dissertao final

1

Universidade de São Paulo Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”

Isolamento e seleção de fungos celulolíticos para hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar

Nara Gustinelli Bortolazzo

Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre em Ciências. Área de concentração: Microbiologia Agrícola

Piracicaba 2011

2

Nara Gustinelli Bortolazzo Licenciada em Ciências Biológicas


Orientador: Prof. Dr. LUIZ CARLOS BASSO

Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre em Ciências. Área de concentração: Microbiologia Agrícola

Piracicaba 2011

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação

DIVISÃO DE BIBLIOTECA - ESALQ/USP

Bortolazzo, Nara Gustinelli Isolamento e seleção de fungos celulolíticos para hidrólise enzimática do bagaço de

cana-de-açúcar / Nara Gustinelli Bortolazzo. - - Piracicaba, 2011. 76 p. : il.

Dissertação (Mestrado) - - Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, 2011. Bibliografia.

1. Bagaços 2. Cana-de-açúcar 3. Celulase 4. Enzimas celulolíticas 5. Fungos 6. Hidrólise I. Título

CDD 633.61 B739i

“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”

3

Aos meus pais José e Maria Angélica

e a minha irmã Nádia

Dedico

5

AGRADECIMENTOS

Àquele que esteve presente em todos os momentos principalmente os difíceis, Deus.

Á toda minha família, pela expectativa e interesse em minha vida profissional.

Ao meu orientador Dr. Luiz Carlo Basso pela orientação, dedicação, compreensão e incentivo

fundamentais para a realização deste trabalho.

Aos amigos da Pós-graduação.

Aos grandes amigos do laboratório: Thalita, Renata, Polé, Stefania, Natália, Camila, Juliana,

Fernanda e Flávia.

Ao querido técnico e amigo, Luiz Lucatti (cometa).

Ao técnico Luiz Humberto Gomes (Beto), pela ajuda e paciência em me ensinar.

Um agradecimento especial a todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a concretização deste trabalho, e todos que de alguma maneira fazem parte da minha vida.

7

SUMÁRIO RESUMO ................................................................................................................................................. 9

ABSTRACT ........................................................................................................................................... 11

LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................................ 13

LISTA DE TABELAS ........................................................................................................................... 15

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................................... 17

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................................ 19

2.1 Cana-de-açúcar ................................................................................................................................. 19

2.2 Bagaço da cana-de-açúcar ................................................................................................................ 20

2.2.1 Lignina ........................................................................................................................................... 21

2.2.2 Celulose ......................................................................................................................................... 22

2.2.3 Hemicelulose ................................................................................................................................. 22

2.3 Materiais lignocelulósicos ................................................................................................................ 23

2.4 Hidrólise dos materiais lignocelulósicos .......................................................................................... 25

2.5 Enzimas celulolíticas ........................................................................................................................ 26

2.5.1 Celulases ........................................................................................................................................ 27

2.6 Microorganismos lignocelulolíticos ................................................................................................. 29

2.6.1 Fungos de degradação branca ........................................................................................................ 32

2.6.2 Fungos de degradação marrom ...................................................................................................... 32

2.6.3 Fungos de degradação branda........................................................................................................ 33

2.7 Objetivo ............................................................................................................................................ 34

3 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................................. 35

3.1 Isolamento ........................................................................................................................................ 35

3.2 Manutenção das linhagens ................................................................................................................ 35

3.3 Avaliação prévia da atividade celulolítica dos isolados em meio com vermelho Congo................. 35

3.4 Produção das enzimas (celulases)..................................................................................................... 36

3.5 Determinação da atividade celulolítica total .................................................................................... 37

3.6 Determinação da atividade da enzima Endo-1, 4-β-Glucanase ........................................................ 38

3.7 Determinação das atividades enzimáticas celulolíticas .................................................................... 38

3.8 Identificação ..................................................................................................................................... 39

3.9 Análise estatística dos dados ............................................................................................................ 39

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................................ 41

8

4.1 Avaliação da atividade celulolítica mediante descoloração com vermelho Congo ......................... 41

4.2 Análise da atividade celulolítica (celulase total e endoglucanase) .................................................. 44

4.3 Identificação dos isolados ................................................................................................................ 55

REFERÊNCIAS ..................................................................................................................................... 59

ANEXOS ............................................................................................................................................... 69

9

RESUMO


Atualmente os processos biotecnológicos têm conquistado um lugar de destaque no desenvolvimento tecnológico mundial, tendo as enzimas como as celulases, grande importância econômica e diferentes aplicações industriais. O objetivo deste trabalho foi à obtenção de fungos isolados e selecionados do ambiente agroindustrial, com a capacidade de hidrolisar a fração celulósica do bagaço de cana-de-açúcar. Um total de 46 isolados foram obtidos de bagaço de cana coletados em 3 destilarias. Quinze apresentaram a formação de halo pela coloração com vermelho Congo, os quais foram avaliados quanto a atividade celulolítica (F1 a F15), tendo como referência o fungo Trichoderma ressei 9414. Os isolados foram cultivados em bagaço de cana-de-açúcar 1% e conduziu-se a determinação da atividade de endoglucanase (CMCase) empregando-se carboximetilcelulose (CMC) como substrato, e da atividade da celulase total (FPase) empregando papel de filtro como substrato. Após 21 dias de cultivo em bagaço de cana-de-açúcar nenhum dos isolados apresentou atividade da celulase total maior que T. ressei QM9414. Destes isolados, F9 apresentou maior valor para a atividade da celulase total após 7 dias de cultivo. Com relação a atividade da endoglucanase, no sétimo dia de cultivo o isolado F27 obteve melhor resultado que T. ressei QM 9414. Quanto à cinética da atividade de endoglucanase os isolados 9, 23 e 27 apresentaram atividades enzimáticas muito próximas do fungo referência (QM9414). Os resultados mostram o grande potencial da biodiversidade existente em nichos industriais, na busca de linhagens com potencialidade na hidrólise enzimática de substrato lignocelulósico, como o bagaço de cana- de-açúcar. Palavras-chave: Celulase; Vermelho Congo; Endoglucanase; Bagaço de cana-de-açúcar;

Trichoderma ressei

11

ABSTRACT

Isolation and screening of cellulolytic fungi for enzymatic hydrolysis of sugarcane bagasse

Biotechnological processes are achieving increased relevance in today's technological development, being enzymes such as celullases, of great economical importance in different industrial applications. The objective of this work was the isolation and selection of fungi from agroindustrial environment, with capacity of hydrolysing the cellulosic fraction of sugar cane bagasse. Forty six isolates were evatuated for their cellulolytic activity using CMC as carbon source and Cong Red as staining indicator . Fifteen isolates showed halo formation by red Congo staining, and they were evaluated for cellulolytic activity (F1 to F15), using Trichoderma ressei 9414 as a reference. The isolates were cultivated in 1% sugar cane bagasse and the cellulolytic activities were assessed by the determination of endoglucanase activity (CMCase) using carboximetilcelulose (CMC) as substrate, and the total celullase activity (FPase) applying filter paper as substrate. After 21 days of cultivation in sugar cane bagasse neither of the isolates showed total cellulase activity higher than T. ressei QM9414. From these isolates, F9 showed higher total cellulase activity after 7 cultivation days. For endoglucanase activity, the isolate F27 showed better result than T. ressei QM 9414 in the seventh cultivation day. For the endoglucanase activity kinetics, the isolates 9, 23 and 27 showed enzymatic activities very close to the reference fungus (QM9414). These results allow to suggest a great biotechnological potential for the biodiversity found in industrial niches, regarding the enzymatic hydrolysis of lignocellulosics substrates, namely the sugar cane bagasse. Keywords: Cellulase; Red Congo; Endoglucanase; Sugarcane bagasse; Trichoderma ressei

13

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Esquema ilustrativo da composição da fibra do bagaço..........................................21

Figura 2 - Estrutura da celulose..................................................................................................22

Figura 3 - Atuação das enzimas da celulase sobre a estrutura da celulose................................28

Figura 4- Placas de Meio CMC sólido com Vermelho Condo 1%. A zona mais clara ao redor das

colônias, correspondente ao halo indicador da degradação da CMC foi que observada

em 15 dos 46 isolados ou seja, 32,6%. ∅c = diâmetro da colônia (cm); ∅h = diâmetro

do halo (cm)..............................................................................................43

Figura 5- Atividade enzimática da celulase total, utilizando papel de filtro como substrato,

obtidos do cultivo dos isolados em bagaço de cana-de-açúcar após 0 dia. Valores das

médias de 3 repetições. Médias com a mesma letra não diferem entre si, segundo

teste de Tukey (p<0,005).............................................................................................46

Figura 6 – Atividade enzimática da celulase total, utilizando papel de filtro como substrato,

obtidos do cultivo dos isolados em bagaço de cana-de-açúcar após 7 dias. Valores

das médias de 3 repetições. Médias com a mesma letra não diferem entre si,

segundo teste de Tukey (p<0,005)..........................................................................47









14

Figura 9 – Atividade enzimática da endoglucanase, utilizando a carboximetilcelulose (CMC)

como substrato, obtidos do cultivo dos isolados em bagaço de cana-de-açúcar após 0

dias. Valores das médias de 3 repetições. Médias com a mesma letra não diferem entre

si, segundo teste de Tukey (p < 0,005).............................................................................50













Figura 13 – Atividade enzimática específica (UI/mg bagaço), obtidos do cultivo dos fungos em

bagaço de cana-de-açúcar após 21 dias. Valores das médias de 3 repetições. Médias com

a mesma letra não diferem entre si, segundo teste de Tukey (p < 0,005)........................54

15

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Meio sintético CMC 1% de acordo com Nogueira & Cavalcanti (1996).......................36

Tabela 2 – Meio Basal proposto por Mandels e WebER(1969).....................................................37

Tabela 3 - Atividade da celulase dos fungos isolados do bagaço de cana-de açúcar, cultivados em

meio sintético com carboximetilcelulose durante 3 e 5 dias a 28 ºC. ∅c = diâmetro da

colônia (cm); ∅h = diâmetro do halo (cm); Íe = índice enzimático; ( - ) = não cresceu

e/ou não produziu halo................................................................................................41

Tabela 4- Identificação morfológica dos isolados do bagaço.........................................................55

17

1 INTRODUÇÃO

O Brasil é o maior produtor de cana-de-açúcar do mundo. Em 2007, a área plantada da

cultura era de 6,5 milhões de hectares e foram produzidas 515,3 bilhões de toneladas da cana,

segundo cálculos do IBGE. Na safra de 2008/2009 a produção foi em torno de 570 milhões de

toneladas de cana-de-açúcar em uma área plantada de 8,5 milhões de hectares (UNIÃO DA

INDÚSTRIA DE CANA-DE-AÇÚCAR - UNICA, 2009). A previsão do Instituto é que o setor

expanda 8,6% na área plantada e 8,3% na produção em toneladas.

