DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

A Origem das Células de Defesa (hemócitos) em Biomphalaria glabrata (Say, 1818)

SAMALY DOS SANTOS SOUZA

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA

INSTITUTO DE CIËNCIAS DA SAÛDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA

Salvador – Bahia – Brasil 2006

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIËNCIAS DA SAÛDE

FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ CENTRO DE PESQUISAS GONÇALO MONIZ

Curso de Pós-Graduação em Imunologia

A Origem das Células de Defesa (hemócitos) em Biomphalaria glabrata (Say, 1818)

SAMALY DOS SANTOS SOUZA

Orientador: Zilton de Araújo Andrade

Dissertação apresentada para

Obtenção do Grau de Mestre em

Imunologia.

Salvador - Bahia – Brasil 2006

Ficha Catalográfica elaborada pela Biblioteca do CPqGM/FIOCRUZ - Salvador - Bahia.

Souza, Samaly Santos S719e Estudo da origem das células de defesa (hemôcitos) em Biomphalaria glabrata , cepa Feira de Santana, quando infectada pelo Schistosoma mansoni [manuscrito] / por Samaly dos Santos Souza. – 2006. 90 p.: il. Datilografado (fotocópia)

Dissertação (Mestrado em Imunologia) – Universidade Federal da Bahia. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, 2006.

Orientador: Prof. Dr. Zilton de Araújo Andrade. Laboratório de Patologia Experimental.

1. APO. 2. Hemöcitos. 3. S. mansoni. 4. B. glabrata . 5. Bahia

I. Título.

CDU: 616.995.122 (813.8)

A Origem das Células de Defesa (hemócitos) em Biomphalaria glabrata (Say, 1818)

SAMALY DOS SANTOS SOUZA

Dissertação apresentada para obtenção do grau de mestre Salvador, 07

de Abril de 2006

Banca Examinadora

Membros Titulares:

_____________________________________

Dr. Zilton de Araújo Andrade (Professor Orientador)

Pesquisador Titular CPqGM – FIOCRUZ

__________________________________

Membro 1

Prof. Dr. Paulo Marcos Zeck Coelho

_________________________________

Membro 2

Profa. Dra. Rita de Cássia Farani Assis

Membro Suplente:

___________________________________

Membro 3

Profa. Dra. Marlene Peso Campos de Aguiar

“É a combinação da vida a transformação lenta e serena do progresso que faz da ciência tão fascinante e essencial”.

Michael Joseth.

Aos meus amados pais, Benedito & Lúcia, pelo apoio amigo e exemplo de humildade e perseverança.

Meus eternos agradecimentos.

Aos meus queridos irmãos, Jônatas e Leandra, pelo apoio e incentivo.

Amo muito vocês!

Ao Professor Dr. Zilton de Araújo Andrade pela orientação esclarecedora e amiga, pelo seu bom humor de mestre, humildade

em transmitir seus conhecimentos e pela confiança a mim depositada.

Agradecimentos

• Ao Dr. Lobato Paraence. “Papa da Malacologia” por me ensinar as técnicas de

dissecção de caramujos do gênero Biomphalaria e pelo exemplo de lucidez e

profissionalismo. A Dra. Lígia Paraence pelo bom convívio e carinho demonstrado a

todo instante quando estagiei em seu Departamento de Malacologia- IOC/RJ.

• A Dra. Silvana Carvalho Thiengo, Dra. Mônica Ammon Fernandez e toda sua

equipe (Eloísa, Aline, Fernanda, Márcio, André e Eduardo) pela humildade, incentivo

á pesquisa, orientações morfológicas, exemplo de profissionalismo, carinho e convívio

amigo.

• Ao Dr. Paulo Marcos Zech Coelho e Dr. Omar dos Santos Carvalho e pela

colaboração em ceder alguns exemplares de Biomphalaria glabrata albinos.

• A Dra. Tânia Correia pelo incentivo à pesquisa, profissionalismo e colaboração

nos trabalhos de Imuno-histoquímica. Linda e cheia de vida!

• A Dra. Acácia por me receber com todo carinho em seu laboratório e

contribuição nas análises de imuno-histoquímica.

• A Dra. Lúcia Menezes e ao Mestre Cláudio, pelo profissionalismo, apoio

constante nas análises de microscopia eletrônica, amizade conquistada e carinho

demonstrado a todo instante.

• Ao Dr. Marcos André Vannier por me permitir fazer as análises ultra-estruturais

em seu laboratório e sua equipe, pelo bom humor freqüente, convívio amigo e carinho

demonstrado.

• Aos professores do curso de Pós-graduação em Imunologia do ICS-UFBA,

que contribuíram para o aprendizado teórico/prático das disciplinas e para o

desenvolvimento do senso crítico inerente à pesquisa.

• A secretária do colegiado, Dilcéia, mais do que uma excelente funcionária,

uma amiga, sempre disposta a minimizar e resolver qualquer problema relacionado

aos alunos, meus inestimáveis agradecimentos.

• A CAPES- Instituição financiadora deste projeto, que possibilitou a conquista de

mais um sonho.

• A Dra. Cláudia Maria da Cunha Borges, pela experiência em malacologia e

sobretudo seu espírito crítico.

• A Cristina Mota, pelo carinho e exaustiva colaboração na preparação do

material histológico, excelência em dedicação e profissionalismo e a todos os

integrantes do Laboratório de Histopatologia.

• As minhas amigas, Queli Teixeira Lemos, Isis Fernandes Magalhães, Márcia

Maria de Souza, pelo exemplo de ética, profissionalismo e carinho inestimáveis

demonstrado a todo instante.

• Aos meus companheiros Glabrata (Carine, Rafael, Manuela (s), Igor), pelo bom

convívio e amizade.

• A mestra Tininha pelo bom humor, amizade e orientação nas questões de

imuno-histoquímicas, bem como por toda atenção nos momentos necessários.

• A Dra. Alena Andrade pelas instruções esclarecedoras nas análises de

microscopia eletrônica e carinho demonstrado a todo instante.

• Aos meus amigos (Joaquim, Liliane, Zaira, Bárbara e Elisângela) pelo carinho,

troca de experiências e convívio constante.

• Ao Sr. Antônio Carlos da Silva pelo convívio amigo, colaboração em todos os

momentos de sufoco, respeito, consideração e auxílio na manutenção dos moluscos e

ciclo, durante o desenvolvimento desse estudo. O senhor é muito especial!

• Às Bibliotecárias, Ana Fiscina, Vânia, D. Edite, Eliana, Adelvan, Evany,

Rosângela e Renata; pelos auxílios nas correções bibliográficas e pela paciência em

nos atender sempre com disposição.

• Ao Centro de Pesquisas Gonçalo Muniz, UFBA-ICS e CAPES, por financiar

parte do material para realização deste trabalho, toda a infra-estrutura, bem como

pelo suporte financeiro através da bolsa de mestrado cedida durante os dois anos e

por tornar possível a realização de um sonho.

• A todos os colegas do LAPEX e LACEI - Laboratório de Patologia

Experimental e Laboratório de auto-imunidade/CPqGM, pelo apoio e incentivo durante

a Pós-Graduação.

• Aos colegas da turma do Mestrado de 2004 do ICS/UFBA, por todos os

momentos de aprendizagem e distrações durante o curso.

• A Sra. Telma, Elaine, Elenir David e Joilson Ramos, exemplo de humildade,

generosidade e vencedores. Amigos para as questões políticas, sociais, culturais e

religiosas nos últimos anos.

A todos meus eternos agradecimentos!

