dissertação de mestrado - ufpe
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Dissertação de Mestrado
AVALIAÇÃO FARMACOLÓGICA DO
Ricinus communis L. NA DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE
ANTITUMORAL E EM ESTUDOS COM RADIOFÁRMACO.
Kristiana Cerqueira Mousinho
Recife, 2006
Kristiana Cerqueira Mousinho
AVALIAÇÃO FARMACOLÓGICA DO
Ricinus communis L. NA DETERMINAÇÃO DA
ATIVIDADE ANTITUMORAL E EM ESTUDOS COM
RADIOFÁRMACO.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Ciências Farmacêuticas, do
Departamento de Ciências Farmacêuticas, da
Universidade Federal de Pernambuco, como requisito
à obtenção do grau de Mestre em Ciências
Farmacêuticas na área de Produtos Naturais e
Bioativos.
Orientadora: Profª. Drª. Maria Teresa J. de A.Catanho
Co-Orientadora: Profa. Drª. Ivone Antônia de Souza
Recife, 2006
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Reitor
AMARO HENRIQUE PESSOA LINS
Vice-Reitor
GILSON EDMAR GONÇALVES E SILVA
Pró-Reitor para Assuntos de Pesquisa e Pós-Graduação
CELSO PINTO DE MELO
Diretor do Centro de Ciências da Saúde
JOSÉ THADEU PINHEIRO
Vice-Diretor do Centro de Ciências da Saúde
MÁRCIO ANTÔNIO DE ANDRADE COELHO GUEIROS
Chefe de Departamento de Ciências Farmacêuticas
JANE SHEILA HIGINO
Vice-Chefe de Departamento de Ciências Farmacêuticas
SAMUEL DANIEL DE SOUZA
Coordenador de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
MIRACY MUNIZ DE ALBUQUERQUE
Vice-Coordenador de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
PEDRO JOSÉ ROLIM NETO
Essa dissertação é dedicada aos meus pais,
Gabriel e Nádja, titia Nazaré, irmãos Karinne e
Diogo, as pequenas Lívian e Líris, pela
compreensão nos momentos em que precisei estar
ausente e por fazerem o sacrifício valerem à
pena.
AGRADECIMENTOS
• A Deus, o mestre dos mestres, por guiar todos os momentos da minha
vida, com seu infinito amor, misericórdia e bondade. A minha Virgem
Santíssima que sempre me há de valer, e que como mãe sempre me
confortou nos momentos de aflição.
• As orientadoras Profas. Teresa e Ivone, a minha gratidão, que
conhecendo as dificuldades e inexperiência dedicou total assistência em
todas as situações, para que eu pudesse superar as falhas. Agradeço pela
amabilidade, paciência e acima de tudo os ensinamentos transmitidos.
• A Profo. Mário Bernardo-Filho pela valiosa atenção e contribuição em
todo o trabalho, pela disposição e colocações pertinentes no intuito de
que este trabalho ficasse melhor.
• As Profas. Silene Carneiro e Julianna Albuquerque por toda atenção e
considerações feitas para a melhoria da dissertação.
• Aos meus pais, Gabriel e Nádja Mousinho, pelo apoio, incentivo,
compreensão e o amor dado em todos os momentos da minha vida, não
dispensando esforços para que eu realizasse esse sonho.
• Aos meus irmãos Karinne e Diogo por sempre torcerem pelo meu
sucesso. Ao meu cunhado Luciano por todo o apoio.
• As minhas pequenas e amadas sobrinhas Lívian, que é o meu xodó e a
bonequinha Líris, que chegou antes da hora só pra comemorar com a
titia este momento.
• As minhas estimadas Titia Nazaré e Vovó Nadege por todo o carinho
durante o mestrado.
• A Júnior por entender que a ausência era para o meu crescimento
profissional.
• A toda minha família pelo carinho dedicado, em especial, Paulinha, Tio
Pipico, Lucitânia, Airton, Tia Norma.
• As minhas amigas, Ângela e Sâmya, que sempre estiveram comigo.
• Ao corpo docente do Mestrado em Ciências Farmacêuticas da UFPE,
por todo o apoio recebido durante o curso.
• A Prof. Haroudo, por ter o prazer de poder estudar com uma pessoa tão
alegre e sábia.
• Aos amigos: Simey Magnata, André, Jailson, Odinilson, Thiago.
Elizângela Barbosa, pela valiosa contribuição na construção do
conhecimento e a riqueza dos experimentos; Luciana, Diogo Florêncio,
Janaína, Marigilson, André, Cínthia, Leonardo, Aldo, Júlio, Guedes,
Maria Patrícia por todo o companheirismo durante o tempo que
passamos juntos.
• Em especial a mamãe Jovita, Laurimar e Marília que são seres que
possuem luz própria, que transmitem paz, amor e acima de tudo
lealdade em tudo o que faz.
• A todos do pensionato, D. Vilma, Vitor, Madalena, Fernanda, Quinha,
Juliana, Débora, Thaís por todos os momentos maravilhosos que
passamos juntos.
• A Iguacy, Fal, Fredson e Edna por toda atenção dispensada.
Espero que não tenha esquecido de ninguém, e aproveito para agradecer mais
uma vez a Deus por estar sempre colocando anjos na minha vida, estrelas e
não cometas, desde o dia em que nasci...
Quem é você, surgindo das nuvens, trazendo esperança,
Que faz com que eu creia que o mal se irá chegando a bonança?
Quem é você, que sofre com a gente sofrida, aflita,
A dor que não é sua, mas muito lhe dói, pois é infinita?
Quem é você, sorriso tão franco, que acalma e ampara,
Que não por magia, da noite escura faz a noite mais clara?
Quem é você, que na chuva ou no sol, acode e mitiga
A dor desse irmão cuja cura em questão é a voz mais amiga?
Quem é você, humilde e atento, que herdou de Galeno o dom de curar
Que busca nos frascos da simples botica a mistura correta que há de
salvar?
Quem é você, que, nas grandes bancadas, um dia, quem sabe, irá
conceber
O tal comprimido da cura total e a doença deter,
Envolto em penumbra, modesto e avesso à fama e ao poder?
Enfim, já o vejo no embate sem tréguas vencendo tanatos
Com tantas poções, comprimidos, loções, milagrosos extratos,
Buscando a ciência e, quem sabe, um dia, talvez, transformar
A fera que somos num ser mais perfeito
Incapaz de odiar...
(A voz mais amiga - Isaac Schneider)
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS............................................................................................. III
LISTA DE TABELAS........................................................................................... VI
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS.............................................................. VII
RESUMO................................................................................................................ IX
ABSTRACT............................................................................................................ XI
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................. 1
2. REVISÃO DA LITERATURA.......................................................................... 4
3. OBJETIVOS....................................................................................................... 13
3.1 GERAL.............................................................................................................. 14
3.2 ESPECÍFICO.................................................................................................... 14
4. ARTIGO I: Avaliação da Atividade Antitumoral da Fração Não-Oleosa do
Ricinus communis L. em Sarcoma 180................................................................... 15
RESUMO................................................................................................................... 16
INTRODUÇÃO......................................................................................................... 17
METODOLOGIA...................................................................................................... 18
RESULTADOS.......................................................................................................... 20
DISCUSSÃO.............................................................................................................. 23
ABSTRACT.............................................................................................................. 24
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................... 25
5. ARTIGO II: Efeitos do extrato de Ricinus communis L. na fragilidade
osmótica, marcação de hemácias com Tecnécio-99m e morfologia das
células...................................................................................................................... 29
ABSTRACT.............................................................................................................. 30
INTRODUÇÃO........................................................................................................ 30
METODOLOGIA...................................................................................................... 31
RESULTADOS......................................................................................................... 33
DISCUSSÃO............................................................................................................. 37
RESUMO.................................................................................................................. 38
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................... 38
I
6. ARTIGO III: Biodistribuição com Tc-99m do Ricinus communis L............. 42
ABSTRACT............................................................................................................. 43
INTRODUÇÃO....................................................................................................... 43
METODOLOGIA.................................................................................................... 44
RESULTADOS........................................................................................................ 47
DISCUSSÃO............................................................................................................ 49
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................... 51
7. CONCLUSÃO.................................................................................................... 60
8. PERSPECTIVAS............................................................................................... 62
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................ 64
10. ANEXOS........................................................................................................... 71
ANEXO I................................................................................................................. 72
ANEXO II............................................................................................................... 79
II
LISTA DE FIGURAS
Revisão da Literatura Figura 1A. Ricinus communis L............................................................................... 6
1B. Sementes de Ricinus communis L.......................................................... 6
Figura 2. Esquema simplificado de um gerador de Molibdênio-99/Tecnécio-99m... 9
Artigo I Figura 1. Média dos pesos dos tumores, Sarcoma 180, para os grupos controle,
padrão e tratados (grupo 1- gr-1 e grupo 2 – gr - 2) com R. communis L nas doses de
2,0 e 3,0 mg/kg, respectivamente. Os resultados são expressos em média ± desvio
padrão com Teste- T,* p≤0,05................................................................................... 21
Figura 2. Percentagem de inibição tumoral, Sarcoma 180, para os grupos controle,
padrão e tratados (gr-1 e gr-2) com R. communis L nas doses de 2,0 e 3,0 mg/kg,
respectivamente....................................................................................................... 21
Figura 3. Comparação entre o grupo de camundongos machos com Sarcoma 180, no
controle, tratados com solução salina 0,9% e o grupo padrão, tratado com
ciclofosfamida na dose de 2,5 mg/kg...................................................................... 22
Figura 4. Comparação entre o grupo de camundongos machos com Sarcoma 180, no
controle, tratados com solução salina 0,9% e o grupo tratado com R. communis na
dose de 2,0 mg/kg................................................................................................... 22
Figura 5. Comparação entre o grupo de camundongos machos com Sarcoma 180 e no
controle tratados com solução salina 0,9% e o grupo tratado com R. communis com
dose de 3,0 mg/kg.................................................................................................... 23
Artigo II Figura 1. Curva de fragilidade osmótica das hemácias dos ratos (H) após tratamento
com Ricinus communis L. Os valores das médias são representativos de três
experimentos similares............................................................................................. 34
III
Figura 2. Efeitos do extrato de Ricinus communis na fixação de Tc-99m no plasma e
nas hemácias em água. Os resultados são expressos em médias ± desvio padrão com
Teste-T, p<0,05...................................................................................................... 34
Figura 3. Efeitos do extrato de Ricinus communis na fixação de Tc-99m na fração
insolúvel. Os resultados são expressos em médias ± desvio padrão com Teste-T,
*p<0,05................................................................................................................. 35
Figura 4. Células do controle - Esfregaço foi preparado, secado, fixado e corado.
Após isso, a morfologia das hemácias foi avaliada em microscópio óptico (x40)..... 36
Figura 5. Na presença do extrato de Ricinus communis L. (0,062 mg/mL), o
esfregaço foi preparado, secado, fixado e corado. Após isso, a morfologia das
hemácias foi avaliada em microscópio óptico (x40). A seta indica alteração na
morfologia celular................................................................................................................ 36
Figura 6. Na presença do extrato de Ricinus communis L. (0,125 mg/mL), o
esfregaço foi preparado, secado, fixado e corado. Após isso, a morfologia das
hemácias foi avaliada em microscópio óptico (x40). A seta indica alteração na
morfologia celular..................................................................................................... 37
Artigo III Figura 1. Determinação de proteínas totais, para os grupos controle e tratados (grupo
1 – gr-1 e grupo 2 – gr-2) com R. communis L nas doses de 1,0 e 3,0 mg/kg,
respectivamente. Os resultados são expressos em média ± desvio padrão com Teste-
T, *p≤0,05............................................................................................................... 56
Figura 2. Comparação entre o grupo de camundongos machos com Sarcoma 180 e o
controle, tratados com solução salina 0,9% e o grupo tratado com R. communis na
dose de 1,0 mg/kg................................................................................................... 57
Figura 3. Comparação entre o grupo de camundongos machos com Sarcoma 180 e no
controle tratados com solução salina 0,9% e o grupo tratado com R. communis com
dose de 3,0 mg/kg................................................................................................... 57
Figura 4. Frações de proteínas do extrato puro passado na coluna de cromatografia de
filtração.................................................................................................................... 58
IV
Figura 5. Frações do Tc-99m puro passado na coluna de cromatografia de filtração
em gel...................................................................................................................... 58
Figura 6. Frações do extrato marcado de R. communis com Tc-99m passado na
coluna de cromatografia de filtração....................................................................... 59
Figura 7. Frações do extrato marcado de R. communis com Tc-99m na marcação de
células sanguíneas, hemácia e plasma..................................................................... 59
V
LISTA DE TABELAS
Revisão da Literatura
Tabela 1. Sistema de geradores de radionuclídeos, adaptado de THRALL & ZIESSMAN,
2003.................................................................................................................................. 8
Artigo I Tabela 1. Efeito do R. communis na avaliação de inibição tumoral. Os resultados são
expressos em média ± desvio padrão com Teste-T, *p≤0,05........................................... 20
Artigo III Tabela 1. Efeito do R. communis na cinética da biodistribuição do Tc-99m em 25
camundongos normais Swiss sacrificados após 20 minutos da injeção do radiofármaco.