Atualmente os processos biotecnológicos têm conquistado um lugar de destaque no

desenvolvimento tecnológico mundial, exibindo características econômicas e operacionais que

conferem vantagens em relação aos processos químicos convencionais (MACIEL, 2006).

Com a crescente busca da utilização dos resíduos agroindustriais, devido à incessante

demanda das atividades agrícolas, cresce o acúmulo destes resíduos gerando a deterioração do

meio ambiente e perda de recursos, com contribuição significante para o problema da reciclagem

e conservação da biomassa. Diversos processos são desenvolvidos para utilização desses

materiais, transformando-os em compostos químicos e produtos com alto valor agregado como o

álcool, enzimas, ácidos orgânicos, aminoácidos, etc. A utilização de resíduo de bagaço de cana

em bioprocessos é uma racional alternativa para a produção de substratos, e uma ajuda para

solucionar o problema da poluição ambiental (PANDEY et al., 2000).

O uso prático das enzimas tem sido explorado pelo ser humano a milhares de anos de

forma direta via emprego de preparações enzimáticas brutas de origem animal ou vegetal ou

indiretamente, pelo aproveitamento da ação enzimática decorrente do crescimento microbiano

sobre determinados substratos. Por outro lado, a produção e o uso de enzimas de origem

microbiana, sob uma forma controlada, apesar de serem relativamente recentes constituem, hoje,

o maior setor da indústria biotecnológica (NEIDLEMAN, 1991).

Diversos substratos são utilizados com o objetivo de se obter grandes quantidades de

enzimas celulolíticas por microrganismos (VITTI, 1988; SILVA; DILLON, 1988).

As celulases são enzimas de importância econômica que são vendidas em grande volume

tendo diferentes aplicações industriais, como por exemplo, no processamento do amido, produção

de ração animal, fermentação de grãos para produção de álcool, extração de suco de frutas e

vegetais polpa e indústria de papel e indústria têxtil (OGEL et al., 2001). Atualmente a mais

importante aplicação para celulases e hemicelulases é o bio-branqueamento da polpa na indústria

18

de papel, a produção da polpa dissolvida, tratamento de água residual e reciclagem dos resíduos

do papel. O potencial do tratamento enzimático foi avaliado e o processo provou ter sucesso

(GÜBITZ et al., 1998; BAJPAI, 1999).

O custo e o baixo rendimento dessas enzimas são os maiores problemas para a aplicação

industrial (KANG et al., 2004). No entanto, investigações quanto à habilidade de cepas de

diferentes microrganismos hidrolisarem celulose e hemicelulose utilizando substratos disponíveis

e a preços acessíveis, tem sido feita. Muitos trabalhos estão sendo direcionados ao

desenvolvimento de uma alta produção microbiana enquanto focam o aprimoramento do processo

de fermentação (ESTERBAUER et al., 1991; HALTRICH et al., 1996).

A degradação microbiana da celulose é total e específica e tem estimulado o uso dos

processos de fermentação celulolíticas pelo homem (LINCHY et al., 1981). A celulose é o

composto orgânico mais abundante e renovável da Terra. Muitos estudos continuam encontrando

mais aplicações econômicas para esse resíduo celulósico nativo, o qual representa mais de 60%

de todo resíduo agrícola. A maioria desses materiais são utilizados como ração animal ou

queimado como fonte de energia (KANSOH et al., 1999).

19

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Cana-de-açúcar

Cana-de-açúcar, nome comum que se dá a uma herbácea vivaz, planta que pertence ao

gênero Saccharum L., da família das gramíneas, espécie Saccharum officinarum, originária da

Ásia Meridional. Há pelo menos seis espécies do gênero, sendo a cana-de-açúcar cultivada um

híbrido multiespecifico, recebendo a designação Saccharum spp. Ela é muito cultivada em países

tropicais e subtropicais, onde se alternam as estações secas e úmidas, para obtenção do açúcar, do

álcool e da aguardente, devido à sacarose contida em seu caule, formado por numerosos nós.

Segundo (MAGALHÃES, 1987) a cana-de-açúcar é uma gramínea perene que perfilha

abundantemente na sua fase inicial de desenvolvimento. Quando se estabelece com uma cultura,

a competição intra-específica por luz induz uma inibição no perfilhamento e uma aceleração do

crescimento do colmo principal. Este crescimento em altura continua até a ocorrência de

temperaturas baixas, ou ainda devido ao florescimento.

A partir do ano 2000 a produção de cana vem crescendo no Brasil a uma taxa anual de

aproximadamente 35 milhões de toneladas de cana. Segundo as estatísticas da União da Indústria

de Cana-de-açúcar (UNICA), na safra 08/09 o Brasil processou cerca de 570 milhões de

toneladas de cana, produzindo ao redor de 160 milhões de toneladas de bagaço. Ainda nesta safra

foram produzidos aproximadamente 27 milhões de litros de etanol e 30 milhões de toneladas de

açúcar. Toda cana-de-açúcar produzida no Brasil ainda apresenta potencial de mais de 160

milhões de toneladas de palha e, provavelmente, 6% desse material acompanhou os colmos de

cana até a indústria sendo que o restante foi queimado ou permaneceu no campo (ÚNICA).

A diversidade dos produtos comerciais que são fabricados a partir do caldo da cana-de-

açúcar e dos resíduos sólidos e líquidos da moagem é um ponto bastante relevante. Destacam-se

nessa lista de produtos, além do açúcar e do álcool etílico, a cachaça e a rapadura, produtos

extraídos do caldo e produzidos em pequenas fábricas especializadas na atividade, e a cogeração

de energia elétrica gerada com a queima do bagaço. A maior parte da produção de açúcar e álcool

etílico é oriunda de indústrias equipadas para a fabricação de ambos os produtos. Esta

característica se estabeleceu a partir da década dos anos 70 como decorrência das políticas da

época, que possibilitaram a criação de programas inovadores e independentes de produção e o

uso mandatório de álcool etílico como combustível automotivo. Esses programas criaram um

20

grande mercado interno para esse produto e permitiu que o Brasil desenvolvesse um modelo de

indústria mista, capaz de destinar parte do caldo da cana-de-açúcar para a produção de açúcar e

parte para a fabricação de álcool, sem similar em outros países produtores de cana-de-açúcar,

(COMPANHIA NACIONAL DE ABASTECIMENTO – CONAB, 2008).

2.2 Bagaço da cana-de-açúcar

Segundo Burgi (1995) de cada tonelada de cana-de-açúcar moída na indústria obtêm-se

700 litros de caldo e 300 kg de bagaço (50% Matéria Seca), portanto, dos 500 milhões de

toneladas moídas nas usinas e destilarias do Brasil, a cada ano, 75 milhões de toneladas de bagaço

de cana são obtidos.

O bagaço de cana-de-açúcar é, sem dúvida, o resíduo agroindustrial obtido em maior

quantidade no Brasil, aproximadamente 290 kg por tonelada moída. Estima-se que a cada ano

sejam produzidos de 5 a 12 milhões de toneladas desse material, correspondendo a cerca de 30%

do total moído. (SILVA et al., 2007)

O bagaço é constituído por celulose, hemicelulose e lignina (Figura 1). O bagaço de cana

contém de 25 a 40% de celulose, (20 a 35%) de hemicelulose e lignina (15 a 35%) (COWLING;

KIRK, 1976), com pequenas quantidades de outros compostos classificados conjuntamente como

componentes estranhos. Segundo o Departamento de Energia dos EUA o bagaço de cana

proveniente da variedade Saccharum spp., a mais utilizada no Brasil, possui 23% de lignina total,

23% de hemicelulose e 38,6% de celulose (EERE, 2007).

Gomes (1985) determinou teores de 34,4% de celulose, 22,4% de hemicelulose e 20,3% de

lignina em bagaço seco e moído, sem tratamento. Já Aguiar e Menezes (2000), em estudos com A.

niger IZ-9, determinaram frações de celulose 37% e lignina 24,6% em bagaço de cana-de-açúcar

sem tratamento.

Ele é um subproduto do qual ficam apenas alguns constituintes do material original e, no

caso da cana-de-açúcar, resta fibra e alguma quantidade de açúcar. O bagaço resultante da sua

exploração pode ser queimado para o processo de produção de calor nas caldeiras, mas não

substitui 100% da lenha e acaba sobrando de 37 a 50 kg por tonelada de cana-de-açúcar moída. A

sobra de bagaço é preocupante, pois toma espaço, polui e deve ser encontrada uma forma de

utilizá-la. Nas grandes destilarias, o bagaço prensado tem sido comercializado até para a

fabricação de conglomerados. O bagaço resultante das destilarias de cana-de-açúcar para

21

aguardente teria uso mais adequado para queima e o restante para alimentação animal.

(CARDOSO, 2006). Atualmente, devido à crescente utilização do bagaço na cogeração de energia

elétrica, acarretará um aumento no seu consumo na própria destilaria, sendo que tal retorno

econômico determinará a viabilidade de alternativas para o mesmo, incluindo os processos

biotecnológicos.

Figura 1 – Esquema ilustrativo da composição da fibra do bagaço

2.2.1 Lignina

A lignina é um polímero fenólico, uma macromolécula tridimensional amorfa encontrada

em vegetal associada à celulose na parede celular cuja função é de conferir rigidez,

impermeabilidade e resistência a ataques microbiológicos e mecânicos aos tecidos vegetais. Ela é

geralmente mais resistente à decomposição biológica que os outros biopolímeros principais

encontrados em resíduos de planta, por causa de sua estrutura química. A taxa de decomposição

da lignina é lenta comparada com a celulose e hemiceluloses (WAGNER; WOLF, 1999).

Mesmo presente em quantidades menores em relação à fração celulósica, a lignina confere

limitação suficiente para retardar, ou mesmo impedir completamente, a atuação microbiana sobre

o material (FAN et al., 1987).

LIGNINA

CELULOSE

HEMICELULOSE

22

2.2.2 Celulose

A celulose é a molécula mais abundante da natureza, sendo o componente mais

importante da parede celular das plantas, composta de cadeias lineares de D-glicose, unidas por

ligações β-1,4 com alto grau de polimerização e elevado peso molecular, principalmente, em sua

forma cristalina que confere a alta resistência ao rompimento de suas ligações por substâncias

químicas (GIGERREVERDIN, 1995).

Suas cadeias podem se unir através de pontes de hidrogênio formando as microfibrilas de

celulose. O grau de cristalinidade destas fibrilas ou a presença de outros polímeros associados à

matriz celulósica é de grande importância na avaliação, pois esta interação pode influenciar na

suscetibilidade da molécula de celulose a hidrólise enzimática microbiana (VAN SOEST, 1994).

Sua estrutura, conforme mostra a figura abaixo (Figura 2), apresenta regiões altamente

ordenadas (regiões cristalinas), estabilizadas por inúmeras ligações de hidrogênio intra e

intermoleculares e áreas menos ordenadas chamadas também de regiões amorfas (FAN et al.,

1987).