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS LISTA DE FÍFURAS E GRÁFICOS RESUMO ABSTRACT

1 INTRODUÇÃO ......................................................................19

1.1 REVISÃO DA LITERATURA.................................................20

2 JUSTIFICATIVA....................................................................25

3 OBJETIVOS..........................................................................26

3.1 OBJETIVO GERAL................................................................26

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS..................................................26

4 MATERIAIS E MÉTODOS......................................................27

4.1 ANIMAIS UTILIZADOS...........................................................27

4.1.1 Grupos Experimentais..........................................................27

4.2 OBTENÇÃO DE INÓCULO..................................................28

4.3 INFECÇÃO DOS MOLUSCOS...........................................29

4.3.1 Exame de Positividade....................................................29

4.4 SACRIFÍCIO....................................................................30 .

4.5 CONTAGEM DOS HEMÓCITOS....................................31

4.6 ANÁLISE MORFOMÉTRICA DO APO............................32

4.7 IMUNO-HISTOQUÍMICA................................................32

4.7.1 Marcador imunológico anticorpo monoclonal contra o antígeno Ki67..................................................................32

4.7.2 Marcador imunológico de organização nucleolar pela

Prata AgNOR..................................................................33

5 RESULTADOS...............................................................34

6 DISCUSSÃO..................................................................45

7 CONCLUSÃO................................................................51 REFEÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................52 ANEXOS

LISTA DE ABREVIATURAS

AMEBÓCITOS =Hemócitos - células de defesa dos caramujos APO Inglês (Amebocyte producing Órgão) “Órgão Produtor de Amebócitos” AgNor Proteínas nucleolares impregnadas pela prata CPqGM Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz CPqRR Centro de Pesquisas René Rachou FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz LAPEX Laboratório de Patologia Experimental NORs inglês (Nucleolar Organizer Regions) –Região de Organização Nucleolar Karnovisk Solução Fixadora Ki67 Antígeno monoclonal contra proteína que não se expressa em células na fase Go

LISTA DE FIGURAS E GRÁFICOS Figura 1- Biomphalaria glabrata Normal Figura 1: A Região do coração...............................................................................39 Figura 1: B APO......................................................................................................39 Figura 1: C Porção anterior do saco pericárdico com o APO ................................39 Figura 1: D Região do manto mostrando o APO...................................................39 Figuras (2, 3 & 4) Biomphalaria glabrata Infectada Figura 2: A Coração com acúmulo de hemócitos..................................................40 Figura 2: B Maior detalhe dos hemócitos dentro do coração................................ 40 Figura 2: C Coração de um caramujo inoculado com miracídios irradiados...........40 Figura 2: D Coração com hemócitos de um exemplar normal...............................40 Figura 3: A APO......................................................................................................41 Figura 3: B Reação encapsulante próximo ao APO...............................................41 Figura 3: C Revestimento pericárdico com o APO e reações próximas.................41 Figura 3: D Maior detalhe do APO..........................................................................41 Figura 4: A Marcação com o (KI67) na região do ovoteste.....................................42 Figura 4: B Detalhe da marcação positiva com o Ki67...........................................42 Figura 4: C Células do APO marcadas - AgNOR...................................................42 Figura 4: D Hemócitos marcados - AgNOR...........................................................42

Figuras 5 (A, B, C & D) Micrografias eletrônicas do APO Normal..............................43 Gráficos- I Contagem dos hemócitos em caramujos infectados pelo S. mansoni e

seus controles não- infectados................................................................44 Gráfico- II Morfometria da extensão do APO de caramujos infectados pelo S. mansoni e seus controles não- infectados........................................44 Gráfico- III Morfometria da espessura do APO de caramujos infectados pelo S. mansoni e seus controles não- infectados...............................................45

RESUMO

A ORIGEM DAS CÉLULAS DE DEFESA (HEMÓCITOS) NA BIOMPHALARIA GLABRATA. SAMALY DOS SANTOS SOUZA. As reações de defesa contra microorganismos são realizadas nos moluscos do gênero Biomphalaria por um único tipo de célula – o hemócito ou amebócito. Estas células, fagocíticas e móveis, existem no interior dos tecidos e circulam na hemolínfa. O seu local de origem ainda é incerto. Na Biomphalaria glabrata, admite-se que essas células se originam em um órgão situado na parede anterior do saco pericárdico denominado APO (“Amebocyte Producing Organ”). A ocorrência de hiperplasia e mitoses no APO, durante a infecção pelo Schistosoma mansoni, tem sido tomada como o principal argumento para considerá-lo um órgão hematopoiético. O trabalho estuda a localização, forma, e comportamento do “APO” em B. glabrata normal e após infecção pelo S.mansoni, no intuito de compreender o seu papel nas reações de defesa. A investigação foi feita através de estudo histopatológico, ultraestrutural e imuno-histoquímico. O APO apareceu representado por coleções de células basófilas, com núcleos redondos, ricos em cromatina e citoplasma homogêneo, escasso, formando grupos ou fileiras ao longo de uma estreita região da membrana pericárdica, com raras variações entre infectados e não-infectados, e mitoses ocasionais. A microscopia eletrônica revelou que o órgão é formado por células epiteliais justapostas, unidas por interdigitações, e ricas em organelas. Os resultados com o anticorpo monoclonal contra o antígeno Ki67, que revela fator de proliferação nuclear, deram forte positividade para esporocistos e cercárias, mas não evidenciaram marcação nos tecidos e APO. Nas preparações em que a técnica do “AgNOR” foi empregada, o resultado positivo, revelador de atividade proliferativa nucleolar, apareceu como uma coloração castanho dourada no interior do núcleolo das células em processo de divisão. Esta positividade apareceu em células localizadas em vários sítios. A marcação foi expressa no APO e em células de vários órgãos, especialmente naqueles com evidente proliferação celular, como o ovo-testis e as glândulas digestivas, tanto em caramujos normais, como nos infectados. Por outro lado, foram vistos acúmulos de hemócitos no interior de vários tecidos e nas cavidades de vários órgãos, especialmente no coração, nos animais infectados. Estes achados se correlacionaram melhor com a hipertrofia e hiperplasia das células dos revestimentos dos espaços lacunares, do que com as escassas modificações presentes no APO. Conclui-se que os presentes achados morfológicos apontam para uma origem multicêntrica dos hemócitos da B. glabrata, a partir do endotélio dos espaços vasculares (como sugerido nos estudos mais antigos).

Palavras Chaves: APO, Schistosoma mansoni, Biomphalaria glabrata, Hemócitos, Ki67.

ABSTRACT THE ORIGIN OF THE CELLS OF DEFENSE (HEMOCYTES) IN BIOMPHALARIA GLABRATA. SAMALY DOS SANTOS SOUZA. The defensive reactions against micro-organisms in snails of the genus Biomphalaria are performed by a single cell type – the hemocyte or amebocyte. These cells, phagocytic and mobile, exist in the interior of the tissues and circulate in the hemolymph. Its site of origin is still uncertain. It is admitted that these cells in Biomphalaria glabrata originate in an organ situated in the anterior wall of the pericardial sack denominated APO (“Amebocyte Producing Organ”). The occurrence of hyperplasia and mitoses within the APO during infection with Schistosoma mansoni has been taken as the main argument to consider this organ as a hematopoietic organ. This work looks at the location, form, and behavior of the APO in normal and S. mansoni-infected B. glabrata, aiming at understanding its role in defense reactions. The investigation was performed by means of a histopathological, morphometrical, ultra-structural an immuno-histochemical study. The APO appeared represented by collections of basophilic cells with round nucleus rich in chromatin, and a homogenous cytoplasm, forming rows alongside a narrow region of the pericardial membrane. There were mild variations in the APO of infected snails in comparison with non-infected controls. Presence of mitoses was not a differential feature. Electron microscopy revealed that the organ is formed by juxtaposed epithelial cells, rich in organelles, united by inter-digitations. Monoclonal antibody against the Ki67 antigen, which reveals a factor of nuclear proliferation, gave a strong positivity for sporocysts and cercarias, but failed to be expressed on snail tissues, including the APO. In the preparations where the AgNOR technique was applied, the positive results, indicative of nucleolar proliferative activity, appeared with a golden brown color in the interior of the nucleolus of cells in the process of division. The marking was expressed in APO and in cells from various organs, especially in those with clear cellular proliferation, such as the ovotestis and digestive glands, both in normal snails and in those infected. On the other hand, accumulation of hemocytes in the interior of various tissues and cavities of various organs, especially the heart, were observed in the animals infected. These findings correlate better with hypertrophy and hyperplasia of the lining cells from the lacunar spaces, than with the scarce modifications present in the APO.