Abreviações: DP = desvio padrão; %ATI = percentual de radioatividade e * = p≤
0,05..................................................................................................................................... 55
Tabela 2. Efeito do R. communis na cinética da biodistribuição do Tc-99m em 25
camundongos com indução tumoral Swiss sacrificados após 20 minutos da injeção do
radiofármaco. Abreviações: DP = desvio padrão; %ATI = percentual de radioatividade e *
= p≤ 0,05........................................................................................................................... 56
VI
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
%ATI Percentagem de radioatividade ou da atividade total injetada
%H Percentual de hemólises
β Beta
C Células
cpm Contagem por minuto
DP Desvio Padrão
FDA Food and Drug Administration
FI Fração Insolúvel
FIP Fração Insolúvel do Plasma
FS Fração Solúvel
FSP Fração Solúvel do Plasma
g Grama
H Hemácias
ICLAS Normas Internacionais do Conselho do Laboratório de Animais
Experimentais
IF Insoluble Fraction
IP Intraperitoneal
keV kiloeletronvolt
kg kilograma 99m Tc Isótopo metaestável do elemento tecnécio de número de massa 99 99Mo Isótopo do elemento molibdênio de número de massa 99
Na99mTcO4 Pertecnetato de sódio
MBq Mega Bequerel
µL Microlitro
µCi Micro Curie
mg Miligrama
mL Mililitro
mm Milimetro
NaCl 0,9% Cloreto de Sódio 0,9% ou solução fisiológica (salina)
VII
nm nanômetro
DO Densidade Óptica
P Plasma
RBC Red Blood Cells
rpm Rotação por minuto
SF Soluble Fraction
SnCl2 cloreto estanoso
TCA 5% Ácido Tricloroacético 5%
TcO-4 Íon pertecnetato
v/v Volume por volume
VIII
RESUMO Ricinus communis L. é popularmente conhecida como carrapateira, mamona e pertence à família das Euforbiáceas. Possui três sementes em cada fruto, das quais é extraído o óleo de rícino. A fração não-oleosa, que é resultante da expressão do óleo, contém proteína tóxica (ricina) que é utilizada como adubo orgânico. Neste estudo foi avaliada a influência do Ricinus communis na atividade antitumoral, fragilidade osmótica, marcação (in vitro) de elementos sanguíneos com pertecnetato de sódio (Na99mTcO4) e morfologia celular; na biodistribuição com Tc-99m em animais sadios e com indução tumoral e análise de proteínas totais; como também a marcação e controle radioquímico do extrato com Tc-99m. Após 48 horas do implante do Sarcoma 180, os camundongos machos foram tratados com o extrato durante sete dias, sendo sacrificados após este período e os tumores dissecados e pesados. Na fragilidade osmótica, amostras de sangue de ratos Wistar foram incubadas com o extrato de R. communis e com soluções de NaCl (0,4; 0,7; 0,9%). Na marcação das células vermelhas do sangue (in vitro), amostras de sangue foram obtidas de ratos Wistar e incubadas com diferentes concentrações de R. communis, para o controle foi utilizado NaCl 0,9% e adicionados o cloreto estanoso (SnCl2) e o Tc-99m. As frações de plasma (P) e de hemácias (H) foram separadas e, também, precipitadas com ácido tricloroacético a 5% obtendo as frações solúvel (FS) e insolúvel (FI), sendo analisado também a morfologia das células. A percentagem de radioatividade (%ATI) de cada uma das frações foi calculada. Na biodistribuição foi realizado o implante tumoral nos dois grupos tratados com R. communis e o controle com solução salina 0,9%, injetados por via IP, em dose única por 7 dias, os animais foram sacrificados no 8° dia, 20 minutos após a administração do Tc-99m. Os órgãos foram isolados e a percentagem de radioatividade (%ATI) de cada órgão foi calculada; do sangue foi retirado o soro dos animais e feito a avaliação das proteínas totais. O extrato foi marcado com pertecnetato de sódio e cloreto estanoso, avaliando o controle radioquímico. O extrato protéico de R. communis apresentou resultados satisfatórios na inibição tumoral com 67% e 72% de resposta quando comparado com o controle. Os resultados de fragilidade osmótica indicam que houve aumento na taxa de hemólise na concentração de 0,125 mg/mL e que não houve ocorrência de alterações na marcação de células vermelhas do sangue nas concentrações de 6,25% para 25% do extrato quando comparado com o % do controle, entretanto, foi observado um decaimento de 49,69% na concentração de 100%, verificando que nestas concentrações ocorrem alterações morfológicas nas células do sangue e que a radiação nas frações insolúveis promoveu a redução da radioatividade. Na biodistribuição houve redução na captação do Tc-99m na maioria dos órgãos analisados, sendo significativo nos rins grupo 1, músculo e cérebro; e aumento no estômago (G2) e nos rins (G3); em animais tumorais, essa redução foi significativa, principalmente no coração, pulmão, rins e tumor, apresentando uma concentração de proteínas totais nos animais tumorais de 34,62 e 34% com relação ao % controle. Quanto ao controle radioquímico através da cromatografia de filtração observou-se que o extrato marcado com Tc-99m apresentou duas frações com 130.007 e 494.592 cpm, e que estas frações foram analisadas pela marcação das células sanguíneas, com % de ATI de 61,88 e 41,32 % nas frações 1 e 2, respectivamente. Portanto conclui-se que o extrato de R. communis possui grande potencial antitumoral, alterando a captação do Tc-99m nos testes in vitro e in vivo, competindo com o Tc-99m no sítios de ligação das
IX
hemácias devido à capacidade de oxidação do íon estanoso, pela competição nos sítios de ligação do íon pertecnetato, modificando assim as estruturas celulares. Palavras – Chave: Ricinus communis L., antitumoral, fragilidade osmótica, marcação de hemácias, morfologia celular, biodistribuição.
X
ABSTRACT Ricinus communis L. is popularly known as carrapateira, mamona and belongs to the Euforbiacea family. It has three seeds, where the ricin oil is extracted. The non-oil fraction, which is the result of the oil extraction, contains a toxic protein (ricin) which is used as organic manure. In this study, it was evaluated the influence of Ricinus communis in the antitumour activity, osmotic fragility, labeling (in vitro) of blood elements with sodium pertechnetate (Na99mTcO4) and cells morphology; in the biodistribution with Tc-99m in healthy animals and with tumours and analysis of total protein; and also the labeling and radiochemical control of the extract with Tc-99m. After 48 hours implanting Sarcoma 180 in the male mices it was realized the treatment with the extract during seven days, being sacrificed after this time, and the tumours were dissected and weighed. In the osmotic fragility, blood samples from Wistar rats were incubated with the R. communis extract and solutions of NaCl (0.4; 0.7; 0.9%). In the labeling of red blood cells (in vitro), blood samples were obtained from Wistar rats and incubated with different concentrations with of R. communis, for control group was used NaCl 0.9% and added stannous chloride (SnCl2) and Tc-99m. The plasma fractions (P) and the cells (C) were separated and, also, precipitated with trichloroacetic acid at 5% obtaining the soluble (SF) and insoluble fractions (IF), being analyzed also the cells morphology. The radioactivity rate (%ATI) of each fraction was calculated. In the biodistribution was realized the tumour implant in both groups treated with R. communis and the control group with salt solution 0.9% administrated IP, in single dose for 7 days, the animals were sacrificed in the 8th day, 20 minutes after the administration of Tc-99m. The organs were isolated and the radioactivity rate (%ATI) of each organ was calculated; from the blood was extracted the animals serum and realized the evaluation of total proteins. The extract was labeled with sodium pertechnetate and stannous chloride, evaluating the radiochemical control. The proteic extract of R. communis showed satisfactory results in the tumor inhibition with 67% and 72% of success comparing with the control. The osmotic fragility results indicate that there was an increase in the hemolysis rate in the concentration of 0.125 mg/mL and there weren’t alterations in the labeling of red blood cells in the concentrations of 6.25% to 25% of the extract when compared with the rate of the control group, however, it was observed a decrease of 49.69% in the concentration of 100%, verifying that in these concentrations occur morphological alterations in the red blood cells and the radiation in the insoluble fractions promoted a reduction of the radioactivity. In the biodistribution, there was a decrease in the uptake of Tc-99m in most of the analyzed organs, being significant in the kidney of group 1, muscle and brain; and increased in the stomach (G2) and in the kidneys (G3); in tumour animals, this reduction was significant, mainly in the heart, lung, kidney and tumour, presenting a concentration of total proteins in the tumour animals of 34.62 and 34% in relative to the rate of the control group. Concerning the radiochemical control through the filtration cromatograph, it was observed that the extract labeled with Tc-99m presented two fractions with 130.007 and 494.592 cpm, and these fractions were analyzed by the labeling of blood cells, with the rate of ATI of 61.88 and 41.32% in the fractions 1 and 2, respectively. So, it’s concluded that the extract of R. communis has great antitumour potential, changing the uptake of Tc-99m in the in vitro and in vivo, competing with Tc-99m in the binding sites of the blood cells of pertechnetate ion, modifying this way the cells structure.
XI
Keywords: Ricinus communis L., antitumour, osmotic fragility, labeling of red blood cells, morphology cells, biodistribution.
XII
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
1. INTRODUÇÃO
1
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
1. INTRODUÇÃO
Desde a antiguidade, o ser humano utilizava as espécies vegetais para tratar as
enfermidades (ELDIN & DUNFORD, 2001). Dentre os medicamentos comercializados no
mundo cerca de 40% tiveram origem direta ou indireta de fontes naturais, sendo 78% das drogas
antibacterianas e 60% dos antitumorais (DE LA CRUZ, 2005).
A alta capacidade de diagnóstico envolvendo a medicina nuclear deve-se a grande
diversidade dos radiofármacos disponíveis no mercado (THALL & ZIESSMAN, 2003).
Desde os últimos anos, a oncologia tem sido uma área representativa para a medicina
nuclear, transformando-se em área de maior crescimento tanto para métodos de diagnósticos
(imagem tumoral) quanto para tratamento. O tecnécio-99m é um radionuclídeo muito importante
para a imagem tumoral, aprovado pela Food and Drug Administration (FDA), além de possuir
ótimas características físicas, como meia-vida de 6 horas, energia gama de 140 keV, impacto
ambiental desprezível e baixo risco radiológico para o paciente (BRAGA et al., 2000; THALL &
ZIESSMAN, 2003 HOLANDA, 2004; SOUZA et al., 2005).
Muitos estudos têm analisado os efeitos de drogas naturais ou sintéticas em possíveis
alterações na biodistribuição dos radiofármacos, bem como no processo de marcação das células
sanguíneas com Tecnécio-99m utilizando técnicas in vivo e in vitro (GOMES et al., 1998; DIRÉ
et al., 2001; CAPRILES et al., 2002).
O Ricinus communis L. possui características de alta toxicidade tanto para animais como
para células em crescimento (KOGA et al.,1979) e é largamente utilizada na indústria como
lubrificante (SOUZA et al., 1994; OLSNES, 2001; OLSNES, 2004).
Os produtos naturais e sintéticos vêm sendo muito estudados na medicina nuclear nos
últimos anos, principalmente no Brasil, pela sua grande biodiversidade, podendo interferir nos
testes experimentais alterando o comportamento farmacocinético e farmacodinâmico do
radiofármaco, modificando a resposta farmacológica, como relatado nos estudos de Maytenus
ilicifolia, Coffea beans, Thuya occidentallis, Ginkgo biloba, Tabacco, Paullinia cupana
(OLIVEIRA et al., 1997; GUTFILEN et al., 1998; OLIVEIRA et al., 2000; MORENO et al.,
2001; FALCÃO, 2003; OLIVEIRA et al., 2003; SANTOS-FILHO et al., 2004).
2
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
Pujatti et al.(2005) analisaram o efeito da preparação do veneno de Crotalus marcado com
Tc-99m na marcação de hemácias e constataram que houve uma atividade hemolítica indireta
quando incubados em meio contendo uma fonte exógena de lecitina.
Capriles et al. (2002) estudaram o efeito do extrato de Solanum melogena (berinjela) na
biodistribuição com Na99mTcO4, observando aumento da captação do radiofármaco no fígado dos
animais tratados com o extrato, sendo causado provavelmente pelos glicocorticóides existentes
na planta.
Assim, este trabalho visa avaliar os efeitos do extrato hidroalcoólico de Ricinus communis
em vários modelos experimentais.
3
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
2. REVISÃO DA LITERATURA
4
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
2. Revisão da Literatura
2.1. Ricinus communis (mamona, carrapateira)
Ricinus communis Linn. pertence a família das Euforbiáceas. A família Euphorbiaceae
compreende uma das maiores dicotiledônias, cerca de 290 gêneros e aproximadamente 7.500
espécies, distribuídas principalmente nas regiões tropicais (JOLY, 1975). É popularmente
conhecida como carrapateira, mamona, palma-cristo (Figura 1a); é um arbusto silvestre grande,
de proporções diversas (geralmente 2-3 m), vegeta em quase todos os países do mundo sendo
aclimatado facilmente no Brasil, principalmente no Norte-nordeste. É originária provavelmente
da África intertropical, possui caule ereto e ramos grossos, lisos; as folhas são alternadas,
grandes e serradas; flores monóicas e dispostas em grupo, numerosas, que desabrocham no
verão. Os frutos possuem cápsulas de 10-12 mm de diâmetro com elevações espiniformes e
arredondadas, as sementes são em número de três, com coloração acinzentada e brilhante, lisas,
de aspecto parecido a um carrapato, da qual é extraído o óleo de rícino (Figura 1b). As sementes
fornecem até 50% de óleo com densidade de 0,961 a 0,966, altamente tóxico, usado como
combustível, fixador de cores e lubrificante para as máquinas, nos motores de alta rotação,
especialmente aéreos, por sua resistência as baixas temperaturas da alta atmosfera. A torta ou a
fração protéica é resultante da extração do óleo e utilizada como fertilizante e inseticida. Na
medicina popular, o óleo de rícino constitui um purgativo comumente usado que contém dois
componentes nocivos, a ricina que é um óleo composto de triglicerídeo do ácido ricinoléico, é
hidrolizado em glicerol no intestino delgado pela ação das lipases, agindo primariamente no
intestino delgado, onde estimula a secreção de água e eletrólitos, aumentando a motilidade
intestinal e podendo destruir em extensão o trato intestinal (HARDMAN & LIMBIRD, 2003;
OLSNES, 2004); é também usado como vermífugo e queimaduras. O decocto das folhas é
recomendado em banhos para o tratamento de hemorróidas. A raiz é empregada no tratamento de
moléstias dos rins (FEIJÃO, 1963; JOLY, 1975; BRAGA, 1976; PIO CORRÊA, 1984; SOUZA
et al., 1994; ALZUGARAY, 1996; CRUZ, 1997).
5
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
Fig 1-A Ricinus communis L. Fig 1-B Sementes de R. communis L.
2.2. Antitumorais O câncer é uma doença em que existe uma multiplicação descontrolada de células anormais
e pode disseminar no organismo (RANG et al., 2000).