Figura 2 – Estrutura da celulose

Fonte: http://www.micro.siu.edu

2.2.3 Hemicelulose

Segundo Van Soest (1994), as hemiceluloses compreendem uma coleção heterogênea de

polissacarídeos amorfos com grau de polimerização muito inferior ao da celulose. Emprega

23

grupos distintos de polissacarídeos constituídos por açúcares pentoses (xilose e arabinose) e/ou

hexoses (glucose, manose e galactose), ácidos urônicos e grupos acetila.

Estruturalmente são mais parecidas com a celulose do que com a lignina e são depositadas

na parede celular em um estágio anterior a lignificação. Sua estrutura apresenta ramificações e

cadeias laterais que interagem facilmente com a celulose, dando flexibilidade e estabilidade ao

agregado (RAMOS, 2003). Comparada as celuloses, as hemiceluloses apresentam maior

susceptibilidade à hidrólise ácida, pois oferecem uma maior acessibilidade aos ácidos.

A natureza química das hemiceluloses varia, nas plantas, em relação ao tipo de tecido

vegetal e espécies a quem pertencem. As madeiras em geral possuem de 20% a 30% de

hemicelulose na composição geral, enquanto que nas gramíneas esse valor é de 20% a 40%

(SJӦSTRӦM, 1992).

2.3 Materiais lignocelulósicos

Biomassa pode ser considerada como uma massa de material orgânico de qualquer

material biológico. Uma vasta variedade de recursos de biomassa estão disponíveis em nosso

planeta para conversão em bioprodutos. Nestes, podem ser inclusos plantas, partes da planta

(semente, caule), constituintes da planta (ex. lipídios, proteínas, fibras, amido), bioprodutos

processados (milho solúvel), material de origem marinha, subprodutos de origem animal e

resíduo industrial (SMITH et al., 1987).

A lignocelulose é o principal componente estrutural das plantas lenhosas e plantas não

lenhosas como a grama, e representa uma importante fonte de matéria orgânica renovável. As

propriedades químicas de seus componentes fazem dela um substrato de grande valor

biotecnológico (MALHERBE; CLOETE, 2003).

Grandes quantidades de "resíduos" lignocelulósicos são gerados através de práticas

agrícolas e florestais, indústrias de celulose, indústrias de madeira e muitas agroindústrias

contribuindo com o problema da poluição ambiental. Infelizmente, grande parte dos resíduos

lignocelulósicos são muitas vezes eliminados pela queima de biomassa, não apenas por países em

desenvolvimento pois esta ação é considerada como um fenômeno global (LEVINE, 1996). No

entanto, a enorme quantidade de biomassa vegetal residual considerado como um "resíduo" pode

ser potencialmente convertida em diferentes produtos de valor agregado, incluindo os

24

biocombustíveis, produtos químicos, fontes de energia barata para a fermentação, melhoramento

de ração animal e nutrientes humanos.

Ballesteros (2001) também afirma que os resíduos lignocelulósicos são uma grande

alternativa para a geração de energia, devido a sua grande disponibilidade na natureza.

Atualmente, os maiores usos da lignocelulose concentram-se nas polpas e indústrias de papel,

proteína para ração, em meios tecnológicos de alimentação, além de poderem gerar energia

através da produção de etanol.

Enzimas lignocelulolíticas também têm um potencial significante na indústria química,

de combustível, de comida, cerveja e vinho, animal, têxtil, celulose e papel e na agricultura

(LEVINE, 1996).

Tanto a cana-de-açúcar in natura quanto o bagaço são essencialmente materiais de alto

teor de lignoceculósico. Portanto, a viabilidade de sua utilização requer o desenvolvimento de

métodos de tratamento de promover o rompimento da estrutura fibrosa, para torná-la mais

digestível (BURGI, 1985).

Devido à natureza polissacarídica, os materiais lignocelulósicos não são diretamente

utilizados pelos microrganismos produtores de substâncias de interesse industrial, tendo a

necessidade de proceder a hidrólise dos seus componentes (BULCHOLZ et al., 1981;

KUMAKURA; KAETSU, 1983).

A utilização dos diferentes componentes passíveis de serem obtidos dos materiais

lignocelulósicos necessita inicialmente de uma separação mais seletiva dos mesmos. Desta forma

ocorre à necessidade da ruptura do complexo lignina-celulose bem como a remoção de cada uma

destas frações através das técnicas de pré-tratamento bem como de deslignificação. Dentre estas

técnicas existem diferentes tipos de separação, oriunda de processos térmicos, químicos, físicos,

biológicos e até mesmo a combinação destes conforme o grau de separação requerido para o

material em estudo. Segundo a literatura os pré-tratamentos mais eficientes são os que combinam

técnicas físicas e químicas para promover o afrouxamento das paredes celulósicas, sendo ainda

sugerido o uso do vapor saturado (explosão a vapor) reconhecido como um dos métodos mais

promissores para implementação industrial (FOCHER et al., 1988; WOOD; SADDLER, 1988;

GHOSH; SINGH, 1993; RAMOS; SADDLER, 1994).

A celulose é o mais abundante composto orgânico renovável da Terra. Muitos estudos

estão sendo feitos com a finalidade de encontrar aplicações econômicas para esse resíduo que

representa mais de 60% dos resíduos agrícolas. A maioria desses materiais são usados como

25

ração animal ou queimados como fonte de energia. Esse resíduo agrícola contém uma mistura de

lignina e hemicelulose ligadas fortemente a celulose dificultando a decomposição enzimática

(KANSOH et al., 1999).

2.4 Hidrólise dos materiais lignocelulósicos

Extensas pesquisas foram completadas em relação a conversão de materiais

lignocelulósicos em etanol nas últimas duas décadas. A conversão inclui dois processos: hidrólise

da celulose em materiais lignocelulósicos para fermentação de açucares redutores e a

fermentação do açúcar em etanol. A hidrólise é usualmente catalisada pela celulase e a

fermentação é realizada por leveduras ou bactérias. Os fatores que afetam a hidrólise da celulose

são a porosidade do bagaço, a cristalinidade da fibra de celulose e quantidade de lignina e

hemicelulose. A presença da lignina e hemicelulose dificultam a eficiência da enzima durante a

hidrólise. A remoção da lignina e hemicelulose reduzem a cristalinidade da celulose, e aumenta a

porosidade do bagaço no processo de pré-tratamento com significante melhora na hidrólise

(McMILLAN, 1994).

A hidrólise enzimática da celulose é feita usando enzimas celulolíticas. A celulase é

composta de endo-β-1,4-glucohidrolase, exo-β-1,4-glucocelobiohidrolase (celulases) e β-

glicosidase (PARISI, 1989).

Os fatores que afetam a hidrólise enzimática da celulose incluem substratos, a atividade

da celulase e condições de reação (temperatura, pH, bem como outros parâmetros). A

susceptibilidade dos substratos celulolíticos depende das características estruturais do substrato

incluindo cristalinidade da celulose, o grau de polimerização da celulose, área de superfície e

conteúdo de lignina. A lignina interfere na hidrólise, bloqueando o acesso das celulases a celulose

e pela ligação irreversível das enzimas hidrolíticas. Portanto, a remoção de lignina pode

dramaticamente aumentar a taxa de hidrólisee (McMILLAN, 1994).

Kirk e Farrel (1987) mencionaram que remover a lignina é necessário para aumentar a

eficiência da hidrólise enzimática e relataram que a bioconversão da celulose depende do grau de

cristalização e da força de ligação da mistura de celulose. A remoção de materiais ligados e a

degradação da estrutura cristalina podem aumentar a eficiência da bioconversão da celulose

(KANSOH et al., 1999).

26

A hidrólise enzimática da celulose consiste em três etapas: adsorção da celulase para a

superfície da celulose, a biodegradação da celulose para açúcares fermentáveis e adsorção de

celulase. A atividade da celulase diminui durante a hidrólise. A adsorção irreversível da celulase

sobre a celulose é parcialmente responsável por essa desativação (CONVERSE et al., 1988).

Também a adição de surfactantes durante a hidrólise é capaz de modificar a propriedade da

superfície da celulose, minimizando a ligação irreversível da celulase sobre a celulose. Os

tensoativos utilizados na hidrólise enzimática incluem não iônico Tween 20, 80 (WU; JU, 1998),

polioxietileno glicol (PARK et al., 1992), Tween 81, Emulgen 147,(OOSHIMA et al., 1986).

Na hidrólise enzimática há maior produção de monossacarídeos do que na hidrólise com

ácido diluído, porque a celulase catalisa somente as reações de hidrólise e não reações de

degradação de açucares (PARISI, 1989).

2.5 Enzimas celulolíticas

O custo da enzima é considerado um grande obstáculo para a comercialização da hidrólise

enzimática celulolítica (WALKER; WILSON, 1991; EVELEIGH, 1987). O custo da enzima é

estimado em aproximadamente 50% do custo do processo de hidrólise total.

As enzimas apresentam propriedades que tornam os seus usos altamente desejáveis como

catalisadores. Elas são bastante ativas, versáteis e executam uma variedade de transformações de

modo seletivo e rápido, em condições brandas de reação. Ao contrário dos catalisadores não

enzimáticos, que em geral, têm ação ampla, as enzimas não requerem altas temperaturas e valores

extremos de pH. Além disso, a atividade enzimática pode ser regulada com relativa facilidade,

bastando modificar a natureza do meio de reação, como, por exemplo, pela alteração do pH ou

pela adição de algum efetor. Toda enzima em razão da sua grande especificidade catalisa as

transformações moleculares sem ocorrência de reações paralelas indesejáveis que são comuns em

sínteses químicas. Conseqüentemente, os processos industriais que empregam enzimas são, em

geral, relativamente simples, fáceis de controlar, eficientes energicamente e de investimento de

baixo custo (DZIEZAK, 1991; PATEL, 2002; PIZARRO; PARK, 2003).

Todos os organismos que degradam a celulose cristalina secretam sistemas mais ou menos

complexos de celulases, estes sistemas são compostos de uma variedade de enzimas com

especificidade e modo de ação distinta, os quais agem em sinergia hidrolisando a celulose; dois

tipos de distintos mecanismos controlam a síntese e secreção de celulases, na maioria dos

27

organismos, a produção de celulase é reprimida na presença de altas concentrações de fonte de

carbono prontamente metabolizáveis. Adicionalmente, em diversos sistemas, a síntese de celulase

é regulada por celobiose ou seforose, que são geradas a partir da degradação da celulose por

pequenas quantidades de celulases constitutivas (BEGUIN, 1990).

2.5.1 Celulases

As celulases são usualmente uma mistura de diversas enzimas envolvidas na degradação

da celulose. Os três maiores grupos de celulases que estão no processo de hidrólise são:

endoglucanases (EG); exoglucanases ou cellobiohydrolase(CBH) e betaglucosidase (SUN;

CHENG, 2002). Conforme mostra a figura 3, as celulases quebram a celulose em celobiose, que é

subseqüentemente clivada a glicose pela betaglucosidase (PALMQVIST; HAHN-HÃGERDAL,

2000).

