dissertação de mestrado caracterizaÇÃo biolÓgica
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Dissertação de Mestrado
CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICA, SOROLÓGICA E MOLECULAR DE
UM ISOLADO DE Squash mosaic virus, AVALIAÇÃO DE
INFECÇÕES MISTAS COM VÍRUS DO GÊNERO Potyvirus E
ANÁLISES COMPARATIVAS COM Cowpea severe mosaic virus
Fabiana Rodrigues da Silva
Recife – PE 2014
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL
DE PERNAMBUCO PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FITOPATOLOGIA
FABIANA RODRIGUES DA SILVA
CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICA, SOROLÓGICA E MOLECULAR DE UM
ISOLADO DE Squash mosaic virus, AVALIAÇÃO DE INFECÇÕES MISTAS COM
VÍRUS DO GÊNERO Potyvirus E ANÁLISES COMPARATIVAS COM Cowpea severe
mosaic virus
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Fitopatologia da Universidade Federal Rural de
Pernambuco, como parte dos requisitos para obtenção do
título de Mestre em Fitopatologia.
COMITÊ DE ORIENTAÇÃO:
Orientador: Gilvan Pio Ribeiro
Co-Orientador: José Albersio de Araújo Lima
RECIFE-PE
FEVEREIRO – 2014
Ficha catalográfica
S586c Silva, Fabiana Rodrigues da Caracterização biológica, sorológica e molecular de um isolado de squash mosaic virus, avaliação de infecções mistas com vírus do gênero potyvirus e análises comparativas com Cowpea severe mosaic virus / Fabiana Rodrigues da Silva. – Recife, 2014. 60 f. :il. Orientador: Gilvan Pio Ribeiro. Dissertação (Mestrado em Fitopatologia) – Universidade Federal Rural de Pernambuco. Departamento de Agronomia, Recife, 2014. Referências.
1. Infecção mista 2. IP-ELISA 3. Relacionamento Sorológico I. Ribeiro, Gilvan Pio, orientador II. Título CDD 632
CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICA, SOROLÓGICA E MOLECULAR DE UM
ISOLADO DE Squash mosaic virus, AVALIAÇÃO DE INFECÇÕES MISTAS COM
VÍRUS DO GÊNERO Potyvirus E ANÁLISES COMPARATIVAS COM Cowpea severe
mosaic virus
FABIANA RODRIGUES DA SILVA
Dissertação defendida e aprovada pela Banca Examinadora em: 25/02/2014
ORIENTADOR:
_____________________________________________________
Profº Dr. Gilvan Pio Ribeiro
EXAMINADORES:
_____________________________________________________
Profº Dr. José Albersio de Araújo Lima
_____________________________________________________
Profª Drª. Elineide Barbosa de Souza
_____________________________________________________
Dr. José Jaime Vasconcelos Cavalcanti
RECFE-PE
FEVEREIRO – 2014
“Tudo concorre para o bem daqueles que
servem a Deus”. Rm 8, 28.
A DEUS, primeiramente, e aos meus
tesouros, minha mãe (Zuila) e meu pai
(Costa Neto).
DEDICO
v
AGRADECIMENTOS
A DEUS, por ser tão fiel e presente em minha vida e a Nossa Senhora por me
guardar em seu manto sagrado.
À Universidade Federal Rural de Permanbuco pela oportunidade de concluir a
pós-graduação. Aos professores que fazem parte do curso pelos inúmeros ensimamentos.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
pela concessão da bolsa de estudo.
A querida Kátia Félix que me acolheu protamente em sua moradia.
A todos da turma de mestrado e em especial, Etiane Ferraz, Elizabethe Alexandre
e Nívia Teixeira, pela amizade e pela agradável convivência durante as disciplinas.
Ao Prof. PhD José Albersio de Araújo Lima, pela excelente orientação, pelos
inúmeros ensinamentos, confiança e por ceder o Laboratório de Virologia Vegetal da
Universidade Federal do Ceará (LabVV/UFC) para desenvolvimento da pesquisa.
Ao Prof. PhD Gilvan Pio Ribeiro pela orientação, ensinamentos, paciência,
confiança e por concordar em realizar a pesquisa no LabVV/UFC.
À equipe elite do LabVV/UFC: Ana Kelly (e a Maria Izabel, também), Aline
Kelly, Câmara, Fátima Gonçalves, Graziela Barbosa, Layanne Maia, Lainara Santos e Vicente
Thiago, pela amizade e pelos momentos de descontrações que fizeram os dias mais belos.
Ao meu amigo, companheiro e irmão Felipe Rodrigues pelo apoio e amor
incondicional.
Aos meus pais, irmão, sobrinha, cunhada, tios, tias, avó, primos por acreditarem e
confiarem tanto em mim.
Às amigas Carla, Cássia, Cecília, Emília, Jamille, Naiara, Rachel, Tatiana e
Zirlane pela amizade e apoio tão essencial em minha vida.
Enfim, a todos que de alguma forma participaram desse trabalho minha eterna
gratidão.
vi
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS________________________________________________ v
SUMÁRIO__________________________________________________________ vi
RESUMO GERAL___________________________________________________ vii
GENERAL ABSTRACT_______________________________________________ viii
Capítulo I – Introdução Geral__________________________________________ 2
1- FAMÍLIA BOTÂNICA Cucurbitaceae________________________________ 2
2-GÊNERO VIRAL Comovirus________________________________________ 5
3- ESPÉCIE VIRAL Squash mosaic virus________________________________ 7
4- ESPÉCIE VIRAL Cowpea severe mosaic virus__________________________ 11
5- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS_________________________________ 16
Capítulo II - Caracterização biológica, sorológica e molecular de um isolado de
Squash mosaic virus, avaliação de infecções mistas com vírus do gênero
Potyvirus e análises comparativas com Cowpea severe mosaic
virus__________________________________________________
28
RESUMO__________________________________________________________ 28
ABSTRACT________________________________________________________ 29
INTRODUÇÃO_____________________________________________________ 30
MATERIAL E MÉTODOS____________________________________________ 32
RESULTADOS E DISCUSSÃO________________________________________ 40
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS___________________________________ 45
Conclusões Gerais___________________________________________________ 59
vii
RESUMO GERAL
As medidas preventivas são as estratégias mais eficientes de controle das viroses das plantas.
Dentre os vírus do gênero Comovirus de importância para a agricultura brasileira, sobretudo
para o Nordeste, destacam-se o Squash mosaic virus (SqMV) para cucurbitáceas e o Cowpea
severe mosaic virus (CPSMV) para feijoeiro-caupi (Vigna unguiculata). O objetivo da
pesquisa foi avaliar as características sorológicas, biológicas e moleculares de um isolado de
SqMV-LabVV em comparação com dois isolados de CPSMV (CPSMV-MC e CPSMV-CE),
todos pertencentes ao banco ativo de vírus do Laboratório de Virologia Vegetal (LabVV) da
UFC. Testes sorológicos e moleculares mostraram que o isolado SqMV-LabVV estava puro
livre de contaminação com outros vírus. Produtos da RT-PCR do SqMV-LabVV
possibilitaram a obtenção de uma sequência de 1.143 nt correspondente ao gene da capa
protéica (cp). Estudos filogenéticos com a sequência da cp relevaram que SqMV-LabVV
pertence a um terceiro subgrupo do SqMV caracterizado por um novo isolado japonês.
Estudos de interação com vírus do gênero Potyvirus evidenciaram algum tipo de interferência
do SqMV-LabVV quando em infecção conjunta com espécies do gênero Potyvirus. Estudos
comparativos demonstraram que espécies da família Amaranthaceae foram as únicas
hospedeiras comuns aos SqMV-LabVV, CPSMV-MC e CPSMV-CE, embora com sintomas
de lesões localizadas. A imunização individual de coelhos com preparações purificadas de
SqMV-LabVV e de CPSMV-MC permitiu a produção de antissoros policlonais específicos.
Os antissoros obtidos apresentaram títulos de 1:40.000 para SqMV-LabVV e 1:20.000 para
CPSMV-MC enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA) - Plate Trapped Antigen ELISA
(PTA-ELISA) de 1:160.000 para SqMV-LabVV e 1:80.000 para CPSMV-MC em
imunoprecipitação em ELISA (IP-ELISA). Em dupla difusão em agar ambos os antissoros
apresentaram títulos de 1:1.024. Estudos do relacionamento sorológico entre SqMV-LabVV e
os isoladosde CPSMV contra seus antissoros homólogos e heterólogos em Dupla Difusão em
Agar demonstraram relacionamento unilateral entre os mesmos. Estudos filogenéticos da
região cp dos três isolados mostraram semelhança entre os dois isolados de CPSMV, os quais
se apresentaram diferentes do SqMV-LabVV.
Palavras-chave: Infecção mista, IP-ELISA, Relacionamento sorológico.
viii
GENERAL ABSTRACT
Preventive measures are the most efficient control strategies of plant viruses. Among the
viruses of the genus Comovirus of importance for Brazilian agriculture, especially in the
Northeast, we highlight the Squash mosaic virus (SqMV) for cucurbits and Cowpea severe
mosaic virus (CPSMV) for bean-cowpea (Vigna unguiculata). The present research had the
objective to evaluate some serological, biological and molecular properties of an isolate of
SqMV comparing them with the properties of two isolates of CPSMV (CPSMV-CE and
CPSMV-MC). These virus isolates belong to a live virus collection of the Plant Virus
Laboratory (LabVV) from the UFC. Serological and molecular studies showed that the
SqMV-LabVV isolate was free from other plant virus contamination, which should be
considered a pure SqMV isolate. A RT-PCR sequencing product obtained for part of SqMV-
LabVV RNA had 1,143 nt corresponding to part of the virus coat protein gene (cp).
Phylogenetic studies with the amplified RNA fragment indicated that SqMV-LabVV should
belong to a third subgroup of SqMV characterized by a new SqMV isolate from Japan.
Interaction studies in double infected plants demonstrated some kind of interferenceof SqMV-
LabVV with species from the genus Potyvirus. Biological studies indicated that species from
the Amaranthaceae family were the only common host to SqMV-LabVV, CPSMV-CE and
CPSMV-MC. Rabbits individually immunized with the purified preparations of SqMV-
LabVV and CPSMV-MC produced specific polyclonal antisera, confirming the efficience of
the purified method used for both viruses. The obtained antisera had titers of 1:40.000 for
SqMV-LabVV and 1:20.000 for CPSMV-MC in indirect enzyme linked immune absorbent
assay (ELISA), and of 1:160.000 for SqMV-LabVV and 1:80.000 for CPSMV-MC in
immune - precipitation ELISA (IP-ELISA). In agar double immune-diffusion both antisera
presented titles of 1:1.024. Serological studies in Double Diffusion between the virus isolates
against their homologous and heterologous antisera demonstrated a unilateral relationship
between SqMV-LabVV and CPSMV. Molecular characterization involving phylogenetic
analysis with the cp region from the three virus isolates showed close relationshid between the
CPSMV isolates, while SqMV-LabVV clustered in a separated branch not close to the
CPSMV isolates.
Key words: Mixed infection. IP-ELISA. Serological relationship
.
CAPÍTULO I
Introdução Geral
2
CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICA, SOROLÓGICA E MOLECULAR DE UM
ISOLADO DE Squash mosaic virus, AVALIAÇÃO DE INFECÇÕES MISTAS COM
VÍRUS DO GÊNERO Potyvirus E ANÁLISES COMPARATIVAS COM Cowpea severe
mosaic virus
INTRODUÇÃO GERAL
1- FAMÍLIA BOTÂNICA Cucurbitaceae
A família Cucurbitacea é considerada de grande importância agronômica por incluir
vegetais domesticados de interesse para a humanidade, cujos frutos entram na composição da
dieta da população. Algumas espécies embora consideradas silvestres são cultivadas e
possuem importância econômica para determinada finalidade (LIMA, 2010). Plantas da
família Cucurbitaceae são cultivadas em praticamente todo o mundo e estão distribuídas em
97 gêneros que possuem aproximadamente 950 espécies (SCHAEFER; RENNER, 2011).
As espécies de cucurbitáceas apresentam uma introdução histórica muito distinta. A
melancia (Citrullus lanatus Thunb Matsum & Nakai), por exemplo, foi introduzida no Brasil
pelos imigrantes europeus e japoneses, e escravos africanos, sendo que sua dispersão no
Nordeste brasileiro se deu pelos os índios Tapuias. Há três possíveis locais da origem da
melancia no Brasil, sendo um deles na Bahia, outro em Pernambuco e outro em São Paulo
(CORREA, 2010). Segundo Mohr (1986) a domesticação da cultura parece ter sido na África,
apesar da existência de relatos de cultivo em vários locais como Egito e em países Árabes. O
pepino (Cucumis sativus L.) chegou ao Brasil através da imigração dos europeus, mas teve
origem na Índia e no Sudeste Asiático. O maxixe (Cucumis anguria L.) teve origem na África
e foi introduzido no Brasil pelos escravos africanos (LOWER; EDWARDS, 1986). De origem
mexicana e de outros países americanos, as abóboras (Cucurbita ssp.) se tornaram
importantes para o Brasil e sua introdução se deu através dos índios que iam para o Norte e
Nordeste (PRIORI et al., 2010). Originários da África tropical, os melões (Cucumis melo L.)
se difundiram para a Ásia, Europa e outros continentes (BURGER et al.,2009), sendo que sua
introdução no Brasil ocorreu de diversas formas, provavelmente através de escravos africanos,
como se concluiu através da pintura de Albert Eckhout, que em meados de 1640 em Olinda e
Recife retratou, em uma de suas telas, um fruto de melão com ramos e flores. Outra forma
possível de introdução foi através dos imigrantes europeus, principalmente no Sul e Sudeste
do Brasil proporcionando a dispersão da cultura pelo país, a qual se tornou de grande
3
expressão econômica especialmente para o Nordeste brasileiro (QUEIRÓZ, 2011).