Atualmente as terapias genéticas, manipulação do sistema imune, inibição da angiogênese e
estimulação dos elementos hematopóieticos têm direcionado as pesquisas clínicas em cada uma
dessas áreas (HARDMAN & LIMBIRD, 2003). Há alguns anos, a descoberta de novos fármacos
derivados de produtos naturais, como os alcalóides da vinca, os taxóides, agentes semi-sintéticos,
proporcionou novos campos de investigação (HARDMAN & LIMBIRD, 2003). Estudos de
repercussão mundial mostram que o Ricinus communis possui atividade antitumoral. Segundo
Olsnes (2004) a ricina possui propriedades anticancerígenas quando testada em ratos frente ao
carcinoma de Ehrlich. Souza et al. (1994) investigou a fração protéica do R. communis e obteve
como resultado a inibição do crescimento tumoral de carcinosarcoma de Walker 256 em
camundongos.
A medicina nuclear vem investindo em pesquisas para diagnóstico e principalmente no
tratamento do câncer. Alguns tratamentos já possuem êxito, como o radionuclídeo iodo131 (131I)
para tumores específicos e gálio-67, Tálio-201, 99mTc-sestamibi, Tc-99m, anticorpos
monoclonais (THALL & ZIESSMAN, 2003).
2.3 Interação dos Produtos Naturais com Radiofármacos As drogas sintéticas e naturais podem interagir com o radionuclídeo e promover imagens
modificadas, alterando a biodisponibilidade dos radiobiocomplexos (BERNARDO-FILHO,
2005).
6
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
Estudos com plantas medicinais como Thuya occidentallis, Maytenus ilicifolia, Paullinia
cupana, Mentha crispa, Coffee beans, descrevem que essas plantas interferem na marcação de
células sanguíneas (OLIVEIRA et al., 1997; OLIVEIRA et al., 2000; OLIVEIRA et al., 2002;
OLIVEIRA, 2003; SANTOS-FILHO, 2004). A literatura descreve ainda que a toxina purificada
do R. communis foi testada no sangue e observou-se que ela induzia aglutinação dos eritrócitos e
precipitação das proteínas séricas (OLSNES, 2004).
2.4. Radiofármacos
O radiofármaco é um componente radioativo usado para diagnóstico e terapêutica (SAHA,
1998). É constituído de um radionuclídeo e fármaco, sendo detectado pelas características dos
componentes, que permite a detecção externa de uma porção biologicamente ativa e responsável
pela biodistribuição (THALL & ZIESSMAN, 2003).
Inicialmente, a escolha de um radiofármaco se deve as propriedades adequadas para os
procedimentos, como ser facilmente disponível no serviço de medicina nuclear, vida média
efetivamente curta evitando uma exposição maior ao paciente que a necessária; seletividade pelo
órgão desejado, devendo ser baixa a captação nos tecidos vizinhos; possuir uma inércia
metabólica, dosimetria e de fácil preparação (SAHA, 1998; SORIANO et al., 2002; THALL &
ZIESSMAN, 2003).
Os radiofármacos marcados com tecnécio-99m são mais utilizados para fins de diagnóstico
pelas suas excelentes características: período de semi-desintegração de 6 horas, emissão de
radiação gama com 140 keV de alto rendimento por imagem, impacto ambiental desprezível
(SORIANO et al., 2002; THALL & ZIESSMAN, 2003; HOLANDA, 2004; SOUZA et al.,
2005).
2.5. Radionuclídeo
Alguns átomos são instáveis sofrendo posteriormente um decaimento radioativo, devido as
suas propriedades físicas. O resultado deste processo é denominado de radionuclídeo e está
sempre num estado de energia menor que o radioisótopo, podendo ser obtidos a partir de um
subproduto de fissão nuclear (reator), por intermédio do bombardeamento de núcleos com
7
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
nêutrons, geradores, o uso de aceleradores de partículas-ciclotron (OWUWANNE et al., 1995;
THALL & ZIESSMAN, 2003).
Os geradores de radionuclídeos apresentam vantagens por sua praticidade de fácil
transporte e manuseio, podendo ser encontrado em clínicas e hospitais (SAHA, 1998).
Vários sistemas de geradores foram aperfeiçoados nos últimos anos (Tabela 1), sendo o
gerador de Molibdênio-99/Tecnécio-99m (Figura 2) o mais importante para a prática clínica.
Tabela 1-Sistema de geradores de radionuclídeos, adaptado de THRALL & ZIESSMAN, 2003.
Sistema de geradores de radionuclídeos, com meia-vida do pai e do filho
Radionuclídeo (pai) Meia-vida Radionuclídeo (filho) Meia-vida
Molibdênio-99 66 horas Tecnécio-99m 6 horas
Rubídio-81 4,5 horas Criptônio-81m 13 segundos
Estrôncio-82 25 dias Rubídio-82 1,3 horas
Estanho-113 115 dias Índio-113m 1,7 horas
Telúrio-132 3,2 dias Iodo-132 2,3 horas
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Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
Figura 2- Esquema simplificado de um gerador de Molibdênio-99/Tecnécio-99m.
O molibdênio-99 (99Mo) pode ser obtido em um reator por fissão nuclear do 235U, é eluído
em estruturas de alumina (Al2O3), acondicionado em coluna de vidro ou plástico; sendo a coluna
protegida por chumbo (SAHA, 1998).
2.6. Tecnécio-99m (99mTc)
O tecnécio é um metal de transição da tabela periódica e possui 7 elétrons na última
camada. Na perda dos elétrons o tecnécio passa para o estado oxidado +7, onde se obtém o íon
pertecnetato (TcO-4) (OLIVEIRA-JÚNIOR, 2003). É um dos radioisótopos mais utilizados na
medicina nuclear, com cerca de 85% das rotinas de procedimento de radiodiagnóstico, por suas
características que constitui em meia-vida curta de 6 horas, fácil disponibilidade em geradores de
Molibdênio-99/Tecnécio-99m (99Mo/99mTc), baixa dose de radiação para o paciente comparado
com os outros radionuclídeos; pequena energia gama de 140 keV, com rendimento de 90%,
facilidade de se ligar às hemácias sanguíneas, marcação de espécies biológicas e estruturas
celulares, baixo custo e impacto ambiental desprezível (HLADIK III et al., 1987; BERNARDO-
FILHO et al., 1992; EARLY & SODEE, 1995; BRITO et al. 1998; SAHA, 1998; SORIANO et
al., 2002; ; THALL & ZIESSMAN, 2003; HOLANDA, 2004; SOUZA et al., 2005).
O tecnécio na sua forma quimicamente ativa de pertecnetato de sódio (99mTcO4Na) na
forma +7 precisa sofrer pequena redução com auxílio de um agente redutor, o cloreto estanoso
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Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
(SnCl2), por não se ligar a nenhuma estrutura celular ou molecular através de ligação direta
(SRIVASTAVA, 1987; BERNARDO-FILHO et al., 1992; SAHA, 1998).
2.7. Marcação de Hemácias e Proteínas Plasmáticas com 99mTc
As hemácias têm formato discóide, flexível e fazem o transporte de oxigênio para os
tecidos do corpo. Origina-se das células-tronco da medula óssea durante o processo de maturação
e perdem os núcleos antes de caírem na circulação. A composição da membrana que reveste a
hemácia é de 49% de proteínas, 44% de lipídeos e 7% de carboidratos, é semipermeável,
permitindo a passagem de água e eletrólitos (SMITH, 1985; COMARCK, 1991; LORENZI &
WENDEL NETO, 2005).
A marcação de células sangüíneas envolve um pré-tratamento do tecnécio (pertecnetato de
sódio) com o cloreto estanoso (SnCl2), que é o agente redutor mais utilizado nos sistemas
biológicos, principalmente para a redução do pertecnetato de sódio (BRAGA et al., 2000;
OLIVEIRA-JÚNIOR, 2003), no qual é reduzido se ligando intracelularmente na cadeia beta da
hemoglobina (SRIVASTAVA, 1987). A marcação de hemácias é favorecida por vários fatores:
por constituírem os elementos sanguíneos em maior quantidade; são estruturas que pode ser
facilmente manipuladas, tanto química quanto fisicamente sem sofrerem alterações
consideráveis; são mais numerosas; sobrepõem-se às outras células na marcação com
radionuclídeos por intermediarem mecanismos de transporte celulares e pela hemoglobina ser o
constituinte principal, com sítio ativo de ligações metálicas (BRAGA et al., 2000).
O pertecnetato de sódio liga-se 70-80% das proteínas plasmáticas quando administrado por
via endovenosa. A meia-vida plasmática é de 30 minutos que corresponde a 30% da dose
administrada, com eliminação nas primeiras 24 horas (HLADIK III; SAHA; STUDY, 1987). O
íon pertecnetato no compartimento interno da hemácia é reduzido pelo cloreto estanoso, ao se
ligar à hemoglobina, utilizando o sistema de troca de ânions que é executado pela banda 3
proteína integral, abundante na membrana das hemácias, e é constituída por dupla cadeia
polipeptídica, com domínio extracelular, intracelular e transmembrana. O transporte do íon
estanoso, essencial para a marcação do 99mTc dentro da molécula de hemoglobina, utiliza os
canais de cálcio ou semelhantes a este (CALLAHAN & RABITO, 1990; SAMPSON, 1996;
DANTAS et al., 2005).
10
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
Bernardo-Filho et al. (1992) observaram que drogas bloqueadoras dos canais de cálcio
(nifedipina) exercem influência na passagem do cloreto estanoso para o interior da célula,
competindo pelo mesmo caminho para a entrada na hemácia, através dos canais de cálcio.
Nas proteínas plasmáticas, compostas principalmente por fibrinogênio, globulinas e
albumina, representando quase 60% das proteínas. A ligação que ocorre entre o radiofármaco e
as proteínas plasmáticas poderá influenciar na distribuição no organismo, na taxa de difusão para
o compartimento vascular e na eliminação da substância (RIPOLLHAMER et al., 1995).
Para quantificar a radioatividade ligada às células sangüíneas e as proteínas plasmáticas,
deve-se fazer o mesmo tratamento com o agente precipitante (ácido tricloroacético) é
responsável pela separação das frações (BERNARDO-FILHO et al., 1996).
A ligação dos radiofármacos nas células sangüíneas e órgãos alvo podem ser alteradas pela
presença de drogas naturais ou sintéticas (HESSEWOOD & LEUNG, 1994; EARLY & SODEC,
1995; SANTOS et al., 1995).
2.8. Biodistribuição
O estudo da biodistribuição é primordial para estabelecer a eficácia do uso do
radiofármaco. Este estudo inclui a absorção, distribuição, metabolismo e excreção da substância
(SORIANO et al., 2002).
A biodistribuição normal pode ser modificada por interação medicamentosa, que poderá
alterar a interpretação das imagens pelos profissionais, podendo acarretar em diagnóstico errôneo
(SAHA, 1998).
Uma droga terapêutica pode modificar a natureza do fármaco, o meio bioquímico ao qual o
radiofármaco está exposto, a capacidade do radiofármaco de se ligar aos elementos sangüíneos e
até os alvos preferenciais de ligação dos radiofármacos (HLADIK III et al., 1987;
SRIVASTAVA, 1987; SAMPSON, 1996). Encontra-se na literatura vários relatos de interações
de fármacos na biodistribuição, como a vincristina (BRITTO et al., 1998).
Atualmente a medicina nuclear vem investindo em pesquisas em torno do tratamento,
principalmente do câncer. Estudos com marcadores de anticorpos monoclonais; o uso do iodo-
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Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
131 para câncer de tireóide e outros radiofármacos que podem ser naturais ou sintéticos vêm
incentivando pesquisadores em todo o mundo a descobrir substâncias promissoras, que possam
ser marcadas pelos radionuclídeos e com atuação no órgão alvo, melhorando a resposta
terapêutica e diminuindo a ocorrência de toxicidade para o paciente.
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Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
3. OBJETIVOS
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Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
3. OBJETIVOS
3.1. Geral Este trabalho visa avaliar a influência do extrato protéico de Ricinus communis L. na
atividade antitumoral frente ao Sarcoma 180, fragilidade osmótica e analisar a marcação dos
elementos sanguíneos com tecnécio-99m na presença do extrato, verificando sua ação na
morfologia das células. Como também, verificar a biodistribuição do Tc-99m na presença de
extrato in vivo em camundongos sadios e com indução tumoral, analisando a concentração das
proteínas totais e promover a marcação do extrato com Tc-99m, avaliar a marcação através do
controle radioquímico.
3.2. Específicos
• Isolar o extrato protéico do Ricinus communis L. através da extração hidroalcoólica e o
óleo de rícinus retirado com acetona e concentrado a vácuo;
• Avaliar a atividade antitumoral, frente ao Sarcoma 180 em camundongos;
• Verificar o efeito do extrato protéico do Ricinus communis na fragilidade osmótica;
• Promover a marcação dos elementos sanguíneos com Tc-99m;
• Verificar a interação do extrato na morfologia das hemácias;
• In vivo, avaliar a influência do Ricinus communis na biodistribuição marcados com Tc-
99m em camundongos normais e com indução tumoral (Sarcoma 180);
• Determinar a concentração de Proteínas Totais em animais tumorais na presença do
extrato;
• Realizar o controle radioquímico do extrato protéico de Ricinus communis, promovendo
a marcação do extrato com Tc-99m.
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Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
4. ARTIGO I Artigo a ser submetido à Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas
15
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences Vol. 00, n. 0, 00/00., 0000 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DA FRAÇÃO NÃO-
OLEOSA DO RICINUS COMMUNIS L. EM SARCOMA 180
Kristiana Cerqueira Mousinho1*, Elisangela Christhianne Barbosa da Silva1, Aldo César Passilongo da
Silva1, Laurimar Thomé da Rocha1, Jovita Maria de Farias Braga 1, Ivone Antônia de Souza2, Maria
Teresa Jansem de Almeida Catanho3. 1Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal Pernambuco – UFPE; 2Departamento
de Antibióticos – UFPE; 3Departamento de Biofísica e Radiobiologia – UFPE.