- As endoglucanases agem de forma aleatória, clivando ligações β-1,4-glucosídicas, dentro

da molécula da celulose. Seu modo de ação diminui a viscosidade específica da CMC

significativamente devido as clivagens intramoleculares (ZHANG; LYND, 2004), resultando em

uma rápida diminuição do comprimento da cadeia.

- Celobiohidrolases a qual é freqüentemente chamada de exoglucanases, cliva os

segmentos nas extremidades redutoras e não redutoras das cadeias expostas pela endoglucanase,

gerando a celobiose. As exoglucanases participam da hidrólise primária da fibra e são

responsáveis pela amorfogênese, que é um fenômeno que envolve uma ruptura física do substrato,

acarretando na desestratificação das fibras, pelo aumento das regiões intersticiais

- β-glicosidase, enzima que hidrolisa celobiose (solúvel) a unidades de glicose. A remoção

da celobiose é um passo importante no processo da hidrólise enzimática, uma vez que ela auxilia

na redução do efeito inibitório de celobiose sobre a EG e CBH (DUFF; MURRAY, 1996).

28

Figura 3 - Atuação das enzimas da celulase sobre a estrutura da celulose

Atividade de endoglucanase também pode ser facilmente detectada em placas contendo

Agar através da coloração residual de polissacarídeos (CMC, celulose), com diversos corantes,

pois estes corantes são absorvidos apenas por longas cadeias de polissacarídeos (FÜLÖP; PONYI,

1997; HAGERMAN et al., 1985; JANG et al., 2003;. JUNG et al., 1998; KIM et al., 2000;

PIONTEK et al., 1998; RESCIGNO et al., 1994; DEZ et al., 2004). Esses métodos são semi-

quantitativo, e estão bem adaptados ao monitoramento um grande número de amostras.

Segundo Martin et al. (2006), a hidrólise é necessária para a conversão de polissacarídeos

da lignocelulose a açúcares fermentescíveis.

A utilização de celulases na hidrólise da celulose ocorre em condições mais brandas de

pressão, temperatura e pH do que os processos químicos, e exibe elevada especificidade,

eliminando a chance de ocorrência de substâncias tóxicas (furfurais e derivados de lignina) às

células microbianas que serão utilizadas para fermentação do meio hidrolisado.

A hidrólise enzimática da celulose e conversão dos açúcares liberados em moléculas de

interesse, tal como o etanol, podem ser conduzidas de forma seqüencial (processo HSF, hidrólise

separada da fermentação) ou simultânea (SSF, sacarificação simultânea à fermentação).

29

2.6 Microorganismos lignocelulolíticos

Durante a Segunda Guerra, militares preocupados devido ao grande desgaste de roupas e

equipamentos recolheram amostras de microrganismos suspeitos de serem os responsáveis pelo

prejuízo e as levaram ao laboratório de pesquisas do exército, em Natick, Massachussetts. Dentre

milhares de amostras, uma, recolhida na Nova Guiné, mostrou conter um fungo – Trichoderma

viride (atualmente denominado T. reesei, em homenagem ao seu descobridor, Elwyn Reese) –

capaz de converter celulose em seus monômeros (BJERRE; SCHMIDT, 2007 apud FENGEL;

WEGENER, 1989).

A partir da década de 60 descobriu-se que preparados de enzimas extracelulares eram

responsáveis pela ação hidrolítica, despertando então novamente o interesse pelos fungos. A idéia

de aproveitar essas enzimas na conversão de resíduos celulósicos em produtos de interesse

alimentar e energético surgiu em 1973, e foi no ano de 1979 que a equipe de Natick anunciava o

isolamento de cepas mutantes de T. reesei com poder hidrolítico aproximadamente vinte vezes

superior ao da cepa nativa. O microrganismo original continua sendo referência para as celulases

comerciais do século XXI.

Fungos são considerados os mais importantes microrganismos utilizados pela indústria na

produção de enzimas (NOVO NORDISK, 1996; MENEZES, 1997), e os principais celulolíticos

produtores de celulases e xilanase incluem: Trichoderma reesei (também denominado

Trichoderma viride), Trichoderma koningii, Trichoderma lignorum, Sporotrichum pulverulentum

(também denominado Chrysosporum lignorum), Penicillium funiculosum, Penicillium iriensis,

Aspergillus sp, Schizophyllumm sp, Chaetomium sp e Humicola sp (DA SILVA et al., 1994).

Algumas leveduras como as do gênero Trichosporium sp também são produtoras de

xilanases e celulases, assim como diversas espécies de Aspergillus produzem altos níveis de

glicosidase (STEVENS; PAYNE, 1997).

Altos níveis da enzima celulolítica foram observados quando celulose insolúvel foi usada

como fonte de carbono. Joglekar e Karanth (1984), citados por Vitti (1988), verificaram que o

desenvolvimento de Penicillium funiculosum UV49 em algodão, papel de filtro, bagaço de cana e

carboximetil celulose foi pequeno e a atividade celulolítica baixa. Porém Dekker (1981), citado

por Vitti (1988), observou que as celuloses que não são facilmente hidrolisadas pelas celulases,

como Avicel, algodão, celulose em pó e carboximetil celulose parecem ser os melhores substratos

30

para induzir a formação de celulase. Gong e Tsao (1975) observaram que indutores da síntese de

celulases incluem celulose, derivados de celulose, celobiose, soforose e lactose.

A resposta das células fúngicas aos diferentes indutores varia dependendo da concentração

e tipo do indutor ou pela presença de glicose ou outros açúcares no meio de crescimento. Os

indutores da síntese de celulolítica têm duas funções, ou seja, podem servir como fonte de carbono

para o crescimento celular, ou mesmo como indutores da síntese enzimática (GONG; TSAO,

1975).

A produção de enzimas fúngicas, em escala industrial no mundo ocidental, tem sido

realizada pelo cultivo do fungo em meio de cultura líquido (fermentação submersa) como

processo majoritário, provavelmente por ser tecnologicamente fácil de executar e controlar bem

como apresentar rendimentos de produção considerados satisfatórios (SANT’ANNA Jr., 2001).

No Japão, entretanto, tem-se utilizado a fermentação em substrato sólido para a produção não

apenas de alimentos e bebidas tradicionais, mas também, industrialmente, para a produção de

enzimas fúngicas, procedimento mais compatível com o comportamento natural dos fungos. Os

avanços tecnológicos que têm sido incorporados aos processos de fermentação em substrato

sólido, como o aumento dos rendimentos de produção, têm, aos poucos, alterado o perfil da

produção de substâncias de origem fúngica no ocidente.

O sucesso para a produção de um metabólito de fungo requer um conhecimento detalhado

das características de crescimento e da fisiologia do fungo em questão. Sabe-se que não apenas a

produção de diferentes metabólitos requer diferentes condições fisiológicas, mas, também, cada

fungo é único no seu desenvolvimento anatômico, morfológico e fisiológico. Essas diferenças

ocorrem não apenas entre o modo de cultivo, isto é, em substrato líquido ou sólido, mas, também,

dentro de cada um, devido à alteração em algum fator que venha a interferir no desenvolvimento

do fungo. Por isso, para cada fermentação, as condições precisas e o correto estágio de

desenvolvimento do fungo devem ser estabelecidos para que seja conseguida a produção máxima

do metabólito de interesse. Em outras palavras, o controle da morfologia desses microrganismos é

um ponto que necessita grande atenção de modo que possam ser usados na sua forma ótima para

maximizar a capacidade potencial de produção (PAPAGIANNI; MOO-YOUNG, 2004).

Pesquisadores da UFRJ desenvolveram uma técnica com o uso de microorganismos

encontrados no intestino de peixes que pode aumentar a produção de 80 litros de etanol por

tonelada de cana-de-açúcar para 110 litros por tonelada. Os pesquisadores descobriram

microrganismos no intestino de peixes capazes de quebrar a celulose no bagaço de cana-de-

31

açúcar. As bactérias descobertas produzem até 5 vezes mais celulase que as bactérias já

registradas. Além do intestino dos peixes, os pesquisadores também tentam encontrar este tipo de

bactérias no estômago de ruminantes, já que estes animais precisam digerir a celulose que ingerem

(CANABRASIL, 2008).

Aspergillus niger é fonte de celulase destinada ao uso alimentício e Trichoderma viride é

usado para aplicações não alimentícias, embora ambas enzimas possam cumprir muitas tarefas.

Suas enzimas são concentradas e parcialmente purificadas antes de serem comercializadas

(BIGELIS, 1993). Segundo Gokhale (1986) Aspergillus niger pode ser considerado, algumas

vezes, superior aos outros fungos, reconhecidamente bons produtores dos complexos celulolíticos

e hemicelulolíticos, como Trichoderma viride.

Cultura mista de Aspergillus ellipticus e Aspergillus fumigatos desenvolvida e bagaço de

cana-de-açúcar pré-tratado com solução de hidróxido de cálcio a 2% foi favorável à produção de

celulase e ß-glicosidase, após 8 dias de fermentação (GUPTA; MADANWAR, 1997).

Menezes et al. (1991), obtiveram valores próximos a 0,25 UI/mL de celulase total de

Aspergillus niger, quando utilizaram bagaço de cana pré-tratado com solução de hidróxido de

sódio 4%, como fonte de carbono.

Tanto as bactérias como os fungos podem produzir celulases para a hidrólise de materiais

lignocelulósicos. Esses microrganismos podem ser aeróbios, anaeróbios, mesofílos e termófilos.

Celulomonas e Thermomonospora tem sido estudadas para a produção de celulase.

O mecanismo exato pela qual a lignocelluloses é degrada enzimaticamente ainda não está

totalmente compreendido, mas avanços significativos estão sendo feitos como no estudo dos

genes lignocelulolíticos e nas enzimas envolvidas no processo (HOWARD, 2003).

Arantes e Milagres (2009), acreditam que estes fungos agem através da penetração de

suas hifas pelo lúmen das células, as quais ali instaladas produzem uma variedade de metabólitos

extracelulares que vão, assim, atuar degradando os componentes da parede celular vegetal.

T. reesei pode ser um bom produtor de celulase e hemicelulase mas é incapaz de degradar

a lignina. Os fungos de podridão branca pertencente aos basidiomicetos são os mais eficazes na

degradação da lignina (AKIN et al., 1995; GOLD; ALIC, 1993) com P. chrysosporium sendo o

fungo mais estudado, o qual produz em grandes quantidades um complexo de enzimas

lignocelulolíticas.

32

Fungos de podridão marrom atacam principalmente a celulose, enquanto que os de

podridão branca atacam a celulose e a lignina. Sendo os de podridão branca os basidiomicetos

mais eficazes para pré-tratamento de materiais lignocelulósicos (FAN et al., 1987).