No Nordeste brasileiro as principais espécies cultivadas são: C. lanatus, Cucurbita
spp., Cucumis spp., chuchu (Sechium edule Jacq. Sw), cabaça (Lagenaria siceraria Molina
Standl) e bucha (Luffa cylindrica M. Roem.), sendo as duas últimas, normalmente cultivadas
em pequenos plantios ao redor das residências dos agricultores, no campo e até nas cidades
(QUEIRÓZ, 2001). Algumas espécies como abóboras, melão, pepino, melancia e chuchu são
cultivadas com objetivo de comercialização, enquanto outras espécies têm objetivos bem
específicos e são cultivadas em pequenas áreas para uso próprio dos agricultores, como
exemplo, o maxixe que é cultivado para o uso doméstico em saladas cozidas, a bucha é
cultivada objetivando o produto final que é a esponja biológica, a cabaça é cultivada para usos
diversos, como recipientes e instrumentos musicais (QUEIRÓZ, 2011). No caso de espécies
silvestres como o melão de São Caetano (Cucumis africanus Lindl.) é utilizada como planta
medicinal, o pepino indiano (Cucumis metuliferus E. Mey.) que possuem espículos nos frutos
e quando verdes são usados em saladas (QUEIRÓZ, 2011).
Meloeiro, melancia, pepino e abóbora representam cerca de 20% da produção total
de olerículas no mundo (MOREIRA, 2010). Cerca de 95,77% da produção nacional de melão
é oriunda da região Nordeste (FNP, 2010), sendo o Ceará e o Rio Grande do Norte
responsáveis por mais de 80% da sua produção nacional (IBGE, 2011). Entre os principais
municípios produtores destacam-se Mossoró e Açu no Rio Grande do Norte, e Baixo
Jaguaribe no Ceará, com produção anual de aproximadamente 180 mil toneladas, Vale São
Francisco na Bahia e em Pernambuco com produção anual média de 40 mil toneladas
(ARAÚJO; VILELA, 2003).
A abundância de luz solar, a temperatura elevada, o ar seco e os dias longos livres de
geadas são características climáticas que tornaram o Nordeste ideal ao cultivo de meloeiro e
das cucurbitáceas em geral. O excelente desenvolvimento da melancia e do meloeiro e o
aumento na produtividade são resultantes das características edafoclimáticas da região, que
contribuem também para o desenvolvimento de frutos mais saborosos e aromáticos, com
maior concentração de açúcares, polpa mais concentrada e de melhor conservação,
características importantes para a conservação pós-colheita e exportação (ANGELOTTI;
COSTA, 2010; REZENDE; DIAS; COSTA, 2010).
Um dos principais problemas das cucurbitáceas cultivadas em todo o mundo têm
sido as doenças causadas por vírus, sendo que pelo menos 25 espécies de vírus já foram
relatadas infetando naturalmente campos de produção de melão (OLIVEIRA et al., 2000;
4
RAMOS; LIMA; GONÇALVES, 2003). Dependendo das condições ambientais, da cultivar,
da espécie e estirpe do vírus as viroses podem reduzir a produtividade do meloeiro em índices
variando de 1 a 100% (RAVEN; EVERT; EICHHORN, 2001). No Nordeste brasileiro já
foram relatadas as ocorrências dos vírus pertencentes às seguintes famílias que infetam as
cucurbitáceas: família Potyriridae, gênero Potyvirus: Papaya ringspot virus, tipo Watermelon
(PRSV-W); Watermelon mosaic virus (WMV) e Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV);
família Bromoviridae, gênero Cucumovirus: Cucumber mosaic virus (CMV); família
Secoviridae, gênero Comovirus: Squash mosaic virus (SqMV) (LIMA et al., 2012a, 2012b;
LIMA; VIEIRA, 1992; MOURA et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2000; RABELO FILHO et
al., 2005) e um vírus responsável pelo amarelão do meloeiro, Moura et al. (2001) indicam a
possibilidade desse vírus pertencer a família Closteroviridae, gênero Crinivirus, embora
Nagata et al. (2003; 2005) ao analisarem preparações no microscópio eletrônico
demonstraram ser o agente causal um possível vírus da família Flexiviridae, gênero
Carlavirus.
Os problemas fitossanitários são os fatores que inibem a expansão da cultura e as
doenças de origem viral causam os maiores danos, podendo levar ao desaparecimento do
cultivo em determinada região, caso nenhuma forma de controle seja adotada (LIMA et al.,
1996). As viroses são relevantes não somente pelos danos severos na produção de
cucurbitáceas, como também pela ineficiência do uso do controle tradicional por defensivos
agrícolas e da ocorrência natural de infecções sistêmicas e disseminação eficiente dos vírus
por vetores biológicos (LIMA; SITTOLIN; LIMA, 2005; SILVEIRA et al., 2009). Em
condições naturais são observadas, com grande frequência, infecções mistas em
cucurbitáceas, fato que agrava a severidade das doenças causadas pelos vírus. Essas infecções
mistas tornam-se frequentes quando ambos os vírus são transmitidos pelos mesmos insetos
vetores, além disso, tornam impraticável a diagnose baseada em sintomas, pois causam
modificações na sintomatologia típica de virose, tornando-se necessário uma metodologia
com alta especificidade, sensibilidade e eficiente na detecção e identificação viral para que
medidas de controle adequadas possam ser recomendadas (BARBIERI et al., 2004).
Em razão das poucas informações quanto aos aspectos epidemiológicos e reação de
cultivares, poucas medidas têm sido recomendadas com relação ao controle dessas viroses.
Algumas recomendações adotadas como medidas de prevenção ou de controle indireto dos
vírus em cucurbitáceas incluem: aplicação de inseticidas durante a obtenção de mudas e no
início do desenvolvimento das plantas no campo para reduzir a população de vetores;
5
produção de mudas sadias sob telados à prova de insetos, eliminação de hospedeiros do vírus
e do vetor próximo ao local de produção (KUROZAWA; PAVAN; REZENDE, 2005). O
conhecimento do relacionamento entre estirpes virais proporciona indicativo quanto ao
manejo a ser adotado e ao possível surgimento de novas espécies de vírus, entretanto para o
entendimento da cadeia epidemiológica a informação sobre o mapeamento genético de vírus e
o mapeamento de populações tem sido considerado importante (GLASA et al., 2011).
2- GÊNERO VIRAL Comovirus
O gênero Comovirus pertence à subfamília Comovirinae, da família Secoviridae
composta por três gêneros, Comovirus, Fabavirus e Nepovirus, os quais possuem em comum
o genoma bipartido, cujos segmentos são encapsidados em partículas icosaédricos com cada
segmento do genoma produzindo uma poliproteína (KING et al., 2012). Dentre os três
gêneros o Comovirus destaca-se por incluir espécies amplamente estudadas e algumas delas
ocasionarem perdas relevantes em culturas de importância econômica e social para o Brasil,
incluindo o feijoeiro-caupi [Vigna ungiculata (L.) Walp.], meloeiro e soja (Glycina max
Merr.) (LIMA et al., 2011b, LIMA et al., 2012b; SOUTO et al., 2002).
A denominação do gênero Comovirus é originário do nome do seu membro tipo:
Cowpea mosaic virus (CPMV). Os membros desse gênero, que compreendem 15 espécies,
podem ser transmitidos por coleópteros e têm duas proteínas de revestimento de diferentes
tamanhos na sua capa protéica (KING et al., 2012). O genoma dos vírus do gênero Comovirus
é dividido em dois segmentos, possuindo, portanto dois RNAs de fita simples (ssRNA), senso
positivo, denominados RNA1 ou RNA-B (“bottom component”) e RNA2 ou RNA-M
(“middle component”) encapsidados separadamente. O vírus possui três partículas isométricas
distintas, com cerca de 30 nm de diâmetro e conteúdo genético diferente (T, M e B), com
coeficiente de sedimentação 57 S (T), 95 S (M) e 118 S (B) e massa molecular de 4.500 kDa
(T), 6.100 kDa (M) e 6.900 kDa (B).
A partícula T é desprovida de RNA e os ssRNAs das partículas M e B têm pesos
moleculares de aproximadamente 1.600 kDa (M) e 2.400 kDa (B), constituindo 26,8% e
34,8%, do peso da partícula, respectivamente (MURPHY et al., 1995). As partículas M e B
são responsáveis pela infectividade e patogenicidade do vírus. Os RNAs são encapsidados
separadamente para formar o vírus completo com as duas partículas e cada uma apresenta um
coeficiente de sedimentação específico (SUTIC; FORD; TOSIS, 1999). Ambos os RNAs são
necessários para a infecção sistêmica da planta hospedeira. Na replicação dos vírus do gênero
6
Comovirus os ssRNAs genômicos são transcritos resultando na síntese de duas poliproteínas
que são processadas por uma série de clivagens para formarem as proteínas funcionais. O
RNA1 codifica proteínas para a replicação e o RNA2 codifica proteínas para o movimento do
vírus de célula a célula, a longa distância (proteínas MP) e as proteínas do capsídeo. O RNA 1
possui um total de 5.889 nt e produz uma poliproteína de 202 kDa que é transformada em
peptídeos sendo eles responsáveis pela regulação do processamento (co-fator de protease),
nucleotídeo de ligação às proteínas com atividade de helicase, proteína ligada ao genoma e a
protease. O RNA2 possue um total de 3.481 nt e produz uma poliproteína de 105 kDa, a qual
é clivada para produção de peptídeos funcionais, que são responsáveis pelas proteínas
capsidiais grandes e pequenas e pelo movimento de células a célula (ASTIER et.al., 2007;
CAMPBELL, 1971; ZITTER; HOPKINS; THOMAS, 2004). Nesse gênero a proteína madura
mais conservada que é codificada pelo RNA 2 é a proteína maior da capa protéica (CP), e as
homologias de sequências dos seus aminoácidos são os critérios utilizados para a demarcação
das espécies (KING, 2012).
As espécies desse gênero são indexadas através de diversos métodos de diagnose de
vírus de planta que são também utilizados para a de outros gêneros. Os testes comumente
tilizados envolvem suas propriedades biológicas, morfológicas, sorológicas e moleculares
(LIMA; SITTOLIN; LIMA, 2005; LIMA et al., 2012a). Em termos gerais o método ideal é
aquele que proporciona resultados rápidos e confiáveis a um custo reduzido. Testes biológicos
são altamente precisos e de custo reduzido, porém o tempo necessário para o resultado é
longo (2-3 semanas). Ao contrário, os testes sorológicos e moleculares proporcionam
respostas rápidas (12-24 h) e precisas, embora a um custo mais elevado. A indexação por
técnicas sorológicas e moleculares depende da disponibilidade de recursos tecnológicos e
financeiros (LIMA et al., 2012a; ZERBINI; ZERBINI, 2007).
Para espécies do gênero Comovirus podem ser usados testes biológico, sorológicos e
moleculares (LIMA et al., 2012a; SILVA, 2011). Embora pouco usado, o teste biológico
através da gama de hospedeiros pode ser usado, uma vez que os mesmos possuem plantas
indicadoras e plantas que apresentam infecções sistêmicas. A gama de plantas hospedeiras
serve para identificar as plasntas hospedeiras do vírus e os sintomas induzidos pelo vírus em
cada hospedeiro de infecções locais e sistêmicas (LIMA; SITTOLIN; LIMA, 2005;
ZERBINI; ZERBINI, 2007). Diferenças na gama de hospedeiros podem distinguir não apenas
espécies de vírus, mas também estirpes da mesma espécie, permitindo a identificação de um
vírus desconhecido, através dos resultados do teste com as informações disponíveis na
7
literatura (LIMA; SITTOLIN; LIMA, 2005; ZERBINI; ZERBINI, 2007). O teste sorológico
mais comumente utilizado na diagnose de vírus de planta é o teste de “Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay” (ELISA) indireto devido sua facilidade, sensibilidade, rapidez e
possibilidade de testar grande número de amostras (ALMEIDA; LIMA, 2001; LIMA;
SITTOLIN; LIMA, 2005, LIMA et al., 2012a). Porém para algumas espécies desse gênero,
como o Cowpea severe mosaic virus (CPSMV) e o SqMV parece existir algumas dificuldades
na aderência das partículas do vírus ao fundo dos poços da placa de ELISA (LIMA et al.,
2012a). Por tal suspeita, Lima et al. (2011b) desenvolveram uma técnica denominada
Imunoprecipitação por PTA-ELISA (IP-PTA-ELISA), visando aumentar a sensibilidade do
teste de PTA-ELISA sem a necessidade de adicionar proteína A e objetivando uma
identificação segura sobretudo para CPSMV e SqMV (LIMA et al., 2011b; 2012a).
Outro técnica sorológica também utilizada é o teste de dupla difusão em agar
conhecida por teste de Outchterlony (LIMA et al., 2012b; OUTCHTERLONY, 1962), que
embora não muito sensível, ainda é bastante usado na avaliação dos títulos dos antissoros, na
indexação viral de rotina e em estudo do relacionamento sorológico de estirpes de um mesmo
vírus ou mesmo entre espécies de vírus de um mesmo grupo taxonômico (ALMEIDA; LIMA,
2001). Os vírus pertencentes ao gênero Comovirus podem ser facilmente purificados e
constituem bons antígenos para imunização de coelhos, produzindo com seus antissoros fortes
reações em meio de agar nas mais variadas condições (LIMA; AMARAL, 1985; LIMA;
NELSON, 1973).
Um dos testes moleculares mais usados para identificação e caracterização de
espécies desse gênero é a técnica de transcrição reversa e a reação em cadeia da polimerase
(RT-PCR) que é capaz de amplificar regiões correspondentes do gene do vírus de diversas
espécies, podendo ser aplicado para detecção simultânea de espécies distintas de vírus
(MALIOGKA et al., 2004).
3- ESPÉCIE VIRAL Squash mosaic virus
O Squash mosic virus (SqMV) é o agente causal do mosaico da abóbora e pertence
ao gênero Comovirus da família Secoviridae (KING et al., 2012). O mesmo foi identificado
pela primeira vez em 1916 (FREITAG, 1956) ocasionando mosaico em abóbora e em outras
espécies de cucurbitáceas, inclusive meloeiro. A primeira caracterização do SqMV foi no ano
de 1956, por Freitag (1956), envolvendo estudos sobre transmissão do vírus por semente,
estudo de gama de hospedeiros e propriedades do vírus como ponto de inativação térmica e
8
ponto máximo de diluição. Um fato de importância particular nos estudos de Freitag (1956)
foi a observação do SqMV não infetar melancia. Ausência da infecção do SqMV em melancia
foi durante muito tempo a principal forma utilizada para diferenciar o SqMV de outros vírus
que infetavam cucurbitáceas (NELSON; KNUHTSEN, 1973).