Resumo
Ricinus communis L., é popularmente conhecida como carrapateira, mamona, pertence à família das
Euforbiáceas. Possui folhas grandes e longo-pecioladas, seu fruto apresenta cápsula com elevações
espiniformes, com sementes em número de três, das quais é extraído o óleo de rícino. É originária
provavelmente da África, mas encontrada também no Brasil, sobretudo no Norte-Nordeste. Este estudo
visa avaliar a atividade antitumoral da fração protéica do extrato de R. communis no Sarcoma 180. Após
48 horas do implante da massa tumoral os camundongos machos albinos Swiss (mus musculus), foram
tratados com solução salina 0,9% para o controle, 2,5 mg/kg de ciclofosfamida para o padrão e extrato
hidroetanólico de R. communis (2,0 mg/kg e 3,0 mg/kg) via intraperitonial, durante 7 dias, sendo
sacrificados os animais no 8° dia e os tumores dissecados e pesados. Os resultados indicaram que o
extrato utilizado apresentou resposta antitumoral expressiva (67% e 72%) em comparação com os grupos
padrão (62%) e controle, comprovando a atividade antitumoral da substância e perfazendo-se a idéia de
mais uma substância promissora para o tratamento do câncer.
Unitermos: Ricinus communis L., tumor maligno, atividade antineoplásica, Sarcoma 180. *
Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas
* Autor para correspondência
16
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences Vol. 00, n. 0, 00/00., 0000
INTRODUÇÃO
Ricinus communis L., é popularmente conhecida como carrapateira, mamona, palma de
Cristo, pertence à família das Euforbiáceas, originária provavelmente da África, mas encontrada
em quase todas as partes do mundo, também no Brasil, sobretudo no Norte-Nordeste, São Paulo,
Minas Gerais e Rio de Janeiro (CORRÊA, 1984; ALZUGARAY, 1996; FETROV & ÁVILA,
2000; OLSNES, 2004). Possui folhas grandes e longo-pecioladas, seu fruto apresenta cápsula
com elevações espiniformes, com sementes em número de três, das quais é extraído o óleo de
rícino (FEIJÃO, 1963; CORRÊA, 1984). A torta ou fração não oleosa, que é resultante da
expressão do óleo, contém proteína tóxica (ricina) que é muito utilizada como adubo orgânico,
contendo 50% de nitrogênio, 1% de fósforo e 1% de potássio (SOUZA et al., 1994). É uma
planta que possui alta toxicidade tanto para animais como para células em crescimento (KOGA
et al., 1979). Além de sua comprovada ação antineoplásica in vitro e in vivo através de estudos
de repercussão mundial, o Ricinus communis é utilizado também como laxante, pois aumenta o
peristaltismo ao estimular o plexo nervoso intramural da musculatura do intestino delgado
(FEIJÃO, 1963; FODSTAD et al., 1979; SOUZA et al., 1994; FETROV & ÁVILA, 2000;
ZHAN & ZHOU, 2003).
O uso dos produtos naturais vem aumentando cada vez mais no mundo desde últimas
décadas, além do que, são importantes fontes de pesquisa para os farmacêuticos (STEPP, 2004;
SOUZA et al., 2005). A ricina é uma proteína muito tóxica que compromete a síntese de DNA e
o metabolismo das proteínas, resultando em morte celular (FETROV & ÁVILA, 2000).
Nos últimos anos a descoberta de produtos naturais como agentes anti-proliferativos tem
proporcionado novos campos de investigação nesta área. A Vincristina é um exemplo de
substância antineoplásica derivada de planta como a Vinca rosea, amplamente utilizada no
tratamento quimioterápico, que atua em protocolos para tumores como os linfomas, leucemias,
mama, ovário. Outros derivados de compostos naturais também fazem parte dos tratamentos
convencionais, como os taxanos, antibióticos, enzimas, epipodofilotoxinas, campotecinas e
modificadores da resposta biológica (RANG et al., 2000; HARDMAN & LIMBIRD, 2003,
ALMEIDA, 2004).
17
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences Vol. 00, n. 0, 00/00., 0000
Este estudo tem como objetivo avaliar a atividade antitumoral da fração protéica do Ricinus
communis L. em Sarcoma 180.
MATERIAIS E MÉTODOS
Animais
Os camundongos machos albinos Swiss (mus musculus), com 45 dias de nascidos,
pesando entre 25-35 g, foram adquiridos no Biotério Aggeu Magalhães (Fiocruz), Brasil. Os
animais foram abrigados em gaiolas de plástico individual com estante e ventilação interna,
temperatura e umidade controlada, ciclo claro-escuro de 12 horas, de acordo com as normas
internacionais do Conselho do Laboratório de Animais Experimentais (ICLAS). O ensaio foi
aprovado pelo Comitê de Ética Experimental da Universidade Federal de Pernambuco de acordo
com o processo número 011553/2005.
Coleta do vegetal e extração
Ricinus communis L. foi coletado no bairro de Pau Amarelo, cidade de Paulista em
Pernambuco, Brasil, identificado por Dra. Marlene Barbosa e a espécie registrada no Herbário
Geraldo Mariz, com número 52.116, da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE, Brasil). O
material botânico foi obtido da trituração e extraído em solução hidroetanólica 8:2 (v/v), e para a
retirada do óleo de rícino foi acrescentado acetona e concentrado a vácuo, obtendo a fração
protéica. O extrato foi preparado e utilizado no período de 12 meses.
Parte experimental
Os ensaios de atividade antitumoral foram realizados de acordo com a metodologia
descrita por Stock et al. (1965). Foram utilizados camundongos, machos, albinos Swiss (mus
musculus) com implantação do tumor Sarcoma 180.
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Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences Vol. 00, n. 0, 00/00., 0000
Implante da Massa Tumoral
Para a realização da atividade antitumoral do Ricinus communis foi utilizado 5
camundongos machos por grupo, totalizando 4 grupos. O implante da massa tumoral foi
realizado através do transplante do Sarcoma 180 de um animal doador, após remoção do material
que foi fragmentado e colocado em solução antibiótica (80 mg de Garamicina). Um fragmento
tumoral com cerca de 3mm de diâmetro, equivalente a massa, foi introduzido por via subcutânea,
na região axilar do animal receptor, segundo a técnica descrita por Stock et al.(1965) e
Funayama e Komaiyama (1993).
Tratamento
A quimioterapia experimental teve início 48 horas após o implante dos tumores. O
extrato hidroalcoólico (8:2 v/v) de Ricinus communis foi diluído em solução salina 0,9%, Tween
80 a 0,2% (Falcão, 2003) e administrada por via intraperitoneal durante 7 dias em doses diárias
de: 2,0 e 3,0 mg/kg para o grupo tratado. Para o grupo controle os animais foram tratados com
solução salina 0,9% e 2,5 mg/kg para a droga com atividade antitumoral conhecida,
ciclofosfamida, utilizada como padrão positivo. Os animais foram sacrificados através de
deslocamento cervical, no oitavo dia e os tumores foram retirados, dissecados, pesados e em
seguida calculada a diferença entre os grupos tratados e controle para o índice de inibição
tumoral usando a fórmula (Machon et al., 1981):
TWI%= C-T x 100
C
Onde:
TWI%= % de inibição tumoral
C= Média dos pesos dos tumores dos animais do grupo controle
T= Média dos pesos dos tumores dos animais do grupo teste.
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Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences Vol. 00, n. 0, 00/00., 0000 Análise estatística
Para o teste estatístico foi utilizado T-Student, média ± desvio padrão, com p≤0,05.
RESULTADOS
A Tabela 1 apresenta a taxa de inibição tumoral do Sarcoma 180, sendo observado o
valor dos pesos tumorais, a percentagem de inibição tumoral, onde foi verificado que a
substância padrão (ciclofosfamida) e as concentrações do extrato de R. communis de 2,0 e 3,0
mg/kg tiveram pesos proporcionais quando comparado com o grupo controle. Através dos
cálculos de percentagem de inibição tumoral foi verificado que o extrato de R. communis nos
valores de 67% e 72% respectivamente, em comparação com o padrão (62%) teve resultado
expressivo frente a atividade inibitória sobre o crescimento tumoral.
TABELA 1- Efeito do R. communis na avaliação de inibição tumoral. Os resultados são expressos em
média ± desvio padrão com Teste-T, *p≤0,05.
Grupos Média de Peso do
Tumor (g)
Desvio Padrão
(±)
Teste T-Student % de Inibição
Tumoral
Controle 2,60 0,38
Padrão 2,5
mg/Kg
0,99 0,09 0,0038* 62%
2,0 mg/kg 0,87 0,24 0,0010* 67%
3,0 mg/kg 0,73 0,29 0,0006* 72%
Por outro lado, foi observado que a figura 1 apresenta a média de pesos referentes aos
tumores dos grupos tratados com o R. communis nas doses de 2,0 e 3,0 mg/kg, com 0,87g e 0,73
g respectivamente e o grupo controle apresentou peso tumoral de 2,60g, enquanto que o padrão
tratado com ciclofosfamida (2,5 mg/kg), o peso tumoral foi de 0,99g.
20
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences Vol. 00, n. 0, 00/00., 0000
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
controle padrão gr1 gr2
méd
ia d
os p
esos
dos
tum
ores
(g)
controlepadrãogr1gr2
*
* * *
FIGURA 1-Média dos pesos dos tumores, Sarcoma 180, para os
grupos controle, padrão e tratados (grupo 1- gr-1 e grupo 2- gr-2)
com R. communis L nas doses de 2,0 e 3,0 mg/kg, respectivamente.
Os resultados são expressos em média ± desvio padrão com Teste-
T, *p≤0,05.
Em relação à figura 2, foi observado que a percentagem de inibição tumoral, em que 2,5 mg/kg
de ciclofosfamida (padrão) ficou com 62% de inibição, a dose de 2,0 mg/kg de R. communis teve
resposta de 67% e na dose de 3,0 mg/kg do extrato a resposta foi de 72% de inibição
respectivamente.
0102030405060708090
100
padrão gr1 gr2
% d
e In
ibiç
ão T
umor
al
padrãogr1gr2
FIGURA 2- Percentagem de inibição tumoral, Sarcoma 180,
para os grupos controle, padrão e tratados (gr-1 e gr-2) com R.
communis L nas doses de 2,0 e 3,0 mg/kg, respectivamente.
21
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences Vol. 00, n. 0, 00/00., 0000
Com relação à massa tumoral, a figura 3 mostra a imagem dos tumores dissecados após sacrifício
dos animais do grupo controle que receberam solução salina 0,9% e o grupo padrão tratado com
2,5 mg/kg de ciclofosfamida, onde se observa a inibição do crescimento tumoral para os animais
tratados com a substância padrão.
FIGURA 3- Comparação entre o grupo de camundongos
machos com Sarcoma 180, no controle, tratados com solução
salina 0,9% e o grupo padrão, tratado com ciclofosfamida na
dose de 2,5 mg/kg.
Na figura 4, os animais tratados com 2,0 mg/kg de R. communis em relação ao controle,
mostra uma redução tumoral relevante.
FIGURA 4- Comparação entre o grupo de camundongos machos
com Sarcoma 180, no controle, tratados com solução salina 0,9% e
o grupo tratado com R. communis na dose de 2,0 mg/kg.
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Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences Vol. 00, n. 0, 00/00., 0000
Enquanto que, na figura 5 foi observado uma inibição tumoral maior, no grupo 2 tratado
com R. communis na dose de 3,0 mg/kg do que no grupo 1 tratado com 2,0 mg/kg e em relação a
ciclofosfamida, substância padrão.
FIGURA 5- Comparação entre o grupo de camundongos machos
com Sarcoma 180 e no controle tratados com solução salina 0,9% e
o grupo tratado com R. communis com dose de 3,0 mg/kg.
DISCUSSÃO
A substância extraída da fração protéica do R. communis apresentou ação inibitória para
Sarcoma 180, nas duas concentrações (2,0 e 3,0 mg/kg) em comparação ao grupo controle e
padrão por via intraperitoneal, considerada estatisticamente significativa, com p≤0,05. O Ricinus
communis L. por sua atividade tóxica tem sido muito estudada como inibidor tumoral por
diversos pesquisadores do mundo (FODSTAD et al., 1979; SOUZA et al., 1994; OLSNES &
KOZLOV, 2001).
De acordo com os resultados apresentados foi evidenciado que o extrato hidroalcoólico
de Ricinus communis L. possui atividade antitumoral equivalente à substância padrão
(ciclofosfamida). Atualmente os protocolos clínicos usam a ciclofosfamida para tratamento de
sarcomas em humanos.
23
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences Vol. 00, n. 0, 00/00., 0000
Por não existirem substâncias antineoplásicas que sejam especificas para as células
tumorais, pois geram muitas reações adversas e toxicidade, as pesquisas com produtos naturais
estão direcionadas para substâncias com características tóxicas (ALMEIDA, 2004).
O número cada vez maior de pesquisas acerca de substâncias antitumorais vem
demonstrando a necessidade de tratamentos mais completos no mercado terapêutico. Os produtos
naturais estão sendo os maiores alvos mundiais das pesquisas científicas (SOUZA et al., 2005).
Segundo Sutherland et al. (1990), para uma substância ser considerada ativa, deve
promover uma inibição do crescimento celular acima de 50% em relação ao grupo controle. Em
face ao exposto, os resultados apresentados ratificaram uma redução tumoral de 67 e 72 % com
relação à dose estabelecida. Sendo observado que a percentagem de inibição tumoral aumentou
de acordo com a quantidade do extrato aplicado.
Os nossos resultados estão de acordo com outras investigações desenvolvidas com
plantas medicinais, como Vellozia pusilla P. e Ocimum campechianim M. (SOUZA, 2004;
DANTAS et al., 2005), e análogos pirimidínicos 4-amino-2,6-diarilpirimidinas-5-carbonitrilas,
onde se obteve 77,47% para carcinoma de Ehrlich e 91,21% para Sarcoma 180 (FALCÃO,
2003).
O desafio da medicina está focado na descoberta de novos agentes que possam contribuir
para o tratamento e melhoria na qualidade de vida do paciente oncológico. O Ricinus communis
mostrou-se ativo para tumores malignos, tornando-se mais uma substância com alta
potencialidade e promissora, o que abre novas perspectivas para a terapêutica do câncer.