2.6.1 Fungos de degradação branca

Os principais agentes de degradação da lignina estão entre os fungos da decomposição

branca que são dotados de um sistema ligninolítico constituído de peroxidades (Lignina e

Manganês-Peroxidase) e da lacase, essas enzimas atribuem aos fungos a capacidade de

desestabilizar a estrutura da da lignina (BONONI, 1997; CLOETE; CELLIERS, 1999; CHAGAS;

DURRANT, 2001).

Inúmeras são as espécies de fungos da podridao branca (FPB), sendo a maioria destas

Basidiomycotina, seguidas por algumas Ascomycotina (ERIKSON et al., 1990). No grupo dos

basidiomicetos lignoceluloliticos encontram-se organismos que atuam como importantes

decompositores, sendo os principais responsáveis pela reciclagem do carbono nos ecossistemas.

Degradam os componentes da madeira, celulose, hemicelulose e lignina a partir dos quais obtêm

energia para seu crescimento e reprodução. Esses microrganismos são os únicos conhecidos com

a capacidade de metabolizar completamente a molécula de lignina a gás carbônico e água, sendo

os maiores responsáveis pela degradação dos tecidos vegetais (KIRK; FARREL, 1987).

A degradação da lignina por estes fungos de degradação branca é mais rápida do que a

causada por outros microrganismos. O crescimento destes fundos diminui em condições limitadas

de nitrogênio e carbono, e a atividade de enzimas lignolíticas aparece como forma de metabolismo

secundário (KIRK; FARELL, 1987; TUOMELA et al., 2000).

2.6.2 Fungos de degradação marrom

Fungos de degradação marrom degradam a cellulose e hemicelulose sem alterar a lignina

(COWLING, 1961).

No entanto, basidiomicetos de podridão marrom são conhecidos por serem responsáveis

por grave deterioração das paredes das células lenhosas (ZABEL; MORELL, 1992). Portanto, os

fungos chamados de podridão-marrom efetivamente digerem componentes celulósicos sem a

33

remoção da lignina. O que retarda ataques microbianos em hidratos de carbono lenhosos

(CRAWFORD, 1981; ERIKSSON et al., 1990).

A podridão parda assim também chamada, provoca uma diminuição nas características

mecânicas da madeira mais rapidamente que a podridão branca, uma vez que a diminuição na

massa específica ao final do processo é maior nesta última (LEPAGE, 1986).

De acordo com Lee (2003); Azevedo (2008), devido a esses fungos atacarem as células

das paredes formando poros e erosões devido à quebra das microfibrilas, as hifas dos fungos de

degradação marrom pode-se dividir em duas categorias: sendo a primeira que degradam os

componentes da parede celular e a segunda que somente modificam a lignina enquanto degradam

a celulose e a hemicelulose.

2.6.3 Fungos de degradação branda

É o resultado da ação de fungos inferiores (classe Ascomicetos), os quais atacam a

madeira em situações de grande concentração de umidade, para o desenvolvimento dos fungos

que originam as podridões pardas e brancas. Assim, é freqüente encontrar-se este ataque em

zonas bastante úmidas e sem ventilação, em contato com o terreno ou diretamente com água, de

que são exemplo os elementos de madeira dos sótãos, os postes de madeira em contacto com o

solo, entre outros. Os gêneros que mais freqüentemente provocam este tipo de podridão são os

Cephalosporium e os Chaetomium (MERINO,1998).

O fungo da podridão mole assim como o da podridão marrom costuma atacar a celulose

da célula. A madeira que foi atacada pela podridão mole pode escurecer um pouco, mas

geralmente a cor não muda muito. Nos estágios avançados, a madeira atacada pela podridão mole

se torna muito mole e quando testada ela se fragmenta em pedaços. Quando seca a madeira é

mais frágil e desenvolve rachaduras decorrentes do encolhimento (FAN et al., 1982).

Em contraste com outros tipos de apodrecimento, o índice de deterioração decorrente da

podridão mole é diretamente proporcional à quantidade de nitrogênio e por isso ela é mais ativa

na madeira que está em contato com o solo ou com a água que contenham este nutriente em

solução.

34

2.7 Objetivo

Este trabalho teve por objetivo a obtenção de fungos isolados e selecionados do ambiente

agroindustrial, com a capacidade de hidrolisar a fração celulósica do bagaço de cana-de-açúcar.

35

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Isolamento

O isolamento foi conduzido em bagaço de cana-de-açúcar proveniente de três destilarias

da região de Piracicaba, SP: Usina Costa Pinto (COSAN), Granelli e Furlan. Para o isolamento

dos fungos, amostras de 5g foram homogeneizadas com 45mL de água peptonada 0,1%.

Seguido da homogeneização, amostras foram diluídas para 10-2 , 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7,

10-8; das quais alíquotas de 100µl foram plaqueadas em placas de petri em meio BDA (20%

batata, 2% dextrose e 2% Agar), contendo tetraciclina (100mg/L), incubadas por um período de 5

a 7 dias a temperatura de 280 C. Após o crescimento dos fungos, colônias isoladas foram

selecionadas de acordo com sua morfologia e repicadas em meio BDA.

3.2 Manutenção das linhagens

A manutenção das linhagens foi de acordo com Castellani (1967). Após o

crescimento da colônia em meio BDA, discos de aproximadamente 1 cm de diâmetro contendo

micélio foram transferidos em frascos âmbar contendo água estéril e armazenados em

temperatura ambiente.

3.3 Avaliação prévia da atividade celulolítica dos isolados em meio com vermelho Congo

Isolados foram cultivados em meio sintético contido em placas de petri com

carboximetilcelulose (CMC) como única fonte de carbono (Tabela 1). Os inóculos foram obtidos

com agulha no centro de placas de Petri. Com os isolados previamente crescidos em meio BDA

por 3 e 5 dias a 28ºC, foram adicionados 10 mL de solução corante de vermelho congo (2,5 g.L-

1) em tampão Tris HCl 0,1 M, pH 8,0. Decorrido 30 minutos a solução foi descartada e as placas

foram lavadas com 5 mL de solução de NaCl 0,5 M neste mesmo tampão. Os diâmetros das

colônias e dos halos produzidos foram medidos com paquímetro (Nogueira & Cavalcanti 1996).

36

Tabela 1 - Meio sintético CMC 1% de acordo com Nogueira e Cavalcanti (1996) Componentes Unidades Concentração

NaNO3 g/L 3,0

(NH4)2 SO4 g/L 1,0

MgSO4 g/L 0,5

KCl g/L 0,5

FeSO4.7H2O mg/L 10,0

CMC

g/L 10,0

Ágar g/L 20,0

3.4 Produção das enzimas (celulases)

Como substrato foi empregado bagaço de cana-de-açucar, previamente da Usina Costa

Pinto, previamente moido (em liquidificador domestico por 2 minutos) e peneirado com

granulação máxima de 1mm. O material foi seco em estufa até (600 C) até pesos constantes e

armazenados em potes plásticos hermeticamente fechados.

Pesou-se 1g de bagaço em frascos de Erlenmeyers de 125mL acrescidos de 100mL de

meio basal (pH 5,5) descrito na Tabela 2, autoclavado a 1 atm. 1210 C durante 15 minutos. Após

a esterização foram inoculados nos frascos, em triplicata, 1 disco de micélio fúngico (1cm de

diâmetro) e incubados por um período de 21 dias a 28oC sob agitação de 150 rpm em incubadora

orbital. Tais discos foram obtidos de placas BDA com 7 dias de cultivo a 280C. Em intervalos

regulares de 7 dias amostras de 4mL do extrato enzimático foram retiradas de cada frasco,

centrifugadas a 3000 gx durante 5 minutos. O sobrenadante foi utilizado para a determinação das

atividades enzimáticas.

Nesta etapa foram empregados os isolados fúngicos mais promissores segundo a atividade

celulolítica observada mediante hidrólise de carboximetilcelulase seguida de coloração com

vermelho Congo. Empregou-se também o fungo QM 9414 como referência.

37

Tabela 2 – Meio Basal proposto por Mandels e Weber (1969)

Componentes Unidade Concentração KH2PO4 g/L 2,0

(NH4) SO4 g/L 1,4

CaCL2.2H2O g/L 0,3

MgSO4.7H2O g/L 0,3

FeSO4.7H2O mg/L 5,0

MnSO4.H2O mg/L 1,6

ZnSO4.7H2O mg/L 1,4

CoCl2 mg/L 2,0

Tween-80 ml/L 1,0

Peptona g/L 1,0

3.5 Determinação da atividade celulolítica total

Foi baseada no protocolo de Ghose (1987), empregando-se papel de filtro como substrato

e avaliando-se a atividade pela liberação de substancial redotoras dosadas mediante o método de

Miller (1959) empregando o ácido 3,5 – dinitrosalicílico.

O reativo de DNS foi preparado da seguinte forma: 300 g de tartarato duplo de sódio e

potássio ((CHOH)2.COONa.COOK) com 16 g de hidróxido de sódio (NaOH) dissolvido em

água destilada. Em seguida, adiciona-se 10 g de acido 3-5 dinitrosalicílico (C7H4N2O7)

(aquecendo se necessário). Por fim, completou-se o volume para 1 litro com água destilada.

Em tubos de ensaio de 25mL foram colocados uma tira de papel de filtro Whatman no1 de

1,0 x 6,0 cm pesando aproximadamente 50 mg. Adicionado 1,0 mL de tampão citrato de sódio

0,05 Molar e 0,5 mL da amostra centrifugada (enzima bruta). Para o branco amostra procedeu-se

da mesma forma, porém sem o substrato. Já para o branco reagente colocou-se somente 1,5 mL

do tampão citrato.

O material foi incubado em banho-maria a 50ºC durante 1 hora. Após o período de

incubação acrescentou-se 3,0 mL de DNS paralisando a reação. Amostras foram fervidas (1000C)

durante 5 minutos para a produção de cor e posteriormente foram colocadas em banho frio. Após

38

a fervura foi adicionado 20 mL de água. A leitura foi realizada no em espectrofotômetro a

absorbância de 540 nm.

De acordo com o protocolo de Ghose (1987), foi necessário realizar diluições a fim de se

obter amostras as quais liberassem acima e abaixo de 2,0 mg de açúcar por 0,5 mL. Ao encontrar

as diluições, e com o auxilio da reta padrão identificou-se a concentração que liberasse 2,0 mg de

açúcar por 0,5 mL de solução.

3.6 Determinação da atividade da enzima Endo-1, 4-β-Glucanase

Igualmente a atividade de endoglucanase (CMCase) foi conduzida segundo Ghose (1987)

e Miller (1959), empregando-se carboximetilcelulase (CMC) como substrato.

Em tubos de ensaio foram adicionados 0,5 de tampão citrato de sódio 0,05 Molar e 0,5

mL da amostra centrifugada (enzima bruta). Para o branco amostra procedeu-se da mesma forma,

porém sem o substrato. Já para o branco reagente colocou-se somente 1,5 mL do tampão citrato.

