de resistência para bactérias comensais ou
patogênicas humanas. O uso de antibióticos na rotina influi na microbiota
normal e pode aumentar a pressão de seleção e ser um fator de contribuição
para o aparecimento dessas cepas resistentes. Os MRSA são incomuns em
animais, e o grande risco de infecção são animais hospitalizados,
especialmente aqueles com cateter intravenoso, os que vão sofrer intervenção
cirúrgica principalmente com implantes, e animais imunocomprometidos
(DUQUETTE; NUTTALL, 2004; COELHO et al., 2007; HUNTER et al., 2010),
enquanto Duijkeren et al (2011) relatam que os animais positivos com cepas
MRS vem aumentando, o que também foi relatado por outros estudos em
Portugal (COUTO et al., 2012), na Itália (PAUL et al., 2011) e nos USA
(MORRIS et al., 2012).
A transmissão de amostras bacterianas entre animais de companhia e
seus donos tem sido demonstrada em várias instâncias. A análise molecular
tem mostrado a presença indistinguível de MRS em pets e humanos moradores
da mesma casa, sugerindo a direção da transmissão. Os isolados provenientes
de cães e gatos se assemelham aos MRS nosocomiais, assumindo que os
animais de companhia os adquirem dos humanos. Tanto os animais quanto os
39
humanos são mais colonizados que infectados e ambos funcionam como
reservatórios de MRS (PANTOSTI, 2012).
Existem diferenças na ocorrência dos MRSA entre animais de
companhia e animais de campo. Até 2006 os MRSA eram raros em animais de
companhia, e agora estão aumentando (OLIVEIRA et al., 2001;
STROMMENGER et al., 2006; MATLOW; MORRIS, 2009; HUNTER et al.,
2010), o que vem sendo observado, como na pesquisa da prevalência de S.
pseudintermedius isolados de amostras clínicas de animais de companhia e
equinos na Alemanha, das 870 amostras, todas mostraram resistência à
oxacilina (RUSCHER et al., 2009).
2.7. AS MORDEDURAS CAUSADAS POR ANIMAIS DE COMPANHIA
Os cães foram domesticados cerca de 15.000 anos atrás e o primeiro
gato domesticado há cerca de 9.500 anos. Hoje aproximadamente 75 milhões
de cães e 88 milhões de gatos são animais de companhia só nos EUA, e
aproximadamente 30% das famílias possuem gatos. Na Europa é estimado que
existam de quatro a 16 gatos para cada 100 habitantes (OEHLER et al., 2009),
o fato é que o número de pessoas que possuem animais de estimação é muito
alto na Europa e Estados Unidos (DUIJKEREN et al., 2011). Segundo a
Associação Nacional dos fabricantes de Alimentos para animais de estimação,
no Brasil, a população de cães foi estimada em 33 milhões e de gatos em 17
milhões, somente de animais domiciliados (ANFAAE, 2010).
A população de animais de estimação está continuamente aumentando.
Isto é uma consequência do reconhecimento dos benefícios em possuir esses
animais, que podem promover um bem estar para seus donos, em especial
crianças. Entretanto, os animais de companhia que vivem em estreito contato
com os humanos representam uma potencial fonte de zoonoses e ferimentos
causados direta ou indiretamente (OSTANELLO et al., 2008; ABRAHAMIAN;
GOLDSTEIN, 2011) com isso, devido à urbanização da sociedade
contemporânea e a limitação das áreas ambientais, a ameaça dos ataques
animais ainda é um problema médico e social. Ferimentos sérios no corpo
muitas vezes são causados por ataques de grandes animais. Os ataques por
40
animais de pequeno porte normalmente não causam ferimentos que requerem
hospitalização, mas podem representar uma séria ameaça por causa da
transmissão de doenças infecciosas (NOGALSKI et al., 2007).
De acordo com os serviços de Saúde Pública dos EUA, mais que um
milhão de mordeduras animais que ocorrem a cada ano requerem atenção
médica, embora a maioria desses ferimentos possa parecer inofensivos
inicialmente, eles podem evoluir para sérias complicações (BROOK, 1987).
Devido a popularidade dos animais domésticos, continua a crescer a
incidência das mordeduras por esses animais que vem se desenvolvendo
numa proporção epidêmica, representando um importante problema de Saúde
Pública nos EUA. É estimado que 2 milhões de americanos são mordidos por
um animal doméstico a cada ano, e que 50% dos americanos ainda será
mordido em sua vida. As mordeduras animais constituem em torno de 1% dos
atendimentos de todo o serviço de emergência (BENSON et al., 2006). Dessas
lesões, 3-18% das mordeduras de cães e 28-80% das mordeduras por gatos
tornam-se infectadas, com sequelas ocasionais como meningites,
endocardites, artrite séptica e choque séptico. Num estudo na Espanha duas
mulheres apresentaram celulite após serem mordidas por gatos (TALAN et al.,
1999; PENNIE et al., 2004; GARCIA et al., 2009).
Estudos recentes dos EUA, Austrália, e Itália são consistentes em
afirmar que os cães são a espécie mais frequentemente responsável por
injúrias relacionadas com mordeduras associadas a animais vertebrados,
seguida pelos gatos (80% e 20% respectivamente). As mordeduras continuam
a ter uma importância particular em crianças (PATRONEK; SLAVINSKI, 2009;
KRAMER et al, 2010). No Brasil, embora os números exatos não sejam
conhecidos, sabe-se que os cães são responsáveis pela maioria das
mordeduras de animais, seguidos pelos gatos (SANTOS et al., 2007).
Nos EUA, a cada ano, 300.000 visitas às unidades de emergência são
devido a mordeduras de gatos (WESTLING et al., 2006) e a proximidade dos
donos e seus animais faz com que haja um potencial de transmissão de até 30
agentes infecciosos (OEHLER et al., 2009).
Os ataques animais a pessoas em todo o mundo resultam em milhões
de injúrias e centenas de mortes. Esses ataques afetam tanto a população rural
41
quanto a urbana. Muitas pessoas com injúrias menores não contactam os
serviços de saúde e com isso esses casos não são computados na estatística.
Os relatos de injúrias causadas por animais tem uma baixa porcentagem em
todos os pacientes com injúrias, mas exige uma abordagem individual de cada
paciente (NOGALSKI et al., 2007).
As principais complicações das mordeduras por mamíferos são os danos
teciduais, a infecção e o estresse psicológico. O trauma psicológico seguido
das mordeduras animais ainda é um problema subestimado. As lesões sofridas
por mordidas são dependentes da espécie animal e dentição, da ferocidade do
ataque e da região anatômica da mordida. As mordeduras por cães resultam
mais em esmagamentos, lacerações e abrasões, em contraste as mordeduras
por gatos quase sempre são puntiformes devido aos seus dentes incisivos
serem muito longos e delgados. As feridas podem parecer menores na
superfície da pele, mas podem penetrar profundamente e atingir ossos,
articulações e tendões. Isto é de particular importância nas mãos, onde a
penetração nas articulações é facilmente encontrada por clínicos. A maioria
das feridas por mordeduras animais podem ser gerenciadas em práticas
rotineiras, entretanto é importante reconhecer quando uma ferida tem alto risco
de infecção e quando um hospital deve ser procurado (MITNOVETSKI;
KIMBLE, 2004; BENSON et al., 2006; WESTLING et al., 2006; DENDLE;
LOOKE, 2009; OEHLER et al., 2009; WESTLING; JORUP, 2009).
As mordeduras de gatos podem ser devastadoras em temos de
infecção e incapacidade permanente se não for tratada apropriadamente. As
extremidades superiores, especialmente as mãos, são particularmente
vulneráveis às feridas por mordidas de gatos. De todos os casos de
mordeduras de gatos, as mãos estão envolvidas em 45-63% dos casos. As
taxas de infecção representam o dobro das taxas por mordidas de cães. Alguns
pacientes mordidos por gatos necessitam de intervenção cirúrgica
(MITNOVETSKI; KIMBLE, 2004).
As feridas por mordeduras de animais têm sido categorizadas em três
grupos com base no tipo de injúria, avulsão, laceração ou perfurantes. As
avulsões ocorrem quando a pele é arrancada do tecido subjacente e osso.
Laceração são rupturas na pele; em instâncias mais graves podem incluir
42
rupturas no tecido subcutâneo e resultar em bordas irregulares. Perfurações
resultam da penetração dos dentes na pele e a possibilidade de estruturas
mais profundas. Os gatos primeiro mordem e depois seguram sua presa até
que fiquem imóveis. Como tal, as mordidas de gatos mais frequentemente
resultam em feridas perfurantes. Os dentes longos e afiados dos gatos podem
facilmente perfurar estruturas subjacentes, incluindo ligamentos, ossos,
cápsulas articulares, tendões, nervos e estruturas vasculares, além disso, as
feridas perfurantes causadas pelos felinos normalmente envolvem uma
penetração profunda e a preservação de uma parte da ferida fechada
(SANTOS et al., 2007; PATRONEK; SLAVINSKI, 2009).
A mistura da biota aeróbica e anaeróbica juntamente com a injúria
frequentemente complexa de estruturas profundas pode acarretar em infecção.
A microbiota bucal contém uma grande variedade e concentração bacteriana,
que tornam susceptível a infecção da ferida, sendo a principal complicação das
mordeduras (SANTOS et al., 2007; KRAMER et al, 2010; SYRMOS et al.,
2010; MADSEN; JUSTESEN, 2011), sendo assim a mordedura do gato, faz
uma lesão penetrante que instila microrganismos no tecido subcutâneo
traumatizado enquanto uma lesão fechada predomina, permitindo que os
microrganismos mais sensíveis possam encontrar refúgio (LOVE; MALIK;
NORRIS, 2000).