Os isolados de SqMV são classificados nos grupos SqMV-I e SqMV-II, com base em
suas propriedades sorológicas e biológicas. Isolados do grupo SqMV-I causam sintomas mais
severos no meloeiro e sintomas mais leves em abóbora. Enquanto que os do grupo SqMV-II
causam sintomas significativos em abobrinha (Cucurbita pepo L.) e sintomas fracos em
meloeiro (ZITTER; HOPKINS; THOMAS, 2004). Somente membros do grupo SqMV-I
infetam plantas de melancia (TERÃO et al., 2010). Essa classificação do SqMV em grupos foi
relatada por Nelson e Knuhtsen (1973) ao avaliarem seis variantes de SqMV quanto as suas
características biológicas, através da gama de hospedeiros em três espécies de cucurbitáceas,
incluindo abóbora, melão e melancia e assim dividiram os seis biótipos em dois grupos, que
foram distinguidos com base nas informações das reações sorológicas e biológicas. Os
estudos demonstraram, também, que os membros do grupo I causavam sintomas severos em
melão cantalupe e sintomas fracos em abóbora, enquanto que alguns membros do grupo II
infetavam melancia. Han et al. (2002) caracterizaram molecularmente um isolado do Japão e
propuseram que se tratava de um representante de um possível terceiro subgrupo do SqMV
devido sua distinção com os demais isolados dos Estados Unidos. Ling et al. (2011),
objetivando indexar SqMV independente do grupo a qual o isolado pertencia, desenvolveram
uma única metodologia capaz de detectar SqMV através da técnica de Real-time RT-PCR
(qRT-PCR). A disponibilidade de técnicas que permitam a indexação de SqMV de ambos os
grupos é de extrema importância para o monitoramento permanente dos campos de produção
e indexação de lotes de sementes (LIMA et al., 2012a, 2012b).
O SqMV pode ser transmitido por coleópteros e por sementes de plantas infetadas
(ASTIER et al., 2007; CAMPBELL, 1971; FREITAG, 1956; ZITTER; HOPKINS;
THOMAS, 2004). Foi inclusive devido a comprovação da transmissão por semente que o
SqMV foi outrora denominado por Mc Clintock (1916) de Cucumber mosaic virus (CMV)
atual membro do gênero Cucumovirus. No entanto, em razão do elevado índice de
transmissão por semente de pepino, é provável que Mc Clintock (1916) estava, na realidade,
trabalhando com um isolado de SqMV (NELSON; KNUHTSEN, 1973). A transmissão do
SqMV por vetores é feita por insetos da ordem Coleoptera, destacando-se como principais
vetores Acalymma spp. e Diabrotica spp. (FREITAG, 1956), existindo relatos da transmissão
9
por gafanhoto (STONER, 1963). Segundo Zitter; Hopkins e Thomas (2004) as espécies
Acalymma trivitattum e Diabrotica undecimpunctata Howardiadquirem o vírus em 5 min e
são capazes de manter o vírus durante 20 dias. Embora o vírus não se multiplique no vetor ele
pode ser recuperado a partir do produto da regurgitação, hemolinfa e fezes do inseto. A
transmissão do SqMV também pode ocorrer por sementes, apresentando uma taxa de
transmissão que varia de 0,4% a 10%, apesar de já ter sido relatadas maiores porcentagens
(ASTIER et al., 2007; ÁVILA; REIS, 2007; CAMPBELL, 1971; ZITTER; HOPKINS;
THOMAS, 2004). Grogan; Hall e Kimble (1959) afirmaram que cerca de 1% dos lotes de
sementes de abóbora, abobrinha e melão comerciais ou experimentais estavam infetadas com
SqMV. Porém há relatos de que a transmissão das estirpes do grupo SqMV-II ocorre somente
por sementes de abóbora e de forma experimental por inoculação mecânica (ASTIER et al.,
2007; ÁVILA; REIS, 2007; CAMPBELL, 1971; ZITTER; HOPKINS; THOMAS, 2004).
A ocorrência de seis biótipos de SqMV foi relatada nos Estados Unidos ocasionando
infecção em áreas produtoras de cucurbitáceas (NELSON; KNUHTSEN, 1973). No Japão,
Yoshida et al.(1980) avaliaram campos de produção de cucurbitáceas durante o período de
1970 a 1975, e identificaram índices recordes da infecção do SqMV nessas áreas. Apesar do
SqMV ter sido constado em índices reduzidos na China, pesquisas envolvendo estudos
moleculares têm sido bastante expressivos (HU et al., 1993, 2009). Coutts e Jones (2005)
avaliando a incidência e distribuição de vírus em culturas de cucurbitáceas durante os anos de
2003 e 2004 na Austrália, observaram uma elevada incidência de SqMV em algumas das
áreas produtoras avaliadas. No Brasil, o SqMV já foi constatado em praticamente todo o
Nordeste brasileiro, em especial nos estados do Ceará, Maranhão, Pernambuco, Piauí e Rio
Grande do Norte, onde o SqMV tem apresentado baixo índices de incidência (LIMA;
AMARAL, 1985; LIMA; VIEIRA, 1992; LIMA; VALE; OLIVEIRA, 1997; MOURA et al.,
2001; SILVA, 2011; SILVEIRA et al., 2009). Segundo Florindo e Lima (1993), o SqMV
provavelmente foi introduzido no estado do Rio Grande do Norte por intermédio de sementes
comerciais importadas. Halfeld-Vieira et al. (2004) avaliaram campos de cultivos de melancia
no Estado de Roraima no período de 2003 a 2004 e os resultados indicaram a ausência ou
inexistência do SqMV na região. Enquanto que no estado de Tocantins, Alencar et al. (2012)
observaram que 56% das amostras de abóbora e melancia coletadas em campos de produção
da região estavam infetadas com SqMV.
Os sintomas induzidos pelo SqMV em folhas jovens manifestam-se na forma de
mosaico bem característico e sob certas condições ambientais, as plantas infetadas podem
10
desenvolver enação foliar; paralisação do crescimento e produção de frutos mal formados e
manchados (ÁVILA; REIS, 2007; FLORINDO; LIMA, 1993; LIMA; AMARAL, 1985;
LIMA; VIEIRA, 1992; MOURA et al., 2001). As plantas infetadas geralmente apresentam
uma variedade de sintomas, como mosqueado, mosaico, bolhas, manchas e protuberâncias,
anel das nervuras na margem da folha (ÁVILA; REIS, 2007). Em determinadas condições
ambientais, plantas infetadas de algumas abóboras podem desenvolver salientes descamações
foliares e muitas vezes, as plantas produzem frutos malformados e manchados (ZITTER;
HOPKINS; THOMAS, 2004). Os sintomas causados por vírus e os graus de incidência no
campo variam em função da espécie de vírus e suas estirpes, espécie e variedade vegetal
cultivada, proximidade da fonte de inóculo e população dos vetores correspondentes
(MOURA et al., 2001). Evidências do aumento da severidade em relação a sintomas mais
severos desde o início da infecção foram constatadas em plantas de meloeiro, resultantes de
infecção simultânea do SqMV e vírus do gênero Potyvirus (SILVA, 2011). Os efeitos da
interação sinérgica entre vírus podem ser evidenciados experimentalmente na forma de
sintomas mais severos do que os observados nas plantas com infecções isoladas (SILVA,
2011). Infecções mistas ocorrem naturalmente acarretando alterações nos sintomas das
doenças, o que reflete diretamente na produtividade da cultura, principalmente quando se
verifica o efeito sinérgico entre os vírus. Por isso, como estratégias de controle e de
convivência com viroses não se deve considerar somente os vírus isoladamente, tendo em
vista que quando ocorrem simultaneamente em uma mesma planta, podem causar danos
maiores que são resultantes de sintomas mais severos (OLIVEIRA et al., 2000; RAMOS;
LIMA; GONÇALVES, 2003; SILVEIRA et al., 2009). O SqMV possui uma gama de plantas
hospedeiras limitada a espécies de cucurbitáceas e de forma experimental a algumas espécies
de gêneros das famílias Leguminosae, Umbeliferae e Hydrophyllaceae (ASTIER et al., 2007;
ÁVILA; REIS, 2007; CAMPBELL, 1971; FREITAG, 1956; ZITTER; HOPKINS; THOMAS,
2004). Como a distribuição de vírus no campo está diretamente associada com a presença do
vetor em índices elevados, o uso de defensivos agrícolas nos campos de produção de meloeiro
e de melancia, possivelmente, mantém as populações dos coleópteros vetores do SqMV sob
controle, reduzindo a eficiência na disseminação do vírus dentro do campo de cultivo
(ÁVILA; REIS, 2007; FLORINDO; LIMA, 1993; LIMA; AMARAL, 1985; LIMA; VIEIRA,
1992; MOURA et al., 2001; SILVA, 2011).
Para um manejo eficaz da doença indica-se o uso de sementes livres de vírus, uso de
cultivares resistentes, erradicação das fontes iniciais de vírus no campo e controle dos vetores
através de pulverizações com inseticidas de contato ou de ingestão a fim de eliminar
11
coleópteros vetores do vírus (LIMA et al., 2012b). No entanto, para o estabelecimento de
estratégias de manejo das doenças infecciosas, sobretudo das viroses, é imprescindível uma
prévia e segura identificação do agente causal e suas formas de sobrevivência e disseminação
(LIMA; SITTOLIN; LIMA, 2005). Para o SqMV existem diversas maneiras disponíveis para
sua indexação, incluindo técnicas sorológicas e moleculares como técnica RT-qPCR, Kits de
ELISA. Em caso de maior independência pode-se realizar a produção de antissoro, a partir da
purificação química do vírus, existindo roteiros eficientes já desenvolvidos para purificação
do SqMV (LIMA; AMARAL, 1985).
4- ESPÉCIE VIRAL Cowpea severe mosaic virus
Cowpea severe mosaic virus (CPSMV) é o agente causal do mosaico severo do
caupi, pertence ao gênero Comovirus da família Secoviridae (KING et al.,2012). O CPSMV
foi descrito pela primeira vez por Smith (1924) e durante muito tempo foi considerado uma
estirpe do Cowpea mosaic virus (CPMV), a espécie padrão do gênero Comovirus
(AGRAWAL, 1964; KAMMEN, 1971; SWAANS; KAMMEN, 1973).
A distribuição geográfica do CPSMV inclui os países Estados Unidos, Trinidad,
Porto Rico, El Salvador, Venezuela, Costa Rica, Suriname, Peru e Brasil (CAMARÇO et al.,
2009; LIMA; SITTOLIN; LIMA, 2005; PIO-RIBEIRO et al.,2005). No Brasil, o CPSMV foi
primeiramente relatado no Rio Grande do Sul e desde então a presença do vírus tem sido
registrada em todas as regiões do território nacional onde o feijoeiro-caupi é cultivado
(COSTA et al., 1978; KITAJIMA et al., 1984; LIMA; SANTOS; SILVEIRA, 1986a, 2012c;
LIMA; NELSON, 1977; LIMA; SITTOLIN; LIMA, 2005; LIN; KITAJIMA; RIOS,1981). As
doenças de etiologia viral têm sido consideradas como um dos principais problemas para a
produção do feijoeiro-caupi, tendo em vista que a cultura é considerada importante para a
subsistência de pequenos agricultores e também para grandes produtores (LIMA et al., 2003,
2011a, LIMA; SITTOLIN; LIMA, 2005). Levantamentos efetuados por Lima e Nelson (1973)
mostraram o CPSMV como sendo o vírus mais prevalecente sobre o feijoeiro-caupi no Ceará,
na década de 1970.
Dentre os vírus que infetam a cultura do feijoeiro-caupi o CPSMV vem sendo
considerado um dos mais importantes, devido sua infecção natural (LIMA et al.,2012c). Lima
e Nelson (1973) caracterizaram o primeiro isolado obtido no Ceará que foi designado de
CPSMV-CE. Vários outros isolados também foram caracterizados no Laboratório de
Virologia Vegetal-UFC, porém o isolado denominado CPSMV-Macaibo (CPSMV-MC) que
12
possuia propriedade de infetar a cultivar Maicabo do feijoeiro-caupi imune a todos os demais
isolados já descritos no Brasil, a qual foi utilizada em programas de melhoramento para
produção de variedades resistentes ao CPSMV (LIMA et al., 2012c). Estudos realizados por
Lima et al. (2012c) mostraram a estabilidade biológica, genética e molecular do CPSMV-MC
por mais de 20 anos. A herança imune ao CPSMV-MC esta associada a um gene de
resistência recessivo (VALE; LIMA, 1995; ASSUNÇÃO et al.,2005).
O CPSMV é transmitido de forma natural por insetos vetores da ordem Coleoptera,
existindo mais de dez espécies do gênero Ceratoma capaz de transmitir isolados do vírus
(LIMA; SITTOLIN; LIMA, 2005). A transmissão experimental através do processo artificial
de inoculação mecânica é eficientemente. No Brasil, C. arcuata constituí, possivelmente, o
principal vetor do vírus no campo (COSTA et al., 1978). De forma experimental, em casa de
vegetação, Lima e Gonçalves (1980) comprovaram que o manhoso, Chalcodermus
bimaculatus, importante praga da vagem do feijão-caupi foi capaz de transmitir CPSMV a
partir de plantas infetadas para plantas sadias. O CPSMV é transmitido por sementes e Dale
(1949) relatou a transmissão do vírus para sementes de feião aspargo [Vigna unguiculata
sesquipedalis (L.) Verd.], Shepherd (1964) relatou que o isolado Arkansas do CPSMV foi
transmitido por sementes de feijoeiro-caupi; Haque e Persad (1975) encontraram a presença
do vírus em 3,3 a 5,8% de sementes de feijoeiro-caupi. Porém, diversas pesquisas já foram
realizadas no Nordeste brasileiro e mais de 15.000 sementes provenientes de plantas de
diferentes cultivares infetadas com CPSMV, manifestaram a ausência de transmissão do vírus
nas sementes, cujos resultados foram confirmados mediantes testes sorológicos com
antissoros específicos para isolados do CPSMV (ASSIS FILHO et al.,1992; LIMA et al.,
1989; LIMA; SILVEIRA, 1986b). Em outras partes do Brasil e em outros países latino-
americanos resultados semelhantes foram obtidos (GAMEZ; MORENO, 1983; SANTOS,
1986). A larga dispersão do vírus nas áreas produtoras de feijão-caupi pode ser explicada pela
quantidade de fontes de inóculo fora da cultura, a maioria constituída de hospedeira silvestre
(ALCONERO; SANTIAGO, 1973; LIMA; NELSON, 1977).