O material foi incubado em banho-maria a 50ºC durante 30 minutos. Após o período de

incubação acrescentou-se 3,0 mL de DNS paralisando a reação. Amostras foram fervidas (1000C)

durante 5 minutos para a produção de cor e posteriormente foram colocadas em banho frio.

Adicionou-se 20 mL de água. A leitura foi realizada no em espectrofotômetro a absorbância de

540 nm.

De acordo com o protocolo de Ghose (1987), foi necessário realizar diluições a fim de se

obter amostras as quais liberassem acima e abaixo de 2,0 mg de açúcar por 0,5 mL. Ao encontrar

as diluições, e com o auxilio da reta padrão identificou-se a concentração que liberasse 2,0 mg de

açúcar por 0,5 mL de solução.

3.7 Determinação das atividades enzimáticas celulolíticas

As análises protéicas foram realizadas conforme metodologia de Bradford (1976).

Reagente: 10 mg de Coomassie Brilliant Blue G250 foi dissolvido em 5 mL do álcool

etílico de 95%. A solução então é misturada com os 10 mL do ácido fosfórico de 85% e

completado para 100 mL com a água destilada (microbradford). Armazenado em frasco âmbar e

em geladeira.

39

Com o auxilio de uma reta padrão de albumina bovina em uma concentração de 1 mg/mL,

determinou-se as quantidades de proteínas presentes nas seguintes concentrações: 10,

25,50,75,100, 250,500 e 1000 µg/mL.

A quantificação protéica foi realizada diluindo o reagente 1:1 em água destilada.

Utilizando microplaca de fundo redondo, 20µL das amostras foram colocadas nos poços e 200

µL do reagente foram adicionados. Em seguida (menos de 2 minutos) foi realizada a leitura no

leitor de microplacas Idexx ELX 800: Software X-chek na absorbância de 545 nm. Para o branco,

20 µL de água destilada foram utilizados no lugar da amostra.

3.8 Identificação

Análise molecular foi realizada primeiramente através da região 26S, usando os

iniciadores específicos NL4 (5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’) e NL1 (5’-

GCCATATCAATAAGCGGAGGAAAG-3’). Em uma segunda análise usou-se primers para

região altamente conservada (ITS1F e ITS4) previamente descrita por (WHITE et al., 1990;

GARDES; BRUNS, 1993).

Por não se obter um bom seqüenciamento para uma identificação através do banco de

dados, optou-se por uma identificação morfológica, mediante observação ao microscópio ótico,

observando-se as seguintes características.

3.9 Análise estatística dos dados

Para análises dos dados, o programa utilizado foi ESTAT (Sistema para análise estatística,

versão 2.0, Departamento de Ciências Exatas – UNESP, Jaboticabal, 1992), foi feito teste de

Turkey, com nível de significância de 5%, de modo que os experimentos foram sempre

realizados em triplicata.

41

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Avaliação da atividade celulolítica mediante descoloração com vermelho Congo

Após o período de incubação (3 e 5 dias) dos isolados em meio CMC 1% e corados com

vermelho congo, observou-se a formação de halos somente em 15 dos 46 cultivos avaliados.

(Tabela 3). A formação de halos em meio CMC sólido resulta da quebra da CMC em fragmentos

menores que celohexose, à qual o vermelho Congo não se liga. A quebra da CMC gera

fragmentos pequenos o suficiente para serem lavados para fora da placa de Petri durante o

processo. Apenas a atividade da endoglucase pode ser esperada para produzir zonas de hidrólises

(WOOD, 1980). O vermelho Congo mostrou uma forte interação com polissacarídeos β (1-4)

ligado em unidades D-glucopiranosil fornecendo a base para um ensaio sensível para a detecção

de colônias de bactérias produtoras de celulase (TEATHER; WOOD, 1982).

O índice enzimático (I.e.) foi calculado somando o diâmetro da colônia mais o halo

formado, dividindo o resultado pelo valor do diâmetro da colônia segundo (Furlaneto, 1989).

Tabela 3 - Atividade celulolítica dos isolados do bagaço de cana-de açúcar, cultivados em meio sintético com

carboximetilcelulose durante 3 e 5 dias a 28 ºC. ∅c = diâmetro da colônia (cm); ∅h = diâmetro do halo

(cm); Íe = índice enzimático; ( - ) = não cresceu e/ou não produziu halo

(continua)

Isolados Usina ∅∅∅∅h ∅∅∅∅c Íe. ∅∅∅∅h ∅∅∅∅c Íe. 3 dias 5 dias

1 Cosan - 1,1 - - 1,3 - 2 Cosan 0,2 1,1 ++ 1,4 2,5 ++++ 3 Cosan - 2,5 - - 1,9 - 4 Cosan - 1,0 - - 1,5 - 5 Cosan - 2,7 - - 3,6 - 6 Cosan 0,6 1,3 ++++ 1,7 2,5 ++++ 7 Cosan - 2,4 - - 4,2 -

8 9

Cosan Cosan

- -

2,3 1,3

- -

- 1,3

3,1 2,2

- ++++

10 Cosan - 0,7 - - 0,9 - 11 Cosan - 1,6 - - 1,7 - 12 Cosan 0,3 1,2 +++ 1,8 2,5 ++++ 13 Cosan - 2,6 - - 3,8 - 14 Cosan - 1,8 - - 2,7 -

42

Tabela 3 - Atividade celulolítica dos isolados do bagaço de cana-de açúcar, cultivados em meio sintético com

carboximetilcelulose durante 3 e 5 dias a 28 ºC. ∅c = diâmetro da colônia (cm); ∅h = diâmetro do halo (cm); Íe

= índice enzimático; ( - ) = não cresceu e/ou não produziu halo

(conclusão)

Isolados Usina ∅∅∅∅h ∅∅∅∅c Íe. ∅∅∅∅h ∅∅∅∅c Íe. 3 dias 5 dias

15

Cosan - 1,7 - - 4,1 -

16 Cosan - 2,5 - - 4,0 - 17 Cosan - - - 1,0 1,6 +++ 18 Furlan - 2,8 - - 4,5 - 19 Furlan - 2,3 - - 3,7 - 20 Furlan - 1,0 - 2,0 2,9 ++++ 21 Furlan - 2,3 - 1,7 2,2 ++++ 22 Furlan 1,0 1,5 ++++ 1,6 2,9 ++++ 23 Furlan 1,3 1,0 ++++ 1,6 3,2 ++++ 24 Furlan 0,8 1,5 ++++ 1,9 3,3 ++++ 25 Furlan 0,2 1,2 ++ 1,2 1,8 ++++ 26 Furlan - 1,2 - - 1,2 - 27 Furlan 0,6 1,0 ++++ 1,7 2,4 ++++ 28 Furlan - 1,0 - - 1,5 - 29 Furlan - 0,9 - - 2,5 - 31 Furlan 0,1 1,1 - - 2,7 - 32 Furlan - 1,7 - 2,8 - 33 Furlan - 2,3 - - 2,3 -

34 Furlan - 2,1 - - 3,0 - 35 Granelli - 2,4 - - 3,5 - 36 Granelli 1,7 0,5 ++++ 1,7 2,4 ++++ 37 Granelli - 3,5 - - 5,8 -

38 Granelli - 0,8 - - 1,1 - 39 Granelli - 1,3 - 1,7 2,4 ++++

40

Granelli - 2 - - 4,3 - T1 Granelli - - - - 5,6 - T2 Granelli - 3,0 - - - -

T4 Granelli - 3,8 - - - - T5 Granelli - - - - - - T6 Granelli - 3,9 - - 6,5 -

QM 9414 - 4,2 - - 6,3 - Índice enzimático: de 0 -0,99 (-); 1,0 – 1,10 (+); 1,11 – 1,20 (++); 1,21 – 1,30 (+++);1,31 – 1,40 (++++).

43

Utilizando a mesma metodologia Nogueira et al., (1996), mediram o halo de degradação

com 5 e 7 dias, encontrando valores com a mesma variabilidade que as apresentadas no presente

trabalho. Observou-se maiores valores para Aspergillus janus ++++; Aspergillus caesiellus Saito

+++; Penicillium bilaii Chalabuta ++++. Ruegger e Tauk-Tornisielo (2004) constataram a não

formação halo em linhagens do gênero Trichoderma, de seis cepas do citado fungo analisados,

apenas dois apresentaram para celulase, com valores iguais a 1,1 e 4,0. Esse resultado não condiz

com vários autores como Feldman et al. (1988) e Galliano et al. (1988) e com a literatura em

geral onde Trichoderma é considerado como uma boa fonte de celulase. Souza e Oliveira (2008)

e Sazci et al. (1986) relatam que todos os fungos estudados foram efetivamente capazes de

produzirem halos de degradação da celulases. No entanto, no presente trabalho o T. reesei QM

9414 não mostrou a presença de halo de hidrólise, como demonstrado na tabela acima (Tabela 4).

Ruegger e Tauk-Tornisielo (2004), relatam também que a linhagem Penicillium herquei

apresentou maior índice enzimático, obtendo diâmetro de colônia de 2 mm e índice enzimático 6

e entre as cepas que apresentaram maior diâmetro de colônia estava Trichoderma harzianum com

um índice enzimático de 1,1. Com isso nota-se que os resultados também mostraram que a cepa

com o maior índice enzimático apresentou um diâmetro de colônia menor em relação às outras

cepas analisadas. Portanto, ao se avaliar as cepas para selecionar uma como boa produtora de

enzima celulolítica, não se deve ter como referência somente os dados sobre o índice enzimático,

mas também se deve levar em consideração o crescimento do microrganismo no meio de cultura.

Figura 4 - Placas de Meio CMC sólido com Vermelho Condo 1%. A zona mais clara ao redor das colônias,

correspondente ao halo indicador da degradação da CMC foi que observada em 15 dos 46 isolados ou seja, 32,6%. ∅c = diâmetro da colônia (cm); ∅h = diâmetro do halo (cm)

44

4.2 Análise da atividade celulolítica (celulase total e endoglucanase)

Vários componentes dos materiais ligno-celulósicos podem induzir a produção de celulase

quando usado uma fonte de carbono para o crescimento do fungo. Fernandez (1996) relatou que o

bagaço de cana-de-açúcar é um material bastante heterogêneo constituído por uma mistura de

fibras e tecidos. Além disso, apresenta em sua composição um elevado teor de açucares totais

(glicose, frutose, sacarose, rafinose, etc.).

Neste ensaio 14 dos 46 isolados juntamente com o T. ressei QM 9414 foram avaliados

quanto a atividade enzimática da celulase total (FPase) e a atividade da endoglucanase

(CMCase), ambas expressas em UI/mL e IU/g de substrato, empregando-se o bagaço de cana de

açúcar como substrato indutor das celulases

Após 21 dias de cultivo em bagaço de cana-de-açúcar nenhum dos isolados apresentou

atividade da celulase total maior que a referencia T. ressei QM 9414, onde sua maior atividade

celulolítica total foi de 0,40 UI/mL com 7 dias de cultivo.