As complicações geradas pelas mordeduras dependem de vários
fatores, como a microbiota específica da saliva do animal, a isquemia tissular
na região da ferida causada pela força compressiva, responsável pela maior
dificuldade para os anticorpos realizarem a proteção do organismo contra as
bactérias, e também é mais difícil para que os antibióticos cheguem em suas
concentrações terapêuticas no tecido esmagado e isquêmico (NOGALSKI et
al., 2007), já as taxas de infecção por mordeduras diferem entre as espécies
animais, dependendo da microbiota oral e do tipo de injúria. Os organismos
infectantes mais comumente são provenientes da boca do animal mordedor,
entretanto eles também podem ser provenientes da própria biota do hospedeiro
ou do meio ambiente. As infecções por mordeduras de animais devem ser
consideradas polimicrobianas, mas certamente patógenos incomuns podem ser
característicos de determinadas espécies animais, e o conhecimento deste fato
43
é útil na orientação da escolha do antibiótico (DENDLE; LOOKE, 2009;
WEINBERG; BRANDA, 2010).
A microbiota oral de humanos e animais é extremamente variada e
esses microrganismos estão frequentemente envolvidos em muitas doenças
(KRAMER et al., 2010). Num estudo realizado em Goiás, na microbiota oral de
cães pastores saudáveis, foram encontrados diversos gêneros bacterianos,
entre eles, Staphylococcus (S. hycius, S. xylosus, S. saccharolyticus e S.
auricularis) (LEE,1994; BRAGA et al., 2005), enquanto que outros patógenos
comuns nas mordeduras dos gatos (Quadro1) são: Streptococcus sp.;
Fusobacterium sp.; Bacteroides sp.; Porphyromonas sp.; Moraxella sp.;
Pasteurella multocida e Staphylococcus sp. (OEHLER et al., 2009;
ABRAHAMIAN; GOLDSTEIN, 2011). Em outro estudo microbiológico de
mordeduras de animais, 20 das feridas foram nas mãos, dez nas pernas, seis
no pescoço e cabeça e três no tronco. Linfadenopatia foi observada em 11
casos. Foram recuperadas 39 espécies de bactérias obtidas das feridas. Os
agentes bacterianos mais frequentemente isolados nas mordeduras animais
foram S. aureus e Pasteurella multocida. A atividade da β-lactamase foi notada
em 18 isolados. As bactérias obtidas das feridas infectadas por mordeduras
geralmente colonizam a pele e cavidade oral dos animais e humanos. Em 41%
dos isolados havia produção de β-lactamases, suscitando-se então a questão
se as penicilinas representam terapia adequada para mordeduras infectadas
(BROOK, 1987).
Em ensaios clínicos tem sido demonstrado que embora 80% das feridas
por mordeduras de cães apresentem cultura positiva para bactérias, somente
de 3-20% virão a ser infectadas (MEYERS et al., 2008). Já no estudo de 110
pacientes nos USA com mordeduras de cães e gatos, 57 pacientes tiveram a
ferida infectada proferida por gatos. A idade média das vítimas era de 39 anos,
e a maioria dos pacientes eram mulheres. Desses 85% das feridas por
mordeduras de gatos eram perfurantes, 3% lacerações e 12% uma
combinação das duas. Uma mistura de infecção por aeróbios e anaeróbios
estava presente em 56% de todas as feridas, sendo que 63% nos gatos.
Staphylococcus foram isolados em 52% das feridas. Foram hospitalizados 33
pacientes (31%), e realizado tratamento com antibióticos intravenosos.
44
Aproximadamente 20% dos pacientes com infecções, nesse estudo, foram
tratados empiricamente com penicilina, ampicilina ou cefalosporinas de
primeira geração (TALAN et al., 1999).
Em decorrência dos S. aureus meticilina resistente terem se tornado
patógenos comuns adquiridos na comunidade, eles podem ser identificados em
culturas bacterianas de amostras provenientes de feridas por mordeduras. As
espécies aeróbias mais comuns identificadas são: Streptococcus,
Staphylococcus, Moraxella, Corynebacterium, e Neisseria (PATRONEK;
SLAVINSKI, 2009).
Segundo dados do SUS (Sistema Único de Saúde) no Brasil, de 2000-
2007, houve 4.520 internações ocasionadas por mordeduras de gatos e outros
mamíferos excetuando-se os cães, e dados mais recentes de 2008-2010 já
computam 1022 internações, sem contabilizar os atendimentos ambulatoriais,
gerando alto custo à saúde pública (BRASILa; BRASILb). As mordeduras e
arranhões representam a questão mais importante na saúde pública
relacionada a cães e gatos por causa do trauma físico e psicológico, também
computa-se as feridas infectadas por diferentes microrganismos e o risco da
transmissão de zoonoses. No passado, o risco da transmissão da raiva era a
questão de saúde pública mais importante ligada a esses ferimentos, mas a
atenção vem sendo focada na associação médica e custos com a saúde
pública (OSTANELLO et al., 2008).
Não obstante a natureza da maioria das mordeduras, o custo dos
ferimentos causados por cães permanece substancial. A partir de dados
coletados provenientes de 904 hospitais em 17 estados dos EUA (Estados
Unidos), foi estimado em pelo menos 330 000 visitas em departamentos de
emergência e 5.991 altas hospitalares relacionadas com injúrias por
mordeduras de cães. A estimativa com cuidados médicos diretos ocasionados
por cães é de165 milhões de dólares (PATRONEK; SLAVINSKI, 2009).
Os atendimentos de emergência nos USA causados por mordeduras de
cães e gatos compreendem 1% de todos os atendimentos, e números similares
são vistos na Europa. As mordeduras por gatos são mais comuns em mulheres
e idosos. A maioria das exposições ocorre em crianças entre cinco e nove anos
de idade (OEHLER et al., 2009).
45
A ameaça de ataques animais a pessoas é ainda um enorme problema
médico e social. Esses ataques resultam em milhões de injúrias e milhares de
mortes por todo o mundo. Na Turquia entre 1995-2004, 240 mordeduras
animais resultaram em mortes e um total de 39. 511 pacientes necessitaram de
hospitalização. Uma média de 177 fatalidades por ano relacionada a animais é
relatada nos USA. Além disso, os custos médicos desses incidentes fatais e
não fatais tem um impacto significante na saúde pública. No departamento de
emergência na Turquia em dois anos, um total de 921 lesões relacionadas a
injúrias animais deram entrada. Dos pacientes, 73,2% eram homens e 44,4%
crianças. A hospitalização ocorreu em 5,6% dos pacientes. A maioria das
lesões foram ocasionadas no verão(91,3%) e em períodos de alta umidade do
ar. Os gatos se encontraram em terceiro lugar como causadores de
mordeduras neste estudo, já que, os cavalos estavam em segundo lugar entre
os mamíferos. Já na Suiça, Espanha e USA, estes permaneceram logo depois
dos cães (EMET et al., 2009).
Em um estudo nos USA , o número de dias de internação dos pacientes
por mordidas de gatos foi de 2-8 dias. Todos os pacientes necessitaram de
tratamento cirúrgico. Quarenta e sete pacientes foram alocados na categoria 1,
com custos de 1.880 dólares, 30 pacientes na categoria 2 (internação), com
custos de 11.174 dólares, e 21 pacientes na categoria 3, (internação e
procedimento cirúrgico), 17.906 dólares. Na categoria 4 se enquadram os
pacientes com complicações e tratamento por seis semanas de antibióticos,
envolvendo um custo de 77.730 dólares. Na categoria 5, seis pacientes, foram
submetidos a debridamento ósseo, e reparo de nervos e tendões, com custo de
81.926 dólares (BENSON et al., 2006).
Nas mordeduras animais os estudos de sensibilidade “in vitro”
frequentemente não são realizados por fatores técnicos ou de contenção de
custos, e consequentemente os clínicos fazem o uso empírico dos
antimicrobianos (GOLDSTEIN et al., 1997; KRAMER et al., 2010) e isso faz
com que a escolha do antimicrobiano adequado para as infecções causadas
por mordidas humanas ou animais representem um dilema para os clínicos
(JAINDL et al., 2012). Aproximadamente 80% das feridas por mordidas
albergam potenciais patógenos, incluindo bactérias aeróbicas e anaeróbicas.
46
Embora alguns clínicos defendam o uso oral de cefalosporinas para feridas por
mordeduras, estão aumentando os relatos de falhas clínicas. Estudos revelam
a alta resistência bacteriana tipicamente encontrada nas feridas por
mordeduras a esse grupo. A amoxicilina associada ao ácido clavulânico se
mostrava clinicamente efetiva no tratamento de feridas infectadas causadas por
mordeduras e era considerada por vários como sendo a droga de escolha na
terapia empírica (GOLDSTEIN; CITRON, 1988).
A profilaxia realizada com antibióticos para pequenas feridas de
mordeduras de gatos, tem se mostrado efetiva em reduzir as taxas de infecção,
e a amoxicilina associado ao clavulanato tem se mostrado mais efetiva que
outros antibióticos nas infecções depois de mordeduras animais
(MITNOVETSKI; KIMBLE, 2004). A profilaxia com antimicrobianos tem sido
muito discutida e há muitas controvérsias sobre o assunto (JAINDL et al, 2012).
Mesmo feridas aparentemente menores requerem exploração
cuidadosa, porque as lesões que podem parecer superficiais podem recobrir
fraturas, laceração de tendões, vasos, ou nervos, se estender em cavidades do
corpo, penetrar espaços articulares ou danos a estruturas como os olhos.
Mesmo quando recebem atenção imediata cerca de 85% das mordidas
abrigam patógenos potenciais. A prevenção da infecção depois das feridas
permanece controvérsia, embora estudos recentes reportem taxas de infecção
mais altas que 45% depois de mordidas por cães e gatos. Os antibióticos são
quase sempre recomendados para as feridas de alto risco, tais como as
perfurantes profundas (causadas por gatos), e aquelas que requerem reparo
cirúrgico, e as que envolvem as mãos. Ocasionalmente infecções severas
podem se desenvolver depois de mordeduras, resultando da disseminação
hematógena, causando sepsis, endocardites, meningites ou penetração não
detectada em estruturas profundas, ocasionando abcessos cerebrais e artrites
sépticas (FLEISHER, 1999; SANTOS et al., 2007; KRAMER et al., 2010). As
infecções estafilocócicas são mais complicadas pela frequente multirresistência
aos antibióticos. A resistência a meticilina é comum (QUECK et al., 2009).