Conclusion: Hemocytes in B. glabrata seem to originate from the endothelial lining of the vascular spaces throughout the snail body, as suggested in earlier studies rather than from a unique central organ, the APO.

Key words : APO, Schistosoma mansoni, Biomphalaria glabrata, Hemócitos, Ki67.

INTRODUÇÃO

O molusco Biomphalaria glabrata (SAY, 1918) é o principal hospedeiro

intermediário do Schistosoma mansoni SAMBON 1907, no Brasil. As relações entre o

verme e o seu hospedeiro intermediário constituem um importante elo da cadeia

epidemiológica da esquistossomose, pois o grau de susceptibilidade ou resistência

apresentado pelo molusco numa determinada área geográfica tem relação direta com

o grau de endemicidade e de gravidade da esquistossomose. Por isso, estas relações

têm sido muito estudadas. Os moluscos mais resistentes, aqueles que quando

infectados eliminam poucas cercarias, exibem nos seus tecidos uma forte reação

celular em torno dos esporocistos e cercarias em desenvolvimento. Essas reações de

defesa são feitas por um único tipo celular – os hemócitos ou amebócitos – que são

células móveis que fagocitam corpos estranhos, e também secretam moléculas ativas

contra os parasitos, lembrando na sua forma e função, os macrófagos dos

vertebrados. Estão por toda à parte do organismo, vagando no interior dos tecidos e

circulando na hemolinfa, mas o seu local de origem ainda é controvertido. Há duas

idéias em curso entre os pesquisadores. Uma, a mais antiga, admite que os

hemócitos tenham uma origem multicêntrica, a partir de células que compõem o

tecido conjuntivo do molusco; outra que propõe uma origem em um órgão especial,

localizado na parede da porção sacular do órgão renal, a qual forma parte do saco

pericárdico, e que foi denominado APO (uma sigla do inglês “Amebocyte Producing

Organ”). O principal argumento para considerá-lo órgão hematopoiético foi à

ocorrência de hiperplasia e mitose nas células do APO durante a infecção pelo S.

mansoni, relatado por alguns autores. Há também a suspeita da existência de células

20

blásticas entre as células do órgão. O APO funcionaria como um análogo da medula

óssea dos vertebrados. Estas idéias ganharam aceitação tácita, e hoje em dia vêm

sendo admitidas como um assunto já bem estabelecido.

No curso de exames microscópicos de moluscos normais e infectados pelo S.

mansoni, em que particular atenção foi dada para o exame do APO, vários aspectos

foram observados que sugerem terem os hemócitos uma origem multicêntrica. Estes

aspectos serão aqui descritos e discutidos.

1.1 REVISÃO DA LITERATURA

Os moluscos pertencentes ao gênero Biomphalaria, possuem na região entre o

pericárdio e o epitélio posterior da cavidade do manto, uma estrutura que é

considerada como o órgão principal para hematopoiese. Segundo alguns autores,

este órgão seria responsável pela produção de células circulantes, denominadas

genericamente de hemócitos ou amebócitos. Tais células, após sua formação, podem

ser encontradas tanto na hemolinfa quanto nos espaços intersticiais. Em caramujos

infectados, elas mobilizam-se em direção ás regiões onde aparecem as formas

parasitárias, acumulando-se ao seu redor e formando cápsulas ou complexos

encapsulantes (LIE et al., 1975).

BAECKER (1932) afirmou ser desconhecida a origem dos amebócitos nos

pulmonatas. Estudos realizados por HAUGHTON (1934) indicaram primariamente os

espaços sanguíneos dos invertebrados como sítio de produção destas células.

Segundo PAN (1958) os possíveis sítios normais de produção dos amebócitos seriam

os sinusóides sanguíneos e a parede da porção sacular do rim, os quais formam a

porção sacular do pericárdio. A parede da porção sacular do rim que margeia o

21

pericárdio é dito pôr este autor ser composto de tecido primitivo de provável origem

mesenquimatosa e é considerado como possível tecido hematopoiético, tendo os

componentes celulares, forma esférica ou oval, mas com perfil irregular e, em certas

condições patológicas, pode-se evidenciar a hiperplasia desse tecido.

PAN (1965) descreve tal estrutura como comparável a um tecido linfóide, que

se torna frequentemente hiperativa durante as cinco primeiras semanas de infecção,

mas que geralmente se tornava escassa de elementos celulares no momento em que

as respostas teciduais generalizadas apareciam.

Em B. glabrata e Bulinus sp., foi identificado um órgão localizado entre o

pericárdio e o epitélio posterior da cavidade do manto. A ultraestrutura desse órgão foi

descrita pela primeira vez por (JEONG et al., 1983; KINOTI, 1971). Em caramujos

controles o órgão se caracterizava como uma estrutura pequena e superficial,

constituída de células alongadas com citoplasma basófilo e núcleos que variavam de

ovais a alongados, provindas da membrana posterior da cavidade do manto, onde as

mitoses são poucas ou ausentes. Estas células são encontradas em pequenos grupos

ou nódulos variando em espessura de 25 á 40µm. Em caramujos infectados e re-

infectados com S. mansoni ou Echinostoma caproni, o APO foi observado

indistintamente maior, resultante tanto de hiperplasia quanto de hipertrofia, sendo que

as figuras mitóticas ficavam evidentes nos primeiros dias da infecção (1 – 3 dias). Os

nódulos de células proliferadas ficam confluentes formando uma massa celular, que

varia de espessura entre 230 á 400µm. Os parasitos nunca foram vistos neste órgão

(LIE & HEYNEMAN, 1975; JOKY & MATRICON - GONDRAN, 1985).

Durante a sensibilização da B. glabrata induzida por única infecção com

Echinostoma lindoense, os esporocistos deste trematódeo começaram a ser

encapsulados e destruídos pelos amebócitos. Esta reação apresentada pelo

22

hospedeiro foi associada à intensa atividade mitótica e ao aumento do APO. Quando

observado a porção sacular do rim e ocasionalmente, a região dorsal do reto, as

mitoses também foram vistas em caramujos sensibilizados, sendo constatado que os

amebócitos continuavam se dividindo em outras áreas do caramujo, formando locais

de produção como se fosse uma extensão do sítio produtor (APO), LIE et al. (1976).

Estas observações estão de acordo com os achados de SMINIA et al. (1974), que

mostraram que os amebócitos têm capacidade de se dividir na linfa e nos tecidos.

Em seu artigo KINOTI (1971) identificou um órgão similar nas espécies de

Bulinus examinadas: B. africanus Krauss, 1848; B. truncatus Audouin, 1827; B.

tropicus KrausS,1848; ao encontrado em B. glabrata, que em secções histológicas

apresentam núcleo grande com aproximadamente 7µm e citoplasma escasso. Estas

células migravam em direção aos sinusóides sanguíneos, central e periférico, de onde

eram transportadas para toda a parte do corpo.