As plantas de feijoeiro-caupi infetadas com CPSMV exibem sintomas de
clareamento de nervuras, bolhosidade e mosaico severo nas folhas (LIN et al., 1981; PIO-
RIBEIRO et al., 2005; LIMA; SITTOLIN; LIMA, 2005). Também é comum observar a
redução do crescimento dos entre-nos o que consequentemente ocasionará redução da
produtividade e do crescimento da planta, podendo acontecer da planta não chegar a sua fase
produtiva (NECHET; HALFEL-VIEIRA, 2006). Porém o quadro sintomatológico é variável
13
em função da estirpe do vírus, da cultivar plantada, da época do plantio, da fonte de inóculo,
da fase da cultura em que ocorra a infecção. Dependendo dos fatores citados os danos
causados pelo CPSMV podem ser significativos (LIMA; SITTOLIN; LIMA, 2005; PIO-
RIBEIRO et al., 2005). A severidade dos sintomas externos difere com a cultivar,
apresentando reações que vão desde a imunidade à alta suscetibilidade, portanto dependendo
da severidade dos sintomas, os danos na produção são bastante significativos podendo reduzir
a produtividade em até 81% (GONÇALVES; LIMA, 1982, 1988; GONÇALVES, 1983;
LIMA; SITTIOLIN; LIMA, 2005). Desta forma, se a doença surge mais cedo, a tendência é
que o vírus cause mais danos e haja maior redução da produtividade da lavoura, estando a
redução da produtividade fortemente associada com a redução da área fotossintética das
folhas, resultado do ataque do vírus que leva também à redução dos teores de clorofila nos
tecidos foliares (GONÇALVES;LIMA, 1982; LIMA; SITIOLIN; LIMA, 2005). De forma
semelhante ao SqMV que possui gama de hospedeiros restrita a família Curcubitaceae, a
gama de hospedeiras do CPSMV esta restrita a famílias botânicas específicas que inclui a
Fabaceae com destaque para as seguintes espécies já confirmadas como hospdeiras naturais
de isolados do vírus: Calopogonium mucunoides Desvaux, Crotalaria juncea L., Phaseolus
vulgaris L., Psophocarpus tetragonolobus (L.) DC., Vigna radiata (L.) Walp. e V.
unguiculata (L.) Walp. subsp. Sesquipadalis (L.) Verdc. As hospedeiras naturais do CPSMV
devem desempenhar importante papel na sobrevivência e epidemiologia do vírus,
funcionando como reservatórios naturais do mesmo, durante os períodos de estiagem,
considerando a não transmissibilidade do CPSMV por sementes de feijoeiro-caupi (ASSIS
FILHO et al., 1992; LIMA et al., 2005, 2011a; LIMA; SITIOLIN; LIMA, 2005). Além da
gama de hospedeiros de infecção sistêmica, o CPSMV também possui uma gama de
hospedeiros que causam infecções localizadas nas folhas inoculadas, cujas espécies podem ser
usadas como excelentes plantas indicadoras: Canavalia ensiformis D.C., Chenopodium album
L., C. amaranticolor Coste & Reyn, C. quinoa (L.) DC., Gomphrena globosa L., Datura
stramonium L., P. vulgaris cvs Pinto, Scotia e algumas cultivares do próprio feijoeiro-caupi
(ASSIS FILHO et al., 1992; LIMA et al., 2005, 2011a; LIMA; SITIOLIN; LIMA, 2005).
Para o manejo de doenças, sobretudo as de etiologia viral recomendam-se medidas
que objetivam a redução ou eliminação total de fontes de inóculo dentro e fora dos plantios,
medidas para evitar a transmissão através de vetores e minimizar os efeitos das infecções na
produtividade das culturas. No entanto, uma das formas mais efetiva de controlar viroses do
feijoeiro-caupi tem sido, universalmente, o desenvolvimento de genótipos resistentes às
infecções virais, e quanto maior o número de genótipos identificados como fontes de
14
resistência aos vírus, melhores serão as alternativas para os melhoristas desenvolverem novas
cultivares resistentes (ANDERSON et al., 1996; ASSUNÇÃO et al., 2005; HAMPTON et al.,
1997; VALE; LIMA, 1995). Lima et al. (2011a) avaliando a resistência simples e múltipla de
genótipos do feijoeiro-caupi ao CPSMV observaram que os genótipos: TE 97 299 G10, TE 97
299 G13,TE 97 299 G24, TE 97 309 G9, TE 97 299, TE 97 299 G14 e TE97 299 G15 se
mostraram imunes ao CPSMV. A utilização de cultivares resistentes constitui a forma de
controle de vírus mais eficientes e duradoura (LIMA et al., 2011a). Apesar das controversas
quanto a transmissão do CPSMV por sementes é importante o uso de sementes certificadas,
pois as sementes funcionam como importantes veículos de disseminação de agentes
causadores de doenças e de outras espécies de vírus, incluindo CMV e Cowpea aphid-borne
mosaic virus (CABMV) (HAMPTON et al., 1997; LIMA et al., 2003; 2005; PHATAK, 1974;
SILVEIRA; LIMA; ASSUNÇÃO,1988; SHEPHERD, 1972). O controle do inseto vetor
através do uso de defensivos químicos é eficiente para o CPSMV devido à forma de
transmissão do tipo persistente (LIMA; SITTIOLIN; LIMA, 2005). Em razão da gama de
hospedeiros silvestres do CPSMV a erradicação de fontes de vírus nas proximidades ou
dentro do campo de produção pode contribuir para reduzir os graus de incidência do vírus no
campo. Outra importante forma de redução de fontes naturais de vírus é a prática do
“roguing”, ou seja, eliminação das plantas infetadas dentro do próprio cultivo, cuja prática
quando adotada no desenvolvimento inicial do cultivo é bastante eficiente, por reduzir o
número de plantas como fontes de inóculo para disseminação secundária do vírus (LIMA;
SITTIOLIN; LIMA, 2005)
Diante do exposto a presente pesquisa teve por objetivo estudar as características
sorológicas, biológicas e moleculares de um isolado de SqMV do Banco Ativo de Vírus do
Laboratório de Virologia Vegetal da UFC (SqMV-LabVV), avaliando seu possível relacionamento
sorológico, biológico e molecular com isolados de CPSMV (CPSMV-CE e CPSMV-MC). Estudos
comparativos de técnicas sorológicas e moleculares foram, também, desenvolvidos visando definir
formas eficientes de indexação dos isolados virais, em razão da existência de algum tipo de
dificuldade na aderência das partículas de SqMV e de CPSMV ao fundo dos poços da placa de
ELISA.
15
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26
CAPÍTULO II
CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICA, SOROLÓGICA E MOLECULAR DE UM
ISOLADO DE Squash mosaic virus, AVALIAÇÃO DE INFECÇÕES MISTAS COM
VÍRUS DO GÊNERO Potyvirus E ANÁLISES COMPARATIVAS COM Cowpea severe
mosaic virus
27
CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICA, SOROLÓGICA E MOLECULAR DE UM
ISOLADO DE Squash mosaic virus, AVALIAÇÃO DE INFECÇÕES MISTAS COM
VÍRUS DO GÊNERO Potyvirus E ANÁLISES COMPARATIVAS COM Cowpea severe
mosaic virus
Fabiana Rodrigues da Silva1, 2a
, Ana Kelly Firmino da Silva2 a
, José Albersio de Araújo Lima2a
,
Cristiano Sousa Lima2b
, Aline Kelly Queiroz do Nascimento2a
e Gilvan Pio-Ribeiro1
1Departamento de Agronomia/Fitossanidade, Universidade Federal Rural de Pernambuco-
UFRPE, 52171-900, Recife- PE; 2 Departamento de Fitotecnia, Laboratório de Virologia
Vegetala,Laboratório de Micologia
b, Universidade Federal do Ceará, 60451-970, Fortaleza-
CE.
Autor para correspondência: J.Albersio A.Lima e-mail: [email protected]
RESUMO- O objetivo da pesquisa foi avaliar as características sorológicas, biológicas e
moleculares de um isolado de Squash mosaic virus (SqMV-LabVV) em comparação com dois
isolados de Cowpea severe mosaic virus (CPSMV: CPSMV-MC e CPSMV-CE) pertencentes ao
banco ativo de vírus do Laboratório de Virologia Vegetal (LabVV) da UFC. O sequenciamento dos
produtos da RT-PCR do SqMV-LabVV possibilitou a obtenção de uma sequência de 1.143 nt
correspondente a região do gene da capa protéica (cp). Estudos filogenéticos relevaram que o
isolado estudado pertence a um possível terceiro subgrupo do SqMV. Estudos de interação
demonstraram interferência na infecção mista do SqMV-LabVV com vírus dos gêneros Potyvirus e
Cucumovirus. Espécies da família Amaranthaceae foram as únicas hospedeiras comuns aos três
isolados em estudos comparativos de gama de hospedeiros. Imunizações individuais de coelhos
com as preparações purificadas de SqMV-LabVV e de CPSMV-MC permitiram a produção de
antissoros policlonais específicos. Os antissoros produzidos apresentaram títulos de 1:40.000 para o
SqMV-LabVV e 1:20.000 para o CPSMV-MC quando avaliados por enzyme-linked immuno
sorbent assay (ELISA) - Plate Trapped Antigen ELISA (PTA-ELISA) e 1:160.000 para o SqMV-
LabVV e 1:80.000 para o CPSMV-MC em immune-precipitation ELISA (IP-PTA-ELISA),
enquanto os títulos em Dupla Difusão em Agar foi de apenas 1:1.024 para ambos os isolados.
Estudos do relacionamento sorológico entre SqMV-LabVV e os dois isolados de CPSMV contra
seus antissoros homólogos e heterólogos em Dupla Difusão em Agar demonstraram relacionamento
unilateral entre os mesmos. A caracterização molecular comparativa a partir do estudo filogenético
28
da região da CP dos três isolados mostrou que CPSMV-CE e CPSMV-MC ficaram próximos entre
si e distantes de SqMV-LabVV.
Palavras-chave: Infecção mista. IP-PTA-ELISA. Relacionamento sorológico.
ABSTRACT-The present research had the objective to evaluate some serological, biological and
molecular properties of an isolate of Squash mosaic virus (SqMV) comparing them with the
properties of two isolates of Cowpea severe mosaic virus (CPSMV: CPSMV-CE and CPSMV-MC).
All these virus isolates belong to a live virus collection from the Plant Virus Laboratory (LabVV)
from the UFC. Serological and molecular studies showed that the SqMV-LabVV isolate was free
from other plant virus contamination, which should be considered a pure SqMV isolate. A RT-PCR
sequencing product obtained for part of SqMV-LabVV RNA had 1,143 nt corresponding to part of
the virus coat protein gene (cp). Phylogenetic studies with the amplified RNA fragment indicated
that SqMV-LabVV should belong to a third subgroup of SqMV characterized by a new SqMV
isolate from Japan. Interaction studies in double infected plants demonstrated some kind of
interference of SqMV-LabVV with species from the genus Potyvirus. Biological studies indicated
that species from the Amaranthaceae family were the only common host to SqMV-LabVV,
CPSMV-CE and CPSMV-MC. Rabbits individually immunized with the purified preparations of
SqMV-LabVV and CPSMV-MC produced specific polyclonal antisera, confirming the efficience of
the purified method used for both viruses. The obtained antisera had titers of 1:40.000 for SqMV-
LabVV and 1:20.000 for CPSMV-MC in indirect enzyme-linked immuno absorbent assay (ELISA),
and of 1:160.000 for SqMV-LabVV and 1:80.000 for CPSMV-MC in immune - precipitation
ELISA (IP-ELISA). In agar double immune-diffusion both antisera presented titles of 1:1.024.
Serological studies in Double Diffusion between the virus isolates against their homologous and
heterologous antisera demonstrated a unilateral relationship between SqMV-LabVV and CPSMV.
Molecular characterization involving phylogenetic analysis with the cp region from the three virus
isolates showed close relationshid between the CPSMV isolates, while SqMV-LabVV clustered in a
separated branch not close to the CPSMV isolates.
29
INTRODUÇÃO
Mais de dez espécies de vírus já foram constatadas infetando naturalmente diferentes
espécies de cucurbitáceas no Brasil e no Nordeste brasileiro já foram relatadas as seguintes espécies:
um vírus responsável pelo amarelão do meloeiro possivelmente pertencente ao gênero Crinivirus da
família Closteroviridae (MOURA et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2000), embora Nagata et al. (2003;
2005) considerarem ser o agente causal um vírus pertencente ao gênero Carlavirus da família
Flexiviridae; Papaya ringspot virus, tipo Watermelon (PRSV-W), Watermelon mosaic virus (WMV)
e Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) do gênero Potyvirus, família Potyviridae; Cucumber mosaic
virus (CMV) do gênero Cucumovirus, família Bromoviridae e o Squash mosaic virus (SqMV) do
gênero Comovirus subfamília Comovirinae, família Secoviridae: O SqMV já foi constatado nos
estados do Ceará, Maranhão, Piauí e Rio Grande do Norte (LIMA et al., 2012a, 2012b; LIMA;
VIEIRA, 1992; MOURA et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2000; RABELO FILHO et al., 2005).