As mordeduras de gatos nas mãos de humanos tem ganhado atenção
especial por causa do alto potencial de infecção e complicações. A
administração profilática de antibióticos permanece controversa. Um estudo
47
prospectivo bem delineado e padronizado é necessário para examinar a
eficácia da profilaxia e tratamento das feridas. O tratamento antimicrobiano
deve ser direcionado contra os patógenos típicos associados com a microbiota
oral do animal mordedor e a pele da vítima e aqueles com maior probabilidade
de causar infecções (PATRONEK; SLAVINSKI, 2009).
Num estudo feito na Itália, avaliando mordeduras e arranhões
provenientes de mamíferos admitidos nos serviços de saúde, foram estudados
1509 pacientes, a maioria das injúrias foram causadas por cães (76,9%),
seguidas pelos gatos (19,7%). Os ferimentos por cães ocorreram mais em
homens, enquanto que os ferimentos por gatos ocorram em maior frequência
em mulheres. As lesões causadas por gatos mais frequentemente envolviam
as mãos (69,6%), extremidades baixas (14,7%), braços (13,3%), e face,
cabeça e pescoço (2,3%) (OSTANELLO et al., 2008).
No Canadá, uma a duas pessoas em média morrem ao ano por ataques
de cães. Num estudo realizado nesse país, 85,7% dos ataques foram em
crianças e com menos de 12 anos de idade, e 60% das vítimas eram homens
(RAGHVAN, 2008). As mordeduras de animais podem causar sérias
complicações como no caso relatado na África de um menino de 21 meses que
havia sido mordido por um cão há um mês, e apresentou um abcesso cerebral
que teve que ser tratado cirurgicamente onde foi drenado 100 microlitros de
pus (JONES, 2000).
Um estudo no Reino Unido, revelou que duas semanas após ser
mordida, uma senhora de 66 anos apresentando boa saúde desenvolveu
endocardite por S.aureus. Vários casos são descritos na literatura. Uma boa
higiene da ferida e o uso de antimicrobianos de amplo espectro em casos de
mordeduras animais devem sempre ser considerados (BRADSHAW, 2003),
porque podem provocar doenças graves como pneumonia, abcessos
pulmonares, peritonites, endocardites, meningites, e sepsis que são bem
conhecidas, especialmente em pacientes imunocomprometidos. Na Croácia foi
relatado um caso de um paciente imunocomprometido que foi mordido por um
gato desconhecido, e rapidamente desenvolveu sepsis, morrendo 70 horas
após a mordida apesar de todo o tratamento intensivo realizado
(DRENJANCEVIC et al., 2008).
48
Mitnovetski e Kimble (2004) conduziram um estudo com mordeduras de
gatos na Austrália, e observaram que a maioria dos pacientes que sofreram as
injúrias foram mulheres de meia idade. Geralmente apresentavam dor, eritema,
inchaço, ao redor da perfuração, embora outros sinais pudessem ser
evidenciados, como elevação da temperatura, linfangite, linfadenite, e coleção
de pus. A infecção é a complicação mais comum de mordeduras de gatos nas
mãos.
Na Suécia, em 72 episódios, 91% das mordidas de gatos foram
localizadas na mão ou no braço, cinco nos pés ou pernas, e dois na face.
Dezenove pacientes foram hospitalizados devido à doença severa ou cirurgias.
Complicações ocorreram em 14 pacientes (18%). As mordidas por gatos foram
mais comum em mulheres (70%) neste estudo, e esse achado é similar em
vários outros (WESTLING et al., 2006).
Quadro 1. Gêneros comuns de bactérias aeróbicas e anaeróbicas isoladas de feridas por mordeduras de gatos.
Microrganismos aeróbicos Referências
Pasteurella multocida Mitnoveski and Kimble, 2004; Westling et al., 2006;
Santos et al., 2007; García et al., 2009; Patroneck
and Slavinski, 2009
Staphylococcus sp. Mitnoveski and Kimble, 2004; Westling et al., 2006;
Santos et al., 2007; Patroneck and Slavinski, 2009
Streptococcus sp. Mitnoveski and Kimble, 2004; Westling et al., 2006;
Santos et al., 2007; Patroneck and Slavinski, 2009
Neisseria sp. Patroneck and Slavinski, 2009
Moraxella sp. Patroneck and Slavinski, 2009; Weinberg and Branda,
2010
Corynebacterium sp. Patroneck and Slavinski, 2009
Enterococcus sp. Abrahamian and Goldstein, 2011
Bacillus sp. Abrahamian and Goldstein, 2011
Microrganismos anaeróbicos Referências
Porphyromonas sp. Westling et al., 2006
49
Bacteroides sp. Westling et al., 2006; Patroneck and Slavinski, 2009
Prevotella sp. Westling et al., 2006; Patroneck and Slavinski, 2009
Propionibacterium sp. Westling et al., 2006
Fusobacterium sp. Westling et al., 2006; Patroneck and Slavinski, 2009
50
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GERAL
Identificar a presença de Staphylococcus na cavidade oral de gatos,
verificando as espécies envolvidas bem como sua susceptibilidade aos
antimicrobianos, em particular a resistência à meticilina, com vistas ao seu
papel em Saúde Pública.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Isolar e identificar as espécies de Staphylococcus presentes na cavidade
oral de gatos clinicamente saudáveis.
Avaliar a sensibilidade aos antimicrobianos dos Staphylococcus
isolados.
Detectar a resistência à meticilina por métodos fenotípicos e genotípicos.
51
4. MATERIAL E MÉTODOS
O estudo foi aprovado pelo Comitê de ética no uso de animais (CEUA) da
Universidade Federal Fluminense e recebeu o número 141/09.
4.1. LOCAL DO ESTUDO
O estudo foi realizado na cidade de Teresópolis, estado do Rio de Janeiro.
Foram estudados animais de 13 bairros da cidade, como Alto, Agriões, Várzea,
Vale do Paraíso, Panorama, São Pedro, Pimenteiras, Canoas, Féo, Araras,
Fazendinha, Golf e Barra, em Julho de 2009.
4.2. ANIMAIS
A pesquisa foi realizada colhendo-se amostras de 200 gatos, sendo 128
machos e 72 fêmeas, adultos (acima de um ano de idade), sendo 174 SRD
(sem raça definida) e 26 animais de raça (18 siameses e oito persas),
clinicamente saudáveis (mucosas normocoradas, ausência de lesões na
cavidade oral, ausência de lesões corporais e secreções e bom escore
corporal). Os critérios de inclusão previam ausência de qualquer doença
infecciosa e ausência de tratamento com antimicrobianos há pelo menos 30
dias. Foram excluídos 27 animais do estudo. Todos os animais possuíam dono.
Em casas com grande número de animais, limitou-se a coleta a cinco animais.
Todos os proprietários foram esclarecidos quanto aos objetivos do estudo e
assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido para participação da
pesquisa.
52
4.3. COLETA DAS AMOSTRAS
As amostras foram colhidas por três pessoas na clínica escola de
medicina veterinária do UNIFESO (Centro Universitário Serra dos Órgãos), e
nos domicílios dos animais no mês de Julho de 2009. Após contenção física, a
colheita de amostras foi realizada com auxílio de swab estéril na região
sublingual de cada gato (Figura 1). Os swabs em meio de Stuart (ABSORVE,
JIANGSU, CHINA) foram então identificados e acondicionados, sendo
mantidos sob refrigeração até o transporte ao laboratório.
Figura 1: Coleta de amostra com swab estéril na região
sublingual do gato.
4.4. PROCESSAMENTO BACTERIOLÓGICO
4.4.1. Cultura bacteriana
Todas as amostras foram identificadas por número e semeadas em
placa contendo o meio Agar manitol salgado (Agar Chapman – HIMEDIA,
MUMBAI, INDIA) e incubados a 37ºC em aerobiose, em estufa bacteriológica
por 24h. Uma vez que tal meio é seletivo e indicador para Staphylococcus sp.,
não foram considerados outros microrganismos. Amostras em que não se
53
observou nas placas crescimento sugestivo de Staphylococcus sp. foram
inoculadas em caldo BHI (Brain Hearth infusion - HIMEDIA, MUMBAI, INDIA)
em tubos para enriquecimento por 24h a 37ºC para posteriormente serem
novamente semeadas em Agar manitol salgado. Foi realizada nova semeadura
em Agar manitol salgado de todas as mostras para purificação das colônias.
As colônias foram categorizadas de acordo com suas características
macroscópicas. Essas colônias isoladas foram semeadas em meio ATS (Agar
tripticase soy - HIMEDIA, MUMBAI, INDIA) para formação de massa
bacteriana. Foram incubadas à 24h/37ºC. Foram retiradas das placas e então
congeladas em crio tubos contendo meio com leite e glicerol a 10%,
previamente esterilizado por autoclavação, devidamente identificadas e
armazenadas em freezer a temperatura de -20°C.
4.4.2. Identificação bacteriana
Em todas as provas foram utilizadas cepas controle positivas e
negativas, como, S. epidermidis (ATCC 14990), S. haemolyticus (ATCC
29970), S. aureus (ATCC 12600), S. hominis hominis (ATCC 27844), S.
saprophyticus saprophyticus (ATCC 15305), S. cohnii cohnii (ATCC 29974), S.
xylosus (ATCC 29971), S. lugdunensis (DSMZ 4804), S. schleiferi scheiferi
(DSMZ 4807) e S. warneri (ATCC 10209).
As amostras bacterianas sugestivas de pertencerem ao gênero
Staphylococcus sp. foram identificadas com base nas características coloniais,
morfo-tintoriais, produção de pigmento e provas bioquímicas diversas (HOLT et
al., 1994; MAC FADDIN, 1997; BANNERMAN, 2003).
As provas utilizadas para confirmação de gênero foram à prova da
catalase e prova OF (fermentação/oxidação) da glicose em meio Hugh e
Leifson (BAKER; HACKETT; SIMARD, 1986).