Dos isolados selecionados os que apresentaram maiores valores para a atividade da

celulase total foram de 0,25 UI/mL para o isolado 9 após 7 dias de cultivo, de 0,17 IU/mL para o

isolado 23 e de 0,24 UI/mL para o isolado 27, ambos após 21 dias de cultivo.

Basso (2010), trabalhando em cultivo em estado sólido, obteve atividade da celulase total

de 0,16 UI/mL para T. ressei e 0,06 UI/mL para Aspergillus fumigatus após 10 dias de incubação

em bagaço. De acordo com Aguiar e Menezes (2000), verificou-se que produção de celulase total

em bagaço não tratado pela linhagem Aspergillus Níger IZ-9 foi de aproximadamente 0,08

UI/mL em um período de 7 dias de cultivo submerso sob agitação, valor inferior comparado com

os resultados mostrados neste trabalho (Figura 5a).

No entanto Wen et al. (2005) utilizando T. ressei observou atividade da celulase total de

aproximadamente 0,30 UI/mL em bagaço não tratado depois de 6 dias, valor semelhante ao

obtido no presente trabalho.

Tanto para a celulase total como para a endoglucanase, os isolados que apresentaram

maiores valores foram 9, 17, 22, 23 e 27.

Quanto à atividade de celulase total no transcorrer do ensaio se observa maiores

atividades para a linhagem QM9414, atingindo um máximo aos 14 dias e declinando para quase

metade deste valor aos 21 dias de cultivo. O cultivo deste fungo em bagaço, porém em

fermentação em estado sólido, igualmente mostrou incremento na atividade de celulase total até

45

os 15 dias (Basso 2010), porém com valores de atividade correspondendo a 1 vigésimo

(expressas em UI/g) daquele observado neste trabalho. Tal constatação evidencia uma maior

produção de enzima quando em fermentação submersa.

Os isolados 9 e 23 mostraram maiores atividades com 7 dias de cultivo, declinando

discretamente até os 21 dias. No entanto o isolado 27 apresentou um padrão de atividade de

celulase total, completamente diferente, incrementando abruptamente a atividade enzimática com

14 dias de cultivo, mantendo até os 21 dias, quando igualou em atividade com a linhagem QM

9414. Estes resultados mostram que cada isolado apresenta um perfil característico de produção

enzimática.

Quanto à cinética da atividade de endoglucanase os isolados 9, 23 e 27 apresentaram

atividades enzimáticas muito próximas do fungo referência (QM9414), sendo que os isolados 9 e

23 apresentaram os maiores valores aos 7 dias, enquanto o isolado 27 mostrou uma atividade

máxima aos 21 dias. Os perfis de atividade de celulase total e endoglucanase mostraram um

paralelismo para todos os microrganismos avaliados.

Mesmo com estes poucos isolados avaliados, se percebe que dado isolado pode ter alta

atividade de celulase total e baixa atividade de endoglucanase (ou vice e versa), confirmando que

o preparo de coquetéis enzimáticos (obtidos de diferentes linhagens microbianas) venha a ser

uma alternativa com grande praticidade.

46

(a)

Figura 5 – Atividade enzimática da celulase total, utilizando papel de filtro como substrato, obtida do cultivo dos

isolados em bagaço de cana-de-açúcar após em 0 dia. Valores das médias de 3 repetições. Médias com a mesma letra não diferem entre si, segundo teste de Tukey (p<0,005).

2 6 9 12 17 20 21 22 23 24 25 27 36 39 QM

Isolados

0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0

47

(b)


isolados em bagaço de cana-de-açúcar após 7 dias. Valores das médias de 3 repetições. Médias com a mesma letra não diferem entre si, segundo teste de Tukey (p<0,005)

40 35 30 25 20 15 10 5 0 2 6 9 12 17 20 21 22 23 24 25 27 36 39 QM

Isolados

48

(c)



45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

Isolados

2 6 9 12 17 20 21 22 23 24 25 27 36 39 QM

49

(d)



25 20 15 10 5 0

2 6 9 12 17 20 21 22 23 24 25 27 36 39 QM Isolados

50

(a)

Figura 9 – Atividade enzimática da endoglucanase, utilizando a carboximetilcelulose (CMC) como substrato, obtida

do cultivo dos isolados em bagaço de cana-de-açúcar em 0 dia. Valores das médias de 3 repetições. Médias com a mesma letra não diferem entre si, segundo teste de Tukey (p < 0,005).

0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,0

2 6 9 12 17 20 21 22 23 24 25 27 36 39 QM Isolados

51

(b)


do cultivo dos isolados em bagaço de cana-de-açúcar após 7 dias. Valores das médias de 3 repetições. Médias com a mesma letra não diferem entre si, segundo teste de Tukey (p < 0,005).

60 50 40 30 20 10 0

2 6 9 12 17 20 21 22 23 24 25 27 36 39 QM

Isolados

52

(c)



60 50 40 30 20 10 0

Isolados

53

(d)



Com relação à atividade da endoglucanase dentre os isolados F9, F22, F23 e F27 os quais

apresentaram maiores atividades, destaca-se o isolado F27 sendo sua atividade para CMCase no

210 dia de cultivo de 0,50 UI/mL comparado com 0,30 UI/mL pelo QM 9414, tido como

referência neste trabalho (Figura 12).

Este resultado indica que é possível obter consideráveis resultados de hidrólise do bagaço

utilizando-se isolados selvagens com desempenho similar ou melhor à cepa mutagênica T. ressei

9414. Dillon (1992), em experimento com a linhagem mutante de Penicillium sp, através da luz

ultra-violeta (UV) obteve 3MUV243 e seus clones 3MUV2431e 3MUV2434 selecionados por

terem melhor capacidade hidrolítica.

No trabalho realizado por Menezes et al. (2009) observou-se atividade de endoglucanase

de 0,06 UI/mL produzida pela linhagem Pleurotus sajor-caju durante 30 dias de cultivo em

bagaço de cana-de-açúcar em fermentação submersa sem agitação, enquanto Aguiar e Menezes

Isolados

54

(2000) encontraram valor de 0,2 UI/mL para a linhagem Aspergillus Níger IZ-9 com 7 dias de

cultivo em bagaço.

O crescimento de Trichoderma harzianum em meio liquído com bagaço de cana 1% (m/v)

realizado por Mendoza (2009) obteve-se atividade da endoglucanase de 0,032 UI/mL após 9 dias

de cultivo. Já em seu trabalho Basso (2010), apresentou valor de 6,0 IU/g bagaço para T. ressei

QM 9414 e 4,8 UI/g bagaço para Penicillium verruculosum (G3).

Figura 13 – Atividade enzimática específica (UI/mg proteína), obtida do cultivo dos isolados em bagaço de cana-de-

açúcar após 21 dias. Valores das médias de 3 repetições. Médias com a mesma letra não diferem entre si, segundo teste de Tukey (p < 0,005)

Neste estudo da endoglucanase, valores bem próximos ao T. ressei QM 9414 de 0,50

UI/mL foram encontrados pelos isolados F9 (A), F23 (G) e F27 (I). Resultado semelhante

apresentado por Basso (2010), onde a atividade máxima de endoglucanase para T. ressei 9414

tambem foi de 0,50 UI/mL, no entanto comparando em UI/g bagaço, o resultado obtido neste

estudo foi de 9 vezes maior. Considerando-se que o trabalho conduzido por BASSO (2010)

empregou o cultivo em meio sólido com menor teor de umidade, o presente trabalho está

indicando uma maior produção de celulase quando em fermentação submerça (meio líquido).

2 6 9 12 17 20 21 22 23 24 25 27 36 39 QM

Ativ

idad

e es

pec

ífic

a

Cel

ula

se to

tal

UI/

mg

pro

teín

a

55

Dentre os isolados cultivados em bagaço durante 10 dias, Trichoderma ressei QM 9414

apresentou maior valor para atividade específica da celulase total de 0,7 UI/mg proteína, Basso

(2010).

4.3 Identificação dos isolados

Os fungos isolados foram identificados morfologicamente, mediante observação das hifas

e corpos de frutificação pelo professor T. S. Suryanarayanan do Vivekananda Institute of

Tropical Mycology (VINSTROM) – Índia.

Tabela 4 - Identificação morfológica dos isolados do bagaço

Isolados Nomenclatura (gênero)

F9 Trichoderma

F17 Aspergillus

F22 Penicillium

F23 Trichoderma

F27 Penicillium

57

5 CONCLUSÕES

A avaliação da atividade celulolítica mediante descoloração com vermelho Congo traz

informações divergentes, não apenas confirmando diferentes resultados mencionados na

literatura, como neste trabalho, não permitindo discriminar as grandes diferenças nas atividades

de endoglucanase e celulase total dos isolados avaliados. Tanto assim que o fungo QM9414 que

não apresentou halo foi aquele que propiciou as maiores atividades celulolíticas.

Comparativamente com a literatura o sistema de fermentação em meio líquido (cultura

submersa) mostrou uma maior atividade tanto de endoglucanase como celulase total.

Os isolados mostraram perfis de produção de celulases típicos para cada linhagem, tanto

na atividade enzimática como no tempo de incubação para a produção máxima.

Alguns isolados mostraram induções enzimáticas, empregando-se o bagaço de cana como

substrato, bem próximas daquela exibida pelo fungo referência (QM9414). Como tal linhagem já

foi geneticamente melhorada, enquanto os isolados testados são linhagens selvagens, pode-se

especular que as mesmas ainda podem ser melhoradas para uma maior produção de celulases.

Os resultados evidenciam o grande potencial da biodiversidade existente em nichos

industriais, como o depósito de bagaço de cana, na busca de linhagens com potencialidade de

emprego na hidrólise enzimática deste substrato lignocelulósico.