Um órgão “linfóide” de similar localização foi também descrito em várias

espécies de Lymnaea (RONDELAUD & BARTHE, 1981, 1982; RUELLAN &

RONDELAUD, 1992); especialmente em L. truncatula MULLER, 1774. Tal órgão está

localizado entre o pericárdio e o rim; possui uma extremidade anterior afilando-se na

direção do ducto conectivo dos túbulos renais e o pericárdio, tendo uma face

pericárdica que é lisa e ligeiramente curvada, e uma face renal, que é frequentemente

protraída e às vezes angular. A extremidade posterior do órgão tem limites indefinidos

com o tecido conjuntivo adjacente. Os autores citam que as dimensões do órgão são

pequenas em caramujos controle; o comprimento não excede 150µm, com largura

que varia entre 30 e 60µm. O percentual de células do tecido conjuntivo é

predominante em 65%; estas células possuem núcleo redondo ou oval, às vezes em

forma de rim e sua posição nas células é frequentemente central, ou excêntrico.

23

Quanto ao citoplasma, é arredondado, ligeiramente granular e espesso, onde as

mitoses são raras. Quando exposto à infecção pela Fasciola hepatica, o órgão

aumenta de volume, chegando a alcançar 300µm, com largura média de 150µm;

apresentando numerosas mitoses, que também foram vistas nos tecidos conjuntivos e

em várias formações nodulares entre as glândulas digestivas, em complexos

encapsulantes formados em torno dos trematódeos presentes, envolvendo ambas as

células, maduras e jovens (RONDELAUD & BARTHE, 1981).

Estudos ultraestruturais desta região em Lymnaea truncatula exibem uma típica

estrutura de um órgão de filtração - o rim; similar ao APO, observado em B. glabrata

(MATRICON-GONDRAN, 1990A; MONTEIL & MATRICON-GONDRAN, 1991).

Portanto a parte proximal do rim de L. truncatula difere do APO de B. glabrata. De

acordo com os autores, a origem dos hemócitos nesta espécie parece ser difusa.

Estes achados estão em acordo com dados pertinentes, observados por (SMINIA et

al., 1972,1974) em Lymnaea stagnalis. Em exames prévios, SMINIA em 1972, na

estrutura dos componentes (células e fibras do tecido conectivo), evidenciou que

células do sangue (amebócitos) ocorrem não somente na circulação sanguínea, mas

também nos tecidos conjuntivos. A presente observação mostrou que os amebócitos

nos tecidos não possuem características que lembrem células embrionárias,

sugerindo que amebócitos do sangue e dos tecidos não diferem essencialmente em

estrutura e função, não observando assim, a presença de órgão hematopoiético bem

definido em L. stagnalis, indicando que os tecidos conectivos e o sangue circulante

estão envolvidos na formação dos amebócitos.

Nos moluscos gastrópodes e bivalves não é mencionada a presença de um

órgão hematopoiético especializado (CHENG & RIFKIN, 1970; NARAIN, 1973);

existindo assim, uma indicação de que nestes animais, as células do sangue são

24

formadas por todo o corpo. Os autores sugerem, que a presença de amebócitos se

dividindo, tanto na circulação sanguínea como no tecido conectivo, favorece o grande

sucesso adaptativo destas espécies, que ocupam posição de destaque no filo

Mollusca (CUENOT, 1892; GEORGE & FERGUSON, 1950; BROWN & BROWN,

1965).

25

2. JUSTIFICATIVA

Os invertebrados são animais muito adaptáveis, por isso têm sobrevivido

em ambientes os mais variados. O seu sistema de defesa é primitivo, mas encerra

ainda aspectos pouco estudados, e que são importantes para os estudos básicos de

biologia comparada. Suas reações de defesa se fazem primordialmente através de

um único tipo celular – o hemócito. Apesar da importância de tal célula, ainda hoje se

discute a sua origem. O presente estudo visa contribuir para esclarecer a origem dos

hemócitos na B. glabrata, o molusco hospedeiro intermediário do S. mansoni,

causador da esquistossomose humana. Há duas correntes de estudos: uma mais

antiga, que considera que os hemócitos possam se formar em vários sítios do

organismo, e outra mais recente, que postula uma origem focal, em um órgão

especial, que foi denominado APO (da sigla em inglês “Amebocyte Producing

Organ”). O presente estudo confronta estas duas possibilidades e traz subsídios que

favorecem uma origem multicêntrica dos hemócitos.

26

3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Contribuir para o entendimento das reações de defesa da B. glabrata na sua

interação como hospedeiro intermediário do S. mansoni.

3.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS

A - Identificar através de análises histopatológicas, imuno-histoquímica e de

microscopia eletrônica, a localização, forma e comportamento do “APO” em B.

glabrata normal e após infecção pelo S.mansoni, no intuito de compreender o seu

papel nas reações de defesa.

B – Considerar a alternativa dos hemócitos poderem ter uma origem em vários órgão,

através da participação das células endoteliais do revestimento dos espaços

vasculares, empregando a mesma metodologia da usada para a análise do APO.

27

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 ANIMAIS UTILIZADOS

Foram utilizados exemplares de B. glabrata provenientes da linhagem de Feira

de Santana. Esta linhagem é mantida há vários anos no moluscário do CPqGM e

utilizada até hoje na rotina de manutenção do ciclo do S. mansoni. Além disso, foram

usados espécimes de B. glabrata albino provenientes de Belo Horizonte – CPqRR

(infectados pela cepa LE dos S. mansoni), cedidos pelo Dr. Paulo Marcos Zech

Coelho e Dr. Omar Carvalho. Estes exemplares foram incluídos na esperança de

virem a apresentar reações celulares em torno de esporocistos e cercárias, e por

serem albinos, pois a presença de pigmentação dificulta a leitura das lâminas

preparadas com técnicas imuno-histoquímicas.

4.1.1 Grupos Experimentais

Os animais foram divididos em dois grupos:

1- Grupo experimental - 50 caramujos medindo entre 11-13mm (40-60 dias)

selecionados aleatoriamente dos aquários de criação foram expostos a 20 miracídios

do S. mansoni (cepa FS- ANDRADE & SADIGURKY, 1985). Estes animais foram

28

divididos de acordo com a duração da infecção, a qual variou de 1, 5, 15, 35 e 45

dias.

2- Grupo controle - 25 caramujos medindo entre 11-13mm, não infectados,

sacrificados ao mesmo tempo que os animais do grupo anterior.

4.2 OBTENÇÃO DE INÓCULO

Oito (8) camundongos suíços Mus musculus (JACOBY et al.,2002), com no

mínimo 50 dias de infecção pelo S. mansoni, foram anestesiados com éter etílico e

sacrificados pelo deslocamento da coluna cervical. Após tal procedimento foram

feitas as retirada dos fígados os quais foram esmagados em um tamis Granutest,

USBS 40, com abertura de 0,42mm – número 35, colocando-se, então, o material em

um cálice de sedimentação, completando com salina á 0,85% e levando-se à

geladeira por 50 minutos.