As provas utilizadas para identificação das espécies foram o teste da
coagulase em tubo, produção de acetoína, fosfatase, redução de nitrato a
nitrito, urease (VETEC - DUQUE DE CAXIAS, RJ, BRASIL), resistência à
polimixina, desferrioxamina, novobiocina (SENSIFAR - SÃO PAULO, SP,
54
BRASIL), descarboxilação da arginina e ornitina e produção da enzima
pirrolidonil arilamidase (PYR), além da fermentação aeróbica de sacarose, D-
manose, D-celobiose, D-xilose, ribose, D-trealose, maltose, lactose e D-manitol
(VETEC - DUQUE DE CAXIAS, RJ, BRASIL) (BANNERMAN, 2003).
4.4.2.1 Teste da coagulase: A coagulase é uma enzima que é
secretada durante o crescimento bacteriano. Foi diluído o
plasma liofilizado de coelho em salina (0,85%) e adicionado
cinco colônias da amostra em estudo e colocados em tubos
estéreis e incubados a 37°C. A leitura foi realizada com 4h e
as negativas confirmadas em 24h de incubação. O resultado
positivo foi quando se formou um coágulo e a prova negativa
não houve formação.
4.4.2.2 Teste da catalase: Este teste foi utilizado para diferenciação
dos gêneros Staphylococcus e Streptococcus. Os
estafilococos em contato com a solução de H₂O₂ produzem
formação de bolhas. Foi adicionado á lâmina de vidro de
microscopia uma gota de H₂O₂ e com auxilio de agulha
bacteriológica tocou-se a colônia em teste e colocou-se em
contato com a gota.
4.4.2.3 Teste da oxidação e fermentação da glicose (OF): Teste
utilizado para diferenciação entre os gêneros Micrococcus e
Staphylococcus. Os Staphylococcus sp. apresentam
metabolismo fermentativo, fazendo com que o meio de cultura
inicialmente verde, se torne amarelo. Preparou-se dois tubos
com 5mL para cada amostra com meio de Hugh & Leifson`s,
pH7,1, repicou-se uma colônia em cada tubo, sendo que um
tubo foi coberto com óleo mineral. Os meios e o óleo foram
esterilizados. A incubação foi feita a 37°C por 48h.
55
4.4.2.4 Produção de acetoína: Avaliou a produção de acetoína
proveniente da glicose ou piruvato. Foi utilizado o caldo de
Clark & Lubs, pH 6,9 em tubos com 3mL esterilizados por
autoclavação. Colocou-se uma gota do inoculo pela escala de
Mc Farland equivalente a 2.0. A incubação foi feita a 37°C por
48h. Após esse período foi adicionado 0,6 mL do reativo alfa-
naftol a 5% e em seguida 0,2mL do reativo KOH 40%. A
leitura foi feita com 15min e até uma hora após a adição dos
reagentes. O resultado positivo apresentou coloração rosa-
vermelho, e no negativo não houve alteração de cor do meio.
4.4.2.5 Redução do nitrato: Preparou-se o caldo nitrato, pH 7,0.
Distribuiu-se 2,0 mL por tubo e realizada a esterilização por
autoclavação. Adicionou-se três gotas do inoculo equivalente
a 2,0 na escala de Mc Farland. Incubou-se a 37°C por 24 h, e
procedeu-se a adição de 0,5 mL de cada reagente. Alfa
naftilamina a 0,5% e em seguida ácido sufanílico a 0,8%. O
teste positivo apresentou cor rosa-vermelho e o negativo não
apresentou alteração de cor do meio. A coloração marrom
apareceu em amostras fortemente positivas.
4.4.2.6 Fermentação de carboidratos: Utilizou-se o caldo base
vermelho fenol, pH 7,4. Esse caldo foi esterilizado por
autoclavação e após a solução de açúcar foi adicionada já
filtrada por filtros Millipore estéreis. Distribuiu-se 3mL por tubo
e a solução final dos açúcares ficou em 1%. Foi inoculado 5
gotas de cultura na turvação de 2,0 da escala de Mc Farland e
incubados a 37°C, por 72h. As leituras foram feitas 24, 48 e
72h, sendo que em cada uma delas eram retirados os tubos
positivos. Foram utilizados nove açúcares para cada amostra
(lactose, manitol, manose, maltose, celobiose, xilose, trealose,
ribose e sacarose). O resultado positivo produziu coloração
amarela (pH ácido 6,8), o resultado negativo coloração
56
vermelho-rosa (pH alcalino) e quando apresentou coloração
laranja, indicou prova duvidosa, foi repetida.
4.4.2.7 Descaboxilação da Arginina e ornitina: Utilizou-se o meio base
Moller descarboxilase, pH 6,0. Foi distribuído 1 mL por tubo e
esterilizados por autoclavação. Foi adicionado inoculo pesado
uma gota com turvação 2,0 da escala de Mc Farland em salina
em cada tubo e cobertos com óleo mineral estéril. A incubação
foi feita a 37°C, por 72h. Os tubos com resultado positivos
apresentaram coloração roxa e os negativos, coloração
amarela.
4.4.2.8 Produção de fosfatase: Preparou-se o caldo PDP, pH 7,5. Foi
realizada a esterilização por autoclavação e distribuição de 3,0
mL por tubo. Foi adicionado uma gota da solução PDP
(difosfato de fenolftaleína 0,5%) por tubo. Esta solução foi
esterilizada por filtração em membrana Millipore. Adicionou-se
5 gotas do inoculo pesado equivalente ao grau 2,0 na escala
de Mc Farland em salina. Procedeu-se a incubação a 37°C por
24h. Após o período de incubação foi adicionado uma gota de
solução Na OH 40%. Os tubos positivos apresentaram
coloração rosa-vermelho e nos tubos negativos não houve
alteração de cor do meio.
4.4.2.9 Hidrólise da uréia: Verificação da presença da enzima urease.
Utilizou-se o caldo uréia Rustigian & Stuart`s, pH 6,8. Meio
esterilizado por autoclavação e distribuídos 3,0mL por tubo.
Adicionado cinco gotas do inoculo equivalente ao grau 2,0 na
escala de Mc Farland. A incubação foi feita a 37°C por 48h. A
prova positiva apresentou coloração rosa-vermelho e na prova
negativa não houve alteração na coloração do meio.
57
4.4.2.10 Produção da enzima pirrolidonil arilamidase (PYR): A atividade
da pirrolidonil arilamidase pode ser determinada pela hidrólise
da piroglutamil-beta naftilamida à L-pirrolidona e beta-
naftilamina, os quais combinados com o reagente PYR (p-
dimetilaminocinamaldeido) produz coloração vermelha. Foi
utilizado Kit comercial da Probac do Brasil®. Os discos foram
colocados em lâmina de vidro e umedecidos com água
destilada estéril. Com auxílio de alça flambada foi feito um
esfregaço com a bactéria no disco. Após 5 minutos a
temperatura ambiente colocou-se uma gota do PYR reagente.
As reações ocorreram em um minuto. As amostras positivas
apresentaram coloração vermelho cereja. As amostras
negativas apresentaram coloração amarela ou alaranjada.
4.4.2.11 Teste de resistência a novobiocina, polimixina e
desferrioxamina: Foi realizado o teste de suscetibilidade em
discos no meio de cultura Mueler Hinton com inoculo 0,5 da
escala de Mc Farland. Foram utilizados discos comerciais de
polimixina B (300µg) e discos de novobiocina. Foram
preparados discos de desferrioxamina (100µg). A
sensibilidade da novobiocina foi indicada pela zona de inibição
≥16mm, a susceptibilidade a polimixina B foi indicada pela
zona de inibição ≥ 6mm diferenciando S. epidermidis (R) S.
hominis (S). A desferrioxamina foi utilizada para diferenciação
de S. warneri(R) S. hominis (S).
4.4.3. Testes de suscetibilidade aos antimicrobianos (TSA)
Utilizou-se suspensões bacterianas em solução salina estéril, ajustadas
em turvação equivalente ao grau 0,5 da escala de McFarland e obtidas a partir
de colônias isoladas após o crescimento em Agar Chapman (HIMEDIA –
MUMBAI, INDIA) e repicadas em meio ATS (HIMEDIA – MUMBAI, INDIA) para
então serem semeadas em placa contendo o meio Agar Muller Hinton
58
(HIMEDIA – MUMBAI, INDIA) para a realização do TSA pelo método de difusão
de discos, de acordo com as recomendações do Clinical and Laboratory
Standards Institute - CLSI (CLSI, 2008; CLSI, 2010). Resumidamente,
pequenos discos comerciais (Laboratório Sansifar) de papel de filtro
impregnados com concentrações conhecidas e pré-definidas (concentração
plasmática que a droga alcança após administração sistêmica) de
antimicrobianos foram colocados equidistantes na superfície do meio. As
placas foram incubadas à 35ºC(+ ou – 2) por 24 horas, quando então foram
medidos os halos de inibição de crescimento para cada antimicrobiano. De
acordo com o tamanho desses halos, medidos com auxílio de halômetro e
conferidos com a literatura (CLSI, 2008), as amostras foram classificados como
sensíveis ou resistentes.
Para o presente estudo foram testados os antimicrobianos de acordo
com uma escolha realizada pelas recomendações do CLSI humano e
veterinário, totalizando 16 drogas, já que o intuito seria o tratamento de seres
humanos mordidos por animais. A classe dos aminoglicosídeos foi
representada pela gentamicina (10µg), tobramicina (10 µg), enquanto as
fluoroquinolonas foram representadas pela enrofloxacina (5µg), ciprofloxacino
(5µg) e norfloxacino (10µg). Penicilinas foram representadas pela cefoxitina (10
µg), oxacilina (1µg) penicilina (10 UI). No grupo dos nitrofuranos a
nitrofurantoína (300µg). No grupo das tetraciclinas foram testadas a tetraciclina
(30µg) e a doxiciclina (30µg). No grupo das lincosamidas a clindamicina (2µg) e
no grupo dos macrolídeos a eritromicina (15µg). No grupo dos inibidores de
folato o trimetropim + sulfametoxazol (1,25/23,75µg). No grupo dos fenicóis, o
cloranfenicol (30µg), e no grupo das ansamicinas foi testada a rifampicina
(5µg). Os discos utilizados foram do laboratório SENSIFAR (SÃO PAULO, SP).