ABSTRACT
Ricinus communis L., is popularly known as carrapateira, castor oil plant, belongs to the
Euforbiaceae family. It has large leaves and its fruits present thorny capsules, with seeds in
number of three, where the ricin oil is extracted. It’s probably originated from Africa, but also
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Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas Brazilian Journal of Pharm l Sciences aceuticaVol. 00, n. 0, 00/00., 0000
found in Brazil, above all in North and Northeast regions. This study aims to evaluate the
antitumour activity of the proteic fraction of the extract of R. communis in Sarcoma 180. After 48
hours of the tumour implant the albin Swiss male mices (mus musculus), were treated with salt
soluction 0.9% to the control group, 2.5 mg/kg of cyclosphosphamide to the standard group, and
hydroalcoholic extract of R. communis (2.0 mg/kg and 3.0 mg/kg) I.P., during 7 days, being
sacrificed in the 8th day and the tumours were dissected and weighed. The results indicated that
the extract used obtained expressive antitumour answers (67% and 72%) in comparison with the
standard group (62%) and control group, proving the antitumour activity of the substance and
completing the idea of one more promising substance in the treatment of cancer.
keywords: Ricinus communis L., malign tumour, antineoplasic activity, Sarcoma 180.
AGRADECIMENTOS
A Vitor Ferreira pela formatação do artigo.
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Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
5. ARTIGO II Artigo submetido à Brazilian Archives of Biology and Technology
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Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
Efeitos do extrato de Ricinus communis L. na fragilidade
osmótica, marcação de hemácias com Tecnécio-99m e
morfologia das células.
Kristiana Cerqueira Mousinho1*, Marília Bezerra Libório Correia1, Jailson Oliveira da Silva1, Simey de
Souza Leão Pereira Magnata1, Ivone Antônia de Souza2 e Maria Teresa Jansem de Almeida Catanho1. 1 Departamento de Biofísica e Radiobioloia; 2 Departamento de Antibióticos;Universidade Federal de Pernambuco-
UFPE, Av. Prof. Morais Rego, 1236, Cidade Universitária – Recife/PE– [email protected], Brasil.
ABSTRACT
This article presents studies involving the influence of the proteic extract of R. Communis, with strong
antitumor activity in the osmotic fragility, where blood samples of rats Wistar were incubated with
concentrations of R. Communis and with solutions of NaCl (0.4; 0.7; 0.9%), in the labeling of the blood
elements, where the rats blood was treated with a solution of Tc-99m and TCA at 5%, determining the
rate of radioactivity (%ATI) in the plasma (P)and in the red blood cells (RBC). The soluble and insoluble
fractions of the plasma were also evaluated, as also the morphology cells. The results indicate that the
rate of hemolysis increased in the presence of 0.125 mg/mL of the extract, there was a decay of 49.69% in
the rate of ATI in the insoluble fraction of the cells, occurring morphologic alterations of the blood cells.
These results suggest that the extract changes the capacity of ligation of the red blood cells due to the
stannous ion oxidation, modifying the cells structure.
Key words: Ricinus communis, labeling of red blood cells, osmotic fragility, Technetium-99m,
morphology cells.
INTRODUÇÃO
Ricinus communis L. é uma Euforbiaceae com folhas grandes, palmadas e frutos muito típico
de onde é extraído o “óleo de rícino”, usado na medicina como laxativo ou purgativo e as outras
utilidades do óleo é na indústria como lubrificante (Feijão, 1963; Corrêa, 1984; Souza et al.,
1994; Olsnes, 2004).
* Autor para correspondência
30
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
É uma planta que possui alta toxicidade tanto para animais como para células em crescimento
(Koga et al., 1979), além de sua comprovada ação antineoplásica através de estudos de
repercussão mundial (Feijão, 1963; Fodstad et al., 1979; Souza et al., 1992; Zhou et al., 2003).
Em particular, o extrato também é muito usado no tratamento do câncer terminal na medicina
alternativa. O uso dos produtos naturais vem aumentando cada vez mais no mundo desde últimas
décadas (Olsnes et al., 2001; Souza, 2005).
A fragilidade osmótica visa avaliar a influência do extrato na membrana plasmática das
células vermelhas do sangue de forma qualitativa.
A marcação dos eritrócitos com o tecnécio-99m vem sendo muito estudada. O tecnécio é o
radionuclídeo mais utilizado em pesquisas diagnósticas na medicina nuclear, por possuir
características físicas aceitáveis, meia-vida plasmática de 6 horas e impacto ambiental
desprezível. É usado basicamente no estudo da influência das drogas naturais ou sintéticas na
marcação de células sanguíneas (H) e proteínas plasmáticas (P) em todo o mundo (Braga et al.,
2000; Oliveira et al., 2000; Holanda, 2004; Dantas et al., 2005; Souza et al., 2005)
Neste estudo, foi avaliado o efeito de diferentes concentrações da fração não oleosa do
Ricinus communis na fragilidade osmótica, marcação de células vermelhas do sangue e proteínas
plasmáticas com o tecnécio-99m e na morfologia das hemácias.
MATERIAIS E MÉTODOS
Coleta da planta
Ricinus communis foi coletado no bairro de Pau Amarelo, cidade de Paulista-
Pernambuco, e identificado por Dra. Marlene Barbosa e a espécie está localizada no herbário
Geraldo Mariz, com o número 52.116, da Universidade Federal de Pernambuco- Brasil.
Preparação do extrato
O extrato foi preparado através da trituração das sementes e extraído em solução
hidroalcoólica 8:2 v/v. Para retirada do óleo foi feito uma partição com acetona e concentrado a
vácuo, obtendo a fração protéica.
31
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
A diluição do extrato para a realização dos experimentos foi realizada com Tween 80
0,2% (Falcão, 2003) e solução salina 0,9%.
Fragilidade Osmótica
Foi retirado amostras de sangue venoso na presença de heparina, sendo incubado 0,5
mL de sangue com 0,5 mL do extrato protéico de R. communis em diferentes concentrações
(0,125 mg, 0,0625 mg, 0,0312 mg) por 1 hora à temperatura ambiente. O controle foi incubado
com 0,5 mL de solução salina 0,9%. Após o período de incubação as amostras foram lavadas 3
vezes com NaCl 0,9% para remover o excesso de extrato. As células do sangue foram
resuspendidas em NaCl 0,9%. A fragilidade osmótica das células vermelhas do sangue foi
realizada de acordo com o método de Dacie (1984), modificado. As hemácias foram submetidas
as diferentes concentrações de NaCl (0,4%; 0,7%; 0,9%). Amostras de hemácias (50 µL) tratadas
com R. communis foram adicionadas em tubos com 5 mL dessas soluções de NaCl. Após 1 hora,
à temperatura ambiente, esses tubos foram submetidos à centrífuga clínica (centrifugador
EXCEL SA2; Fanem Ltda) a 2000 rpm por 5 minutos. Os sobrenadantes foram isolados e foi
determinada a densidade óptica (DO) no espectrofotômetro (modelo UV-Vis 634-5; Varian) em
545 nm. O teste foi realizado em triplicata. Após a determinação da fragilidade osmótica foi
realizada a curva de fragilidade em função do percentual.
Marcação dos elementos sanguíneos
Amostras de 0,5 mL de sangue de rato Wistar foram incubadas com heparina à
temperatura ambiente, por uma hora, com 100µL de Ricinus communis, nas concentrações pré-
determinadas, sendo realizada em triplicata para cada concentração que correspondem de
0,0039-0,0625 mg, contendo o controle solução salina 0,9%. Em seguida adicionou-se 0,5 mL de
solução de cloreto estanoso (SnCl2) contendo 1,2 µL/mL à temperatura ambiente. Após mais
uma hora de incubação, foram adicionados 0,1 mL de Tc-99m (3,7 MBq) na forma de
pertecnetato de sódio (Na99m TcO4), sendo incubada por mais 10 minutos. As amostras foram
centrifugadas (centrifugador Excelsa 2; Fanem Ltda) à 1500 rpm durante 5 minutos, para separar
as frações contendo plasma (P) e células (C), respectivamente. Alíquotas de 20 µL de plasma e
células foram utilizadas para a contagem de radioatividade, e a %ATI calculada. Alíquotas de 20
32
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
µL de (P) e (C) foram precipitadas em 1 mL de ácido tricloroacético (TCA 5%), sendo
posteriormente centrifugadas (1500 rpm; 5 min.), isolando-se as frações solúvel e insolúvel do
plasma (FS-P; FI-P) e célula (FS-C; FI-C), sendo em ambas realizada a contagem de
radioatividade no contador gama (modelo DPC- Gambyt CR. Série: 95-3/1122), e
posteriormente foi calculado a %ATI.
Morfologia das células vermelhas do sangue
Para observar o efeito do extrato protéico sobre a morfologia das hemácias, foram
realizados esfregaços em lâminas de microscopia do extrato de Ricinus communis nas
concentrações 0,0625 mg/mL e 0,125 mg/mL em contato com amostras de sangue de rato
Wistar, e no grupo controle o sangue ficou em contato com solução salina à 0,9% durante uma
hora. O teste foi realizado em triplicata e as lâminas foram coradas com metanol, eosina e azul
de metileno (Kit Instant-Prov®). A análise das lâminas foi realizada utilizando microscópio
óptico (40X).
Análise Estatística
Os resultados foram analisados pelo teste T-Student. As diferenças foram consideradas
significativas nos valores em que p≤0,05.
RESULTADOS
Fragilidade Osmótica das hemácias dos ratos com Ricinus communis.
A figura 1 mostra a curva de fragilidade osmótica obtida após o tratamento de amostras
sanguíneas de um rato com diferentes concentrações de Ricinus communis (0,125 mg/mL;
0,0625 mg/mL; 0,0312 mg/mL). A análise dos resultados indica que houve uma diminuição
significativa, com p<0,05, no percentual de hemólises (%H) nas concentrações de 0,062 mg/mL
e 0,031 mg/mL do extrato em comparação ao controle nas três concentrações de NaCl (0,4; 0,7 e
0,9%). Em meio hipotônico (até 0,4% NaCl) foi observado um aumento desse percentual na
33
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
concentração de 0,125 mg/mL do extrato, enquanto que em meio isotônico (0,7 e 0,9% NaCl)
houve uma discreta diminuição da %H e posteriormente uma estabilidade da taxa de hemólise.
0
50
100
150
0.0 0.4 0.7 0.9
NaCl (%)
(%) H
emól
ise Control
0,125 mg/mL0,062 mg/mL0,031 mg/mL
Fig.1 – Diagrama de fragilidade osmótica das hemácias
dos ratos (H) após tratamento com diferentes
concentrações de Ricinus communis L. Os valores das
médias são representativos de três experimentos similares.
Marcação de hemácias com Tecnécio-99m.
A Figura 2 mostra a distribuição da radioatividade nas hemácias (H) e plasma (P) do
sangue, tratado com solução de diferentes concentrações de Ricinus communis. A análise dos
resultados indica que existe uma diminuição significativa (p<0,05) da radioatividade nas frações
25% (84,77%), 50% (64,87%), 100% (58,55%) do extrato nas células vermelhas, enquanto que
houve um aumento significativo na ligação com o plasma nas mesmas frações com 15,23%;
35,13% e 41,45%, respectivamente.
0
50
100
150
0 6,25 12,5 25 50 100 Extrato de Ricinus communis L.
(%)
% d
e lig
açã
o c
om
T
c9
9m H
PL
* ** *
Figura 2 - Efeitos do extrato de Ricinus communis na
fixação de Tc-99m no plasma e nas hemácias em água. Os
resultados são expressos em médias ± desvio padrão com
Teste-T, *p<0,05.
34
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
Na Figura 3 foi observado a distribuição da radioatividade nas frações solúveis (FS-H)
e insolúveis (FI-H) das células sanguíneas, tratadas com diferentes concentrações (0,0038- 0,062
mg/mL) da solução de R. communis e TCA à 5%. A análise dos resultados indica que houve uma
alteração significativa (p<0,05). Nas doses de 0% a 25%, a capacidade de ligação do Tc-99m
permanece inalterada após precipitação com TCA, no entanto foi verificado entre as
concentrações de 50% e 100% que ocorre um decréscimo de até 49,69% na presença de TCA.
Foi observado que a fração solúvel das hemácias apresentou um %ATI de 60% na capacidade de
ligação do Tc-99m nas concentrações de 6,25 a 25% do extrato, enquanto que as frações de
100% do extrato ocorreu uma redução de 25 a 30%, isso mostra que as frações insolúveis das
células promovem uma ligação específica mantendo-se inalterada quando comparado com o
gráfico da figura 2.
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150
Extrato de Ricinus communis L. (%)
% d
e lig
ação
com
Tc-
99m
FS-H
FI-H
*
*
*
*
*
Figura 3 - Efeitos do extrato de Ricinus communis na
fixação de Tc-99m nas frações solúveis e insolúveis das
hemácias. Os resultados são expressos em médias ±
desvio padrão com Teste-T, *p<0,05.
A morfologia das hemácias foi avaliada sob microscópio óptico.
A Figura 4 mostra a preparação histológica das hemácias do grupo controle em contato
com solução fisiológica 0,9%, observando-se que as células (H) são discóides e anucleadas.
35
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
Figura 4 – Células do controle - Esfregaço foi preparado,
secado, fixado e corado. Após isso, a morfologia das
hemácias foi avaliada em microscópio óptico (x40).
Na Figura 5, onde mostra as hemácias que foram incubadas com R. communis 0,062 mg/mL.
Foram observadas discretas alterações morfológicas nas células, em comparação com o grupo
controle, com pouca hemólise.
Figura 5 - Na presença do extrato de Ricinus communis
L. (0,062 mg/mL), o esfregaço foi preparado, secado,
fixado e corado. Após isso, a morfologia das hemácias foi
avaliada em microscópio óptico (x40). A seta indica
alteração na morfologia celular.
A Figura 6 mostra o tratamento realizado na concentração 0,125 mg/mL do R. communis,
apresentando importantes alterações na morfologia das células com quebra da membrana celular,
fragmentação, hemólises e hemoaglutinação.
36
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
Figura 6 – Na presença do extrato de Ricinus communis
L. (0,125 mg/mL), o esfregaço foi preparado, secado,
fixado e corado. Após isso, a morfologia das hemácias foi
avaliada em microscópio óptico (x40). A seta indica
alteração na morfologia celular.
DISCUSSÃO
O Ricinus communis L. tem-se mostrado uma planta extremamente tóxica para animais
e células em crescimento in vitro (Koga et al., 1979; Zhou et al., 2003).