Decorrido este tempo o sobrenadante foi desprezado e adicionado a este, nova

salina a 0,85%; levando-se novamente à geladeira por mais 50 minutos. O

sobrenadante foi novamente descartado e adicionado água destilada ao recipiente,

despejando-se todo o conteúdo do cálice em um vasilhame de boca larga (tipo

cristalizador) que foi deixado sob luz intensa (3 lâmpadas de 60 watts) por 30

minutos. Em seguida, o líquido foi transferido para um balão volumétrico envolto em

papel escuro, deixando-se apenas o gargalo descoberto, por um tempo de 10 a 20

minutos exposto à luz, de onde 1 ml do líquido do gargalo foi retirado e, após

contagem do número de miracídios, ajustou-se o inóculo necessário para obtenção

de 20 miracídios/ ml, usado para infecção dos moluscos.

29

4. 3 INFECÇÃO DOS MOLUSCOS

Os animais foram colocados em pequenos poços em placa de cultura

contendo 1/ml do inoculo (20 miracídios do S. mansoni) e adicionado água, o

suficiente para que cada animal pudesse ficar totalmente submerso durante 4 horas.

Após exposição os caramujos foram acondicionados em aquários contendo três litros

de água descolorada e um pouco de terra.

4. 3.1 Exame de Positividade

Após quatro semanas de infecção os moluscos foram lavados em água

corrente e colocados, individualmente, em tubos de plásticos pequenos de 50ml, com

cerca de 4ml de água e exposto a um foco de luz (3 lâmpadas de 60W), durante 1

hora e 30 minutos, para verificar a positividade através da eliminação de cercárias.

Decorrido este tempo de exposição, foram retirados 1ml da água e colocando-a em

placas de vidro escavadas de 20 poços onde foi acrescentada 1 gota de Lugol 1%

para fixação e coloração das cercárias. A contagem das cercárias coradas foi

realizada com o auxílio de uma lupa estereoscópica e um contador manual de

células.

30

4.4 SACRIFÍCIO

Os moluscos foram sacrificados com 1, 5, 15, 35 e 45 dias pós - infecção. Os

animais foram colocados em uma cuba com água e cristais de mentol (anestésico),

pôr no mínimo 3 a 4 horas. Depois do tempo estabelecido, retirou-se o excesso da

água com papel toalha e, com uma haste com algodão umedecido em álcool a 70%

completou-se a limpeza da concha com a retirada dos detritos aí aderidos. As

conchas dos exemplares foram perfuradas com agulha de 13 x 4 mm, próximo à

região cefalopodal a fim de coletar a hemolinfa extravasada. Com uma pipeta

automática, 20µl da hemolinfa foi coletada e transferida para tubos ependorffs

estéries devidamente etiquetados e mantidos no gelo, deixando-se sedimentar por 5

mim para deposição dos resíduos da concha.

Após tal procedimento, os caramujos foram dissecados sob visualização em

um microscópio estereoscópico. Com uma lâmina de vidro a concha do molusco foi

fragmentada e com uma pinça as partes moles foram removidas. Foi feita uma

dissecção, começando com uma incisão no lado esquerdo da região renal, com o

auxílio de um estilete, a fim de localizar o coração, que era removido e daí se isolava

a região do APO, a qual era processada para análise em microscopia eletrônica e

óptica. Para microscopia óptica, o APO e outros órgãos foram colocados em uma

solução de Formol Salina a 10% onde permanecia por 2-4 horas. Decorrido este

tempo, o material foi transferido para o álcool a 70% até o momento da inclusão em

blocos de parafina, para realização de cortes seriados (5 micrômetros de espessura)

para coloração em hematoxilina-eosina e imunomarcação.

31

Para Microscopia Eletrônica, os APOS foram fixados em solução de Karnovisk

durante duas horas em temperatura ambiente, sofrendo em seguida lavagens rápidas

em tampão cacodilato a 0,2M. Para pós-fixação foi utilizada uma mistura de tetróxido

de ósmio a 2% + cacodilato 0,2M na proporção de 1:1, por uma hora em temperatura

ambiente no vácuo. Decorrido este tempo, o material foi lavado em cacodilato a 0,2M

à temperatura ambiente e desidratado em ordem crescente de acetona

(30%,50%,70%,90% e 100%). O material foi colocado em uma mistura de resina

Poly-bed 812 sem DMP3 e acetona por 12 horas ou da noite para o dia, à

temperatura ambiente, seguindo impregnação, por 7 horas em resina com DMP3 no

vácuo e temperatura ambiente e posterior emblocamento em moldes plástico para

secar em estufa a 60ºC a fim de que a resina polimerizasse. Após polimerização,

estes blocos foram cortados em ultramicrótomo de marca Reichert-Supernova. Foram

feitos cortes semi-finos de 1µm e selecionados os melhores para posterior realização

dos cortes ultrafinos (50nm), os quais foram contrastados com acetato de uranila, e

depois em citrato de chumbo para análise ao microscópio eletrônico da marca Zeiss,

sob voltagem de 50mV.

4.5 CONTAGEM DOS HEMÓCITOS

Amostra de 10µl de hemolinfa de cada animal foi coletada e misturada em 90µl

de corante vermelho neutro a 1%. Desta solução, foram retirados 10µl e colocados

em câmara de Naubauer e observadas ao microscópio óptico da marca Leica Galen

III para contagem e verificação dos subtipos celulares em objetiva de 40X. Esta

contagem foi realizada sistematicamente por dois observadores.

32

4.6 ANÁLISE MORFOMÉTRICA DO APO

Foram examinadas secções randômicas de cortes do APO, através da análise

morfométrica automática utilizando-se um Sistema Processador e Analisador de

Imagens em microscópio (Zeiss Axioskop 2, Alemanha) com sistema de câmera

acoplada (JVC TK-128OU, Japão) utilizando software Axiovision 2.0 Zeiss. Para os

estudos morfométricos, foram verificadas a extensão e espessura dos APOs.

O sistema foi calibrado para uma ampliação com aumento de 10x e 40x,

utilizando-se o foto-microscópio Axioskop 2-Zeiss, medindo-se a extensão e largura

do APO em µm². Os dados obtidos das várias medições e dos vários animais foram

avaliados através do teste de Kruskal Walles com intervalo de confiança de 95%, com

o auxílio do sofwear Bioestat.

4.7 IMUNO-HISTOQUÍMICA

4.7.1 Marcador Imunológico Anticorpo Monoclonal contra o Antígeno

Ki67

Cortes seriados (5µm) de caramujos normais e infectados contendo o APO

foram obtidos em lâminas silanizadas e após desparafinização em xilol e hidratação

em concentrações decrescentes de álcool etílico foram submetidos à exposição

antigênica pelo calor úmido em tampão citrato pH 6.0. O bloqueio da peroxidase

endógena foi feito com metanol e peróxido de hidrogênio a 3%. O anticorpo primário

monoclonal anti-Ki67 humano (DAKO, Carpinteria, USA) clone MIB-1 foi utilizado na

33

diluição de 1:100 e incubado em câmera úmida a 4ºC por 16h. Seguiu-se de

incubações com o anticorpo secundário biotinilado e estreptoavidina - peroxidase com

o Kit LSAB + HRP (DAKO) e a revelação da reação foi feita com diaminobenzidina

(DAB/H2O2 - DAKO), conforme especificações do fabricante. A contra-coloração foi

feita com hematoxilina de Harris ou verde metila.

4.7.2 Histoquímica utilizando a técnica de coloração pela prata, para

evidenciar regiões organizadoras de nucléolos (Agnor)

Cortes seriados (5µm) de caramujos normais e infectados contendo o APO

foram obtidos em lâminas silanizadas e após desparafinização em xilol e hidratação

em concentrações decrescentes de álcool etílico foram submetidos a duas gotas da

solução de gelatina 2% + ácido fórmico 1% e quatro gotas da solução de nitrato de

prata. As lâminas foram cobertas com lamínula e levadas para estufa á 60ºC por 3-4

minutos até atingir a cor marrom dourada. Depois de retirada da estufa as lâminas

passaram por lavagens rápidas em água corrente e apirogênica, em seguida foram

submetidas a solução de tiossulfato de sódio 5% por 3 minutos e contra-coradas com

giemsa diluído em PBS 3:1 por 10 minutos e montadas com bálsamo do Canadá.