4.5 Detecção do gene mecA
Todas as amostras de Staphylococcus sp. foram submetidas à detecção
do gene de resistência à meticilina mecA pela reação em cadeia da polimerase
para confirmação dos resultados da análise fenotípica. Este método permitiu
também a comparação do uso dos discos de cefoxitina e oxacilina para
amostras de origem veterinária. Todas as amostras que foram consideradas
59
resistentes a meticilina no método de difusão de discos como também as não
resistentes foram submetidas à detecção do gene mecA.
4.5.1 Liberação do DNA
A extração do DNA bacteriano foi realizada pelo método de lise térmica
como descrito por Pacheco e colaboradores (1997). As amostras foram
semeadas em meio Agar tripticase soja e incubadas a 37ºC em aerobiose
durante 24 horas.
A partir desse crescimento bacteriano foi preparada uma suspensão em
1,5mL de tampão TE [Tris-HCl 10mM (pH 8,0), EDTA 1mM (ph 8,0)] ajustadas
em turvação equivalente ao grau 6,0 da escala de McFarland. Um volume de
558μL da suspensão original foi centrifugada a 12.000 x g por um minuto. Após
a centrifugação, o sobrenadante foi descartado e 200 μL de tampão TE foram
adicionados ao sedimento. Essa nova suspensão foi, então, submetida à
fervura por 10 minutos e em seguida, foi centrifugada e, agora, o sobrenadante
separado para ser utilizado como fonte de DNA nas reações de amplificação.
4.5.2 Reação em cadeia da polimerase (PCR)
As amostras de estafilococos foram submetidas à PCR para detecção do
gene de resistência à meticilina mecA. Com isto, foi realizada a confirmação
das amostras bacterianas em MRS e, também, sugeriu a determinação da
eficiência dos discos de cefoxitina e oxacilina para detecção desta resistência
em amostras de origem veterinária.
A detecção do gene mecA foi realizada de acordo com Zhang e
colaboradores (2005), com modificações. A reação consistiu de um volume
final de 25μL com os seguintes reagentes: 50 mM de KCl, 20 mM de Tris-HCl
(pH 8.4), 2,5 mM de MgCl2, 0,2 mM of dNTP, 0,2 M de cada iniciador (todos os
reagentes obtido da Invitrogen, Carlsbad, California, EUA), além de 2 μL da
solução contendo DNA obtida após a liberação. Foram utilizados os iniciadores:
5’-GTG AAG ATA TAC CAA GTG ATT-3’ e 5’-ATG CGC TAT AGA TTG AAA
GGA T-3’.
A amplificação foi realizada em um termociclador (Applied Biosystems,
60
California, EUA) e consistiu de uma etapa de desnaturação inicial de 94ºC por
cinco minutos, seguido por 30 ciclos de 94ºC por 45 segundos, 65ºC por 45
segundos e 72ºC por um minuto e meio, e uma etapa de extensão final de 72º
C por dez minutos.
A visualização dos produtos da reação foi realizada por meio de
eletroforese em gel de agarose a 1% em tampão TBE 0,5X (0,05 nM de Tris,
1,25 mM de EDTA e 0,05 M de ácido bórico). Foi utilizado um marcador
molecular de 100 pb (Invitrogen). O produto da amplificação foi visualizado sob
luz ultravioleta após o gel ser corado com brometo de etídio a 0,5 μg/mL. O
peso do produto esperado foi de 147 pb.
5. ANÁLISE DE DADOS
Os dados coletados foram armazenados em planilha de Excel. Avaliou-
se a frequência da ocorrência das diferentes espécies de Staphylococcus.
Foram empregados testes não paramétricos para avaliar a resistência aos
antibióticos das diferentes espécies de Staphylococcus, assim como a
ocorrência do gene mecA. Empregou-se o teste de qui-quadrado.
61
6. RESULTADOS
Das 200 amostras colhidas dos 200 gatos, 141 (70,5%) apresentaram
crescimento de Staphylococcus, enquanto em 59 amostras (29,5%), não houve
crescimento de microrganismos deste gênero, mesmo após a etapa de
enriquecimento em caldo BHI (após o enriquecimento em BHI houve 10% de
crescimento nas amostras não crescidas inicialmente em Chapman).
Das 141 amostras em que houve crescimento compatível com
Staphylococcus sp, em 88 (44%) obteve-se o crescimento de apenas um tipo
colonial sugestivo deste gênero, enquanto em 35 (17,5%) obteve-se dois tipos
distintos e em 18 (9%) obteve-se três tipos coloniais. Assim, a partir das 141
amostras onde ocorreu crescimento de microrganismos deste gênero, foram
obtidas um total de 212 amostras bacterianas de Staphylococcus sp.
Destas 212 amostras bacterianas, 190 mostraram-se como
Staphylococcus coagulase-negativos (89,6%), sendo estes mais frequentes
(<0,0001) na população do que os coagulase-positivos, com 22 amostras
(10,4%). De acordo com a análise bioquímica para classificação das espécies,
dos 212 isolados, a espécie mais frequente foi S. xylosus (50,9%), seguida de
S. felis (27,4%), S. simulans (6,1%), grupo S.intermedius (SIG) (5,7%), S. sciuri
(5,2%), e com menor frequência S. aureus (4,7%) (Tabela 1).
62
Tabela 1: Distribuição de espécies de Staphylococcus sp. obtidas de amostras da cavidade oral de 200 gatos da cidade de Teresópolis, RJ
ESPÉCIES Coagulase N° %
S. xylosus Negativa 108 50,9
S. felis Negativa 58 27,4
S. simulans Negativa 13 6,1
S. sciuri Negativa 11 5,2
Grupo S. intermedius (SIG) Positiva 12 5,7
S. aureus Positiva 10 4,7
TOTAL 212 100
No que se refere aos resultados das provas de susceptibilidade aos
antimicrobianos, verificou-se que penicilina e tetraciclina foram os
antimicrobianos aos quais as amostras bacterianas apresentaram maior
resistência (56,1%).
A resistência à eritromicina foi de 25,9%, ao cloranfenicol (24,5%), à
clindamicina (18,8%) à norfloxacina (8,9%), à enrofloxacina e ciprofloxacina
(8,0%), tobramicina (3,8%), nitrofurantoína (3,3%), sulfametoxazol+trimetropim
(1,9%), doxiciclina e gentamicina (0,9%), oxacilina (14,1%) e nenhuma amostra
foi resistente à rifampicina. Com relação à clindamicina 21 amostras
apresentaram resistência induzida na presença da eritromicina, no teste de
sensibilidade aos antimicrobianos (método de difusão em discos) quando
colocados os discos de eritromicina e clindamicina um ao lado do outro sendo
observado à formação do “D” no halo. (Tabela 2).
63
Tabela 2: Perfil de resistência das 212 amostras de Staphylococcus sp.
isoladas da cavidade oral de gatos frente a classe e aos antimicrobianos testados
* As amostras coagulase negativas foram testadas com discos de cefoxitina.** 21 amostras apresentaram resistência induzida.
A multirresistência, ou seja, a resistência a três ou mais classes de
antimicrobianos foi observada em 83 (39,1%) amostras, sendo que 15 eram
CoPS (Staphylococcus coagulase-positivos) e 68 eram CoNS (Staphylococcus
coagulase-negativos). A diferença de ocorrência de multirresistência entre
CoPS e CoNS não foi estatisticamente significante.
Classe Antimicrobiano N° de amostras resistentes a droga
%
Aminoglicosídeos
Gentamicina Tobramicina
2 8
0,9 3,8
Fluoroquinolonas
Enrofloxacina Ciprofloxacino Norfloxacino
17 17 19
8,0 8,0 8,9
Penicilinas
Oxacilina* Penicilina
30 119
14,1 56,1
Nitrofuranos
Nitrofurantoína
7
3,3
Tetraciclinas
Tetraciclina Doxiciclina
119 2
56,1 0,9
Lincosamidas
Clindamicina**
40
18,8
Macrolídeos Eritromicina 55 25,9
Inibidores do folato
Sulfa/Trimetropim
4
1,9
Fenicóis
Cloranfenicol
52
24,5
Ansamicinas
Rifampicina
0
0
64
De acordo com a classificação fenotípica, 14,1% das amostras
bacterianas estudadas se mostraram como Staphylococcus meticilina
resistente (MRS).
Foi verificada a resistência a pelo menos uma droga em 83,9% das
amostras, sendo que 44 apresentaram resistência a uma droga, 44 resistência
a duas drogas, 34 a três drogas, 16 a quatro drogas, 18 a cinco drogas, 11 a
seis drogas, sete a sete drogas, duas a oito drogas e duas a nove drogas
(Figura 2).
Figura 2: Padrão de resistência das 212 amostras de Staphylococcus sp. de acordo com a quantidade de drogas, frente aos 16 antimicrobianos avaliados.
Já no que se refere à resistência as classes de antimicrobianos, dez
amostras apresentaram resistência aos aminoglicosídeos, 20 à classe das
fluoroquinolonas, 123 a classe das penicilinas, sete a classe das
nitrofurantoínas, 122 a classe das tetraciclinas, 40 a classe das lincosamidas,
55 a classe dos macrolídeos, quatro a classe dos inibidores de folato, 52 a
classe dos fenicóis e nenhuma apresentou resistência à classe das
65
ansamicinas (Tabela 3). A classe das penicilinas foi o grupo de drogas onde foi
observado um maior número de amostras resistentes, 123 (58,0%).