O gênero Comovirus pertence a subfamília Comovirinae da família Secoviridae a qual é
composta por três gêneros, Comovirus, Fabavirus e Nepovirus. As espécies dos três gêneros
possuem em comum o genoma bipartido, com os segmentos genômicos encapsidados em partículas
icosaédricas, sendo cada segmento do genoma responsável pela produção de uma poliproteína
(KING et al., 2012). O Comovirus destaca-se por incluir espécies amplamente estudadas e algumas
delas serem responsáveis por perdas relevantes em culturas de importância econômica e social para
o Brasil, incluindo o feijoeiro-caupi (Vigna ungiculata subespécie unguiculata Walp.), meloeiro
(Cucumis melo L.), soja (Glycina max (L.) Merr.) (LIMA et al.,2011; LIMA et al. 2012b; SOUTO
et al., 2002). Dentre os problemas fitossanitários causados por diferentes agentes biológicos, os de
natureza viral ocasionam danos severos na produção do meloeiro, sobretudo pela inexistência de
medidas tradicionais de controle por defensivos agrícolas, com o agravante de resultarem em
infecções sistêmicas e os vírus serem disseminados por vetores biológicos eficientes (LIMA et al.,
2012a; 2012b; LIMA; SITTOLIN; LIMA, 2005; SILVEIRA et al., 2009).
O SqMV tem sido pouco estudado no Brasil, pois as vezes é considerado de menor
importância entre os que infetam as cucurbitáceas no país. No entanto, em razão da importância
econômica das espécies de cucurbitáceas cultivadas, não somente no Nordeste brasileiro como no
mundo e em razão dos crescentes problemas fitossanitários resultantes de mutações de fitopatógenos,
sobretudo vírus de genoma dividido, todo estudo envolvendo agentes biológicos que possam afetar a
produtividade das espécies desta família é de extrema importância (LIMA et al., 2012a, 2012b).
30
No Brasil, em especial no Nordeste, o Cowpea severe mosaic virus (CPSMV) merece
destaque pelo seu grau de severidade e ocorrência em feijoeiro-caupi importante cultura, que
apresenta alto valor econômico e social na região. Seu primeiro relato no Brasil foi em 1947 e, a
partir de então sua distribuição alcançou todas as regiões produtoras dessa leguminosa no país
(LIMA; SITTOLIN; LIMA, 2005). Segundo Camarço et al. (2009) o CPSMV é o único vírus
pertencente ao gênero Comovirus já identificado no Brasil infetando o feijoeiro-caupi.
A presente pesquisa teve por objetivo estudar as características sorológicas, biológicas e
moleculares de um isolado de SqMV do Banco Ativo de Virus do Laboratório de Virologia Vegetal
da UFC (SqMV-LabVV), avaliando seu possível relacionamento sorológico, biológico e molecular
com isolados de CPSMV (CPSMV-CE e CPSMV-MC). Estudos comparativos de técnicas
sorológicas e moleculares foram, também, desenvolvidos visando definir formas eficientes de
diagnose dos isolados virais, em razão da existência de algum tipo de dificuldade na aderência das
partículas de SqMV e de CPSMV ao fundo dos poços da placa de ELISA.
MATERIAL E MÉTODOS
Caracterização Sorológica do Isolado de Squash mosaic virus
O isolado viral usado na presente pesquisa pertence ao banco ativo de vírus do
Laboratório de Virologia Vegetal (LabVV) da Universidade Federal do Ceará (UFC).Para
confirmação da identidade e do grau de pureza do isolado de SqMV-LabVV, amostras coletadas de
plantas de meloeiro mantidas em casa de vegetação foram testadas por imunoprecipitação (IP) do
vírus seguida de Plate Trapped Antigen (PTA) Enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA) (IP-
PTA-ELISA), segundo metodologia desenvolvida por Lima et al. (2011a), utilizando antissoro
policlonal específico contra SqMV. Complementarmente, as amostras foram testadas por Difusão
Dupla em Agar contra antissoro para SqMV. Visando confirmar a ausência de infecção das
amostras com outros vírus que também infetam cucurbitáceas no Nordeste brasileiro, as amostras
foliares foram avaliadas por PTA-ELISA (ALMEIDA; LIMA, 2001; LIMA et al., 2012a, 2012b),
utilizando antissoros policlonais pertencente à soroteca do LabVV contra CMV, PRSV-W, WMV e
ZYMV. Nos testes de imunoprecipitação foram utilizados como controle positivo e negativo plantas
infetadas com SqMV, CMV, PRSV-W, WMV e ZYMV e plantas sadias. Da mesma forma, nos
testes para os demais vírus foram sempre usados homólogos constituídos de amostras frescas de
plantas infetadas mantidas em casa de vegetação e extratos de plantas reconhecidamente sadias
como controle negativo.
31
Para os testes de IP-PTA-ELISA foram usadas alíquotas de 1,0 g de cada folha, as quais
foram maceradas na proporção 1:10 (p/v) em tampão carbonato pH 9,6. Um total de 0,5 mL do
extrato foi misturado com 1,0 mL do antissoro para SqMV previamente absorvido com extrato de
folhas de meloeiro sadio, na diluição de 1:100 em tampão do antissoro (0,5 M de polivenil
pirrolidona, 2% de ovoalbumina, 0,003 M de azida de sódio, 0,17 de dietilditiocarbamato). A
mistura foi incubada durante 3 h a 37 °C e centrifugada a 5.000 g durante 10 min. O sobrenadante
foi descartado e o precipitado foi ressuspendido em tampão carbonato pH 9,6 seguindo com o teste
de PTA-ELISA (LIMA et al., 2012a). No teste de ELISA indireto ou PTA-ELISA, poços das placas
foram cobertos com 100 mL de extratos das folhas infetadas (controle positivo), folhas sadias
(controle negativo) e das folhas das amostras avaliadas. Em seguida as placas foram incubadas a 37
oC em estufa seca e de agitação lenta constante durante 1 h. Após três lavagens com tampão PBS-
Tween, foi adicionado 100 mL do antissoro correspondente para SqMV, CMV, PRSV-W, WMV ou
ZYMV diluídos 1:1.000, previamente absorvidos com extrato de tecido sadio 1:20. Após incubação
a 37 oC durante 1 h na estufa a seco, foram efetuadas mais três lavagens com PBS-Tween e
adicionados 100 mL de IgG de cabra anti-IgG de coelho, conjugada à fosfatase alcalina, diluída na
proporção 1:2.000 em tampão contendo 2% de polivinil pirrolidona, 0,2% de ovalbumina e 0,02%
de azida de sódio. As placas foram novamente incubadas a 37 oC por 1 h e, em seguida, lavadas três
vezes com PBS-Tween. Finalmente, foram adicionados 100 mL do substrato p-nitrofenil fosfato na
concentração 0,5 mg/mL, dissolvido em tampão contendo 12% de dietanolamina e 0,25% de azida
de sódio, pH 9,8. Decorridos 45 min, as leituras das placas foram realizadas no aparelho
Labsystems Multiskan MS, utilizando-se o comprimento de onda 405 nm. Foram consideradas
positivas as amostras cujos valores de absorbância correspondiam a duas vezes e meia as médias
dos valores registrados para os extratos de plantas sadias usadas como controle negativo, seguindo o
critério adotado para as análises no LabVV (ALMEIDA; LIMA, 2001; LIMA et al., 2012a).
Caracterização Molecular do Isolado de Squash mosaic virus
Para a caracterização molecular do isolado de SqMV-LabVV foi, inicialmente,
efetuada a extração total de RNA de plantas sistemicamente infetadas e o RNA total extraído
foi realizado a sua transcrição reversa e, em seguida, o cDNA obtido foi submetido a reação
em cadeia da polimerase (PCR). Foi feito também a transcrição reversa, seguido de reação em
cadeia da polimerase em tempo real (RT-qPCR) do RNA total.
32
a) Extração de RNA Total e Transcrição Reversa – Reação em Cadeia da Polimerase (RT-
PCR)
As extrações de RNA total de folhas de plantas de meloeiro infetadas com SqMV
mantidas em casa de vegetação e de plantas sadias usadas como controle negativo foram realizadas
utilizando o kit Promega, seguindo o protocolo sugerido pelo fabricante Promega ® Madison, USA.
Em seguida foi realizado a RT-PCR, utilizando dois pares de primers específicos com as seguintes
sequências: SqMV-R1 (5-‟GGA AAG AAG CCA CAAA C-3‟) e SqMV-F1 (5‟ TTT GAC GGC
ATG GTC 3‟), SqMV- R2 (5‟-CTG CCC AGA AAT TCC TAG CA-3‟) e SqMV-F2 (5‟ GAC
TAG AAC ACC GCT TAC-3‟) selecionados da região conservada do gene da CP (cp) do SqMV
nas concentrações de 10 μ moles. O processo de amplificação por RT-PCR envolveu duas etapas: A
primeira constituída da preparação de um cDNA complementar à sequência do RNA viral e a
segunda na amplificação dos cDNAs obtidos na reação anterior.
No preparo de cDNA, 3 μL da preparação do RNA foi colocada em micro tubos de 200
μL, contendo o mix 1 (5 μL de água DEPC e 2 μL dos primers), totalizando 10 μL. A mistura foi
levada ao termociclador programado para 10 min a 70 ºC, retirada em seguida e colocada em gelo.
Em seguida, foram adicionados 15 μL do mix 2 (6 μL de água DEPC; 5 μL do tampão da RT 5X; 2
μL de dTT 0,1M;1μL de 10mM dNTPs; 0,5 μL de Inibidor de RNAse 400 U/ μL e 0,5 μL de
MMLV 15 200 U/ μL) e por fim os tubos foram levados ao termociclador programado para 1 h a 37
ºC e 15 min a 70 ºC.
Os fragmentos de cDNA obtidos foram amplificados por PCR, usando-se 2 μL da
reação anterior (cDNA); 5 μL do tampão da Taq polimerase 5X; 2,5 μL de 25 mM cloreto de
magnésio (MgCl2); 0,5μL de10 mM dNTPs; 0,25 μL da Taq polimerase 5 U/ μL e 0,5 μL de cada
primers para um volume de reação de 25 μL completados com 13,75 μL de água DEPC. O
programa de amplificação foi constituído de um único ciclo inicial de 94 ºC por 5 min e 31 ciclos
subsequentes de 94 ºC por 1 min para a desnaturação do cDNA. A temperatura de anelamento dos
primeres SqMV-F1 e SqMV-R1 foi de 49,2 ºC e para os primeres SqMV-R2 e SqMV-F2 foi de
56,5, seguidas de 31 ciclos subsequentes de 72 ºC por 5 min para a extensão. Os resultados obtidos
na PCR foram analisados em gel de agarose 1%, preparado em tampão de corrida TBE 1X (40 mM
Tris base, 2 mM de EDTA) e a eletroforese foi conduzida a 90 V por aproximadamente 45 min.
Após a corrida, o gel foi corado em brometo de etídio (0,1 μg/mL) e o perfil eletroforético
visualizado foi foto documentado em luz ultravioleta no Transiluminador 212 PRO Gel Logic.
33
b) Estudo Filogenético
Para o estudo filogenético do SqMV-LabVV foram realizadas extrações de RNA total e
as RT-PCR seguindo o mesmo protocolo acima descrito, porém os primers específicos utilizados
foram selecionados para a parte da região do RNA2 (Tabela 1) que compreende toda a região
conservada da CP grande e pequena. Os produtos da RT-PCR foram quantificados em ng com
auxílio do aparelho de Picodrop TM -Biochrom Ltd e sequenciados pela empresa ACTGene. Os
consensos das sequências de nucleotídeos foram obtidos e as sequências foram alinhadas pelos
programas Multalin e Clustal W.Multiple Sequence Alignment. As árvores filogenéticas foram
geradas através do método de neighbour-joining, utilizando-se o programa MEGA v.5. As
sequências de nucleotídeos e de aminoácidos do SqMV-LabVV foi comparada com outros isolados
de SqMV e com outras espécies do gênero Comovirus depositadas no GenBank.
c) Transcrição Reversa – Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (RT-qPCR)
Folhas de plantas de meloeiro infetadas com SqMV-LabVV e de plantas sadias de
meloeiro mantidas em casa de vegetação foram analisadas por qPCR. Os primers utilizados foram o
SqMV- R2 (5‟-CTG CCC AGA AAT TCC TAG CA-3‟) e SqMV-F2 (5‟ GAC TAG AAC ACC
GCT TAC-3‟). O cDNA foi sintetizado a partir de 350 ng, utilizando seus respectivos primers anti-
senso específicos e a transcriptase reversa M-MLV (Promega, Madison, WI). Aproximadamente 2,0
µL de cada cDNA obtido foram misturados com 10 µL do Mix Master Green SYBR FastStart
Universal - ROX (Roche), e 30 µM de cada primer previamente diluído em Tris 0,01 M pH 8,0.
Cada reação foi incubada a 95 ° C durante 10 min, e submetidas a 19 ciclos (95°C por 15 s; 55°C
por 60 s; 72°C por 60 s), em aparelho de PCR em tempo real- ILLUMINA e os dados foram
analisados utilizando um sistema de Software ECO ILLUMINA (Uniscience, EUA). A
concentração relativa foi estimada pela escolha de um limite da fluorescência do SYBR verde
durante a fase exponencial do aumento da fluorescência.
Avaliação de Infecções Mistas de Squash mosaic virus com Vírus dos Gêneros Potyvirus
Os experimentos foram realizados em condição de casa de vegetação visando avaliar os
efeitos da infecção mista do SqMV-LabVV com vírus do gênero Potyvirus (PRSV-W, WMV e
ZYMV) em abobrinha ‘Caserta’ (Cucurbita pepo L.). Plantas de abobrinha ‘Caserta’ foram obtidas
por semeaduras em bandejas contendo substrato. Após a germinação, as plântulas foram
transplantadas para vasos de 2 L contendo uma mistura de terra e esterco na proporção 1:1 (p/v),
previamente autoclavadas, utilizando quatro vasos por tratamento, com três plantas, por vaso. Dois
34
dias após o transplantio e quando as plântulas estavam com as duas folhas cotiledonares totalmente
formadas e expandidas e a primeira folha verdadeira formada, foi realizada a inoculação mecânica dos
vírus, por meio da maceração de tecido foliar infetado com cada vírus. O SqMV foi inoculado em
uma das folhas e em seguida uma das espécie do gênero Potyvirusfoi inoculada em outra folha. O
experimento foi composto de oito tratamentos assim constituídos: A- plantas inoculadas somente
com SqMV; B- plantas inoculadas somente com PRSV-W; C- plantas inoculadas somente com
WMV; D- plantas inoculadas somente com ZYMV; E- plantas inoculadas com SqMV e com
PRSV-W; F- plantas inoculadas com SqMV e com WMV; G- plantas inoculadas com SqMV e com
ZYMV; H- testemunha, plantas sem inoculação.