34

5. RESULTADOS

As análises feitas através da microscopia óptica revelaram que a estrutura tida

como órgão central formador de amebócitos no molusco B. glabrata –o chamado

APO- apresentou características histológicas que não diferiram essencialmente

daquelas presentes nos exemplares não infectados.

Na região próxima à porção sacular dos túbulos renais foi observada a

presença de um coração com seus dois átrios e um ventrículo, envolto pelo saco

pericárdico. Aí foi identificado o APO, o qual se apresentou como uma camada fina e

longa de células epiteliais basófilas, compactamente arrumadas, com núc leos

redondos, ricos em cromatina e com citoplasma homogêneo e escasso (Fig. 1: A, B,

C & D). As células geralmente formavam grupos ou fileiras ao longo de uma estreita

região da membrana pericárdica. Além da investigação ser feita no APO, a pesquisa

foi dirigida também para a área do coração e outros órgãos, tais como glândulas

digestivas, ovoteste e túbulos renais.

O acúmulo de células hemocitárias ocorreu particularmente no coração, tendo-

se aí encontrado, tanto em animais controles como infectados, compactas coleções

de células arredondadas, isoladas, com núcleos fortemente corados e citoplasma

levemente eosinofílico. Foi possível observar algumas células em estágio de mitose

no interior da cavidade ventricular, bem como nas proximidades da região sacular do

rim (Fig. 2: A, B, C & D).

Nos tecidos dos animais infectados foram vistas numerosos esporocistos e

cercárias em diferentes fases de desenvolvimento, com ou sem reação evidente em

torno dos mesmos. Mesmo no interior do APO tais achados foram observados.

35

Nestes casos, foi possível se verificar estruturas parasitárias envolvidas por reações

encapsulantes, sem que as células do APO mostrassem reações evidentes e sem

que a faixa ocupada por essa estrutura estivesse alargada ou hiperplásica (Fig 3: A,

B, C & D). Estes achados de disseminada proliferação de esporocistos e cercárias,

em vários estágios de desenvolvimento, sem reação nos tecidos do hospedeiro foram

observados em animais do presente experimento, denunciando a presença de alta

susceptibilidade da cepa dos moluscos ao S. mansoni. Por outro lado, alguns animais

deste mesmo grupo exibiam um padrão morfológico característico de animais

resistentes, com proliferação de hemócitos e formação de estruturas granulomatosas

encapsulantes, em torno de esporocistos bem desenvolvidos. Todavia, mesmo nestes

animais, com reações encapsulantes presentes nas proximidades e até mesmo no

interior do APO, tais reações gerais ou hiperplásicas não foram observadas no APO

destes mesmos animais, embora tenha sido detectada a presença de eventuais

figuras de mitose em alguns deles.

O número de hemócitos circulantes entre os caramujos normais e os

infectados variou de forma discreta, apresentando uma média em torno de 0,25x 105

á 1,70x 105 e 1,35 x 105 á 4,32 x 105, respectivamente. No Pós-teste de Dunn’s esta

variação não foi estatisticamente significante, com exceção do número de hemócitos

do grupo com cinco dias de infecção, quando comparado ao do grupo normal, que

apresentou um pH 0.05 (Gráfico I).

Na hemolinfa coletada de caramujos normais e infectados, foram identificados

dois tipos de hemócitos: os hialinócitos e os granulócitos. Os hialinócitos

apresentaram-se como células imaturas, esféricas e pequenas, ao passo que os

granulócitos exibiram núcleo excêntrico e citoplasma expandido em finos

prolongamentos citoplasmáticos.

36

A análise morfométrica do APO nos animais controles demonstrou que a

extensão do APO variava entre 287,92 µm a 885,17 µm; com espessura de 21,17µm

a 35,17µm. Em animais infectados variou de 390,5 µm a 975,83 µm; com espessura

de 29,16µm a 57,17µm (Gráfico II & III). As diferenças não tiveram significado

estatístico.

Para se verificar a presença de mitoses no APO de caramujos normais e

infectados com S. mansoni, além da histologia clássica com lâminas coradas em H &

E, foi utilizado também um marcador imuno-histoquímico, o Ki67, que é uma proteína

de localização nuclear que se expressa durante a divisão nuclear. Trata-se de um

indicador de proliferação celular, com expressão específica nos estágios de G1, S, G2

e M. A reação de imunoperoxidase indireta revelada pelo cromógeno DAB, evidenciou

nos sítios de ligação antígeno-anticorpo, uma cor castanho-dourada. Ela foi negativa

para a presença do antígeno Ki67 no APO tanto dos animais infectados quanto nos

animais não infectados, bem como em todos os outros tecidos do molusco. No

entanto, foi positiva nos esporocistos e, com menor freqüência, nos estágios

evolutivos das cercárias (Fig. 4: A & B).

Nas preparações em que a técnica do “AgNOR” foi empregada, o resultado

positivo, revelador de atividade proliferativa nucleolar, apareceu como uma coloração

castanho dourada no interior do núcleolo das células em processo de divisão. Esta

positividade apareceu em células localizadas em vários sítios. A marcação foi

expressa no APO e em células de vários órgãos, especialmente naqueles com

evidente proliferação celular, como o ovo-testis e as glândulas digestivas, tanto em

caramujos normais, como nos infectados (Fig. 4: C & D).

37

A microscopia eletrônica revelou que o APO possui muitas organelas, tendo

características típicas de células epiteliais justapostas, apresentando microvilosidades

na sua superfície livre. Puderam ser observados núcleos excêntricos com cromatina

condensada. O citoplasma denso exibia retículo endoplasmático liso e, sobretudo,

rugoso, complexo de Golgi e numerosas mitocôndrias e raros lisossomos. Na

membrana externa, a presença de inúmeras interdigitações e alguns desmossomos

delimitava e ancorava uma célula com outra (Fig. 5: A, B, C & D). Foi possível verificar

também, vacúolos de gordura, rosetas de glicogênio e microtúbulos. O APO possui

lâmina basal espessa e subjacente a esta estrutura, é possível verificar-se um tecido

conectivo contendo fibras musculares lisas com finos filamentos de actina e de para-

miosina, estes um pouco mais espessos. Alguns amebócitos foram vistos no interior

do APO e um número maior deles no tecido conjuntivo, logo abaixo da membrana

basal que delimita o APO.

38

1A – Região do coração de B. glabrata normal, mostrando o revestimento pericárdico com o APO (seta) o coração com o ventrículo único (V) e os dois átrios (A), próximos aos túbulos renais (asteriscos). Microscopia óptica, Hematoxilina & Eosina, X100.

®

© ©

APO

V

A

*

APO

Prancha 1

1B – APO- “ Òrgão Produtor de Amebócitos” de um exemplar normal de B. glabrata (FS/BA) formado por células arredondadas e basofílicas (seta) entre a região sacular do rim (®) e o coração (©). Microscopia óptica, Hematoxilina & Eosina, X200.

1C – Porção anterior do sacular pericárdico mostrando o APO em maior detalhe. APO composto por células basofílicas compactamente arrumadas em fileiras, ao longo da fita pericárdica (seta). Animal normal. Hematoxilina & Eosina, X200.