Tabela 3: Perfil de resistência das 212 amostras de Staphylococcus sp.
isoladas da cavidade oral de gatos em relação as dez classes de antimicrobianos testadas
CLASSE N %
AMINOGLICOSÍDEOS 10 4,7
FLUOROQUINOLONAS 20 9,4
PENICILINAS 123 58,0
NITROFURANOS 7 3,3
TETRACICLINAS 122 57,5
LINCOSAMIDAS 40 18,8
MACROLÍDEOS 55 25,9
INIBIDORES DO FOLATO 4 1,9
FENICÓIS 52 24,5
ANSAMICINAS 0 0
Com exceção da classe das tetraciclinas, os Staphylococcus coagulase-
positivos (CoPS) foram mais resistentes a todas as classes de antimicrobianos
do que os coagulase-negativos (CoNS). Assim, em relação à classe dos
aminoglicosídeos, os CoPS apresentaram maior resistência do que os CoNS.
Já na classe das fluoroquinolonas, verificou-se que os CoPS apresentaram
27,3% das amostras resistentes, enquanto que os CoNS apresentaram 24,6%.
Em relação à classe das penicilinas os CoPS apresentaram resistência maior
com 70%, enquanto os CoNS mostraram 65,9%, o que também pôde ser
observado na classe das nitrofurantoínas com 4,5% dos CoPS resistentes e
3,1% dos CoNS. Para o grupo das tetraciclinas foi observado maior resistência
nos CoNS com 58,3% para 54% dos CoPS. Na classe das lincosamidas 54,5%
dos CoPS foram resistentes para 14,7 dos CoNS. Nos macrolídeos os CoPS
também prevaleceram com 59% de resistência e nos CoNS 21,6%. Na classe
dos inibidores do folato os CoPS também apresentaram maior resistência, com
4,5% enquanto que os CoNS apresentaram 1,6%, o que também foi observado
na classe dos fenicóis com 27,3% para os CoPS e 23,1% nos CoNS. Já na
66
classe das ansamicinas não houve resistência de ambos os grupos de
Staphylococcus (Tabela 4).
Tabela 4: Número de amostras resistentes dentre as 190 amostras de
Staphylococcus coagulase-negativas (CoNS) e 22 coagulase-positivas (CoPS) isoladas da cavidade oral de gatos em relação à classe de antimicrobianos e as 16 drogas testadas
Classe ATBa CoNS (190)
% CoPS (22)
%
Aminoglicosídeos GEN 2 1,0 0 0
TOB 5 2,6 2 9,1
Fluoroquinolonas ENO 16 8,4 2 9,1
CIP 14 7,3 2 9,1
NOR 17 8,9 2 9,1
Penicilinasb OXA 26 13,7 4 18,2
PEN 102 53,7 15 68,1
Nitrofuranos NIT 6 3,1 1 4,5
Tetraciclinas TET 109 57,3 12 54,5
DOX 2 1,0 0 0
Lincosamidas CLI 28 14,7 12 54,5*
Macrolídeos ERI 41 21,6 13 59,0
Inibidores folato SUT 3 1,6 1 4,5
Fenicóis CLO 44 23,1 6 27,3
Ansamicinas RIF 0 0 0 0 a ATB: antimicrobiano; GEN: gentamicina; TOB: tobramicina; ENO: enrofloxacina; CIP: ciprofloxacina;
NOR: norfloxacina; CFO: cefoxitina; OXA: oxacilina; PEN: penicilina; NIT: nitrofurantoína; TET: tetraciclina; DOX: doxiciclina; CLI: clindamicina; ERI: eritromicina; SUT: sufa + trimetropim; CLO: cloranfenicol; RIF: rifampicina. *Indica diferença estatisticamente sigfnificativa (p<0,0001)
Penicilinasb: Os CoNs foram avaliados por discos de cefoxitina e os CoPs por discos de oxacilina.
Em relação à resistência das espécies de Staphylococcus para as
classes de antimicrobianos testadas, foi observada para os CoNS, S. simulans
com 2,1% de resistência para classe dos aminoglicosídeos, seguidos de S. felis
com 1,0%, S. xylosus com 0,5% e S. sciuri, que não apresentou resistência à
classe. Já para os CoPS foi observado 4,5% em S. aureus e 4,5% no grupo
SIG.
67
Na classe das fluoroquinolonas, quanto aos CoNS, S. xylosus
apresentou 16,8% de resistência seguido de S. felis 7,3%, S. sciuri 0,5% e S.
simulans, que não apresentou resistência. Nos CoPS, S. aureus 13,6% e o
grupo SIG com 13,6%.
Na classe das penicilinas entre os CoNS foi observado 40,6% de
resistência nos S. xylosus, 20,5% nos S. felis, 5,2% nos S. simulans, 1,0% nos
S. sciuri e nos CoPS, 5,2% de resistência nos S. aureus e 4,7% no grupo SIG.
Na classe das nitrofurantoínas nos CoNS, observou-se 2,1% de
resistência nos S. xylosus, 0,5% nos S. felis, 0,5% nos S. simulans, não foi
observado resistência a essa classe nos S. sciuri, e nos CoPS 0,5% de
resistência nos S. aureus e nenhuma no grupo SIG.
A resistência observada na classe das tetraciclinas nos CoNS foi de
35,8% nos S. xylosus, 16,8% nos S. felis, 3,7% nos S. simulans, 2,1% nos S.
sciuri, no grupo dos CoPS observou-se 27,3% de resistência nos S. aureus e
27,3% no grupo SIG.
Nas lincomicinas os CoNS apresentaram 8,9% nos S. xylosus, 3,1% nos
S. felis, 2,1% nos S. simulans e 0,5% nos S. sciuri. Já nos CoPS, 31,8% de
resistência nos S. aureus e 22,7% nos grupo SIG.
Na classe dos macrolídeos nos CoNS, o S. xylosus apresentou 11,0%
de resistência, S. felis 6,8%, S. simulans 3,1% e S. sciuri 0,5%. Nos CoPS, S.
aureus 31,8% e o grupo SIG 27,2%.
Para os inibidores do folato os CoNS apresentaram 0,5% nos S. xylosus,
1,0% S.felis, e S. simulans e S. sciuri não mostraram resistência. Nos CoPS, S.
aureus não mostrou resistência e o grupo SIG 4,5%.
Na classe dos fenicóis, no grupo dos CoNS, S. xylosus apresentou
12,6% de resistência, S. felis 7,3%, S. simulans 2,1%, S. sciuri 1,0%. No grupo
dos CoPS, S. aureus 9% e o grupo SIG 18,1%.
Na classe das ansamicinas ambos os grupos CoNS e CoPS não
demonstraram resistência (Tabela 5).
68
Tabela 5: Número de amostras resistentes dentre as 190 amostras de
Staphylococcus coagulase-negativas (CoNS) e 22 coagulase-positivas (CoPS) isoladas da cavidade oral de gatos em relação às espécies e á 16 antimicrobianos testados.
Espécies de Staphylococcus resistentes
Classe ATB S. xylosus
S. felis
S. simulans
S. sciuri
TotalCoNS
S. aureus
SIG TotalCoPS
Aminoglicosídeos GEN 0 1 1 0 2 0 0 0
TOB 1 1 3 0 5 1 1 2
Fluoroquinolonas ENO 10 5 0 1 16 1 1 2
CIP 10 4 0 0 14 1 1 2
NOR 12 5 0 0 17 1 1 2
Penicilinasb
CFO 16 8 2 0 26 - - -
OXA - - - - - 1 3 4
PEN 61 31 8 2 102 8 7 15
Nitrofuranos NIT 4 1 1 0 6 1 0 1
Tetraciclinas TET 67 31 7 4 109 6 6 12
DOX 1 1 0 0 2 0 0 0
Lincosamidas CLI 17 6 4 1 28 7 5 12
Macrolídeos ERI 21 13 6 1 41 7 6 13
Inibidores folato
SUT 1 2 0 0 3 0 1 1
Fenicóis CLO 24 14 4 2 44 2 4 6
Ansamicinas RIF 0 0 0 0 0 0 0 0
a ATB: antimicrobiano; GEN: gentamicina; TOB: tobramicina; ENO: enrofloxacina; CIP: ciprofloxacina;
NOR: norfloxacina; CFO: cefoxitina; OXA: oxacilina; PEN: penicilina; NIT: nitrofurantoína; TET: tetraciclina; DOX: doxiciclina; CLI: clindamicina; ERI: eritromicina; SUT: sufa + trimetropim; CLO: cloranfenicol; RIF: rifampicina.
Penicilinasb: Os CoNs foram avaliados por discos de cefoxitina e os CoPs por discos de oxacilina.
Resultado da Análise molecular (PCR)
Foi realizada a Reação em Cadeia da Polimerase para identificação do
gene mecA nas 212 amostras.
Das 212 amostras, 30 apresentaram-se fenotipicamente como
Staphylococcus meticilina resistentes (MRS). Das 182 amostras
negativas fenotipicamente, confirmaram-se negativas com a realização
69
da PCR, ou seja não apresentavam o gene mecA. Das 30 amostras
fenotipicamente suspeitas, 26 (12,3%) apresentaram-se positivas
(Tabela 6), ou seja, confirmando a presença do gene MecA (Fig.3)
pela realização da PCR.
Figura 3: Eletroforese de produtos obtidos da PCR para pesquisa do gene mecA de
cepas de Staphylococcus sp. isoladas da cavidade oral de gatos em gel de agarose 1%
70
Tabela 6 : Resultado das amostras (30) fenotipicamente suspeitas
submetidas à PCR para pesquisa do gene mecA
ESPÉCIE/ COAGULASE OXACILINA CEFOXITINA mecA
S. xylosus N I R + S. xylosus N R R + S. xylosus N R R + S. xylosus N R R + S. xylosus N R R + S. xylosus N S R - S. xylosus N R R + S. xylosus N R R + S. xylosus N R R + S. xylosus N R R + S. xylosus N R R + S. xylosus N R R + S. xylosus N R R + S. xylosus N R R + S. xylosus N R R + S. xylosus N R R + S. xylosus N R R + S.felis N R R + S. felis N R R - S. felis N R R + S. felis N R R + S. felis N R R + S. felis N R R + S. felis N R R - S. simulans N R R + S. simulans N R R + S. simulans N I R + S. simulans N R R + Grupo intermedius P R R + Grupo intermedius P R S -
N – Coagulase negativa; P – Coagulase positiva; R – Resistente, S – Sensível, I – Resistência intermediária.