Estudos já realizados mostraram a ação de drogas sintéticas e naturais, Thuya
occidentallis, Tabacco, Maytenus ilicifolia, Paullinea cupana e Coffee beans que interferem na
marcação de células sanguíneas com 99mTc (Oliveira et al., 1997; Vidal et al., 1998; Oliveira et
al., 2000; Lima et al., 2002; Oliveira et al., 2002; Oliveira et al., 2003). O mecanismo para a
fixação do 99mTc nas células sanguíneas consiste na ligação do elemento radioativo na cadeia β
da hemoglobina (Bernardo-Filho et al., 2005).
Nossos resultados mostraram que houve aumento na taxa de hemólise na concentração
de 0,125 mg/mL e que não houve ocorrência de alterações na marcação de células vermelhas do
sangue nas concentrações de 6,25% para 25% do extrato quando comparado com o percentual do
grupo controle, entretanto, foi observado um decaimento de 49,69% na concentração de 100%,
verificando que nestas concentrações ocorrem alterações morfológicas nas células do sangue e
que a radiação nas frações insolúveis promovem a redução da radioatividade. Alguns estudos
mostram que a toxina ricina provoca aglutinação dos eritrócitos e precipitação das proteínas
séricas (Olsnes, 2004) e nossos resultados mostraram alterações morfológicas com aglutinação
37
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
dos eritrócitos (Fig. 6). O extrato hidroetanólico de Ricinus communis pode alterar a marcação
das hemácias e FI-H diminuindo a fixação da radioatividade nas células sanguíneas.
Os resultados deste estudo sugerem que o extrato protéico de Ricinus communis
promove efeitos tóxicos, alterando a capacidade de ligação das hemácias devido à capacidade de
oxidação do íon estanoso, inibição direta (ação quelante) referentes à competição dos íons pelos
sítios de ligação do íon pertecnetato, modificando assim as estruturas celulares.
AGRADECIMENTO
A Vitor Ferreira pela revisão do texto em inglês e formatação do artigo.
RESUMO
Este trabalho apresentou estudos envolvendo a influência do extrato protéico de R. communis L.,
com potente atividade antitumoral na fragilidade osmótica, onde amostras de sangue de rato
Wistar foram incubadas com concentrações de R. communis e com soluções de NaCl (0,4; 0,7;
0,9%), na marcação dos elementos sanguíneos. O sangue de rato foi tratado com solução de Tc-
99m e TCA à 5%, determinando o percentual de radioatividade (%ATI) no plasma (P) e nas
hemácias (H). As frações solúvel e insolúvel do plasma também foram avaliadas, como também
a morfologia das células. Os resultados indicam que a % hemólise aumentou na presença de
0,125 mg/mL do extrato, houve decréscimo de 49,69% na % ATI na fração insolúvel das células,
ocorrendo alterações morfológicas das células sangüíneas. Esses resultados sugerem que o
extrato altera a capacidade de ligação das células vermelhas devido à oxidação do íon estanoso,
modificando as estruturas celulares.
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6. ARTIGO III Artigo a ser submetido à Acta Biologica Hungarica
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Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
Biodistribuição com Tc-99m do Ricinus communis L.
Mousinho, Kristiana C.1, Correia, Marília B. L.1, Barros, A. L. S.1, Magnata, Simey S. L. P.1, Souza,
Ivone A.2 and Catanho, Maria T. J. A.1. 1 Department of Biophysics and Radiobiology; 2 Antibiotics Department; Federal University of Pernambuco-
UFPE, Av. Prof. Morais Rego, 1236, Cidade Universitária – Recife/PE, Brazil.
ABSTRACT
Ricinus communis L. belongs to the Euforbiaceae family, which from fruits is extracted the ricin oil,
highly toxical. It was analyzed the extract effect in the normal and tumour biodistribution with Tc-
99m, counting the %ATI in organs like heart, lungs, pancreas, stomach, liver, intestine, kidneys,
muscles, bones and brain, blood and tumour; in the total proteins, the extract was labeled with Tc-
99m and evaluated the radiochemical control in the labeling of red blood cells. The results showed
that in the biodistribution there was a decrease in the captivating of Tc-99m in most of the analyzed
organs, being significant in the kidneys (G1), muscles, brain and an increase in the stomach, kidneys
(G3); in tumour animals, there was a significant reduction in the heart, lungs, kidneys and tumour, in
the concentration of total proteins of 34.62 and 34% relative to the rate of the control group. In the
radiochemical control through chromatography, it was observed that the extract labeled with Tc-99m
showed two fractions with 130.007 and 494.592 cpm, analyzed by the labeling of red blood cells,
with %ATI of 61.88 and 41.32% in the fractions 1 and 2. It’s concluded that the extract of R.
communis alterates the captivating of Tc-99m in vitro and in vivo, competing with Tc-99m in the
binding sites of the red blood cells by the capacity of oxidation of the stannous ion or competition in
the binding sites of the pertechnetate ion.
Keywords: Ricinus communis L., Technetium-99m, Biodistribution, radiochemical control, labeling
of red blood cells.
INTRODUÇÃO
O Tecnécio-99m (99mTc) é o radionuclídeo mais utilizado na medicina nuclear para
procedimentos de diagnóstico com imagem funcional de diferentes órgãos e estudos
experimentais (8; 9; 19), possuindo características físicas aceitáveis: meia-vida de 6 horas,
emissão fóton gama de 140 keV, impacto ambiental desprezível e resultando em baixa
43
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
exposição da radiação para o paciente (4; 7; 8; 14; 19; 21; 24). O uso dos produtos naturais
nos estudos experimentais tem aumentado consideravelmente no mundo (1; 2; 4).
Ricinus communis L. pertence à família das Euforbiáceas, dos frutos típicos é extraído o
óleo de rícino, que é muito utilizado na medicina popular como laxante, purgativo e como
lubrificante na indústria (3; 5; 17; 18; 22).
Neste estudo foi avaliado o efeito da fração protéica do Ricinus communis na
biodistribuição com Tc-99m em camundongos normais e tumorais, análise das proteínas
totais, marcação das células sanguíneas com frações do extrato marcado.
MATERIAIS E MÉTODOS
ANIMAIS
Os camundongos machos albinos Swiss (mus musculus), adultos foram adquiridos no
Biotério Aggeu Magalhães (Fiocruz), Brasil. Os animais foram abrigados em gaiolas de
plástico individual com estante e ventilação interna, temperatura e umidade controlada, ciclo
claro-escuro de 12 horas, de acordo com as normas internacionais do Conselho do
Laboratório de Animais Experimentais (ICLAS). O ensaio foi aprovado pelo Comitê de Ética
Experimental da Universidade Federal de Pernambuco de acordo com o processo número
011553/2005.
COLETA DA PLANTA E EXTRAÇÃO
Ricinus communis L. foi coletado no bairro de Pau Amarelo, cidade de Paulista em
Pernambuco, Brasil, identificado por Dra. Marlene Barbosa e a espécie registrada no
Herbário Geraldo Mariz, com número 52.116, da Universidade Federal de Pernambuco
(UFPE, Brasil). O material botânico foi obtido por trituração e extraído em solução
hidroetanólica 8:2 (v/v), e para a retirada do óleo de rícino foi acrescentado acetona e
concentrado em seguida a vácuo, obtendo a fração protéica.
44
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
BIODISTRIBUIÇÃO
CAMUNDONGOS NORMAIS
Neste estudo foi utilizado 4 grupos com 5 camundongos em cada gaiola, sendo um grupo
controle, que recebeu solução salina 0,9%, três grupos tratados com doses diárias de Ricinus
communis de 0,1, 0,3 e 1,0 mg/kg, por via IP, durante 7 dias consecutivos. No 8° dia foi
administrado 0,1 mL de pertecnetato de sódio e cloreto estanoso com atividade radioativa
inicial de 100µCi, via IP, em cada animal, obtido pela adição de pertecnetato de sódio,
recentemente eluído de um gerador de 99Mo/99mTc produzido no Hospital das Clínicas de
Pernambuco. Após 20 minutos da administração do tecnécio-99m, os animais foram
sacrificados e isolados os seguintes órgãos: coração, pulmão, pâncreas, estômago, fígado,
intestino grosso e delgado, rins, músculo, osso e cérebro e uma amostra de sangue. Foi
realizada a contagem do percentual de atividade radioativa total injetada (%ATI) no contador
gama (modelo DPC - Gambyt CR. Série: 95-3/1122). O experimento foi realizado em
triplicata.
CAMUNDONGOS COM INDUÇÃO TUMORAL
Os ensaios de atividade antitumoral foram realizados de acordo com a metodologia
descrita por Stock (23) e Funayama e Komaiyama (6). Foram utilizados camundongos,
machos, albinos Swiss (mus musculus) com implantação do tumor Sarcoma 180.
Implante da Massa Tumoral
Para a realização da atividade antitumoral do Ricinus communis foi utilizado 5
camundongos machos por grupo. O implante da massa tumoral foi realizado através do
transplante do Sarcoma 180 de um animal doador, após remoção do material que foi
fragmentado e colocado em solução antibiótica (80 mg de Garamicina). Um fragmento
tumoral com cerca de 3mm de diâmetro foi introduzido por via subcutânea, na região axilar
do animal receptor, segundo a técnica descrita por Stock (23) e Funayama e Komaiyama (6).
45
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
ESTUDO DA BIODISTRIBUIÇÃO EM CAMUNDONGOS COM INDUÇÃO
TUMORAL
Após 48 horas do implante tumoral os camundongos foram tratados e subdivididos em:
controle, que recebeu solução salina 0,9% e dois grupos tratados com doses diárias de
Ricinus communis de 1,0 e 3,0 mg/kg, por via IP, durante 7 dias consecutivos. No 8° dia foi
administrado 0,1 mL de Tc-99m com atividade radioativa inicial de 100 µCi, via IP, em cada
animal, obtido pela adição de pertecnetato de sódio, recentemente eluído de um gerador de 99Mo/99mTc do Hospital das Clínicas de Pernambuco. Após 20 minutos da administração do
tecnécio-99m, os animais foram sacrificados e isolados os seguintes órgãos: coração,
pulmões, rins, músculo, tumor e amostras de sangue. Foi realizada a contagem do percentual
de atividade radioativa total injetada (%ATI) no contador gama (modelo DPC-Gambyt CR.
Série: 95-3/1122). O experimento foi realizado em triplicata. Para o índice de inibição
tumoral foi calculado através da fórmula de Machon (11):
TWI%= C-T x 100
C
Onde:
TWI%= % de inibição tumoral
C= Média dos pesos dos tumores dos animais do grupo controle
T= Média dos pesos dos tumores dos animais do grupo teste.
ANÁLISE DAS PROTEÍNAS TOTAIS
Para a análise de proteínas totais foram utilizados os soros sanguíneos das amostras dos
animais tumorais e analisados na Universidade Federal Rural de Pernambuco, com auxílio do
Kit da Katal®.
CONTROLE RADIOQUÍMICO
Para a elaboração da coluna cromatográfica de filtração, foi utilizado para a fase
estacionária de SEPHADEX G100®, sendo compactado com solução salina 0,9%. O extrato
46
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
de Ricinus communis foi diluído com Tween 80 0,2% e solução salina 0,9% na concentração
de 1,0 mg/mL. O extrato frio não marcado foi eluído na coluna obtendo as frações de 1mL,
coletadas em tubos de ensaio e analisados através do espectrofotômetro a 280 nm. Em
seguida foi realizado a reação de pertecnetato com cloreto estanoso por 10 minutos e
cromatografado obtendo as frações no volume de 1 mL e contado no contador gama.
Posteriormente, a concentração do extrato de 1,0 mg/mL foi incubada na presença do Tc-
99m (0,1 mL de Tc-99m e 0,9 mL do extrato), passando então pela coluna e coletada as
frações, onde foi feita a contagem da radiação. Para cada procedimento a coluna foi lavada
repetida vezes com solução salina 0,9%.
MARCAÇÃO DE HEMÁCIAS COM EXTRATO MARCADO
A marcação das hemácias foi realizada com extrato marcado após a cromatografia,
utilizando as duas frações obtidas anteriormente no controle radioquímico. O sangue foi
obtido através de punção cardíaca em rato Wistar e heparinizado, e colocado em contato com
as duas frações coletadas do extrato marcado com Tc-99m. Para o controle foi utilizado
solução salina 0,9%, incubados por 10 minutos e centrifugado os tubos para a separação do
plasma e hemácias, sendo feita à contagem da radiatividade no contador gama.
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para o teste estatístico foi utilizado T-Student, média ± desvio padrão, com p≤0,05.
RESULTADOS
Na tabela 1 encontram-se os resultados referentes à captação (%ATI) do Tc-99m nos
grupos tratados com R. communis, grupo 1 (0,1 mg/kg), grupo 2 (0,3 mg/kg), grupo 3 (1,0
mg/kg) e no grupo controle com solução salina 0,9%, 20 minutos após a injeção do Tc-99m.
A análise dos resultados mostrou um aumento significativo (p≤0,05) do %ATI do grupo 1
nos rins; grupo 2 no estômago e redução no músculo; enquanto que no grupo 3 houve
aumento na captação nos rins e cérebro. Não houve nenhuma alteração significativa do
%ATI nos demais órgãos.
INSERIR TABELA 1
47
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
Enquanto que na Tabela 2, encontra-se os resultados referentes à captação (%ATI) do Tc-
99m em animais com tumor induzido, com dois grupos tratados com R. communis, grupo 1
com 1,0 mg/kg, grupo 2 com 3,0 mg/kg e o grupo controle com solução salina 0,9%,
sacrificados após 20 minutos da administração do Tc-99m. A análise dos resultados mostrou
uma redução significativa (p≤0,05) do %ATI no coração, pulmão e tumor nos grupos 1 e 2
com relação ao controle, e rins no grupo 2; e aumento dessa captação nos rins do grupo 1.
Não houve nenhuma alteração significativa do %ATI no músculo nos 2 grupos.
INSERIR TABELA 2
Na concentração das proteínas totais observadas nos animais tumorais, foi verificado que
a concentração sérica protéica foi reduzida de 34,64 e 34 % nos animais tratados nas doses
1,0 e 3,0 mg/kg quando comparado ao % controle. Como pode ser observado na Figura 1.