1D – Região anterior do manto onde se vê o APO formado por células arredondadas, coradas fortemente pela Hematoxilina & Eosina, (seta), e com núcleos excêntricos. Microscopia óptica. X400.

39

Prancha 2

2A – Coração de B. glabrata infectada pelo S. mansoni, onde se observa um acúmulo de hemócitos no interior da cavidade ventricular, que se estende entre as fibras cardíacas (asterisco). Microscopia óptica. Hematoxilina & Eosina, X200.

*

¯ ¯

2B – Maior detalhe dos hemócitos no interior do coração, (seta). Estas células parecem estar em deslocamento progressivo a partir do revestimento endotelial para o interior dos espaços vasculares. Microscopia óptica, Hematoxilina & Eosina, X400.

2C – Coração de um caramujo inoculado com miracídios irradiados. Observa-se a formação de nódulos hemocitários na cavidade ventricular (asteriscos). Microscopia óptica. Hematoxilina & Eosina, X200. (Foto por gentileza da colega Carine Azevedo).

2D – Coleção de hemócitos dentro da cavidade ventricular vista em um caramujo não infectado (seta longa).Microscopia óptica. Hematoxilina & Eosina, X100.

40

Prancha 3

©

APO

3A – APO de B. glabrata infectada pelo S. mansoni. As células do APO estão arrumadas em fileiras, ao longo do pericárdio (seta vazada), sem evidência de proliferação. Nota-se a presença de esporocistos próximos ao APO (seta longa)b e coração (©). Hematoxilina & Eosina, X100.

3C – Revestimento pericárdico onde se vê o APO de um caramujo infectado pelo S. mansoni, constituído por um grupo de células compactamente arrumadas (seta longa). Próximo a essa região vê-se uma reação em torno de parasitas (seta listrada). Observa-se ainda, que não há evidências de hiperplasia no APO. Microscopia óptica. Hematoxilina & Eosina X100.

3B – APO de dimensões dentro dos limites normais, mas onde é possível se observar uma reação encapsulante em torno á parasitas em degeneração, (seta). Microscopia óptica. Hematoxilina & Eosina, X200.

3D – Maior detalhe do APO, com suas células esféricas e basofílicas. Nota-se a presença de material amorfo pigmentado entre as células, provavelmente derivado de parasitas, (seta). Microscopia óptica. Hematoxilina & Eosina X400.

41

Prancha 4

4A – Região do ovoteste de B. glabrata infectada pelo S. mansoni (FS/BA). Observar a marcação em castanho dourado nos esporocistos e nas cercárias e sua ausência no restante do tecido, (seta). Imunohistoquímica com monoclonal contra o antígeno Ki67, X200.

4B – Maior detalhe do ovoteste mostrando a marcação positiva no esporocisto e cercaria bem desenvolvida. Imunohistoquímica com Ki67, X200.

4C – Células do APO, onde se observa a marcação nucleolar em castanho-escuro pela impregnação pela prata, (seta). AgNOR, X400.

4D – Coleção de hemócitos no ovoteste, marcados pela prata, (seta). AgNOR, X400.

42

Prancha 5

5A – Aspectos das células epiteliais justapostas, apresentando microvilosidades na sua superfície livre (seta longa), retículo endoplasmático rugoso (seta curta) e desmossomos (seta larga).

5B – Células do APO contendo material de secreção aparentemente em processo de eliminação (seta branca).

5C – Maior detalhe da figura anterior. Notar interdigitações de membrana celular (seta longa) e a presença de mitocôndrias, vacúolos e grumos de glicogênio.

5D – Mitocôndrias do APO em maior aumento. A membrana interna está organizada em cristas (seta vazada). Observar a presença de DNA mitocôndrial (seta larga).

43

Normal 1dpe 5dpe 15dpe 30dpe 45dpe0

250

500

750

1000

Tempo de Infecção

Ext

ensã

o A

PO

(µ

m)

Gráficos (I, II & III)

Gráfico: 01 – Média de hemócitos obtidos em diferentes períodos da infecção. Hemolinfa fresca, (10µl). Observação nos 4 campos da câmara de Naubauer. Teste Kruskal Walles com intervalo de confiança 95%.

Normal 1dpe 5dpe 15dpe 30dpe 45dpe0

1

2

3

4

5

Tempo de Infecção

Nº

célu

las

(x 1

05)

Gráfico: 02 – Análise morfométrica dos APOs de caramujos infectados em diferentes dias, pelo S. mansoni, e seus controles não-infectados. Cada coluna representa o comprimento dos APOs. Teste Kruskal Walles. Intervalo de confiança 95%.

44

Normal 1dpe 5dpe 15dpe 30dpe 45dpe0

25

50

75

Tempo de Infecção

Esp

essu

ra A

PO

(µ

m)

Gráfico: 03 - Análise morfométrica dos APOs de caramujos normais e infectados em diferentes dias, pelo S. mansoni. As colunas representam a espessura dos APOs. Teste Kruskal Walles. Intervalo de confiança 95%.

45

6. DISCUSSÃO

Embora a tendência atual seja a de admitir que os hemócitos na B. glabrata

tenham uma origem comum em um órgão central – o APO – que seria uma espécie

de medula óssea, gerando as células circulantes responsáveis pela defesa do

organismo, os nossos achados não demonstraram evidências que apoiassem esta

possibilidade.

Segundo JEONG & HEYNEMAN (1983), o APO funcionaria como um análogo

da medula óssea dos vertebrados. Esse autor, concordando com SULLIVAN et al

(1984, 1990, 2004, 2005) utiliza como principal argumento o fato de se observar

hiperplasia e mitoses em células do APO durante a infecção pelo S. mansoni. Outro

tipo de evidência para mostrar o APO como o local onde se originam os hemócitos,

tem sido tentado com uma técnica de transplante de um APO de um animal

resistente para outro suceptível ao S. mansoni. SULLIVAN & SPENCE (1994),

relataram sucesso em tais experimentos. Todavia, existem várias limitações.

O APO é uma estrutura difícil de ser dissecada e isolada. Ela exibiu uma

distribuição focal e, como ocupava uma faixa muito estreita, o seu encontro ficava

dificultado em secções tomadas aleatoriamente, o que exigia cortes escalonados ou

seriados da região, para ser encontrada. As dissecções facilitavam a tarefa de se

obter blocos com maiores chances de se localizar o APO. Mas, deve-se considerar

que, além do fragmento que contem o APO ser muito pequeno, ele é friável, e requer

cuidados especiais para o seu isolamento e sua inclusão em parafina, para que seja

possível obter cortes seriados contendo todo o APO e regiões próximas. Nas

46

preparações obtidas nunca foram vistas grandes coleções de hemócitos no interior

ou nas proximidades imediatas do APO. Entretanto, tais coleções foram encontradas

nos revestimentos dos espaços vasculares de outros órgãos e estas células exibiam

sinais de multiplicação, a saber, aumento numérico e evidência morfológica de

descolamento progressivo a partir do revestimento endotelial para o interior dos

espaços vasculares.

Em algumas tentativas de que temos conhecimento, quando o produto da

dissecção foi analisado histologicamente, estava representado pelo coração. Assim

tais transplantes podem levar muitos hemócitos do caramujo resistente além do

APO. Alguns controles podem diminuir tais problemas, mas são muito difíceis de

serem avaliados.

O APO tem sido observado também em Echinostoma lindoense e

Echinostoma caproni (JEONG et al, 1980; JOKY & MATRICON-GONDRAN, 1985;

LIE et al, 1976), e na Lymnaea truncatula (MONTEIL & MATRICON-GONDRAN,

1991; RONDELAUD & BARTHE 1982). Nesta última espécie, os autores não

concordam que o APO seja o órgão formador de hemócitos e sim um local de

filtração da linfa.