71
7. DISCUSSÃO
Membros do gênero Staphylococcus sp. estão amplamente distribuídos
em infecções e também são residentes da microbiota da pele e das mucosas
de humanos e animais. Tal fato pôde ser confirmado no presente estudo, uma
vez que tais microrganismos foram recuperados em cultura pura a partir de
amostras da cavidade oral de gatos saudáveis, conforme esperado (Zubier et
al. 2007, Moodley et al., 2009, Otto 2009 e Pantosti 2012). A frequência de
recuperação de 70,5% verificada no presente estudo se assemelha ao estudo
realizado na mesma população (Lilenbaum; Esteves; Souza, 1999) quando se
relatou o isolamento de 104 cepas deste microrganismo apartir da saliva de
150 gatos hígidos (69,3%).
Staphylococcus vem sendo isolados de gatos com frequência em
diferentes países, como relatado por Cox et al (1985), que isolaram várias
espécies de Staphylococcus de gatos saudáveis das narinas anteriores, boca,
faringe, conjuntiva, orelhas, vagina e prepúcio nos USA. Já Loeffler et al.
(2005) isolaram Staphylococcus da mucosa bucal e nasal de gatos no Reino
Unido, assim como Malik, Peng e Barton (2005), que isolaram Staphylococcus
da pele de gatos hígidos na Austrália. Já Rich (2005) isolou vários
Staphylococcus provenientes de amostras da pele de gatos doentes no Reino
Unido. Desta forma, é consenso à presença de Staphylococcus tanto em gatos
saudáveis como doentes.
Staphylococcus coagulase-negativos foram prevalentes nesse estudo
(89,6%), o que também foi verificado por Lilenbaum, Esteves e Souza (1999) e
Loeffler et al. (2005). Embora pequenas variações na biota possam ocorrer
devido à população analisada, ao grupo a que vivem, tipo de manejo e do meio
72
ambiente habitado por esses animais, é também consenso que Staphylococcus
coagulase-negativos são membros majoritários da microbiota dos gatos (Rich,
2005; Ganiere, Medaille e Mangion, 2005; Malik, Peng, Barton, 2005; Soares et
al. 2008).
A maior frequência de amostras de S. xylosus foi outro achado não
surpreendente, visto que, esta vem sendo a espécie mais isolada da
amostragem animal (Rich, 2005; Soares et al. ,2008). No entanto, Lilenbaum;
Esteves; Souza (1999) relataram S. felis como a espécie de maior prevalência.
É digno de nota que, mesmo considerando que o estudo citado tenha sido
conduzido também no Rio de Janeiro, as populações estudadas são diferentes,
e também ao longo dos anos o perfil das espécies de estafilococos
pertencentes à microbiota normal possa estar em contínua modificação, visto
que, ocorrem mudanças ambientais, adaptação dos microrganismos e
evolução das espécies. Também Igimi et al. (1994) no Japão, em condições
distintas, relataram predominância de S.felis em diversas amostras clínicas de
gatos, além da presença, em menor escala, de S. simulans, S. aureus, S.
intermedius, S. sciuri, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. xylosus, S. cappitis,
S. equorum, S. galinarum e de S. lentus. Tal variabilidade de espécies é
esperada, já que são grupos populacionais distintos de animais, épocas
diferentes de análise, climas diferentes e animais criados com manejos
variados.
Enfatizando a importância do manejo e da ambientação diferentes na
variabilidade das espécies de Staphylococcus, Cox et al. (1985) encontraram
S. simulans (43,9%) como a espécie mais frequente. Deve- se observar que
tais autores estudaram amostras provenientes de gatos de gatis, onde há
grande concentração de animais; a fim de evitar tal viéis, no presente estudo
limitou-se a coleta de amostras ao máximo de cinco animais por residência.
Embora tenham sido encontrados em menor número no presente
estudo, deve-se observar que os CoPS, tais como S. aureus e membros do
grupo SIG, são microrganismos virulentos envolvidos em diversos processos
infecciosos, como cistites, piodermites, septicemias e pneumonias (PITKALA et
al., 2007; PANTOSTI, 2012) nos animais e no homem. Sua presença em
amostras nasais e retais de gatos foi relatada no Canadá (HANSELMAN et al.,
73
2009) assim como no Brasil (LILENBAUM; ESTEVES; SOUZA, 1999). Apesar
da possibilidade de causarem processos infecciosos, estes microrganismos
foram isolados também de animais sadios, indicando que estas cepas podem
fazer parte da microbiota normal de gatos.
Desta forma, considerando-se a grande ocorrência de membros do
gênero Staphylococcus sp, tanto CoNS quanto CoPS, na cavidade oral de
gatos, não é surpreendente que tais microrganismos tenham sido relatados em
infecções secundárias às mordeduras por gatos em mãos de humanos
(MITNOVESTSKI; KIMBLE, 2004), evidenciando o potencial zoonótico destes
agentes e os prejuízos que estes eventos podem determinar para a saúde
pública.
Um achado alarmante diz respeito a alta frequência de resistência aos
antimicrobianos nas cepas isoladas, visto que 83,9% das amostras bacterianas
foram resistentes a pelo menos uma droga. Apesar de preocupante, este não
foi um achado inesperado, visto que já há três décadas sabe-se (LOVE et al.,
1981) que Staphylococcus isolados de infecções de gatos tem se revelado
resistentes às drogas antimicrobianas. Tal fenômeno vem sendo reforçado ao
longo dos anos com o aumento da resistência de amostras de origem felina
relatado na literatura (Cox et al.,1985; Lilenbaum; Esteves; Souza, 1999; Otto
2009). Pôde ser observado também neste estudo que com exceção da classe
das tetraciclinas, os CoPS foram mais resistentes a todas as classes de
antimicrobianos do que os CoNS, fato este que também foi observado em
outros estudos (Lilenbaum; Esteves; Souza, 1999; Malik, Peng, Barton, 2005),
e que possivelmente possa haver uma mudança neste perfil ao longo dos anos,
já que os CoNS são causadores de infecções, estando em constante contato
com diversos antimicrobianos.
Tal resistência variou bastante quanto à classe de antimicrobianos. Em
relação às penicilinas, esta vem sendo relatada e pode variar desde 15,3%
(Poeta e Rodrigues, 2008) a índices alarmantes (Malik, Peng, Barton, 2005),
tais como 58,6%. Rich (2005), com 62% ou 65,4% (Lilenbaum, Esteves e
Souza, 1999) para amostras obtidas de gatos, taxas bem altas comparáveis às
encontradas no presente estudo (58,0%). Analisando ainda a resistência á
classe das penicilinas, Soares et al. (2008) encontraram 95% de resistência,
74
concordando com Mimica e Mendes (2007) onde foram observadas as taxas de
90% em hospitais e 70% na comunidade e com Gonano et al. (2009) que em
225 amostras de S. aureus encontraram 40,6% de resistência em amostras
humanas. Embora tenha sido recentemente relatado que a penicilina V seria
suficiente para tratar mordeduras de gatos infectadas (Westling e Jorup, 2009),
tal recomendação se encontra em desacordo com o presente estudo e outros
relatos, que apontaram altas taxas de resistência das cepas de estafilococos a
esta classe. Tal resistência se deve principalmente pela produção de β-
lactamases, ou presença do gene mecA, frequentemente encontrado tanto em
amostras de origem animal quanto humana (PRESCOTT et al., 2002;
OLIVEIRA et al., 2007; BERGLUND et al., 2009).
Ao analisar a resistência à classe das tetraciclinas, um estudo
demonstrou um baixo índice (Poeta e Rodrigues, 2008) encontrando 11,5%,
discordante de outros (Ganieri, Medaille e Mangion, 2005) que verificaram 46%
de resistência e 60% (Rich, 2005). Índices esses próximos aos verificados no
presente estudo (57,5%). Lilenbaum, Esteves e Souza (1999) reportaram
31,8% à classe das tetraciclinas. Duijkeren et al. (2004) relataram ter
encontrado alta resistência de CoNS a esta classe enquanto Prescott et al.
(2002) relataram ser comum à resistência a esta droga.
Já no que se refere à classe das fluoroquinolonas, a resistência parece
ser frequente no Brasil (Malik, Peng, Barton, 2005), com índices oscilando
entre 7,6% (Poeta e Rodrigues, 2008) e 23,1% (Lilenbaum, Esteves e Souza,
1999). Embora tais achados estejam em concordância com os verificados no
presente estudo (9,4%), contrastam com relatos de outros países, tais como na
França, onde foi reportado 2% de resistência (Garnieri, Medaille e Mangion,
2005), ou no Canadá (Murphy et al., 2009) que não encontraram nenhuma
amostra proveniente de gato resistente as fluoroquinolonas.
Na classe dos aminoglicosídeos, as taxas verificadas foram
inesperadamente baixas (4,7%), uma vez que outros estudos brasileiros
reportaram 9,6% (Poeta e Rodrigues, 2008) e 15,4% (Lilenbaum, Esteves e
Souza, 1999) de resistência à classe. Já no Canadá, não encontraram (Murphy
et al., 2009) amostras resistentes a esta classe. Fenômeno similar foi
observado em relação à classe dos inibidores do folato. Embora tenham
75
encontrado 9,6% de resistência (Poeta e Rodrigues, 2008), índices mais altos
foram verificados com 52% (Garnieri, Medaille e Mangion, 2005) e 64% de
resistência a esta classe (Rich, 2005), bastante inferiores ao índice de 1,9%
verificado no presente estudo.