As plantas foram observadas diariamente quanto ao surgimento de sintomas e início da
floração. Após 30 dias da inoculação as concentrações dos vírus do gênero Potyvirus foram
estimadas por testes de PTA-ELISA, sendo que as concentrações do SqMV foram avaliadas por
imunoprecipitação seguida de PTA-ELISA (IP-PTA-ELISA). No final do experimento foi realizada
a extração de RNA total e RT-PCR de todas as plantas, seguindo o mesmo protocolo acima
descrito, para confirmação da presença dos vírus, utilizando primers específicos (Tabela 2).
Caracterização Biológica Comparativa Entre os Isolados de Squash mosaic virus e de Cowpea
severe mosaic virus
a) Estudo Comparativo em Possíveis Hospedeiras de Lesões Locais
Os estudos de gama de plantas hospedeiras de lesões locais foram realizados em casa de
vegetação com Chenopodium amaranticolor Costa e Reyn e C. quinoa Willd, ambas espécies da
família Amaranthaceae e possíveis hospedeiras locais dos três isolados virais. Cada vírus foi
inoculado mecanicamente em duas folhas de cada planta adulta. As inoculações foram realizadas
com extratos de plantas, de meloeiro infetadas sistemicamente pelo SqMV-LabVV e de feijoeiro
caupi infetadas sistemicamente pelos isolados CPSMV-CE e CPSMV-MC, preparados na presença
de solução tampão 0,05 M de KPO4, pH 7,5, obtidos pela maceração de tecido foliar infetado, na
proporção de 1g de tecido para 5mL de solução. Diariamente as plantas foram observadas quanto ao
surgimento, quantidade e tamanho das lesões locais.
b) Estudo Comparativo em Gama de Hospedeiros de Infecção Sistêmica
Foram avaliadas 19 espécies da família Fabaceae, única família com plantas hospedeiras
sistêmicas ao SqMV (FREITAG, 1956) e ao CPSMV (LIMA; SITTOLIN; LIMA, 2005). Por conta
35
da gama de plantas hospedeirasao CPSMV foram incluídas espécies das famílias Cucurbitaceae:
abóbora (Cucurbita moschata L.)‘Menina Rajada’; abobrinha (Cucurbita pepo L.) ‘Caserta’e
pepino indiano (Cucumis metuliferus L.); da família Solonaceae: berinjela (Solanum melongena L.)
e fumo (Nicotiana tabacum L.) ‘Sansum’, ‘TNN’, ‘Xanth’, ‘Sansum White burley’.
Todas as plantas encontravam-se em fase inicial de desenvolvimento em regime de casa
de vegetaçãoe foram inoculadas com cada isolado de vírus específico (SqMV, CPSMV-CE e
CPSMV-MC), cujos inóculos foram preparados na proporção de 1 g de tecido para 5 mL da solução
tampão 0,05 M de KPO4, pH 7,5.Uma segunda inoculação foi efetivada nas plantas que não
apresentaram sintomas dez dias após a primeira inoculação. As plantas inoculadas foram
observadas diariamente quanto ao aparecimento de sintomas e testadas por Dupla Difusão em Agar
contra antissoros específicos para SqMV e para CPSMV, 25 dias após a primeira inoculação.
Purificação Química de Squash mosaic virus e de Cowpea severe mosaic virus
Os isolados virais SqMV-LabVV e CPSMV-MC foram multiplicados sob condições de
casa de vegetação em 100 plantas de meloeiro e 100 plantas de feijoeiro caupi respectivamente.
Vinte dias após a inoculação, folhas com sintomas característicos dos vírus foram coletadas para
purificação por meio da clarificação com n- butanol e precipitação das partículas virais com
polietilenoglicol (PEG) 6.000, segundo protocolo usado por Lima e Amaral (1985), com algumas
modificações. O material foliar foi macerado na presença de tampão fosfato de potássio 0,1 M pH
7,0, na proporção de 1:2 (p/v), acrescido de sulfito de sódio na proporção de 0,5%. Após a
maceração, o extrato obtido foi filtrado em gaze tripla e submetido a uma clarificação com 8% de n-
butanol, sob agitação lenta e constante por aproximadamente 30 min. Em seguida, a mistura foi
submetida a uma centrifugação de 10.000 g, durante 20 min em centrífuga Sorvall RC-513. Ao
sobrenadante foram adicionados 8% de PEG, 4% de NaCl e 5% de Triton, e a mistura foi submetida
a agitação lenta e constante, por um período de 1 h. A mistura foi submetida a uma nova
centrifugação de 15.000 g por 15 min, para a precipitação do vírus, que foi ressuspendido em
tampão de fosfato 0,05 M pH 8,2. O processo de precipitação do vírus com PEG seguido de
clarificação foi repetido por três vezes e o último precipitado contendo o vírus após ressuspendido e
clarificado foi submetido a ultracentrifugação a 120.000 g, em temperatura de 30C, por 1 h e 30
min, na ultracentrífuga Bekman 27-55. A preparação final foi avaliada quanto a sua integridade
biológica por meio de inoculação em plantas sadias de meloeiro (SqMV) e feijoeiro caupi
(CPSMV-MC) e analisadas espectroforeticamente, a fim de analisar o grau de pureza e
concentração do vírus.
36
Obtenção de Antissoros Policlonais para Isolados de Squash mosaic virus e de Cowpea severe
mosaic virus
Coelhos da Raça Nova Zelândia Branco sadios, criados e mantidos em gaiolas, foram
imunizados, individualmente, com preparação purificada de cada isolado de vírus para obtenção de
antissoros específicos. Foi adotado esquema de imunização com três injeções semanais na pata
trazeira dos animais (LIMA, 1978; LIMA et al., 2012a), com as preparações virais previamente
homogeneizadas com igual volume de adjuvante incompleto de Freund. Duas semanas após a
última imunização, os animais foram sangrados para a produção de 30 a 40 mL de sangue, em
intervalos de oito a 15 dias, por um período de nove meses. As amostras de sangue coletadas foram
postas para coagular em banho-maria, à temperatura de 37°C por 40 a 50 min e, em seguida,
centrifugadas a fim de precipitar os coágulosde células vermelhas formados. Os antissoros foram
então clarificados a uma centrifugação de 10.000 g e conservados em temperatura de -20°C.
Os títulos dos antissoros foram determinados por IP-PTA-ELISA e PTA-ELISA
utilizando diluições de 1:1.000, 1:10.000, 1:20.000, 1:40.000, 1:80.000 e 1:160.000. Os antissoros
foram previamente absorvidos com proteína purificada de meloeiro sadio para antissoro de SqMV e
de feijoeiro cupi para antissoro CPSMV-MC, visando remover possíveis anticorpos reativos com
proteínas de plantas.
Uma purificação das proteínas de plantas sadia foi efetuada através das etapas iniciais
do protocolo usado para purificação do vírus. O material foliar dessas plantas sadias foi macerado
na presença de tampão fosfato de potássio 0,1 M pH 7,0, na proporção de 1:2 (p/v), acrescido de
sulfito de sódio na proporção de 0,5%. Após a maceração, o extrato obtido foi filtrado em gaze
tripla e submetido a uma clarificação com 8% de n-butanol, sob agitação por aproximadamente 2 h
em temperatura ambiente. Em seguida, a mistura foi submetida a uma centrifugação de 10.000 g,
durante 10 min em centrífuga Sorvall RC-513. Ao sobrenadante foram adicionados 8% de PEG e
4% de NaCl homogeneizados em agitação lenta a 4ºC, por um período de 1 h. A mistura foi
submetida a uma nova centrifugação de 10.000 g, por 10 min, para a precipitação das proteínas, que
foram ressuspendidas em tampão de fosfato 0,05 M pH 8,2. Após agitação de 1 h a 4 ºC, a mistura
foi submetida a uma centrifugação de 5.000 g por 10 min, mantendo-se o sobrenadante com as
proteínas parcialmente purificadas, as quais foram utilizadas na absorção dos antissoros, usando a
proporção de 1:2 (antissoro/proteína purificada). Em seguida, a mistura foi incubada a 37 ºC por 3 h
e centrifugada a 5.000 g por 10 min, sendo o sobrenadante recuperado para constituir o antissoro
absorvido. A titulação foi também avaliada pela técnica de Dupla Difusão em Agar utilizando
37
extrato de planta de meloeiro infetada com SqMV, de planta de feijoeiro caupi infetada com
CPSMV-MC e plantas de sadias de meloeiro e feijoeiro caupi na proporção de 1:2 (p/v) obtidos a
partir da maceração, em presença de água destilada, seguido de filtração em gaze dupla. Em
seguida, alíquotas de 25 a 35 μL dos extratos foram distribuídos nos orifícios periféricos do gel (0,8
% de agar Noble 1,0 % de NaN3) e testados contra o antissoro para SqMV e o antissoro para
CPSMV-MC nas diluições de 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64; 1:128; 1:256; 1:512 e 1:1.024 em
solução salina a 0,85%.
Relacionamento Sorológico Entre Isolados Squash mosaic virus e Cowpea severe virus
A avaliação de possíveis relacionamentos sorológicos entre SqMV-LabVV e isolados
de CPSMV foi realizada através de testes de Dupla Difusão em Agar, PTA-ELISA e IP-PTA-
ELISA, envolvendo a absorção heterológa dos antissoros. Antissoros para SqMV, foram absorvidos
com extrato concentrado de plantas infetadas com CPSMV e vice-versa. Nos testes de Dupla
Difusão em Agar foram utilizados os antissoros específicos produzidos para SqMV-LabVV e para
CPSMV-MC e com antissoros pertencentes a soroteca do LabVV/UFC específicos para o isolado
de CPSMV-CE. Extratos foliares de plantas de meloeiro infetadas com SqMV e extratos de plantas
de feijoeiro-caupi infetadas com isolados de CPSMV na diluição 1:2 (p/v) foram testados contra
seus antissoros homólogos e heterólogos nas diluições de 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32 e 1:64. Extratos
de plantas sadias de meloeiro e feijoeiro caupi foram usados como testemunha em todos os testes.
Caracterização Molecular Comparativa de Isolados de Squash mosaic virus e de Cowpea severe
mosaic virus
Para os estudos filogenéticos comparativos entres os isolados de SqMV-LabVV e de
CPSMV, as sequências do SqMV-LabVV foram comparadas com as sequências dos isolados
CPSMV-MC e CPSMV-CE do LabVV já depositadas no GenBank (BESERRA JUNIOR et al.,
2011), código de acesso HM450147 e HM448426, respectivamente. A comparação foi realizada,
com os três isolados, a partir da região do genoma que compreende a CP. Além da comparação das
sequências do cp dos três isolados (SqMV, CPSMV-CE, CPSMV-MC) entre si foi realizada a
comparação dessas com sequências de vírus do gênero Comovirus depositadas no GenBank.
38
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados dos testes sorológicos em Dupla Difusão em Agar, IP-PTA-ELISA e
PTA-ELISA com SqMV-LabVV confirmaram sua identidade e ausência de infecção com CMV,
PRSV-W, WMV e ZYMV, que também infetam cucurbitáceas no Nordeste brasileiro (LIMA et al.,
2012b; MOURA et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2000; SILVEIRA et al., 2009). Os resultados dos
estudos moleculares por RT-PCR mostraram uma banda de 818 pb com os pares de primers SqMV-
R1 e SqMV-F1 (Figura 1) para os RNAs de plantas infetadas por SqMV-LabVV. O fragmento
amplificado deve compreender uma parte da região 3’ do gene da proteína maior (L proteína) e toda
a proteína menor (SM) da CP do SqMV. Nascimento et al. (2011), utilizando os mesmos primers
para identificação de isolados de SqMV provenientes de Tocantins encontraram resultados
semelhantes e Alencar et al. (2012) detectarama presença de SqMV em áreas produtoras de
cucurbitáceas utilizando o mesmo par de primers. O par de primer SqMV-R2 e SqMV-F2
amplificou um fragmento de 665 pb, correspondendo a uma parte da região do RNA 2 que codifica
parte de uma das proteínas da CP (Figura 1). Resultado semelhante foi encontrado por Lima et al.
(2013), utilizando a mesma sequência de primers no desenvolvimento de uma nova técnica para
detectar RNA viral de planta que combina imunoprecipitação e RT-PCR.
Quando o isolado SqMV-LabVV foi submetido a amplificações por RT-PCR, com os
cinco pares de primers específicos, apresentaram banda de tamanho igual ao esperado para cada par
de primer (Figura 2). O sequenciamento desse produto gerou uma sequência de 1.143 nt
correspondente ao gene da CP, demonstrando através de estudo filogenético que o isolado SqMV-
LabVV está mais próximo do isolado SqMV-Japão do que dos outros isolados de SqMV (Figura 3),
apresentando uma identidade de nucleotídeos de 96,3% com o isolado do SqMV do Japão (Tabela
3). Han et al. (2002) caracterizaram molecularmente o isolado do Japão e propuseram que se tratava
de um representante de um terceiro subgrupo do SqMV em razão da sua distinção com os demais
isolados dos Estados Unidos. De forma semelhante, Hu et al. (2009) realizaram estudos
filogenéticos com um isolado chinês de SqMV em comparação com os demais isolados depositados
no Genbank, inclusive o isolado do Japão e observaram que o isolado Japonês foi o único que não
ficou próximo aos demais isolados, indicando, portanto, se tratar de um terceiro subgrupo de
SqMV. Com esse resultado foi possível fazer inferência de que o isolado SqMV-LabVV,
caracterizada na presente pesquisa, também pertence ao terceiro subgrupo de SqMV caracterizado
pelo isolado Japonês.