Como vimos nossos achados demonstraram ausência de modificações

apreciáveis do APO, mesmo quando estruturas parasitárias foram encontradas no

seu interior. Também dados morfométricos falharam em demonstrar diferenças

significativas no numero de células, no comprimento e na largura do APO, em

animais infectados quando comparados com os controles normais. Estes dados

discordam dos achados observados por RONDELAUD & BARTHE (1981), que

evidenciaram uma extensão aumentada no APO de caramujos infectados pela F.

hepática, apresentando comprimento entre 90µm a 310µm com 1 e 2 dias de

47

infecção e alargamento entre os dias 7 e 14, quando comparados com os caramujos

controles. Já as mitoses, estas foram encontradas na presente investigação apenas

ocasionalmente e após pesquisas exaustivas. Todavía, JOKY & MATRICON-

GONDRAN et al. (1985), observaram intensa atividade mitótica no APO de B.

glabrata no primeiro e terceiro dias pós-infecção, e declínio após o quarto dia de

exposição. Os autores descreveram ainda que o APO foi o único lugar onde

numerosas divisões celulares ocorreram durante a resposta de caramujos resistentes

à infecção trematódea. Isso difere dos dados observados no presente estudo, em

que as mitoses podiam ser encontradas raramente, tanto no APO como em outros

órgãos, como glândulas digestivas e túbulos renais. Estas observações estão de

acordo com os achados de SMINIA (1972), que mostraram que os hemócitos têm

capacidade de se dividir na linfa e nos tecidos.

A origem dos hemócitos foi inicialmente discutida por PAN & CHING-TUNG

(1958, 1963, 1965), como tendo lugar não só nas paredes da porção sacular do

órgão renal, a qual forma parte do saco pericárdico, como nos seios venosos e no

tecido conectivo frouxo. Assim, ele postula uma origem multicêntrica para os

hemócitos a partir do revestimento dos espaços vasculares. Este revestimento existe

por todos os órgãos, já que o molusco tem uma circulação aberta, mas a proliferação

ocorre focalmente, toda vez que um estímulo adequado se faz presente. Todavia,

LIE et al., (1975) consideraram a primeira região mencionada por Pan como um

órgão hematopoiético ou linfóide e deu-lhe a denominação de APO, a qual foi

adotada por muitos deste então.

A favor de ser os espaços vasculares, o local de formação dos hemócitos,

temos no presente estudo a observação de proliferação focal em vários órgãos,

sendo a mais impressionante aquela observada no coração, tal como podemos ver

48

na figura (2: A). Tivesse uma proliferação semelhante ocorrido no interior do APO, tal

seria mais convincente para justificar um órgão central hemocitário, do que a

propalada hiperplasia ou as eventuais figuras de mitose.

Se quisermos olhar com um olho prático, podemos deduzir que a proliferação

focal de hemócitos surge como mais adequada para a defesa, já que a circulação da

linfa é vagarosa e se faz em espaços vasculares muito numerosos e relativamente

amplos. Poder-se-ia argumentar que a ausência de modificação no APO observada

no presente estudo foi devida ao uso de caramujos muito susceptíveis, que

praticamente não respondem com proliferação hemocitária à invasão pelo S.

mansoni. De fato, na maioria das vezes as respostas proliferativas em torno dos

parasitos eram quase inexistentes. Todavia, alguns casos apresentaram reação,

inclusive aquela que preencheu a cavidade ventricular com numerosos hemócitos,

sem que o APO exibisse modificações apreciáveis. Por outro lado, foram

encontradas coleções de hemócitos nos revestimentos dos espaços vasculares de

outros órgãos tais como glândula digestiva, túbulos renais e especialmente o

coração. Estes elementos celulares apresentavam-se tumefeitos, com núcleos

proeminentes, fortemente corados pela hematoxilina. Estas células se dispunham

formando agrupamentos ou nódulos, alguns dos quais exibindo mitoses.

Também seria de se esperar que, havendo um órgão central formador de

hemócitos, tais hemócitos aí originados teriam que trafegar pela corrente da hemo-

linfa para se concentrar nos locais de reação. Teríamos assim uma maior

concentração deles nos animais infectados, o que consistiria numa espécie de

“leucocitose”. Os dados até aqui publicados não permitem deduzir que tal aconteça.

Embora JOKY & MATRICON-GONDRAN (1985), RONDELAUD & BARTHE (1980) e

JEONG et al., (1980), tenham verificado um ligeiro aumento no numero de hemócitos

49

circulantes nos primeiros dias da infecção pelo S. mansoni, seguido de uma

diminuição logo após. Outros pesquisadores não conseguiram demonstrar um

achado consistente entre resposta tecidual e sua repercussão nas células da

hemolinfa (REIS et al., 1995; BORGES et al., 2005 In press). Aliás, nossos achados

aqui apresentados estão concordantes com os destes últimos autores.

Adicionalmente, no presente estudo, foi constatado que os hemócitos

presentes nos tecidos e no APO exibiam características de um único tipo celular, os

granulócitos. Estes resultados ratificam os resultados descritos por SMINIA &

BARENDSEN (1980) e JEONG et al., (1983).

Como visto por LIE et al., (1975 & 1976), o presente estudo também registrou

a presença em alguns exemplares infectados pelo S. mansoni e inoculados com

miracídios irradiados, a formação de agregados amebocitários em alguns órgãos,

especialmente no lúmem do ventrículo do coração, e nódulos celulares na região do

manto, glândulas digestivas e túbulos renais, sugerindo aí uma origem focal dos

hemócitos.

Também, como já notado pela primeira vez por JEONG et al., (1983), os

nossos achados ultra-estruturais mostraram o APO como uma estrutura complexa

composta de células justapostas com características epiteliais, com microvilosidades

em sua superfície li vre. Estas células ricas em organelas sugerem uma função

metabólica importante e também de secreção e filtração, mas não dão indícios de

diferenciação em células livres (hemócitos). Foram vistos hemócitos no tecido

conjuntivo, logo abaixo da membrana basal do APO, mas sem que se evidenciassem

as formas transicionais a partir de células no interior do APO.

Em conclusão, nossos achados favorecem uma origem multicêntrica para os

hemócitos da B. glabrata, os quais poderiam se formar em qualquer órgão, inclusive

50

no APO, a partir de células dos revestimentos dos seios venosos e, talvez, também

de células situadas no interior do tecido conjuntivo frouxo.

51

7. CONCLUSÕES

1- Nossos estudos são consistentes com a origem multicêntrica dos hemócitos,

células de defesa do molusco Biomphalaria glabrata, a partir dos revestimentos dos

espaços vasculares, especialmente no coração e porção sacular do rim, ao mesmo

tempo em que não confirmam ser o APO (amebocyte-producing organ) o único ou

principal local de origem dos hemócitos.

2- O estudo histológico do APO não mostrou alterações apreciáveis quando sua

estrutura geral foi comparada em caramujos infectados pelo Schistosoma mansoni

com os controles não-infectados.

3- A análise morfométrica do APO, feita em caramujos infectados pelo Schistosoma

mansoni, mostrou que o comprimento e a largura do órgão não variaram de maneira

estatisticamente significante quando comparados com seus controles não infectados.

4- A microscopia eletrônica revelou que o APO possui características típicas de um

tecido epitelial, com células justapostas, com pontos de aderências entre si, com

microvilosidades na superfície livre, algumas contendo material de secreção, e ricas

em organelas, tais como, retículo endoplasmático liso e rugoso, complexo de Golgi,

lisossomos e numerosas mitocôndrias.

52

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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