INSERIR FIGURA 1
Na figura 2, os animais tratados com 1,0 mg/kg de R. communis (grupo 1) apresentou
29,59% de redução tumoral em relação ao controle, não sendo significativa essa dose como
antitumoral.
INSERIR FIGURA 2
Enquanto que na figura 3, os animais tratados com 3,0 mg/kg de R. communis (grupo 2)
em relação ao controle, mostra uma redução tumoral significativa de 74,55%.
INSERIR FIGURA 3
Para a análise radioquímica do extrato puro de R. communis, a figura 4 mostra as frações
obtidas pela cromatografia de filtração em gel, obtendo duas frações iniciais de 2 e 0,405 em
absorbância, leitura feita no espectrofotômetro à 280 nm, onde foi observada a expressão da
proteína tóxica nestas frações.
INSERIR FIGURA 4
48
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
Para a análise radioquímica do Tc-99m puro, a figura 5 mostra as frações obtidas pela
cromatografia de filtração em gel, obtendo duas frações, com maior atividade de radiação em
cpm de 1.527.880 e outra 778.043, respectivamente. A leitura foi feita no contador gama,
onde se observou a expressão do Tc-99m nestas frações.
INSERIR FIGURA 5
Na determinação da análise radioquímica do extrato marcado de R. communis com Tc-
99m, a figura 6 mostra as frações obtidas pela cromatografia de filtração em gel nas duas
frações, uma que corresponde a fração protéica e outra que corresponde a radiação do Tc-
99m isolado, com contagem de 130.007 e 494.592 cpm, respectivamente. A leitura foi
realizada no contador gama, onde se observa a expressão da proteína tóxica marcada com Tc-
99m nestas frações.
INSERIR FIGURA 6
Enquanto que a figura 7 apresenta a marcação das células sangüíneas do extrato marcado
com Tc-99m, após eluição, foi verificado que o extrato comparado as hemácias marcadas
com Tc-99m apresenta um %ATI de 61,88 e 41,32 nas frações 1 e 2, respectivamente.
INSERIR FIGURA 7
DISCUSSÃO
Diante do exposto, esse trabalho comprovou que na biodistribuição o extrato competiu
com o pertecnetato de sódio, diminuindo a captação do mesmo na maioria dos órgãos
analisados, sendo significativo para os rins (grupo 1), músculo e cérebro e aumentando a
captação nos rins (grupo 3) e estômago, havendo uma possível interação com o R. communis,
facilitando a ligação do pertecnetato de sódio. No protocolo experimental dos camundongos
com tumor induzido, foi escolhido um modelo para analisar a atividade antitumoral em doses
específicas do extrato de R. communis e verificou a %ATI nos órgãos dos camundongos
reduzindo a captação do Tc-99m quando comparado aos órgãos dos animais controle;
entretanto nas doses de 1,0 e 3,0 mg/kg, os rins apresentaram um aumento da captação do
49
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
Tc-99m de 1,086% com relação a primeira dose, enquanto que na segunda dose foi reduzida
a captação em 0,167%. Esses resultados mostram que o extrato de R. communis apresenta
uma interação com os sítios de ligação e modifica o processo metabólico, uma vez que nos
animais com tumores ocorreu uma redução das proteínas séricas de 34,62 e 34% com relação
ao % controle, avaliando ainda a atividade antitumoral que ficou de 29,59 e 74,55% para as
doses de 1,0 e 3,0 mg/kg, respectivamente. Este estudo mostra que comparando a
biodistribuição de camundongos normais e com tumores induzidos pode-se observar que o
grupo controle de animais com tumor apresentou um aumento do %ATI nos órgãos, como
coração e pulmão, em relação ao grupo de animais normais. Este resultado se deve a
presença do tumor nos animais. Estudos demonstraram que os tumores sólidos possuem
células hipóxicas sendo um fator limitante de tratamento pela radioterapia, incluindo a
deficiência na vascularização tumoral e na microcirculação (12). Quanto ao controle
radioquímico através da cromatografia de filtração foi observado que o extrato marcado com
Tc-99m apresentou duas frações com 130.007 e 494.592 cpm, e que estas frações foram
analisadas pela marcação das células sanguíneas, com % de ATI de 61,88 e 41,32 % nas
frações 1 e 2, respectivamente, mostrando que o extrato de R. communis compete com o Tc-
99m na ligação com as hemácias ficando mais livre no plasma.
Segundo Lugnier (10) as propriedades físicas e químicas da ricina foram estudadas em
coluna cromatográfica com SEPHADEX G100® para obtenção da massa molecular, obtendo
um valor de 51.000 à 58.000. No mesmo estudo foi feita a cromatografia de DEAE –
celulose, onde a ricina foi encontrada em duas frações. Esse resultado comprova o nosso
trabalho, onde também obtivemos duas frações e que provavelmente a proteína encontrada é
a ricina, proteína tóxica que é descrita em vários trabalhos de repercussão mundial,
mostrando propriedade altamente tóxica e farmacologicamente ativa como as atividades
antineoplásicas.
Alguns trabalhos também mostram a interferência dos produtos naturais na marcação de
células sanguíneas, reduzindo a captação do Tc-99m nas hemácias, como Thuya occidentalis
(13), Paullinia cupana (15), Coffee beans (16) e no artigo anterior a este, ainda em fase
avaliação (ANEXO 1) com o R. communis (2006). Sabe-se que a forma das células depende
da organização das proteínas presentes na membrana plasmática, portanto quando uma droga
sintética ou natural altera a morfologia de uma célula, provavelmente está alterando também
50
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
as estruturas protéicas, como vimos no estudo anterior, justificando ainda essa diminuição na
marcação das hemácias e aumento da expressão do radiofármaco nas proteínas plasmáticas.
Murugesan et al.(2001) descreveram o aumento da concentração de radioatividade nestes
tumores pode marcar células hipóxicas. Este trabalho pode ser um modelo de atividade
antitumoral e produção de radiofármaco para fins terapêuticos, uma vez que o extrato reduz o
tumor e promove ligação com o Tc-99m.
Em geral, o extrato protéico de Ricinus communis altera os processos de biodistribuição,
bem como a marcação das células sanguíneas com o Tc-99m. Desta forma percebe-se que
algumas drogas facilitam a localização do radiofármaco no órgão alvo, enquanto que outras
drogas dificultam (21). Vale ressaltar que como a população utiliza esta planta na medicina
popular como laxante, a administração concomitante do extrato com o Tc-99m, pode
interferir nos resultados de exames radiológicos.
AGRADECIMENTOS
À Vitor Ferreira pela imensa colaboração na formatação deste artigo.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Biodistribuição com Tc-99m em camundongos machos Swiss tratados com Ricinus
communis.
Tabela 1 – Efeito do R. communis na cinética da biodistribuição do Tc-99m em 25 camundongos normais Swiss
sacrificados após 20 minutos da injeção do radiofármaco. Abreviações: DP = desvio padrão; %ATI =
percentual de radioatividade e * = p≤ 0,05.
%ATI (média±DP)
__________________________________________________________
Órgãos Grupo controle Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3
Coração 0,162 ± 0,048 0,186 ± 0,069 0,166 ± 0,015 0,160 ± 0,048
Pulmão 0,111 ± 0,072 0,072 ± 0,03 0,077 ± 0,065 0,150 ± 0,072
Pâncreas 0,727 ± 0,285 0,739 ± 0,366 0,896 ± 0,349 0,628 ± 0,285
0,21 ± 0,268 Estômago 0,488 ± 0,204* 0,344 ± 0,228 0,408 ± 0,268
Fígado 2,058 ± 1,183 1,631 ± 0,501 1,483 ± 1,077 2,138 ± 1,183
I. Grosso 0,215 ± 0,157 0,093 ± 0,095 0,196 ± 0,113 0,312 ± 0,157
I. Delgado 0,318 ± 0,209 0,183 ± 0,086 0,195 ± 0,057 0,316 ± 0,209
Rins 1,301 ± 0,524* 2,98 ± 0,964* 1,925 ± 0,964 1,604 ± 1,148
Músculo 0,263 ± 0,053* 0,465 ± 0,167 0,396 ± 0,05 0,621 ± 0,167
Osso 0,025 ± 0,011 0,031 ± 0,018 0,028 ± 0,027 0,021 ± 0,011
Cérebro 0,03 ± 0,011* 0,014 ± 0,011 0,019 ± 0,009 0,018 ± 0,008
55
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
Biodistribuição com Tc-99m em camundongos machos Swiss com Sarcoma 180 tratados
com Ricinus communis.
Tabela 2 – Efeito do R. communis na cinética da biodistribuição do Tc-99m em 25 camundongos com indução
tumoral Swiss sacrificados após 20 minutos da injeção do radiofármaco. Abreviações: DP = desvio padrão;
%ATI = percentual de radioatividade e * = p≤ 0,05.
%ATI (média±DP)
__________________________________________________________
Órgãos Grupo controle Grupo 1 Grupo 2
0,045 ± 0,012* 0,08 ± 0,01* Coração 0,677 ± 0,161
0,175 ± 0,037* 0,084 ± 0,011* Pulmão 0,59 ± 0,162
1,086 ± 0,224* 0,167 ± 0,026* Rins 0,703 ± 0,097
Músculo 0,304 ± 0,16 0,198 ± 0,066 0,417 ± 0,167
1,147 ± 0,267* 1,191 ± 0,327* Tumor 6,019 ± 0,924
Análise de proteínas totais em camundongos machos Swiss.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
controle gr1 gr2
prot
eina
s to
tais
(g/d
L)
controlegr1gr2
* *
Figura 1: Determinação de proteínas totais, para os grupos controle e tratados
(grupo 1 – gr-1 e grupo 2 – gr-2) com R. communis L nas doses de 1,0 e 3,0
mg/kg, respectivamente. Os resultados são expressos em média ± desvio padrão
com Teste-T, *p≤0,05.
56
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
Tumores (Sarcoma 180) em camundongos machos Swiss tratados com Ricinus
communis.
Figura 2: Comparação entre o grupo de camundongos machos com Sarcoma 180 e o
controle, tratados com solução salina 0,9% e o grupo tratado com R. communis na dose
de 1,0 mg/kg.
Tumores (Sarcoma 180) em camundongos machos Swiss tratados com Ricinus
communis.
Figura 3: Comparação entre o grupo de camundongos machos com Sarcoma 180 e no
controle tratados com solução salina 0,9% e o grupo tratado com R. communis com dose
de 3,0 mg/kg.
57
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
Frações de proteínas do extrato puro
00,20,40,60,8
11,21,41,61,8
0 20 40 60 80
números de tubos
dens
idad
e óp
tica
( 280
nm
)
Figura 4: Frações de proteínas do extrato puro passado
na coluna de cromatografia de filtração.
Frações do Tc-99m puro
0200000400000600000800000
10000001200000140000016000001800000
0 10 20 30 40 50 60
números de tubos
cont
agem
em
CPM
do
Tc99
m
Figura 5: Frações do Tc-99m puro passado na coluna de
cromatografia de filtração em gel.
58
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
Frações do extrato marcado de Ricinus communis com Tc-99m
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
0 10 20 30 40 50 60
números de tubos
Tc99
m
(cpm
)
Figura 6: Frações do extrato marcado de R. communis
com Tc-99m passado na coluna de cromatografia de
filtração.
Marcação de células sanguíneas com extrato de Ricinus communis marcado com Tc-
99m
0
20
40
60
80
100
120
controle fração1 fração 2
% d
e A
TI
hemáciasplasma
Figura 7: Frações do extrato marcado de R. communis com Tc-99m na marcação de
células sanguíneas, hemácia e plasma.
59
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
7. CONCLUSÃO
60
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
7. Conclusão
De acordo com os resultados obtidos, podemos concluir que o extrato de Ricinus
communis possui:
(i) Atividade antitumoral nas concentrações de 2,0 e 3,0 mg/kg;
(ii) A concentração de 0,125 mg/mL do extrato promoveu fragilidade osmótica;
(iii) Alteração na marcação de hemácias reduzindo sua eficiência de ligação com o
Tc-99m em 50%;
(iv) Mudança da morfologia celular com fragmentação das hemácias;
(v) Na biodistribuição, o extrato marcado com Tc-99m é mais efetivo nos rins e
estômago;
(vi) O extrato marcado apresenta maior captação do Tc-99m em células tumorais;
(vii) O extrato de Ricinus communis promoveu uma redução das proteínas séricas em
animais com tumores induzidos.
61
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
8. PERSPECTIVAS
62
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
8. Perspectivas Na oncologia, a prática da Medicina nuclear representou um avanço em diagnóstico e
tratamento nos últimos anos (THRALL & ZIESSMAN, 2003).
Há uma grande flexibilidade para direcionar radiofármacos naturais ou sintéticos para
diagnósticos específicos, até porque várias moléculas podem ser marcadas (THRALL &
ZIESSMAN, 2003).
Em face aos resultados apresentados podemos sugerir que o extrato de Ricinus
communis pode ser usado como radiofármaco e marcador de células tumorais. Como também
identificar os possíveis mecanismos de ação que envolve a redução da massa tumoral,
provavelmente em células cancerígenas sanguíneas. Entretanto o cuidado com a toxicidade
deste produto é muito importante, já que o objetivo dos alvos terapêuticos é também a
melhoria da qualidade de vida do paciente.
63
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
64
Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
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10. ANEXOS
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10. ANEXOS ANEXO I: Artigo submetido à Brazilian Archives of Biology and Technology
EFFECTS OF THE EXTRACT OF RICINUS COMMUNIS ON THE OSMOTIC FRAGILITY,
LABELING OF RED BLOOD CELLS WITH TECHNETIUM-99M AND MORPHOLOGY CELLS. Coresponding author: Kristiana Cerqueira Mousinho E-mail address: [email protected] Federal University of Pernambuco, Department of Biophysics and Radiobiology – Phone number: +55-81-21268535 and +55-81-21268536. Av. Prof. Morais Rego, 1236, 50670-420- Cidade Universitária – Recife/PE Brazil Word Processor: Microsoft Word, version 2003 File name on disk: Effects …Fragility, by Mousinho et al.
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Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.