59

REFERÊNCIAS

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69

ANEXOS

71

Anexo A- Atividade de endoglucanase (CMCase) do extrato enzimático obtido do cultivo dos isolados em bagaço de cana-de-açúcar (continua)

CMC Isolados 0 dia 7 dias 14 dias 21 dias

UI/mL UI/g

bagaço Desvpad UI/mL UI/g



bagaço Dtdev 2 0,0006 0,0640 0,0156 1,5600 0,0020 0,2000 0,0027 0,2700

0,0026 0,2550 0,0003 0,0125 1,2500 0,0005 0,0020 0,2000 0,0002 0,0019 0,1900 0,0001 0,0027 0,2661 0,0125 1,2500 0,0011 0,1100 0,0034 0,3400

6 0,0033 0,3300 0,0080 0,8000 0,0027 0,2700 0,0027 0,2700 0,0039 0,3900 0,0004 0,0132 1,3200 0,0001 0,0034 0,3400 0,0005 0,0020 0,2000 0,0001 0,0059 0,5900 0,0073 0,7300 0,0034 0,3400 0,0053 0,5300

9 0,0032 0,3200 0,4502 45,0200 0,3503 35,0300 0,3615 36,1500 0,0027 0,2700 0,0003 0,4318 43,1800 0,008 0,3797 37,9700 0,0063 0,3361 33,6100 0,0068 0,0013 0,1300 0,5078 50,7800 0,3981 39,8100 0,3877 38,7700

12 0,0077 0,7700 0,0265 2,6500 0,0115 1,1500 0,0027 0,2700 0,0042 0,4200 0,0005 0,0232 2,3200 0,0010 0,0084 0,8400 0,0006 0,0033 0,3300 0,0002 0,0068 0,6800 0,0190 1,9000 0,0068 0,6800 0,0042 0,4200

17 0,0033 0,3300 0,0214 2,1400 0,0691 6,9100 0,1133 11,3300 0,0061 0,6100 0,0008 0,0204 2,0400 0,0001 0,0755 7,5500 0,0022 0,0949 9,4900 0,0034 0,0092 0,9200 0,0205 2,0500 0,0855 8,5500 0,0882 8,8200

20 0,0034 0,3400 0,0052 0,5200 0,0065 0,6500 0,0026 0,2600 0,0020 0,2000 0,0002 0,0033 0,3300 0,0004 0,0034 0,3400 0,0002 0,0027 0,2700 0,0004 0,0026 0,2600 0,0026 0,2600 0,0054 0,5400 0,0042 0,4200

72

Anexo A- Atividade de endoglucanase (CMCase) do extrato enzimático obtido do cultivo dos isolados em bagaço de cana-de-açúcar (continuação)


UI/mL UI/g




bagaço Dtdev 21 0,0034 0,3400 0,0042 0,4200 0,0042 0,4200 0,0027 0,2700

0,0032 0,3200 0,0002 0,0033 0,3300 0,0007 0,0053 0,5300 0,0003 0,0053 0,5300 0,0006 0,0019 0,1900 0,0084 0,8400 0,0065 0,6500 0,0072 0,7200

22 0,0228 2,2800 0,2287 22,8700 0,1627 16,2700 0,1226 12,2600 0,0170 1,7000 0,0013 0,2733 27,3300 0,0119 0,1458 14,5800 0,0068 0,1172 11,7200 0,0032 0,0266 2,6600 0,3668 36,6800 0,1118 11,1800 0,1402 14,0200

23 0,0068 0,6800 0,4458 44,5800 0,4387 43,8700 0,3346 33,4600 0,0103 1,0300 0,0008 0,4388 43,8800 0,0045 0,4428 44,2800 0,126 0,3024 30,2400 0,006 0,0046 0,4600 0,4713 47,1300 0,3446 34,4600 0,2902 29,0200

24 0,0039 0,3900 0,0175 1,7500 0,0137 1,3700 0,0091 0,9100 0,0019 0,1900 0,0003 0,0198 1,9800 0,001 0,0160 1,6000 0,0003 0,0110 1,1000 0,0005 0,0026 0,2600 0,0125 1,2500 0,0153 1,5300 0,0125 1,2500

25 0,0083 0,8300 0,0213 2,1300 0,0122 1,2200 0,0038 0,3800 0,0070 0,7000 0,0005 0,0171 1,7100 0,0008 0,0144 1,4400 0,0005 0,0080 0,8000 0,0006 0,0110 1,1000 0,0152 1,5200 0,0103 1,0300 0,0060 0,6000

27 0,0046 0,4600 0,1479 14,7900 0,1643 16,4300 0,4577 45,7700 0,0020 0,2000 0,0004 0,1790 17,9000 0,0041 0,4201 42,0100 0,0131 0,4467 44,6700 0,0134 0,0027 0,2700 0,1661 16,6100 0,4380 43,8000 0,5795 57,9500

73

Anexo A- Atividade de endoglucanase (CMCase) do extrato enzimático obtido do cultivo dos isolados em bagaço de cana-de-açúcar (conclusão)


UI/mL UI/g




bagaço Dtdev 36 0,0019 0,1900 0,0027 0,2700 0,0049 0,4900 0,0042 0,4200

0,0019 0,1900 0,0000 0,0033 0,3300 0,0007 0,0057 0,5700 0,0015 0,0057 0,5700 0,0014 0,0019 0,1900 0,0019 0,1900 0,0061 0,6100 0,0060 0,6000

39 0,0019 0,1900 0,0140 1,4000 0,0085 0,8500 0,0045 0,4500 0,0034 0,3400 0,0002 0,0152 1,5200 0,0003 0,0079 0,7900 0,0004 0,0033 0,3300 0,0005 0,0027 0,2700 0,0132 1,3200 0,0110 1,1000 0,0072 0,7200

QM 9414 0,0069 0,6900 0,4810 48,1000 0,9191 91,9100 0,2471 24,7100

0,0062 0,6200 0,0002 0,5371 53,7100 0,0113 0,9081 90,8100 0,002 0,3379 33,7900 0,0131 0,0056 0,5600 0,5651 56,5100 0,9047 90,4700 0,3170 31,7000

74

Anexo B- Atividade da celulase total (FPase) do extrato enzimático obtido do cultivo dos isolados em bagaço de cana-de-açúcar

(continua)

FP

Isolados 0 dia 7 dias 14 dias 21 dias

UI/mL

UI/g

bagaço Desvpad UI/mL

UI/g


UI/g


UI/g

bagaço Dtdev

2 0,0018 0,1800

0,0047 0,4700

0,0012 0,1200

0,0021 0,2100

0,0023 0,2300 0,0003 0,0068 0,6800 0,0005 0,0012 0,1200 0,0002 0,0016 0,1600 0,0001

0,0005 0,0500

0,0073 0,7300

0,0018 0,1800

0,0012 0,1200

6 0,0008 0,0800

0,0012 0,1200

0,0031 0,3100

0,0017 0,1700

0,0021 0,2100 0,0002 0,0030 0,3000 0,0001 0,0021 0,2100 0,0001 0,0013 0,1300 0,0001

0,0008 0,0800

0,0028 0,2800

0,0018 0,1800

0,0018 0,1800

9 0,0018 0,1800

0,2515 25,1500

0,1868 18,6800

0,1317 13,1700

0,0024 0,2400 0,0002 0,2937 29,3700 0,012 0,1874 18,7400 0,0022 0,1332 13,3200 0,0021

0,0027 0,2700

0,2178 21,7800

0,1760 17,6000

0,1216 12,1600

12 0,0082 0,8200

0,0111 1,1100

0,0109 1,0900

0,0011 0,1100

0,0070 0,7000 0,0002 0,0087 0,8700 0,0007 0,0021 0,2100 0,0002 0,0012 0,1200 0,0001

0,0072 0,7200

0,0129 1,2900

0,0028 0,2800

0,0018 0,1800

17 0,0033 0,3300

0,0057 0,5700

0,0111 1,1100

0,0131 1,3100

0,0051 0,5100 0,0003 0,0064 0,6400 0,0001 0,0136 1,3600 0,0004 0,0129 1,2900 0,0001

0,0042 0,4200

0,0063 0,6300

0,0122 1,2200

0,0125 1,2500

20 0,0024 0,2400

0,0026 0,2600

0,0041 0,4100

0,0018 0,1800

0,0015 0,1500 0,0001 0,0026 0,2600 0 0,0041 0,4100 0,0001 0,0021 0,2100 0,0001

0,0018 0,1800

0,0024 0,2400

0,0047 0,4700

0,0021 0,2100

75


(continua)

FP


UI/mL

UI/g


UI/g


UI/g


UI/g

bagaço Dtdev

21 0,0027 0,2700

0,0029 0,2900

0,0029 0,2900

0,0021 0,2100

0,0015 0,1500 0,0002 0,0021 0,2100 0,0002 0,0024 0,2400 0,0002 0,0016 0,1600 0,0001

0,0023 0,2300

0,0033 0,3300

0,0036 0,3600

0,0024 0,2400

22 0,0010 0,1000

0,0436 4,3600

0,0245 2,4500

0,0203 2,0300

0,0006 0,0600 0,0001 0,0460 4,6000 0,0007 0,0278 2,7800 0,0006 0,0197 1,9700 0,0002

0,0013 0,1300

0,0478 4,7800

0,0263 2,6300

0,0209 2,0900

23 0,0027 0,2700

0,2309 23,0900

0,1820 18,2000

0,1640 16,4000

0,0018 0,1800 0,0002 0,2203 22,0300 0,0052 0,2072 20,7200 0,0044 0,1799 17,9900 0,0027

0,0027 0,2700

0,1995 19,9500

0,2020 20,2000

0,1689 16,8900

24 0,0018 0,1800

0,0039 0,3900

0,0030 0,3000

0,0033 0,3300

0,0024 0,2400 0,0002 0,0049 0,4900 0,0002 0,0039 0,3900 0,0002 0,0033 0,3300 0,0001

0,0027 0,1700

0,0042 0,4200

0,0034 0,3400

0,0027 0,2700

25 0,0033 0,3300

0,0062 0,6200

0,0036 0,3600

0,0020 0,2000

0,0030 0,3000 0,0002 0,0054 0,5400 0,0001 0,0042 0,4200 0,0003 0,0045 0,4500 0,0005

0,0024 0,2400

0,0057 0,5700

0,0054 0,5400

0,0021 0,2100

27 0,0024 0,2400

0,0105 1.05

0,2090 20,9000

0,2462 24,6200

0,0018 0,1800 0,0002 0,0148 1,4800 0,0007 0,1873 18,7300 0,0038 0,2235 22,3500 0,0036

0,0030 0,3000

0,0122 1,2200

0,1894 18,9400

0,2372 23,7200

76


(conclusão)

FP


UI/mL

UI/g


UI/g


UI/g


UI/g

bagaço Dtdev

36 0,0611 6,1100

0,1181 11,8100

0,0693 6,9300

0,0970 9,7000

0,0329 3,2900 0,0001 0,0900 9,0000 0,0003 0,1353 13,5300 0,0002 0,0942 9,4200 0,0002

0,0449 4,4900

0,1153 11,5300

0,1153 11,5300

0,1068 10,6800

39 0,0342 3,4200

0,1082 10,8200

0,1324 13,2400

0,0789 7,8900

0,0315 3,1500 0,0002 0,0928 9,2800 0,0002 0,1195 11,9500 0,0006 0,0886 8,8600 0,0001

0,0342 3,4200

0,1040 10,4000

0,1167 11,6700

0,0707 7,0700

QM 9414 0,0010 0,1000

0,0012 0,1200

0,3791 37,9100

0,1942 19,4200

0,0011 0,1100 0,0001 0,3283 32,8300 0,0091 0,3933 39,3300 0,0059 0,2656 26,5600 0,0121

0,0015 0,1500 0,3849 38,4900 0,4143 41,4300 0,2491 24,9100

dissertao final

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