Na classe dos fenicóis, foi demonstrado 28% de resistência (Ganieri,
Medaille e Mangion, 2005) similar aos 24,5% verificados no presente estudo,
embora bastante inferiores aos achados de outro trabalho que observou 53%
de resistência à classe (Rich, 2005), similarmente, os achados presentes
(18,8%) foram bastante próximos á literatura para a classe das lincosamidas,
uma vez que foram encontrados 22% de resistência (Ganieri, Medaille e
Mangion, 2005) e 24,8% (Rich, 2005). Foi comum a resistência para os
macrolídeos, o que não é um achado surpreendente, visto ter sido relatado por
Prescott et al. (2002) e Duijkeren et al. (2004). Os índices verificados no
presente estudo (25.9%) são bastante próximos aos relatos de 28% (Garnieri,
Medaille e Mangion, 2005) e 24,8% (Rich, 2005).
Os MRS têm sido uma ameaça à saúde pública, por serem
microrganismos amplamente distribuídos e que apresentam alto grau de
resistência aos antimicrobianos (Struelens et al., 2009). Os MRS foram
descritos pela primeira vez em equinos (Hartmann, 1997), em bovinos (De
Vriese et al, 1972) e em animais de companhia (Rich, 2005). Nos países
industrializados os animais de companhia tem se tornado parte integrante dos
lares e cada vez mais numerosos, ocorrendo à transmissão de amostras
bacterianas entre os animais e seus donos (PANTOSTI, 2012). O aumento de
animais de companhia que albergam amostras MRS nos EUA e Europa foi
recentemente reportado (Duijkeren et al., 2011). Clones brasileiros de MRSA
adquiriram genes de resistência a várias drogas, sendo a incidência de MRSA
na América latina 50% maior do que em outros continentes (Rodriguez-Noriega
et al., 2010). Adicionalmente, Staphylococcus coagulase-negativos tem sido
isolados de grande número de infecções humanas, incluindo amostras
resistentes á meticilina (PALAZZO; DARINI, 2006).
Em diversos países a colonização por MRS em animais de companhia
saudáveis é rara (Baptiste et al, 2005; Loeffler et al, 2005 e Hanselmann et al,
2009; Pantosti, 2012), no entanto estudos recentes (Loeffler et al, 2011)
76
demonstram a presença de 2,1% dos gatos colonizados, também constatada
em nosso estudo, o que sugere o aumento da colonização dos animais de
estimação ao longo do tempo.
No presente estudo verificou-se a presença de amostras
multirresistentes, incluindo cepas resistentes à meticilina, na cavidade oral de
gatos saudáveis. Observação similar foi relatada no Reino Unido onde
constatou-se a presença de MRS em várias espécies de animais de companhia
(Loeffler e Lloyd, 2010), e no Brasil, onde 22,1% das amostras de staphylococci
isoladas da cavidade oral de gatos mostrou-se MRS (LILENBAUM; ESTEVES;
SOUZA, 1999), já num estudo na Philadelphia (EUA) em animais saudáveis foi
demonstrado uma proporção considerável de MRS nos animais de companhia
(11,6%) (MORRIS et al., 2012) enquanto na França em amostras de gatos
doentes foi verificado a presença de 1,8% de MRS (HAENNI et al., 2011),
sugerindo a importância dos animais de companhia saudáveis como
reservatórios. Os estudos ao longo dos anos vem apontando o crescimento
desses microrganismos resistentes e seu isolamento nos animais de
companhia, o que provavelmente vem ocorrendo pelo uso maciço de
antimicrobianos na clínica veterinária e pela convivência cada vez mais estreita
entre os homens e os animais de estimação.
Os MRS vêm sendo identificados nos animais de companhia, tanto em
animais doentes quanto saudáveis, assim como em hospitais veterinários
(MIDDLETON et al., 2005) e mostram multirresistência as drogas (LOEFFLER;
LLOYD, 2010), o que reforça a necessidade de seu controle efetivo, ou seja, a
adoção racional do uso dos antimicrobianos e conscientização dos
proprietários sobre medidas higiênicas que devem fazer parte da rotina no
convívio entre ambos A transferência de MRS entre humanos e animais
apresenta potencial para determinar grande impacto, pois representa um
problema mundial de saúde pública (CUNY et al., 2010) e têm sido
demonstrada com estudos de tipificação que constatam claramente que
amostras provenientes de cães e gatos estão associadas às linhagens
humanas hospitalares (MAGALHÃES et al., 2010). A colonização por MRS
pode ser persistente nas pessoas e é horizontalmente transmissível, e a
literatura sugere que os animais domésticos podem também participar na
77
transmissão cruzada (MORRIS et al., 2012). Análises moleculares têm
apontado a presença de amostras de MRS indistinguíveis em humanos e
animais de companhia residentes nos mesmos lares, sugerindo esta
transmissão (WEESE, 2010). Humanos e animais são mais frequentemente
colonizados do que infectados e ambos podem funcionar como reservatórios
de MRS para recirculação das amostras dentro do ambiente doméstico
(MORGAN, 2008). De acordo com estudos realizados no Canadá, os donos de
animais de companhia tem taxas de colonização por MRS de 18%,
significativamente mais altas que a população em geral (1-2%), o que reafirma
a importância dos pets no ciclo de transmissão (PANTOSTI, 2012).
O tratamento empírico das mordeduras causadas por animais com
amoxacilina, como sugerido por Goldsteisn et al. (1997) e por Santos et al.
(2007) pode contribuir para o aumento da resistência às drogas
antimicrobianas, levando à complicações clínicas, gerando hospitalizações e
grande prejuízo a saúde pública (WESTLING et al., 2006). Um tratamento
empírico com benzilpenicilina teve que ser descontinuado após três dias pelo
insucesso após mordedura por gato na Dinamarca (MADSEN; JUSTESEN,
2011) confirmando mais uma vez a necessidade de análise com a terapia.
Note-se que, no presente estudo, verificou-se que 58% das amostras
bacterianas isoladas eram resistentes à classe das penicilinas, que inclui a
amoxicilina. O tratamento antimicrobiano empírico profilático nas mordeduras é
muito discutido e controverso na literatura atual (JAINDL et al., 2012). Devem
ser adotadas medidas realizando coleta de dados atuais de diversos estudos
para que se chegue a um senso comum visando à utilização racional de
antimicrobianos nos casos de acidentes por mordeduras, evitando assim o
insucesso nas terapias e gastos desnecessários com a saúde pública.
No Brasil, entre 2008 e 2010 ocorreram 1022 internações consequentes
de acidentes por mordeduras de gatos e outros mamíferos excetuando-se os
cães (DATASUS, 2010), o que, além de apresentar potencial para
determinação de infecções, gera também altos custos para saúde pública. Tais
custos podem ser muito mais vultosos caso ocorram complicações no
tratamento, como infecções e/ou cirurgias, gerados pelo insucesso do
tratamento empírico. Como a população de animais de estimação cresce
78
continuamente (OSTANELLO et al., 2008), o número de casos de acidentes
envolvendo tais indivíduos também tende a aumentar, já que o convívio cada
vez se torna mais estreito na relação homem- animal. As mordeduras de
animais representam um grande desafio à saúde pública mundial (PATRONEK;
SLAVINSKI, 2009), isso porque, por todo o mundo acontece um grande
número de acidentes, gerando não só elevados custos á saúde pública como
também desabilitando pessoas ao trabalho e em muitos casos levando a óbito.
Gatos se destacam como os segundos maiores responsáveis por casos de
mordeduras, apenas abaixo dos cães (SANTOS et al., 2007), sendo que ao
contrário dos ferimentos ocasionados por estes, de 28 a 80% das mordeduras
daqueles se tornam infectadas, principalmente devido ao tipo de dentição e a
profundidade a qual os microrganismos são inoculados no tecido (DENDLE;
LOOKE, 2009). Tais infecções podem levar a sérias complicações como sepse,
meningites, endocardites e peritonites (OEHLER et al., 2009).
79
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Com base nos resultados do presente estudo, pode-se concluir que
Staphylococcus são membros comuns da microbiota normal da cavidade
oral de gatos, com predominância das amostras coagulase-negativas;
As amostras bacterianas isoladas apresentaram grande resistência à
maioria das drogas antimicrobianas testadas, dentre elas a oxacilina;
Foi constatada a presença do gene mecA em diferentes espécies de
estafilococos presentes nos animais estudados;
A resistência aos antimicrobianos apresentadas no estudo aliadas a
anatomia dos dentes felinos, infere-se que haja uma grande
possibilidade de infecções nas feridas em casos de injúrias ocasionadas
por mordeduras.
Devido ao alto índice de resistência aos antimicrobianos encontrados e
presença de cepas MRS, faz-se necessário refletir sobre o tratamento
empírico e o impacto nos custos com a saúde pública nos casos de falha
da terapia.
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96
APÊNDICE
APÊNDICE I :TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Esta pesquisa faz parte do trabalho de tese de doutorado do aluno Igor
Mansur Muniz, do curso de Pós Graduação em Clínica e Reprodução Animal
da Universidade Federal Fluminense, orientado pelo professor Walter
Lilenbaum. O objetivo desta pesquisa é isolar Staphylococcus da cavidade oral
de gatos clinicamente saudáveis, realizando estudo genotípico e fenotípico. Os
resultados deste estudo serão publicados em literatura especializada.
_________________________________________
Participante
_____________________________ Igor Mansur Muniz Tel: 21-97116410 Teresópolis,_____,de___________________de 2010.
97
APÊNDICE II :ARTIGO ACEITO PARA PUBLICAÇÃO
06-Nov-2012 It is a pleasure to accept your manuscript entitled "TREATING ANIMAL BITES: SUSCEPTIBILITY OF STAPHYLOCOCCI FROM ORAL MUCOSA OF CATS" in its current form for publication in the Zoonoses and Public Health. The comments of the reviewer(s) who reviewed your manuscript are included at the foot of this letter. If you haven't already signed the Copyright Transfer Agreement, please find this attached. If you are unable to open the attachment, the form can also be found here: http://media.wiley.com/assets/1540/86/ctaaglobal.pdf Please either scan the form and email it to: [email protected], or send it by regular mail or fax to the address or number below: Delia Malim-Robinson Editorial Assistant Health Sciences Wiley 9600 Garsington Road Oxford OX4 2DQ United Kingdom F +44 (0)1865 714 591 [email protected] Fax: +44 (0)1865 714591