39
Na detecção do SqMV-LabVV por meio da qPCR com o fluoróforo Green SYBR,
observou-se uma curva de amplificação (CT) de 11,64 (Figura 4) cujo valor foi próximo ao
encontrado por Ling et al. (2011). Para desenvolver metodologia capaz de detectar isolados de
SqMV pertencentes a ambos os grupos através da técnica de qRT-PCR, Linget al. (2011) obtiveram
uma Ct de 12,3 para um isolado de SqMV do grupo II e uma Ct de 17,1 para um isolado do grupo
I,considerando 40 ciclos. Lima et al. (2013) encontraram, também, resultados semelhantes quando
utilizaram qPCR para demonstrar a eficiência da técnica que combina immunoprecipitação e RT-
PCR para detectar RNA viral de planta. Os resultados obtidos por Lima et al. (2013) revelaram
valores médios para Ct variando entre 12 a 22 para Papaya lethal yellow virus (PLYV) gênero
Sobemovirus, SqMV e ZYMV, considerando 28 ciclos. Portanto, os resultados obtidos na qPCR
confirmam a identidade do SqMV em plantas da coleção de vírus vivo do LabVV.
Nas análises sintomatológicas diárias dos estudos de infecção mista foi possível
observar que todas as plantas com infecção manifestaram sintomas quatro dias após a inoculação
mecânica, exceto o tratamento com infecção isolada de PRSV-W cujas plantas apresentaram
sintomas após cinco dias. Todas as plantas com infecção viral simples ou mista retardaram os
períodos de floração quando comparados com as plantas não inoculadas usadas como testemunhas.
Os tratamentos com infecção dupla e tripla apresentaram inicialmente sintomas de pontuações nas
folhas, seguido de mosaico severo e deformação foliar. No entanto, os sintomas e os efeitos no
desenvolvimento das plantas com infecção mista foram menos intensos quando comparados com as
plantas com infecção simples por qualquer um dos vírus do gênero Potyvirus. A par da confirmação
por sorologia, as presenças dos vírus em cada tratamento e cada espécie foram confirmadas por RT-
PCR, com as análises em gel de agarose apresentando asamplificações esperadas (Figura 5).
As concentrações dos vírus do gênero Potyvirus avaliadas por PTA-ELISA em
infecções simples e mistas foram sempre elevadas, porém os tratamentos com infecções mistas
apresentaram menores valores quando comparados com as infecções simples (Figura 6). Tais
resultados indicam a possibilidade de que os vírus do gênero Potyvirus sofreram algum tipo de
interferência quando em infecção conjunta com o SqMV-LabVV. As concentrações do SqMV-
LabVV estimadas por IP-PTA-ELISA indireto foram elevadas nas três formas de infecção, sendo
maior, no entanto,na infecção simples (Figura 7). O SqMV-LabVV também sofreu algum tipo de
interferência nas infecções mistas, exceto no tratamento de infecção dupla com o PRSV-W. No
entanto, apesar das estimativas das concentrações virais em infecções simultâneas terem sido
menores ou iguais quando comparadas com as infecções simples, os sintomas ocasionados pelos
vírus sozinhos ou em combinação são suficientes para afetar significativamente a produtividade das
40
plantas infetadas (SILVEIRA et al., 2009; LIMA et al., 2012b). Segundo Silveira et al. (2009) e
Lima et al. (2012b), o uso de variedades resistentes para mais de um vírus constituem eficientes
formas de controle para o cultivo comercial de espécies de cucurbitáceas. Os resultados encontrados
nessa pesquisa diferiram dos encontrados por Silva (2011) que avaliou o efeito da infecção mista
entre SqMV, PRSV-W, WMV e ZYMV em plantas de meloeiro. Provavelmente as diferenças
devem estar relacionadas às reações diferenciadas das espécies de plantas, uma vez que os
resultados obtidos nesta pesquisa envolveram abobrinha ‘Caserta’, enquanto os resultados obtidos
por Silva (2011) envolveram a cultura do meloeiro, indicando que os efeitos dos vírus nas plantas,
tanto em infecção simples como em infecção mista, dependem, sobretudo da interação vírus planta.
Segundo Lima et al. (2012b); Oliveira et al. (2000); Ramos; Lima; Gonçalves (2003) e Silveira et
al. (2009), hospedeiras diferentes, até dentro de uma mesma espécie podem apresentar reações
biológicas diferentes.
Como esperado, na caracterização biológica comparativa com possíveis hospedeiras
locais os três isolados virais (SqMV-LabVV, CPSMV-CE e CPSMV-MC) ocasionaram lesões
necróticas locais em C. amaranticolor e C. quinoa, no entanto, as mesmas diferiram em número,
quantidade e tamanho. Em folhas de C. amaranticolor inoculadas com CPSMV-CE os sintomas se
manifestaram com seis dias após a inoculação, enquanto com CPSMV-MC e com SqMV-LabVV os
sintomas surgiram somente oito dias após a inoculação. As quantidades de lesões por folha
inoculada variaram, sendo cinco lesões por folha para o CPSMV-MC, 15 para o SqMV-LabVV e
30 para o CPSMV-CE. As folhas de C. quinoa apresentaram sintomas cinco dias após a inoculação
com CPSMV-CE, seis dias após a inoculação com CPSMV-MC e somente 11 dias após a
inoculação com SqMV-LabVV. As quantidades de lesões por folha inoculada foram 10 para o
CPSMV-MC, 20 para o SqMV-LabVV e 28 para o CPSMV-CE (Tabela 4). O tamanho das lesões
em C. amaranticolor variou de pequeno com aproximadamente 2 mm nas lesões induzidas por
CPSMV-MC, 4 mm para CPSMV-CE a 6 mm para SqMV. Essas variações quanto ao número,
quantidade, tamanho e início de formação das lesões podem ser usadas como critério biológico para
diferenciar esses isolados virais. Resultado semelhantes foram obtidos por Silva (2011) com SqMV-
LabVV nas mesmas espécies de plantas. Camarço et al. (2009) observaram também lesões
necróticas locais nessas mesmas espécies de plantas com diferentes isolados de CPSMV. Esses
resultados expõem a existência de hospedeiras locais comuns aos três isolados de vírus, embora
com diferenças nas lesões.
No estudo comparativo em gama de plantas hospedeiras (Tabela 5), nenhum dos três
isolados infetou espécies da família Solonaceae. Com exceção do pepino indiano, o SqMV-LabVV
41
infetou sistematicamente todas as espécies da família Cucurbitaceae, demonstrando que a gama de
hospedeiros sistêmicosdo SqMV deve estar restrita a espécies da família Cucurbitaceae, sendo mais
importante em melão Cantaloupe (LIMA et al., 2012b; MOURA et al., 2001). Ao contrário do
encontrado por Freitag (1956) para SqMV, o isolado de SqMV-LabVV não infetou nenhuma das
espécies das famílias Fabaceae. Os isolados CPSMV-MC e CPSMV- CE não infetaram nenhuma
espécie da família Cucurbitaceae, porém infetaram todas as cultivares de fejoeiro-caupi testadas,
com exceção da cv. Macaibo que não foi infetada pelo CPSMV-CE. De outra parte, as demais
espécies da família Fabaceae não foram infetadas por nenhum dos dois isolados de CPSMV. Lima
et al. (2005), objetivando isolar, identificar e caracterizar um novo isolado de CPSMV encontrado
infetando Crotalaria paulinea Schrank no estado do Maranhão, realizaram também estudos
biológicos através da gama de hospedeiros em espécies da família Fabaceae e observaram que o
isolado de C. paulinea (CPSMV-CROT) infetou quase todas as cultivares de feijoeiro-caupi, o que
não aconteceu para as demais espécies da familia Fababecae, corroborando com os resultados
encontrados nessa pesquisa. Camarço et al. (2009); Lima et al. (2011b) e Lima et al. (2012c)
observaram também que o CPSMV-MC foi o único isolado de CPSMV capaz de infetar a
cv.Macaibo, o que comprova a existência de diferença biológica entre CPSMV-MC e CPSMV-CE
confirmadas na presente pesquisa e que precisam ser consideradasem programas de melhoramento
para a produção devariedades resistentes. Assim sendo todos esses resultados apontaram para a
inexistência de hospedeira sistêmica comum aos isolados de SqMV e de CPSMV.
As preparações purificadasdos isolados SqMV-LabVV e CPSMV-MC apresentaram
razões da absorção nos comprimentos de onda de A260 e A280 nm (A260/A280) de 1,81 e 1,51 para
SqMV-LabVV e para CPSMV-MC, respectivamente. Tais valores são típicos de vírus poliédricos e
semelhantes aos encontrados por Lima e Amaral (1985); Rabelo Filho et al (2005) e Silva (2011)
para um isolado de SqMV e por Lima et al. (2005) e Camarço et al. (2009) para um isolado de
CPSMV. As concentrações dos vírus foram estimadas em 58,32 mg de vírus por Kg de tecido
vegetal infetado para SqMV-LabVV e em 64,83 mg de vírus por Kg de tecido vegetal infetado para
CPSMV-MC. As preparações purificadas dos vírus foram infectivas nas diluições de 1:10 e 1:20,
quando inoculadas em plantas sadias hospedeiras de cada vírus. Esses resultados demonstraram que
o protocolo de purificação utilizado nessa pesquisa (LIMA, AMARAL, 1985) é eficiente para
purificação de vírus do gênero Comovirus e aqueles com características semelhantes como PLYV
eficientemente purificado por Nascimento et al. (2010). As análises eletroforéticas das proteínas
capsidiais dos isolados virais, nas diluições de 1:20 e 1:40 (preparação viral/tampão) permitiram
estimar seus pesos moleculares em aproximadamente 21 e 43 kDa (Figura 8). Segundo King (2012)
esses valores correspondem aos valores dos vírus do gênero Comovirus que possuem duas proteínas
42
na sua CP com massas moleculares estimadas entre 40-45 kDa e 21-27 kDa. Quando avaliado pela
técnica de Dupla Difusão em Agar, os antissoros para CPSMV-MC e para SqMV-LabVV
apresentaram títulos de 1:1024, sem nenhuma reação com extrato de planta sadia. Em IP- ELISA os
títulos dos antissoros absorvidos com proteína de planta sadia ou com o extrato de planta sadia
foram de 1:80.000 para CPSMV-MC e de 1:160.000 para SqMV-LabVV. Em ELISA indireto os
títulos dos antissoros absorvidos foram de 1:20.000 e de 1:40.000 para CPSMV-MC e para SqMV-
LabVV, respectivamente. Esses resultados demonstraram e confirmaram que as metodologias de
purificação química e de imunização de “foot pad” proporcionaram economia de vírus purificado e
produção de elevada concentração de anticorpos no antissoro (LIMA; AMARAL, 1985; LIMA et
al., 2012a).
Em testes de Dupla Difusão em Agar, os extratos foliares de plantas infetadas com
SqMV-LabVV e de plantas infetadas com CPSMV-MC reagiram contra o antissoro para SqMV-
LabVV, com a formação de esporão entre os extratos de plantas infetadas com CPSMV-MC e de
plantas infetadas com SqMV-LabVV. No entanto, extratos de plantas infetadas com SqMV-LabVV
não apresentaram reação quando testados contra antissoro para CPSMV-MC, demonstrando um tipo
de relacionamento sorológico unilateral. Teste com o antissoro para SqMV-LabVV absorvido com
extrato de planta infetado com CPSMV-MC não apresentou reação com o CPSMV-MC,
demonstrando que um possível epitopo comum às duas espécies de vírus do gênero Comovirus foi
de fato absorvido. Esses resultadosdemonstraram a existência de relacionamento sorológico
unilateral entre SqMV-LabVV e CPSMV-MC, capaz de ser detectado somente com o uso de
antissoro para SqMV-LabVV. No entanto, referido relacionamento sorológico unilateral não foi
possível de ser detectado em testes de PTA-ELISA e/ou IP-PTA-ELISA. Silva (2011) também
observou a existência desse relacionamento sorológico, porém os resultados dessa pesquisa são
mais consistente devido a realização da absorção dos antissoros com os extratos de plantas infetadas
com os isolados virais analisados, podendo-se afirmar a existência de um epitopo comum
responsável pelo relacionamento sorológico. A ausência de relacionamento sorológico unilateral em
PTA-ELISA e/ou IP-PTA-ELISA pode estar relacionada com a elevada sensibilidade de referidas
técnicas, indicando a necessidade de diluições seriadas de antígenos e antissoros a fim de que tal
diferença possa ser detectada.
A caracterização molecular comparativa entre SqMV-LabVV e isolados de CPSMV
efetuada a partir do estudo filogenético comparativo da região da CP entre os três isolados, SqMV-
LabVV, CPSMV-MC e CPSMV-CE, mostraram que os isolados de CPSMV ficaram próximos,
enquanto que o SqMV-LabVV ficou distante dos dois isolados de CPSMV e das demais espécies de
43
vírus do gênero Comovirus (Figura 9). O CPSMV-MC e o CPSMV-CE apresentaram valor de
identidade entre as sequências de nucleotídeos da região do cp de 92,5%, enquanto que o SqMV-
LabVV e o CPSMV-MC apresentaram um valor de 31,7% e o SqMV-LabVV e o CPSMV-CE
apresentaram valor de 32,2% (Tabela 6). Beserra Junior et al. (2011) avaliaram a variabilidade na
sequência do cp de seis isolados de CPSMV pertencentes ao banco ativo de vírus do LabVV e
concluíram que esses isolados possuem uma baixa variabilidade entre si. A distância filogenética
entre os isolados de CPSMV e o isolado SqMV-LabVV foi semelhante a encontrada por Abreu et
al. (2011); Camarço et al. (2009) e Souto et al (2002), quando incluíram em suas análises
filogenéticas o SqMV para ser comparado com sequências dos isolados de CPSMV avaliados.
Portanto, como a região analisadaé bastante conservada, os resultados não apresentaram indicativos
da existência de determinantes antigênicos virais reponsáveis pelo relacionamento sorológico
unilateral entre os isolados CPSMV e SqMV-LabVV.
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47
Tabela 1- Oligonucleotídeos específicos para Squash mosaic virus usados para amplificação de
parte do RNA2, temperatura de anelamento e tamanho esperado da amplificação.