Effects of the extract of Ricinus communis on the osmotic fragility, labeling of red blood cells with technetium-99m and morphology cells. Kristiana Cerqueira Mousinho1*, Marília Bezerra Libório Correia1, Jailson Oliveira da Silva1, Simey de Souza Leão Pereira Magnata1, Ivone Antônia de Souza2 and Maria Teresa Jansem de Almeida Catanho1. 1 Department of Biophysics and Radiobiology, Federal University of Pernambuco-UFPE, Av. Prof. Morais Rego, 1236, Cidade Universitária – Recife/PE, Brazil – [email protected]; 2 Antibiotics Department, Federal University of Pernambuco-UFPE.
ABSTRACT This article presents studies involving the influence of the proteic extract of R. Communis, with strong antitumor activity in the osmotic fragility, where blood samples of rats Wistar were incubated with concentrations of R. Communis and with solutions of NaCl (0,4; 0,7; 0,9%), in the labeling of the blood elements, where the rats blood was treated with a solution of Tc-99m and TCA at 5%, determining the rate of radioactivity (%ATI)in the plasma (P)and in the red blood cells (BC). The soluble and insoluble fractions of the plasma were also evaluated, as also the morphology cells. The results indicate that the rate of hemolysis increased in the presence of 0,125 mg/mL of the extract, there was a decay of 49,69% in the rate of ATI in the insoluble fraction of the cells, occurring morphologic alterations of the blood cells. These results suggest that the extract changes the capacity of ligation of the red blood cells due to the stannous ion oxidation, modifying the cells structure. Key words: Ricinus communis, labeling of red blood cells, osmotic fragility, Technetium-99m, morphology cells.
INTRODUCTION
Ricinus communis is a Euforbiaceae with large palm leaves, and very typitcal fruits, where the “ricin oil” is extracted, and used in the Medicine as a laxative and purgative. Other utility from this oil is in the industry as a lubricant (Corrêa, 1984; Feijão, 1963; Olsnes, 2004; Souza et al., 1992). It’s a highly toxic plant as for animals as for cells in growth (Koga et al., 1979), it has a proved antitumor action through studies with worldwide repercussion (Feijão, 1963; Fodstad et al., 1979; Souza et al., 1992; Zhou et al., 2003). In particular, the extract is also very used in the treatment of terminal cancer in the alternative Medicine. The use of natural products is increasing more and more in the world throughout the last decades (Olsnes et al., 2001; Souza, 2005). The osmotic fragility tends blood cells membrane in a qualitative way. The labeling of red blood cells with Technetium-99m
(99m TC-RBC) is being studied with frequency recently. to evaluate the influence of the extract in the red The Technetium is the most used radionuclides in scientific researches and diagnostics in the nuclear medicine, because of its acceptable physical characteristics: six hours of plasmatic half-life and despicable environment impact. It’s basically used in the study of the influences of natural or synthetic drugs in the labeling of red blood cells (RBC) and plasmatic proteins throughout the world (Braga et al., 2000; Dantas et al., 2005; Holanda, 2004; Oliveira et al., 2000; Souza et al., 2005). In this study, it was evaluated the effects of different concentrations of the non-oily fraction of Ricinus communis in the osmotic fragility, labeling of red blood cells and plasm proteins with Technetium 99m and morphology cells.
†
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MATERIALS AND METHODS Plant Materials Ricinus communis was collected in the district of Pau Amarelo in the town of Paulista-Pernambuco, and identified by Dr. Marlene Barbosa. The species are located in the Geraldo Mariz herbarium, with the number 52.116, of the Federal University of Pernambuco-Brazil. Extract preparation The extract was prepared by triturating the seeds and extracting in a hydroalcoholic solution 8:2 v/v, and for the oil extraction it was used acetone and dried right under vacuum, obtaining the proteic fraction. The extract dilution for the realization of the experiments was done with the help of Tween 80 and salt solution 0,9%. Osmotic Fragility It was retracted venous blood samples in the presence of heparin, incubating 0,5ml of blood with 0,5ml of the extract of Ricinus communis in different concentrations (0,125 mg, 0,0625 mg, 0,0312 mg) during 1 hour at local temperature. The control group was incubated with 0,5 ml salt solution 0,9%. After the incubation period, the samples were washed 3 times with NaCl 0,9% to remove the excess of extract. The blood cells were resuspended in NaCl 0,9%. The osmotic fragility of the red blood cells was realized by the Dacie Method (1984), with some modifications. The RBC were submitted to different concentrations of NaCl (0,4%; 0,7%; 0,9%). Samples RBC (50 µL) treated with R. Communis were added in tubes with 5mL of these NaCl solutions. After 1 hour, at local temperature, these tubes were centrifuged in the clinic centrifuge (centrifuge EXCEL SA2; Fanem Ltda) at 2000 rpm for 5 minutes. The sobrenadants were isolated and the optic density (OD) was determinated in the spectrophotometer (model UV-Vis 634-5, Varian) 545 nm. The test was realized three times. After the osmotic fragility determination, were realized fragility curves in function of the percent.
Labeling of blood elements
Samples of 0,5 ml of Wistar rats blood, with heparin were incubated at local temperature, during one hour, with 100µL of Ricinus communis, in the predetermined concentrations, being realized three times for each concentration (100%-0,0625 mg, 50%-0,0312 mg, 25%-0,0156 mg, 12,5%-0,0078 mg, 6,25%- 0,0039 mg), and the control group containing salt solution 0,9%. Then it was added 0,5ml of stannous chlorite (SnCl2) containing 1,2 µL/mL, also at local temperature. After one hour of incubation, was added 0,1ml of Tc-99m (3,7 MBq) in the form of sodium pertechnetate (99mNaTcO4), incubating for more 10 minutes. The samples were centrifuged (centrifugador Excelsa 2. Fab.: Fanem Ltda) at 1500 rpm for 5 minutes, in order to separate the fractions containg plasma (P) and cells (C), respectively. Aliquots of 20 µL of plasma and cells were used for the counting of radioactivity, calculating the percentage (%ATI). Aliquots of 20 µL of P e C were precipitated in 1 mL of trichloroacetic acid (TCA 5%), being centrifuged later (1500 rpm; 5 min.), isolating the soluble and insoluble fractions of plasma (SF-P; IF-P) and cell (SF-C; IF-C). It was also done in both of them the counting of radioactivity in the gamma counter (model DPC-Gambyt CR. Série: 95-3/1122), and later it was calculated at %ATI. Morphology cells To observe the effect of the proteic extracted on the morphology cells, were realized blood smears in microscope shades of the Ricinus communis extract in the concentrations of 0,0625 mg/mL and 0,125 mg/mL in contact with blood samples of Wistar rats, and in the control group, the blood was in touch with salt solution at 0,9% during one hour. The tests were realized three times. Blood smears were prepared, dried, fixed and staining. The morphology of the red blood cells was evaluated under optical microscope (x40). Statistic Analysis The results were analyzed by the T-student test. The differences were considered significant in the values where p≤0,05.
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RESULTS Osmotic Fragility in mice red blood cells with Ricinus communis. Figure 1 shows an osmotic fragility curve obtained after the mice’s red blood cells samples treatment with different concentrations of Ricinus communis (0,125 mg/mL; 0,0625 mg/mL; 0,0312 mg/mL). The analysis of the results indicate that there was a significant decrease, with p<0,05, in the hemolysis rate (%H) in the concentrations of 0,062 mg/mL and 0,031 mg/mL of the extract in comparison with the control group in the three concentrations of NaCl (0,4; 0,7 e 0,9%). In the hypotonic media (up to 0,4% NaCl) it’s observed an increase of this rate in the concentration of 125 mg/mL of the extract, while in the isotonic media (0,7 and 0,9% NaCl) there was a little decrease in the %H and then a stability of the hemolysis rate.
0
50
100
150
0.0 0.4 0.7 0.9
NaCl (%)
(%) H
emol
ysis Control
0,125 mg/mL0,062 mg/mL0,031 mg/mL
Fig.1 - Curve of Osmotic fragility in mice red
blood cells (RBC) after treatment with Ricinus communis L. The mean values are representative of tree similar experiments.
Labeling of Red Blood Cells with Technetium-99m. Figure 2 shows that the distribution of radioactivity in the red blood cells (RBC) and plasma (P), treated with solution of different concentrations of Ricinus communis. The analysis
of the results indicate that there is a significant decrease (p<0,05) of the radioactivity in the fractions of 25% (84.77%), 50% (64.87%), 100% (58.55%) of the extract in red blood cells while it has a significant increase in the ligation with plasma in the same fraction with 15.23%; 35.13%; 41.45% respectively.
0
50
100
150
0 6,25 12,5 25 50 100 Ricinus communis L. Extract
(%)
% o
f ligati
on
wit
h
Tc99
m RBCPL
Fig.2 - Effects of Ricinus communis extract in
fixation of Tc-99m on the plasma and red blood cells in water. The results are averages ± standard deviations with Test-T, *p<0,05.
In the Figure 3 we observe that the distribution of radioactivity in the insoluble fractions of the blood cells (IF-BC) and plasma (IF-P) in blood, treated with different concentrations of the solution of R. Communis and TCA at 5%. The analysis of he results indicate that there was a significant alteration (p<0,05). In the doses from 0% to 25% the ligation capacity of Tc99m remains unaltered after the precipitation with TCA, but it was verified that between the concentrations of 50% and 100% occurred a decrease of until 49,69% in the presence of TCA. However, observing the plasmatic fraction it was verified that the small doses remains unaltered, promoting an increase in the doses 50% and 100% of 49,69%. This shows that insoluble fractions of cells and plasma promote a specific ligation and maintains unaltered when compared with the graphic on Figure 2.
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0
20
40
60
80
100
0 50 100 150
% o
f lig
ati
on
wit
h T
c9
9m
IF-RBC
IF-P
Ricinus communis L . Extract (%)
*
***
Fig.3 - Effects of Ricinus communis extract in
fixation of Tc-99m on insoluble fraction. The results are averages ± standard deviations with Test-T, *p<0,05.
The morphology of red blood cells was evaluated under optical microscope. Figure 4 shows the histological preparation of RBC (control group – not treated) in contact with a physiological solution 0,9%, observing that the cells were discoid, anucleate and with normal aspect. In Figure 5, shows RBC treated with R. Communis 0,062 mg/mL, were we observed little morphological alterations in the cells, in comparison with the control group, with little hemolysis.
Fig.4 - Control group cells -. Blood smears were
as evaluated under optical microscope
Fig.5 -
optical microscope (x40).
agmentation, hemolysis and hemoagglutination.
(x40).
Blood smears were prepared, dried, fixed and staining. After that, the morphology of the red blood cells was evaluated under
Figure 6 shows the treatment realized in the concentration of 0,125 mg/mL of R. communis, presenting important the alterations of the cells morphology with the break of cells membrane,fr
Fig.6 - In the presence of the extract of Ricinus
communis L. (0,125 mg/mL), blood smears were prepared, dried, fixed and staining. After that, the morphology of the red blood cells was evaluated under optical microscope (x40).
prepared, dried, fixed and staining. After that, the morphology of the red blood cells
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RESUMO DISCUSSION
It was proved Ricinus communis L. to be a extremely toxic plant to animals and cells in growth in vitro (Koga et al., 1979; Zhou et al., 2003). Early studies show the action of synthetic and natural drugs, Thuya occidentallis, Tabacco, Cauliflower, Maytenus ilicifolia, Paullinea cupana and Coffee beans that interfere in the labeling of red blood cells with
Este trabalho apresenta estudos envolvendo a influência do extrato protéico de R. communis L., com potente atividade antitumoral na fragilidade osmótica, onde amostras de sangue de ratos Wistar foi incubado com concentrações de R. communis e com soluções de NaCl (0,4; 0,7; 0,9%), na marcação dos elementos sanguíneos, onde o sangue de rato foi tratado com solução de Tc-99m e TCA à 5%, determinando o percentual de radioatividade (%ATI) no plasma (P) e nas células vermelhas (BC). As frações solúvel e insolúvel do plasma também foram avaliadas, como também a morfologia das células. Os resultados indicam que a % hemólise aumentou na presença de 0,125 mg/mL do extrato, houve decréscimo de 49,69% na % ATI na fração insolúvel das células, ocorrendo alterações morfológicas das células sangüíneas. Esses resultados sugerem que o extrato altera a capacidade de ligação das células vermelhas devido à oxidação do íon estanoso, modificando as estruturas celulares.
99mTC (Oliveira et al., 1997; Vidal et al., 1998; Lima et al., 2002; Oliveira et al., 2000; Oliveira et al., 2002; Oliveira et al., 2003). The mechanism for the fixation of 99mTC in the blood cells consists in the ligation of the radioactive element in the hemoglobin by the β channel found in the cells membrane (Bernardo-Filho et al., 2005). Our results indicate that there was an increase in hemolysis tax in the concentration of 0,125 mg/mL and that there wasn’t any alteration in the labeling of red blood cells in the concentrations from 6,25% to 25% of the extract when compared to the rate of the control group. However, it was observed a decay of 49,69% in the concentration of 100%, verifying that in these concentrations occur morphologic alterations in the blood cells and the radioactivity in the insoluble fractions and in the plasma promote a reduction in the radioactivity. Some studies show that the toxin ricin an agglutination of the erythrocytes and precipitation of the serium proteins (Olsnes, 2004). The hydroalcoholic extract of Ricinus communis may alterate the labeling of red blood cells and IF-CB decreasing the fixation of the radioactivity in the blood cells. The results of this study suggest that the proteic extract of Ricinus communis promotes toxic effects, changing the ligation capacity of the red blood cells due to the stannous ion capacity of oxidation, direct inhibition (chelating action) referring to the ions competition for the ligation sites of the pertechnetate ion, modifying this way the cells structure.
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To Vitor Ferreira and Mariane for the English review and for the manuscript layout.
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ANEXO II
Trabalho intitulado de “Effect of Extract of Ricinus communis on the Morphology and Labeling of Red Blood
Cells with Technetium-99m” reconhecido como melhor pôster na seção de Farmácia Nuclear do V Scientific
Meeting of the Brazilian Society of Nuclear Biosciences, que foi realizado em Belo Horizonte, MG, no período
de 26 a 29 de outubro de 2005.
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