Tabela 2- Oligonucleotídeos específicos para Papaya ringspot virus, tipo Watermelon (PRSV-
W); Squash mosaic virus (SqMV), Watermelonmosaic virus (WMV) e Zucchini yellow mosaic
virus (ZYMV) usados para confirmação da presença de cada vírus em experimentos de infecção
mista, temperatura de anelamento e tamanho esperado da amplificação.
Oligonucleiotídeo Sequência Tm°C Amplificação
esperada (bp)
SqMV -1F AAG TGA TCT CTG CTC CCT CT
57
457 SqMV-1R CTT GTC TTT GAG TGC CGA
SqMV-2 F AGC AGC TGT CAG AAC CTT G
56 917 SqMV-2 R AGT GGC ATG CAA AGG ATG
SqMV -3 F GAT CAA AGA AAA GGG GGC CA
60 882 SqMV -3 R CCA TGT AAG CAC CAG CGC
SqMV -4 F CCC CAA TCC TTG TGG TGA TG
58 757 SqMV -4 R GTT CCA AGC TGC TGT ACC
SqMV -5 F GGG CTC GTT TGC TAG GAA T
58
630 SqMV -5 R GAA GCC ACA ACA AAA CCC AG
Oligonucleiotídeo Sequência Tm°C Amplificação
esperada (bp)
PRSV-W –F TGAACGGAGGGGAGACT
57,5 999 PRSV-W – R CAGCAAACACACAAGCGCGA
SqMV – F GACTAGAACACCGCTTAC
56,5 655 SqMV – R CTGCCCAGAAATTCCTAGCA
WMV – F CAGTGTCTCTGCAATCAGGA
57,5 800 WMV – R CCCTTGCAGTGTGCCTCTCAG
ZYMV –F GCTCCATACATAGCTGAGACAGC
55
300 ZYMV – R CACAATTTTTTTATGAGAATTAGC
48
Tabela 3- Porcentagem de identidade entre as sequências de nucleotídeos dos fragmentos dos
genes da capa proteica (cp) do isolado de Squash mosaic virus (SqMV) pertencente ao banco
ativo de vírus do Laboratório de Virologia Vegetal (LabVV) da UFC e de vírus do gênero o
Comovirus depositados no Genbank: Cowpea mosaic virus, CPMV(NC-003550.1); Cowpea
severe mosaic virus, CPSMV-USA (NC-003544); Red clover mottle virus, RCMV(NC-
003738.1); SqMV-China (EU421060), SqMV-EUA (AF059533); SqMV- Rep.Czech
(JF922966) e SqMV-Japão (AB-054689).
Isolado CPMV CPSMV-USA
RCMV SqMV- China
SqMV- EUA
SqMV- Rep.Ch
SqMV- Japão
SqMV- LabVV
CPMV - 44,3% 51,7% 35,2% 37,3% 37,3% 36,5% 36,0%
CPSMV-USA - 41,7% 29,7% 31,6% 31,6% 30,5% 30,0% RCMV - 33,3% 37,0% 37,0% 34,9% 35,2%
SqMV- China - 84,0% 84,0% 87,9% 86,8%
SqMV- EUA - 100% 85,0% 84,6%
SqMV- Rep.Czech - 85,0% 84,6% SqMV- Japão - 96,3%
49
50
Tabela 4- Reação, surgimento e quantificação de lesõeslocais em folhas de espécies da família Amaranthaceae inoculadas com isolado de Squash mosaic
virus do Laboratório de Virologia Vegetal da UFC (SqMV-LabVV) e de isolados de Cowpea severe mosaic virus (CPSMV).
Espécie Vegetal
Isolado de Vírus
SqMV-LabVV CPSMV-CE CPSMV-MC
Sintoma
Início
No. Lesões/
Folha
Tamanho
das lesões Sintoma Início
No. Lesões/
Folha
Tamanho
das lesões Sintoma Início
No. Lesões/
Folha
Tamanho
das lesões
Chenopodium amaranticolor LlNe* 8 dias 15 6mm LlNe* 6 dias 30 4mm LlNe* 8 dias 5 2mm
C. quinoa LlNe* 11 dias 20 8 mm LlNe* 5 dia 28 6 mm LlNe* 6 dias 10 4 mm
*LlNe- Lesão local Necrótica
51
Tabela 5- Reações sintomatológicas e resultados de dupla difusão em agar em diferentes espécies de plantas inoculadas com Squash
mosaic virus (SqMV-LabVV) e isolados de Cowpea severe mosaic virus (CPSMV-CE e CPSMV-MC).
Família Vegetal Isolado de Vírus
Espécie
Cultivar
SqMV-LABVV CPSMV-CE CPSMV-MC
Sintoma* Dupla
Difusão Sintoma*
Dupla
Difusão Sintoma*
Dupla
Difusão CUCURBITACEAE
Cucurbita pepo–Caserta Ll /M + SS - SS -
Cucurbita moschata - ‘Menina Rajada’ Ll /M + SS - SS - Cucumis metuliferus SS - SS - SS -
FABACEAE
Cassia occidentales SS - SS - SS - Clitoria ternatea SS - SS - SS -
Leucena sp. SS - SS - SS -
Macroptilium atropurpureum SS - SS - SS -
M. lathyroides SS - SS - SS - Phaseulus vulgaris SS - SS - SS -
Vigna unguiculata
‘Canapú’ SS - Ms + Ml + ‘Canapuzinho’ SS - Ms + Ml +
‘Coruzinha’ SS - M + Ml +
‘Costela- de-Vaca’ SS - Ms + Ml + ‘Feijão preto’ SS - M + Ml +
‘Lizão’ SS - Ms + Ml +
‘Macaibo’ SS - SS - +
‘Maroatã’ SS - Ml + Ml + ‘Manteigão SS - Ms/B + Ml +
‘Milagroso’ SS - M + M +
‘Paulistinha’ SS - Ms/B + Ml + ‘Pingo de ouro’ SS - Ms/B + M +
‘Pitiuba’ SS - Ms/B + Ml +
‘Roxinho’ SS - Ms/B + Ml +
52
‘Sempre Verde’ SS - Ms/B + M +
Tabela 5- Continuação
Família Vegetal Isolado de Vírus
Espécie
Cultivar
SqMV-LABVV CPSMV-CE CPSMV-MC
Sintoma* Dupla
Difusão Sintoma*
Dupla
Difusão Sintoma*
Dupla
Difusão
SOLANACEAE
Nicotiana tabacum SS - SS - SS - ‘Sansum’ SS - SS - SS -
‘TNN’ SS - SS - SS -
‘Xanth’ SS - SS - SS -
‘Sansum White burley’ SS - SS - SS - Solanum melongena SS - SS - SS -
*- B- bolhosidade, Ll- lesões locais, M- mosaico, Ml- mosaico leve, Ms- mosaico severo e SS- sem sintoma
53
Tabela 6- Porcentagem de identidade entre as sequências de nucleotídeos do 1
fragmento do gene da capa protéica (cp) dos isolados de Squash mosaic virus 2
(SqMV-LabVV), Cowpea severe mosaic virus,CPSMV-MC (HM450147) e 3
CPSMV-CE (HM448426) pertencente ao banco ativo de vírus do Laboratório de 4
Virologia Vegetal (LabVV) da UFC e de outros vírus do gênero o Comovirus 5
depositados no Genbank: Cowpea mosaic virus, CPMV(NC-003550.1) e CPSMV-6
USA (AF059533). 7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38 Figura 1- Resultados de eletroforese em gel de agarose de 39
produtos da amplificação de partes do genoma do isolado de 40
Squash mosaic virusdo Laboratório de Virologia Vegetal (SqMV-41
LabVV); M- marcador ladder 1 kb; 1-Amplificação com par de 42 primers 1; 2- Amplificação com par de primers 2; 3- Planta sadia 43 com par de primers 1; 4 -Planta sadia com par de primers 2 44
45
46
47
Isolados
CPSMV-
MC
CPSMV-
CE
CPSMV-USA CPMV SqMV-
LabVV
CPSMV-MC - 92,5% 42,1% 32,3% 31,7%
CPSMV-CE 42,6% 32,6% 32,2%
CPSMV-USA - 48,2% 32,9%
CPMV - 31,3%
54
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
Figura 2- Resultados da eletroforese em gel de agarose de produtos da 65
amplificação de partes do genoma do isolado de Squash mosaic virus do 66
Laboratório de Virologia Vegetal (SqMV-LabVV); M- marcador ladder 1 67
kb; 1,2,3, 4 e 5-Planta infetada com SqMV; SD- Planta de melão sadia; a: 68
Par de primer específico para SqMV -1F e1R; b: Par de primer específico 69
para SqMV -2F e 2R; c: Par de primer específico para SqMV -3F e3R; d: 70
Par de primer específico para SqMV -4F e4R;e: Par de primer específico 71
para SqMV -5F e5R. 72
73
55
74
75
76
77 78
Figura 3- Árvore filogenética obtida a partir das sequências de nucleotídeos do gene da capa 79
proteica (cp) do isolado de Squash mosaic virus do Laboratório de Virologia Vegetal da 80
(SqMV-LabVV) da UFC e de vírus do gênero o Comovirus depositados no Genbank: 81
Cowpea mosaic virus, CPMV (NC-003550.1); Cowpea severe mosaic virus,CPSMV-EUA 82
(NC-003544); Red clover mottle virus, RCMV (NC-003738.1); SqMV-China (EU421060), 83
SqMV-EUA (AF059533); SqMV- Rep.Czech (JF922966) e SqMV-Japão (AB-054689). O 84
comprimento dos ramos horizontais é proporcional a distância genética entre os isolados; os 85
ramos verticais são arbitrários. Os números sobre os ramos indicam a porcentagem de 86
repetições da análise de bootstrap. 87
88
89
56
90
91 Figura 4– Curvas padrão desenvolvida de acordo comos valores dociclo de 92
amplificação (CT) versus o número de cópias amplificados extraída a partir de tecidos 93
de plantas de meloeiro (Cucumis melo) infetadas com o isolado de Squash mosaic virus 94
do Laboratório de Virologia Vegetal (SqMV-LabVV) e tecidos de meloreiro sadia. A 95
eficiência da reacção foi de 99% calculada a partir do coeficiente angular da curva 96
indicado pela fórmula. 97
98
57
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
119
Figura 5- Resultados de eletroforese em gel de agarose de produtos da 120
amplificação de partes do genoma de Papaya ringspot virus (PRSV-W), 121
Squash mosaic virus (SqMV), Watermelon mosaic virus (WMV) e Zucchini 122
yellow mosaic virus (ZYMV) em infecção simples e mista. M- marcador ladder 123
1 kb; S- Planta de abobrinha ‘Caserta’ (Curcubita pepo) sadia; 1- infetada com 124
SqMV+PRSV-W; 2- infetada com SqMV+WMV; 3- infetada com SqMV+ 125
ZYMV; 4- infetada com SqMV; 5- infetada com PRSV-W; 6- infetada com 126
WMV; 7- infetada com ZYMV; A- primer específico para SqMV; B- primer 127
específico para PRSV-W; C- primer específico para WMV; D- primer 128
específico para ZYMV. 129
130
999 pb
655 pb
300 pb
800 pb
A B C D
58
131
132
133
134
Figura 6- Concentrações de Papaya ringspot virus (PRSV-W), Watermelon mosaic virus 135
(WMV) e Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) avaliadas pelas razões dos valores de 136
absorbância em ELISA indireto em infecção simples e em combinação com Squash mosaic 137
virus (SqMV) e dos valores da absorbância para extrato de planta sadia. 138
139
140
141
Figura 7- Concentrações de Squash mosaic virus (SqMV) avaliadas pela razão dos valores de 142
absorbância em IP-ELISA em infecção simples e em combinação com Papaya ringspot virus 143
(PRSV-W), Watermelon mosaic virus (WMV) e Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) e dos 144
Tipo de Infecção
A405nm
Ext. Vírus/ A405nm
Ext. Sadia
59
valores da absorbância para extrato de planta sadia.145
60
146
147
148
149
150
151
152
153
154
155
156
157
158
159 Figura 8- Avaliação da proteína capsidial do isolado de Squash 160
mosaic virus (SqMV) e do Cowpea severe mosaic virus (CPSMV) em 161
gel de poliacrilamida com SDS. M- Marcador Broad Range Protein 162
Molecular Weight Markes; 1- CPSMV purificado na diluição de 1:20; 163
2- CPSMV purificado na diluição de 1:40; 3- SqMV purificado na 164
diluição de 1:10; 4- SqMV purificado na diluição de 1:20. 165
166
167
168
169
170
171
172
173
174
175
176
Figura 9- Árvore filogenética obtida a partir das sequências de nucleotídeos da capa 177
proteica do isolados de Squash mosaic virus (SqMV-LabVV); Cowpea severe mosaic 178
virus (CPSMV-MC (HM450147) e CPSMV-CE (HM448426) pertencente ao banco ativo 179
de vírus do Laboratório de Virologia Vegetal (LabVV) da UFC e de outros vírus do 180
gênero o Comovirus depositados no Genbank: Cowpea mosaic virus, CPMV (NC-181
003550.1) e CPSMV-EUA (AF059533). O comprimento dos ramos horizontais é 182
proporcional a distância genética entre os isolados; os ramos verticais são arbitrários. Os 183
números sobre os ramos indicam a porcentagem de repetições da análise de 184
bootstrap.Código de acesso no GenBank. 185
M 1 2 M 3 4
Conclusões Gerais
60
CONCLUSÕES GERAIS
Com base nos resultados obtidos na presente pesquisa, conclui-se que:
1-Os resultados dos estudos filogenéticos indicam que o SqMV-LabVV está estreitamente
relacionado ao isolado de SqMV Japonês, podendo ser incluído no terceiro subgrupo do SqMV.
De outra parte, o SqMV-LabVV ficou distante dos dois isolados de CPSMV.
2- Espécies de vírus do gênero Potyvirus sofreram algum tipo de interferência quando em infecção
conjunta com o isolado SqMV-LabVV.
3- A metodologia da purificação foi eficiente tanto para SqMV-LabVV como para o CPSMV-MC,
possibilitando a produção de antissoros específicose reativos em Dupla Difusão em Agar e em
testes de ELISA.
4- Existe relacionamento sorológico unilateral entre SqMV-LabVV e CPSMV-MC, detectável por
Dupla Difusão em Agar.